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•• Neue Entwicklungen in der Biologie Neue Entwicklungen in der Biologie
•• Somatisches Klonen und Somatisches Klonen und transgenetransgene Tiere Tiere
•• Embryonale und Embryonale und adulteadulte StammzellenStammzellen
Forum „Chancen der Landwirtschaft im Bereich regenerativer Medizin – Status Quo, Perspektiven, Geschäftsmodelle“
Nifa Hannover, 12. November 2008
Prof. Dr. Heiner Niemann Institut für Nutztiergenetik (FLI)Mariensee, Neustadt, Germany
(Agrar(Agrar--) wissenschaftliche Perspektiven ) wissenschaftliche Perspektiven der regenerativen Medizinder regenerativen Medizin
Was ist regenerative Medizin?Was ist regenerative Medizin?
• Definition: Entwicklung und Anwendung innovativer medizinischer Therapien unter Nutzung von Biomaterialien, Zellen und Organen.
• Ziel: Wiederherstellung der Gewebefunktion, Unterstützung der Regeneration kranker oder verletzter Organe.
• Charakteristikum: Interdisziplinär: Forschung aus Allgemeinmedizin, Chirurgie, Intensiv-, Transplantations-medizin, Entwicklungsbiologie, Molekularbiologie; Grund-lagen- und anwendungsorientiert,
Arbeitsmethoden aus: Zellbiologie, Biotechnologie, Medizintechnik, Molekularbiologie, Ingenieurswesen, u.a.
Der Adler und Prometheus: Erste Hinweise fDer Adler und Prometheus: Erste Hinweise füür r Regenerative MedizinRegenerative Medizin
Nature 426, 2003
Ein neues Zeitalter der Biologie:Ein neues Zeitalter der Biologie:GenomsequenzierungGenomsequenzierung, somatisches Klonen und , somatisches Klonen und
embryonale Stammzellenembryonale Stammzellen
2004: Erste Versionen des Rinder- und Geflügelgenoms
2006: Hund, Biene
2007: Pferd
2009: Schwein (erwartet)
1998Dolly
1996 - 2003
RIP
Qiu, Nature 441, 143-145, 2006
Weitere epigenetische Mechanismen:
• Telomerenlänge
• X-Chromosom-Inaktivierung
Gesamtheit der epigenetischen Mechanismen:
Epigenom
Hauptfaktoren der Hauptfaktoren der epigenetischenepigenetischen Modulation Modulation der Genexpression: der Genexpression:
DNADNA--MethylierungMethylierung und und HistonHiston--ModifikationenModifikationen
Hauptkomponenten des epigenetischen
Codes
DNA MethylierungMethylgruppen an DNA-Basen unterdrücken Genaktivität
HistonmodifikationVerschiedene Moleküle können an die Proteinendenbinden. Dies verändert die DNA-Aktivität.
Chromosom
Histon
Histonende
Me
Me
Me
Me
Dolly
1996 - 2003
RIP
Dolly, das erste geklonte Säugetier markiert den Beginn einer neue Aera in der biologischen
Forschung
Ableitung humaner embryonaler Ableitung humaner embryonaler Stammzellen aus Embryonen im Stammzellen aus Embryonen im
BlastozystenstadiumBlastozystenstadium
1998
Nature 426, 2003
2004: Rind, Gefügel
2006: Hund, Biene
2007: Pferd
2009: Schwein (erwartet)
Aktueller Stand der Aktueller Stand der GenomsequenzierungGenomsequenzierung
Geklonte Rinder in Mariensee aus adulten (links) und fetalen(rechts) Fibroblasten
ET
RekonstruierterEmbryo
7d. IVC
SchlüpfendeKT-Blastozyste
EnukleierteOozyte
KT
Die zweite Generation geklonter Rinder
Somatisches Klonen beim RindSomatisches Klonen beim Rind
Porcine Cumulus OocytenKomplexe aus Schlachthofovarien
Porcine COC nach 42 Std IVM
Mikrochirurgische Entfernung derMetaphase II Platte (Licht und Fuoreszenzmikroskopie)
Somatisches Klonen beim Schwein I: In Somatisches Klonen beim Schwein I: In vitrovitroReifung und Reifung und EnukleationEnukleation von von OozytenOozyten
Gewinnung fetaler und adulter Fibroblastenfür somatischen Kerntransfer
Growing
fibroblasts
Tissue explant
- +
Schweinefetus am Tag 25 pcund auswachsende Fibroblasten
Aufsaugen der Spender-zelle (Fibroblast)
Transfer der Spenderzelle
Fusion von Spenderzelle und Cytoplast
Status 15 min. nach Fusion
Schlüpfende Blastozyste
nach 7 Tagen Kultur
Somatisches Klonen beim Schwein II: Transfer der Somatisches Klonen beim Schwein II: Transfer der Spenderzelle in Spenderzelle in enukleierteenukleierte in in vitrovitro gereifte gereifte OozytenOozyten
Aktueller Entwicklungsstand des Aktueller Entwicklungsstand des somatischen Kerntransferssomatischen Kerntransfers
Spezies % lebensfähige Geschätzte Anzahl
Nachkommen geklonter Tiere
Rind 15-20 <4000
Schaf 8 <400
Ziege 3 <600
Schwein 2-5 <800
Katze ~1 ~10
Maus < 2 >250
Kaninchen < 2 <10
Maultier <1 3
Pferd <1 ~10
Ratte 1 3
Hund 1 4
Wolf 1 2
Weltweite Schätzung, Mai 2008
56 (3.2%)11
(100%)11/11 (78.6%)
1736(∅∅∅∅= 124)
1951 (87.0%)
224314
Geb. Ferkel(Effiz. %)
Abferke-lung(%)
TrächtigTag 25 (%)
Transf. Embryo-nen
Fusion(%)
Anzahl derKT-
Komplexe
AnzahlTransfers
EffizienzEffizienz des des somatischensomatischen KerntransfersKerntransfers beibei VerwendungVerwendungprprääovulatorischerovulatorischer peripubertalerperipubertaler SauenSauen alsals EmpfEmpfäängernger
und und transgenentransgenen SpenderzellenSpenderzellen
♀
♂In vivo embryo
x
Housekeeping Genes
Tissue specific genes
Pluri-/Totipotency related genes
Developmentally immportant genes
xx
Somatic cell
xxxx
x
Clonedembryo
x x
x
IVP embryo
x
xx
x
EpigenetischeEpigenetische ReprogrammierungReprogrammierung der Gender Gen--expressionexpression bei geklonten Embryonenbei geklonten Embryonen
Anwendungsperspektiven des somatischen Anwendungsperspektiven des somatischen Kerntransfers (=Klonen) Kerntransfers (=Klonen)
Reproduktives KlonenReproduktives Klonen
☺ Genetisch identische
Mehrlinge
☺ Transgene Tiere
(Transfektion, homolog.
Rekombination)
☺ Krankheitsmodelle
☺ Erhaltung genetischer
Resourcen
☺ Tierzucht
(Milch, Fleisch, etc.)
Therapeutisches KlonenTherapeutisches Klonen
☺ ES –Zellen
☺ Gerichtete
Differenzierung
☺ Regenerative Zellen
und Gewebe (homolog,
heterolog)
☺ Tissue Engineering
☺ Biomedizin
GrundlagenforschungGrundlagenforschung
☺ Toti- und Pluripotenz
☺ Reprogrammierung
☺ De-Differenzierung
☺ Re-Differenzierung
☺ Alterung
☺ Tumorbildung
☺ Telomerenbiologie
☺ Viele andere Gebiete
Erstellung transgener Tiere mit Hilfe des Erstellung transgener Tiere mit Hilfe des somatischen Kerntransferssomatischen Kerntransfers
Transgene ZelleTransgene Zelle
Transgenes TierTransgenes Tier
Zeitdauer der Produktion transgener Schweine durch Zeitdauer der Produktion transgener Schweine durch Mikroinjektion oder somatischen KerntransferMikroinjektion oder somatischen Kerntransfer
MikroinjektionMikroinjektion der DNA
in Zygoten
Foundertiere
Paarung der Foundertiere
Geburt von F1-Tieren
Testen der F1-Tiere auf transgene Expression
Somatischer KTTransfektion der Spenderzellen
Somatisches Klonen
Transgene Klonschweine
Testen auf transgene Testen auf transgene ExpressionExpression
Zeitgewinn: ~ 350 Tage
Tag0
115
122
180-200
~360
475
530-550
Source: Deutsche Stiftung Organtransplantation 2005
Warteliste und Anzahl der Warteliste und Anzahl der Nierentransplantationen in DeutschlandNierentransplantationen in Deutschland
Das Schwein als potentielle Spenderspezies fDas Schwein als potentielle Spenderspezies füür r humane Organehumane Organe
I like pigs; dogs look up to us, cats look down to us, pigstreat us as equal.
(Winston Churchill)
• Domestizierte Species• Hohe Fertilität, viele Tiere• Anatomie, Physiologie nicht zu verschieden vom Menschen
• Haltung unter strikten hygienischen Konditionen möglich
• Genetische Veränderungen möglich
Klinische Prüfung von Inselzellen vom Schwein zur Diabetes Behandlung läuft zur Zeit.
Endothel der norma-len Schweinegefässe
Genetisch verändertesEndothel der Schweine-gefäße (α1,3Gal-KO)
HAR
AVR
CXRhCD46
hCD46
hCD55
hCD55
hCD59
hCD59
hirudinhirudin
hTMhTM
TFPITFPI
HOHO--II
HLA-G
HLA-GHLA-E
HLA-E
A20A20
A1A1
Fas-L
Fas-L
= αGal-epitopes
= Membrane attack complex (MAC)
= Thrombus
= Natural Killer Cells
preformed anti-Gal-antibodies
Erste dreifach Erste dreifach transgenetransgene (hCD59/hDAF/hTM) (hCD59/hDAF/hTM) Schweine, geb. 11. August 2005Schweine, geb. 11. August 2005
Gene Gene PharmingPharming
ATrynATryn®®: das : das ersteerste zugelassenezugelassene rekombinanterekombinanteMedikamentMedikament ((humaneshumanes AntithrombinAntithrombin III) III) ausaus derder
MilchdrMilchdrüüsese transgenertransgener ZiegenZiegen
Indikation:Prophylaktische
Behandlung genetischbedingter AntithrombinDefizienz im Rahmen
einer eines chirurgischenEingriffs
FRAMINGHAM, MA – June 2, 2006 - GTC Biotherapeutics, Inc. ("GTC", Nasdaq: GTCB) announced today that the Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) of the European Medicines Agency (EMEA) has adopted a positive opinion on the market authorization application (MAA) for ATryn®®, GTC’s recombinant form of human antithrombin.
Generierung differenzierter Zellen durch Generierung differenzierter Zellen durch ReprogrammierungReprogrammierung somatischer Zellensomatischer Zellen
Ableitung embryonaler Stammzellen aus Ableitung embryonaler Stammzellen aus Embryonen im Embryonen im BlastozystenstadiumBlastozystenstadium
1998
Humane Humane ESES--ZellZell KolonieKolonie
Gezielte Differenzierung von ESGezielte Differenzierung von ES--, EG, EG--und ECund EC--Zellen Zellen
Einsatz von Stammzellen zur Generierung von Einsatz von Stammzellen zur Generierung von regenerativen Zellen und Gewebenregenerativen Zellen und Geweben
Therapeutisches KlonenTherapeutisches Klonen
Bioptierte Zelle(z.B. Fibroblast)
Enukleiertehumane Eizelle
Kerntransfer-embryo
Blastozyste
Embryonale StammzellenBenötigte Zellen (z.B.Herzmuskelzellen)
In vitro-
Differenzierung
Published Nature online
ahead of press, June7th, 2007
Erzeugung Erzeugung pluripotenterpluripotenter Stammzellen durch Stammzellen durch ÜÜberexpression von 4 berexpression von 4 SchlSchlüüsselgenensselgenen
Somatische Körperzellen
Induzierte pluripotenteStammzellen
• Oct4 (PouSf1)
• Sox 2
• c-Myc
• KIf4
Gewinnung von Gewinnung von iPSiPS aus humanen aus humanen HaarzellenHaarzellen
Gadue and Cotsarelis; Nature Biotechnology 26, 1243-1244, 2008
Applikation Applikation adulteradulter Stammzellen am HerzenStammzellen am Herzen
Die Notwendigkeit neuer Tiermodelle
Jüngste Entwicklungen:
Pluripotente Zellen,
Reprogrammierung, iPS
In Vorbereitung: Modelle im Minischwein, Rhesusaffe,
Weissbüschelaffe
• Sequenzierung und Annotierung von Genomen
• Somatisches Klonen beim Säuger
• Epigenetische Plastizität von Zellen (Pluripotenz und De-Differenzierung)
Neue Horizonte fNeue Horizonte füür die Nutztiergenetik r die Nutztiergenetik
und Biomedizinund Biomedizin
UmwUmwäälzungen in der Biologielzungen in der Biologie
Area A:
Stammzell Biologie
Klonen/Reprogrammierung
Organogenese
Proliferation und Alterung
• Blut
•Herz
• Lunge
• Leber
• Künstliche Organe
• Autologe Zellen und
Gewebe
• Allogene Zellen und Gewebe
• Xenogene Zellen und
Gewebe
• Tissue Engineering
• (Xenotransplantate)
REBIRTHREBIRTH**: Aufbau eines Centers f: Aufbau eines Centers füür r Regenerative Medizin mit internationaler Regenerative Medizin mit internationaler
SpitzenstellungSpitzenstellung
*DFG-Exzellenzcluster: MHH, Leibniz Univ., TiHo, HZI, MPI, ING-Mariensee
Zusammenfassung und Schlussfolgerungen
• Das somatische Klonen erlaubt die Erstellung transgener Tiermodelle für die regenerative Medizin.
• Pharming ist bereits in der praktischen Anwendung.
• Die Erzeugung multi-transgener Schweine wird die Xenotransplantationbis zur präklinischen Prüfung voranbringen.
• Effektive Verfahren zur Reprogrammierung somatischer Zellen stehen zur Verfügung.
• Die Erstellung individual-spezifischer therapeutischer Zellen, entweder durch therapeutisches Klonen oder iPS Verfahren ist möglich.
• Die Etablierung aussagekräftiger Tiermodelle ist von entscheidender Bedeutung für die Erweiterung der Grundlagenkenntnise und die Weiterentwicklung dieser Technologien bis zur klinischen Anwendungsreife.
• Die Entwicklung aussagekräftiger Grosstiermodelle für die regenerative Medizin ist eine viel versprechende Nische für wirtschaftliche Aktivitäten
VielenVielen Dank fDank füür r
IhreIhre
AufmerksamkeitAufmerksamkeit
Lowry and Plath; Nature Biotechnology 26, 1246-1248, 2008
Lowry and Plath; Nature Biotechnology 26, 1246-1248, 2008
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