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Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit
Aktuelle Erkenntnisse aus einer Studie am LGL Erlangen zum Nachweis von BVDV aus OhrgewebeprobenEinflussfaktor Ohrmarkensysteme und Stabilitätsversuche
Stendal, 17.6.2010
Bogner, K.-H., Kupča, A., Christian, J., Drdlicek, J. und Lindner, M.
TF - Landesinstitut Spezialeinheit Tiergesundheit; Futtermittel
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 2
Ohrstanzen Caisley / Allflex 2008/2009
Caisley Allflex
Probe
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 3
Ohrmarkenmodelle 2009 / 2010
Fa. Allflex Fa. Caisley
OhrgewebeOhrgewebe
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 4
Öffnung alte Caisley-Stanzen in der ersten Studie Birlbauer, Hellwig und Wolf (2006-2008) :
Zugabe von Lysepuffer in Ohrstanzen kann durch Plastikteile etc. gestört werden
störendePlastikteile
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 5
Inhaltskontrolle Caisley-Stanzen
Probe Keine Probe
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 6
Ursprünglich angedachte Inhaltskontrolle (Foto: Caisley)
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 7
Caisley-Ohrstanzen, Originaleinsendungen
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 8
Hängengebliebene Ohrstanze bei manueller Öffnung
Gewebestück
Stanzkegel
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 9
Volumen Gefäß: 400µl
Füllhöhe 200µl
Probe hängt im oberen Teil des Gefäßes,oberhalb des Lysepuffers
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Caisley neu:alternativ Trocknung mittels Silica-Gelteiltransparentes Röhrchen
Trocknungskügelchen
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Gewebestück behindert Einführen der Pipettenspitze
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Poolen aus Caisley-Stanzen mit Roboter,Sollvolumen 50 µl
Grund: Aufsaugen der Flüssigkeit durch Trocknungskügelchen / Pipettierfehler
50 µl 40 µl 30 µl 20 µl
50 µl? µl
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Neue transparente Caisley-Stanze mit Gewebeprobe
Gewebestanze
hängt am Stanzkegel
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Problemlösung: Öffnungsstanze muss tiefer eindringen
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Stand zu Ohrmarken der Fa. Caisley im Moment:
Stanzwerkzeug ist angepasstGrößere EintauchtiefeVerändertes Schneideprofil
Verschiedene Trocknungsalternativen erhältlich ohnewenig kleine Kügelchen Silicagel
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Allflex-Stanzen neu
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Allflex-Röhrchen im 96er Format
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Sichere Probenahme?
Stanzerfolg Caisley(Daten aus Studie 2006/2007, LMU+LGL)
Gesamt %beide ok 11.275 97,8eine leer 237 2,1beide leer 13 0,1SUMME gestanzte Tiere 11.525 100,0
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Beurteilung der Caisley-Stanzen Daten aus Studie 2006/2007, LMU+LGL
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Stanzergebnisse Allflex - Widerlagervarianten
SCHAUM %beide ok 8226 82,7eine leer 1579 15,9beide leer 141 1,4SUMME gestanzte Tiere 9946 100,0
BLAU %beide ok 3802 95,9eine leer 156 3,9beide leer 5 0,1SUMME gestanzte Tiere 3963 100,0
Widerlager = Schaumstoff
Widerlager = grüner oder blauer Kunststoff am „Lochgrund“
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Unterschiedliche Bearbeitungszeiten Allflex / Caisley
96 Proben in Racks aufgestellt, Arbeitszeit fürAusstanzen, Scannen, Kontrolle des Inhalts, Lyse, Pooling(ohne Maschinenzeiten):
Allflex: 54 MinutenVorteil: Inhaltskontrolle in Ablauf integriert, sicherer und problemloser Ablauf danach (keine störendenKügelchen und andere Begleitstoffe, größere Öffnung)
Caisley: 44 Minuten *)Vorteil: einfacherer StanzvorgangNachteil: Kontrolle der Ohrstanze (Qualität, Lage im Röhrchen)
problematisch, störende (z.T. hängende) Bestandteile*) laut Ausführungen von Dr. Bock und Dr. Schwarz entsteht hier aber zusätzlicher Arbeitsaufwand durch Einsatz einer „Vorlageplatte“ zur Sicherstellung der korrekten Pipettierung
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Weitere Erkenntnisse: Kombination Röhrchen-Schnelllysemethode
Das AnDiaTec-System wird im Vergleich zu Allflex-Röhrchen durch Caisley-Röhrchen mit und ohne Trocknungsmittel negativ beeinflusst (8- bis 10 cts und mehr!)
Bei Lagerung wird das Problem verstärkt!
Einflüsse von Röhrchen, Trocknungsmittel und „Autolyse???“ bei der Schnelllyse
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Weitere Erkenntnisse: Kombination Röhrchen-Schnelllysemethode
Es wurde ein Lagerungsversuch mit frischen Proben durchgeführt
Die Proben wurden in verschiedenen Röhrchen bei verschiedenen Temperaturen gelagert
Die Röhrchen wurden mit verschiedenen Methoden untersucht
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No Ct**39,3No Ct**No Ct***No Ct**No Ct**31,229,530,8x37°C
No Ct**No Ct**No Ct**No Ct***34,332,925,430,825,4xRT
23,929,324,923,831,225,518,222,422,329,22 -8°CCaisley
neu mit Silica als Trocken-
mittel
No Ct**32,5No Ct**No Ct***No Ct**23,135,1No Ct**26,9x37°C
32,4No Ct**No Ct**NoCt/41,
1***31,7No
Ct/35,525,7No Ct**34,1xRT
24,2No Ct**No Ct**No Ct***31,6No
Ct/44,125,5No Ct**No Ct*22,82 -8°C
Caisley neu mit
minimaler Menge an Molekular
sieb
42,832No Ct**31,229,2No Ct**28,241,732,2x37°C
38No Ct**38,2NoCt/36,
1***30,8No Ct**26,6No Ct**No Ct*xRT
24,624,926,32628,8282023,324,2242 -8°CCaisley
neu ohne Molekular
sieb
35,5No
Ct/39,6No
Ct/32,433,63032,831,13526x37°C
27,632,132,931,42729,326,726,825,3xRT
27,322,125,623,319,924,421,822,724,719,6
Ct-Wert BVD
2 -8°C
Allflex 96
nach 9 Woch.KW08
nach 8 Wochen KW07
nach 7 Wochen KW06
nach 6 Woch. KW05
nach 5 Woch. KW04
nach 4 Woch.KW03
nach 3 Woch. KW02Sekund.-Gefäß
nach 12 Tagen KW01
nach 5 Tagen KW53
frisch KW52
Schnelllyse
AnDiaTec
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 25
xxxxx3832,639,626,127x37°C
29,826,725,229,128,929,225,823,230,424,4xRT
23,525,123,92830,723,623,732,523,524,1242 - 8°CCaisley neu mit Silica
als Trockenmittel
xxx31,326,725,326,220,92526,3x37°C
27,423,425,825,324,227,929,319,722,820,4xRT
1919,320,323,424,921,922,420,222,919,123,12 - 8°CCaisley neu mit minima
ler Menge
an Molekularsieb
xxxx27,629,637,824,524,821,5x37°C
2224,324,626,92225,1262123,820,8xRT
22,721,619,724,423,522,722,822,523,821,623,72 - 8°CCaisley neu ohne
Molekularsieb
xxx37,731,824,735,928,425,621,2x37°C
26,821,338,123,21924,324,722,921,221,3xRT
19,518,920,324,128,423,122,421,122,120,923,2
Ct-Wert BVD
2 - 8°C
Allflex 96
nach 10 Wochen (KW09)
nach 9 Wochen (KW08)
nach 8 Wochen (KW07)
nach 7 Wochen (KW06)
nach 6 Wochen (KW05)
nach 5 Wochen (KW04)
nach 4 Wochen (KW03)
nach 3 Wochen (KW02)
nach 12 Tagen (KW01)
nach 5 Tagen (KW53)
frisch (KW52)
Referenzmethode
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 26
3,25653,3192,23352,55451,50551,5562,33953,4863,22x37°C
3,32853,7522,72253,11053,18652,7712,58153,323,386xRT
3,37253,4253,20753,30853,05153,0942,90253,3863,6693,3142 -8°C
Caisley neu mit
Silica als Trockenmi
ttel
3,17651,752,57351,35553,11553,3832,82153,393,34x37°C
3,20653,652,89253,11553,10553,242,91553,2793,615xRT
3,48053,463,46853,16553,02953,1452,76453,3423,4913,1642 -8°C
Caisley neu mit
minimaler Menge an Molekular
sieb
2,96653,1991,01152,21853,05251,9872,69253,4093,203x37°C
3,53053,6473,27353,08053,20253,1972,85753,4233,373xRT
3,63953,8323,36353,62853,15153,5143,22653,6973,4553,0062 -8°CCaisley
neu ohne Molekular
sieb
1,42750,6770,51850,86752,63352,7142,14453,6743,456x37°C
3,16453,3843,25753,13752,98753,4512,64153,93,273xRT
2,89153,43,05653,3252,56453,4062,79453,6423,1053,191
OD-Wer
tBVD
(optisch
e Dichte)
2 -8°C
Allflex 96
nach 9 Wochen (KW08)
nach 8 Wochen (KW07)
nach 7 Wochen (KW06)
Nach6 Wochen (KW05)
nach 5 Wochen (KW04)
nach 4 Wochen (KW03)
nach 3 Wochen (KW02)**
**
nach 12 Tagen (KW01)
nach 5 Tagen (KW53)
frisch (KW52)ELISA
LAGERUNGSVERSUCH ELISA
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Röhrchenvergleich mit Qiagen Cador® (vorgefrorene Proben)Streuung der Werte
CAISLEY wenig Trocknungsmittel CAISLEY ohne Trocknungsmittel
Allflex-RöhrchenUntersuchungen im Mehrfachansatz
3 Proben
3 verschiedene Röhrchen
Allflex, 2x Caisley
Puffer A Puffer B
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Einflüsse aus Caisley-Bestandteilen auf ct-Werte bei AnDiaTec:
Trocknungskügelchen: Einfluss erwiesen
Verschiedene Kombinationen aus Trocknungskügelchen, PP-Material, Schneidring, Polycarbonat-Projektil (Linse) und Siegelfolie scheinen eine Rolle zu spielen, die noch nicht eindeutig zugeordnet ist
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ct > 30ct 25-30ct 20-25ct <20
29,56 (10 / 0)26,27 (10 / 0)28,16 (9 / 1)19,97
Sarstedt mit Caisley-Trockenmittel. + C.-Schneidring
24,25 (10 / 0)26,08 (10 / 0)26,41 (9 / 1)25,27
Sarstedt (anderes Lysegefäß) mit Caisley-Trockenmittel
23,3 (10 / 0)24,74 (10 / 0)22,37 (10 / 0)21,01Caisley ohne Trockenmittel
27,95 (10 / 0)26,72 (10 / 0)32,45 (7 / 3)22,99Caisley mit Trockenmittel
24,46 (10 / 0)24,28 (10 / 0)19,28 (10 / 0)19,65Allflex 96-Gefäße
LD Leipzig TRL-Puffer
Virotype BVD
QIAGENENLB-PufferCador-PCR
AndiatecBoVir-SL BVDV Lyse + PCR
"Referenzmethode" (modif. nach
Hoffmann et al., 2006)
SchnelllysenMethode mit Aufreinigung
Gefäßart:
jeweils 10 Proben einzeln analysiert, dargestellt sind Ct-Mittelwerte der positiven Proben
(Anzahl der pos. / neg.)Einzelproben
Ct-Werte des BVDV-Nachweises mit verschiedenen Verfahren (alle Proben stammen aus demselben Ohr eines PI-Rindes):
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 30
25,71 (10 / 0)32,36 (10 / 0)29,44 (10 / 0)13,95
Sarstedt (anderes Lysegefäß) mit Caisley-Trockenmittel
24,08 (9 / 1)30,89 (10 / 0)28,48 (10 / 0)14,82Caisley ohne Trockenmittel
26,71 (10 / 0)31,63 (10 / 0)30,11 (10 / 0)15,42Caisley mit Trockenmittel
33,62 (4 / 6)Mittelwert
ohne Ausfälle32,07 (9 / 1)28,02 (10 / 0)13,98Allflex 96-Gefäße
LD LeipzigTLR-Puffer
VIROTYPE®BVDV
QIAGENENLB
Cador-PCR
AnDiaTecBoVir-SL BVDV
Lyse+PCR„Referenzmethode“
(modif. nach Hoffmann et al.,
2006)
SchnelllysenMethode mit Aufreinigung
Gefäßart:
jeweils 10 Proben einzeln analysiert, dargestellt sind Ct-Mittelwerte der positiven Proben
(Anzahl der pos. / neg.)Einzelproben
Ct-Werte der jeweiligen Internen Kontrollen in verschiedenen Verfahren(alle Proben stammen aus demselben Ohr eines PI-Rindes):
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 31
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45
PI Ref er enz
NPI Ref er enz
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Anzahl
Ct-Werte
Erstuntersuchung von Ohrstanzen
PI Referenz PI Andiatec NPI Referenz NPI Andiatec
n=161
Methodenvergleich Schnelllyse vs. Lyse + AufreinigungUrsprünglicher Vorschlag für die Klassifizierung als PI-Tier (2009)
„Referenzmethode“:Ct=31 als Grenzwert PI / NPI ?
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FRÜHERE BETRACHTUNGSWEISE
TESTSYSTEM ERGEBNIS
Daher Vorschlag FLI:
PI cutoff :
Grenzwert PI / Nachuntersuchung
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JETZT NEUE BETRACHTUNGSWEISE
TEST
ERGEBNIS
OHRSTANZE
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Anzahl der viralen Genomkopien / µl Lysat oder Eluat aus Ohrgewebeproben in Allflex-Gefäßen nach Quantifizierung anhand des FLI-Standardmaterials
96.140199.564214no Ct
174.700135.64136no Ct
216.900118.13525no Ct
87.530104.15913no Ct
17.83072.8679no Ct
241.40052.6604no Ct
449.30051.9173no Ct
123.6001.200.28470.75018.8062no Ct
491.800992.750287.30010.0180no Ct
1.469.000712.365120.1006.9878771011
703.000404.18922.6402.10756820
186.900232.2147.38371160
Eluat b
(Kopien/ µl)Lysat a
(Kopien/ µl)Eluat b
(Kopien/ µl)Lysat a
(Kopien / µl)Eluat b
(Kopien / µl)Lysat a
(Kopien / µl)
Material von PI-Tieren*:Material von NPI-Tieren*:
* die Klassifizierung in PI- und NPI-Tiere wurde durch die Nachuntersuchung aus Blut vorgenommena Schnelllyse-Verfahren der Fa. Andiatecb „Referenzmethode“ (modif. nach Hoffmann et al., 2006; Methode mit Nukleinsäureextraktion)
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Weitere Erkenntnisse: Kombination Röhrchen-Schnelllysemethode
Schlussfolgerung:
Testen Sie Ihre vorgegebene Ohrstanze mit verschiedenen Schnelllysemethoden an Hand von nicht gefrorenen PI-Ohren aus, einschließlich Lagerungsversuch über mehrere Wochen bei 2-8° / RT / 37°
Unter Berücksichtigung des FLI-Standards kann ggf. ein Grenzwert PI / NPI für diese Methodenkombination laborspezifisch erstellt werden!
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Unser Dank gilt:
Doris Göbel, Christine Müller-Boushaba
Amt für Landwirtschaft und Forsten AnsbachBayerisches Staatsministerium für Umwelt und Gesundheit
Bayerische TierseuchenkasseLandeskuratorium der Erzeugerringe für tierische Veredelung in Bayern e. V.
Rinderzuchtverband Mittelfranken
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 37
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
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