analytische chemie -
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14.11.2007 AC – BPBS HS07 1
Analytische Chemiefür Biologie Pharmazie Bewegungs-
wissenschaften und Sport
Teil Chromatographische undElektrophoretische Trennverfahren
LC / HPLC
14.11.2007 AC – BPBS HS07 2
LC / HPLCHigh-Pressure-Liquid-Chromatography
High-Performance-Liquid-Chromatography
High-Price-Liquid-Chromatography
Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie
HPLC vs GC
Apparatur
Theorie
Mobile Phase
Säule und Stationäre Phase
Unterarten HPLC
Detektoren
Dünnschichtchromatographie
Walh einer Methode
14.11.2007 AC – BPBS HS07 3
Warum HPLC ?• GC: nur Trennung von Substanzen, die sich bis ca. 300°C
unzersetzt verdampfen lassen
• Sehr polare und thermisch labile Substanzen
• Ionische Verbindungen, Biopolymere und Polymere
• Selektivität hängt ...... ab
! von der stationären Phase
! von der mobilen Phase (Polarität, Gradientselution)
• Stofftransport in flüssiger Phase ist deutlich langsamer
(kleinere Diffusionskoeffizienten), Hochdruck ist nötig
• Analytische, Präparative und Produktive
14.11.2007 AC – BPBS HS07 4
Scheme HPLC
300 – 400 bar
LM 10 ml/min
Trennsäule
LM Aufteilungsvalve
He/Ar
LM Behälter
Detektor
Injektorvalve
Vorsäule
Pumpe
14.11.2007 AC – BPBS HS07 5
Apparatur
6-port-Valve Injektor
Eluentvorrat (Entgaser, Aufteilungsvalve)
Pumpe (reproduzierbar und konstant Druck)
Injektor (bestimmte Menge zur Säule)
Filter/Vorsäule (fein Partikel in LM und Probe)
Säule
Detektor
Vor- und Nach-derivatisierungsteile
14.11.2007 AC – BPBS HS07 6
Klassische Theorie
!
K =A[ ]
S
A[ ]M
!
v =L
tR
!
u =L
tM
!
k = KVs
VM
!
k =tR" t
M
tM
=tR
'
tM
!
" =K
B
KA
!
" =kB
kA
!
" =(tR
')B
(tR
')A
!
N = Neff "k +1
k
#
$ %
&
' (
2
=tR'
)
#
$ %
&
' (
2
"k +1
k
#
$ %
&
' (
2!
N =L
H=tR
2
" 2=16
tR
w
#
$ %
&
' (
2
!
tR
'= t
R" t
M
Trennfaktor / Selektivätsfaktor
Retentionsfaktor / Kapazitätsfaktor
Retentionszeit / Geschwindigkeit
Verteilungskoeffizient
Auflösung!
H =L
16
w
tR
"
# $
%
& '
2
Bodenzahl und Bodenhöhe
!
R =tB" t
A
wB
+ wA
2
=2(t
B" t
A)
wB
+ wA
!
R =" #1
"
$
% &
'
( ) *
kB
1+ kB
*N
4
14.11.2007 AC – BPBS HS07 7
Van Deemter Gleichung
Minimaler H-Wert
Theore
tische B
odenhöhe H
!
H = 2" # dp +2kD #DM
u+ u #
f (dp2,dc
2)
DM
+q # k # d f
2
(1+ k)2DS
oder2td # k
(1+ k)2
$
% &
'
( )
optimale u
Minimum H
A B C
14.11.2007 AC – BPBS HS07 8
Mobile PhaseReinheit, Siedepunkt, Preis
Inert, Korrosionsbeständigkeit, Toxizität
UV–Durchlässigkeit, Brechungsindex
Mischbarkeit
Puffer
Haltbarkeit
! Viskosität
! Elutionsstärke
! Selektivität
Isokratische Trennung: Eluent bleibt
während des Laufs unverändert.
Gradiententrennung: Eluent wird
während des Laufs verändert.
14.11.2007 AC – BPBS HS07 9
Stationäre Phasen
Unpolare Analyten erst eluiert Polare Analyten erst eluiert
14.11.2007 AC – BPBS HS07 10
Stationäre Phase
Si
O
OH
O Si
Si
O
OH
O Si
O
OH
OH
SiSi O OO Si
OH
OH
OH
single silanol group
two silanol group
three silanol group
SiO2: ideale SP, aber ...
Polymere: Copolymer von Styrene
und Divinylbenzene
! Partikelgrösse, Form und Grössenverteilung
! Porosität, Porengrösse, Oberfläche und Volumen
! Poröse und Nichtporöse
! Stärke (mechanische) gegen Druck und LM (Bruch und Deformation))
Physikalische Eigenschaften:
14.11.2007 AC – BPBS HS07 11
Modifikation der SP
Si
OH
Si
R2
ClR
R1Modifikation:
Si
R1
R2
R
Si
O
SiOH HN[Si(CH3)3]2
Entcapping:
Si(CH3)3SiO
14.11.2007 AC – BPBS HS07 12
Normale (Polare) Phase
Original SiO2, Al2O3: Polare OH-Gruppe
Modifizierte polare NP:
O Si
R1
R2
CN O Si
R1
R2
NH2
O Si
R1
R2
O OH
OH
Cyano (C3–CN)
Amino (C3–NH2)
Diol (C3–OCH2CH(OH)CH2(OH)
14.11.2007 AC – BPBS HS07 13
Modifizierte NP-Säule
Nonpolare Mobile Phase
z.B., Kohlenwasserstoff
Hydrophile Eigenschaft
14.11.2007 AC – BPBS HS07 14
Umkehrphase (RP)
O Si
R1
R2
R
R = C1 – C18
Straight-chain hydrocarbons (C18, C12, C8 C6, C4, C3, C2, C1))
Cyclohexyl, phenyl, alkylphenyl
O Si
R1
R2
O Si
R1
R2
O Si
R1
R2
Unpolare Modifikation durch Kohlenwasserstoffketten
14.11.2007 AC – BPBS HS07 15
Umkehrphase (Reversed Phase, RP)
Si
CH3
CH3
(CH2)17R = CH3
Hydrophobe Eigenschaft
14.11.2007 AC – BPBS HS07 16
Unterarten der HPLC
" Adsorptions-Chromatographie
" Verteilungs-Chromatographie
" Umkehrphasen-Chromatographie (RP)
! Ionenaustausch-Chromatographie (IEC)
! Ionenpaaren-Chromatographie
! Grössenausschluss-Chromatographie (GPC)
# Affinitäts-Chromatographie
# Komplexierungschromatographie
# Chirale Chromatographie
14.11.2007 AC – BPBS HS07 17
Adsorptionschromatographie
Elutrope Reihe:
Hexan < Cyclohexan < Toluol <Dichlormethan< Tetrahydrofuran < Acetonitril < Ethanol <Methanol < Wasser
Probenmoleküle Reihenfolge:
Fluorierte, gesättigte Kohlenwasserstoffe
< gesättigte Kohlenwasserstoffe
< Aromaten < halogenierte Verbindungen
< Äther < Nitrile < Nitroverbindung < Ester
< Ketone < Aldehyde < primäre Amine
< Amide < Phenole < Carbonsäuren
Präparative Trennung im Labor
Feste stationäre Phase
14.11.2007 AC – BPBS HS07 18
Verteilungschromatographie
Flüssige
stationäre
Phase
Nur chemisch-verbundene flüssige Filme
14.11.2007 AC – BPBS HS07 19
Wechselwirkungsmechanismus
schwach
stark
schwach
stark
Hydrophob
Hydrophil
Dipol-Dipol
14.11.2007 AC – BPBS HS07 20
Ionenchromatographie (IC)
$ Ionenaustauschchromatographie (Ion Exchange Chromatography)
$ Ionenpaarchromatographie (Ion Pair Chromatography)
$ Ionenausschlusschromatographie (Ion Exclusion Chromatography)
Schnelligkeit, Empfindigkeit, Selektiivität, und Simultanität
Organische Polymere als Trägermaterial, hohen pH-Stabilität; frei vom
ionische Verunreinigungen aus Edelstahl und korrosive Elutionsmittel
zu vermeiden
Detektor – Leitfähigkeitsdetektor häufig, aber alle andere Detektoren
auch einsetzen können
Suppressor: Reduktion der Grundleitfähigkeit auf minimalen Wert und
Erhöhung des Signal/Untergrund Verhältnisse
Mobile Phase: Wasser oder Puffer (mit pH)
14.11.2007 AC – BPBS HS07 21
Ionenaustauschchromatographie (IC)
Stationäre Phase mit funktionellen Gruppen
• SO3–H+ (Sulfonsäure): stark saurer Kationenaustauscher, pH 2 – 14
• COO–H+ (Carbonsäure): schwach saurer Kationenaustauscher, pH 8 – 14
• NR3+OH– (quaternäres Amin): stark basischer Anionenaustauscher, pH 0 – 10
• NR2 (tertiäres Amin): schwach basischer Anionenaustauscher, nur bei
niedrigem, pH 0 – 6.
14.11.2007 AC – BPBS HS07 22
Ionenaustauschschromatographie
Beispiel stark saurer Kation-
enaustauscher:
Harz-SO3H + M+(aq) ! Harz-
SO3M + H+(aq)
Der Selektivitätskoeffizient S
für den Austausch zweier
verschiedener Metallionen ist
gegeben durch den
Quotienten der entsprechend-
en Gleichgewichtskonstanten
K:
S(M1/M2) = K(M1)/K(M2)
More highly charged
molecules are more
tightly bound to the
resin, and so travel
slowly and are eluted
later.
Moderately charged
molecules equilibrating
between the resin and
the moving buffer more
readily.
Less charged molecules
bind less strongly to the
resin, equilibrate with
the moving buffer more
readily, and so travel
rapidly and are eluted
faster.
14.11.2007 AC – BPBS HS07 23
Elutionsreihenfolge
Elutionsreihenfolge für Kationen:
Ba2+ < Ca2+ < Zn2+ < Mg2+ < Cs+ < Rb+ < K+ < NH4+ < Na+ < H+ < Li+
Elutionsreihenfolge für Anionen:
Citrat (COO–)3 < Sulfat < Oxalat (COO–)2 < Iodid < Nitrat (NO3–) <
Phosphat < Bromid < Nitrit (NO2–) < Chlorid <Acetat < Hydroxid
MP: Wasser, Puffer (gewisser pH-Werte einstellen)
Leitfähigkeitsdetektor mit Supressionsäulen
14.11.2007 AC – BPBS HS07 24
Ionenpaar-Chromatographie
Um die organische grösse Ionen zu Trennen:
ein Ionenpaarbildner (sogenanntes Gegenion) als Hilfskomponente
wird der mobilen Phase zugesetzt, um neutral Ionenpaar zu bilden,
dann kann man die Umkehrphasen-Säule benutzen.
$ das Anion der Heptansulfonsäure für kationische Proben
$ das Tetrabutylammoniumion (Phosphat) für anionische Proben
14.11.2007 AC – BPBS HS07 25
Trennung – Nucleotidegemisch
Mixture of nucleotides
resolved by IPC
Mixture of biogenic amines:
1. Adrenaline
2. Dopamine
3. Tyramine
4. Tryptamine
Buffer: 0.005 M heptanesulfonic acid
sodium/0.01 M phosphoric acid pH 2.4
Weigh-in: ~ 2 mg in 10 ml
acetonitrile/phosphoric acid (0.01 M) 1:9;
Injection volume: 20 µl
Detection: 220 nm; Temperature: ambient
DiscoveryTM C18 (RP): 250/4.0 mm, ID 5 µm
Eluent: acetonitrile, Flow: 1.5 ml/min, gradient:
t=0 min : 6%, t=5 min : 6%, t=18 min : 25%
Heptanesulfonic acid
14.11.2007 AC – BPBS HS07 26
Ionenausschluss
14.11.2007 AC – BPBS HS07 27
Vorteile der Ionenchromatographie$ Schnelligkeit
für Analyse der wichtigsten 7 anorganischen Anionen benötigt man heute nur noch
3 Minuten – Bruchteil der Zeit, die für traditionelle nasschemische Methoden
aufgewendet werden muss
$ EmpfindlichkeitNachweis von Konzentrationen im mittleren und unteren ppb-Bereich ohne
Voranreicherung routinemäßig (Absolutmengen im untersten ng-Bereich), bei
Aufkonzentrierung können NWG bis auf 10 ppt gesenkt werden
$ Selektivitäterreichbar durch Auswahl geeigneter Trenn-und Detektionssysteme.
Probenvorbereitung besteht oft nur aus Verdünnung und Membranfiltration der
Proben
$ Simultane Bestimmungenwerden durch Vorliegen extremer Konzentrationsverhältnisse begrenzt
$ Stabilität der Trennsäulenhohe pH-Stabilität der verwendeten Polymere, vertragen auch verdünnte Säuren
und Basen, sind aber gegenüber organischen Lösungsmitteln empfindlich; hohe
Unempfindlichkeit gegenüber komplexen Matrices
14.11.2007 AC – BPBS HS07 28
GelpermeationschromatographieGrössenausschluss-Chromatographie/Size Exclusion Chromatography
Mechanismus: Grösse / Molekularer Radius
SP:
5 – 100,000 nm
Ausschluss-Limit
Eindringen-Limit
Geeignet für
10% Unterschied in MW
Kein Wechselwirkung
Biopolymer, Polymer
Organische Moleküle
14.11.2007 AC – BPBS HS07 29
14.11.2007 AC – BPBS HS07 30
Größenausschlusschromatographie
!
tR"
1
log10 MW
CH3(CH2)nCOOH
14.11.2007 AC – BPBS HS07 31
Dünnschichtchromatographie (HPTLC)
DC-laufmitteltest
Wahl der DC Platte
Probeauftragen
Laufmitteltest
Entwicklung
Detektion
Normal Silica / Alumina TLC, HPTLC plates C 18-50 (50% silanization)
and C 18-100 (100% silanization) with fluorescent indicator
14.11.2007 AC – BPBS HS07 32
Entwicklung der DC
Laufmittel
Wahl des Laufmittels
(Rein oder Gemisch)
Entwicklung
14.11.2007 AC – BPBS HS07 33
Selektivität und Trennleistung
!
Rf =Sx
S f
Auswertung
14.11.2007 AC – BPBS HS07 34
Detektoren für HPLC
• Brechungsindex-Detektor (RID)
• UV/Vis-Absorption-Detektor (UVD)
• Lichtstreudetektor (ELSD)
• Fluoreszenzdetektor
• Elektrische Leitfähigkeitsdetektor (für Ionen)
• Massenspektrometrie (MS): molekulare Information
• IR, NMR
$ Nachweisgrenze
$ Linearer Messbereich
$ Kompatibilität mit der mobilen Phase
$ Selektivität
$ Flexibilität, Robustheit, Preis
14.11.2007 AC – BPBS HS07 35
Brechungsindex-Detektorrefractive index detectors, RID
Universell, aber geringe Empfindlichkeit
wegen kleiner RID-Unterschied von LM
und Analytenmolekülen
14.11.2007 AC – BPBS HS07 36
Verdampfungs-Lichtstreudetektor ELSD
EBULIZE ELUENT AND
SELECT SMALL
DROPLETS TO MINIMIZE
BACKGROUND NOISE
EVAPORATE AT LOW
TEMPERATURE
DETECT LIGHT
SCATTERING
Universell einsetzbarer Detektor, wenn
• Analytmolekül keine UV-Absorbtion
• Mit einem Brechungsindex-Detektor
nicht detektierbar
• Eine Gradientenelution anstatt
isokratischen Laufmittel Partikelgrösse
und -anzahl
Partikelgrösse und -anzahl
14.11.2007 AC – BPBS HS07 37
Beispiel mit ELSD als Detektor
RP–Säule:a hydrophobic chain andan acidic functional groupas a cation exchanger
14.11.2007 AC – BPBS HS07 38
UV/vis-Detektor
Variiert ! oder PDA
(Photodiodenarray)
um ein ganzes UV-
Spektrum aufzu-
nehmen
Br, I, S
Carbonyl
Konjugierte
Aromatische
14.11.2007 AC – BPBS HS07 39
Fluoreszenzdetekor
Nachweisgrenze +++
Linearbereich +++
Nur einsetzbar für:
• Nativ
fluoreszierenden
Substanzen
• Nach derivati-
sierung nicht-
fluoreszierender
Analyten mit einem
Fluoreszenz-
marker
14.11.2007 AC – BPBS HS07 40
Massenspektrometrische Detektor
Interface – LC und MS
Senkrecht
Off-linearräumlich
zeitlich
14.11.2007 AC – BPBS HS07 41
Leitfähigkeitsdetektor
• Universell für Ionenchromatographie
• Grundleitfähigkeit des Eluenten wird durch Suppressortechnik
erniederigt, um die Nachweisgrenzen zu senken.!
" = "0# $ % C
Harz-NR3OH + H+ + Cl– ––> Harz-Cl + H2O
Harz-SO3H + Na+ + HCO3
– ––> Harz-Na + H2CO3
Für Kationenanalytik, Suppressorsäule mit OH– beladen :
Für Aionenanalytik, Suppressorsäule mit Protonen beladen:
Harz-SO3H + Na+ + Cl– ––> Harz-Na + H+
+ Cl–
Harz-SO3H + Na+ + Br– ––> Harz-Na + H+
+ Br–
14.11.2007 AC – BPBS HS07 42
Suppressor
Suppressor
Harz-SO3H + Na+ + HCO3
– ––> Harz-Na + H2CO3
Harz-SO3H + Na+ + Cl– ––> Harz-Na + H+ + Cl
–
Harz-SO3H + Na+ + Br– ––> Harz-Na + H+ + Br
–
Grundleitigkeit zu erniedrigen
Analyt-signal zu verstärken
" (H+) = 350
" (Na+) = 50
Beispiel von Cl– and Br
–
14.11.2007 AC – BPBS HS07 43
Charakteristika der Detektoren
Detektor Nachweisgrenze Linearer Bereich
Spezielle Eigenschaften des Analytmoleküls oder Bulk-Eigenschaften
von Analytmolekül und Lösungsmittel: Nachweisgrenze, Linearer
Messbereich, Kompatibität mit MP, Selektivität, Flexibilität und
Robustheit, Preis.
10510–12 – 10–15 gICP-MS
10310–9 – 10–12 gAAS
10510–7 – 10–9 gMS
10510–8 g.mL–1Leitfähigkeit
10510–14 gFluoreszenz
10410–11 gUV/Vis
14.11.2007 AC – BPBS HS07 44
Trennstrategie (1)
$ Polarität
$ Löslichkeit
$ Ionenisch
$ Molekulare Masse
Auswahl: Flüssig-chromatographie
NP RP
Ausschluss
14.11.2007 AC – BPBS HS07 45
Trennstrategie (2)• Auswahl: Gradient-Elution
• Derivatisierung:
Online: Vor- (für höhe Trennleistung) und Nach- (mit UV/Fl Marker fürselektive und empfindliche Detektion )
Offline: bei der GC für flüchtig und zu schwer
• Schnell, sauber, Reagenzien mischbar mit MP, Produkte löslich in MP
14.11.2007 AC – BPBS HS07 46
Derivatisierungsreagenzien
Häufig verwendete Derivatisierungsreagenzien in der HPLC:
Funktionelle Gruppe Derivatisierungsreagenz
-NH2 (Amine, Aminosäuren) 5-(N,N-Dimethylamino)-
naphthalin-1-sulphonylchlorid
2,4-dinitrofluorbenzol
-OH (Alkohole) 3,5-Dinitrobenzochlorid
Silylierungsreagenzien
-CHO (Aldehyde) 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH)
-C(O)R (Ketone) 4-Hydroazino-7-nitrobenzofurazan
-COOH (Säuren) 4-Brommethyl-7-methoxycoumarin
-SH (Thiole) Dansylaziridin
14.11.2007 AC – BPBS HS07 47
Einfluss der Eluentenpolarität
14.11.2007 AC – BPBS HS07 48
Complex Mixture of Acids, Bases,
Amino Acids, and Neutral Compounds
RP/IC Säule
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