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Posttranslationale Protein-
Modifikationen
BSc Biochemie 4.Semester – VL Proteinchemie
Leipzig, 17.05.2019
Antje Garten
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
POSTTRANSLATIONALE
MODIFIZIERUNG VON PROTEINEN
2
• Wie kann man PTMs nachweisen?
• Wie kann das Funktionsspektrum von
Proteinen durch PTMs erweitert werden?
• Welche Modifikationen gibt es?
-> permanente Modifizierungen
-> temporäre Modifizierungen
C. T. Walsh, Posttranslational Modification of Proteins
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
21. AS: SELENOCYSTEIN
3
Translationale Modifikation: Selenocystein wird auf tRNASec gebildet und durch ribosomale Synthese in Proteine eingebaut
selenocysteine insertion sequence
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
22. AS: PYRROLYSIN
4 Blight, S.K., et al. (2004). Direct charging of tRNA(CUA) with pyrrolysine in vitro and in vivo. Nature 431, 333-335.
H 2 N
H N
O H
O
O
N
H2N
NH2
OH
O
Lysine
Pyrrolysin MmPylRS MbPylRS
CUA
tRNAPyl
CUA
Pyrrolysyl-tRNAPyl
Methanosarcina barkeri fusaro
Translationale Modifikation: Pyrrolysin wird durch pylS (class II aminoacyl-tRNA synthetase) auf pylT tRNA uebertragen
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
POSTTRANSLATIONALE MODIFIZIERUNG
(PTM)
5
…chemische Modifikationen,
die nach der Translation entstehen
Acetylation
Alkylation
Amidation
Biotinylation
Formylation
Glycosylation
Glycation
Hydroxylation
Iodination
- Faltung
- Lokalisation
- Funktion
Isoprenylation
Lypoylation
Oxidation
Palmitoylation
Phosphorylation
Sulfation
…
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
PTM: EINLEITUNG I
6
Phosphoramidit-Baustein
• Modifizierung mit chemischen Gruppen
- Phosphorylierung, Lipidisierung,
- Glykosylierung, Methylierung,…
• Chemische Modifizierung der Aminosäuren
- Citrullin aus Arg, Glu aus Gln, Amidierung, GFP
• Modifizierung mit Peptiden/Proteinen
- Ubiquitinylierung, SUMOylierung
• strukturelle Änderungen
- Disulfidbrücken, proteolytische Spaltung
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
PTM: EINLEITUNG II
7
temporär - permanent • Modifizierung mit chemischen Gruppen
- Phosphorylierung, Lipidisierung,
- Glykosylierung, Methylierung,…
• Chemische Modifizierung der Aminosäuren
- Citrullin aus Arg, Glu aus Gln, Amidierung, GFP
• Modifizierung mit Peptiden/Proteinen
- Ubiquitinylierung, SUMOylierung
• strukturelle Änderungen
- Disulfidbrücken, proteolytische Spaltung
Signale in der Zelle ändern/erweitern die
Eigenschaften der Proteine
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
KOVALENTE ADDITION
ZU SEITENKETTEN VON AMINOSÄUREN
8
Ausgeführt von Enzymen: > 500 Kinasen, > 150 Protein- phosphatasen, …-> benötigen modifizierbare AS-Reste
Asp
Glu
Ser
Thr
Tyr
His
Cys
Met
Lys
Arg
Asn Gln
Gly Pro
Trp
Nucleophiles
Other modifiable amino acids
Weak nucleophile/electrophile
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
9
EINTEILUNG NACH DEN AMINOSÄUREN I
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
EINTEILUNG NACH DEN AMINOSÄUREN II
10
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
WICHTIGE ÜBERTRÄGER FÜR
MODIFIZIERUNGEN I
11
…benötigen aktivierte (elektrophile) Gruppen
Phosphat-
Sulfat-
Glycosyl-
Isoprenyl-
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
WICHTIGE ÜBERTRÄGER FÜR
MODIFIZIERUNGEN II
12
Acyl- ADP-ribose
Methyl-
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
NACHWEIS
13 www.cellsignal.com
• verändertes Laufverhalten im SDS-Gel
-> zu groß (Glykosylierung)/zu klein (Proteolyse)
im Vergleich zur Berechnung
-> verschmierte Banden (Glykosylierung)
• gruppenspezifische
Abspaltung, Unterschied im
SDS-Gel
-> Glykosidasen
PNGase F: Peptide:N-glycosidase F
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
NACHWEIS
14
• Massenspektrometrie
-> nach tryptischer Spaltung
• spezifische Färbereaktionen im Western-Blot
-> anti-Xaa(PO3)-Antikörper
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
MASSENDIFFERENZEN DER RESTE BEI
PTM I
15
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
MASSENDIFFERENZEN DER RESTE BEI
PTM II
16
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
BEISPIEL MASSENSPEKTROMETRIE
17 Casati P et al. Histone Acetylation and Chromatin Remodeling Are Required for UV-B–Dependent Transcriptional Activation of Regulated Genes in Maize. The Plant Cell, 2008. 20: 827-842.
Spectrum of acylated histone H4 peptide
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
BEISPIEL MASSENSPEKTROMETRIE
18 Li Y et al. Methods Mol Biol. 2013;1077:81-104. doi: 10.1007/978-1-62703-637-5_6.
Spectrum of acylated histone H4 peptide
• Zellaufschluss (Ultraschall)
• Reduktion, Alkylierung
• Tryptischer Verdau
• Aufreinigung der Peptide
• Immunaffinitätspräzipitation (Acetyl-Lysine Antikörper)
• Auftrennung mittels Flüssigchromatografie (LC)
• Massenspektrometrie (MS/MS) Analyse und
• Datenauswertung
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
TEMPORÄRE MODIFIZIERUNGEN
19
• Phosphorylierung
• Acetylierung
• Ubiquitinylierung
• Methylierung
Reversible Modifizierungen:
Enzyme 1
Enzyme 2
Donor-
PTM
Protein Protein
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
Phosphorylierung
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wichtigste temporäre Modifizierung!
-> ändert Ladung und Raumerfüllung im Protein
-> Strukturänderung!
Nachweis: SDS-PAGE -> Western Blot, spezif. Antikörper
sodium dodecylsulfat – polyacrylamide gel electrophoresis
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
ja/nein vs Position der Phosphorylierung:
-> Mutagenese oder spezifische AK, u.U.
Massenspektrometrie (MS)
Auswertung:
PhosphoProtein/Protein
WESTERN BLOT
21
AKT
Anti-Totalprotein-Antikörper
Anti-Phosphoprotein-Antikörper
0 0.01 0.1 1 10 100
Insulin (nmol/l)
pAKT(Thr308)
0 0.01 0.1 1 10 100
Insulin (nmol/l)
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
ACETYLIERUNG
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ändert Ladung im Protein -> Strukturänderung!
Nachweis: Western Blot, isoelektrische Fokussierung
(IEF), tryptische Spaltung und MS/MS
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
UBIQUITINYLIERUNG I
23
-> neue Proteinstruktur, neue Interaktion -> Abbau im
Proteasom
Nachweis: Western Blot
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
UBIQUITINYLIERUNG II
24
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
UBIQUITINYLIERUNG - NACHWEIS
25
Nachweis: SDS-PAGE -> Western Blot, spezif. Antikörper
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
N-METHYLIERUNGEN I
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Substrat
Mechanismus
Vergleiche: -7 kcal/mol for Phosphoryl-Transfer von ATP
O, S, C-Methylierung (Arg and Gln)
thermodynamic driving force
-> verändert nicht die kationische Ladung
-> Hydrophobizität wird erhöht, vor allem
bei Di + Trimethylierung!!
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
N-METHYLIERUNGEN II
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Asn Gln
His
Arg
Lys
-> viele verschiedene Methyl-
transferasen
-> unterschiedliche Strukturen
-> alle benutzen SAM
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
METHYL-TRANSFERASEN
28
SAM
Humane Histon N-Methyltransferase
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
HISTON-MODIFIZIERUNG I
29
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname 30
HISTON-MODIFIZIERUNG II
3D-Modell eines Histon-DNA-Komplexes
Histon-Modifikationen:
- Stabilisierung Histon-DNA-
Wechselwirkung
- Rekrutierung anderer Proteine
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
HISTON H3
31
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
N-TERMINUS DES HISTON H3
32
-> 11/36 Reste sind modifiziert
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
HISTON H3 –MULTIPLE
MODIFIKATIONEN
33
Wechselwirkung von
verschiedenen PTMs
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
PERMANENTE MODIFIZIERUNGEN
34
• Glycosylierung • Lipidierung • Kovalente Bindung von Cofaktoren • Carboxylierung • Transglutaminierung • Hydroxylierung
Irreversible Modifizierungen:
Enzym
Donor-
PTM
Protein Protein
• C-Amidierung • Proteolytische Spaltung • Self-modification
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
GLYCOSYLIERUNG I
35
Funktion: Orientierung in der Membran,
Erhöhung der Hydrophilie, Erkennungsstrukturen
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
N-GLYCOSYLIERUNG IM ER: CO-
TRANSLATIONAL
36 https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-
center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/protein-glycosylation.html
ER: endoplasmatisches Reticulum
OSTase: Oligosaccharid-Transferase
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Einrichtungsname
GLYCOSYLIERUNG II
37
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
GLYCOSYLIERUNG IM WESTERN BLOT
38 CRF1R: corticotropin-releasing factor 1 receptor
Mature glycosylated
Mannose-rich glycosylated
Non-glycosylated
Anti-Protein-Antikörper
CRF1R, MW ~45 kDa
5 N-glycosylation sites
PNGaseF
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
LIPIDANKER
39
Translokation in der Zelle
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
KOVALENTE VERBRÜCKUNG VON
COFAKTOREN IN ENZYMEN I
40
Pantothensäure vitamin H
vitamin B5
-> Prosthetische Gruppen
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
KOVALENTE VERBRÜCKUNG VON
COFAKTOREN IN ENZYMEN II
41
Biotin-Carboxylase
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
KOVALENTE VERBRÜCKUNG VON
COFAKTOREN IN ENZYMEN III
42
-> Einführung neuer
Enzymfunktionen
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
MODIFIKATIONEN VON GLU UND GLN
43
Carboxylierung γ-Carboxy-Glu
Transglutaminierung
Transglutaminase
Carboxylase
Verfestigung von Fibrin bei der Blutgerinnung
Blutverdünner, inhibieren die Regenerierung von Vitamin K
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
HYDROXYLIERUNG
44
Prolyl-4- Hydroxylase
Peptidylglycine –α-hydroxylating monooxygenase
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname 45
MODIFIZIERUNGEN DER PROTEINKETTE
C-terminale Amidierung von Peptiden: oxidativ
Peptidylglycine-a-hydroxylating monooxidase (PHM)
PAL - peptidylamidoglycolate
lyase
-> irreversibel
peptidylamidoglycolate
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
MODIFIZIERUNGEN DER PROTEINKETTE
46
Proteolyse: Hormonbiosynthese, Abbau von Proteinen,
schnelle Signalkaskaden: Blutgerinnung, Immunsystem
-> irreversibel
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
BIOSYNTHESE VON INSULIN
47
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
BIOSYNTHESE
VON INSULIN
48
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
GFP: MODIFIZIERUNG DREIER
AMINOSÄUREN
49
-> irreversibel
Self modification / autocatalyzed reaction
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
GFP
50
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
TAKE HOME
51
• Temporäre PTMs
• Phosphorylierung
• Acetylierung
• Ubiquitinylierung
• Methylierung
• Permanente/irreversible PTMs
• Glycosylierung
• Kovalente Bindung von Enzym-Cofaktoren
• Proteolyse
• Enzymsubstrate/Überträger
• Nachweis von PTMs
VIELEN DANK!
Nächstes Mal: Einführung in die
Enzymologie
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