c a u christian-albrechts-universität zu kiel. entwicklung stammspezifischer pcr- systeme mittels...

C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel

Entwicklung stammspezifischer PCR-Systeme mittels subtraktiver

Hybridisierung anhand verschiedener Stämme von Milchsäurebakterien

Von Christian Stelter

Überblick

1. „Subtraktive Hybridisierung“

Ziel der Methode?

Welche Vorteile?

2. Prinzipieller Ablauf der Methode

3. Praktische Ergebnisse

4. Ausblick

Entwicklung

„Subtractive Hybridization“ als Basis, um

• genetische Unterschiede zu identifizieren.

Identifizierung von Genaktivität für

• Embryonalentwicklung

• Krebsentstehung

Identifizieren von Unterschieden im Genom

• verschiedener Stämme von Bakterien

• komplexer eukaryotischer Lebewesen

Biotechnologie in menschlichen Kulturen

• unkontrollierte Fermentation

• 6000 v. Chr. Alkoholische Getränke im Zweistromland

Milchwirtschaft durch Nomaden in Zentralasien

Ziel: Konservierung und Veredelung von Lebensmitteln

D a m als

H e u te

Star

terk

ultu

ren

1 . G e n e ra tio n

Notwendigkeit zur Diagnose

D a m als

H e u te

Star

terk

ultu

ren

1 . G e n e ra tio n

2 . G e n e ra tio n

3 . G e n e ra tio n

• genetische Identität

• Stabilität von Starterkulturen

• hygienische Risiken

• wirtschaftliche Effizienz

routinemäßige Verifikation

durch genetische Fingerabdrücke

Notwendigkeit zur Diagnose

D a m als

H e u te

Star

terk

ultu

ren

1 . G e n e ra tio n

2 . G e n e ra tio n

3 . G e n e ra tio n

• Fingerprinting

Notwendigkeit zur Diagnose

D a m als

H e u te

Star

terk

ultu

ren

1 . G e n e ra tio n

2 . G e n e ra tio n

3 . G e n e ra tio n

4 . G e n e ra tio n • Verständnis probiotischer Eigenschaften

Anwendbarkeit der SSH

Genomische Unterschiede identifizieren/isolieren

Um darauf aufbauend

a) Funktion der unterschiedlichen DNA zu analysieren

b) PCR-basierende Nachweissysteme zu erstellen

c) Eigenschaften in weiteren MOs zu detektieren

Subtraktive Hybridisierung

dominante Quelle der genomischen Variation: Insertionen oder Deletionen großer (10 bis 50 kb) DNA-Regionen

S ta m m A S ta m m B

=

Subtraktive Hybridisierung

gezielte Identifikation von Unterschiedenbesonders vorteilhaft

S ta m m A S ta m m B

=

Subtraktive Hybridisierung

S ta m m A S ta m m B

- =sp ez ifisch e F ra g m en tefü r S ta m m A

Subtraktive Hybridisierung

S ta m m B S ta m m A

- =sp ez ifisch e F ra g m en tefü r S ta m m B

Subtraktive Hybridisierung

Ausgangs-material

S ta m m A S ta m m B

Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung

Fragmentieren

S ta m m A S ta m m B

Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung

Mischen

S ta m m A S ta m m B+

Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung

Denaturieren

S ta m m A S ta m m B+

Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung

Hybridisieren

S ta m m A S ta m m B+

Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung

Isolieren

h o m o lo g e B ere ich e A n re ich e ru n gs tam m sp ez ifisch e r

F rag m e n te

+

wichtige Entwicklungsschritte

Entwicklungen innerhalb der „Subtraktiven

Hybridisierung“ betrafen die Isolierung der

stammspezifischen, einzelsträngigen DNA

a) Immobilisierung

b) Suppression Effekt

Isolierung durch Immobilisierung

ImmobilisierteSubtraktor-DNA

S ta m m B

Isolierung durch Immobilisierung

Zugegebene,denaturierteProben-DNA

S ta m m A

S ta m m B

Isolierung durch Immobilisierung

HomologeDNA-Fragmente

werden demÜberstandentzogen

S ta m m A

S ta m m B

Suppression Subtractive Hybridization

Verwendung von Adaptoren

Vorteile:1) Geringste Mengen2) Suppression Effekt

s tam m sp ez if isc h e

F rag m e n te

F rag m e n te , d ie in b e id enS tä m m e n v o rh a n d en s in d

Suppression Effekt

P C R -A m p lifik a tio n

U n te rd rü c k u n g

“H aa rn ad e l” -S ch le ife

Ve rv ie lfa ch u n g

Vorteile der SH/SSH

• Geringe Materialanforderungen (PCR)

• bis zu 96% der Unterschiede identifizierbar

• Verzicht auf die Sequenzierung vollständiger Genome

• Reduktion des zeitlichen und finanziellen Aufwandes

Bisherige Anwendung

Genomanalysen im medizinischen Bereich:

• Identifikation von Virulenzgenen

• neuartigen Restriktions-Modifikationssystemen

• Antibiotikaresistenzen

• Oberflächenstrukturen

• PAIs: „pathogenicity islands“

Praktische Ergebnisse

Anwendung auf Milchsäurebakterien

Lactococcus St. 1760-1526

Lactococcus St. 1526-1760

• Isolierung der unterschiedlichen Regionen:

• Funktionen der unterschiedlichen Regionen

• Stammspezifische PCR-Systeme

• Suche nach Eigenschaften in anderen MOs

Anreicherung stammspezifischer Fragmente

1526 – 1760 = ? 1760 – 1526 = ?

Gefundene Unterschiede

Lactococcus Stamm 1760

• A2: Bacteriocin-Produktion

• A5: Funktion unbekannt

Lactococcus Stamm 1526

• A22: zellwandassoziierte Proteinase

• A23: Restriktionsmodifikationssystem

[subunit (hsdS) gene]

PCR-Systeme auf die verwendeten Stämme

A2: Nisin

A5: ?

A22: Proteinase

A23: hsdSNisin

?

Proteinase

hsdS

1526 1760

PCR-Systeme auf weitere Stämme

89 bp: ?

166 bp: Proteinase

271 bp: hsdS

322 bp: Nisin

Weitergehende Anwendungen

Identifizieren von probiotischen Eigenschaften

• größere Überlebensrate

• dauerhafte Ansiedlung

• Reduktion von mutagenen Enzymen

• Stimulation von Makrophagen

Identifikation von gentechnisch veränderten Organismen

ehemalige Systementwicklung: Reaktionen auf Stress

Danke

Danisco Cultor Niebüll GmbH

Dr. Udo Friedrich

PD Dr. Winfried Hausner

Noch Fragen?

Wir haben einen Überschussan einfachen Fragenund einen Mangel

an einfachen Antworten.

Lothar Schmidt

Immer noch Fragen?

Gott weiß alles,sagt es aber nicht.

Ich weiß nichtsund sage alles.

unbekannt

Suppression Subtractive Hybridization

Ligation vonAdaptor 2

Tester DNA m it Adaptor 2Driver DNA (im Überschuss)

Erste Hybridisierungm it Denaturierung

Tester DNA m it Adaptor 1

Ligation vonAdaptor 1

Tester DNADriver DNA

EnzymatischerVerdau

Suppression Subtractive Hybridization

Zweite Hybridisierung ohne Denaturierung

Tester-Tester Hom ohybride

Tester-Tester Heterohybride

Tester-Driver Heterohybride

ds-Driver

ss-Driver

ss-Tester

Auffüllen der Enden

A A

C C

B B

D D

E

Suppression Subtractive Hybridization

Zugabe der PrimerPCR-Amplifikation

Zugabe der PrimerPCR-Amplifikation

Nested PCR

E

A

C

B

DAufschm elzen

“Haarnadel”-Schleife

Elongation

Prim er-Annealing

Self-Annealing

ern

eu

ter

PC

R-Z

ykl

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Ab

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hlu

ng

ern

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PC

R-Z

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lus

Tester-TesterHom ohybride

ITRITR