barrieren der organe – die intelligenten grenzen des körper (tight junctions)
Post on 03-Jan-2016
28 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
Barrieren der Organe – die intelligenten Grenzen des Körper (Tight Junctions)
12.02.2010
Susanne Krug
Institut für Klinische Physiologie
Campus Benjamin Franklin, Charité Berlin
DFG-Forschergruppe 721
Gliederung
Der transepitheliale Widerstand
Chopstick-Elektroden
Die Ussing-Kammer
Impedanzspektroskopie: Ein-Wege-Impedanzspektroskopie Zwei-Wege-Impedanzspektroskopie
Conductance Scanning (Voltage Scanning)
Zusammenfassung
Der transepitheliale Widerstand
- Transepithelialer Widerstand (Rt, TER) gibt Kehrwert aller Ionenpermeabilitäten an
- Kehrwert = transepitheliale Leitfähigkeit (Gt) Einheit: mS/cm²
- allgemeine Rt-Bestimmung:- Anlegen eines Stromimpulses I Spannungsänderung V Ohm'sches Gesetz: R = V / I
beeinhaltet Widerstände des Epithels, der Bad-lösung, des Subepithels, bzw. Supports
Einheit: cm²
- Gt ist proportional zur Fläche mit Flächenzunahme sinkt Rt
[mmol/l]
Chopstick-Elektroden- Anlegen zweier Elektrodenpaare (I-Amplikation; V-Messung) + einfache und schnelle Messung Screening der Konfluenz
und Widerstandsentwicklung+ beliebig oft wiederholbar- positionsabhängige Werte (Nähe zu Zellen; Rand vs. Mitte)- ungerührte Lösung Konzentrationsgradienten
Beeinflussung von Fluxen und resultierenden Permeabilitäten
- AC-Strom-betrieben Kurzschluss der ohm'schen Zellelemente unterschätzter Rt
(- nicht-temperierte Platten keine Langzeitmessung möglich)
Die Ussing-Kammer
- Vier-Elektrodensystem (I-Amplikation; V-Messung)
- Generation eines fast homogenen Stroms (DC-Strom) wirkt auf gesamten Zelllayer
- V wird nahe der Probe detektiert
- Begasung Badlösung permanent durchmischt Versorgung des Epithels mit O2 und CO2
Langzeitexperimente möglich
- Kurzschluss-Technik (ISC) über Spannungsklemme:
- V wird auf 0 V geklemmt
- Aktiver Transport, z.B. Na+ ISC
Beispiel: Transport am Rindercolon
AMIL (mu) = Amilorid hemmt Aldosteron-abhängige Na+-Aufnahme (ENaC)
Ba++ (mu) hemmt K+-Ausstrom
THEO (bds.) = Theophillin cAMP-Anreicherung Stimulation der Cl–-Sekretion
FURO (se) = Furosemid Inhibition der Cl--Sekretion (Na+K+2Cl–-Symporter)
Hegel et al., 1993, Am. J. Physiol.
Biologisches Modell:6-Parameter
Zusammengefasstes
Modell:3-Parameter
Ein-Wege-Impedanzspektroskopie
Impedanzmessung bei Wechselstrom (AC-Messung; 1 Hz bis 65 kHz):- Frequenz 0: Kondensator Cepi ist nicht
leitfähig Repi + Rsub = "TER" - Frequenz : Kondensator Cepi ist leitfähig,
so dass Widerstand Repi kurzgeschlossen ist nur Rsub
Rsub
ZreZ
im
Z = Rsub Z 0 = Rsub + Repi
C = 1/(|Zim|maxRepi)
ZreZ
im
Z = Rsub Z 0 = Rsub + Repi
C = 1/(|Zim|maxRepi)
Repi
Beispiel: Morbus Crohn
10 20 30 40 50 60
-30
-20
-10
0
f0: 1.0 kHz
65 kHz 1 Hz
Zim
agin
ary (
· cm
2 )
Zreal
( · cm2)
10 20 30 40 50 60
-30
-20
-10
0
f0: 113 Hz
65 kHz 1 Hz
Zim
agin
ary (
· cm
2 )Z
real ( · cm
2)
Ileum, CTRL
Ileum, Crohn
Entzündung Barriere
Rt (TER): -10%Repi : -50%
Claudin-2 : Claudin-5 : Claudin-8 :
Zeissig et al., 2004, GutZeissig et al., 2007, Gut
Ziel: Direkte Messung des para- und transzellulären Widerstands
Zwei-Wege-Impedanzspektroskopie
Biologisches Modell:6-Parameter
Zusammengefasstes
Modell:4-Parameter
Krug et al., 2009, Biophys. J.
Messung von zwei zusätzlichen Parametern:1. Rpara-Perturbation EGTA Ca2+-Switch
2. Quotient der Permeabilitäten für einen parazellulären Marker vor und nach Rpara-Perturbation, z.B. für Fluorescein
Rsub
Repivor EGTA
Repinach EGTA
EGTA
Zwei-Wege-Impedanzspektroskopie
Biologisches Modell:6-Parameter
Zusammengefasstes
Modell:4-Parameter
Messung von zwei zusätzlichen Parametern:1. Rpara-Perturbation EGTA Ca2+-Switch
2. Quotient der Permeabilitäten für einen parazellulären Marker vor und nach Rpara-Perturbation, z.B. für Fluorescein
Ziel: Direkte Messung des para- und transzellulären Widerstands
Zwei-Wege-ImpedanzspektroskopieVoraussetzung: Linearer Zusammenhang zwischen Flux des Markers und Leitfähigkeit Muss für jede Zellart zuvor validiert werden
JkGGGG transparatransepi
- Änderungen von Rtrans Verschiebung entlang der y-Achse - Änderungen von Rpara Steigungsänderung
nach
epivor
epinachvor
nachvornachepi
vorepi
para
RRJJ
JJRRR
1
transepipara GGG
Beispiel: Claudin-10b
Günzel et al., 2009, J. Cell Sci.Krug et al., 2009, Biophys. J.
IV IX X
0
1
2
3
4
5
6
7
0
5
10
15
20
25
30
35
40
wt vector 1 #21 #23 YFP #1 #4
MDCK-C7 control cldn-10-1 cldn-10-1 cldn-10-2 cldn-10-2 cldn-10-2
Human Human Human Human Human
Px
[1
0-3 c
m/h
]
Li
Na
K
Rb
Cs
Px (1
0-6cm
/s)
Kontrolle CLDN2 Cldn10b
Eisenman-Seq.
IV IX X
0
1
2
3
4
5
6
7
0
5
10
15
20
25
30
35
40
wt vector 1 #21 #23 YFP #1 #4
MDCK-C7 control cldn-10-1 cldn-10-1 cldn-10-2 cldn-10-2 cldn-10-2
Human Human Human Human Human
Px
[1
0-3 c
m/h
]
Li
Na
K
Rb
Cs
Px (1
0-6cm
/s)
Kontrolle CLDN2 Cldn10b
IV IX X
0
1
2
3
4
5
6
7
0
5
10
15
20
25
30
35
40
wt vector 1 #21 #23 YFP #1 #4
MDCK-C7 control cldn-10-1 cldn-10-1 cldn-10-2 cldn-10-2 cldn-10-2
Human Human Human Human Human
Px
[1
0-3 c
m/h
]
Li
Na
K
Rb
Cs
Px (1
0-6cm
/s)
Kontrolle CLDN2 Cldn10b
Eisenman-Seq.
- Cld10b in MDCK C7 transfiziert Kationenpore
- linearer Zusammenhang von Gepi zu PX
sowohl für Na+ als auch Cl- und Fluorescein mit gleichem Gtrans
- PNa > PCl > PFluorescein
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 10 20 30 40
PX (10-3 cm/h)
Ge
pi (
mS
/cm
2)
Fluorescein Chloride Sodium
PFluo PCl PNaG
ep
i
Beispiel: Forskolin
- apikale Gabe von Forskolin Änderung der apikalen Membran (Doppelbogen)
Rtrans verändert
- zusätzliche EGTA-Gabe Rpara verändert
-500
-400
-300
-200
-100
0
0 200 400 600
Zre [ cm2]
Zim
[
cm
2]
control forskolin
Conductance-Scanning (Voltage Scanning)
Köckerling & Fromm, 1992, Am. J. Physiol.Gitter et al., 1997, Pflügers Arch.
Variable Auflösung: gering: Ulcus-Bereiche
Single-cell wound repairColonoberfläche / Krypten Focal leaks (durch Bakterien)
ApoptosenHoch: trans- / parazellulär
- Messung lokaler Unterschiede der Strom- dichte über der apikalen Membran
- AC-Clamp (200 µA/cm², 24 Hz)
- detektierte Signale im µV-Bereich
- Berechnung des Leitfähigkeitsverteilung über best-fit-Algorithmen
Beispiel: MDCK C11-Zellen
TJ
Gitter et al., 1997, Pflügers Arch.
MDCK-C11 cellsGc 2.6 mS/cm2 = Rtrans 385 cm2 Gpara 10.5 mS/cm2 = Rpara 95 cm2
Gepi 13.1 mS/cm2 = Repi 76 cm2
genauere Rt-Bestimmung: Ussing-Kammer
Bestimmung Repi und Rsub: Ein-Wege-Impedanzspektroskopie
Rt = Repi + Rsub
Bestimmung Rtrans und Rpara: Zwei-Wege-Impedanzspektroskopie
Gepi = Gtrans + Gpara = Gtrans + k JFluorescein
1/Repi = 1/Rtrans + 1/Rpara
Räumliche Lokalisation: Conductance-Scanning
Zusammenfassung
grobe Rt-Bestimmung: Chopstick-Elektroden
Hans UssingKopenhagen1911 - 2000
Dorothee Günzel
Detlef Sorgenfrei
Michael Fromm
Salah Amasheh
Institut für Klinische Physiologie
top related