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Virusdiagnostik
Allgemeine Virologie – SS 2019
Rainer G. Ulrich
Friedrich-Loeffler-Institut
Institut für neue und neuartige Tierseuchenerreger
D-17493 Greifswald - Insel Riems
Allgemeine Virologie – SS 2019
03. 04. 19 Klassifikation und Taxonomie von Viren R. Ulrich
10. 04. 19 Virusdiagnostik R. Ulrich
17. 04. 19 Epidemiologie R. Ulrich
24. 04. 19 Virusaufnahme und Replikation T. Mettenleiter
01. 05. 19 Feiertag
08. 05. 19 Meilensteine der Virologie J. Stech
15. 05. 19 Pathogenese und Virus-Zell-Interaktionen T. Mettenleiter
22. 05. 19 Genetik und Evolution der Viren S. Finke
29. 05. 19 Immunantwort und Impfstoffe S. Finke
05. 06. 19 Tumorviren, Transformation und Tumorbildung S. Finke
12. 06. 19 Projektwoche
19. 06. 19 Viren als Werkzeuge T. Hoenen
26. 06. 19 Ultrastruktur von Viren J. Stech
03. 07. 19 Chemotherapie und Zytokine S. Finke
10. 07. 19 Führung FLI Insel Riems T. Mettenleiter
Klausur: 26.07. 2019 (Nachklausur: 29.10. 2019)
Zusammenfassung
Die diagnostische Fragestellung bestimmt die Auswahl der/des
Nachweisverfahren/s.
Die Virusdiagnostik beinhaltet Verfahren zum direkten
Erregernachweis, zum Nachweis von Virusbestandteilen und
immunologischen Reaktionen des Wirtes.
Der direkte Nachweis von replikationsfähigem Erreger basiert auf der
Anzucht des Virus auf suszeptiblen Zellen und dem Nachweis Virus-
spezifischer cytopathogener Effekte (CPE).
Der direkte Nachweis von Virusbestandteilen basiert auf der Antigen- und
Nukleinsäure-Detektion (ELISA, Immunfluoreszenztest, Hämagglutinationstest,
Hybridisierung, PCR/RT-PCR).
ELISA, Immunfluoreszenztest, Immunoblot-Test, Neutralisations- und
Hämagglutinationshemmtest dienen dem indirekten Nachweis von
Virusinfektionen mittels qualitativer und/oder quantitativer Analyse Virus-
spezifischer Antikörper.
Gliederung der Vorlesung
1. Diagnostische Fragestellungen
2. Überblick über diagnostische Verfahren
3. Direkter Nachweis von replikationsfähigem
Erreger
4. Nachweis von Virusbestandteilen
5. Nachweis von immunologischen Reaktionen
des Wirtes
Gliederung der Vorlesung
1. Diagnostische Fragestellungen
2. Überblick über diagnostische Verfahren
3. Direkter Nachweis von replikationsfähigem
Erreger
4. Nachweis von Virusbestandteilen
5. Nachweis von immunologischen Reaktionen
des Wirtes
1. Diagnostische Fragestellungen I
- Erregeridentifikation bei einer Infektion
- Frische Infektion?
- Akute (selbstlimitierende) Infektion oder chronische Infektion/Reaktivierung?
- Therapiebeginn/Therapieverlauf
- Resistenz gegen antivirale Substanzen
- Unterscheidung von infizierten und immunisierten Tieren
(DIVA, Markervakzine)
- qualitative/quantitative Bestimmung (Titer): Messung einer schützenden
Immunität nach Immunisierung, bei Möglichkeit einer perinatalen Über-
tragung oder zur Bestimmung des Impfstatus nach Nadelstichverletzung
- Ätiologie neuer Erkrankungen
- Epidemiologische Untersuchungen (Prävalenz, molekularepidemiologischer
Nachweis des ätiologischen Agens)
1. Diagnostische Fragestellungen II
Gliederung der Vorlesung
1. Diagnostische Fragestellungen
2. Überblick über diagnostische Verfahren
3. Direkter Nachweis von replikationsfähigem
Erreger
4. Nachweis von Virusbestandteilen
5. Nachweis von immunologischen Reaktionen
des Wirtes
2. Überblick über diagnostische Verfahren
• Direkter Nachweis des replikationsfähigen Erregers
• Direkter Nachweis von Virusbestandteilen
– Antigennachweis
– Nukleinsäurenachweis
• Indirekter Nachweis von immunologischen
Reaktionen des Wirtes
– Antikörper
– Zelluläre Immunantwort
• messbares Auftreten einer spezifischen Immunantwort 2-3
Wochen nach Infektion.
Diagnostisch verwertbar ist die humorale Immunantwort.
• direkter Virusnachweis
zeitlich nur limitiert
möglich.
Bei fortgeschrittenem
Krankheitsstadium ist das
primär ursächliche Virus
häufig nicht mehr
nachweisbar.
2. Diagnostische Marker im Infektionsverlauf I
2. Diagnostische Marker im Infektionsverlauf II
HIV
Gliederung der Vorlesung
1. Diagnostische Fragestellungen
2. Überblick über diagnostische Verfahren
3. Direkter Nachweis von replikationsfähigem
Erreger
4. Nachweis von Virusbestandteilen
5. Nachweis von immunologischen Reaktionen
des Wirtes
• Virusanzucht:
• Zellkultur
• embryoniertes Hühnerei
• Versuchstier
• Morphologische Sichtbarmachung:
• Mikroskopie
• Elektronenmikroskopie
3. Nachweis von replikationsfähigem Erreger
Kuhpockenvirusinfektion, Chorioallantoismembran
Virusanzucht in Zellkultur
• dient dem Infektiositätsnachweis
• nicht bei allen Viren möglich
• langsame, aber hochsensitive Methode
• Voraussetzung: Virusvermehrung führt zu
charakteristischen Veränderungen in der Zellkultur
(cytopathogener Effekt, CPE)
3. Nachweis von replikationsfähigem Erreger
• Primäre Zellkultur – keine oder wenige Passagen
• Sekundäre Zellkultur
– Zellen eines einheitlichen Typs – bis zu 50 Passagen z.B. embryonale Lungenzellen
• Permanente Zelllinien
– Tumorgewebe oder transformiert
3. Zellkulturtechniken
Auswahl (potentiell) suszeptibler Zellen für die Virusanzucht
3. Zellkulturen für die Virusanzucht
Wirtszellen Abkürzung Geeignet zur Vermehrung
folgender Viren
Primäre Affennierenzellen PRMK Pockenviren, Mumpsvirus,
Masernvirus, Rhinoviren,
Influenzaviren
Primäre Hühnerfibroblasten PCEC Tollwutvirus, FSME-Virus
Affennierenzellen Vero Pockenviren, Marburg-Virus,
Ebola-Virus, Rötelnvirus,
Polioviren, Coxsackie-B-Viren,
ECHO-Viren
Hundenierenzellen MDCK Influenzaviren
Humane diploide Fibroblasten HDCS HSV, VZV, HCMV,
Rhinoviren, Rabiesvirus
Humane Tumorzellen HEp2, HeLa Adenoviren, Parainfluenzaviren,
Mumpsvirus, RSV, Polioviren,
Coxsackie-B-Viren, Rötelnvirus,
Coronaviren
Moskitozellen C6/36 Alphaviren, Dengueviren
Cytoplasmatische Einschlusskörperchen
Syncytienbildung Proliferativer CPE
z.B. Respiratorisches Syncytial-Virus z.B. Paramyxoviren, Orthomyxoviren
z.B. Pockenviren
3. Cytopathogene Effekte (CPE)
Diffuser cytolytischer CPE
mit Abkugelung
z.B. Enteroviren
3. Plaque- und Focustest zur Quantifizierung
Vacciniavirus/AGMK-Zellen MoMSV/3T3-Mausfibroblasten
Viren <250nm, keine lichtmikroskopische Darstellung
Ausnahme: Pockenviren, Mimiviren
Elektronenmikroskopie
• mindestens 106 Partikel/ml erforderlich
• sehr hoher apparativer Aufwand
• die Morphologie allein kann meistens nur die Virusfamilie
definieren, nicht aber Subfamilien oder Virusspezies
• schnelles Ergebnis
• „Open view“-Methode: Entdeckung neuer Erreger
• Anwendung: Stuhldiagnostik
3. Direkter Erregernachweis
3. Elektronenmikroskopie und
Immunelektronenmikroskopie
Elektronenmikroskopie (Kotprobe):
Rotaviruspartikel
Immunelektronenmikroskopie (Kotprobe):
Caliciviruspartikel
Gliederung der Vorlesung
1. Diagnostische Fragestellungen
2. Überblick über diagnostische Verfahren
3. Direkter Nachweis von replikationsfähigem
Erreger
4. Nachweis von Virusbestandteilen
5. Nachweis von immunologischen Reaktionen
des Wirtes
- Nachweis viraler Antigene:
- (direkter) Immunfluoreszenztest, Immunhistochemie
- capture-Enzymimmunoassay (EIA)
- Hämagglutinationstest
- Nachweis von viraler Nukleinsäure:
- Polymerasekettenreaktion
(konventionelle und Echtzeit- (real-time) PCR/RT-PCR)
- Hybridisierung
(Chip/Array-Technologie)
4. Nachweis von Virusbestandteilen
- Sandwich-Enzymimmunoassay (EIA, ELISA)
direkte Verfahren: Verwendung von spezifischen Antikörpern, die
enzymmarkiert vorliegen
indirekte Verfahren: Verwendung eines Sekundärantikörpers, welcher
enzymmarkiert vorliegt
- (Direkter) Immunfluoreszenztest, Immunhistochemie
Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen (z.B. FITC) oder Peroxidase bzw.
alkalischer Phosphatase
- Hämagglutinationstest
4.1. Nachweis viraler Antigene
Sandwich-ELISA
4.1. Antigennachweis mittels ELISA
4.1. Immunfluoreszenztest (IFT) und
Immunhistochemie (IHC)
Tollwutvirus-Antigennachweis in
Gehirnprobe eines Hundes.
Tollwutvirus-Antigennachweis im
Gehirn-Paraffinschnitt eines Hundes.
4.1. Hämagglutinationstest
Influenzavirus
• Erreger können direkt ohne vorherige Virusanzucht und
Vermehrung nachgewiesen werden
• empfindlicher als der Nachweis eines viralen Antigens
4.2. Nachweis viraler Nukleinsäuren
• Nukleinsäurenachweis ohne Vervielfältigung der Nukleinsäure
Hybridisierung (Southern Blot - DNA, Northern Blot - RNA, in situ-
Hybridisierung, Chip/Array-Technologie)
• Nukleinsäurenachweis mit Vervielfältigung der Nukleinsäure
Polymerasekettenreaktion (konventionelle und Echtzeit-PCR/RT-PCR)
4.2. Southern Blot zum Virus-DNA-Nachweis
Spezifische Banden
4.2. In situ-Hybridisierung (ISH)
• Methode zur selektiven in vitro-Vermehrung definierter DNA-
Abschnitte unter Verwendung einer thermostabilen DNA-
Polymerase I (Direktnachweis kleinster Mengen von DNA)
• Sequenz des zu vervielfältigenden DNA-Abschnitts muss
bekannt sein (Auswahl der Primer)
Zyklische Wiederholung
von 3 Schritten:
1. Denaturierung der DNA in
Einzelstränge
2. Anlagerung von synthetischen
Polymeren (Oligonukleotiden)
3. Synthese komplementärer
DNA-Stränge
4.2. Polymerasekettenreaktion
Konventionelle PCR/RT-PCR
• (generische) Pan-PCR/RT-PCR
• nested/semi-nested PCR/RT-PCR
• Kompetitive (semiquantitative) PCR/RT-PCR
• Random-priming, Klonierung, Sequenzierung
(Abgleich gegen Datenbanken)
Quantitative Echtzeit-PCR (-RT-PCR)
4.2. PCR-Technologie
• Quantitative Bestimmung der HBV-DNA oder HCV-
RNA als Verlaufsparameter der antiviralen
Therapie.
• Feststellung der Viruslast (viral load) zur Therapie-
überwachung bei einer HIV-Infektion oder bei
Verdacht auf eine perinatale Übertragung.
• Verdacht auf eine Herpesvirusinfektion (HSV-PCR
oder VZV-PCR).
• Molekularepidemiologische Untersuchungen.
4.2. Indikationen für den Einsatz der PCR
• Längenscreening in der Gelelektrophorese und Anfärbung der PCR-
Produkte
• Hybridisierung mit einer Gensonde (Southern Blot; ELISA)
• Sequenzspezifische Amplifikatspaltung durch Restriktionsenzyme
(Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus, RFLP)
• nested/seminested PCR (RT-PCR)
• Nukleinsäuresequenzierung
4.2. Spezifitätsnachweis
4.2. Produktdetektion mittels Echtzeit-PCR
Detektion von Fluoreszenzsignalen, die mit der Amplifikatbildung im direkten Zusammenhang stehen
Verwendung von fluoreszenzmarkierten Hybridisierungssonden (Spezifitätsnachweis) oder Doppelstrang-DNA-bindenden Fluoreszenzfarbstoffen (z.B. SYBR Green I)
•Quantifizierung mittels Software-gestützter Berechnung eines Fluoreszenzschwellenwertes Threshold
•Zyklus, bei dem der berechnete Fluoreszenzschwellenwert gekreuzt wird Threshold Cycle (TC)
•Schwellenwert wird umso eher erreicht, je mehr Zielsequenzen sich in der zu untersuchenden Probe befinden
4.2. Real-time PCR: 5´-Exonuklease-Assay
TaqMan-Sonden
4.2. Real-time PCR: absolute Quantifizierung
Well Name Dye Well Type Ct (dRn) Final Call (dRn) Quantity (copies)
#_00 FAM Unknown 20,21 + 7,94E+05
#_03 FAM Unknown 27,03 + 6,73E+03
DI9 FAM Standard 16,46 + 1,00E+07
DI9 FAM Standard 23,12 + 1,00E+05
DI9 FAM Standard 30,24 + 1,00E+03
DI9 FAM Standard 36,02 + 1,00E+01
NTC FAM NTC No Ct - No CtStandards
Unbekannte Probe
NTC
4.2. Vorteile der Echtzeit (real-time)-PCR
Extrem sensitiv - Amplifikation sehr kleiner Fragmente
Spezifitätsgewinn - Detektion über Sonden
Sehr schnell - gleichzeitige Amplifikation und Detektion
Deutlich verminderte Kreuzkontaminationen - kein Öffnen der PCR-Reaktionsgefäße nach der Amplifikation notwendig
Sehr gut automatisierbar - Hochdurchsatzverfahren
Quantifizierung möglich - Viruslastbestimmung
4.2. Prinzip von DNA-Mikroarrays
Glas-Objektträger mit Mikroarray:
Messpunkte (Spots) mit individuellen
DNA-Oligomeren bekannter Sequenz
DNA-Chip auf Oligonukleotid-Basis
4.2. DNA-Chip-Technologie
Streptavidin ++++++++
Bio.
Streptavidin ++++++++
Bio.
Capture H1-16 HPAIV H5 und H7
Capture (Sonde) M N1-9
Reporter Alexa 555
Reporter Alexa 647
Hämagglutinin Neuraminidase, Matrixprotein
Amplikon PanHA
Amplikon PanNA, M
I. Identifizierung
II. Subtypisierung
III. Pathotypisierung
4.2. Diagnostisches DNA-Chip-System für AIV
A. Gall (FLI)
Gliederung der Vorlesung
1. Diagnostische Fragestellungen
2. Überblick über diagnostische Verfahren
3. Direkter Nachweis von replikationsfähigem
Erreger
4. Nachweis von Virusbestandteilen
5. Nachweis von immunologischen Reaktionen
des Wirtes
• Nachweis einer frischen Infektion (IgM-Ak, Titeranstieg IgG-Ak)
z.B. anti-HAV-IgM
• Nachweis einer stattgefundenen Infektion (IgG-Ak)
z.B. HIV, HCV, HBV, HDV
• Nachweis einer Immunität (IgG-Ak)
z.B. Poliovirus, FSMEV, anti-HBs (HBV)
• Nachweis einer Virusreaktivierung (IgM-Ak)
z.B. HSV, HCMV
5. Antikörpernachweis
ELISA/EIA Enzyme-linked Immunosorbent Assay
Herpesviren, Hepatitis B-Virus
iIFA indirekter Immunfluoreszenzassay Hantaviren
HHT Hämagglutinationshemmtest Rötelnvirus
IB Immunoblot, Western Blot, Lineassay
HIV, HCV, EBV, HEV
NT Neutralisationstest
Enteroviren, Hantaviren
5. Antikörper-Nachweisverfahren
5. Neutralisationstest
5. Hämagglutinationshemmtest (HHT)
5. Rötelnvirus-Hämagglutinationshemmtest
5. Antikörpernachweis mittels ELISA
- indirekter ELISA
- capture ELISA (µ, mAk)
- kompetitiver ELISA
5. ELISA zur qualitativen Bestimmung von
Virus-spezifischen Antikörpern
Quantifizierung von Antikörpern durch Endpunkttitration
5. Immunoblot: Western Blot-Test
HIV-Blot mit positiver Kontrolle
(1), negativer Kontrolle (2) und
3 Patientenseren (A,B,C)
Bestätigungstest
für HIV-Diagnostik
5. Diagnostische Bewertung
• Der Nachweis virusspezifischer Antikörper in einer klinischen Probe ist
nur ein indirekter Hinweis auf eine virale Infektion.
• Da Virus-spezifische IgG-Antikörper oftmals lebenslang persistieren, ist
ihr Nachweis in einer einzelnen Serumprobe kein ausreichender Beweis
für eine akut stattfindende Infektion.
• Nur der Nachweis von Virus-spezifischen IgM-Antikörpern und/oder die
Bestimmung der Titer Virus-spezifischer IgG-Antikörper in zwei
aufeinanderfolgenden Proben (mindestens 14 Tage Abstand) kann
Auskunft über den Zustand der Infektion geben (Titerunterschiede größer
oder gleich einem Faktor 4 sprechen für eine akute Infektion).
• Da bei vielen Virusinfektionen eine signifikante Antikörperbildung erst 8-12
Tage nach der Infektion einsetzt, ist bei negativem Befund unter
Umständen eine Verlaufsprobe erforderlich (Diagnostisches Fenster).
Zusammenfassung
Die diagnostische Fragestellung bestimmt die Auswahl der/des
Nachweisverfahren/s.
Die Virusdiagnostik beinhaltet Verfahren zum direkten
Erregernachweis, zum Nachweis von Virusbestandteilen und
immunologischen Reaktionen des Wirtes.
Der direkte Nachweis von replikationsfähigem Erreger basiert auf der
Anzucht des Virus auf suszeptiblen Zellen und dem Nachweis Virus-
spezifischer cytopathogener Effekte (CPE).
Der direkte Nachweis von Virusbestandteilen basiert auf der Antigen- und
Nukleinsäure-Detektion (ELISA, Immunfluoreszenztest, Hämagglutinationstest;
Hybridisierung, PCR/RT-PCR).
ELISA, Immunfluoreszenztest, Immunoblot-Test, Neutralisations- und
Hämagglutinationshemmtest dienen dem indirekten Nachweis von
Virusinfektionen mittels qualitativer und/oder quantitativer Analyse Virus-
spezifischer Antikörper.
• Gisela Flunker (Greifswald), Astrid Gall und Bernd
Hoffmann (Riems) für die Bereitstellung von Folien
Danksagung