bedeutung von corticotropin-releasing hormon für die · der trophoblast entwickelt sich zur...
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Aus der Kinder- und Jugendklinik der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med. Dr. h. c. Wolfgang Rascher
Bedeutung von Corticotropin-releasing Hormon für die
Leptinexpression und die Synzytialisierung von primären humanen
Trophoblasten
Inaugural-Dissertation zur Erlangung des medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität zu Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Ramona Offergeld
aus
Erlangen
2012
2
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen--ürnberg
Dekan: ............................................................ Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler Referent: ...................................................... Prof. Dr. med Dr. h.c. Wolfgang Rascher
Korreferent: ............................................................ Prof. Dr. rer. nat. Andrea Hartner
Tag der mündlichen Prüfung:................................................................... 27.11.2012
3
Meinen Eltern, Jutta und Werner Offergeld
und meiner Schwester Tanja Offergeld.
4
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung ................................................................................................... 6
1.1 Hintergrund und Ziele ...................................................................................... 6
1.2 Methoden .......................................................................................................... 6
1.3 Ergebnisse und Beobachtungen ........................................................................ 6
1.4 Praktische Schlussfolgerung ............................................................................ 7
2 Abstract ................................................................................................................... 8
2.1 Objective .......................................................................................................... 8
2.2 Methods ............................................................................................................ 8
2.3 Results .............................................................................................................. 8
2.4 Conclusion ........................................................................................................ 9
3 Einleitung .............................................................................................................. 10
3.1 Plazenta und intrauterine Wachstumsrestriktion ............................................ 10
3.2 Fetale Programmierung .................................................................................. 15
3.3 CRH ................................................................................................................ 16
3.4 Fragestellung .................................................................................................. 19
4 Methoden ............................................................................................................... 19
4.1 Isolierung humaner Trophoblasten ................................................................. 19
4.2 Trophoblastenstimulation ............................................................................... 20
4.3 RNA-Extraktion ............................................................................................. 23
4.4 Photometrie .................................................................................................... 24
4.5 Gelelektrophorese ........................................................................................... 25
4.6 Reverse Transkription .................................................................................... 27
4.7 TaqMan-Real-Time-PCR ............................................................................... 28
4.8 ELISA ............................................................................................................. 32
4.8.1 LDH-ELISA ............................................................................................ 32
4.8.2 ßhCG-ELISA ........................................................................................... 34
4.9 Statistische Datenauswertung ......................................................................... 35
5 Ergebnisse ............................................................................................................. 35
5.1 RNA-Extraktion ............................................................................................. 35
5.1.1 Photometrie ............................................................................................. 35
5.1.2 Gelelektrophorese.................................................................................... 35
5.2 TaqMan-Real-Time-PCR ............................................................................... 36
5.2.1 Stimulation der Trophoblasten mit CRH ................................................. 36
5.2.1.1 Leptin-Expression unter CRH-Stimulation ...................................... 36
5.2.1.2 11ßHSD-2-Expression unter CRH-Stimulation ............................... 38
5.3 ELISA ............................................................................................................. 39
5.3.1 LDH-Assay.............................................................................................. 39
5.3.2 ßhCG-ELISA ........................................................................................... 41
6 Diskussion ............................................................................................................. 42
6.1 Diskussion der Methoden ............................................................................... 42
6.1.1 Trophoblastenisolierung .......................................................................... 42
6.1.2 RNA-Extraktion ...................................................................................... 42
6.1.3 TaqMan-Real-Time PCR ......................................................................... 43
6.2 Ergebnisse ...................................................................................................... 43
6.2.1 Zelldifferenzierung und Zelltod .............................................................. 43
6.2.2 Leptin-Expression unter CRH-Stimulation ............................................. 44
6.2.3 11ßHSD-2-Expression unter CRH-Stimulation ...................................... 46
6.3 Ausblick ......................................................................................................... 46
5
7 Literaturverzeichnis ............................................................................................ 48
8 Abkürzungsverzeichnis ....................................................................................... 56
9 Danksagung ......................................................................................................... 59
10 Lebenslauf .....................................................Fehler! Textmarke nicht definiert.
6
1 Zusammenfassung
1.1 Hintergrund und Ziele
Die hier vorgestellte Arbeit untersucht den Einfluss des plazentaren Corticotropin-
releasing Hormon (CRH) auf villöse humane Zytotrophoblasten. Als trophoblastäres
Hormon steuert CRH den physiologischen Schwangerschaftsablauf. Pathologische
plazentare Veränderungen, wie sie bei intrauteriner Wachstumsrestriktion (IUGR)
beobachtet werden, sind mit erhöhten CRH Spiegeln assoziiert. Ätiopathologisch ist
bekannt, dass CRH einen negativen Einfluss auf die Plazentation ausübt. Ungeklärt
bleibt hingegen die Wirkung von CRH auf die Expression bereits bekannter IUGR-
Markergene Leptin und 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase-2 (11ßHSD-2), sowie
sein Einfluss auf die synzytiale Integrität, welche bei IUGR verringert ist.
1.2 Methoden
Die Gewinnung primärer villöser Zytotrophoblasten aus gesunden Dritt-Trimester-
Plazenten erfolgte via mechanischer Isolation mittels Percoll-Dichtegradienten. Die
in Nährmedium angezüchteten Trophoblasten wurden mit CRH (1µg/ml) für 6h, 12h,
24h, 48h und 72h stimuliert und anschließend die relative Genexpression von Leptin
und 11ßHSD-2 mittels RT-PCR gemessen. Das Stadium der Differenzierung und die
Vitalität der villösen Zytotrophoblasten zu den jeweiligen Zeitpunkten wurde durch
die Messung der Konzentrationen von β-humanem Chorion Gonadotropin (ßhCG),
sowie der Laktatdehydrogenase (LDH) im Kulturüberstand mittels ELISA bzw. In
Vitro Toxicology Assay überprüft.
1.3 Ergebnisse und Beobachtungen
Im Einzelnen ergaben sich folgende Ergebnisse am in vitro Modell des villösen
Zytotrophoblasten:
1) CRH erhöhte die Leptin-Expression signifikant nach 48h Stimulation
(p<0,05).
2) CRH zeigte keinen signifikanten Einfluss auf die 11ßHSD-2-Expression.
3) CRH hatte keinen toxischen Einfluss auf trophoblastäre Zellen.
4) CRH hatte keinen Einfluss auf die ßhCG-Sekretionsrate.
7
1.4 Praktische Schlussfolgerung
Die Stimulation primärer humaner Trophoblasten mit CRH induziert direkt die
Expression von Leptin in vitro. Ein indirekter Effekt von CRH auf die
Leptinexpression über die Induktion trophoblastärer Differenzierung zu
sekretorischem Synzytium (gemessen an der ßhCG-Sekretionsrate) war nicht
nachweisbar. Diese Ergebnisse lassen auf eine Interaktion dieser Hormone an der
feto-maternalen Grenzfläche schließen.
Wir entwickelten daher folgende Überlegungen:
1) Neben seinem bekannten maternal endokrinen Einfluss zeigt CRH auch auto-
und parakrine Effekte am plazentaren Synzytiotrophoblasten.
2) Störungen plazentarer Synzytialisierung, wie zum Beispiel bei IUGR, gehen
mit einer erhöhten CRH Sekretion in vivo einher, wobei CRH nach unseren
Befunden in vitro nicht ursächlich für diese Integritätsstörung zu seien
scheint.
3) Sekundäre Effekte durch CRH induziertes Leptin auf die Synzytialisierung,
sowie von CRH auf bereits ausdifferenziertes Synzytium sind zum
derzeitigen Stand unserer Untersuchungen jedoch nicht gänzlich
auszuschließen.
8
2 Abstract
2.1 Objective
The presented study analyzes the influence of the placental corticotropin-releasing
hormone (CRH) on human villous cytotrophoblasts. As a trophoblastic hormone
CRH controls physiologic processes during pregnancy. Pathologic placental changes,
as observed during intra-uterine growth restriction (IUGR), are associated with
increased CRH levels. CRH exerts a negative influence on placentation. The
influence of CRH on the expression of the known IUGR marker-genes leptin and
11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2 (11ßHSD-2) remains unknown. Moreover the
role of CRH for the maintenance of syncytial integrity, a process dysregulated IUGR,
remains to be elucidated.
2.2 Methods
Primary human cytotrophoblasts from healthy third term placentas were isolated
using the established dispase/percoll method. After seeding in culture medium,
trophoblasts were stimulated with CRH (1µg/ml) for 6h, 12h, 24h, 48h and 72h.
Subsequently the relative gene expression of leptin and 11ßHSD-2 was determined
by RT-PCR. The state of differentiation and vitality of villous cytotrophoblasts at the
different time points were assessed by measuring the concentrations of β-human
chorion gonadotropin (ßhCG) and of lactate dehydrogenase (LDH) using ELISA or
in vitro toxicology assay techniques, respectively.
2.3 Results
The in vitro model of the villous cytotrophoblast showed following results:
1) CRH significantly increased the leptin expression after 48h of stimulation
(p<0.05).
2) CRH showed no significant influence on 11ßHSD-expression.
3) CRH had no toxic effects on trophoblastic cells.
4) CRH had no influence on the secretion rate of ßhCG.
9
2.4 Conclusion
The stimulation of primary human trophoblasts with CRH in vitro directly induced
the expression of Leptin. An indirect effect of CRH on leptin expression via the
induction of trophoblast differentiation into secretory syncytium (as measured by the
rate of ßhCG secretion) was not observed. This leads to the assumption of an
interaction between these two hormones on the feto-maternal interface.
Therefore the following aspects have to be taken into final consideration:
1) Beside its maternal-endocrine effects, CRH additionally shows auto- and
paracrine effects on the placental syncytiotrophoblast.
2) Dysregulation of placental syncytialisation, as observed for IUGR e.g., is
associated with an increased rate of CRH secretion in vivo. However our in
vitro results are not indicative of CRH as the causative agent of disturbed
syncytialisation.
3) At this point of our studies secondary effects on the syncytialisation process
through CRH induced leptin cannot be completely excluded. The same
applies for possible effects of CRH on already differentiated syncytium.
10
3 Einleitung
3.1 Plazenta und intrauterine Wachstumsrestriktion
Nach der Implantation der Blastozyste kommt es zur Keimblattdifferenzierung
zweier unterschiedlicher Zellpopulationen: Embryoblast und Trophoblast. Aus dem
Embryoblast entwickelt sich der Embryonalkörper, aus welchem der Fetus
hervorgeht. Der Trophoblast entwickelt sich zur Plazenta, wobei vor allem die frühen
trophoblastären Differenzierungsschritte in der Plazentogenese für die spätere
Funktion des Organs entscheidend sind (Senner et al. 2010). In der
Frühschwangerschaft folgt die trophoblastäre Stammzelle zweierlei funktionellen
Differenzierungswegen und entwickelt sich zu Synzytiotrophoblast und
Zytotrophoblast (Huppertz et al. 2008) (siehe Abbildung 1).
Die Funktion des frühen Synzytiotrophoblasten (SZT) besteht in Invasion und
Arrosion der Dezidua, wodurch es zur Ausbildung von Lakunen kommt, worüber
sich die Frucht initial histiotroph unter hypoxischen Bedingungen ernährt. Bei
zunehmendem embryonalem Wachstum im weiteren Schwangerschaftsverlauf nimmt
der SZT durch Fusion von mononukleären Zytotrophoblasten kontinuierlich an
Austauschfläche zu (Huppertz et al. 1999).
11
Der Zytotrophoblast differenziert zu extravillösen und villösen Trophoblasten.
Villöse Trophoblasten bilden die Plazentazotten, welche den Synzytiotrophoblast bis
zu dessen mütterlicher Seite durchwandern und den ersten Kontakt mit mütterlicher
Dezidua herstellen (Huppertz et al. 2008). Durch Interaktion mit maternaler Matrix
und unter dezidualen Hormoneinflüssen kommt es mit der Ausbildung eines feto-
maternalen Sauerstoffgradienten ab dem zweiten Trimenon zur kontinuierlichen
Differenzierung extravillöser Trophoblasten (epitheliale-mesenchymale
Transformation). Der extravillöse Trophoblast durchsetzt die Dezidua basalis bis zum
Myometrium. Dies ist ein entscheidender Prozess für die Verankerung der Zotten in
uterinem Gewebe (Guibourdenche et al. 2010), sowie für die mütterliche
Immunakzeptanz des fetalen Fremdkörpers. Weiterhin sind extravillöse
Trophoblasten (EVT) entscheidend an der zeitlichen Konzertierung der plazentaren
Sauerstoffversorgung beteiligt: Sie verschließen in der Frühschwangerschaft aktiv
mütterliche Spiralarterien, wodurch ein hypoxisches Milieu für den noch unreifen
SZT hergestellt wird. Dieser Mechanismus schützt den im ersten Trimenon sehr
empfindlichen Synzytiotrophoblast vor zu hohen Sauerstoffkonzentrationen des
maternalen Blutes und der damit verbundene Bildung von toxischen reaktiven
Sauerstoffradikalen (Reactive Oxygen Species (ROS)) (Jauniaux et al. 2000, Watson
et al. 1998).
Bei zunehmendem fetalem Wachstum und adaptierter SZT-Kapazität kommt es im
weiteren Schwangerschaftsverlauf zur bedarfsangepassten Eröffnung mütterlicher
Spiralarterien mit einer konsekutiven Erhöhung des Blutflusses in den intervillösen
Raum. Zudem werden die zu diesem Zeitpunkt englumigen Spiralarterien durch
invasive EVTs in großlumige Gefäße umgebaut. Ab der 12. Schwangerschaftswoche
wird der gesamte intervillöse Raum von mütterlichem Blut umspült (Burton et al.
1999), was eine adäquate Sauerstoff- und Nährstoff-versorgung des
heranwachsenden Fetus gewährleistet (Caniggia et al. 1999, Pijnenborg et al. 2005).
Als Interface zwischen mütterlichem und fetalem Gewebe hat das Synzytium neben
seiner Rolle als Barriere und Gas-/Nährstoffaustauscher eine entscheidende
endokrine Funktion. Der SZT sezerniert für den Erhalt der Schwangerschaft wichtige
Enzyme und Hormone (Benirschke 1998, Muyan et al. 1996).
12
Als wichtiger Marker synzytialer Funktion hat sich humanes Choriongonadotropin
(hCG) etabliert. Es wird aktiv vom Synzytiotrophoblasten sezerniert und maternale
Serumspiegel korrelieren positiv mit dem Grad der SZT-Ausdifferenzierung, weshalb
ßhCG in der Schwangerschaftsfrüherkennung via Schnelltest zum Einsatz kommt
(Guibourdenche et al. 2010). Entkopplung trophoblastärer Reifung von
embryoblastärem Wachstum kann zu fehlerhaften Ausdifferenzierungsprozessen
während der Plazentogenese führen und so fetalen Reifungsprozessen
entgegenwirken.
Es ist bekannt, dass eine mangelhafte Plazentation zu feto-maternalen Pathologien
wie intrauteriner Wachstumsrestriktion (intrauterine growth restriction, IUGR) und
Präeklampsie (PE) führen kann (Langbein et al. 2008) (siehe Abbildung 2).
Als gesonderte Entität des Überbegriffs small-for-gestational-age bezeichnet IUGR
ein dynamisches fetales Wachstumsverhalten mit einem Geburtsgewicht kleiner der
10.Perzentile.
Die IUGR erhöht peripartal Mortalität und Morbidität von Mutter und Kind
(Langbein et al. 2008). Ursächlich gelten maternale, fetale und Umwelteinflüsse.
Diskutiert werden dabei SZT und EVT-Differenzierungsstörungen.
13
SZT-Differenzierungsstörungen führen über eine verminderte Nähr- und
Sauerstoffversorgung zur Wachstumsrestriktion des Fetus (Dupressoir et al. 2009,
Kuzmina et al. 2005, Scifres et al. 2009). Dabei lassen sich direkte SZT-
Differenzierungsstörungen von solchen abgrenzen, bei denen die plazentare
Insuffizienz durch Maldifferenzierung villöser Zytotrophoblasten zum SZT bedingt
ist (Hung et al. 2001, Kuzmina et al. 2005).
Extravillöse Differenzierungsstörungen äußern sich vor allem im zweiten Trimenon
der Schwangerschaft bei der funktionellen Konzertierung fetalen Alimen-
tierungsbedarfs mit der Regulation der Durchblutung des intervillösen Raums. Dabei
kann die unvollständige bzw. fehlende Invasion des extravillösen Trophoblasten in
mütterliche Gefäße zu einer bleibend hohen Resistenz und Kontraktilität der
Spiralarterien führen (Moffett-King et al. 2002) (siehe Abbildung 3).
Abbildung 3: Spiralarteriendifferenzierung in normaler und pathologischer Schwangerschaft
1 Spiralarterie, 2 Myometrium, 3 + 4 extra-villöser Trophoblast,, 5 Dezidua, 6 mangelhaft differenzierte Spiralarterie, 7 erweitertes utero-plazentares Gefäß. Nach Moffett-King 2002
14
Endstrecke einer EVT Maldifferenzierung ist eine Inkonstanz des plazentaren
Blutflusses in Phasen der Vasokonstriktion mit temporärer Gewebehypoxie, wobei
der absolute Blutfluss ggf. unverändert ist (Kuzmina et al. 2005, Scifres et al. 2009).
Der Wechsel von Hypoxie und Reperfusion führt zu oxidativem Stress und einer
Freisetzung von reaktiven Sauerstoffradikalen (Reactive Oxygen Species (ROS)).
ROS wirken toxisch auf den Synzytiotrophoblast im ersten Trimenon. Folglich zeigt
sich eine erhöhte Apoptoserate, ein erhöhtes Risiko für Infarkte und synzytiale
Nekrosen in plazentarem Gewebe (Hung et al. 2001, Kuzmina 2005, Cindrova-
Davies et al. 2007). Die inadäquate Blutversorgung des Fetus bedingt ein erhöhtes
Risiko für IUGR (Kuzmina et al. 2005, Scifres et al. 2009) (siehe Abbildung 4).
Abbildung 4: Pathogenese IUGR
Reaktive Sauerstoffradikale, eine verminderte Fusionsrate der Zytotrophoblasten und eine erhöhte Apoptoserate in der Plazenta führen zu einem Ungleichgewicht zwischen Schädigung und Reparatur des Synzytiotrophoblasten und damit zu einem gestörten Gas- und Nährstoffaustausch an der feto-maternalen Grenzfläche, was eine IUGR nach sich zieht
15
Neben den erwähnten, unmittelbar perinatalen Risiken für Mutter und Kind bewirkt
IUGR beim Kind negative Langzeitfolgen welche mechanistisch unter dem Begriff
der fetalen Programmierung subsumiert werden und von starkem gesundheits-
ökonomischem Interesse sind (Flanagan et al. 1999).
3.2 Fetale Programmierung
„Fetale Programmierung“ oder die „developmental origins of health and disease“-
Hypothese beschreibt den Zusammenhang von strukturellen und funktionellen
Veränderungen in kritischen Phasen der fetalen Entwicklung mit daraus
resultierenden Langzeitschäden und Erkrankungen im Erwachsenenalter (Warner et
al. 2010). Der Begriff der fetalen Programmierung wurde initial vor allem von Hales
und Barker geprägt, welche in retrospektiven Studien im humanen Kollektiv einen
inversen Zusammenhang zwischen dem Geburtsgewicht und der Entwicklung von
kardiovaskulären und metabolischen Erkrankungen aufzeigen konnten (Hales et al.
1991, Hales et al. 2001, Barker 2004). Im Einzelnen werden heute folgende
Erkrankungen ätiopathologisch im Zusammenhang mit fetalen Programmierungs-
vorgängen beim Menschen diskutiert: Diabetes mellitus Typ 2 und verminderte
Glukosetoleranz (Hales et al. 1991), Adipositas (Ong et al. 2000), koronare
Herzkrankheit (Eriksson et al. 2001) sowie Hypertonie und renale
Funktionsstörungen mit konsekutiver Niereninsuffizienz (Dötsch et al. 2009).
Als funktionelles Erklärungsmodell wurde im Verlauf die „thrifty phenotype“
Hypothese von Barker postuliert (Barker et al. 2001). Diese besagt, dass fetale
Mangelernährung physiologische und metabolische Adaptationsvorgänge (sog.
„Programmierung“) bedingt, welche neben dem akuten Überleben des Feten im
Mutterleib, auch seine Überlebenschancen bei postnatal fortbestehender
Mangelernährung erhöhen. Dabei sind die Mechanismen, welche ein Einsparen
fetaler Ressourcen („thrifty“, engl. geizig) während Phasen der Restriktion
ermöglichen, durch ihr postnatales Fortbestehen (Programmierung des phenotype)
ursächlich für das Auftreten von Erkrankungen in diesem Kollektiv.
So werden zugunsten der Entwicklung und Versorgung lebenswichtiger Organe (z.B.
Gehirn) Ressourcen „eingespart“, wodurch sich bei Geburt eine Unreife vor allem
von Nieren, Leber und dem Endokrinum (Pankreas, hypothalamo-hypophysär-
adrenale Achse) (Hales et al. 1999, Barker et al. 2004, Ward et al 2004) zeigt.
16
Da der „thrifty phenotype“ hypothetisch auch nach der Geburt bei ausreichender
Nahrungsversorgung sein intra-uterin festgelegtes Sparprogramm nicht ablegen
kann, wird der unreife Organismus durch die relative Hyperalimentation darüber
hinaus belastet.
Aufgrund ihrer gesundheitlichen Folgen für das Neugeborene ist die fetale
Programmierung aktueller neonataler Forschungsschwerpunkt bei IUGR. Dabei gilt
es, prädiktive Biomarker für das Vorliegen des thrifty phenotype unmittelbar
postnatal zu identifizieren, um ggf. individuell präventiv behandeln zu können.
Hierbei kommt der Plazenta als kindlichem Organ in der Prädiktiv-Diagnostik fetaler
Programmierungsvorgänge beim Neugeborenen nicht zuletzt auf Grund ihrer
direkten Verfügbarkeit eine entscheidende Bedeutung zu.
Plazentare in vitro Studien konnten bereits die ätiopathologische Rolle von
Sauerstoff und plazentaren Hormonen wie Leptin, CRH und Dexamethason bei
IUGR zeigen, welche als plazentare Biomarker diskutiert werden (Hung et al. 2001,
Tzschoppe et al. 2011, Ain et al. 2005). Die Interaktion dieser endokrinen Faktoren
an der feto-maternalen Grenzfläche und ihr Einfluss auf IUGR sind jedoch bislang
nur unzureichend geklärt.
3.3 CRH
Das CRH ist ein aus 41 Aminosäuren bestehendes Polypeptid welches 1981 erstmals
aus Schafshypothalami isoliert und als Neuropeptid charakterisiert wurde. Bereits
1983 erfolgte die Sequenzaufklärung des humanen CRH, welches sich vom Schafs-
CRH durch sieben Aminosäuren unterscheidet. Die Bildung des CRH im
menschlichen Organismus erfolgt im Nucleus paraventricularis des Hypothalamus
aus einem 191 Aminosäuren langen Pro-Hormon. Über das hypothalamo-
hypophysäre Portalsystem gelangt es in den Hypophysenvorderlappen, wo es die
Ausschüttung des Adrenocorticotropen Hormons (ACTH) und Proopiomelanocortin
induziert. ACTH induziert seinerseits die Freisetzung von Glukokortikoiden aus den
Nebennierenrinden. Eine negative Rückkopplung erfolgt durch die Menge an, im
Blutkreislauf vorhandenen, Glukokortikoiden. Sie hemmt sowohl die CRH-Sekretion
im Hypothalamus als auch die ACTH-Biosynthese im Hypophysenvorderlappen.
17
Die Sekretion von CRH unterliegt einer circadianen Rhythmik mit einem Maximum
um 8 Uhr. Zusätzlich wird die Sekretionsrate durch physischen und psychischen
Stress induziert. CRH reguliert indirekt das Immunsystem und die Immunantwort
(Kiapekou et al. 2010). Neben der hypothalamo-hypophysär-adrenalen Achse (HHA-
Achse) wurden CRH und seine Rezeptoren auch in den weiblichen
Reproduktionsorganen wie dem Ovar (Mastorakos et al. 1994), dem Endometrium
(Di Blasio et al. 1997), dem Myometrium (Clifton et al. 1998) und der Plazenta
nachgewiesen. In der Plazenta ist CRH im Synzytiotrophoblasten, nicht jedoch in
den Zytotrophoblasten zu finden (Riley et al. 1991). Es wurden bisher zwei
Unterformen von plazentaren CRH-Rezeptoren (CRH-R) beschrieben: CRH-R1 und
CRH-R2. Studien haben gezeigt, dass CRH-Rezeptoren vom Typ 1 in der Plazenta
und CRH-Rezeptoren vom Typ 2 im Myometrium von schwangeren Frauen
exprimiert werden (Karteris et al. 1998). Entsprechend der Rezeptorlokalisation übt
CRH in verschiedenen Schwangerschaftsstadien unterschiedliche Funktionen aus.
Präkonzeptionell reguliert CRH verschiedene ovarielle Reifungsprozesse (Luteolyse,
Follikelreifung, Ovulation, Steroidbiosynthese) (Kalantaridou et al. 2003). Einen
auto- bzw. parakrinen Effekt hat, lokal in der Plazenta synthetisiertes CRH auf die
Prostaglandinsynthese und somit auf den Dezidualisierungsprozess (Gao et al. 2008).
Hinzu kommt die regulierende Wirkung von CRH, zusammen mit anderen lokalen
Faktoren, auf die Immunantwort bei der Implantation der Blastozyste in mütterliches
Gewebe (Gravanis et al. 2002). Ein Zusammenhang zwischen der Konzentration an
in der Plazenta gebildetem CRH und dem Geburtstermin ist beschrieben (Ellis et al.
2002). In Schwangerschaften mit vorzeitiger Geburt zeigen sich höhere plazentare
Konzentrationen an CRH als in Schwangerschaften mit Geburt zum errechneten
Termin. Umgekehrt resultieren niedrige CRH-Werte in einer längeren
Schwangerschaftsdauer (> 41 Schwangerschaftswochen).
Diese Forschungsergebnisse erlauben die Vermutung, dass CRH die Funktion einer
„plazentaren Uhr“ hat, welche Einfluss auf die Dauer der Schwangerschaft nimmt
(Wadhwa et al. 2004). Die Dauer der Schwangerschaft und der Geburt ist abhängig
von einem empfindlichen Gleichgewicht zwischen inhibitorischen bzw.
stimulierenden Faktoren und systemischen bzw. lokalen Hormoneinflüssen (Gibb et
al. 2002). Hierzu gehören z.B. Uterotonika wie ACTH, Prostaglandine (PG) und
Oxytocin (OT), welche die Kontraktilität des Myometriums positiv beeinflussen.
18
Bekannt ist der stimulierende Einfluss von plazentarem CRH auf die Synthese von
PG, ACTH und OT (Petraglia et al. 1995, Ochedalski et al. 2001). Während der
Schwangerschaft wird CRH trophoblastär gebildet und in den mütterlichen sowie
fetalen Blutkreislauf freigesetzt. Maternale CRH-Spiegel steigen exponentiell mit
dem Fortschreiten der Schwangerschaft an und haben ihren maximalen Anstieg zwei
Wochen vor der Geburt (Goland et al. 1992). Beeinflusst wird die CRH-Synthese
zum einen durch Cortisol, zum anderen durch Progesteron und Stickstoffmonoxid.
Inhibierend auf die Ausschüttung wirken Progesteron und Stickstoffmonoxid,
stimulatorisch wirken Katecholamine, OT, Zytokine und Glukokortikoide (Challis et
al. 2000).
Neben der Regulation durch diese systemischen Hormone erfolgt die lokale
Regulierung von CRH durch intrauterin synthetisiertes CRH-Bindeprotein (CRH-
BP) (Potter et al. 1991), welches mit hoher Affinität freies CRH bindet und dessen
Interaktion mit den CRH-Rezeptoren verhindert (Huising et al. 2008). Gegen Ende
der Schwangerschaft fällt die Konzentration an CRH-BP ab, weshalb die
Bioverfügbarkeit von CRH ansteigt (Petraglia et al. 1993). CRH wirkt über die
Induktion von endothelialem Stickstoffmonoxid vasodilatatorisch auf die
endometrialen Gefäße (Clifton et al. 1994). In der normalen Schwangerschaft wird
über die geringe Gefäßresistenz eine adäquate fetale Versorgung mit Sauerstoff und
Nährstoffen gewährleistet. Es wird postuliert, dass ein in der Schwangerschaft
erhöhtes CRH mit einer Mangelperfusion der Plazenta einhergeht (Donoghue et al.
2000). Interessanterweise ist der vasodilatatorische Effekt von CRH in Plazenten mit
erhöhter Gefäßresistenz, wie z.B. bei IUGR, erniedrigt (Clifton et al. 1995). Dieser
Effekt ist möglicherweise dem Verlust von CRH-Rezeptoren in IUGR-Plazenten
zuzuschreiben (Karteris et al. 2003). Ungeklärt bleibt der aktivierende Einfluss von
Hypoxie auf die fetale HHA-Achse und die dadurch sekundäre Erhöhung von CRH.
Das auf diese Weise fetal gebildete Kortison könnte über plazentare und membranöse
Glukokortikoidrezeptoren die CRH-Expression induzieren (Challis et al. 2000).
19
3.4 Fragestellung
Ziel dieser Arbeit ist die Erforschung der Wirkung von CRH auf die Expression der
IUGR-Markergene Leptin und 11ßHSD-2 am Modell des villösen Zytotrophoblasten
in vitro. Weiterhin gilt es, die Wirkung von CRH auf die synzytiale Integrität in
diesem in vitro Modell zu untersuchen. Wir vermuten, dass die Behandlung von
primären villösen Trophoblasten mit CRH deren Synzytialisierungsrate abschwächt,
sowie zur Induktion der Leptinexpression und zur Reduktion der 11βHSD-2
Expression in diesen Zellen führt – Vorgänge welche man bei der IUGR unter
erhöhtem CRH in vivo beobachtet.
4 Methoden
4.1 Isolierung humaner Trophoblasten
Die Zellgewinnung erfolgte durch die Isolierung der Trophoblasten aus gesunden
Plazenten direkt post partum nach Sectio caesarea (Materialien siehe Tabelle 1).
Unter sterilen Bedingungen wurden die Nabelschnur, Amnionmembran und Dezidua
basalis der Plazenta entfernt und die Plazenta anschließend in 8-10 gleich große
Stücke zerteilt. Das trophoblastäre Gewebe wurde mit einem Metallschaber aus der
bindegewebigen Struktur der Zotten herausgelöst und mit 0,9%iger Natrium-
Chloridlösung gesäubert. Anschließend wurde das Zellmaterial auf zwei
Erlenmeyerkolben verteilt.
Zum weiteren Auftrennen der Zellen wurde das Gewebe durch mehrere Lagen
Mullgaze filtriert. Anschließend wurde das Plazentagewebe zu je 50g auf
Erlenmeyerkolben verteilt und je 250ml Enzymverdau I hinzugegeben. Nach 30-
minütiger Inkubation bei 37°C im Schüttelwasserbad wurde der Enzymverdau II je
zu gleichen Teilen hinzugegeben. Nach 15-minütiger Inkubation bei 37°C wurde zur
Beendigung des Enzymverdaus 50ml NKS (neonatales Kälberserum) hinzugefügt.
Durch 20-minütiges zentrifugieren bei 1250 U/min setzte sich der flüssige Überstand
von den festen Zellbestandteilen ab. Der Überstand wurde abgesaugt und die Pellets
in je 5ml Nährmedium resuspendiert um sie anschließend in einem Gefäß zu poolen.
Anschließend wurde die Suspension für weitere 20min bei 1250 U/min zentrifugiert.
Nach dem Absaugen des Überstandes wurde das Pellet mit Nährmedium
resuspendiert sodass 10ml Endvolumen enstanden.
20
Der, zum Auftrennen der verschiedenen Zelltypen notwendige Percoll-Gradient
wurde bei 4550U/min für 4h 10min ohne Bremse zentrifugiert. Auf den Percoll-
Gradienten wurden je 2,5ml der gelösten Pellets geschichtet und 30min bei
1400U/min ohne Bremse zentrifugiert. Mit einer sterilen Pasteurpipette wurde der,
nun als weißer Flocken sichtbare, Trophoblastenring abgesaugt, mit dem vierfachen
Volumen an Nährmedium aufgefüllt und bei 1250U/min für 15min zentrifugiert. Der
Überstand wurde abgesaugt und die restlichen Zellen mit 10ml Nährmedium
resuspendiert.
Um weitere Versuche durchzuführen bzw. um die Zellen einzufrieren, wurde deren
Anzahl bestimmt. Hierzu wurden 20µl der Zellsuspension mit 180µl Trypan Blue
Stain versetzt und 10µl dieser Mischung in allen vier Quadranten einer
Neubauerzählkammer gezählt. Anschließend wurden je 8x106 Zellen in Eppendorf
Cups eingefroren. Hierzu wurden die Zellen 10min bei 1500U/min zentrifugiert und
zusammen mit 500µl Nährmedium und 500µl Einfriermedium in Eppendorf Cups
pipettiert. Bis zur Weiterverwendung wurden die Zellen bei -80°C gelagert.
4.2 Trophoblastenstimulation
Die eingefrorenen Trophoblasten wurden in 37°C warmen Wasser aufgetaut, in 10ml
Nährmedium resuspendiert und anschließend 5min bei 1500U/min zentrifugiert. In
eine 6-Wellplatte wurden jeweils 3ml Nährmedium in jede Vertiefung vorgelegt. Der
abzentrifugierte Überstand wurde verworfen, das verbleibende Pellet mit
Nährmedium resuspensiert und 1ml der Zellsuspension in jede Vertiefung gegeben.
Pro 6-Wellplatte wurden 12x106 Zellen ausgesät und im Brutschrank bei 37°C
inkubiert. Nach 2-3h, 4-5h, 24h und kurz vor der Stimulation wurde jeweils ein
Mediumwechsel durchgeführt. Hierzu wurde das Nährmedium abgesaugt, die Platte
mit PBS (Phosphate Buffered Saline) mehrmals gespült und anschließend wieder
3ml Nährmedium hinzugegeben. Die Vitalität und das Wachstum der Zellen wurden
vor und nach jedem Mediumwechsel unter dem Mikroskop kontrolliert.
Zur Stimulation der Zellen wurde CRH 1µg/ml verwendet. In die oberen 3 Wells der
6-Well-Platte wurde kein CRH gegeben, sie dienten als Kontrolle. In die unteren 3
Wells wurde jeweils 1µg/ml CRH gegeben und die Platte für 6h, 12h, 24h, 48h und
72h bei 37°C inkubiert (siehe Abbildung 5).
21
Tabelle 1
Materialien Trophoblastenisolierung und –stimulation
Trophoblastennährmedium
500ml Medium M199 PAA Laboratories, Linz, Österreich
1ml 1M Hepes Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
3,4ml L-Glutamin Gibco, Invitrogen GmbH, Karlsruhe
5ml Antibiotika-Antimykotika-Mix:
Pen-Strep (Penicillin, Streptomycin) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
Fungizone Gibco, Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Enzymverdau I
200mg Trypsin Typ I Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
22
120mg DNase I (Desoxyribonuklease) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
20ml Dispase BD (Becton Dickinson) Biosciences,
Heidelberg
500ml HBSS (Hanks’ Balanced Salt
Solution) Gibco, Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Enzymverdau II
20mg Trypsin Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
30mg DNase Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Jeweils in HBSS gelöst Gibco, Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Percoll-Gradient
13ml HBSS 10x Gibco, Invitrogen GmbH, Karlsruhe
49,5ml Percoll Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
67,5ml Aqua destillata B.Braun AG, Melsungen
Einfriermedium (10ml)
2ml DMSO (Dimethylsulfoxide) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
1ml FKS (fetales Kälberserum) PAA Laboratories, Linz, Österreich
7ml Trophoblastennährmedium s.o.
NKS PAA Laboratories, Linz, Österreich
Trypan Blue Stain Gibco, Invitrogen GmbH, Karlsruhe
PBS, pH 7,4 Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
Kochsalzlösung Carl Roth GmbH, München
Zentrifuge Universal 30RF Hettrich, Tuttlingen
Zentrifuge Rotanta96R Hettrich, Tuttlingen
23
4.3 R-A-Extraktion
Die RNA-Extraktion erfolgte mit Hilfe einer vierphasigen Methode:
Homogenisierung, Phasentrennung, RNA-Präzipitation und Waschen der RNA
(Materialien siehe Tabelle 2).
Zur Homogenisierung der Zellen wurden 500µl TRIzol (Total RNA Isolation)®
Reagent, einer monophasischen Lösung aus Phenol und Guanidin-Isothyocyanat
nach den Vorgaben des Herstellers in die Wells gegeben. Nach 5-minütiger
Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen mit Hilfe einer Pipettenspitze
vorsichtig von dem Plattenboden gelöst. Durch das TRIzol Reagent erfolgt die
Zelllyse und Denaturierung der Proteine, ohne die enthaltene RNA zu beschädigen.
Das Zelllysat jedes Wells wurde in je ein Eppendorf Cup pipettiert und jedem Cup
100µl Chloroform zur Phasentrennung hinzugefügt. Nach 15sek mischen gefolgt von
2-3min Inkubation bei Raumtemperatur, wurden die Cups 15min bei 1200U/min und
4ºC zentrifugiert. Hierbei entstehen zwei Phasen: die obere wässrig-klare Phase
enthält die RNA, die untere zähe, milchig-rosafarbene Phase enthält die DNA und
Proteine. Die wässrige Phase wurde abpipettiert und mit 250µl Isopropanol versetzt.
Das Isopropanol sorgt für die Präzipitation der RNA. Nach 45-minütiger Inkubation
bei 4ºC wurde das Gemisch 15min bei 1500U/min und 4ºC zentrifugiert, wodurch
sich ein leicht milchiges Pellet aus RNA am Boden des Eppendorf-Cups absetzt. Das
Isopropanol wurde abgesaugt das Pellet an der Luft getrocknet. Anschließend wurde
es mit 500µl 75%-igem Ethanol gewaschen und 5min bei 15000U/min bei 4ºC
zentrifugiert. Der Ethanolüberstand wurde abgesaugt und die Pellets an der Luft
getrocknet. Anschließend wurden die RNA-Pellets jeweils in 50µl DEPC-Wasser
(Diethylpyrocarbonat in Aqua destillata) gelöst und nach Kontrolle der
Konzentration und Qualität der extrahierten RNA wurde diese bei -80ºC gelagert.
Tabelle 2
Materialien R-A-Extraktion
TRIzol®Reagent Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Chloroform Amresco inc, Cochran, OH, USA
Ethanol Merck KG, Darmstadt
Isopropanol Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
24
Zentrifuge Universal 30RF Hettrich, Tuttlingen
Zentrifuge Rotanta96R Hettrich Tuttlingen
4.4 Photometrie
Die Photometrie diente der Konzentrationsbestimmung der RNA, um die nötige
Menge an RNA-Lösung für die reverse Transkription berechnen zu können
(Materialien siehe Tabelle 3). Die Absorption einer Flüssigkeit hängt von der
stofflichen Zusammensetzung und der Konzentration der Bestandteile ab. Um die
Konzentration eines Moleküls in einer Lösung zu ermitteln, wird der
Wellenlängenbereich gewählt, der von den zu bestimmenden Molekülen absorbiert
wird. Nukleinsäuren absorbieren ultraviolettes Licht bei einer Wellenlänge von
260nm. Bei 260nm und einer Absorption von 1,0 liegen die RNA in einer
Konzentration von 40µg/ml und die doppelsträngige DNA in einer Konzentration
von 50µg/ml vor. Proteine hingegen absorbieren ultraviolettes Licht bei einer
Wellenlänge von 280nm, Aromaten, Phenole und Salze bei einer Wellenlänge von
230nm. Um Kontaminationen herauszufiltern, wurde der Quotient zwischen der
Extinktion bei 260nm und 230nm bzw. 280nm erstellt. Im Idealfall liegt der Quotient
zwischen 1,8 und 2,2. Liegt der Quotient unter 1,8, ist eine Kontamination
wahrscheinlich.
Zur Messung wurde das Photometer zunächst mit destilliertem Wasser geeicht,
anschließend erfolgte die photometrische Messung der Proben. Hierfür wurden diese
mit Aqua ad iniectabilia auf 1:40 verdünnt und die Konzentration gemessen.
Tabelle 3
Materialien Photometrie
Aqua ad iniectabilia DeltaSelect GmbH, Pfullingen
BioPhotometer Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH,
Hamburg
Zentrifuge Universal 30RF Hettrich, Tuttlingen
Zentrifuge Rotanta96R Hettrich, Tuttlingen
25
4.5 Gelelektrophorese
Die Agarose-Gelelektrophorese ist ein Verfahren bei dem die RNA unter
Verwendung eines Gels als Trägermedium aufgetrennt wird (Materialien siehe
Tabelle 4). Hierdurch kann die Qualität der Proben kontrolliert werden.
Die Nukleinsäure-Stränge werden nach ihrer Größe getrennt und mit Strängen
bekannter Größe verglichen. Das verwendete Agarose-Gel besteht aus
Agarosepolymer-Fäden, welche sich in dem Gel zu einem Netz verbinden. Je höher
die Agarose konzentriert ist, desto kleiner sind die Poren des Gels. Bei angelgeter
Gleichstromspannung wandern negativ geladene Nukleinsäure-Moleküle durch das
Gel Richtung Anode. Kleinere Moleküle gelangen schneller durch das Gel, wodurch
die Auftrennung entsprechend der Größe erfolgt.
Zur Herstellung des 1%igen Agarose-Gels wurden 500mg Agarose-Pulver in 50ml
1x TAE-Laufpuffer (Tris-Acetat-EDTA-Laufpuffer, EDTA=Ethylendiamintetra-
acetat) gelöst und zum Kochen gebracht. Anschließend wurden 5µl Ethidiumbromid
hinzugegeben um die RNA-Fragmente, welche nativ nicht sichtbar sind, anzufärben
und unter fluoreszierendem Licht sichtbar zu machen. Das flüssige Gel wurde in eine
Kunststoffschale in die Gelelektrophoresekammer gegossen. Mit einem
Kunststoffkamm wurden Einfülltaschen nahe der Kathode geschaffen. Während dem
20-30-minütigen Aushärten des Gels, wurden 2µl RNA mit 3µl HPLC-Wasser
(Wasser für Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) und 1,5µl mit
Bromphenolblau angefärbten 5x TAE-Puffer versetzt. Nach dem Aushärten des Gels
wurde die Gelelektrophoresekammer vollständig mit 1x TAE-Laufpuffer bedeckt und
in jede Tasche eine der vorbehandelten RNA-Proben pipettiert. Die Auftrennung der
RNA-Fragmente erfolgte durch das Anlegen von 80V für 25-30min. Unter
ultraviolettem Licht der Wellenlänge 254nm werden die Banden der RNA bei 18 S
(Svedberg-Einheit) und bei 28 S sichtbar. Die Dokumentation der Banden erfolgte
durch Fotographie (siehe Abbildung 6).
26
Tabelle 4
Materialien Gelelektrophorese
Agarose (Biozym LE) Biozym Scientific GmbH, Hess,
Oldendorf
Ethidiumbromid Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
1x TAE-Puffer Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
5x TAE-Puffer Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
Bromphenolblau Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
HPLC-Wasser
28 S 18 S Abbildung 6: RNA-Banden bei 18 S und 28 S nach gelelektrophoretischer Auftrennung
27
4.6 Reverse Transkription
Die RNA lässt sich mittels des Enzyms reverse Transkriptase in die zugehörige
cDNA (complementary DNA) synthetisieren (Materialien siehe Tabelle 5).
Eingesetzt wurde hierfür die reverse Transkriptase aus dem „Moloney Murine
Leukemia Virus“. Mit Hilfe der Genexpressionsanalyse durch Polymeraseketten-
reaktion (PCR) kann anschließend die Expressionsrate der jeweils zugrunde
liegenden RNA bestimmt werden.
Die RNA wurde langsam bei Raumtemperatur aufgetaut, gemischt und kurz
zentrifugiert. Nach dem Auftauen musste die RNA gemäß der vorher photometrisch
bestimmten RNA-Werte auf eine Konzentration von 1µg RNA/ 8µl Probe mit
DEPC-Wasser verdünnt werden. Zunächst erfolgten die Zugabe von 4µl des DNase-
Verdaus und die anschließende 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Der
Verdauungsprozess wurde durch Zugabe von 1µl 25mM EDTA (Stop-Solution) und
die 15-minütige Inkubation im Heizblock bei 65° C beendet. Anschließend wurden
die Proben kurz zentrifugiert und 10µl des Mastermix A hinzugegeben. Nach 5-
minütiger Inkubation im Heizblock bei 70°C wurden die Proben für eine Minute auf
Eis abgekühlt. Nach Zugabe von 20µl des Mastermix B wurden die Proben für eine
Stunde bei 37°C inkubiert. Die Umwandlung der RNA in cDNA wurde durch 1-
minütige Abkühlung beendet. Die Proben wurden bis zur Weiterverarbeitung bei
-20°C gelagert.
Tabelle 5
Materialien Reverse Transkription
Dnase-Verdau
1µl 10x Reaction Buffer RQ1 Dnase Promega Madison, WI, USA
1µl DNase/ RNase (Ribonuklease) free Promega Madison, WI, USA
Stop Solution
25mM DNase Stop Solution Promega Madison, WI, USA
Mastermix A
0,6µl Random Primer 1:4, 0,5 µg/ µl Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
0,4µl Oligo dt-Primer (0,5 µg/ µl) MWG-Biotech AG, Ebersberg
28
4µl DEPC-Wasser
Mastermix B
5µl MMLV-RT 5x Buffer Promega Madison, WI, USA
1,25µl dNTP-Mix
(Desoxyribonukleosid-triphosphat-Mix)
(10mM each 500µl)
Finnzymes, Espoo, Finnland
0,5µl RNase-Inhibitor 40U/µl Promega Madison, WI, USA
1µl MMLV Reverse Transkriptase
200U/µl
Promega Madison, WI, USA
2,25µl DEPC-Wasser
Zentrifuge Universal 30 RF Hettrich, Tuttlingen
Zentrifuge Rotanta 96R Hettrich, Tuttlingen
4.7 TaqMan-Real-Time-PCR
Die TaqMan-Real-Time-PCR dient der Vervielfältigung von Nukleinsäuren und
ermöglicht gleichzeitig die Quantifizierung der amplifizierten DNA mittels
fluoreszierenden Sonden. Der PCR-Prozess ist ein polyzyklisches Verfahren welches
in drei Schritten abläuft. Im ersten Schritt, dem Melting, erfolgt die Denaturierung
der doppelsträngigen DNA zu Einzelsträngen. Durch das Erhitzen auf über 90°C
lösen sich die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basen
und es liegen Einzelstränge vor. Im zweiten Schritt, dem Annealing, wird das
Reaktionsgemisch auf 60°C heruntergekühlt, sodass sich die spezifischen
Oligonukleotidprimer an das Startsegment anlagern können. Voraussetzung hierfür
ist die Kenntnis der Nukleotidsequenz, welche die zu amplifizierende Sequenz
umgibt. Komplementär zu diesen Sequenzen werden 16 bis 30 Basen lange
Oligonukleotide als Startermoleküle (Primer) für die DNA-Polymerase verwendet.
Diese Enzyme sind in der Lage die einzelnen DNA-Bausteine zu langen
Molekülsträngen zu verbinden. Im dritten Schritt, der Elongation, ergänzt die DNA-
Polymerase die einzelsträngige DNA durch das Anbauen von Nukleotiden in 3‘-5‘-
Richtung zu einem Doppelstrang.
29
Geht man von optimalen Bedingungen aus, verdoppelt sich bei jedem Zyklus die
Anzahl an kopierten DNA-Molekülen und es erfolgt eine exponentielle Vermehrung
des gewünschten DNA-Segments. Zur Messung der amplifizierten DNA werden
spezielle TaqMan-Sonden verwendet. Für die vorliegende Arbeit wurde die
AmpliTaq Gold™ DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus verwendet, eine
hitzestabile DNA-Polymerase, welche mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert ist.
Am 5‘-Ende dient FAM (6-Carboxy-Fluorescein) als Reporter-Farbstoff und am 3‘-
Ende TAMRA (6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin) als Quencher, welcher als
Farblöscher fungiert. Das Messverfahren funktioniert nach dem Prinzip des TaqMan
PCR Assay. Die Sonde bindet an die Zielsequenz, wodurch die Verbindung der
Farbstoffe durch die 5’Exonukleaseaktivität der Polymerase getrennt wird und die
Auslöschung der Fluoreszenz von FAM durch TAMRA unterbleibt. Die Zunahme der
FAM-Fluoreszenz ist hierbei proportional zur Anzahl neu synthetisierter Kopien und
wird in jedem Zyklus mittels eines automatischen Sequenzdetektors gemessen.
Aufgrund der spezifischen Hybridisierung zwischen Sonde und Matrize, welche
benötigt wird, um Fluoreszenzsignale zu generieren, werden unspezifische DNA-
Amplifikationen nicht detektiert. Die ursprüngliche Menge eingesetzter DNA wird
durch die Analyse der Fluoreszenzintensität bestimmt. Hierbei normalisiert zunächst
ein Algorithmus das Fluoreszenz-Signal der Reporter-Sonde auf eine passive
Referenz. Hierfür wurde der Farbstoff ROX (6-Carboxy-X-rhodamin) verwendet,
welcher weder seine Konzentration noch seine Fluoreszenz während der Analyse
verändert. Der ermittelte Algorithmus multipliziert die Standardabweichung der
Hintergrundfluoreszenzen während der ersten Zyklen (in den meisten PCR-Systemen
Zyklus 3-15) mit einem Fehlerfaktor von 10, um einen Schwellenwert zu bestimmen
und anschließend den CT-Wert abzuleiten. Dieser Wert entspricht der Anzahl an
Zyklen, bei der das gemessene Fluoreszenz-Signal erstmals einen vorgegebenen
Schwellenwert übersteigt. Hierbei hängt der Maximalwert von der Effizienz der
DNA-Amplifikation und des Abspaltens der Sonde ab. Zwischen CT und dem
Logarithmus der anfangs eingesetzten Menge an DNA besteht ein linearer
Zusammenhang über fünf Zehnerpotenzen hinweg. Die CT-Werte der Proben werden
dabei auf eine externe Standardkurve interpoliert, welche mittels Verdünnungsreihen
einer definierten cDNA-Probe erstellt wurde.
Die Durchführung der PCR erfolgte anhand des Protokolls von Applied Biosystems
(Materialien siehe Tabelle 6). Zunächst erfolgte die Herstellung des Mastermix.
30
Dieser besteht aus qPCR Core Kit- No ROX, ROX Passive reference, Sonde,
reverse- und forward-Primer. Zusätzlich wurde eine spezifische Menge an HPLC-
Wasser („H2O“) und die für das nachzuweisende Gen spezifische Menge an
Magnesiumchlorid (MgCl2) hinzugegeben. Das MgCl2 dient der AmpliTaq Gold-
Polymerase als Cofaktor und stabilisiert die Bindung der Sonde. Es wurde eine 96-
Well-Platte verwendet und in jeweils eine Vertiefung 22,5µl Mastermix und 2,5µl
cDNA pipettiert. Zusätzlich wurde für jedes Gen eine Negativkontrolle mit HPLC-
Wasser und zwei Standardreihen angelegt. Es handelt sich hierbei um geometrische
Verdünnungsreihen mit Konzentrationen von cDNA (2,5µl) zu HPLC-Wasser von
1:1 bis 1:128 und 22,5µl Mastermix. Vor dem Starten der PCR wurde eine
Backgroundmessung am Real Time PCR Gerät (Modell 7500 Applied Biosystems)
durchgeführt um Verunreinigungen zu detektieren und zu beseitigen. Anschließend
erfolgte die Messung mit Hilfe einer gerätespezifischen Computersoftware
(Sequence Detection Software für 7500 Real Time PCR, Applied Biosystems).
Tabelle 6
Materialien TaqMan-Real-Time-PCR
Mastermix (Mengenangaben pro Well)
qPCR Core Kit-No ROX
2,5µl 10x Taq-Buffer II Eurogentec, Seraing, Belgien
1µl dNTP-Mix (Uridintriphosphat), 5mM Eurogentec, Seraing, Belgien
MgCl, 50mM Eurogentec, Seraing, Belgien
0,13µl AmpliTaq Gold DNA-Polymerase Eurogentec, Seraing, Belgien
0,25µl AmpERase UNG Eurogentec, Seraing, Belgien
1,75µl ROX Passive reference RT-PARE-03 Eurogentec, Seraing, Belgien
Primer
2,5µl forward Primer (3 oder 6 µM) MWG-Biotech AG, Ebersberg
2,5µl reverse Primer (3 oder 6 µM) MWG-Biotech AG, Ebersberg
Sonde
2,5µl TaqMan-Sonde (2µM) MWG-Biotech AG, Ebersberg
31
Aqua destillata B.Braun AG, Melsungen
7500 Real Time PCR System Applied Biosystems, Darmstadt
Konzentrationen MgCl2 und H2O
HPRT
MgCl2-Konzentration (mM) 4,50
MgCl2-Volumen (µl) 2,25
H2O-Volumen (µl) 7,12
ß2-MG
MgCl2-Konzentration (mM) 5,00
MgCl2-Volumen (µl) 2,50
H2O-Volumen (µl) 6,87
Leptin
MgCl2-Konzentration (mM) 4,00
MgCl2-Volumen (µl) 2,00
H2O-Volumen (µl) 7,37
11ßHSD-2
MgCl2-Konzentration (mM) 3,50
MgCl2-Volumen (µl) 1,75
H2O-Volumen (µl) 7,62
Sequenzen der verwendeten Primer und Sonden
HPRT
Forward 5‘-CCG GCT CCG TTA TGG C-3´
Reverse 5‘-GGT CAT AAC CTG GTT CAT CAT CA-3´
Sonde 5‘(FAM)-CGC AGC CCT GGC GTC GTG ATT A-
(TAMRA)3‘
ß2-MG
Forward 5‘-TGA CTT TGT CAC AGC CCA AGA TA-3´
Reverse 5‘-CCA AAT GCG GCA TCT TC-3´
Sonde 5‘(FAM)-TGA TGC TGC TTA CAT GTC TCG ATC CCA-
32
(TAMRA)3‘
Leptin
Forward 5‘-ACA ATT GTC ACC AGG ATC AAT GAC-3´
Reverse 5‘-GGG CTG TTC AAC TCC AAT ACG-3´
Sonde 5‘(FAM)-CAA GGA GAC GGC CAA GAA ACT GGA CTC-
(TAMRA)3‘
11ßHSD-2
Forward 5‘-CAT CAC CGG CTG TGA CTC TG-3´
Reverse 5‘-CGG CAG CCG CAT GTT AG-3´
Sonde 5‘(FAM)-AAA GGA GAC AAT TTG GCT CTG C-
(TAMRA)3‘
4.8 ELISA
Der ELISA (Enzyme Linked Immunabsorbent Assay) bezeichnet ein
immunologisches Nachweisverfahren für einzelne Proteine. Man nutzt hierbei
spezifische Antikörper, die an den nachzuweisenden Stoff (Antigen) binden. Ein
zuvor angehängtes Enzym katalysiert eine Reaktion, welche das Vorhandensein des
Antigens bestätigt.
4.8.1 LDH-ELISA
In der vorliegenden Arbeit wurde das Prinzip des ELISA mittels Toxicology Assay
Kit Lactate Dehydrogenase based (Sigma Aldrich) angewandt, um eine eventuelle
Toxizität des verwendeten Materials herauszufinden. Im Kulturüberstand der
stimulierten Trophoblasten wurde die Laktatdehydrogenase (LDH) gemessen, da
LDH beim Zelltod freigesetzt wird und somit ein Indikator für die Zellschädigung
ist. Dieser Assay basiert auf dem Prinzip, dass LDH zu einer Reduktion von NAD
(Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid) zu NADH führt. NADH wiederum führt zur
Umwandlung des hinzugegebenen Farbstoffes Tetrazolium. Dieser Farbausschlag
kann spektralphotometrisch gemessen werden (Materialien siehe Tabelle 7). Zur
LDH-Messung wurde ein LDH-Mix verwendet, welcher sich zu gleichen Teilen aus
der LDH-Assay Substrate Solution, dem Cofactor und der Dye-Solution (Farbstoff)
zusammensetzt.
33
In ein Well wurden 200µl des LDH-Mix und 100µl des Kulturüberstands der
Trophoblasten pipettiert. Zusätzlich wurden zwei Negativkontrollen mit 100µl
Trophoblastennährmedium angelegt. Hierdurch kann unterschieden werden ob das
gemessene LDH durch die Trophoblasten oder durch das im Nährmedium enthaltene
FKS freigesetzt wurde. Nach 20-30-minütiger lichtgeschützter Inkubation wurde die
Reaktion durch die Zugabe von 30µl HCl (Chlorwasserstoff) beendet. Anschließend
erfolgte die photometrische Messung der LDH-Konzentration bei einer Wellenlänge
von 490nm. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe der Computersoftware Ascent
Software for Multiscan Vers. 2.6. (©1996-2002 Thermo Labsystems Oy) ermittelt.
Tabelle 7
Materialien LDH-ELISA
LDH-Mix
1/3 LDH Assay Substrate Solution Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
1/3 LDH Assay Cofactor Preparation Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
1/3 LDH Assay Substrate Dye Solution Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
Trophoblastennährmedium
Siehe Tabelle 1
1 N HCl Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
Photometer Multiscan Termo Fischer Scientific Germany Ltd.
& Co. KG, Braunschweig
34
4.8.2 ßhCG-ELISA
Zur quantitativen Bestimmung des Gesamt-ßhCG im Serum wurde der ßhCG-ELISA
durchgeführt. Verwendet wurde der DRG ßhCG-ELISA Kit (DRG® Diagnostics)
(Materialien siehe Tabelle 8) nach Angaben des Herstellers. Die verwendete 96-Well-
Platte ist mit einem monoklonalen Antikörper beschichtet, welcher gegen eine
definierte Antikörper-Bindungsstelle des ßhCG-Moleküls gerichtet ist. Es wurden
25µl des Kulturüberstandes, zwei Standardreihen mit den Konzentrationen 0; 5; 25;
50; 100; 200 U/ml und zwei Negativkontrollen mit Trophoblastennährmedium in ein
Well pipettiert. Hinzu kamen 100µl eines anti-ßhCG-Antikörpers, konjugiert mit
Meerrettichperoxidase. Nach kurzem Schütteln des Wells erfolgte die 60-minütige
Inkubation bei Raumtemperatur. Es bildet sich ein Sandwichkomplex zwischen den
beiden Antikörpern und dem ßhCG-Molekül. Nach der Inkubation wurden die nicht
gebundenen Konjugate durch mehrmaliges Waschen des Wells mit destilliertem
Wasser, entfernt. Anschließend erfolgte die Zugabe von 100µl Substrate Solution.
Durch die enzymatische Reaktion kommt es zu einer Farbentwicklung, welche nach
einer definierten Zeit von 15 Minuten durch den Zusatz von 50µl Stop Solution
beendet wurde. Die hierbei gemessene Farbintensität ist proportional der ßhCG-
Konzentration in der Probe. Mit Hilfe eines Mikrotiterplattenlesers erfolgte die
Messung bei 450nm innerhalb von 10 Minuten nach Zugabe der Stop Solution.
Tabelle 8
Materialien ßHCG-ELISA
Mikrotiterwell mit anti-ßhCG-Antikörper
beschichtet
DRG Instruments GmbH, Marburg
Enzyme Conjugate DRG Instruments GmbH, Marburg
Substrate Solution DRG Instruments GmbH, Marburg
Stop Solution DRG Instruments GmbH, Marburg
Standard 0-5 DRG Instruments GmbH, Marburg
Sample Diluent
(Probenverdünnungsmedium)
DRG Instruments GmbH, Marburg
Photometer Multiscan EX Thermo Fischer Scientific Germany
Ltd. & Co. KG, Braunschweig
35
4.9 Statistische Datenauswertung
Die statistische Auswertung und die graphische Darstellung der erhobenen Daten
erfolgte mittels Two-Way-ANOVA mit Bonferroni post-Test (PRISM 4.0, Graph
PAD Software, San Diego, USA). Die mRNA-Expression der Housekeeping-Gene
HPRT und ß2-MG fungierte als Referenzwert zur Normalisierung der Daten. Zur
Auswertung der erhobenen Daten aus der TaqMan-PCR wurde der Quotient aus der
Leptin-mRNA bzw. der 11ßHSD-2-mRNA und der Housekeeping-Gen-mRNA
gebildet. Alle Werte wurden als Mittelwert ± SEM (Standarderror of the mean)
dargestellt. Ein p-Wert von <0,05 wurde als signifikant betrachtet. Im folgenden
Ergebnisteil sind die Signifikanzniveaus mit *=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,001
gekennzeichnet.
5 Ergebnisse
5.1 R-A-Extraktion
5.1.1 Photometrie
Die Photometrie diente in der vorliegenden Arbeit zur Konzentrationsbestimmung
der zuvor extrahierten RNA. Gemessen wurden die Kontrollen, ebenso wie die mit
CRH stimulierten Proben bei einer Wellenlänge von 260nm. Die Verunreinigung der
Proben durch Proteine wurde durch den Quotienten aus der Extinktion bei
260nm/280nm errechnet. Er betrug maximal 2,42 und minimal 1,18 (Mittelwert
1,62). Die Verunreinigung der Proben durch Phenole, Salze und Aromaten wurde
durch den Quotienten aus der Extinktion bei 260nm/230nm errechnet. Er betrug
maximal 2,24 und minimal 0,57 (Mittelwert 1,07).
5.1.2 Gelelektrophorese
Die Qualitätsprüfung der Proben erfolgte durch die Gelelektrophorese. Beispielhaft
für die Ergebnisse der gelelektrophoretischen Auftrennung der RNA-Banden ist das
Foto in Abbildung 7. Zu sehen sind zwei Banden bei 18 S und 28 S als Nachweis für
intakte RNA.
36
5.2 TaqMan-Real-Time-PCR
Zur Auswertung der Ergebnisse der mRNA-Expression von Leptin und 11ßHSD-2
durch die TaqMan-Real-Time-PCR fungierten die Housekeeping-Gene HPRT und
ß2-MG als Referenzwert zur Normalisierung der Daten. In unseren Versuchen
wurden HPRT und ß2-MG in konstanter Menge exprimiert und daher als quantitative
Standards für die Expressionskontrolle verwendet. In unseren Auswertungen wurden
mRNA-Expressionsdaten bewusst in Relation zur HPRT Expression dargestellt, da
sich dieses Houskeeping-Gen in Metaanalysen plazentarer Studien stabil unter
hormoneller Stimulation zeigte (Meller et al. 2005). Eine Verifikation der Ergebnisse
erfolgte durch Bestimmung von ß2-MG, ohne Divergenz der Messergebnisse.
5.2.1 Stimulation der Trophoblasten mit CRH
5.2.1.1 Leptin-Expression unter CRH-Stimulation
Die Expression von Leptin ist in den Abbildungen 8 und 9 dargestellt. Die
Kontrollzellen zeigten einen Peak der Expressionsrate bei 24 Stunden. Es konnte ein
signifikanter Anstieg der Leptin-Expression in der Kontrollgruppe von 6 Stunden auf
24 Stunden (p<0,05) festgestellt werden. Die Leptin-Expression unter CRH-
Stimulation zeigte einen Peak bei 48 Stunden.
37
Zwei signifikante Anstiege von 6 Stunden bzw. 12 Stunden auf 48 Stunden (p<0,01)
und ein signifikanter Abfall von 48 Stunden auf 72 Stunden (p<0,01) waren
festzustellen.
Abbildung 10 und Tabelle 9 zeigen einen signifikanten Unterschied der Leptin-
Expression zwischen den stimulierten Zellen und den Kontrollzellen bei 48 Stunden
(p<0,05). Zu allen weiteren gemessen Zeitpunkten konnte kein signifikanter
Unterschied zwischen den stimulierten und nicht stimulierten Zellen festgestellt
werden.
38
Tabelle 9
Mittelwert Leptin/HPRT für CRH ± SEM
Zeit Kontrolle Stimuliert Signifikanz
6h 0,28 ± 0,00 0,49 ± 0,11 ns 12h 1,32 ± 0,52 1,12 ± 0,59 ns 24h 3,41 ± 1,20 2,57 ± 0,48 ns 48h 1,65 ± 0,18 5,35 ± 1,65 p < 0,05
72h 1,03 ± 0,12 0,92 ± 0,17 ns
5.2.1.2 11ßHSD-2-Expression unter CRH-Stimulation
Die Expression von 11ßHSD-2 ist in den Abbildungen 11 und 12 dargestellt. Es
konnte weder bei den Kontrollzellen noch bei den stimulierten Zellen ein
signifikanter Anstieg bzw. Abfall der Expressionsrate nachgewiesen werden. Wie in
Abbildung 13 und Tabelle 10 zu sehen, konnte kein signifikanter Unterschied der
11ßHSD-2-Expression zwischen den Kontrollzellen und den stimulierten Zellen
nachgewiesen werden.
39
Tabelle 10
Mittelwert 11ßHSD-2/HPRT für CRH ± SEM
Zeit Kontrolle Stimuliert Signifikanz
6h 0,20 ± 0,01 0,46 ± 0,04 ns 12h 0,77 ± 0,35 0,38 ± 0,15 ns 24h 0,48 ± 0,20 0,45 ± 0,13 ns 48h 0,35 ± 0,04 0,88 ± 0,67 ns 72h 0,34 ± 0,04 0,34 ± 0,00 ns
5.3 ELISA
5.3.1 LDH-Assay
Die Abbildungen 14 und 15 zeigen die Ergebnisse der LDH-Messung im Überstand
der mit CRH stimulierten Trophoblasten und der nicht stimulierten Kontrollzellen. Es
konnte weder ein signifikanter Anstieg der LDH-Absorbance noch ein Unterschied
zwischen den mit CRH stimulierten und den nicht stimulierten Zellen nachgewiesen
werden (siehe Tabelle 11 und Abbildung 16).
40
Tabelle 11
Mittelwert LDH-Absorbance für CRH ± SEM
Zeit Kontrolle Stimuliert Signifikanz
6h 0,021 ± 0,006 0,022 ± 0,013 ns 12h 0,036 ± 0,005 0,032 ± 0,001 ns 24h 0,255 ± 0,017 -0,004 ± 0,003 ns 48h 0,325 ± 0,004 0,019 ± 0,001 ns 72h 0,025 ± 0,005 0,029 ± 0,006 ns
41
5.3.2 ßhCG-ELISA
Abbildung 17 und Tabelle 12 zeigt die Ergebnisse der ßhCG-Messung im Überstand
der mit CRH stimulierten Trophoblasten und der nicht stimulierten Kontrollzellen. Es
zeigt sich ein Peak der ßhCG-Konzentration bei den stimulierten Trophoblasten und
den Kontrollzellen bei 72 Stunden. Es ergab sich bei den Kontrollzellen ein
signifikanter Konzentrations-Anstieg von 6/12/24 und 48 Stunden auf 72 Stunden
(p<0,001) und von 6 bzw. 12 Stunden auf 48 Stunden (p<0,01). Bei den mit CRH
stimulierten Zellen zeigte sich ein signifikanter Anstieg von 6/12/24 und 48 Stunden
auf 72 Stunden (p<0,001) und von 6/12 und 24 Stunden auf 48 Stunden (p<0,01/
p<0,05). Zu keinem Zeitpunkt ist ein signifikanter Unterschied zwischen der ßhCG-
Konzentration in den stimulierten und nicht stimulierten Zellen nachzuweisen.
Tabelle 12
Mittelwert ßHCG-Konzentration für CRH ± SEM
Zeit Kontrolle Stimuliert Signifikanz
6h 0 ± 0 0 ± 0 ns 12h 0,23 ± 0,23 0 ± 0 ns 24h 14,02 ± 3,01 10,36 ± 1,54 ns 48h 29,93 ± 0,68 30,14 ± 3,89 ns 72h 185,50 ± 13,30 140,2 ± 4,82 ns
42
6 Diskussion
6.1 Diskussion der Methoden
6.1.1 Trophoblastenisolierung
Die Isolierung der Trophoblasten aus der Plazenta erfolgte nach der, im Labor
etablierten Methode des Trypsin-DNase-Dispase/Percoll-Gradienten. Mit dem hier
angewendeten Verfahren wurde ein zytotrophoblastärer Reinheitsgrad von 95%
erzielt. Dieser wurde via FACS Analyse (FACSCalibur, BD Biosciences) durch das
zellzytometrische Routinelabor der Kinder- und Jugendklinik Erlangen, wie in
Rübner et al. (Ruebner et al. 2010) beschrieben, ermittelt. Die restlichen 5% der
gewonnen Zellen enthalten neben synzytialen Fragmenten (Guilbert et al. 2007) auch
andere Gewebebestandteile der Plazenta, wie z.B. deziduale Zellen, Fibroblasten,
Makrophagen und Endothelzellen (Ruebner et al. 2010).
Die Verunreinigung durch synzytiale Fragmente beträgt nach
Ethidiumbromidanalyse (50µg/ml, Sigma-Aldrich) 8,5%. Diesem Grad an
Verunreinigung wurde mit Hilfe mehrerer Mediumwechsel nach 2h, 4h und 24h nach
Aussaat entgegengewirkt. Der Einfluss von Verunreinigungen der zytotropho-
blastären Zellpräparationen durch obige plazentare Zellen auf die hier präsentierten
Ergebnisse kann nicht vollständig ausgeschlossen werden. Zum Erhalt
zellspezifischerer Aussagen zu Prozessen des Zytotrophoblasten kann je nach
Fragestellung die hier verwendete Percoll-Methode um weitere, oberflächenantigen-
selektive Separationsschritte ergänzt werden (Ruebner et al. 2010, Stenqvist et al.
2008).
6.1.2 R-A-Extraktion
Die Isolierung der Ribonukleinsäuren aus Trophoblasten erfolgte mit Hilfe einer
vierphasigen Methode (Homogenisierung, Phasentrennung, RNA-Präzipitation und
Waschen der RNA), welche im Labor etabliert wurde. Verwendet wurde das TRIzol-
(Total RNA Isolation)® Reagent nach Angaben des Herstellers. Verunreinigungen
der Proben durch eingesetzte Chemikalien und das Lufttrocknen der Proben können
nicht ausgeschlossen werden. Verbesserungen konnten hierbei durch das Verwenden
einer Vakuumpumpe zum Absaugen von Lösungsresten erzielt werden. Hierdurch
verkürzt sich die Trockenzeit der Pellets. Messungenauigkeiten durch
Verunreinigungen wurden in der photometrischen Konzentrationsbestimmung der
43
RNA und der gelelektrophoretischen Auftrennung detektiert. Verunreinigte Proben
wurden verworfen. Verunreinigungsquellen waren verwendete Phenole, Salze und
Aromate. Eine RNA-Verunreinigung durch Proteine war bei unseren Experimenten
stets vernachlässigbar. Generell wurde versucht, den Einfluss der hier beschriebenen
Verunreinigungen auf die endgültigen Messergebnisse zu minimieren, ein gewisser
Resteinfluss ist jedoch nicht absolut auszuschließen.
6.1.3 TaqMan-Real-Time PCR
Die TaqMan-Real-Time PCR wurde zur quantitativen Darstellung der RNA-
Expression von 11ßHSD-2 und Leptin durchgeführt. Geringe Unterschiede der
Genexpression können mit hoher Sensitivität und Spezifität nachgewiesen werden.
Wie bereits bei Tzschoppe beschrieben, wurden die Ergebnisse der RNA-
Expressionsmessung auf die beiden Housekeeping-Gene Hypoxanthin-
Phosphoribosyl-Transferase (HPRT) und ß2-Mikroglobulin (ß2-MG) normalisiert
(Tzschoppe et al. 2011). In unseren Experimenten wurden HPRT und ß2-MG in
konstanter Menge exprimiert und daher als quantitative Standards für die
Expressionskontrolle verwendet. In unseren Auswertungen wurden mRNA-
Expressionsdaten bewusst in Relation zur HPRT Expression dargestellt, da dieses
Houskeeping-Gen, wie Metaanalysen in plazentaren Studien zeigen, stabil unter
hormoneller Stimulation ist (Meller et al. 2005). Eine Verifikation der Ergebnisse
erfolgte durch Bestimmung von ß2-MG, ohne Divergenz der Messergebnisse.
Generell sollte bei der Wahl der Housekeeping-Gene zur Optimierung der
Messgenauigkeit die Stabilität verwendeter Gene bezüglich der jeweiligen
Extraktionsmethode und Stimulation überprüft werden. Während sich in unseren
Experimenten HPRT und ß2-MG als konstant erwiesen, konnte eine komparative
Studie die Gene Ubiquitin C (UBC), Topoisomerase (DNA) 1 (TOP1) und
Phospholipase A2 (YWHAZ) als potentielle plazentare Housekeeper identifizieren
(Cleal et al. 2009).
6.2 Ergebnisse
6.2.1 Zelldifferenzierung und Zelltod
Die Messung von ßhCG im Überstand ergab einen signifikanten Anstieg nach 48
Stunden sowohl bei den mit 1µg/ml CRH stimulierten Trophoblasten, als auch den
44
nicht stimulierten Kontrollzellen. Ein signifikanter Unterschied in der Expression
konnte nicht nachgewiesen werden. Es zeigt sich daher, dass CRH keinen direkten
Einfluss auf die Synzytialisierung der Zytotrophoblasten hat. Desweiteren lässt der
späte Anstieg darauf schließen, dass ßhCG erst vom Synzytiotrophoblast und nicht
von den Zytotrophoblasten gebildet wird.
Die LDH-Konzentration im Überstand zeigte zu keinem Zeitpunkt, weder bei den
mit 1µg/ml CRH stimulierten Zellen noch bei den nicht stimulierten Kontrollzellen,
einen signifikanten Anstieg. Hierdurch wird eine konstante Vitalität der
Trophoblasten bewiesen. Zu keinem Stimulationszeitpunkt nimmt CRH Einfluss auf
die Reifung der Trophoblasten.
Der gemessene ßhCG-Anstieg ist somit nicht auf eine Zellschädigung oder Zelltod
zurückzuführen sondern ein valider indirekter Marker für die Synzytialisierungsrate
der Zytotrophoblasten. Bei nicht aussagekräftigen ßhCG-Messungen könnte man den
Prozess der Synzytialisierung auch direkt über eine zusätzliche Messung der
Genexpression von Syncytin-1 monitoren (Ruebener et al. 2010).
6.2.2 Leptin-Expression unter CRH-Stimulation
Leptin ist ein, vor allem von differenzierten Fettzellen, sezerniertes Proteohormon,
welches systemisch endokrine Steuerungsvorgänge des Stoffwechsel, der
Energiehomöostase und des Wachstums reguliert (Wauters et al. 2000). Neben diesen
Funktionen kommt Leptin auch eine entscheidende Rolle während der
Schwangerschaft zu. Hier findet sich eine Expression in fetalem sowie plazentarem
Gewebe (Hoggard et al. 1997). Die ausgedehnte Verteilung von Leptinrezeptoren
sowohl in der Plazenta als auch in dem Fetus lässt neben einer para-/autokrinen
Wirkung auch systemische Effekte Leptins in utero auf die Energiehomöostase und
das Wachstum vermuten (Forhead et al. 2009, Bodner et al. 1999). Wie bei
Klaffenbach et al. beschrieben, kommt es während der Schwangerschaft zu einer
erhöhten plazentaren Leptinproduktion (Klaffenbach et al. 2000).
Parallel zu Leptin erfolgt ein physiologischer, kontinuierlicher Anstieg der
synzytialen CRH-Expression bis zum Ende der Schwangerschaft (Ochedalski et al.
2001), wobei CRH entscheidend auf den dezidualen Gefäßtonus Einfluss nimmt
(Clifton et al. 1994). Beide Hormone stehen unter dem regulativen Einfluss von
Glukokortikoiden (Challis et al. 2000). Sowohl für Leptin als auch für CRH werden
45
para-/autokrine Wirkweisen diskutiert. Bislang existieren jedoch nur unzureichende
Daten zur gegenseitigen Einflussnahme dieser Hormone aufeinander.
Unsere Versuche zeigten einen signifikanten Anstieg der trophoblastären
Leptinexpression nach 48h. Während sich dies sowohl in Kontrollzellen, als auch
CRH(1µg/ml)-stimulierten Trophoblasten nachweisen ließ, war die Induktion der
Leptinexpression in CRH stimulierten Trophoblasten ausgeprägter. Basierend auf
den in dieser Arbeit präsentierten Ergebnissen lassen sich daher folgende
Hypothesen formulieren:
Der hier beobachtete spontane Anstieg der Leptinexpression in der Kontrollgruppe in
vitro entspricht plazentaren in vivo Ergebnissen, wonach Leptin im dritten Trimenon
vor allem von ausdifferenzierten Synzytiotrophoblasten gebildet wird, und
vermindert von undifferenzierten Zytotrophoblasten (Ashworth et al. 2000). Ein
Anstieg der Leptinkonzentration im zeitlichen Verlauf könnte daher möglicherweise
mit dem Fortschreiten des trophoblastären Reifungsprozesses zu funktionellem
Synzytium zu erklären sein. Trophoblastäre ßhCG-Produktion im Zellüberstand ist
bei gleichzeitigem Ausschluss erhöhter Zelllyse ein Marker für den
Synzytialisierungsgrad dieser Zellen. Wir konnten keinen Unterschied in der ßhCG-
Konzentration zwischen CRH-stimulierten und Kontrolltrophoblasten zeigen.
Schlussfolgernd könnte man annehmen, dass die gesteigerte Leptinexpression in der
CRH-Gruppe nicht sekundäre Folge einer CRH-induzierten Synzytialisierung war,
sondern die direkte Wirkung von CRH. Der Mechanismus und die funktionelle Rolle
einer solchen Stimulation bleiben unklar. Hypothetisch könnte eine parakrin CRH-
induzierte Leptinexpression des Synzytiums der geburtsinitiierenden Wirkung von
CRH auf das deziduale Gefäßbett und des Myometriums durch seine anti-
apoptotischen Eigenschaften entgegenwirken. Interessant in diesem Zusammenhang
ist die Tatsache, dass bei einer IUGR, welche unter anderem durch eine
Dysregulation im dezidualen Gefäßbett charakterisiert ist, niedrige Leptinspiegel
trotz hoher CRH-Spiegel zu finden sind (Jaquet et al. 1998). Dies könnte ggf. auf
eine Störung in der Kommunikation dieser beiden hormonellen Systeme (wie hier
gezeigt) begründet liegen, wobei der genaue Mechanismus Gegenstand weiterer
Untersuchungen sein wird.
46
6.2.3 11ßHSD-2-Expression unter CRH-Stimulation
11ßHSD-2 ist ein Schlüsselenzym in der Inaktivierung von aktivem Cortisol zu
seiner inaktiven Form Cortison und damit essentieller Bestandteil der plazentaren
Schranke zum Schutz des Fetus vor maternalem Glukokortikoidexzess (Benediktsson
et al 1997). In diesem Zusammenhang wird seine Funktion bei Cortisol-gesteuerten
Prozessen der fetalen Programmierung diskutiert, insbesondere in der Genese eines
metabolischen Phänotyps post-IUGR. In IUGR-Plazenten findet sich eine erhöhte
11ßHSD-2-Expression. Tzschoppe et al. zeigte einen positiven Zusammenhang
zwischen plazentarer 11ßHSD-2-Expression und postnatalem Wachstum bei IUGR
(Tzschoppe et al. 2009).
Unser in vitro Ergebnis an CRH-stimulierten Trophoblasten zeigte keinen
signifikanten Unterschied in Bezug auf die Genexpression von 11ßHSD-2 zu den
Kontrollzellen. Die plazentare CRH-Expression ist von Glukokortikoiden abhängig
und wird vor allem gegen Ende der Schwangerschaft durch diese induziert (Riley et
al. 1991). Die fehlende Wirkung von CRH auf die Expression von 11ßHSD-2 lässt
vermuten dass diese direkt über Glukokortikoidrezeptoren reguliert wird. Trotzdem
ist eine regulierende Rolle von plazentarem CRH nicht ausgeschlossen. Friedberg et
al. zeigte eine CRH-induzierte Reduktion der 11ßHSD-2-Expression in Adipozyten
in vitro (Friedberg et al. 2003). Ein solcher Effekt konnte bisher in der Plazenta noch
nicht nachgewiesen werden. Jedoch ist ein negativer Feedback-Mechanismus von
CRH auf die trophoblastäre 11ßHSD-2 Expression bei fehlender in vitro Stimulation
mit Glukokortikoiden hier nicht gänzlich auszuschließen.
6.3 Ausblick
Wir konnten zeigen, dass die Stimulation primärer humaner Trophoblasten mit CRH
keinen Einfluss auf deren Synzytialisierungsrate in vitro hat. CRH induzierte jedoch
die Leptinexpression in synzytialisierten Trophoblasten, was auf eine Interaktion
dieser Hormone an der feto-maternalen Grenzfläche schließen lässt. Der genaue
Wirkmechanismus des CRH auf die synzytiale Leptinexpression wurde in dieser
Arbeit nicht untersucht und bleibt Gegenstand weiterführender Forschungsprojekte.
Denkbar wäre eine Wirkung von CRH über seine synzytialen Rezeptoren CRH-R1
und -R2 und deren Splicevarianten (Karteris et al. 1998, Gao et al. 2007). Die
Tatsache, dass CRH keinen Einfluss auf den Vorgang der Synzytialisierung unserer
47
Trophoblasten in vitro zeigte, schließt Effekte des Hormons auf bereits
ausdifferenzierte Trophoblasten nicht gänzlich aus.
Einen solchen potentiellen Effekt gilt es in Folgeexperimenten zu überprüfen, wobei
man sich der Bestimmung von trophoblastären Fusionsindices und der
Expressionsrate des trophoblastären Fusionsproteins Syncytin-1 bedienen könnte,
wie bereits durch unsere Arbeitsgruppe beschrieben (Ruebner et al 2010). Weiterhin
kämen als alternative Methode auch in vitro Stimulationsversuche an villösen
Explantkulturen in Frage (siehe methodische Review Orendi et al. 2011).
Es wurden neue Mitglieder der CRH-Familie entdeckt: Urocortin I-III (Gu et al.
2001, Petraglia et al. 1996, Imperatore et al. 2006), welche ähnlich dem CRH an
CRH-R1 und –R2 binden (Richard et al. 2002, Grammatopoulos et al. 2002,
Slominski et al. 2001). Bekannt ist, dass maternale und fetale Plasma-
Urocortinspiegel bei Präeklampsie/IUGR erhöht sind (Florio et al. 2006). Aufgrund
ihrer Analogie zu CRH wären weiterführende Untersuchungen zum Einfluss dieser
Faktoren auf die hier dargestellten plazentaren Zielgene und Prozesse interessant,
insbesondere hinsichtlich einer möglichen lokalen Synergie dieser Hormone mit
CRH auf den Prozess der Synzytialisierung.
48
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8 Abkürzungsverzeichnis
11βHSD-2 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase-2
ß Beta
β2-MG β2-Mikroglobulin
βhCG β-humanes Chorion Gonadotropin
µ Mikro
ACTH Adrenocorticotropes Hormon
A Adenin
bzw. beziehungsweise
C Celsius
C Cytosin
ca. circa
cDNA complementary DNA
COX-2 Cyclooxygenase 2
CRH Corticotropin-Releasing Hormon
CRH-BP Corticotropin-Releasing Hormon-Bindeprotein
CRH-R Corticotropin-Releasing Hormon-Rezeptor
d day, Tag
DEPC Diethylpyrocarbonat
DMSO Dimethylsulfoxide
DNA Desoxyribonukleinsäure
DNase Desoxyribonuklease
dNTP-Mix Desoxyribonukleosidtriphosphat-Mix
EDTA Ethylendiamintetraacetat
e.g. exemplum gratiae
ELISA Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay
EVT extravillöser Trophoblast
FAM 6-Carboxy-Fluorescein
FKS fetales Kälberserum
ggf. Gegebenenfalls
G Guanosin
h hour, Stunde
H2O Wasser
57
HBSS Hanks’ Balanced Salt Solution
HCl Chlorwasserstoff, Salzsäure
HHA-Achse hypothalamo-hypophysär-adrenale-Achse
HPRT Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
IUGR intrauterine growth restriction, intrauterine
Wachstumsrestriktion
l liter, Liter
LDH Laktatdehydrogenase
M Mol
MgCl2 Magnesiumchlorid
min minute, Minute
ml milliliter
MMLV dem Moloney Murine Leukemia Virus
mRNA messenger RNA
NAD/NADH Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid
NKS neonatales Kälberserum
nm nanometer
NO Stickstoffmonoxid
ns nicht signifikant
OT Oxytocin
PAF Platelet activating Factor
PBS Phosphate Buffered Saline
p.c. post conceptionem
PCR Polymerase-Kettenreaktion
PE Präeklampsie
Pen-Strep Penicillin-Streptomycin
PG Prostaglandin
rel relative, relativ
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuklease
ROS Reactive Oxygen Species, reaktive Sauerstoffradikale
ROX passive reference dye (6-Carboxy-X-rhodamin)
RT-PCR Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
58
S Svedberg-Einheiten
sek second, Sekunde
SEM Standarderror of the mean
sog. sogenannt
SZT Synzytiotrophoblast
T Thymin
TAE-Puffer Tris-Acetat-EDTA-Puffer
TAMRA 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin
TOP1 Topoisomerase 1
TRIzol® Reagent Total RNA Isolation Reagent
U Umdrehung
UBC Ubiquitin C
UTP Uridintriphosphat
UV ultraviolet
V Volt
YWHAZ Phospholipase A2
z.B. zum Beispiel
59
9 Danksagung
Zunächst gilt mein besonderer Dank Prof. Dr. med. Jörg Dötsch und Prof. Dr. med
Dr. h.c. Wolfgang Rascher für die außerordentliche gute Betreuung sowie für die
Bereitstellung des Themas.
Weiterhin möchte ich mich bei meinem Betreuer Dr. med. Fabian Fahlbusch für die
unermüdliche und außerordentlich engagierte, sowie kompetente Betreuung und
Beratung bedanken.
Desweiteren möchte ich Prof. Dr. rer. nat. Andrea Hartner für die hervorragende
Betreuung und Hilfestellung danken.
Mein besonderer Dank gilt meiner Mitdoktorandin Karoline Schulz-Harder für die
unermüdliche Unterstützung, Hilfestellung und hervorragende Zusammenarbeit.
Außerdem möchte ich mich bei Julia Seidel und Jens Bode für die tolle
Zusammenarbeit bedanken. Weiterhin gilt mein Dank Dr. med. Anja Tzschoppe,
Kathrin Bitterer und dem gesamten Laborteam der Kinderklinik Erlangen.
Desweiteren möchte ich mich bei Prof. Dr. med. Schild und dem Team der
Geburtshilfe der Universitäts-Frauenklinik Erlangen für die Bereitstellung der
Proben danken.
Zuletzt gilt mein besonderer Dank meinen Eltern Jutta und Werner Offergeld, meiner
Schwester Tanja Offergeld und meinem Freund Michael Tuchscherer für die
unermüdliche moralische Unterstützung und Geduld, ohne den Rückhalt und die
Unterstützung meiner Familie wäre dieser berufliche Werdegang nicht möglich
gewesen.
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