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Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek
Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen
Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2012
© 2012 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH,
Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-0
Verlag: DVG Service GmbH
Friedrichstraße 17
35392 Gießen
0641/24466
geschaeftsstelle@dvg.net
www.dvg.net
91-5
Tierärztliche Hochschule Hannover
Morphologische Untersuchungen an den Atemwegen von
Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) unter besonderer
Berücksichtigung von Clara-Zellen
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
-Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Victoria Seidel
Iwanowo (Russland)
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup
Deutsches Primatenzentrum, Göttingen
Abteilung Infektionspathologie
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup
Tierärztliche Hochschule Hannover,
Deutsches Primatenzentrum, Göttingen
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Gasse
Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 25.05.2012
Meinem Vater, meiner Mutter
und meinem Mann Andreas
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG ................................................................................................... 7
2 LITERATURÜBERSICHT ............................................................................. 8
2.1 Der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus) ................................................................................ 8
2.2 Einsatz von Weißbüschelaffen in der biomedizinischen Forschung ................................... 10
2.3 Anatomie der Lunge ............................................................................................................... 12
2.3.1 Makroskopie ............................................................................................................................. 12
2.3.1.1 Lappung .................................................................................................................................... 13
2.3.1.2 Bronchialbaum .......................................................................................................................... 15
2.3.2 Lunge bei Weißbüschelaffen .................................................................................................... 17
2.4 Nicht-zilierte Zellen des pulmonalen Respirationsepithels ................................................. 19
2.4.1 Flimmerepithel .......................................................................................................................... 19
2.4.2 Nicht-zilierte Zellen des Flimmerepithels ................................................................................. 20
2.4.2.1 Clara-Zellen .............................................................................................................................. 20
2.4.2.2 Becherzellen.............................................................................................................................. 22
2.4.2.3 Pulmonale neuroendokrine Zellen ............................................................................................ 22
2.4.2.4 Basalzellen ................................................................................................................................ 24
2.4.3 Alveolarepithel .......................................................................................................................... 25
2.4.3.1 Pneumozyten Typ I ................................................................................................................... 26
2.4.3.2 Pneumozyten Typ II .................................................................................................................. 27
2.4.4 Pulmonale Surfactant-Proteine ................................................................................................. 28
3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN .................................................................. 30
3.1 Material und Methoden .......................................................................................................... 30
3.1.1 Tiere und Probenmaterial .......................................................................................................... 30
3.1.2 Haltungsbedingungen ............................................................................................................... 30
3.1.3 Probenentnahme ........................................................................................................................ 31
3.1.4 Korrosionstechnik ..................................................................................................................... 33
3.1.5 Computertomographie und Datenauswertung mit MeVisLab .................................................. 33
3.1.6 Zuordnung und Nomenklatur der Bronchialbäume .................................................................. 34
3.1.7 Lichtmikroskopie ...................................................................................................................... 35
3.1.7.1 Histologie und Immunhistochemie ........................................................................................... 35
3.1.8 Elektronenmikroskopie ............................................................................................................. 38
3.1.8.1 Transmissionselektronenmikroskopie ....................................................................................... 38
3.1.8.2 Rasterelektronenmikroskopie.................................................................................................... 39
3.1.9 Datenauswertung und statistische Berechnungen ..................................................................... 39
3.2 Ergebnisse ................................................................................................................................ 42
3.2.1 Makroskopie ............................................................................................................................. 42
3.2.1.1 Bronchialbaum .......................................................................................................................... 44
3.2.2 Histologie und Immunhistochemie ........................................................................................... 59
3.2.2.1 Trachea ..................................................................................................................................... 59
3.2.2.2 Hauptbronchus .......................................................................................................................... 59
3.2.2.3 Lobar- und Segmentbronchus ................................................................................................... 60
3.2.2.4 Bronchiolus ............................................................................................................................... 61
3.2.2.5 Nicht-zilierte Zellen der intrapulmonalen Atemwege ............................................................... 62
3.2.2.6 Alveolarepithel .......................................................................................................................... 69
3.2.2.7 Alveolarmakrophagen ............................................................................................................... 71
3.2.3 Verteilung der nicht-zilierten Zellen in den intrapulmonalen luftführenden Wegen ................ 74
3.2.3.1 Statistische Auswertung der nicht-zilierten Zellen ................................................................... 74
3.2.3.2 Prozentuale Verteilung der nicht-zilierten Zellen im Vergleich zu zilierten und
undifferenzierten Zellen ............................................................................................................ 79
3.2.4 Elektronenmikroskopische Untersuchungen an den Clara-Zellen ............................................ 83
4 DISKUSSION .................................................................................................. 90
5 ZUSAMMENFASSUNG .............................................................................. 105
6 SUMMARY ................................................................................................... 108
7 LITERATURVERZEICHNIS .................................................................... 111
8 ANHANG ...................................................................................................... 127
Einleitung 7
1 EINLEITUNG
Der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus) als nicht-menschlicher Primat ist ein weit
verbreitetes Tiermodell für verschiedene humane Erkrankungen. Im Vergleich zu anderen
Primaten haben diese Neuweltaffen dank ihrer kleinen Größe, ihrer Anpassungsfähigkeit an
Gefangenschaftshaltung, ihrer reproduktiven Besonderheiten und ihrer Kosteneffizienz viele
Vorteile als Versuchstiermodell.
Hintergrund der vorliegenden Arbeit ist die Etablierung eines Tiermodells in nicht-
menschlichen Primaten für chronische Atemwegserkrankungen des Menschen, insbesondere
Asthma und Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD).
Bei Asthma und COPD des Menschen spielen die nicht-zilierten Zellen des respiratorischen
Epithels bekanntermaßen eine wichtige Rolle. Um Veränderungen dieser Zellpopulation im
Tiermodell beurteilen zu können, sind umfassende Kenntnisse zur normalen Verteilung und
Morphologie dieser Epithelzellen sowie allgemeiner Lungenbesonderheiten bei
Weißbüschelaffen unerlässlich. Da es aber in der Literatur kaum Informationen zu den
morphologischen Verhältnissen im Respirationstrakt bei Weißbüschelaffen gibt, ist es das
Ziel dieser Arbeit, umfangreiche Informationen und Daten zur Lungenmorphologie,
Bronchialbaumstruktur, Verteilung und Morphologie von Clara-Zellen, Becherzellen und
neuroendokrinen Zellen im Atmungstrakt von Weißbüschelaffen unterschiedlichen Alters zu
gewinnen bzw. generieren, um Referenzdaten im Vorfeld tierexperimenteller Arbeiten zur
Verfügung zu haben und um Aussagen über die anatomischen Ähnlichkeiten und
Unterschiede zu anderen Tiermodellen und dem Menschen machen zu können.
8 Literaturübersicht
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus)
Callithrix (C.) jacchus, auch als Pinselohraffe, Marmoset oder Weißbüschelaffe bezeichnet,
ist ein tagaktiver, baumbewohnender Primat aus der Gruppe der Neuweltaffen. Nach
aktueller Klassifikation von RYLANDS und MITTERMEIER (2009) sind die Krallenaffen
eine eigenständige Familie (Callitrichidae) innerhalb der Gruppe der Breitnasenaffen
(Platyrrhini), die aus 7 Gattungen besteht: Atlantische Marmosetten (Callithrix),
Zwergseidenäffchen (Cebuella), Zwergmarmosetten (Callibella), Amazonas-Marmosetten
(Mico), Tamarine (Saguinus), Löwenaffen (Leontopithecus) und Springtamarine (Callimico)
(RYLANDS u. MITTERMEIER 2009). Bei der Gattung Callithrix gibt es keine weiteren
Untergattungen. Der Name „Marmosetten“ wurde zum ersten Mal von WOLTERS und
IMMELMANN (1988) eingeführt, die darunter die Gattungen Callithrix und Cebuella
zusammenfassten (WOLTERS u. IMMELMANN 1988). Inzwischen werden die Gattungen
Callithrix, Mico und Callibella als Marmosetten bezeichnet und die Gattungen Saguinus und
Callimico als Tamarine (GEISSMANN 2003; RYLANDS u. MITTERMEIER 2009).
Gemeinsames anatomisches Merkmal der Gattungen Callithrix, Cebuella und Mico ist, dass
alle Zähne im Vordergebiss etwa gleich hoch sind, wobei die Incisivi vergrößert und die
Canini verkürzt sind (GEISSMANN 2003).
Laut der taxonomischen Revision von GROVES (2005) und RYLANDS u. MITTERMEIER
(2009) besteht die Gattung Callithrix aus 6 Arten (GROVES 2005; RYLANDS u.
MITTERMEIER 2009):
C. jacchus - Weißbüschelaffe
C. penicillata - Schwarzpinselaffe
C. kuhli - Bahia-Seidenaffe
C. geoffroyi - Weißgesichtsseidenaffe
C. aurita - Weißohrseidenaffe
C. flaviceps - Gelbkopfbüschelaffe
Literaturübersicht 9
Weißbüschelaffen weisen eine vorwiegend graubraune Fellfärbung auf. Das Rücken- und
Schwanzfell ist in hellgrauen Tönen transversal gestreift (SCHRÖPEL 2010). Im Alter von
etwa drei Monaten beginnen sich die typischen Gesichtszeichnungen dieser Tierart, weiße
Ohrbüschel, auszubilden (SCHRÖPEL 2010). STEVENSON und RYLANDS (1988) geben
für den adulten Weißbüschelaffen Kopf-Rumpf-Längen von ca. 25 cm und Schwanzlängen
von 28 cm an. Das Gewicht wildlebender Tiere beträgt 317,9 +/- 34,1 g für Männchen und
322,0 +/- 40,4 g für Weibchen. In Laborhaltung wurden mit 347,6 +/- 30,5 g (Männchen)
und 359,7 +/- 50,4 g (Weibchen) etwas höhere Werte ermittelt (ARAUJO et al. 2000).
Im Alter von 9 bis 13 Monaten werden die männlichen Weißbüschelaffen geschlechtsreif,
weibliche Tiere allerdings erst nach ca. 20 Monaten (EISENBERG 1977). Laut HEARN
(1983) beträgt die Ovarialzyklusdauer 28,6 +/- 1,0 Tage (HEARN 1994). Nach einer
Tragzeit von 141-146 Tagen gebären Weißbüschelaffen in bis zu 65 % der Fälle Zwillinge,
die Blut- und Stammzellchimären sind (HEARN 1983, 1994; A. KÖNIG 1995;
GEISSMANN 2003; SCHRÖPEL 2010).
Die Weißbüschelaffen sind vor allem im Nordosten Brasiliens und bis zum Rio Sao
Francisco bzw. südwestlich bis zum Rio Grande verbreitet. In diesem Gebiet herrscht ein
gemischtes Klima, und es sind verschiedene Vegetationsformen vorhanden, die eine hohe
Anpassungsfähigkeit der Tiere verlangen. Die Luftfeuchtigkeit im atlantischen Küstenwald
ist mit 77 - 99 % (auch in der Trockenzeit) sehr hoch. Niederschläge kommen außerhalb der
Regenzeit (Juni bis Juli) eher selten vor. Die Temperaturschwankung in diesem Gebiet
beträgt zwischen 21 und 31° C. Die Tiere sind häufig im Sekundärwald anzutreffen, der
zusammen mit Zuckerrohr- und Cashewnuss-Plantagen reichlich vorhanden ist
(SCHRÖPEL 2010). Je nach Literaturquelle liegt die Lebenserwartung der
Weißbüschelaffen in freier Wildbahn zwischen 10 und 16 Jahren. In Laborhaltung reicht sie
bis zu 18 Jahren (NOWAK 1999). Im Deutschen Primatenzentrum (DPZ), das seit 30 Jahren
über eine große Weißbüschelaffenkolonie verfügt, leben einzelne Tiere, die schon mehr als
20 Jahre alt sind.
10 Literaturübersicht
2.2 Einsatz von Weißbüschelaffen in der biomedizinischen
Forschung
Weißbüschelaffen werden in den letzten Jahren zunehmend als Tiermodell in der
biomedizinischen Forschung eingesetzt (SASAKI et al. 2009). Während sie zunächst
hautsächlich im Bereich der Infektionsforschung, der Reproduktionsbiologie, der
Neurowissenschaften sowie der Verhaltensforschung eingesetzt wurden, finden sie heute
zunehmend Verwendung in der Arzneientwicklung sowie für die Sicherheitsbewertung von
Substanzen in toxikologischen Studien (MANSFIELD 2003).
In der Infektionsforschung zeigen die Weißbüschelaffen eine hohe Empfänglichkeit für
einige wichtige humane Infektionserreger, u.a. Yersinia pseudotuberculosis, Herpesviren
und Toxoplasma gondii. Außerdem werden sie auch zur Erforschung von
Alterserkrankungen wie der Alzheimer Krankheit und altersbedingter Gehörabnahme
(TARDIF et al. 2010) sowie für Atemwegserkrankungen wie dem Schweren Akuten
Respiratorischen Syndrom (SARS) eingesetzt (GREENOUGH et al. 2005). Weitere
biomedizinische Einsatzgebiete sind Onkologie, Virologie (ADAMS et al. 2008),
Pharmakologie (CHELLMAN et al. 2009), Teratologie, Endokrinologie, Osteologie,
Autoimmunerkrankungen und Transplantationsimmunologie. Zusammenfassend sind in der
Tabelle 1 Krankheitsmodelle und Forschungsbereiche aufgeführt, in denen
Weißbüschelaffen als Tiermodell eingesetzt werden.
Aufgrund ihrer geringen Größe können diese nicht-menschlichen Primaten auch in kleineren
Käfigen artgerecht in Gruppen gehalten werden. Die Größe erleichtert zudem das Handling
der Tiere. Dazu kommen ökonomische Vorteile: da in der Arzneimittelentwicklung das
Verbrauchsmaterial nach Gewicht des Tieres berechnet wird, sind Weißbüschelaffen im
Vergleich zu Rhesusaffen (etwa 5 - 10 kg) 10 - 15 mal kostengünstiger (ORSI et al. 2010).
Durch die frühe Geschlechtsreife und die gute und konstante Reproduktion in Laborhaltung
ergeben sich darüber hinaus Vorteile bezüglich zeitlicher Aspekte, da im Vergleich zu
anderen Affenspezies in kürzerer Zeit reproduzierbare Datensätze erhoben werden können.
Literaturübersicht 11
Tabelle 1: Einsatz der Weißbüschelaffen für Krankheitsmodelle und Forschungsbereiche.
(MANSFIELD 2003; ORSI et al. 2010).
Neurowissenschaften Multiple Sklerose
Parkinson-Krankheit
Chorea Huntington (Huntington-
Krankheit)
Schlaganfall
Alzheimer-Krankheit
Absence-Epilepsie
Alterung
Rückenmarksverletzung
Immunologie Thymusepithelium
Interleukin 2und 4
Amyloid A (AA) Amyloidose
Induzierte thrombozytopenische Purpura
Infektionskrankheiten Hepatitis
Östliche Pferdeenzephalomyelitis
Schweres Akutes Respiratorisches
Syndrom (SARS)
Viruspersistenz
HIV
Masern
Milzbrand
Pocken
Hämorrhagisches Fieber
Filariose
Malaria
Urogenitale Infektionen
Legionellose
Prionkrankheiten
Andere Reproduktive Biologie und
Immunokontrazeption
Knochenerkrankungen
Humane Physiologie
Verhaltenswissenschaften
12 Literaturübersicht
2.3 Anatomie der Lunge
2.3.1 Makroskopie
Bei Menschen und Haus- und Labortieren unterscheidet man zwei im Brustraum liegende
Lungen, eine rechte (Pulmo dexter) und eine linke (Pulmo sinister). Sie gliedern sich in
Lappen, Segmente, Läppchen und Azini (LARSEN u. ZIEGENFUSS 2009).
Man differenziert drei äußere Lungenflächen, die von einem einschichtigen flachen Epithel
(Serosa bzw. Pleura) überzogen sind: Facies diaphragmatica, Facies mediastinalis und
Facies costalis (jeweils angrenzend an das Zwerchfell, das Mediastinum und die Rippen)
(MOLL u. MOLL 2005; H. KÖNIG u. LIEBICH 2008). Auf diesen Flächen sind zwei
Kanten zu finden: bei menschlichen Lungen zwischen Facies mediastinalis und Facies
costalis der Margo anterior und beim Übergang zwischen Facies costalis und Facies
diaphragmatica der Margo inferior (MOLL u. MOLL 2005). Bei Haustierlungen nennt man
den stumpfen dorsalen Rand der Lunge Margo dorsalis oder obtusus und den gegenüber
stehenden scharfen Rand Margo acutus (H. KÖNIG u. LIEBICH 2008).
Die rechte und linke Lunge befindet sich jeweils in einer Cavitas pleuralis (in dieser Arbeit
wird aufgrund der starken Ähnlichkeit von Weißbüschelaffen und Menschen sowie der
Motivation dieser Arbeit an einigen Stellen die Human-Nomenklatur benutzt, die Cavitas
pleuralis hieße in der Veterinärnomenklatur Cavum pleurae). Sie werden von einer Pleura
pulmonalis (Pleura visceralis) überzogen, die durch einen schmalen Spalt von der Pleura
parietalis getrennt wird. Im Pleuralspalt befindet sich ein Flüssigkeitsfilm, der die
Verschiebung der Lungen gegenüber der Brustwand ermöglicht (LARSEN u.
ZIEGENFUSS 2009). Die Pleura parietalis ist äußerst schmerzempfindlich, da sie viele
Nerven enthält. Im Gegensatz dazu hat die Pleura visceralis keine sehr ausgeprägte
Innervation (WALDEYER 2003).
Literaturübersicht 13
2.3.1.1 Lappung
Die Lungenlappung bei Säugetieren ist artspezifisch unterschiedlich ausgebildet. Als Basis
für die Bezeichnung der einzelnen Lungenlappen dient die Aufzweigung des
Bronchialbaums (H. KÖNIG u. LIEBICH 2008). Bei Menschen besteht die rechte Lunge
aus drei Lappen (LARSEN u. ZIEGENFUSS 2009):
- Oberlappen (Lobus superior);
- Mittellappen (Lobus medius);
- Unterlappen (Lobus inferior).
Die linke Lunge hingegen besteht nur aus zwei Lappen:
- Oberlappen (Lobus superior);
- Unterlappen (Lobus inferior).
In der Tabelle 2 wird zusammenfassend die Lappung der Lunge bei Menschen, Labor- und
Haustieren dargestellt.
Die Lungenlappen sind bei Menschen (und größeren Säugetieren wie Rindern und Pferden)
mit interlobäre bindegewebige Septen verbunden. Bei Rhesusaffen sind die Septen nur
schwach entwickelt, und bei Mäusen und Ratten fast gar nicht vorhanden (PLOPPER 1996).
14 Literaturübersicht
Tabelle 2: Lungenlappung bei Menschen, Labor- und Haustieren (ELLENBERGER u.
BAUM 1943; MERCER et al. 1987; TYLER et al. 1988; WEIBEL 1989; HARKEMA et al.
1991; MCBRIDE 1992).
Linke Lunge Rechte Lunge
Mensch Lobus superior
Lobus inferior
Lobus superior
Lobus medius
Lobus inferior
Rhesusaffe Lobus cranialis
Lobus caudalis
Lobus cranialis
Lobus medius
Lobus caudalis
Lobus accessorius
Ratte Lobus cranialis
Lobus caudalis
Lobus cranialis
Lobus medius
Lobus caudalis
Lobus accessorius
Maus Lobus cranialis
Lobus caudalis
Lobus cranialis
Lobus medius
Lobus caudalis
Lobus accessorius
Schwein Lobus cranialis
(zweigeteilt)
Lobus caudalis
Lobus cranialis
Lobus medius
Lobus caudalis
Lobus accessorius
Pferd Lobus cranialis
Lobus caudalis
Lobus cranialis
Lobus caudalis
Lobus accessorius
Literaturübersicht 15
2.3.1.2 Bronchialbaum
Erste Erkenntnisse über den Bronchialbaum der Säugetiere, inklusive des Menschen,
wurden im Jahr 1880 von AEBY (1880) veröffentlicht.
Die Luftröhre (Trachea) ist eine flexible Röhre, die den Kehlkopf mit den Hauptbronchien
verbindet. Bei menschlichen Erwachsenen ist sie 10 bis 12 cm lang und hat einen
Durchmesser zwischen 1,2 und 1,5 cm (MOLL u. MOLL 2005). Die Trachea wird von
hyalinen Knorpelspangen stabilisiert, die je nach Tierart unterschiedliche Form und Anzahl
haben können (H. KÖNIG u. LIEBICH 2008). Die Trachea des Menschen, des Hundes, und
des Pferds besitzt C-förmige Knorpelspangen (MOLL u. MOLL 2005; H. KÖNIG u.
LIEBICH 2008). Beim Schwein hat sie die Form eines fast verschlossenen Ringes mit
überlappenden Enden, und beim Rind sind die Enden der Spangen nach dorsal aufgebogen
(H. KÖNIG u. LIEBICH 2008). Die dorsalen Enden der Knorpelspangen werden von
transversal verlaufender glatter Muskulatur (Musculus trachealis) verschlossen (DRAKE et
al. 2007). Bei den meisten Säugetieren teilt sich die Trachea an dem keilförmigen
Knorpelstück Carina tracheae über die Bifurcatio tracheae in zwei Hauptbronchien
(Bronchi principales), die weiter zur linken und rechten Lunge führen. Bei Wiederkäuer und
Schwein entlässt die Trachea auf der rechten Seite vor ihrer Bifurcatio tracheae einen
Bronchus trachealis. Er ist für die Belüftung des Lobus cranialis verantwortlich (H.
KÖNIG u. LIEBICH 2008). Im weiteren Verlauf verzweigt sich jeder Hauptbronchus in
Lappenbronchien (Bronchi lobares). Je nach Säugetierart können die Abzweigungen
innerhalb der Lappenbronchien jedoch unterschiedlich sein (H. KÖNIG u. LIEBICH 2008).
Die Verzweigung der Bronchien beim Mensch erfolgt dichotomisch (LARSEN u.
ZIEGENFUSS 2009). Das Aufzweigungsprinzip bei nicht-menschlichen Primaten ist relativ
einzigartig: es kann dichotomisch und trichotomisch sein. Die Bronchialsegmente
verzweigen sich dabei unter einem Winkel von etwa 45° (PLOPPER 2005). Beim Menschen
teilt sich der rechte Hauptbronchus in drei Lappenbronchien (Bronchi lobares superior,
medius und inferior) auf. Der linke Hauptbronchus teilt sich in zwei Lappenbronchien
(Bronchi lobares superior und inferior) auf (MOLL u. MOLL 2005). Danach verzweigen
16 Literaturübersicht
sich die Lappenbronchien in Segmentbronchien (Bronchi segmentales), die zu einzelnen
bronchopulmonalen Lungensegmenten innerhalb eines Lappens führen. Unter einem
bronchopulmonalen Segment versteht man eine selbstständige funktionstüchtige
Atmungseinheit, die einen Segmentbronchus und eine zugehörige pulmonale Arterie besitzt
(DRAKE et al. 2007). Auf der rechten Seite befinden sich beim Menschen 10
Segmentbronchien:
Bronchus lobaris superior mit 3 Segmentbronchien (1.-3. Lungensegment);
Bronchus lobaris medius mit 3 Segmentbronchien (4.-5. Lungensegment);
Bronchus lobaris inferior mit 5 Segmentbronchien (6.-10. Lungensegment);
Auf der linken Seite sind nur 9 Segmentbronchien vorhanden:
Bronchus lobaris superior mit 5 Segmentbronchien (1.-5. Lungensegment);
Bronchus lobaris inferior mit 4 Segmentbronchien (6.-10. Lungensegment, der 7.
Bronchus fehlt);
Den Segmentbronchien schließen sich mehrere Generationen von Bronchi intrasegmentales
an: mittlere, kleine und kleinste. Die Bronchi lobares, Bronchi segmentales und die anderen
kleineren Bronchien besitzen Knorpelspangen, die unregelmäßig ringförmig in der Wand
angeordnet sind (WALDEYER 2003). Weiterhin gehen die Bronchi subsegmentales in
Bronchioli veri über. In der Humanliteratur spricht man von Bronchiolen, wenn sie weniger
als 1 mm im Durchmesser sind und keine Knorpelplatten haben. Nach mehreren
Verzweigungen gehen die Bronchioli veri in Bronchioli terminales über (DRAKE et al.
2007) und teilen sich schließlich in die Bronchioli respiratorii auf. Bronchioli respiratorii
sind Bronchiolen, in deren alveolären Aussackungen der Gasaustausch stattfindet. Die
Letzteren teilen sich noch 3 mal und zweigen sich in Ductuli alveolares auf. Von den
Ductuli alveolares gehen die Alveolen ab, die sich traubenartig um einen Ductulus
alveolaris herum gruppieren. Gruppen von Alveolen werden als Sacculi alveolares
bezeichnet (MOLL u. MOLL 2005) (Abbildung 1).
Literaturübersicht 17
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Bronchialbaums (H. KÖNIG u. LIEBICH
2008).
Für die großen Menschenaffen (Schimpansen (NAKAKUKI 1992), Orang-Utans
(NAKAKUKI u. EHARA 1991) und Gorillas (NAKAKUKI 1991)) liegen ausführliche
Daten über den Bronchialbaum vor. Es konnte gezeigt werden, dass die Verzweigung des
Bronchialbaums des Menschen und der Menschenaffen weitgehend übereinstimmt
(NAKAKUKI 1992).
2.3.2 Lunge bei Weißbüschelaffen
Erste Beschreibungen der anatomischen Charakteristika der Lunge von Weißbüschelaffen
finden sich in den wissenschaftlichen Arbeiten von FORBES (1880), WELDON (1884) und
BEDDARD (1901). Eine makroskopische und histologische Beschreibung der
18 Literaturübersicht
Lungenmorphologie bei Callithrix jacchus erfolgte erstmalig von SURRIBAS u.
LAWZEWITSCH (1987) und von FOERSTER (1988).
Die etwa 3 cm lange Trachea teilt sich in zwei Hauptbronchien (SURRIBAS u.
LAWZEWITSCH 1987). Die Lunge von einem adulten Weißbüschelaffen hat, gemessen
von der oberen Kante des oberen Lappens bis zur unteren Kante des unteren Lappens, eine
Ausdehnung von etwa 3,5 cm und ist, wie bei allen luftatmenden Lebewesen, von Pleura
überzogen (SURRIBAS u. LAWZEWITSCH 1987). Die Lunge ist unterteilt in sechs
Lappen: zwei auf der linken Seite und vier auf der rechten Seite. Die beiden oberen Lappen
(Lobus cranialis sinister und Lobus cranialis dexter) haben eher eine ovale Form. An seiner
Spitze hat der obere linke Lappen (Lobus cranialis sinister) sehr häufig eine Einkerbung.
Die beiden unteren Lappen (Lobus caudalis sinister und Lobus caudalis dexter) sind die
größten. Kranial des Herzens und kaudal des Zwerchfells liegt der mittlere Lappen (Lobus
medius), der eine langgezogene, spitz auslaufende Gestalt aufweist. Der infrakardiale
Lappen (Lobus accessorius) befindet sich auf der rechten Seite und ist im Vergleich zu den
anderen Lappen beweglicher (FOERSTER 1988).
Eine Übersicht über die pränatale Entwicklung sowie die Morphologie der Lunge in der
neonatalen Periode bei Weißbüschelaffen gibt die Arbeit von FOERSTER (1988). In dieser
Arbeit wurden mit Hilfe von Lupen-, Licht- und Elektronenmikroskopie die einzelnen
Phasen der Lungenentwicklung identifiziert und mit denen anderer nicht-menschlicher
Primaten bzw. des Menschen verglichen. Die Lungenentwicklung bei Weißbüschelaffen
stimmt weitgehend mit der anderer Primaten überein.
Literaturübersicht 19
2.4 Nicht-zilierte Zellen des pulmonalen Respirationsepithels
2.4.1 Flimmerepithel
Die Trachea, Hauptbronchien und intrapulmonalen Atemwege sind von einem
respiratorischen Flimmerepithel (Abbildung 2) ausgekleidet. Die Höhe des Flimmerepithels
nimmt entlang des Bronchialbaums in distale Richtung der Alveolen kontinuierlich ab. In
der Trachea, den Hauptbronchien und den Bronchien befindet sich ein mehrreihiges
hochprismatisches Epithel, wohingegen die Bronchiolen von einem einschichtigen
isoprismatischen Flimmerepithel ausgekleidet sind (LIEBICH 2009). Die größte
Zellpopulation des respiratorischen Epithels stellen zilierte Zellen dar (SHAH et al. 2009).
Diese besitzen am apikalen Zellpol Zilien, die koordiniert Bewegungen in Richtung des
Pharynx ausführen und damit eine wichtige Rolle bei der mukoziliären Clearance spielen
(WELSCH 2006). Die Oberfläche des respiratorischen Flimmerepithels wird von einem
seromukösen Sekretfilm überzogen, der von Becherzellen und Bronchialdrüsen produziert
wird und zur Reinigung der Atemwege von Pathogenen und Fremdpartikeln (z. B. Staub)
dient. Der Schleimfilm wird in zwei Phasen unterteilt: eine Sol- und Gelphase (LARSEN u.
ZIEGENFUSS 2009). Für die mukoziliäre Clearance ist die Anzahl, Struktur, Aktivität und
koordinierte Bewegung der Zilien sowie eine ausreichende Sekretproduktion der nicht-
zilierten Zellen relevant. Beim Menschen setzt eine optimale Funktion der mukoziliären
Clearance eine Körpertemperatur von 37 °C und eine intrapulmonale absolute Feuchtigkeit
von 44 mg/l entsprechend einer relativen Feuchtigkeit von 100 % voraus (OCZENSKI et al.
2008).
Eine erste Beschreibung zur Histologie des Flimmerepithels im Respirationstrakt von
Weißbüschelaffen lieferten SURRIBAS und LAWZEWITSCH (1987). Das einschichtige
iso- bis hochprismatische Epithel kleidet die Nasen-, Trachea- und stellenweise die
Bronchialbereiche aus. Das bronchioläre Epithel zeichnet sich durch einreihiges kubisches
Epithel aus (SURRIBAS u. LAWZEWITSCH 1987).
20 Literaturübersicht
2.4.2 Nicht-zilierte Zellen des Flimmerepithels
2.4.2.1 Clara-Zellen
Clara-Zellen (Abbildung 2) sind nicht-zilierte, sekretorisch aktive Zellen, die erstmals von
KÖLLIKER (1881) und später von CLARA (1937) in den terminalen Bronchiolen bei
Kaninchen und Mensch beschrieben wurden. Clara-Zellen erfüllen verschiedene wichtige
Funktionen im respiratorischen Epithel der Lunge. Sie sind involviert in die Regulation von
Entzündungsprozessen und in die Regeneration des Bronchialepithels. Weiterhin können sie
bei Schädigungen des respiratorischen Epithels als Vorläuferzellen für andere zilierte und
nicht-zilierte Zellen dienen (REYNOLDS u. MALKINSON 2009). Ihre Hauptfunktion liegt
in der Synthese und Sekretion verschiedener Substanzen. Sie sezernieren hauptsächlich das
Clara-Zell-Protein, das auch als Clara Cell Secretory Protein (CCSP) bekannt ist. Spezies-
und organabhängig kann man dieses Protein auch unter anderen Namen finden: CC10,
CC16, Uteroglobulin oder Blastokinin (COPPENS et al. 2007).
Durch die Bildung der Surfactant-Proteine A, B und D, die für die unspezifische
Immunabwehr erforderlich sind, tragen die Clara-Zellen zum pulmonalen Surfactant-System
bei (PLOPPER 1996; REYNOLDS u. MALKINSON 2009). Surfactant-Proteine setzen die
Oberflächenspannung herab und ermöglichen die Zilienbewegung unter dem Schleim. Eine
wesentliche detoxifizierende Wirkung für die gesamte Lunge wird den Clara-Zellen
aufgrund verschiedener intrazytoplasmatischer Enzymsysteme, insbesondere einer
Zytochrom-P-450 (CYP) und einer Flavin-enthaltenden Monooxygenase (FMO),
zugeschrieben (DROMMER et al. 1987; DEVEREUX et al. 1989). Bei Rhesusaffen sind
diese jedoch nur in geringem Maße nachweisbar (PLOPPER 1996). Bei den meisten anderen
Labortieren ist eine Zytochrom-P-450-Expression, insbesondere von CYP2B und CYP4B,
nachweisbar. Weiterhin spielen die Clara-Zellen eine wichtige immunmodulierende Rolle,
weil sie Glykosaminoglykane, Lysozym und sekretorisches Immunglobulin A (IgA)
sezernieren können (SINGH u. KATYAL 2000).
Literaturübersicht 21
Hinsichtlich ihrer Morphologie weisen Clara-Zellen große, spezies-abhängige Unterschiede
auf. Insbesondere ihre Granula, die Menge von Glykogen, das raue endoplasmatische
Retikulum (RER) und das glatte endoplasmatische Retikulum (GER) unterliegen
tierartspezifischen Variationen (PLOPPER et al. 1980a; PLOPPER et al. 1980c; PLOPPER
1983, 1996; REYNOLDS u. MALKINSON 2009).
Man glaubte viele Jahre, dass sich Clara-Zellen nur in den terminalen Bronchiolen befinden.
PLOPPER et al. (1983) konnten jedoch nachweisen, dass die Clara-Zellen bei einigen
Tierarten nicht nur in den Bronchiolen, sondern auch in der Trachea und den
Hauptbronchien vorkommen, wie z. B. bei Rhesusaffe, Maus, Hamster und Kaninchen
(PLOPPER et al. 1983; MARIASSY 1992; COPPENS et al. 2007). Im Gegensatz zu diesen
Tieren sind die Clara-Zellen in der menschlichen Lunge erst ab Höhe der terminalen
Bronchiolen zu finden (BOERS et al. 1999). Immunhistochemisch können Clara-Zellen mit
Antikörpern gegen CCSP dargestellt werden (SINGH u. KATYAL 1997; COPPENS et al.
2007).
Ultrastrukturell weisen Clara-Zellen die für sie typischen elektronendichten Granula auf. Bei
der Katze fehlen diese vollständig (PLOPPER et al. 1980c). Die Mitochondrien können in
der Größe sehr variabel sein. Die größten von ihnen sind zugleich in großen Mengen z.B.
bei Maus und Meerschweinchen zu finden. Die Glykogenspeicherung im Zytoplasma ist
besonders ausgeprägt bei Ratten, Rindern und Kaninchen (PLOPPER u. HYDE 1992; EL-
GAWAD u. WESTFALL 2000). Von einem besonders großen Nukleus wird häufig bei
menschlichen Clara-Zellen berichtet (SMITH et al. 1979). Mit Hilfe der
Elektronenmikroskopie ist der Sekretionsmodus der Clara-Zellen darstellbar: ein apokriner
Typ der Sekretion liegt vor, wenn die Zellen ihre Sekretionsgranula unter Verlust ihres
Zytoplasmas in sogenannten „apical caps“ abschnüren; bei dem merokrinen Typ trennen
sich die Granula ohne Verlust des Zytoplasmas von der Zelle. Beide Sekretionsmodi wurden
bei den Clara-Zellen des Pferdes beobachtet (DROMMER et al. 1987). In der vorhandenen
wissenschaftlichen Literatur liegen bis jetzt keine morphologischen Daten zu Clara-Zellen
bei Weißbüschelaffen vor.
22 Literaturübersicht
2.4.2.2 Becherzellen
Becherzellen sind nicht-zilientragende, becherförmige, schleimproduzierende Zellen, die im
respiratorischen und intestinalen Epithel sowie in den Konjunktiven des Auges vorkommen.
Sie produzieren hauptsächlich Muzine, die sich unter Wasseraufnahme zu Mukus (Schleim)
umbilden. Becherzellen geben ihre Sekrete auf der Zelloberfläche auf apokrinem und
merokrinem Sekretionsweg ab. Chronische Atemwegserkrankungen, wie z. B. Asthma,
COPD und zystische Fibrose, führen zu einer Hyperplasie und Hypertrophie der
Becherzellen. In der Folge verändert sich aufgrund einer Hypersekretion von Muzinen das
Volumen und die Zusammensetzung des Mukus (ROGERS 2003). Histologisch können
Becherzellen mit der PAS-Reaktion oder immunhistochemisch mit muzinbindenden
Antikörpern wie z. B. MUC5AC nachgewiesen werden.
Ultrastrukturell zeigen Becherzellen eine becherförmige Morphologie und liegen zwischen
den zilientragenden Zellen. In den apikalen Bereichen des Zytoplasmas sind die
charakteristischen elektronendurchlässigen, muzin-enthaltenden Granula zu finden. Im
basalen Bereich befinden sich das raue endoplasmatische Retikulum, Mitochondrien, der
Nukleus und weitere Organellen (TOMASHEFSKI u. FARVER 2008).
Bis jetzt ist sehr wenig bekannt über die Becherzellen von Weißbüschelaffen. SURRIBAS
und LAWZEWITSCH (1987) erwähnt in seiner Arbeit nur kurz, dass sie in der Trachea in
geringer Anzahl vorhanden sind.
2.4.2.3 Pulmonale neuroendokrine Zellen
Seit der ersten Erwähnung von FEYRTER (1938) haben die pulmonalen neuroendokrinen
Zellen (PNEZ) (Abbildung 2) großes wissenschaftliches Interesse hervorgerufen
(FEYRTER 1938; PAN et al. 2004). Sie kommen in geringer Anzahl bei den meisten
Säugetieren, Reptilien, Amphibien, Vögeln und sogar in den Kiemen von Fischen vor
(SORHAUG 2007). Disseminiert im respiratorischen Epithel treten sie einzeln oder in Form
korpuskulärer Zellaggregate, sogenannter „neuroepithelial bodies“, auf (CUTZ 1982). Es ist
Literaturübersicht 23
bekannt, dass beim Menschen pulmonale neuroendokrine Zellen von dem respiratorischen
Epithel der Nasenhöhle bis zu den bronchioalveolären Regionen vorkommen (SORHAUG
2007). Sie sind meistens nahe an der Basalmembran lokalisiert (HARKEMA et al. 1991).
Neuroepithelial bodies (NEBs) befinden sich eher im Bifurkationsbereich und an den
Übergangsstellen zwischen den Bronchiolen und Alveolen (SORHAUG 2007).
Viele funktionelle und morphologische Eigenschaften teilen die pulmonalen
neuroendokrinen Zellen mit anderen neuroendokrinen Zellen, die z.B. im
Gastrointestinaltrakt vorkommen. Sie synthetisieren und geben bioaktive Peptide und Amine
ab, die über das Blut (endokrin) auf Zielzellen wirken können. NEBs können als
Sauerstoffsensoren dienen. Sie haben engen Kontakt mit Nervenfasern, und die
Sekretprodukte der NEBs können daher als Neurotransmitter agieren (SORHAUG 2007).
Laut SOROKIN et al. (1993) und HOYT et al. (1993) spielen PNEZ eine regulatorische
Rolle in der Lungenentwicklung. Während der pulmonalen Organogenese reifen die PNEZ
als erster Zelltyp aus. Es wird vermutet, dass die von PNEZ produzierten Peptide einen
parakrinen stimulierenden Effekt auf ihre Nachbarzellen haben und damit für die Ausreifung
der Lungen verantwortlich sind (SORHAUG 2007).
Die von den PNEZ bzw. NEBs produzierten Peptide sollen weiterhin die
Entzündungsreaktion bei Erkrankungen wie Asthma und COPD modulieren (SORHAUG
2007). Außerdem werden den PNEZ bzw. NEBs weitere Funktionen wie die Regulation der
pulmonalen Blutbahn und des bronchialen Tonus zugeschrieben (SORHAUG 2007).
Ausgereifte PNEZ haben eine konische oder spindelförmige Struktur, die mit ihrer basalen
Oberfläche an die Basallamina grenzt. Die dünnen apikalen Teile der Zellen dehnen sich in
Richtung des Lumens aus (JOHNSON 1991).
Mit verschiedenen histologischen Techniken, wie z. B. Versilberungen, kann eine prägnante
Argyrophilie der Granula nachgewiesen werden (GRIMELIUS 2004). Dann zeigen die
neuroendokrine Zellen ihre charakteristischen argyrophilen, endokrinen Granula
(DIAUGUSTINE u. SONSTEGARD 1984). Immunhistochemisch kann diese
Zellpopulation mit den üblichen neuroendokrinen Markern, wie z.B. Neuronspezifische
24 Literaturübersicht
Enolase (NSE) oder Chromogranin A, gut dargestellt werden (WHARTON et al. 1981).
Weitere immunhistochemische Marker für pulmonale neuroendokrine Zellen bzw.
neuroepithelial bodies sind Calcitonin gene-related peptide (CGRP) und gastrin releasing
peptide (GRP, bombesin) (SCHEUERMANN 1997).
Ultrastrukturell sind für die neuroendokrinen Zellen zahlreiche runde und ovoide
intrazytoplasmatische neurosekretorische Granula charakteristisch, deren Durchmesser
zwischen 70 und 150 nm beträgt. Sie enthalten Peptide und Serotonin (CUTZ et al. 1993).
Die Granula besitzen ein elektronendichtes Zentrum, das von der äußeren Grenzmembran
durch einen klaren, elektronentransparenten Halo getrennt ist.
Neuroendokrine Zellen in der Lunge wurden bei nicht-menschlichen Primaten unter
anderem bei Geoffroy-Klammeraffen (Ateles geoffroyi) beschrieben (LAUWERYNS et al.
1972), aber bis heute liegen keine Veröffentlichungen über die Morphologie oder Verteilung
der pulmonalen neuroendokrinen Zellen bei Weißbüschelaffen vor.
2.4.2.4 Basalzellen
Basalzellen sind kleine, abgeflachte Zellen, die auf der Basallamina ruhen, aber mit ihren
apikalen Zellgrenzen nicht an das Lumen heranreichen (HARKEMA et al. 1991). Mit dieser
zentralen Position haben sie direkten Kontakt mit den Epithelzellen, den Nervenfasern, der
Basalmembran sowie den mesenchymalen Zellen. Auf diese Weise spielen sie eine wichtige
Rolle in der sogenannten „epithelial-mesenchymal trophic unit“ im Bronchialepithel
(EVANS et al. 2001). Sie kommen im gesamten respiratorischen Epithel vor und erfüllen in
der ersten Linie eine regenerative Funktion durch Ersatz von abgestorbenen oder
beschädigten Epithelzellen. Man vermutet, dass sie sich als Reservezellen in eine Clara-
Zelle, Becherzelle oder sogar eine zilierte Epithelzelle differenzieren können (ROCK et al.
2009). Es wird auch berichtet, dass sie zusätzlich eine Funktion in neurogenen
Entzündungen, anderen Entzündungsreaktionen, bei der mukoziliären Clearance und bei
Antioxidationsprozessen im Gewebe haben können (EVANS et al. 2001).
Literaturübersicht 25
Morphologisch weisen die Basalzellen keine charakteristischen Organellen wie die anderen
nicht-zilierten Zellen auf. Sie besitzen wenig Zytoplasma und einen kleinen Nukleus. Das
Zytoplasma ist gefüllt mit Intermediärfilamenten. Zahlreiche Desmosomen verbinden die
Basalzellen mit umliegenden Epithelzellen (HARKEMA et al. 1991). Immunhistochemische
Untersuchungen der Basalzellen von BOERS et al. (1998) zeigten eine positive Reaktion mit
Hilfe des Antikeratin-Antikörpers 34βE12 als Marker für Basalzellen (BOERS et al. 1998).
Während die Verteilung der Basalzellen innerhalb des Bronchialbaumes bei Rhesusaffen
bereits von HARKEMA et. al. (1991) untersucht wurde, gibt es bis heute bei den als
Versuchstiermodell interessanteren Weißbüschelaffen noch keine Untersuchungen zu den
Basalzellen im Respirationsepithel.
Abbildung 2: Schematische Darstellung verschiedener Zelltypen im Bronchialepithel
(WALDEYER 2003).
2.4.3 Alveolarepithel
Als Alveolarepithel bezeichnet man das einschichtige flache Epithel, mit dem die Innenseite
der Alveolen ausgekleidet ist. In den Alveolen als strukturelle Einheiten des
26 Literaturübersicht
Respirationstraktes findet der Gasaustausch zwischen Blut und alveolären Luftraum statt.
Das Alveolarepithel setzt sich aus zwei Zelltypen zusammen: Pneumozyten Typ I und
Pneumozyten Typ II. Die Alveolen haben die Form kleiner Bläschen, die weintraubenförmig
einen Alveolargang (Ductulus alveolaris) bilden, der seinerseits das Ende der Bronchiolen
ist. Die einzelne Alveole weist eine runde bis polygonale Form auf, wobei ihr Durchmesser
stark davon abhängt, in welcher Phase der Ein- oder Ausatmung sie sich befindet (WELSCH
2006). Angrenzende Alveolen sind voneinander durch dünne Alveolarsepten getrennt, in
denen sich feinste Poren, die sogenannten Kohn‘schen Poren, befinden. Sie ermöglichen
eine kollaterale, alveoläre Ventilation, Umtausch des Surfactants und auch Durchtritt für
pulmonale Makrophagen (BLÜMCKE 1983). Außerdem enthalten Alveolarsepten viele
Kapillaren und sind reich an Elastin (HEINZELLER 2001).
Untersuchungen von BARBIER und BACHOFEN (2000) zeigen, dass die Alveolarsepten
bei Weißbüschelaffen von auffällig vielen Kohn‘schen Poren unterbrochen werden. Sie
stellen sich in rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen besonders gut dar. Des
Weiteren sind die Alveolen bei Weibüschelaffen ungewöhnlich stark kapillarisiert
(BARBIER u. BACHOFEN 2000).
2.4.3.1 Pneumozyten Typ I
Etwa 95 % der inneren Alveolaroberfläche wird von Pneumozyten vom Typ I ausgekleidet
(LIEBICH 2009). Ihre Hauptfunktion ist der Gasaustausch. Pneumozyten Typ I bilden die
Blut-Luft-Schranke, deren Hauptkomponenten, außer den Pneumozyten Typ I, die noch
darunter liegende Basalmembran und das Kapillarendothel sind. Durch die Blut-Luft-
Schranke findet die Aufnahme von Sauerstoff in das Blut und die Abgabe von
Kohlenstoffdioxid in die Atemwege statt (WELSCH 2006).
Pneumozyten vom Typ I sind etwa 50 µm breite und ca. 0,1 – 0,2 µm hohe, stark
abgeflachte Zellen, die über tight junctions mit den Pneumozyten vom Typ II verbunden
sind (TOMASHEFSKI u. FARVER 2008). Immunhistochemisch lassen sich die Typ I
Pneumozyten mit dem Epithelzellmarker Caveolin-1 darstellen (NEWMAN et al. 1999).
Literaturübersicht 27
Auf ultrastrukturellem Niveau besitzen Typ I Pneumozyten einen zentral liegenden Nukleus,
Mitochondrien, eine minimale Menge von rauem endoplasmatischen Retikulum und eine
moderate Menge von endozytotischen Vesikeln, Mikrotubuli, Mikrofilamenten und andere
Organellen (PLOPPER 1996; WELSCH 2006).
SURRIBAS und LAWZEWITSCH (1987) beschreiben die Typ I Pneumozyten bei
Weißbüschelaffen als Zellen mit wenig Zytoplasma und einem prominenten Nukleus, die
nur minimal in das Alveolarlumen hineinragen (SURRIBAS u. LAWZEWITSCH 1987).
2.4.3.2 Pneumozyten Typ II
Etwa 5% der inneren Alveolaroberfläche bedecken Pneumozyten Typ II, die ebenso viele
wichtige Funktionen erfüllen: Produktion von pulmonalen Surfactant-Proteinen und
Synthese von Fibronektin, Kollagen Typ IV und Proteoglykanen. Ebenso können sie
Arachnidonsäure metabolisieren, um Eikosanoide (z. B. Prostaglandin) zu bilden.
Untersuchungen der letzten Jahre weisen darauf hin, dass die Pneumozyten Typ II sich in
Pneumozyten Typ I differenzieren können und somit als Reservezellen anzusehen sind
(BISHOP 2004). Darüber hinaus exprimieren Pneumozyten Typ II den
Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) I-Rezeptor und fungieren als Antigen-
präsentierende Zellen (OSBORN u. LOWENSTINE 1998).
Pneumozyten Typ II haben eine kubische bis polygonale Form, sind bis zu 10 – 15 µm im
Durchmesser groß und liegen meist in den Nischen der Alveolen. Das erklärt die Tatsache,
dass ihre Gesamtzahl innerhalb einer Alveole größer ist als die der Pneumozyten Typ I (40
% Pneumozyten Typ I und 60 % vom Typ II), denn die Pneumozyten vom Typ II sind
wesentlich flächenmäßig kleiner als die vom Typ I (TOMASHEFSKI u. FARVER 2008).
Ultrastrukturell besitzen Pneumozyten vom Typ II einen großen, basal liegenden, runden
Kern mit einem prominenten Nukleolus. Außerdem haben sie viele Mitochondrien,
Ribosomen, wenige Lysosomen, raues endoplasmatisches Retikulum, Mikrovesikel und
einen Golgi-Apparat und Mikrovilli (PLOPPER 1996). Eine Besonderheit der Typ II
Pneumozyten sind zahlreiche osmophile ‚lamellar inclusion bodies‘ (TOMASHEFSKI u.
28 Literaturübersicht
FARVER 2008), die die wesentlichen Surfactant-Proteine A, B, C und D (SP-A, SP-B, SP-
C, SP-D) enthalten. Dank dieser Surfactant-Proteine lassen sich Typ II Pneumozyten mit
Antikörpern gegen Surfactant-Proteine immuhistochemisch detektieren (SCHMIEDL et al.
2005).
Pneumozyten vom Typ II sind bei Weißbüschelaffen laut SURRIBAS und
LAWZEWITSCH (1987) kubisch bis oval, ihre Zellgrenzen sind „schaumig“ und die Zellen
wölben sich deutlich in Richtung des Alveolarlumens vor.
2.4.4 Pulmonale Surfactant-Proteine
Als „grenzflächenaktive Substanz“ spielt der Surfactant mehrere wichtige Rollen in der
Stabilität und normalen Funktion einer Alveole (TOMASHEFSKI u. FARVER 2008).
Surfactant setzt sich aus verschiedenen Phospholipiden, insbesondere Dipalmitoyl-Lecithin,
und Glykoproteinen, Plasmaproteinen und speziellen Surfactant-Proteinen (SP-A, SP-B, SP-
C, SP-D) zusammen (TOMASHEFSKI u. FARVER 2008). Während SP-A und SP-D eine
immunologische Funktion zugeordnet wird, spielen SP-B und SP-C eine eher
biophysikalische Rolle. Für die Erkennung von Kohlenhydraten haben hydrophile
Surfactant-Proteine A und D spezielle Domänen, mit deren Hilfe sie mit den
Oberflächenantigenen von Bakterien und Viren interagieren können und sie damit für
Makrophagen phagozytierbar machen. SP-B und SP-C gehören zu den hydrophoben
Membranproteinen, die für die Beschleunigung der Ausbreitung des Surfactantfilms auf der
Alveolaroberfläche verantwortlich sind (GRIESE 1992, 1999).
Bei der Entfaltung einer Alveole werden die Phospholipide zusammengedrückt. Dabei
arrangieren sich die hydrophoben und die hydrophilen Enden jeweils auf einer Seite der
Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht. Dadurch reduziert sich die Oberflächenspannung, und der
Kollaps der Alveole wird verhindert. Bei der Inflation einer Alveole wird diese Anordnung
zerstört. Durch den sich damit ergebenden Anstieg der Oberflächenspannung wird die
elastische Rückstellkraft der Alveole beim Ausatmen unterstützt. Die alveoläre Clearance
Literaturübersicht 29
wird durch die ständige Sekretion des Surfactants in den Alveolen und seinem Fluss zu den
Bronchiolen unterstützt.
Die Surfactant-Proteine werden hauptsächlich von den Pneumozyten Typ II und den Clara-
Zellen produziert. Ein Teil des Surfactants wird von den Makrophagen phagozytiert
(WELSCH 2006).
Eine mengenmäßig nicht ausreichende Surfactantproduktion kann bei Menschen,
insbesondere bei Neugeborenen zu schweren Erkrankungen wie dem „Neonatal Respiratory
Distress Syndrome“ (NRDS) führen (WELSCH 2006).
30 Eigene Untersuchungen
3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN
3.1 Material und Methoden
3.1.1 Tiere und Probenmaterial
In der vorliegenden Arbeit wurden Gewebeproben des Respirationstrakts von 37 klinisch
gesunden Weißbüschelaffen verwendet (s. Anhang, Tabelle 15). Das Probenmaterial stammt
aus dem Sektionsgut des Deutschen Primatenzentrums (DPZ) aus dem Zeitraum von 2009
bis 2011. Die Tiere wurden aufgrund ungünstiger Prognose bei einer nicht den
Respirationstrakt betreffenden Erkrankung, aus tierschutzrelevanten Gründen oder im
Rahmen anderer genehmigter tierexperimenteller Arbeiten euthanasiert. Die verwendeten
Tiere wurden anhand klinischer Angaben, nachfolgender Sektionsergebnisse und
pathohistologischer Untersuchungen als lungengesund eingestuft.
Aufgrund ihrer Altersstruktur wurden die Tiere in 3 Gruppen eingeteilt:
erste Gruppe - Neugeborene (1 bis 2 Tage)
zweite Gruppe - juvenile Tiere (ab 5 bis 18 Monaten)
dritte Gruppe - adulte Tiere (ab 18 Monaten und älter)
3.1.2 Haltungsbedingungen
Die Weißbüschelaffenkolonie des DPZ wird in einem modernen Haltungssystem unter
Berücksichtigung der Mindestanforderungen zur Haltung von Versuchstieren gehalten. Die
Tiere wohnen paarweise, als Familiengruppe mit oder ohne Nachwuchs. Im Alter von etwa
3 bis 5 Monaten werden die Jungtiere von ihren Elterntieren getrennt.
Jede Tiereinheit besitzt eine eigene Futterküche und einen Raum für die tierärztliche
Versorgung. Die Tiere werden in Zuchtvolieren mit einer Größe von 1 m2 Grundfläche und
250 cm Höhe gehalten, wobei mehrere derartige Volieren verbunden werden können. Die
Ausstattung jedes Käfigs schließt verschiedene Kletteräste, Baumzweige sowie wechselndes
Eigene Untersuchungen 31
Spielzeug wie z. B. Pappkartons, Seile, Ketten, Kunststoffkontainer etc. ein. Pro Käfig
stehen den Tieren je nach Gruppengröße 1 bis 2 Holzschlafhäuschen zur Verfügung. Die
Raumtemperatur beträgt 24 bis 26 °C. Die relative Luftfeuchtigkeit liegt zwischen 60 und 70
%. Die Raumluft wird etwa 8 Mal pro Stunde ausgetauscht. Der Hell/Dunkelzyklus beträgt
12 Stunden.
Im Alter von ca. 3 Monaten werden alle Jungtiere gegen Bordetella bronchiseptica
(Bestandsspezifischer Impfstoff gegen Bordetella-Infektionen bei Affen, IDT, Roßlau,
Deutschland), Yersinia pseudotuberculosis (Pseudovac, Fa. IBSS Biomed, Krakow, Polen)
und Rotlauf (Porcilis ery, Fa. Intervet, Unterschleißheim, Deutschland) geimpft und mit
einem individuellen Mikrochip markiert.
Im Futtermenü der Kolonie von Weißbüschelaffen sind enthalten:
Morgens: Quarkbrei mit Obstanteil, frisches Obst und Gummi arabicum
Mittags: Obst, Gemüse, Reis, Nudeln, Hühnerfleisch
Einmal pro Woche: Mehlwürmer, Heuschrecken
Die Fütterung erfolgt 2 mal am Tag (außer am Sonntag, dann nur einmal). Täglich
bekommen die Tiere Krallenaffenpellets (Fa. Ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest,
Deutschland) sowie Wasser ad libitum.
3.1.3 Probenentnahme
Die Tiere wurden unmittelbar vor der Sektion euthanasiert. Hierzu wurden sie zunächst mit
Göttinger Mischung II (GM II, 0,1 ml/kg Körpergewicht i.m.), in tiefe Narkose gelegt.
Göttinger Mischung (10 ml) setzt sich zusammen aus 5 ml Ketamin (100 mg/ml), 1 ml
Xylazin (10 % ig), 0,1 ml Atropin (1 % ig) und 3,9 ml Aqua ad injectionem. Die Euthanasie
erfolgte mittels intrakardialer Injektion von 150 mg/kg Körpergewicht Pentobarbital-
Natrium (Narcoren, Fa. Merial GmbH, Hallbergmoos, Deutschland). Nach der Eröffnung
des Thorax wurde die Lage des Respirationstraktes untersucht. Anschließend wurde der
gesamte Respirationstrakt in toto entnommen und makroskopisch hinsichtlich Größe,
Gewicht und Lappung beurteilt. Die weitere Probenentnahme erfolgte entsprechend dem
Entnahmeschema in Abbildung 3. Für histologische und immunhistochemische
Untersuchungen wurden die vier rechtsseitigen Lungenlappen in 4% igem Formalin fixiert.
32 Eigene Untersuchungen
Für die elektronenmikroskopische Aufarbeitung wurden die zwei linksseitigen Lappen in 2,5
% igem, frisch angesetztem Glutaraldehyd (GA) verbracht (Protokolle s. Anhang). Hierzu
wurden Gewebeproben aus Bronchien, Bronchiolen und alveolären Bereichen in 2,5 mm3
große Stücke geschnitten und im Kühlschrank bei 4 °C mindestens 24 Stunden und maximal
eine Woche gelagert. Bei einer Reihe von Tieren (G 8233, G 8307, G 8111, G 8001, G
8003, G 8375, G 8217, G 8218, G 8247) wurden zusätzlich Trachea und Hauptbronchus für
histologische und elektronenmikroskopischen Untersuchungen asserviert. Bei diesen Tieren
handelte es sich ausschließlich um adulte Tiere.
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Lungen von Weißbüschelaffen und
Probeentnahme. Beschriftung der Lappen: I – Lobus cranialis dexter; II – Lobus medius
dexter; III – Lobus caudalis dexter; IV – Lobus accessorius dexter; V – Lobus cranialis
sinister; VI – Lobus caudalis sinister.
Eigene Untersuchungen 33
3.1.4 Korrosionstechnik
Mithilfe der sogenannten Ausgusstechnik wurde die Bronchialbaumstruktur der Lunge von
Weißbüschelaffen dargestellt. Es wurden drei Ausgusspräparate der Lungen hergestellt,
jeweils von einem Neonaten (K 2163), von einem Jungtier (K 2097/2) und von einem
adulten Tier (K 2157) (s. Anhang, Tabelle 15). Dabei wurde der Kunststoff
(Methylmetacrylat) Technovit 7143 (Fa. Kulzer&Co GmbH, Bad Homburg, Deutschland)
verwendet.
Zunächst wurden die Lungen inklusive der Trachea von bindegewebigen Anteilen und
Mediastinum abpräpariert und in eine Warmwasserwanne gelegt. Die Luft wurde zusammen
mit der bronchoalveolären Flüssigkeit mittels einer 2 ml-Spritze vorsichtig aus der Lunge
herausgezogen. Daraufhin wurde das Technovit 7143 mit einer 2 ml-Einmalspritze und einer
Kanüle mit Mandrin, die über die Trachea fast bis zur Bifurkation vorgeschoben wurde,
unter mäßigem Druck von Hand in die Lunge injiziert. Für die Lunge eines adulten Tieres
wurden ca. 1,5 ml verwendet. Bei juvenilen Tieren betrug die Menge lediglich ca. 1,1 ml
und bei neugeborenen Tieren ca. 0,8 ml. Die Injektionsdauer betrug 5 bis 10 Sekunden.
Nach der Füllung der Lungen wurde die Kanüle vorsichtig herausgezogen und die Trachea
mit einem Faden zugebunden. Die gefüllte Lunge wurde für den Polymerisationseffekt in
der Warmwasserwanne für 3 Stunden gelagert. Nach der Polymerisation des Kunststoffs
wurden die Lungen mit 40 %igem Kaliumhydroxid (KOH) korrodiert. Um eine bessere,
schnellere und effektivere Korrosion zu erreichen, wurden die Lungen für 24 Stunden in
KOH in den Wärmeschrank bei 50 °C verbracht. Anschließend wurde das Ausgusspräparat
mit Wasser gespült, lackiert und auf einer Halterung fixiert.
3.1.5 Computertomographie und Datenauswertung mit MeVisLab
Die bildgebende Analyse und Ausmessung des Bronchialsystems erfolgte mit Hilfe von
Mikro Computer Tomograph (CT) Scans der Ausgusspräparate mit anschließender
Datenauswertung, die mit speziellen MeVisLab-basierten Bildanalyseverfahren vom
Fraunhofer Institut MEVIS in Bremen durchgeführt wurde.
34 Eigene Untersuchungen
Mit Hilfe des MeVisLab wurden die Durchmesser der Ausgüsse der Trachea und des
Bronchialbaums ermittelt. Dabei wurden folgende digitale Bildverarbeitungsmethoden
verwendet: Erstellung von 2D-Histogrammen, Skelettierung und Rendering. Ausgehend von
den 2D-Histogrammen der Grauwerte relativ zur Kantenstärke (3D Gradient aus Sobel-
Filter) konnten die optimalen Schwellenwerte per Scan gefunden werden, um die Daten zu
binarisieren. Lücken und kleine Defekte wurden durch Constraint Connection Cost
Operationen gefüllt bzw. bereinigt. Danach wurde die Halterung von dem Ausgusspräparat
entfernt. Eine euklidische Distanztransformation wurde auf die binäre Baummaske
angewendet, um einen Schätzwert für den lokalen Lumenradius zu erhalten. Mit
Skelettierung erhält man die Mittellinien und die Voronoi-Markierung, so dass anschließend
die Radiusinformation vom Skelett auf den vollen Durchmesser der Zweige des
Bronchialbaums übertragen werden konnte. Ebenso wurde der Abstand von der Carina zu
den Voxeln des Skeletts verwendet, um Abbildungen zu erstellen, in denen alle Baumvoxel
dargestellt sind. Eine 3D-Visualisierung der Abbildungen wurde sowohl für Entfernung als
auch für den Durchmesser erstellt. Der Farbkodex pro Parameter blieb für beide Scans
gleich. Anschließend wurde eine virtuelle Unterteilung in Subtrees durchgeführt, indem
Grenzwerte festgelegt wurden, um den zentralen Teil des Bronchialbaums entweder
innerhalb einer von Hand eingestellten Entfernung zur Bifurkation oder über einen günstig
eingestellten Grenzdurchmesser zu entfernen. Bildlich gesehen ergibt der
Durchmesseransatz eine Teilung des Bronchialbaums in anatomisch ähnlichere Teile als der
Entfernungsansatz. Der resultierende Satz nicht zusammenhängender Subtrees wurde mittels
Connected Component Analysis markiert, um die Subtrees in kontrastierende zufällig
ausgewählten Farben zu kolorieren. Um die Übersichtlichkeit zu erhöhen, wurden einige
Teile der Bäume nur als erweitertes Skelett und nicht als komplette Bronchialbaummaske
dargestellt.
3.1.6 Zuordnung und Nomenklatur der Bronchialbäume
Die Bronchialbäume der Weißbüschelaffen wurden mit den bekannten Bronchialbäumen
von Haussäugetieren, Labornagern und dem Menschen verglichen. Aufgrund der großen
Eigene Untersuchungen 35
Ähnlichkeiten wurde die beim Menschen etablierte Nomenklatur angewandt (MOLL u.
MOLL 2005).
3.1.7 Lichtmikroskopie
3.1.7.1 Histologie und Immunhistochemie
Nach der Entnahme wurden die Gewebeproben aus dem Respirationstrakt für 24 Stunden in
4 %igem, neutral gepuffertem Formalin fixiert. Anschließend wurden durch die
Lungenlappen Nummer I und III (Abbildung 3) 2 Querschnitte angelegt, so dass 3
Lokalisationen (bronchusnah: A, mittig: B, bronchusfern: C) entstanden, die zusammen in
eine Einbettkassette gelegt wurden. Bei einer Reihe von adulten Tieren (G 8233, G 8307, G
8111, G 8001, G 8003, G 8375, G 8217, G 8218, G 8247) wurden zusätzlich Trachea und
Hauptbronchus entnommen. Der mittlere Teil der Trachea und der gesamte Hauptbronchus
wurden transversal geschnitten und in die Einbettkassette gelegt. Die automatische
Paraffineinbettung erfolgte im Excelsior ES (Fa. ThermoFisher Scientific, Dreieich,
Deutschland) nach laborüblichem Protokoll (s. Anhang). Das Ausgießen der Paraffinblöcke
erfolgte mit Hilfe der Ausgießstation EC 350-1 (Fa. ThermoFisher Scientific, Dreieich,
Deutschland). Beim Ausgießen wurden die Lokalisationen A, B und C in eine
standardisierte Reihenfolge gebracht und in Stahlblechformen gelegt. Nach dem Aushärten
wurden die Paraffinblöcke aus den Stahlblechformen herausgenommen und zur Aushärtung
auf Eis gestellt.
Danach wurden Paraffinschnitte für histologische und immunhistochemische Färbungen
hergestellt. Dafür wurden ca. 3 μm dicke Schnitte am Schlittenmikrotom HM 400 (Fa.
ThermoFisher Scientific, Dreieich, Deutschland) angefertigt. Danach wurden die Schnitte
mit einem in Eiswasser angefeuchteten Streifen Durchschlagpapier vom Paraffinblock
gelöst. Zum Strecken und Beseitigen von Falten wurden sie in ein Warmwasserbad (40 °C)
überführt. Anschließend wurden die Schnitte für die histologischen Färbungen auf
Standardobjektträger (Menzel-Gläser, Fa. Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig,
Deutschland) und für die Immunhistochemie auf Superfrost Plus Objektträger (Menzel-
Gläser, Fa. Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig, Deutschland) aufgezogen. Zum
36 Eigene Untersuchungen
Trocknen wurden sie 24 Stunden im Wärmeschrank bei 37 °C gelagert und anschließend bei
Raumtemperatur aufbewahrt.
Nach dem im Anhang aufgeführten Protokoll wurden die angefertigten Schnitte für die
histologischen Untersuchungen mit Hilfe des Färbeautomaten Varistain Gemini (Fa. Thermo
Fisher Scientific, Dreieich, Deutschland) mit der Hämatoxylin-Eosin (H&E)-Färbung
gefärbt.
Für die Darstellung der muzinbildenden Becherzellen wurde die Periodic-Acid-Schiff
(PAS)-Reaktion, die ebenfalls mit dem Färbeautomat Varistain Gemini (Fa. Thermo Fisher
Scientific, Dreieich, Deutschland) erfolgte, als Nachweis für neutrale Mukopolysaccharide
und die Alcian Blau-Färbung (per Hand, s. Anhang) für saure Mukopolysaccharide
durchgeführt.
Die immunhistochemischen Färbungen erfolgten im automatisierten Immunfärbeautomat
Discovery XT (Fa. Roche, Mannheim, Deutschland, Protokolle s. Anhang). Die
verwendeten Primär-Antikörper sind in Tabelle 3 aufgelistet. Mit der indirekten SABC
(Streptavidin-Biotin-Komplex)-Methode und DAB (3,3'-Diaminobenzidin) als Chromogen
wurden in 4 %igem, neutral gepuffertem Formalin fixierte Paraffinschnitte gefärbt. Als
Sekundärantikörper wurde der Universal Secondary Antibody (Fa. Roche, Mannheim,
Deutschland) verwendet. Für die negative Kontrolle diente Antibody Diluent Roche (Fa.
Roche, Mannheim, Deutschland).
Die Auswertung der histologischen und immunhistochemischen Schnittpräparate erfolgte an
dem Lichtmikroskop Axioplan 2 Imaging mit der Kamera AxioCam HRc (Fa. Zeiss,
Oberkochen, Deutschland). Dabei wurde die Verteilung und Morphologie der nicht-zilierten
Zellen evaluiert und das Lungengewebe grundsätzlich morphologisch beurteilt.
Eigene Untersuchungen 37
Tabelle 3: Verwendete Antikörper für die immunhistochemischen Färbungen.
Zielzelle/-
Protein
Antikörper Firma/Bestell-
nummer
Verdünnung Positiv-
Kontrolle*
Clara-Zellen Clara Cell Protein Human
Rabbit
Polyclonal Antibody
BioVender
RD 181022220
1:2000 Lunge C.j.
Neuroendokrine
Zellen
Monoclonal Mouse Anti-
Human Neuron-Specific
Enolase (NSE)
Dako M 0873 1:400 Nebenniere C.j.
Becherzellen Mucin 5AC Antibody
(45M1) (MUC5AC)
Novus Biologicals
NB120-3649
1:50 Trachea M.m.
Surfactant B Mouse Monoclonal
Surfactant Protein B
(Precursor) Ab-1
Lab Vision
MS-704-B0
1:10 Lunge C.j.
Surfactant C Rabbit Polyclonal
Prosurfactant Protein C
Abcam ab 28744 1:400 Lunge C.j.
Makrophagen MAC387
Monoclonal Mouse Anti-
Human
Myeloid/Histiocyte
Dako M 0747 1:100 Lunge C.j.
*C.j. – Callithrix jacchus;
M.m. – Macaca mulatta.
38 Eigene Untersuchungen
3.1.8 Elektronenmikroskopie
3.1.8.1 Transmissionselektronenmikroskopie
Um die Zellen des respiratorischen Epithels auf ultrastrukturellem Niveau zu untersuchen,
wurden zusätzlich transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen durchgeführt.
Das in 2,5 %igem Glutaraldehyd fixierte Gewebe wurde bis zur weiteren Verarbeitung bei 4
°C im Kühlschrank aufbewahrt und anschließend in einem Epongemisch nach LUFT (1961,
s. Anhang) im Lynx Einbettautomaten (Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) nach
laborüblichlichem Protokoll (s. Anhang) für die Transmissionselektronenmikroskopie
(TEM) eingebettet.
Die Gewebeproben wurden gerichtet eingebettet, so dass beim Schneiden der eingebetteten
Blöcke die untersuchten Lokalisationen, nämlich Bronchus, Bronchiolus und alveoläre
Bereiche erreicht werden konnten. Anschließend erfolgte die Polymerisation des
Epoxidharzes über 24 Stunden bei 60 °C im Wärmeschrank. Die ausgehärteten
Kunststoffblöcke wurden mit Hilfe einer Fräse (Reichert Ultratrim, Fa. Leica, Bensheim,
Deutschland) auf die Größe des eingebetteten Gewebes zugetrimmt. Am Ultramikrotom
Reichert, Ultracut S (Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) wurden unter Verwendung eines
Diamantenmessers (Fa. Diatome, Bienne, Schweiz) 0,5 µm dicke Semidünnschnitte
angefertigt. Die Schnitte wurden auf Objektträger aufgezogen, bei 60 °C getrocknet und
anschließend mit Methylenblau nach RICHARDSON et al. (1960) gefärbt. Die
lichtmikroskopische Untersuchung von Semidünnschnitten half, die relevanten Bereiche der
Bronchen und Bronchiolen mit nicht-zilierten Zellen zu identifizieren. Die ausgewählten
Bereiche wurden für die Anfertigung von Ultradünnschnitten zeichnerisch dargestellt, und
der Block wurde per Hand auf den gewünschten Bereich zugetrimmt. Nachfolgend wurden
am Ultramikrotom (Reichert, Ultracut S der Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) 60 nm
dünne Ultradünnschnitte mit Hilfe eines Diamantenmessers (Fa. Diatome, Bienne, Schweiz)
angefertigt. Diese wurden auf Kupfer-Lochblenden (single slot 1 x 2, Fa. Plano, Wetzlar,
Deutschland) aufgefangen und mit Uranylazetat und Bleizitrat per Hand kontrastiert.
Eigene Untersuchungen 39
Die transmissionselektronenmikroskopische Darstellung der nicht-zilierten Zellen erfolgte
am Elektronenmikroskop EM 10 C (Fa. Zeiss, Oberkochen, Deutschland). Die
morphologische Befunde wurden fotographisch mit Hilfe einer integrierten Digitalkamera
Slow-scan CCD-Camera for TEM (Fa. Zeiss, Oberkochen, Deutschland) zusammen mit dem
Bildverarbeitungsprogramm iTEM 5.0 (Fa. Olympus Soft Imaging Solutions GmbH,
Münster, Deutschland) dokumentiert.
3.1.8.2 Rasterelektronenmikroskopie
Von einzelnen Tieren (G 8109 (adult), K 2114 (juvenil) und K 2091 (neonatal)) wurden
darüber hinaus rastelektronenmikroskopische Untersuchungen von dem Lungenlappen V
(Abbildung 3) durchgeführt. Bei der Probenentnahme wurde der Lungenlappen gründlich
mit physiologischer Kochsalzlösung gespült und in 2,5 %igem Glutaraldehyd sagittal
geschnitten. Die so gewonnenen Gewebeproben wurden bis zur weiteren Verarbeitung in 2,5
%igem Glutaraldehyd bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahrt. Die weitere Probenverarbeitung
erfolgte nach laborüblichem Protokoll (s. Anhang). Die Trocknung erfolgte im Critical Point
Dryer (Modell CPA E 3100, Fa. Polaron, Watford, England). Anschließend wurden die
Gewebestücke mit einem Spezialklebstoff (Leit C, Fa. Plano, Marburg, Deutschland) auf
Aluminiumpräparatehaltern aufgeklebt und im Sputter Coater SCD 040 (Fa. Balzers,
Wiesbaden, Deutschland) mit einer dünnen Goldschicht überzogen. Die Auswertung der
Oberflächenstruktur des Bronchial- und Bronchiolarepithels erfolgte mit Hilfe des
Rasterelektronenmikroskops FEI Quanta 400 F (Hillsboro, Oregon, USA) bei einer
Beschleunigungsspannung von 5-10 kV. Die bildgebende Fotodokumentation wurde mit
dem Bildbearbeitungsprogramm Adobe Photoshop CS (Version 8.0.1., Fa. Adobe Systems
Incorporated, USA) durchgeführt.
3.1.9 Datenauswertung und statistische Berechnungen
Grundsätzlich wurden alle untersuchten Tiere (n = 37) in drei Altersgruppen eingeteilt:
adulte Tiere, juvenile und neugeborene Tiere. Bei allen Tieren der Studie wurden 8 Schnitte
aus den Lungenlappen I und III (Abbildung 3) angefertigt. Für die statistischen
40 Eigene Untersuchungen
Untersuchungen wurden insgesamt 20 Tiere verwendet (für genauere Angaben zu den
Tieren s. Anhang, Tabelle 15). Die 8 Schnitte pro Lungenlappen wurden hintereinander nach
folgendem Schema geschnitten und histologisch bzw. immunhistochemisch gefärbt:
Schnitt Nr. 1 Haematoxylin und Eosin-Färbung (HE)
Schnitt Nr. 2 PAS-Reaktion
Schnitt Nr. 3 MUC5AC
Schnitt Nr. 4 CCSP
Schnitt Nr. 5 NSE
Schnitt Nr. 6 Surfactant B
Schnitt Nr. 7 Surfactant C
Schnitt Nr. 8 MAC 387
Schnitt Nr. 1 diente der allgemeinen histologischen Beurteilung des Lungengewebes mittels
HE-Färbung. Dabei wurde vor allem geprüft, ob die Lungen gesund waren, und welche
anatomischen Besonderheiten in den Lungen von Weißbüschelaffen gegenüber anderen
Tieren vorhanden sind. Mit dem Schnitt Nr. 2, an dem die PAS-Reaktion durchgeführt
wurde, wurden hauptsachlich die Muzine enthaltenden Becherzellen hinsichtlich Existenz,
Färbeverhalten und Verbreitung evaluiert. Schnitte Nr. 6 (Surfactant B) und 7 (Surfactant C)
wurden hergestellt, um Surfactant-Proteine in Clara-Zellen nachzuweisen. Außerdem
wurden Pneumozyten Typ II mit Hilfe von Surfactant-Protein B deskriptiv beschrieben.
Mittels Schnitt Nr. 8 (MAC 387) konnten Alveolarmakrophagen im Alveolarlumen und auf
der Oberfläche des Alveolarseptum nachgewiesen und allgemein beschrieben werden.
Außerdem wurde die Verteilung bei unterschiedlichen Altersgruppen deskriptiv ermittelt.
Für statistische Untersuchungen wurden bei 20 Tieren (s. Anhang, Tabelle 15) nur die
Schnitte 3, 4 und 5 ausgewählt und miteinander verglichen, um die Verteilung der nicht-
zilierten Zellen (Clara-Zellen, Becherzellen und pulmonale neuroendokrine Zellen) je nach
Lokalisation (Bronchus oder Bronchiolus) und Altersgruppe zu bestimmen. Dabei wurde die
Verteilung der Zellen auf signifikante Unterschiede zwischen den Altersgruppen und
Lokalisationen geprüft. Hierfür wurden in jedem Schnitt Nr. 3, 4 und 5 fünf Strecken pro
immunhistochemischer Färbung (CCSP Human für Clara-Zellen, MUC5AC für
Eigene Untersuchungen 41
Becherzellen, NSE für pulmonale neuroendokrine Zellen und neuroepithelial bodies), pro
Tier und pro Lokalisation (Bronchi und Bronchioli veri) von Hand ausgezählt. Um die
Vergleichbarkeit zwischen den Strecken bzw. Zählungen herzustellen, wurden die Strecken
auf eine Länge von exakt 100 Zellen standardisiert.
Für die Datenerfassung und Berechnung von Mittelwerten wurde die Software Microsoft
Excel 2010 (Microsoft Corporation, Redmond, USA) verwendet. Die statistische
Auswertung und die Erstellung der Grafiken erfolgten mit Hilfe des Statistikprogramms
Statistica (Statsoft, Tulsa, USA). Für die primären Endpunkte (Anzahl der CCSP-positiven
Clara-Zellen, MUC5AC-positiven Becherzellen und NSE-positiven pulmonalen
neuroendokrinen Zellen) wurde ein Repeated-Measure Analysis of Variance (ANOVA) Test
modelliert. Bei diesem Test handelt es sich um eine Varianzanalyse, bei der überprüft wird,
ob die Varianzen innerhalb einer Gruppe von Werten größer oder kleiner sind als die
Varianzen zwischen den einzelnen Gruppen. Es wurden die Haupteffekte Altersgruppierung
und Lokalisation und eine Wechselwirkung zwischen den beiden Faktoren modelliert. Das
Signifikanzniveau wurde in allen globalen Tests mit α = 5 % festgelegt, das heißt, dass ein
Unterschied statistisch signifikant war, sobald für die Irrtumswahrscheinlichkeit p < 0,05
galt. Für die Paarvergleiche wurden als weiterführende Auswertung T-Tests und eine
Adjustierung mit der Bonferroni-Methode durchgeführt. Bei diesen Tests handelt es sich um
Verfahren, die die Hypothese des signifikanten Unterschieds in der Gruppe weiter
untersuchen. Eine Adjustierung mit der Bonferroni-Methode ist ab einer gewissen Größe der
Gruppe notwendig, um konservativ zu bleiben, d. h. um die Signifikanzen richtig zu
erkennen. Die Grafiken zu den Analysen zeigen Mittelwerte und Konfidenzintervalle
(Standardabweichungen).
42 Eigene Untersuchungen
3.2 Ergebnisse
3.2.1 Makroskopie
Die paarig angelegten Lungen von Weißbüschelaffen, Pulmo dexter und Pulmo sinister,
lagen im Thorax und füllten dessen ganzen Raum aus. Die Lungen lagen im Brustkorb auf
Höhe der 3. bis 10. Rippe (Weißbüschelaffen haben insgesamt 12 Rippen). Der Lungenhilus
befand sich auf Höhe des 5. Brustwirbels. Die beiden Lungen waren umgeben von der
rechten und linken Pleurahöhle, Cavitas pleuralis, auf beiden Seiten des Mediastinums. Die
Oberfläche der Lungen wurde von der Pleura visceralis bedeckt. Die Pleura war mit dem
Mediastinum am unteren Ende des Hilus durch das kurze Ligamentum pulmonale
verbunden. In diesem Bereich schlug die Pleura visceralis in die Pleura parietalis um.
Größe und Gewicht der Lunge von Weißbüschelaffen waren ziemlich gering. Die hier
aufgeführten Zahlen basieren auf den in dieser Arbeit untersuchten Proben und haben in
erster Linie illustrativen Charakter. Für neugeborene Tiere betrugen das Längenmaß etwa
1,5 - 1,7 cm und die Breite etwa 1,7 - 2,0 cm; für juvenile Tiere betrugen das Längenmaß
etwa 2,0 - 2,4 cm die Breite etwa 2,5 - 3,0 cm und für adulte betrugen das Längenmaß etwa
3,5 - 7,0 cm und die Breite etwa 4,0 - 8,0 cm. Eine adulte Weißbüschelaffenlunge wog
insgesamt (Pulmo dexter und Pulmo sinister ohne Trachea und ohne Hauptbronchus) etwa
2,1 bis 2,6 g. Das entsprach ca. 4,5 % des Körpergewichts. Das Gewicht der Lunge bei
juvenilen Tieren lag bei etwa 1,8 bis 2,1 g und bei neugeborenen Tieren bei etwa 1,1 bis 1,7
g.
Man konnte drei Außenflächen unterscheiden:
- Die Facies costalis hatte eine besonders glatte Oberfläche und eine kuppelartige
Form.
- Die Facies mediastinalis grenzte von ihrer medialen Seite an das Mediastinum und
ihrer dorsalen Seite an die Wirbelsäule. Außerdem hatte diese Oberfläche Kontakt
mit Herz (im Herzbeutel), Vena cava superior und inferior, Vena azygos und
Ösophagus.
- Die Facies diaphragmatica grenzte an das Zwerchfell.
Eigene Untersuchungen 43
Abbildung 4: Lunge von einem adulten Weißbüschelaffen nach Befüllung mit Agarose.
Ansicht von ventral. Die rechte Lunge besteht aus vier Lungenlappen: I – Lobus cranialis
dexter; II – Lobus medius dexter; III – Lobus caudalis dexter; IV – Lobus accessorius dexter
und die linke Lunge aus zwei: V –Lobus cranialis sinister; VI – Lobus caudalis sinister. Auf
beiden kranialen Lappen sind Einkerbungen (Pfeile) vorhanden.
Die Lungen des Weißbüschelaffen bestanden aus sechs eigenständigen Lungenlappen: vier
auf der rechten Lunge und zwei auf der linken Lunge (Abbildung 4 und Tabelle 4).
Tabelle 4: Lappung der Lunge bei Weißbüschelaffen.
Linke Lunge
Pulmo sinister
Rechte Lunge
Pulmo dexter
Lobus cranialis Lobus cranialis
Lobus caudalis Lobus medius
Lobus caudalis
Lobus accessorius
44 Eigene Untersuchungen
Zwischen den Lappen waren intralobäre Septen vorhanden.
Die linke Lunge bestand aus zwei Lappen (Abbildung 4): der Lobus cranialis wies eine
flache und ovale Form auf. Deutlich unterhalb des Apex pulmonalis war eine Einkerbung
mit einer Tiefe von einigen Millimetern vorhanden. Der Lobus caudalis hatte eine
dreieckige Form. Auf der medialen Oberfläche des Lobus caudalis befand sich die Impressio
cardiaca.
Die rechte Lunge bestand aus vier Lappen (Abbildung 4): der Lobus cranialis hatte eine
ovale, flache Form mit Einkerbung mit einer Tiefe von einigen Millimetern an der Spitze
(ähnlich dem gleichnamigen Flügel auf der linken Seite). Der Lobus medius hatte eine in
lateraler Richtung spitz zulaufende Gestalt. Außerdem wies der Lobus medius drei Kanten,
eine gewölbte dorsale Seite und zwei flachere mediale Seiten auf. Der Lobus caudalis war
der größte Lappen der rechten Lunge. Er war etwa schildförmig bis dreieckig mit einer
markanten Einbuchtung auf dem Margo acutus. Der Lobus accessorius war der kleinste
Lungenlappen der Lunge. Er lag nah am Herzen und ähnelte in seiner Form auch dem
Herzen selbst, da er oval und spitz zulaufend war.
3.2.1.1 Bronchialbaum
Die Morphologie des Bronchialbaums wurde bei je einer Weißbüschelaffenlunge aus allen
drei Altersgruppen makroskopisch untersucht. Als Grundlage dienten Ausgusspräparate der
Weißbüschelaffenlungen unterschiedlicher Altersstufen (Anhang, Tabelle 15). Die in
Abbildung 5 dargestellten Ausgusspräparate veranschaulichen die altersabhängige Form und
volumenmäßige Ausdehnung der Trachea, Hauptbronchien und Segmentbronchien.
Eigene Untersuchungen 45
Abbildung 5: Ausgusspräparate von der Lunge (Bronchialbäume) von drei
Weißbüschelaffen unterschiedlicher Altersstufen (von links nach rechts: adultes (K 2157),
juveniles (K 2097/2), neugeborenes (K 2163) Tier). Ansicht von dorsal.
Die Morphologie des Bronchialbaumes war bei allen Altersgruppen grundsätzlich ähnlich
und durch eine dichotomische Aufzweigung gekennzeichnet. Die knorpelgestützte Trachea
teilte sich in zwei Hauptbronchien: Bronchus principalis dexter und Bronchus principalis
sinister. Aus dem Bronchus principalis dexter entsprang kurz hinter der Bifurkation der
Trachea in einem Winkel von etwa 90° in lateraler Richtung der Bronchus lobaris cranialis
dexter, der mit seinen Segmentbronchien den Lobus cranialis belüftet. Er teilte sich sogleich
in drei Segmentbronchien: in den nach dorsal orientierten Bronchus segmentalis apicalis (B
I), in den nach lateral orientierten Bronchus segmentalis posterior (B II) und in den nach
ventral orientierten Bronchus segmentalis anterior (B III). Aus dem Bronchus principalis
dexter gingen drei weitere Abzweigungen hervor: für den Lobus medius in laterale Richtung
in einem Winkel von 90° der Bronchus lobaris medius dexter mit seinem Bronchus
46 Eigene Untersuchungen
segmentalis lateralis (B IV) und Bronchus segmentalis medialis (B V); für den Lobus
accessorius in ventromediale Richtung in einem Winkel von 130° der Bronchus lobaris
accessorius und für den Lobus caudalis in ventrale Richtung der Bronchus lobaris caudalis
dexter. Der Bronchus lobaris caudalis dexter als Fortsetzung des Bronchus principalis
dexter teilte sich in vier Segmentbronchien auf: in den nach medial orientierten Bronchus
segmentalis superior (B VI), in den nach ventromedial orientierten Bronchus segmentalis
basalis medialis (B VII), in den nach lateral orientierten Bronchus segmentalis basalis
anterior (B VIII) mit seinen kranialen und kaudalen Ästen, in den nach ventrolateral
orientierten Bronchus segmentalis basalis lateralis (B IX) und in den nach ventral
orientierten Bronchus segmentalisbasalis posterior (B X).
Aus dem linken Bronchus principalis sinister entsprang in einem Winkel von 145° der
Bronchus lobaris cranialis sinister, der für die Versorgung des Lobus cranialis
verantwortlich war. Er verzweigte sich in vier Segmentbronchien: in den nach dorsal
orientierten Bronchus segmentalis apicalis (B I), in den nach dorsolateral orientierten
Bronchus segmentalis posterior (B II), in den nach ventrolateral orientierten Bronchus
segmentalis anterior (B III) und in den sich sofort spaltendenden Bronchus segmentalis
lateralis (B IV) und Bronchus segmentalis superior (B V). Als Fortsetzung des Bronchus
principalis sinister verlief der Bronchus lobaris caudalis sinister weiter in ventrale Richtung
und belüftet damit den größten Lappen auf dieser Seite, den Lobus caudalis. Wie auch auf
der rechten Seite besaß er drei kleinere Verästelungen: Bronchus segmentalis superior (B
VI), Bronchus segmentalis basalis medialis (VII), Bronchus segmentalis basalis anterior (B
VIII) und zwei kräftigere Verästelungen in Form des nach ventrolateral orientierten
Bronchus segmentalis basalis lateralis (B IX) und des nach ventral orientierten Bronchus
segmentalis basalis posterior (B X).
Anhand der CT-Scans dieser Ausgusspräparate (Abbildung 6 bis Abbildung 11) wurden die
Bronchialbäume vermessen (s. Material und Methoden 3.1.5). Die Ergebnisse zum
Durchmesser der Ausgüsse der einzelnen Bronchien und zu der Distanz von der Bifurkation
nach distal sind zusammenfassend in den bis Tabelle 7 aufgeführt.
Bei adulten Tieren maß beim Ausgusspräparat der Durchmesser der Trachea ca. 1000 bis
1150 µm. Während der rechte Hauptbronchus mit 850 bis 1150 µm einen etwas größeren
Eigene Untersuchungen 47
Durchmesser hatte, war der linke Hauptbronchus mit nur 600 bis 800 µm Durchmesser
etwas kleiner. Der linke Hautbronchus war etwas kürzer als der rechte. Die Lobarbronchien
hatten Durchmesser von 450 bis 650 µm. Der intraluminale Durchmesser der
Segmentbronchien variierte zwischen 250 und 550 µm. Der Bifurkationsbereich der Trachea
wurde für die Entfernungsangaben als Nullpunkt definiert, d. h. alle im Folgenden
angegebenen Entfernungen beziehen sich auf diesen Punkt, an dem rechter und linker
Hauptbronchus zusammentreffen. Nach 4 mm in distaler Richtung im rechten
Hauptbronchus erreichte man den Bronchus lobaris cranialis dexter, wo schon nach 8 bzw.
9 mm die Segmentbronchien anfingen. Von der Bifurkation 7 mm tief rechts in lateraler-
kaudaler Richtung lagen Bronchus lobaris medius dexter und Bronchus lobaris inferior
dexter. Etwas medialer befand sich in einem Abstand von 8 mm ein Bronchus, der in den
akzessorischen Lungenlappen führte, der Bronchus lobaris accessorius. Ausführliche
Angaben zum intraluminalen Durchmesser jedes einzelnen bronchialen Segments sind
zusammenfassend in der Tabelle 5 aufgeführt.
Tabelle 5: Durchmesser der Bronchien und deren Distanz von dem Bifurkationsbereich bei
einem adulten Weißbüschelaffen (K 2197), ermittelt an einem Ausgusspräparat.
Durchmesser
(µm)
Distanz von der
Bifurkation (mm)
Trachea 1000-1150 _
Bronchus principalis dexter 850-1150 0
Bronchus lobaris cranialis dexter teilt sich in: 450-650 4
Bronchus segmentalis apicalis (B I) 450 9
Bronchus segmentalis posterior (B II) 400 9
Bronchus segmentalis anterior (B III) 300 8
Bronchus lobaris medius dexter teilt sich in: 400-450 7
Bronchus segmentalis lateralis (B IV) 300 12
Bronchus segmentalis medialis (B V) 250 12
Bronchus lobaris inferior dexter teilt sich in: 650 7
Bronchus segmentalis superior (B VI) 300 8
Bronchus segmentalis basalis medialis (B VII) 400 12
48 Eigene Untersuchungen
Bronchus segmentalis basalis anterior (B VIII) 450-500 12
Bronchus segmentalis basalis lateralis (B IX) 450 13
Bronchus segmentalis basalis posterior (B X) 500 13
Bronchus lobaris accessorius 300 8
Bronchus principalis sinister 600-800 0
Bronchus lobaris cranialis sinister teilt sich in: 450-500 8
Bronchus segmentalis apicalis (B I) 300 12
Bronchus segmentalis posterior (B II) 400 12
Bronchus segmentalis anterior (B III) 300 12
Bronchus lingularis superior (B IV) 250 11
Bronchus lingularis inferior (B V) 250 11
Bronchus lobaris caudalis sinister teilt sich in: 650-700 8
Bronchus segmentalis superior (B VI) 400-450 11
Bronchus segmentalis basalis medialis (B VII) 300 11
Bronchus segmentalis basalis anterior (B VIII) 300 11
Bronchus segmentalis basalis lateralis (B IX) 500-550 11
Bronchus segmentalis basalis posterior (B X) 400 11
Eigene Untersuchungen 49
Abbildung 6: Ansicht des Bronchialbaums (Ausgusspräparat) von ventral mit Durchmesser
der Bronchusausgüsse bei einem adulten Weißbüschelaffen (K 2157). Der Stern * steht für
B VII, der sich auf der dorsalen Seite befindet und daher nicht sichtbar ist.
50 Eigene Untersuchungen
Abbildung 7: Ansicht des Bronchialbaums (Ausgusspräparat) von ventral mit Distanzen
vom Bifurkationsbereich nach distal bei einem adulten Weißbüschelaffen (K 2157). Der
Stern * steht für B VII, der sich auf der dorsalen Seite befindet und daher nicht sichtbar ist.
Eigene Untersuchungen 51
Bei juvenilen Tieren waren die relativen Maßangaben grundsätzlich ähnlich wie bei adulten
Tieren, jedoch entsprechend kleiner skaliert. Die Trachea hatte im Lumen einen
Durchmesser von 1000 bis 1150 µm. Genauso wie bei den oben beschriebenen adulten
Tieren hatte der rechte Hauptbronchus einen Durchmesser von 800 bis 1050 µm im Lumen,
der linke hingegen nur 650 bis 800 µm. Die Lobarbronchien maßen 350 bis 650 µm in
Durchmesser. Der intraluminale Durchmesser der Segmentbronchien variierte zwischen 250
und 500 µm. Ab dem Bifurkationsbereich teilte sich die Trachea (Ausgangspunkt „0 mm“)
in zwei Hauptbronchien, deren Länge unterschiedlich war. Der linke Hautbronchus war
etwas kürzer als der rechte. Der rechte Hauptbronchus verzweigte sich schon nach 5 mm,
dann erreichte man den ersten Lobarbronchus - Bronchus lobaris cranialis dexter. Wenn
man dem rechten Hauptbronchus noch weiter in lateraler Richtung folgte, fand man ab 8
mm die Verzweigung in drei Lobarbronchien: Bronchus lobaris medius dexter, der weiter in
lateraler Richtung verlief, Bronchus lobaris inferior dexter, der für die Versorgung des
rechten kaudalen Lappens verantwortlich war und Bronchus lobaris accessorius, der den
akzessorischen Lappen versorgte. Mehr Angaben zu den einzelnen Bronchien bei juvenilen
Tieren sind in Tabelle 6 angegeben.
Tabelle 6: Durchmesser der Bronchien und deren Distanz von dem Bifurkationsbereich bei
einem juvenilen Weißbüschelaffen (K 2097/2), ermittelt an einem Ausgusspräparat.
Durchmesser
(µm)
Distanz von der
Bifurkation (mm)
Trachea 1000-1150 __
Bronchus principalis dexter 800-1050 0
Bronchus lobaris cranialis dexter teilt sich in: 450-550 5
Bronchus segmentalis apicalis (B I) 350 11
Bronchus segmentalis posterior (B II) 300-350 11
Bronchus segmentalis anterior (B III) 250 9
Bronchus lobaris medius dexter teilt sich in: 350-500 8
Bronchus segmentalis lateralis (B IV) 300 14
Bronchus segmentalis medialis (B V) 250 14
Bronchus lobaris inferior dexter teilt sich in: 550-650 8
Bronchus segmentalis superior (B VI) 400 12
52 Eigene Untersuchungen
Bronchus segmentalis basalis medialis (B VII) 250-300 11
Bronchus segmentalis basalis anterior (B VIII) 400-450 13
Bronchus segmentalis basalis lateralis (B IX) 350-400 17
Bronchus segmentalis basalis posterior (B X) 450-500 17
Bronchus lobaris accessorius 350-400 8
Bronchus principalis sinister 650-800 0
Bronchus lobaris cranialis sinister teilt sich in: 500-600 8
Bronchus segmentalis apicalis (B I) 350-400 14
Bronchus segmentalis posterior (B II) 400-450 14
Bronchus segmentalis anterior (B III) 350 13
Bronchus lingularis superior (B IV) 300 9
Bronchus lingularis inferior (B V) 250 9
Bronchus lobaris caudalis sinister teilt sich in: 600-700 8
Bronchus segmentalis superior (B VI) 250 13
Bronchus segmentalis basalis medialis (B VII) 300 14
Bronchus segmentalis basalis anterior (B VIII) 250 14
Bronchus segmentalis basalis lateralis (B IX) 300 16
Bronchus segmentalis basalis posterior (B X) 300-350 16
Eigene Untersuchungen 53
Abbildung 8: Ansicht des Bronchialbaums (Ausgusspräparat) von dorsal mit Durchmesser
der Bronchusausgüsse bei einem juvenilen Weißbüschelaffen (K 2097/2). Der Stern * steht
für B VI, der von der dorsalen Seite nicht sichtbar ist.
54 Eigene Untersuchungen
Abbildung 9: Ansicht des Bronchialbaums (Ausgusspräparat) von dorsal mit Distanz vom
Bifurkationsbereich nach distal bei einem juvenilen Weißbüschelaffen (K 2097/2). Der Stern
* steht für B VI, der von der dorsalen Seite nicht sichtbar ist.
Eigene Untersuchungen 55
Bei dem neugeborenen Tier betrug der intraluminale Durchmesser der Trachea 700 bis 800
µm. Der rechte und der linke Hauptbronchus maßen beide 500 bis 650 µm im Durchmesser.
Die Lobarbronchien waren deutlich kleiner als bei den anderen Altersgruppen, und der
intraluminale Durchmesser variierte von 250 bis 500 µm. Die Segmentbronchien zeigten
Durchmesser von 100 bis 300 µm. Nach der Verzweigung der Trachea begannen die zwei
Hauptbronchien. Der linke Hautbronchus war etwas kürzer als der rechte. Der rechte
Hauptbronchus verzweigte sich schon nach 2 mm in die Lobarbronchien, wo in lateraler
Richtung der Bronchus lobaris cranialis dexter begann. Weiter kaudal im rechten
Hauptbronchus entsprang nach 6 mm der Bronchus lobaris medius dexter. Nach weiteren 7
mm erreichte man noch zwei Lobarbronchien: Bronchus lobaris inferior dexter und den
nach medial führenden Bronchus lobaris accessorius. Eine detaillierte Information zu jedem
einzelnen Bronchus beim neugeborenen Tier ist in der Tabelle 7 zu finden.
Tabelle 7: Durchmesser der Bronchien und deren Distanz vom Bifurkationsbereich bei
einem neugeborenen Weißbüschelaffen (K 2163), ermittelt an einem Ausgusspräparat.
Durchmesser
(µm)
Distanz von der
Bifurkation (mm)
Trachea 700-800 __
Bronchus principalis dexter 500-650 0
Bronchus lobaris cranialis dexter teilt sich in: 350-400 2
Bronchus segmentalis apicalis (B I) 150-200 6
Bronchus segmentalis posterior (B II) 250-300 6
Bronchus segmentalis anterior (B III) 150 5
Bronchus lobaris medius dexter teilt sich in: 250-300 6
Bronchus segmentalis lateralis (B IV) 100-150 8
Bronchus segmentalis medialis (B V) 100 8
Bronchus lobaris inferior dexter teilt sich in: 500 7
Bronchus segmentalis superior (B VI) 250-300 8
Bronchus segmentalis basalis medialis (B VII) 100-150 10
Bronchus segmentalis basalis anterior (B VIII) 250-300 9
Bronchus segmentalis basalis lateralis (B IX) 250-300 12
Bronchus segmentalis basalis posterior (B X) 250-300 12
56 Eigene Untersuchungen
Bronchus lobaris accessorius 250-300 7
Bronchus principalis sinister 500-650 0
Bronchus lobaris cranialis sinister teilt sich in: 350 6
Bronchus segmentalis apicalis (B I) 150-250 9
Bronchus segmentalis posterior (B II) 150 9
Bronchus segmentalis anterior (B III) 150 9
Bronchus lingularis superior (B IV) 150-200 8
Bronchus lingularis inferior (B V) 150-200 8
Bronchus lobaris caudalis sinister teilt sich in: 400-450 6
Bronchus segmentalis superior (B VI) 100-150 11
Bronchus segmentalis basalis medialis (B VII) 100-150 9
Bronchus segmentalis basalis anterior (B VIII) 100-150 9
Bronchus segmentalis basalis lateralis (B IX) 250-300 9
Bronchus segmentalis basalis posterior (B X) 250-300 9
Eigene Untersuchungen 57
Abbildung 10: Ansicht des Bronchialbaums (Ausgusspräparat) von ventral mit Durchmesser
der Bronchusausgüsse bei einem neugeborenen Weißbüschelaffen (K 2163). Die Sterne *
stehen für B VII und B VI, die sich auf der dorsalen Seite befinden und daher nicht sichtbar
sind.
58 Eigene Untersuchungen
Abbildung 11: Ansicht des Bronchialbaums (Ausgusspräparat) von ventral mit Distanz vom
Bifurkationsbereich nach distal bei einem neugeborenen Weißbüschelaffen (K 2163). Die
Sterne * stehen für B VII und B VI, die sich auf der dorsalen Seite befinden und daher nicht
sichtbar sind.
Eigene Untersuchungen 59
3.2.2 Histologie und Immunhistochemie
Die Ergebnisse der histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen zu Trachea
und Hauptbronchus beziehen sich entsprechend der Angaben im Abschnitt Material und
Methoden nur auf adulte Tiere. Die Ergebnisse zu den intrapulmonalen Atemwegen
(Bronchus, Bronchiolus) schließen alle untersuchten Altersgruppen ein.
3.2.2.1 Trachea
Die Trachea war von zwei verschiedenen Epithelformen ausgekleidet. Der größte ventrale
Teil der Trachea, die Pars cartilaginea, bestand aus einem einschichtigen, einreihigen
kubischen Epithel, in dem nicht-zilierte Zellen gegenüber den zilierten Zellen dominierten.
Der dorsale knorpelfreie Teil der Trachea, die Pars membranacea, wurde von einem
einschichtigen, mehrreihigen, hochprismatischen Flimmerepithel ausgekleidet, in dem die
zilierten Zellen überwogen. Mit immunhistochemischen Färbungen konnten die nicht-
zilierten Zellen in beiden Lokalisationen unterschieden werden. Insbesondere im Bereich der
Pars membranacea lagen eine große Anzahl an Clara-Zellen, eine deutlich geringere Anzahl
an Becherzellen und vereinzelt basal liegende pulmonale neuroendokrine Zellen (PNEZ)
vor. Unter der schmalen Basalmembran, auf deren Oberfläche die zilierten und nicht-
zilierten Zellen ruhten, und die nur unter großer Vergrößerung gut sichtbar war, lag die
Lamina propria mucosae. Sie bestand aus lockerem Bindegewebe mit elastischen Fasern
und glatter Muskulatur, Gefäßen und Nerven. Seromuköse Trachealdrüsen waren in der
Lamina propria mucosae nicht nachweisbar.
3.2.2.2 Hauptbronchus
Die an der Bifurcatio tracheae (Bifurkation) beginnenden zwei Hauptbronchien wiesen ein
einschichtiges, mehrreihiges, hochprismatisches Flimmerepithel auf, das in den basalen
Bereichen durch zahlreiche deutlich runde Basalzellen gekennzeichnet war. Außerdem
60 Eigene Untersuchungen
zeigten sich verschiedene nicht-zilierte Zellen, die mit Hilfe der immunhistochemischen
Färbungen identifiziert werden konnten: Clara-Zellen, vereinzelt Becherzellen und basal
vereinzelt liegende PNEZ. In der Lamina propria mucosae befanden sich eine Schicht
glatter Muskulatur, elastischer Fasern, Gefäße und Nerven. Seromuköse Bronchialdrüsen
waren nicht nachweisbar.
3.2.2.3 Lobar- und Segmentbronchus
Das Bronchiallumen wurde von einem einschichtigen, mehrreihigen, hochprismatischen
Flimmerepithel ausgekleidet, das einer Basalmembran auflag. Die Höhe des Epithels nahm
nach distal ab. Aber auch in den proximalen Regionen in den Bereichen der
Abzweigungsstellen der Lobar- und Segmentbronchien war das Epithel eher isoprismatisch.
Neben zilierten Zellen, die den überwiegenden Teil der Epithelzellen darstellten, zeigten
sich als nicht-zilierte Zellen hauptsächlich Clara-Zellen, aber auch Becherzellen und
pulmonale neuroendokrine Zellen (sie werden später im Kapitel 3.2.2.5 ausführlicher
beschrieben). Zwei Besonderheiten der Bronchuswand bei Weißbüschelaffen waren das
Fehlen von Bronchialdrüsen und die starke Ausprägung des Knorpelgewebes. Die Lamina
propria mucosae war reich an Bindegewebe, das aus kollagenen und elastischen Fasern,
Nerven, Blut- und Lymphgefäßen bestand. Glatte Muskulatur lag den Knorpelstrukturen
lumenwärts auf und war konzentrisch angeordnet. In dem in Abbildung 12 gezeigten
histologischen Schnitt sind die Besonderheiten des respiratorischen Epithels im Bronchus
dargestellt.
Eigene Untersuchungen 61
Abbildung 12: Histologischer Aufbau eines Segmentbronchus bei einem adulten
Weißbüschelaffen (G 8272). H&E-Färbung, Scale bar = 100 µm.
3.2.2.4 Bronchiolus
Nach mehrmals sich dichotomisch aufteilenden Bronchien folgten die Bronchiolen mit
Durchmesser von etwa 250 µm im Durchmesser. Die Bronchioli veri waren mit einem
einschichtigen, mehrreihigen, isoprismatischen Flimmerepithel ausgekleidet. Das
Flimmerepithel bestand aus zilierten Zellen und nicht-zilierten Zellen, hauptsächlich Clara-
Zellen, einzelnen Becherzellen und einzelnen pulmonalen neuroendokrinen Zellen sowie
vereinzelt neuroepithelial bodies (NEBs).
Das einschichtige, mehrreihige, isoprismatische Flimmerepithel nahm zur Peripherie hin an
Höhe ab und ging in Höhe der Bronchioli terminales in ein einschichtiges, einreihiges
flaches bis kubisches Flimmerepithel über, bei dem deutlich weniger zilierte Zellen
nachweisbar waren. In den Bronchioli terminales wurden außer den nicht-zilierten Zellen
nur Clara-Zellen und PNEZ gefunden. Die Lamina propria mucosae war nicht mehr so reich
an Bindegewebe. Drüsenstrukturen fehlten. Dafür waren immer noch einzelne
Knorpelplättchen vorhanden (Abbildung 13). Die glatte Muskelschicht war ebenfalls
sichtbar.
62 Eigene Untersuchungen
Die Bronchioli respiratorii beim Weißbüschelaffen besaßen ein einschichtiges, einreihiges,
kubisches Epithel ohne Zilien. Unter der schmalen Basalmembran fanden sich elastische
Fasern und glatte Muskelzellen. Knorpelplättchen und Drüsenstrukturen lagen nicht vor.
Abbildung 13: Histologischer Aufbau eines Bronchiolus bei einem adulten
Weißbüschelaffen (G 8272). Auch in den terminalen Bronchiolen finden sich bei dieser
Primatenspezies noch hyaline Knorpelstrukturen. H&E-Färbung, Scale bar = 50 µm.
3.2.2.5 Nicht-zilierte Zellen der intrapulmonalen Atemwege
Histologisch war die Differenzierung der verschiedenen nicht-zilierten Zellen im
standardgefärbten H&E-Schnitt sehr schwierig bzw. nicht möglich. Man konnte allenfalls
apikale Zellabschnitte der nicht-zilierten Zellen als konvexe Vorbuchtungen im Bronchial-
und Bronchiolarlumen sehen, die auf apokrin sezernierende Becher- oder Clara-Zellen
hindeuteten (Abbildung 14).
Eigene Untersuchungen 63
Abbildung 14: Flimmerepithel eines Segmentbronchus eines juvenilen Weißbüschelaffen (G
2095). Es sind vorgewölbte nicht-zilierte Zellen zu sehen (Pfeile). H&E-Färbung, Scale bar
= 20 µm.
3.2.2.5.1 Clara-Zellen
Die Clara-Zellen waren im intrapulmonalen respiratorischen Epithel aller Altersgruppen im
Vergleich zu den anderen nicht-zilierten Zellen der dominante Zelltyp. Die Anzahl der
Zellen hing stark davon ab, welcher Teil des Bronchialbaums untersucht wurde.
Mithilfe eines Antikörpers gegen das Clara Cell Secretory Protein (CCSP) Human konnten
Clara-Zellen im respiratorischen Epithel markiert werden. Hierbei fiel auf, dass von den
Hauptbronchien bis in die terminalen Bronchiolen bei Weißbüschelaffen aller Altersklassen
in hoher Anzahl Clara-Zellen zu finden waren. Die Immunreaktivität der Zellen zeigte sich
in einem intrazytoplasmatischen, teils deutlich granulierten Signal mit Akzentuierung im
apikalen Zellkompartiment (Abbildung 15). Die meisten Zellen hatten entweder eine leicht
vorgewölbte Oberfläche oder eine apikal kuppelartige Form, was der typischen Clara-
Zellmorphologie entsprach. Aber es wurden auch Zellen gefunden, die sich von den
benachbarten zilierten Zellen nicht sonderlich abhoben.
Mit Hilfe der Antiköper gegen die Surfactant-Proteine B und C konnte eine entsprechende
Surfactant-Proteinexpression in den Clara-Zellen bei Weißbüschelaffen aller Altersgruppen
nachgewiesen werden. Surfactant-Protein B wurde ab Höhe der Segmentbronchien
(Abbildung 15 B) und zunehmend nach distal bis zu den Bronchiolen (Abbildung 16 B)
gefunden. Im Gegensatz dazu wurde Surfactant-Protein C nur vereinzelt ab Höhe der
kleineren Segmentbronchien exprimiert und nahm dann ebenfalls nach distal bis zu den
64 Eigene Untersuchungen
Bronchiolen zu (Abbildung 16 C). Im Bereich der Bronchioli respiratorii wurden beide
Surfactant-Proteine B und C von nahezu allen Clara-Zellen exprimiert.
Abbildung 15: A: CCSP-positive Zellen (Pfeile) in einem Segmentbronchus bei einem
adulten Weißbüschelaffen (G 8023). IHC, SABC-DAB. CCSP Human. Scale bar = 20 µm.
B: Surfactant-Protein B-positive Zellen (Pfeile) in einem Segmentbronchus bei einem
adulten Weißbüschelaffen (G 8023). IHC, SABC-DAB, Surfactant B. Scale bar = 20 µm.
Eigene Untersuchungen 65
Abbildung 16: Clara-Zellen in einem Bronchiolus veri bei einem adulten Weißbüschelaffen
(G 8023). Scale bar = 20 µm. A: CCSP exprimierende Clara-Zellen (Pfeile), IHC, SABC-
DAB, CCSP-Human; B: Surfactant-Protein B exprimierende nicht-zilierte Zellen (Pfeile),
IHC, SABC-DAB, Surfactant B; C: Surfactant-Protein C exprimierende nicht-zilierte Zellen
(Pfeile), IHC, SABC-DAB, Surfactant C.
3.2.2.5.2 Becherzellen
Die Markierung von Becherzellen erfolgte färberisch mit der PAS-Reaktion und mit Alcian
Blau 8 GS sowie immunhistochemisch mit dem mukusbindenden intrazytoplasmatischen
Antikörper MUC5AC. Alle angewendeten Färbungen bei allen Altersgruppen zeigten
positive Signale im gesamten respiratorischen Epithel der intrapulmonalen Atemwege,
wenngleich die Intensität aller Färbungen insgesamt eher schwach war und Details der
Becherzellmorphologie wenig deutlich hervortraten (Abbildung 17 und Abbildung 18).
Grundsätzlich konnten in den proximalen Anteilen des Bronchialbaums mehr Becherzellen
identifiziert werden als in den distalen Bereichen.
Die Färbung mit dem mukusbindenden intrazytoplasmatischen Antikörper MUC5AC zeigte
deutliche positive Signale in Granulaform, die sich disseminiert intrazytoplasmatisch
66 Eigene Untersuchungen
befanden (Abbildung 17 A), vorwiegend aber im apikalen und seltener im mittleren Bereich
des Zytoplasmas nachweisbar waren.
Die in den Becherzellen enthaltenen sauren Mukopolysaccharide wurden mit Hilfe der
Alcian Blau-Färbung (Abbildung 17 B) dargestellt. Mit dieser Färbung waren Becherzellen
nur vereinzelt zu erkennen. Weiterhin war der Oberflächenfilm des respiratorischen Epithels
diffus Alcian Blau positiv.
Die PAS-Reaktion, mit der saure und neutrale Mukopolysaccharide angefärbt werden
konnten, charakterisierte die Becherzellen als magentafarbige Zellen, deren Farbintensität
sehr ungleichmäßig war. Etwa jede 20ste Zelle eines Segmentbronchus war positiv. Bei
neugeborenen Tieren konnte man zusätzlich zu den markierten Becherzellen in basalen
Epithelbereichen viele PAS-positive rundovale Zellen nachweisen, die nicht die luminale
Oberfläche erreichten.
Abbildung 17: A: MUC5AC positive Becherzellen (Pfeile) in einem Segmentbronchus
eines adulten Weißbüschelaffen (G 8023). IHC, SABC-DAB, MUC5AC, Scale bar = 20
µm. B: Alcian Blau positive Becherzellen (Pfeile) in einem Segmentbronchus bei einem
adulten Weißbüschelaffen (G 8023). Der Oberflächenfilm ist ebenfalls Alcianblau positiv
(gepunkteter Pfeil). Alcian Blau 8GS, Scale bar = 20 µm.
Eigene Untersuchungen 67
Abbildung 18: PAS-positive Becherzellen (Pfeile) in einem Segmentbronchus eines adulten
Weißbüschelaffen (G 8282). PAS-Reaktion, Scale bar = 20 µm.
3.2.2.5.3 Pulmonale neuroendokrine Zellen
Die immunhistochemische Färbung mit einem Antikörper gegen die Neuronspezifische
Enolase (NSE) stellte die pulmonalen neuroendokrinen Zellen (PNEZ) in den Bronchien
sowie in den Bronchiolen bei Weißbüschelaffen aller Altersgruppen dar.
Die PNEZ waren am häufigsten nahe der Basalmembran lokalisiert. Es handelte sich zum
einen um runde bis ovale Einzelzellen und zum anderen um korpuskuläre Zellaggregate,
sogenannte „neuroepithelial bodies“ (NEBs) (Abbildung 19). Auffallend war die
topographische Nähe der positiv markierten PNEZ zu den ebenfalls mit NSE anfärbbaren
peribronchialen und peribronchiolären Nervenfasern (Abbildung 19 und Abbildung 20). Die
NEBs bestanden durchschnittlich aus 2 bis 20 Einzelzellen (Abbildung 21). Die Anzahl der
NEBs nahm besonders in terminalen Bronchiolen zu.
Bei allen untersuchten Präparaten kamen die PNEZ selten in Lobar- und Segmentbronchien
vor. Allerdings stieg die Anzahl von PNEZ im bronchiolären Bereich.
68 Eigene Untersuchungen
Abbildung 19: Runde, überwiegend basal lokalisierte NSE-positive Zellen (Pfeile). Einzelne
Zelle (rechts) und NEB (links) in einem Segmentbronchus bei einem adulten
Weißbüschelaffen (G 8023). IHC, SABC-DAB, NSE, Scale bar = 20 µm.
Abbildung 20: NEB (durchgezogener Pfeil) ist mit einer NSE-positivmarkierten Nervenfaser
(gepunkteter Pfeil) verbunden. Segmentbronchus bei einem adulten Weißbüschelaffen (G
8307). IHC, SABC-DAB, NSE, Scale bar = 20 µm.
Abbildung 21: NSE-positive Zellen (gepunkteter Pfeil) und NEB bestehend aus ca. 10
Einzelzellen (durchgezogener Pfeil) in einem Bronchiolus bei einem adulten
Weißbüschelaffen (G 8023). IHC, SABC-DAB, NSE, Scale bar = 20 µm.
3.2.2.5.4 Basalzellen
Im respiratorischen Epithel der intrapulmonalen Atemwege auf der schmalen Lamina
propria mucosae waren Basalzellen und andere undifferenzierte Zellen zu finden. Mit
Ausnahme des respiratorischen Epithels in den terminalen Bronchiolen und der Bronchioli
respiratorii, konnten sie in allen Lokalisationen und bei allen Altersgruppen gefunden
Eigene Untersuchungen 69
werden. Die Zellen wiesen eine runde, ovale oder längliche Form auf. Sie besaßen einen
rund-ovalen Kern und wenig Zytoplasma. Auffallend war, dass die Basalzellen häufig
ziemlich nah an den nicht-zilierten Zellen lagen (Abbildung 22). Bei neugeborenen Tieren
waren sie aufgrund des hohen Glykogengehaltes häufig PAS positiv.
Abbildung 22: In Bereichen, wo die nicht-zilierten Zellen (gepunktete Pfeile) häufiger
vorkamen, lagen auf der Basalmembran Basalzellen (durchgezogene Pfeile).
Segmentbronchus bei einem adulten Weißbüschelaffen (G 8109). Semidünnschnitt,
Methylenblaufärbung nach RICHARDSON et al. (1960), Scale bar = 20 µm.
3.2.2.6 Alveolarepithel
Das Alveolarepithel der Weißbüschelaffen bestand aus zwei Zelltypen: flachen
Pneumozyten Typ I und polygonalen Pneumozyten Typ II, die beide auf der Basalmembran
ruhten. Bei adulten und juvenilen Tieren stellte sich das Alveolarseptum sehr schmal dar.
Bei neugeborenen Tieren wurde das Alveolarseptum von kubischen Alveolarepithelzellen
bedeckt. Der Durchmesser einer Alveole bei neugeborenen Tieren war etwa halb so groß
wie der bei adulten Tieren. Eine einzelne Alveole war rundlich bis polygonal und maß bei
adulten Tieren etwa 50 bis 100 µm im Durchmesser. Bei adulten und juvenilen Tieren
stellten sich Pneumozyten Typ I histologisch als flache Zellen.
Um die Pneumozyten Typ II identifizieren zu können, wurden immunhistochemische
Färbungen mit Antikörpern gegen die Surfactantproteine B und C verwendet. Mittels der
immunhistochemischen Färbungen konnte gezeigt werden, dass die Pneumozyten Typ II
Surfactant-Proteine B und C im Zytoplasma exprimierten. Die meisten Penumozyten Typ II
70 Eigene Untersuchungen
lagen in den Nischen der Alveolen. Es waren durchschnittlich etwa 2 bis 3 Zellen pro
Alveole bei adulten Tieren vorhanden (Abbildung 23 und Abbildung 24). Sie waren bis zu
15 µm breit und hoch.
Abbildung 23: Alveolarepithel eines adulten Weißbüschelaffen (G 8023) mit Surfactant-
Protein B-positiven Pneumozyten Typ II (Pfeile). Pro Alveole sind etwa 2 bis 3 Surfactant
B-positive Zellen zu sehen. IHC, SABC-DAB, Surfactant-Protein B, Scale bar = 20 µm.
Eigene Untersuchungen 71
Abbildung 24: Alveolarepithel eines adulten Weißbüschelaffen (G 8023) mit Surfactant-
Protein C-positiven Pneumozyten Typ II (Pfeile). Es wurden ca. 2 bis 3 positive Zellen pro
Alveole gefunden. IHC, SABC-DAB, Surfactant-Protein C, Scale bar = 20 µm.
3.2.2.7 Alveolarmakrophagen
Bei allen Altersgruppen konnten in den alveolären Bereichen pulmonale
Alveolarmakrophagen gefunden werden. Es handelte sich um Zellen mit einer Größe von bis
zu 15 µm im Durchmesser. Während Pneumozyten Typ I und II auf der Basalmembran
saßen, befanden sich die Alveolarmakrophagen anhaftend an den Pneumozyten lumenwärts
oder direkt im Lumen. Pro Alveole konnte man bei einem gesunden adulten
Weißbüschelaffen zwischen 3 und 5 Alveolarmakrophagen finden. Histologisch zeigten sie
ihre typische Struktur mit viel Zytoplasma und großem Kern. Mit Hilfe von
immunhistochemischen Methoden konnten die Alveolarmakrophagen bei
Weißbüschelaffenlungen dargestellt werden. Dazu diente eine immunhistochemische
Färbung mit dem Antikörper MAC 387. Die Alveolarmakrophagen zeigten sich damit als
runde bis ovale Zellen mit viel Zytoplasma (Abbildung 25). Mittels immunhistochemischer
Färbungen mit den Antikörpern Surfactant-Protein B und C konnte außerdem gezeigt
72 Eigene Untersuchungen
werden, dass Alveolarmakrophagen Surfactant-Proteine B (Abbildung 26 A) und Surfactant-
Protein C (Abbildung 26 B) enthielten.
Abbildung 25: Alveolarmakrophagen (Pfeile) im alveolären Bereich bei einem adulten
Weißbüschelaffen (G 8023). IHC, SABC-DAB, MAC 387, Scale bar = 20 µm.
Eigene Untersuchungen 73
Abbildung 26: A: Surfactant-Protein B enthaltender Alveolarmakrophage (Pfeil) bei einem
adulten Weißbüschelaffen (G 8023). IHC, SABC-DAB, Surfactant B, Scale bar = 20 µm. B:
Intraalveoläre Surfactant-Protein C enthaltender Alveolarmakrophage (Pfeil) bei einem
adulten Weißbüschelaffen (G 8023). IHC, SABC-DAB, Surfactant C, Scale bar = 20 µm.
74 Eigene Untersuchungen
3.2.3 Verteilung der nicht-zilierten Zellen in den intrapulmonalen luftführenden
Wegen
3.2.3.1 Statistische Auswertung der nicht-zilierten Zellen
Im Anschluss an die histomorphologischen und allgemeinen immunhistochemischen
Untersuchungen wurde die Verteilung der nicht-zilierten Zellen statistisch ausgewertet. Die
statistischen Untersuchungen erfolgten an einer ausgewählten Gruppe von
Weißbüschelaffen (n = 20) aus drei Altersgruppen (neugeboren, juvenil, adult). Bei den
Clara-Zellen wurde mittels Repeated-Measure ANOVA Test ein signifikanter Unterschied
zwischen den Altersgruppen in der Anzahl der Clara-Zellen gefunden (p < 0,01). Ein
Unterschied in der Anzahl der Clara-Zellen in der Lokalisation bzw. in der Wechselwirkung
von Altersgruppen und Lokalisation konnte nicht gezeigt werden (Tabelle 8).
Tabelle 8: Ergebnisse der Repeated-Measure ANOVA Tests hinsichtlich Clara-Zellen
bezüglich der Signifikanz der festgestellten Unterschiede.
Effekt p-Wert Interpretation
Altersgruppe < 0,01 Signifikant
Lokalisation = 0,51 Nicht signifikant
Altersgruppe*Lokalisation = 0,21 Nicht signifikant
Die Auswertung deutet auf keine Wechselwirkung zwischen Lokalisation und Altersgruppe
hin, daher wird keine Auftrennung nach Lokalisation unternommen. Auch die Verteilung
der Clara-Zellen in den beiden Lokalisationen Bronchus und Bronchiolus weist keine
statistisch signifikanten Unterschiede auf. Um die Unterschiede in den Altersgruppen
herauszustellen, wurde ein T-Test mit Adjustierung nach der Bonferroni-Methode
verwendet, der unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Altersgruppen durchgeführt
wurde. Hierbei wurden signifikante Unterschiede zwischen adulten und neugeborenen sowie
zwischen juvenilen und neugeborenen Tieren festgestellt (Tabelle 9). Zwischen adulten und
juvenilen Tieren wurden keine signifikanten Unterschiede gefunden.
Eigene Untersuchungen 75
Tabelle 9: Paarvergleich hinsichtlich Clara-Zellen.
Vergleich p-Wert (adjustiert) Interpretation
Adulte-Neugeborene < 0,01 Signifikant
Juvenile-Neugeborene < 0,01 Signifikant
Die Mittelwerte der Zählungen von Clara-Zellen und die entsprechenden
Standardabweichungen sind in Tabelle 10 zusammengefasst. Die Ergebnisse zeigten, dass
juvenile und adulte Tiere mehr Clara-Zellen besaßen als neugeborene. Eine graphische
Darstellung dieser Ergebnisse ist in Abbildung 27 zu sehen, die das unterschiedliche
Vorkommen von Clara-Zellen bei neugeborenen, juvenilen und adulten Weißbüschelaffen
veranschaulicht.
Tabelle 10: Mittelwerte und Standardabweichungen zu den Repeated-Measure ANOVA
Tests hinsichtlich Clara-Zellen.
Altersgruppe Mittelwert ± Standardabweichung
Adulte 22,23 ± 4,08
Juvenile 26,98 ± 8,53
Neugeborene 16,45 ± 5,08
76 Eigene Untersuchungen
Adulte Juvenile Neugeborene
Altersgruppe
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
Anzahl der
Cla
ra-Z
ellen
Abbildung 27: Haupteffekt Altersgruppe der Repeated-Measure ANOVA Tests.
Bei den Becherzellen wurden keine signifikanten Unterschiede innerhalb der Altersgruppen
und keine Wechselwirkung zwischen Altersgruppe und Lokalisation gefunden (p = 0,91, p =
0,51), wohl aber hinsichtlich der Lokalisation (p < 0,02). So war die Anzahl der
Becherzellen im Bronchus signifikant höher als im Bronchiolus. Da keine Wechselwirkung
zwischen Lokalisation und Altersgruppen gefunden werden konnte, war keine Auftrennung
nach Altersgruppen notwendig. Da nur zwei Lokalisationen untersucht wurden, erübrigte
sich auch ein weiterer Hypothesentest innerhalb der Lokalisationen. Die Ergebnisse des
Repeated-Measure ANOVA Test sind in der Tabelle 11 zusammengefasst. Tabelle 12 enthält
die Mittelwerte der Zählungen und die entsprechenden Standardabweichungen. Eine
graphische Darstellung der Zählungen der Becherzellen, nach Lokalisation aufgeschlüsselt,
zeigt Abbildung 28. Die Becherzellen kommen im Bronchus häufiger vor als im
Bronchiolus, sind aber in beiden Lokalisationen recht selten.
Eigene Untersuchungen 77
Tabelle 11: Ergebnisse der Repeated-Measure ANOVA Tests hinsichtlich Becherzellen.
Effekt p-Wert Interpretation
Altersgruppe 0,91 Nicht signifikant
Lokalisation 0,02 Signifikant
Altersgruppe*Lokalisation 0,51 Nicht signifikant
Tabelle 12: Mittelwerte und Standardabweichungen des Repeated-Measure ANOVA Tests
hinsichtlich Becherzellen.
Lokalisation Mittelwert ± Standardabweichung
Bronchus 3,61 ± 3,71
Bronchiolus 1,16 ± 1,64
Bronchus Bronchiolus0
1
2
3
4
5
6
An
za
hl d
er
Be
ch
erz
elle
n
Abbildung 28: Haupteffekt Lokalisation des Repeated-Measure ANOVA Tests bezüglich
Becherzellen.
Bei den pulmonalen neuroendokrinen Zellen wurden ebenfalls keine signifikanten
Unterschiede zwischen den Altersgruppen und keine Wechselwirkung zwischen Alter und
Lokalisation gefunden (Tabelle 13). Die Unterschiede zwischen den Lokalisationen sind
jedoch signifikant (p < 0,01). So war die Anzahl der PNEZ im Bronchiolus signifikant höher
78 Eigene Untersuchungen
als im Bronchus. Da keine Wechselwirkung zwischen Lokalisation und Altersgruppen
gefunden werden konnte, war keine Auftrennung nach Altersgruppen notwendig. Auch hier
wurden nur zwei Lokalisationen untersucht, so dass auf eine weitergehende Untersuchung
mittels T-Test verzichtet werden konnte. Die Ergebnisse des Repeated-Measure ANOVA
Tests sind in Tabelle 13 zusammengefasst. Die Ergebnisse der Zählungen stehen in Tabelle
14 und sind ferner in Abbildung 29 graphisch dargestellt. Es konnte also gezeigt werden,
dass die pulmonalen neuroendokrinen Zellen im Bronchiolus häufiger vorkommen als im
Bronchus.
Tabelle 13: Ergebnisse des Repeated-Measure ANOVA Tests hinsichtlich pulmonaler
neuroendokriner Zellen.
Effekt p-Wert Interpretation
Altersgruppe = 0,61 Nicht signifikant
Lokalisation < 0,01 Signifikant
Altersgruppe*Lokalisation = 0,23 Nicht signifikant
Tabelle 14: Mittelwerte und Standardabweichungen zum Repeated-Measure ANOVA Test
hinsichtlich pulmonaler neuroendokriner Zellen.
Lokalisation Mittelwert ± Standardabweichung
Bronchus 1,06 ± 0,70
Bronchiolus 1,87 ± 1,22
Eigene Untersuchungen 79
Bronchus Bronchiolus0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
An
za
hl d
er
pulm
ona
len n
eu
roe
nd
okrin
en Z
elle
n
Abbildung 29: Haupteffekt Lokalisation des Repeated-Measure ANOVA Tests bei
pulmonalen neuroendokrinen Zellen.
3.2.3.2 Prozentuale Verteilung der nicht-zilierten Zellen im Vergleich zu zilierten und
undifferenzierten Zellen
Die Verteilung der nicht-zilierten Zellen im respiratorischen Epithel in den intrapulmonalen
Wegen war je nach Lokalisation und Altersgruppe unterschiedlich. Im Bereich des
Bronchus stellten die CCSP-positiven Clara-Zellen die Mehrheit der nicht-zilierten Zellen
dar. Becherzellen und PNEZ bildeten einen geringeren Anteil. Betrachtet man zusätzlich zu
den nicht-zilierten Zellen auch die zilierten Zellen, so waren bei adulten Tieren (Abbildung
30) etwa 25 % aller Zellen Clara-Zellen. Bei juvenilen Tieren betrug ihr Anteil sogar 27 %
(Abbildung 31), also etwas mehr als bei adulten Tieren. Bei neugeborenen Tieren hingegen
machte der Anteil der Clara-Zellen lediglich 16 % (Abbildung 32). Diese Ergebnisse
entsprechen somit den bereits dargestellten Werten der statistischen Auswertungen.
MUC5AC-positive Becherzellen machten bei neugeborenen und adulten 4 % der
Gesamtheit aus, bei juvenilen etwa 3 %. NSE-positive pulmonale neuroendokrine Zellen
80 Eigene Untersuchungen
waren am wenigsten vorhanden und hatten bei allen Altersgruppen konstant ein Anteil von 1
%.
Abbildung 30: Prozentualer Anteil der Epithelzellen bei adulten Tieren im Bronchus.
Abbildung 31: Prozentualer Anteil der Epithelzellen bei juvenilen Tieren im Bronchus.
Zilierte und
undifferenzierte
Zellen
70%
Clara-Zellen
25%
Becherzellen
4%
Neurendokrine
Zellen
1%
Zilierte und
undifferenzierte
Zellen
69%
Clara-Zellen
27%
Becherzellen
3%
Neurendokrine
Zellen
1%
Eigene Untersuchungen 81
Abbildung 32: Prozentualer Anteil der Epithelzellen bei neugeborenen Tieren im Bronchus.
Im Bereich des Bronchiolus wurde genauso wie im Bereich des Bronchus festgestellt, dass
die CCSP-positive Clara-Zellenpopulation unter den nicht-zilierten Zellen vorherrschte. Bei
adulten Tieren (Abbildung 33) lag ihr Anteil an allen Zellen mit 17 % etwas niedriger als im
Bereich des Bronchus. Bei den juvenilen Tieren (Abbildung 34) war der Anteil mit 27 %
genauso hoch wie im Bronchus. Neugeborene Tiere (Abbildung 35) wiesen im
bronchiolären Bereich mit einem Anteil von 17 % etwas mehr CCSP-positive Clara-Zellen
auf als im Bereich des Bronchus. MUC5AC-positive Becherzellen waren im bronchiolären
Bereich kaum vorhanden. Adulte und neugeborene Tiere wiesen nur 1 % und juvenile 2 %
Becherzellen auf. Die NSE-positiven pulmonalen neuroendokrinen Zellen waren im
bronchiolären Bereich etwas stärker vertreten als im Bereich des Bronchus. Die Anteile
lagen bei adulten und juvenilen Tieren um 2 % und bei neugeborenen bei 1 %.
Zilierte und
undifferenzierte
Zellen
79%
Clara-Zellen
16%
Becherzellen
4%
Neurendokrine
Zellen
1%
82 Eigene Untersuchungen
Abbildung 33: Prozentualer Anteil der Epithelzellen bei adulten Tieren im Bronchiolus.
Abbildung 34: Prozentualer Anteil der Epithelzellen bei juvenilen Tieren im Bronchiolus.
Zilierte und
undifferenzierte
Zellen
78%
Clara-Zellen
19%
Becherzellen
1%
Neurendokrine
Zellen
2%
Zilierte und
undifferenzierte
Zellen
69%
Clara-Zellen
27%
Becherzellen
2%
Neurendokrine
Zellen
2%
Eigene Untersuchungen 83
Abbildung 35: Prozentualer Anteil der Epithelzellen bei neugeborenen Tieren im
Bronchiolus.
3.2.4 Elektronenmikroskopische Untersuchungen an den Clara-Zellen
Da Clara-Zellen einen besonderen Schwerpunkt dieser Arbeit darstellen und außerdem die
mit Abstand häufigsten nicht-zilierten Epithelzellen in den luftleitenden Wegen waren,
wurden entsprechende ultrastrukturelle Untersuchungen durchgeführt, um diesen Zelltyp
näher zu charakterisieren.
Die Clara-Zellen im Bronchus und im Bronchiolus besaßen einen runden bis ovalen Nukleus
mit einem prominenten Nukleolus (Abbildung 36 und Abbildung 37). Das Zytoplasma der
Clara-Zellen war insgesamt etwas elektronendichter als bei den benachbarten zilierten
Zellen (Abbildung 37). Die charakteristischen Clara-Zellgranula waren meistens im apikalen
Bereich des Zytoplasmas zu finden. Sowohl im Bronchus als auch im Bronchiolus konnte
eine unterschiedliche Anzahl von Granula beobachtet werden. Dabei wurde keine
Abhängigkeit von der Lokalisation festgestellt. Die Anzahl von Clara-Zellgranula in einer
Clara-Zelle schwankte zwischen 2 und 40 Stück. In den Clara-Zellen, deren luminaler
Zellpol gleich hoch wie bei den anderen zilierten Zellen war, befanden sich wenige Granula.
Zilierte und
undifferenzierte
Zellen
81%
Clara-Zellen
17%
Becherzellen
1% Neurendokrine
Zellen
1%
84 Eigene Untersuchungen
In denjenigen, die die anderen zilierten Zellen überragten, konnten in der Regel viele
Granula nachgewiesen werden. Die Granula hatten unterschiedliche Durchmesser und
unterschiedliche elektronenmikroskopische Dichte. Die kleinsten der Granula maßen 100
nm im Durchmesser, die größten hingegen bis zu 500 nm. Die besonders elektronendichten
Granula waren 250 bis 300 nm groß, rund und lagen im apikalen Zytoplasma. Etwa 1 bis 3
Granula pro Zelle zeigten einen elektronenhellen Hof (Abbildung 38).
Im apikalen Zytoplasma, supra- und perinukleär, befand sich wenig glattes und viel raues
endoplasmatisches Retikulum. Perinukleär war der Golgi-Apparat zu erkennen.
Mitochondrien waren basal und perinukleär lokalisiert. Sie waren etwa 1 bis 1,8 µm groß
und vom Crista-Typ (Abbildung 39). Diffus im Zytoplasma wurden weiterhin
Glykogenpartikel gefunden. In den apikalen Bereichen konnten bei vielen Zellen
pinozytotische Vesikel mit einem Durchmesser von etwa 50 bis 80 nm gefunden werden.
Außerdem enthielten die Clara-Zellen vereinzelt Lipidgranula, die bis zu 1 µm im
Durchmesser maßen. Diese Lipidgranula waren rund und elektronendurchlässig.
Die meisten Clara-Zellen überragten mit ihrem apikalen Zellpol die Zilien des
Flimmerepithels. Aber es gab auch Clara-Zellen, die nicht über die Ebene der benachbarten
luminalen Zellgrenzen hinausragten. Sowohl im Bronchial- als auch im Bronchiolarepithel
konnten Clara-Zellen mit und ohne luminale Projektion gefunden werden. Die apikale
Zellmembran war entweder mit feinen zytoplasmatischen Protrusionen (Abbildung 40 A)
versehen oder glatt. Außerdem waren auf der Oberfläche einiger Zellen viele Mikroporen zu
erkennen (Abbildung 41). Diese konnten besonders gut mittels
rasterelektronenmikroskopischer Untersuchungen festgestellt werden. Unter Verlust des
apikalen Zytoplasmas schnürten die Clara-Zellen bisweilen die sogenannten apical caps als
Ausdruck apokriner Sekretion ab.
Eigene Untersuchungen 85
Abbildung 36: Clara-Zellen in einem Hauptbronchus mit runden elektronendichten Granula
im apikalen Zytoplasma, hellen Lipidgranula (Pfeil) und Mikrovilli auf der luminalen
Oberfläche bei einem adulten Weißbüschelaffen (G 8212). TEM, Gerätevergrößerung (GV):
X6300.
Abbildung 37: Clara-Zelle in einem Segmentbronchus bei einem adulten Weißbüschelaffen
(G 8238), die mit ihrem apikalen Zellpol die Flimmerzellen überragt. TEM, Multiple image
alignment (MIA), GV: X2500.
86 Eigene Untersuchungen
Abbildung 38: Sekretorische Clara-Zellengranula im apikalen Zytoplasma einer Clara-Zelle.
Die Granula (G) sind rund, elektronendicht und unterschiedlichen Durchmessers. Im
Zytoplasmasaum befinden sich Glykogen (Sternchen) und pinozytotische Vesikel (weiße
gepunktete Pfeile). Die Oberfläche weist Mikrovilli (schwarzer Pfeil) auf.
Segmentbronchus, adulter Weißbüschelaffe (G 8212). TEM, GV: X10000.
Eigene Untersuchungen 87
Abbildung 39: Clara-Zelle in einem terminalen Bronchiolus bei einem adulten
Weißbüschelaffen (G 8210). Apikal und perinukleär befinden sich elektronendichte Granula
(durchgezogene Pfeile). Die Zelle besitzt einen ovalen Kern (NU). Das Zytoplasma (ZY) ist
etwas elektronendichter als bei den zilierten Zellen und ist reich an rauem
endoplasmatischem Retikulum (RER). Außerdem sind große Mitochondrien vom Crista-T
yp (MI) und viele pinozytotische Vesikel (gepunktete Pfeile) zu finden. Weiterhin sind auf
der Oberfläche der Clara-Zelle zytoplasmatische Protrusionen (ZP), die in das Lumen (L)
hineinragen, zu sehen. TEM, EV: X6300.
88 Eigene Untersuchungen
Abbildung 40: Nicht-zilierte Clara-Zellen umgeben von zilierten Zellen im
Rasterelektronenmikroskop (REM). Bemerkenswert ist die unregelmäßige Oberfläche der
Clara-Zellen in einem Segmentbronchus bei einem adulten Weißbüschelaffen (G 8109).
REM, GV: X7800.
Eigene Untersuchungen 89
Abbildung 41: „Apical cap“ einer Clara-Zelle mit zahlreichen Mikroporen (Pfeile) im
Rasterelektronenmikroskop bei einem adulten Weißbüschelaffen (G 8210). REM, GV:
X24750. *
90 Diskussion
4 DISKUSSION
Asthma und COPD zählen zu den häufigsten chronischen Atemwegserkrankungen des
Menschen in Deutschland und der Welt (AMBROSINO u. PAGGIARO 2012). Das
Bundesministerium für Bildung und Forschung schätzt, dass etwa vier Millionen Deutsche
an einer COPD leiden. Um dieser konstant zunehmenden Problematik der chronischen
Atemwegserkrankungen zu begegnen, werden neue Modelle gesucht und entwickelt
(AMBROSINO u. PAGGIARO 2012). Zu den neusten Tiermodellen in der Forschung über
respiratorische Erkrankungen zählen Weißbüschelaffen. Vor einigen Jahren verfassten
PLOPPER und HYDE (2008) ein Review im Zusammenhang mit der Benutzung des
„epithelial-mesenchymalen trophic unit“ (EMTU)-Konzepts und postulierten, dass nicht-
menschliche Primaten ein geeignetes Modell für das Verständnis der Mechanismen von
Asthma und COPD beim Menschen darstellen. Außerdem evaluierte GREENOUGH et al.
(2005) den Weißbüschelaffen als potenzielles Modell für humane Atemwegserkrankungen
wie zum Beispiel dem Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS). Voraussetzung für die
Etablierung von Weißbüschelaffen als nicht-menschliches Primatenmodell für
respiratorische Erkrankungen des Menschen sind umfassende Kenntnisse zur Morphologie
und Physiologie der Lungen bei dieser Spezies. Ziel der vorliegenden Arbeit war die
Darstellung der Lungen-Anatomie bei Weißbüschelaffen auf makroskopischer,
histologischer und elektronenmikroskopischer Ebene sowie die Verteilung der nicht-
zilierten Zellen in der Lunge bei unterschiedlichen Altersgruppen und, damit einhergehend,
die Charakterisierung artspezifischer Besonderheiten bei dieser nicht-menschlichen
Primatenspezies. Eine detaillierte Beschreibung der nicht-zilierten Zellen im
respiratorischen Epithel der intrapulmonalen Atemwege liefert Referenzdaten für weitere
tierexperimentelle Arbeiten hinsichtlich der Physiologie und Pathologie des
Respirationstrakts. Gegenstand der Untersuchungen in der vorliegenden Arbeit waren
insgesamt 37 Tiere unterschiedlicher Altersstufen, die alle als klinisch gesund gewertet
wurden. Darüber hinaus wurden bei 20 Tieren aus allen Altersgruppen (s. Anhang, Tabelle
15) statistische Untersuchungen zur Verteilung von nicht-zilierten Zellen in der Lunge
durchgeführt.
Diskussion 91
In der vorhandenen Literatur gibt es nur wenige Daten zur topographischen Anatomie der
Lungen bei Weißbüschelaffen. Die hier dargestellten Ergebnisse stellen eine detaillierte
Beschreibung der Lungen und deren anatomischer Besonderheiten dar. Im Vergleich zu
anderen Labortieren ist die Lunge von Weißbüschelaffen hinsichtlich ihrer Größe sehr gut
vergleichbar mit der Lunge einer Ratte (HEBEL 1976). Die erste Beschreibung der Lungen
von Weißbüschelaffen wurde von SURRIBAS und LAWZEWITSCH (1987) veröffentlicht,
die die Länge der Lunge von einem adulten Tier, gemessen von der oberen Kante des oberen
Lappens, bis zur unteren Kante des unteren Lappens, mit 3,5 cm beziffern. Die Ergebnisse
der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Länge der Lunge für neugeborene Tiere 1,5 - 1,7
cm, für juvenile Tiere 2,0 - 2,4 cm und für adulte 3,5 - 7,5 cm beträgt. Die beiden Lungen
eines adulten Tieres wiegen zusammen ca. 2,1 bis 2,6 g, was einem relativen Lungengewicht
bei Weißbüschelaffen von etwa 4,5 % entspricht. Beim Menschen ist die Lunge in Relation
zum metabolischen Körpergewicht etwas kleiner als beim Weißbüschelaffen (3,3 vs. 4,5 %)
(MOLL u. MOLL 2005).
Die Lungen von nicht-menschlichen Primaten unterscheiden sich von denen des Menschen
hauptsächlich hinsichtlich der Anzahl der Lungenlappen. Menschen haben drei Lappen auf
der rechten Seite und zwei auf der linken, die jeweils eng mit einander verbunden sind
(PLOPPER 2005). SURRIBAS und LAWZEWITSCH (1987) und FOERSTER (1988)
beschreiben die Lungenlappung bei Weißbüschelaffen, wonach vier Lappen inklusive des
Lobus accessorius auf der rechten Seite und zwei Lappen auf der linken Seite vorhanden
sind. FOERSTER (1988) erwähnt zusätzlich, dass auf dem oberen linken Lappen eine
Einkerbung zu finden ist. In Ergänzung der Ergebnisse von FOERSTER (1988) konnte in
dieser Arbeit festgestellt werden, dass solche Einkerbungen auf beiden kranialen Lappen,
sowohl links als auch rechts, bei Weißbüschelaffen vorhanden sind. Hinweise auf ähnliche
Einkerbungen bei anderen Spezies konnten in der Literatur nicht gefunden werden.
Die sechslappige Aufteilung der Lungen wurde nicht nur bei Weißbüschelaffen
nachgewiesen. Sie trifft auch bei Spezies wie Gorilla (NAKAKUKI 1992), Rhesusaffe
(PLOPPER 2005), Ratte, Maus und Schwein (H. KÖNIG u. LIEBICH 2008) zu.
NAKAKUKI (1991, 1992) beschreibt die Unterschiede bzw. Ähnlichkeiten in der
92 Diskussion
Lungenlappung bei Menschenaffen, und legt dar, dass der sechs-lappige Aufbau bei
Menschenaffen durchaus nicht immer üblich ist. So besteht die rechte Lunge von Orang-
Utans und Schimpansen aus Ober-, Mittel- und Unterlappen, was sich mit der Aufteilung
beim Menschen deckt. Akzessorische Lungenlappen fehlen. Die linke Lunge ist in zwei
Lungenlappen (Mittel- und Unterlappen) unterteilt. Es fehlen bei beiden Spezies die
Oberlappen auf der linken Seite. Außerdem bilden die Lungenlappen von Orang-Utans auf
beiden Seiten jeweils einen Lungenflügel. Im Gegensatz dazu sind die Lungenlappen bei
Schimpansen jeweils durch Lungenfissuren voneinander getrennt, was in den im Rahmen
dieser Arbeit erfolgten Untersuchungen ebenso bei Weißbüschelaffen nachgewiesen wurde.
Bei Gorillas hingegen besteht die rechte Lunge aus vier Lungenlappen (Ober-, Mittel-,
Unter- und Akzessorische Lappen). Die linke Lunge besteht ebenso wie bei Orang-Utans
und Schimpansen aus zwei Lungenlappen: Mittel- und Unterlappen. Alle Lungenlappen bei
Gorillas sind mit Lungenfissuren voneinander getrennt, ebenso wie bei Weißbüschelaffen
(NAKAKUKI 1992).
Nach MARIASSY (1992), MERCER et al. (1987), MCBRIDE (1992), und PLOPPER und
HYDE (1992) ist das Aufzweigungsprinzip bei nicht-menschlichen Primaten dichotomisch
und trichotomisch. Beim Menschen ist es allerdings nur dichotomisch (LARSEN u.
ZIEGENFUSS 2009), und das steht im Gegensatz zu Labornagern wie Maus und Ratte, die
eine monopodiale Verzweigung aufweisen (PLOPPER 2005). Um das Aufzweigungsprinzip
bei Weißbüschelaffen zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit außer der allgemeinen
makroskopischen Beurteilung und Beschreibung der Lunge zusätzlich eine
Korrosionstechnik durchgeführt, um Ausgusspräparate des Bronchialbaums zu erhalten. Mit
Hilfe der so entstandenen Präparate und der an diesen durchgeführten CT-Scans war es
möglich, das Bronchialsystem bei Weißbüschelaffen unterschiedlicher Altersstufen zu
charakterisieren. Diese Methode hat durchaus schon eine gewisse Vorgeschichte in der
Forschung an Weißbüschelaffen. Eine der ersten Plastoidfüllungen der Lunge eines
neugeborenen Weißbüschelaffen wurde von FOERSTER (1988) hergestellt. Er konnte
zeigen, dass das Aufzweigungsprinzip des Bronchialbaumes dichotomisch ist. Auf der Basis
unserer Ausgusspräparate konnte ebenfalls ein dichotomisches Aufzweigungsprinzip des
Bronchialsystems bei Weißbüschelaffen festgestellt und die Ergebnisse von FOERSTER
Diskussion 93
(1988) somit bestätigt werden. Darüber hinaus konnten Kenntnisse des
Bronchialbaumsystems, seines Aufzweigungsprinzips, des Durchmessers jedes einzelnen
Segments und der Distanz von der Bifurkation in distaler Richtung gewonnen werden, die
wichtige Informationen für tierexperimentelle Arbeiten mit Weißbüschelaffen darstellen, u.
a. für bronchoskopische Untersuchungsmethoden.
Daten zum Durchmesser der Bronchien und zu der Distanz vom Bifurkationsbereich sind für
klinische, bildgebende Untersuchungsmethoden, wie Bronchoskopie und Radiographie
relevant. Insbesondere wird die Auswahl der Instrumente erleichtert, wenn luminale
Durchmesser des Bronchialbaums bekannt sind. Ein weiteres wichtiges Hilfsmittel ist die
Nomenklatur des Bronchialsystems, denn sie dient vor allem dazu, pathologische
Veränderungen topographisch genauer einzuordnen. Dies erleichtert die Identifizierung der
präzisen Lokalisation pathologischer Lungenbefunde im Tiermodell. Die erste und bis heute
die einzige Untersuchung der Aufzweigung des Bronchialsystems bei Weißbüschelaffen
wurde von FOERSTER (1988) durchgeführt. Er konnte anhand des Ausgusspräparats eines
neugeborenen Tieres alle beim Menschen bekannten 10 Segmentbronchien finden. Unsere
Untersuchungen bezogen Tiere unterschiedlicher Altersgruppen (neugeboren, juvenil, adult)
ein, was die Überprüfung von Unterschieden zwischen den Altersgruppen ermöglichte. Die
Ausgusspräparate zeigten zum einen die dichotomische Aufteilung der Bronchien, was die
Weißbüschelaffen als gemeinsames Merkmal mit dem Menschen teilen, und zum anderen
auch die im Vergleich zum Menschen fehlenden und zusätzlichen Bronchien bei
Weißbüschelaffen. Der beim Menschen oft fehlende, auf der linken Seite der Lunge
liegende, Segmentbronchus (B VII) Bronchus segmentalis basalis medialis kommt bei
Weißbüschelaffen aller Altersgruppen auf der linken und rechten Seite immer vor. Auf der
linken Seite befinden sich der Bronchus segmentalis superior (B VI), der Bronchus
segmentalis basalis medialis (B VII) und der Bronchus segmentalis basalis anterior (B VIII)
auf der gleichen Höhe. Beim Menschen liegt der Bronchus segmentalis superior (B VI)
immer näher an die Bifurkation. Außerdem besitzen die Weißbüschelaffen einen Bronchus
lobaris accessorius, der den Lobus accessorius belüftet. Dieser Bronchus wurde von
FOERSTER (1988) nicht beschrieben. Er beschreibt auch nicht die anderen Lobarbronchien,
sondern nur die Segmentbronchien. Mit dieser Arbeit wurde damit erstmals ein vollständiger
Überblick über die Topographie des Bronchialbaums der Weißbüschelaffenlunge gegeben.
94 Diskussion
In der vorhandenen Literatur werden keine Angaben zum Durchmesser der Bronchien und
deren Abstand von der Bifurkation bei Weißbüschelaffen gemacht. Um diese Fragestellung
zu klären, benutzten wir eine CT-basierte Methode, die von (SCHMIDT u. KUHNIGK
2010) bei menschlichen Lungen etabliert wurde. Die sich anschließende Datenauswertung
mit Hilfe spezieller MeVisLab-basierter Bildanalyseverfahren (www.mevislab.de;
Fraunhofer MEVIS, Bremen) ergab Werte bezüglich des Durchmessers von Trachea, beider
Hauptbronchien, aller Lobarbronchien und Segmentbronchien. Ebenso wurde die Distanz
von der Bifurkation bis zum Anfang jedes Lobar- und Segmentbronchus bei einem
neugeborenen, juvenilen und adulten Weißbüschelaffen bestimmt. Aus der Untersuchung
von MOURISSOUX et al. (2010) ist bekannt, dass die Durchmesser von Bronchien von
Patienten mit hochgradiger COPD-Diagnose größer sind als von Patienten mit
geringgradiger COPD. Durch die wachsende Beliebtheit von Weißbüschelaffen als
Versuchstiermodell auf dem Gebiet der Lungenforschung können Daten über Größen- und
Längenverhältnisse des Bronchialbaumes im Labortier die Exploration von Ergebnissen auf
den Menschen erleichtern und dazu beitragen, methodische Ansätze in der Anaestesiologie
und Notfallmedizinforschung, z. B. bei der Auswahl von passenden Endotrachealtuben, zu
entwickeln (SCHMIDT u. KUHNIGK 2010).
Abschließend ist zum makroskopischen Teil zu sagen, dass trotz einiger Unterschiede in der
Lappung und Segmentierung des Bronchialbaums die Weißbüschelaffen in vielen anderen
morphologischen Aspekten weitgehende Übereinstimmung mit der menschlichen Lunge
zeigen.
Mit Hilfe histologischer Methoden wurden Trachea, Hauptbronchus und die
intrapulmonalen Atemwege untersucht und deskriptiv beschrieben. Histologisch zeigte sich,
dass die Trachea von zwei verschiedenen Formen von Epithel ausgekleidet ist. Dabei fiel
auf, dass die Pars cartilaginea, der größte ventrale Teil der Trachea, im Gegensatz zur Pars
membranacea, überwiegend von nicht-zilierten Zellen überzogen war. Dies steht im
Gegensatz zu den Beobachtungen bei anderen Tierarten (PLOPPER 2005; LIEBICH 2009),
und beim Menschen (PLOPPER 2005), die in der Trachea eine homogene Verteilung von
ziliertem respiratorischen Epithel aufweisen, und stellt möglicherweise eine
tierartspezifische physiologische Besonderheit bei Weißbüschelaffen dar.
Diskussion 95
Es wurde in der Trachea eine große Anzahl von Clara-Zellen gefunden, insbesondere in der
Pars membranacea. PLOPPER (2005) hat in der Trachea von Rhesusaffen und Menschen
nur sehr wenige Clara-Zellen festgestellt, dafür sehr viele bei Ratten und Mäusen. Laut
HARKEMA et al. (1991) sind bei Kaninchen ebenfalls eine große Anzahl von Clara-Zellen
in der Trachea vorhanden.
Der sehr geringe Anteil an Becherzellen in der Trachea von Weißbüschelaffen entspricht
den von PLOPPER (2005) gemachten Angaben bei Ratte und Maus eher als den
Verhältnissen bei Menschen oder Rhesusaffen.
PNEZ wurden beim Weißbüschelaffen in der Trachea und den Hauptbronchien nur
vereinzelt gefunden, was mit Ergebnissen bei anderen Tierarten übereinstimmt (HARKEMA
et al. 1991). NEBs wurden in der Trachea und den Hauptbronchien nicht gefunden, was
ebenfalls die Ergebnisse in der Literatur bestätigt (LAUWERYNS et al. 1972; CUTZ 1982).
Bei der Wahl eines Versuchstiermodells steht häufig die Frage im Raum, ob die
immunhistochemischen Methoden beim Tier funktionieren und die erwartete
Proteinexpression mit dem gewünschten Ergebnis korreliert werden kann. Heutzutage
existieren nur einige wenige Antikörper, die spezifisch für Weißbüschelaffen entwickelt
wurden. Allerdings funktionieren aufgrund der phylogenetischen Nähe zwischen dem
Weißbüschelaffen und dem Menschen viele poly- und monoklonale Antikörper bei
Weißbüschelaffen genau so gut wie beim Menschen (MANSFIELD 2003). In dieser Arbeit
wurden die Antikörper CCSP, MUC5AC, NSE, MAC387, Surfactant-Protein B, Surfactant-
Protein C und CD3 und CD20 (auch als Doppelmarkierung) verwendet, die teilweise im
eigenen Labor für diese Arbeit zunächst für den Weißbüschelaffen etabliert werden mussten.
Mittels des CCSP-Antikörpers konnte die Clara-Zellpopulation detektiert werden, die im
gesamten respiratorischen Epithel der Lungen nachgewiesen werden konnte. Zu diesem
Zelltyp bei Weißbüschelaffen gibt es bis heute keine veröffentlichten Untersuchungen. Wie
schon von PLOPPER et al. (1980b; 1983) berichtet wurde, weisen die Clara-Zellen bei
unterschiedlichen Tierarten eine variable Morphologie auf. In früheren Publikationen wurde
berichtet, dass die Clara-Zellen bei Menschen ausschließlich in den terminalen Bronchiolen
vorkommen (BOERS et al. 1999; RYERSE et al. 2001). Dagegen bestätigen neuere
Untersuchungen das Vorhandensein von CCSP-positiven Zellen auch in den
96 Diskussion
Hauptbronchien und Trachea. Bei Ratten-Lungen benutzten SINGH et al. (1997) einen
CCSP-Antikörper, um Clara-Zellen in den Bronchien und Bronchiolen zu detektieren. Bei
nicht-menschlichen Primaten, z. B. bei Rhesusaffen, kommen die Clara-Zellen in der
Trachea und in den Haupt-, Lobar- und Segmentbronchien vor (COPPENS et al. 2007).
Diese Verteilung von Clara-Zellen ist bei Weißbüschelaffen und Rhesusaffen sehr ähnlich.
Ein interessanter Aspekt zur Verteilung der CCSP-positiver Zellen bei Rhesusaffen wurde
von COPPENS et al. (2007) veröffentlicht. Die Autoren stellten eine besonders große
Menge der CCSP-Expression an den Verzweigungen der Bronchien fest. Diese konnte bei
Weißbüschelaffen in dieser Arbeit nicht beobachtet werden.
Darüber hinaus zeigten die Untersuchungen von COPPENS et al. (2007), dass CCSP zum
Teil mit Muzinen im Zytoplasma kolokalisiert ist. Zu ähnlichen Ergebnissen kommen auch
BOERS et al. (1999) und SINGH und KATYAL (1997) in Bezug auf den Menschen. Im
Rahmen dieser Arbeit wurden keine Doppelmarkierungen hinsichtlich der Kolokalisation
der Clara-Zellproteine und Muzine durchgeführt, und daher kann nur vermutet werden, dass
bei Weißbüschelaffen die Clara-Zellen auch Muzine enthalten.
Zur Verteilung der Clara-Zellen im humanen gesunden respiratorischen Epithel liegen nur
wenige Untersuchungen vor. BOERS et al. (1999) untersuchten die Clara-Zellen bei
erwachsenen Menschen mittels einer statistischen Methode, die der in der vorliegenden
Arbeit sehr ähnlich ist. BOERS et al. (1999) haben Clara-Zellen in Bronchien, großen
Bronchiolen, terminalen und respiratorischen Bronchiolen bezogen auf die Gesamtzahl der
Epithelzellen in den jeweiligen Lokalisationen gezählt, wobei die Zahl der gezählten
Epithelzellen zwischen 400 und 450 lag. In den hier dargestellten Untersuchungen wurden
die Strecken auf exakt 500 Epithelzellen pro Lokalisation standardisiert. Durch die große
Grundgesamtzahl an Zellen war mit einer zuverlässigen Statistik zu rechnen. Die
prozentualen Mittelwerte der Anteile von Clara-Zellen an der Gesamtzahl der Epithelzellen
im Bronchus wurden von BOERS et al. (1999) mit 0 % angegeben, d. h. innerhalb dieser
Untersuchung wurden gar keine Clara-zellen gefunden. Im Gegensatz dazu zeigten unsere
Ergebnisse durchschnittlich 25 % Clara-Zellen im Bronchus bei Weißbüschelaffen. Diese
Diskrepanz ließe sich dadurch erklären, dass die Clara-Zellen beim Weißbüschelaffen
Diskussion 97
möglicherweise einen Teil der Schleimproduktion übernehmen, um das weitgehende Fehlen
von Becherzellen zu kompensieren.
BOERS et al. (1999) unterschieden im bronchiolären Bereich zwischen großen, terminalen
und respiratorischen Bronchiolen. In dieser Arbeit wurden dagegen nur die Zellen von
großen und terminalen Bronchiolen zusammengefasst gezählt. Daher können die Ergebnisse
von BOERS et al. (1999) auch nur unter Berücksichtig dieser Lokalisation (Bronchiolus)
verglichen werden. Laut BOERS et al. (1999) ergaben die Mittelwerte von Clara-Zellen in
großen Bronchiolen und terminalen Bronchiolen zusammen nur 5,7 %. In dieser Arbeit war
der Anteil mit 19 % wieder wesentlich höher. Hinsichtlich der Verteilung der Clara-Zellen
bei juvenilen Weißbüschelaffen betrug der Anteil im Bronchus und im Bronchiolus 27 %. In
der vorhandenen Literatur gibt es keine weiteren Veröffentlichungen mit gleichartiger
quantitativer Auswertung, um unsere Ergebnisse vergleichen zu können. Neugeborene
Tieren zeigten insgesamt etwas weniger Clara-Zellen als adulte und juvenile Tiere – im
Bronchus nur 16 % und im Bronchiolus nur 17 %. Ein Grund dafür könnte sein, dass die
Clara-Zellen sich erst im Laufe der Entwicklung aus Vorläuferzellen vollständig
differenzieren. Es gibt nur eine Arbeit von XU et al. (1998), die unter anderem auch die
Verteilung und Häufigkeit von Clara-Zellen in menschlichen Föten und Neugeborenen
beschreibt. Leider sind die Ergebnisse kaum vergleichbar, da Föten und Neugeborene in der
vorliegenden Arbeit nicht systematisch unterschieden werden (XU et al. 1998).
Aufgrund der Tatsache, dass Clara-Zellen Surfactant-Proteine sezernieren können, wird
ihnen eine wichtige protektive Rolle zugeordnet (PLOPPER 1996). Unsere Untersuchungen
konnten bestätigen, dass Clara-Zellen Surfactant-Proteine bilden können. Die
immunhistochemische Färbung mit einem Antikörper gegen das Surfactant-Protein B zeigte,
dass Surfactant-Protein B von Clara-Zellen vom Bronchus bis in die distalen Bronchiolen
sezerniert wird. Dagegen trat eine Surfactant-Protein C-Expression durch Clara-Zellen in
den Bronchien seltener auf als in bronchiolären Bereichen, wo zahlreiche nicht-zilierte
Zellen Surfactant-Protein C exprimierten. Es ist möglich, dass die Clara-Zellen in distalen
Bereichen lamelläre Körperchen haben, die für die Produktion von Surfactant-Protein C
verantwortlich sind, so wie es beim Menschen vermutet wird (WAUER 2004).
98 Diskussion
Aufgrund der bekannten Funktionen der Clara-Zellen wie die Bildung von CCSP, das
beteiligt ist bei Regeneration, mukoziliärer Clearance und Regulation von
Entzündungsprozessen, sowie die Bildung von Surfactant-Proteinen, spielt die Verteilung
der Clara-Zellen eine große Rolle, wenn man diese funktionellen Mechanismen in der Lunge
genauer lokalisieren bzw. die Lunge als Gesamtsystem verstehen möchte (REYNOLDS u.
MALKINSON 2009). Da bei Weißbüschelaffen die dominierende Clara-Zellpopulation in
den gesunden Lungen im gesamten respiratorischen Epithel von der Trachea bis in die
respiratorischen Bronchiolen vorkommt, ist anzunehmen, dass die Lunge der
Weißbüschelaffen schon in den oberen Atemwegen eine zusätzliche Schutzfunktion besitzt.
Das Vorhandensein von Clara-Zellen im gesamten respiratorischen Epithel ermöglicht eine
flächendeckende Sekretion von CCSP und Surfactant-Proteinen und damit eine
Bereitstellung der damit einhergehenden Schutz- und immunmodulierenden Funktionen. Die
genaue Funktion der Clara-Zelle und deren Einfluss auf die Zusammensetzung des
Oberflächenfilmes im respiratorischen Epithel muss in der Zukunft noch detaillierter
untersucht werden, z. B. durch zytochemische Analysen.
Die am zweithäufigsten auftretende nicht-zilierte Zelle im respiratorischen Epithel bei
Weißbüschelaffen war die Becherzelle. Mit den in dieser Arbeit verwendeten histologischen
und immunhistochemischen Färbungen (PAS-Reaktion, Alcian blau 8 GS und MUC5AC)
konnten bei allen Altersgruppen nur wenige Zellen gefunden werden, die der
Becherzellmorphologie entsprachen. Da die Intensität aller Färbungen insgesamt sehr
schwach war, war eine eindeutige Identifizierung einer Zelle als Becherzelle nur in seltenen
Fällen möglich. Dies bildet einen Gegensatz zu der Situation bei Menschen und anderen
nicht-menschlichen Primaten (z. B. Rhesusaffen), bei denen die Becherzellmorphologie
immer deutlich zu erkennen ist (PLOPPER 1996; ROGERS 2003).
Die Becherzellen im respiratorischen Epithel bei Weißbüschelaffen wurden im Hinblick auf
ihre Verteilung im gesamten Atmungstrakt erstmals von SURRIBAS und LAWZEWITSCH
(1987) beschrieben. Im Vergleich zu einigen anderen Tierarten und dem Menschen sind die
Becherzellen in deutlich geringerer Anzahl nachweisbar, wobei die mit den Färbungen
nachweisbaren Mukopolysaccharide nur in den apikalen Bereichen der Zellen zu beobachten
Diskussion 99
waren. Diese Tatsache konnte in den hier dargestellten Untersuchungen bestätigt werden.
Mit Hilfe der histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen wurde
nachgewiesen, dass die Becherzellen im gesamten respiratorischen Epithel in der Lunge in
geringer Anzahl vorkommen, wobei sie überwiegend in den proximalen Anteilen des
Bronchialbaums anzutreffen sind.
Im Anschluss an diese ersten Untersuchungen konnten wir feststellen, dass MUC5AC der
beste Marker für Muzin enthaltende Becherzellen war. Mittels alternativer histologischer
Färbungen, der PAS-Reaktion und der Alcian blau 8 GS, wurden nur sehr schwache und oft
fragliche positive Signale im respiratorischen Epithel der intrapulmonalen Atemwege bei
Weißbüschelaffen festgestellt. Bei neugeborenen Tieren handelte es sich bei vielen der PAS-
positiven Signale aufgrund der Lokalisation wahrscheinlich um glykogenreiche Basalzellen,
die eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen den Altersgruppen unmöglich gemacht
hätten. Daher wurden alle weiteren statistischen Untersuchungen nur unter Berücksichtigung
der MUC5AC positiven Zellen durchgeführt.
Die statistischen Untersuchungen ergaben, dass im Bronchus bei adulten und
neugeborenen Tieren nur 4 % MUC5AC positive Zellen vorhanden sind. Juvenile Tiere
zeigten mit 3 % etwas geringere Werte. Wie erwartet, zeigten sich im bronchiolären Bereich
noch weniger MUC5AC positive Zellen: bei adulten und neugeborenen Tieren waren es nur
1 %, bei den juvenilen Tieren waren sie mit 2 % etwas zahlreicher.
Die geringe Anzahl von Becherzellen bei Weißbüschelaffen könnte man durch das feuchte
Klima ihrer Heimat erklären. Möglicherweise machen die übrigen Funktionen der Clara-
Zellen die Weißbüschelaffen widerstandsfähiger und anpassungsfähiger, besonders in Bezug
auf das Klima. Es wäre interessant zu untersuchen, ob es bei vergleichbaren Spezies aus
diesem Lebensraum eine ähnliche Entwicklung zu beobachten gibt. Allerdings stellt diese
Arbeit die erste Untersuchung dieser Art bei Krallenaffen dar, daher fehlen bislang
Vergleichsdaten.
100 Diskussion
Bei erwachsenen Menschen gibt es im gesunden respiratorischen Epithel bis zu 25 %
Becherzellen (ROGERS 2003). Bei den anderen Altersgruppen wurden keine vergleichbaren
Daten gefunden.
Eine Besonderheit des respiratorischen Epithels im Bronchus bei Weißbüschelaffen ist das
Fehlen der seromukösen Bronchialdrüsen. Bei Menschen, Makaken und Kaninchen
existieren sie in den Bronchien. Bei vielen Tierarten, auch bei Rhesusaffen, übernehmen
Becherzellen in den distalen Bronchien, wo keine seromukösen Bronchialdrüsen
vorkommen, die Mukussekretion (ROGERS 1994). Bei Ratten, Hamstern und Mäusen
hingegen werden distal von der Trachea, wie bei Weißbüschelaffen, keine seromukösen
Bronchialdrüsen gefunden (PLOPPER 1996). Es ist möglich, dass die Rolle der
seromukösen Bronchialdrüsen ebenso wie die der Becherzellen durch die große Anzahl an
Clara-Zellen kompensiert wird mit den bereits diskutierten Folgen und Vorteilen.
Pulmonale neuroendokrine Zellen (PNEZ) sind im respiratorischen Epithel der
intrapulmonalen Atemwege bei Weißbüschelaffen aller Altersgruppen in geringer Anzahl
vertreten und sind die zahlenmäßig kleinste, nicht-zilierte Zellpopulation in diesem Bereich.
Gleiche Verhältnisse liegen bei den meisten Säugetieren, Reptilien, Amphibien, Vögel und
Fischen vor (SORHAUG 2007). Die PNEZ können einzeln sowie in Form von NEBs
vorkommen (CUTZ 1982). Mit Hilfe von immunhistochemischen Methoden konnten bei
Weißbüschelaffen die PNEZ in allen Regionen des Bronchialbaums bei allen Altersgruppen
nachgewiesen werden. Es ist bekannt, dass die von den PNEZ und NEBs produzierten
Peptide die Entzündungsreaktion bei chronischen Lungenerkrankung wie Asthma und
COPD modulieren können (SORHAUG 2007). Deswegen ist das breite Vorhandensein
dieser Zellen ein Indiz dafür, dass Entzündungsreaktionen in allen Bereichen des
Bronchialbaums und bei allen Altersgruppen erkannt und kontrolliert werden können.
Die Morphologie der Zellen war ähnlich wie bei anderen Säugetieren. Die meisten Zellen
waren rund bis oval und lagen basal. NEBs stehen häufig in Kontakt mit Nervenfasern.
Diese Tatsache wurde mit Hilfe des immunhistochemischen Markers NSE nachgewiesen. Es
wurde bislang in der Literatur berichtet, dass NEBs an den Verzweigungsstellen des
Diskussion 101
Bronchialbaums besonders häufig auftreten (SORHAUG 2007). In den hier dargestellten
Untersuchungen konnte das allerdings nicht beobachtet werden, was aber eine einfache
Konsequenz der Seltenheit des Zelltyps im Allgemeinen und der nicht exakt kontrollierbaren
Lokalisation der untersuchten Schnitte ist.
Hinsichtlich der Verteilung der PNEZ im Bronchus konnten bei Weißbüschelaffen aller
Altersgruppen in allen Lokalisationen bis zu 1 % PNEZ gefunden werden. Ausschließlich in
der Neugeborenen-Gruppe konnte man feststellen, dass die PNEZ im Bronchiolus
zunahmen, nämlich mit einem Anteil von bis zu 2 %. Die Ergebnisse von BOERS et al.
(1996), die nur die Lunge von erwachsenen Menschen untersucht haben, zeigen, dass der
Anteil von PNEZ im Bereich von 0,41 bis 0,17 % liegt. Allerdings wurde dabei ein anderer
Antikörper benutzt, nämlich Chromogranin A, bei dem es sich aber ebenfalls um einen
neuroendokrinen Zellmarker handelt. Es kann daher sein, dass aufgrund von leichten
Abweichungen in der Spezifität der Antikörper die Ergebnisse nicht ohne weiteres
vergleichbar sind.
Im Rahmen dieser Studie wurden die Basalzellen nur deskriptiv morphologisch
beschrieben. Sie konnten im ganzen respiratorischen Epithel der Lunge gefunden werden.
Sie hatten Kontakt mit allen anderen Epithelzellen, zilierte und nicht-zilierte Zellen
eingeschlossen. Bei neugeborenen Tieren wurden viele glykogenreiche Basalzellen
gefunden, die sich vermutlich mit fortschreitendem Alter und Wachstum abbauen.
Das Vorhandensein von ausgeprägten Knorpelanteilen in distalen Bereichen des
Bronchialbaums, also auch in den Bronchiolen, wurde bereits von SURRIBAS und
LAWZEWITSCH (1987) und FOERSTER (1988) erwähnt und konnte durch unsere
Untersuchungen bestätigt werden. Bei menschlichen Lungen werden Knorpelstrukturen nur
in Bronchien gefunden. Die Bronchiolen sind knorpelfrei. Es wird vermutet, dass bei
Menschen die Bindegewebssepten wesentlich stärker sind als bei Affen, und letztere daher
Knorpel zur Stützung des Lungengewebes benötigen (MCLAUGHLIN et al. 1961;
FOERSTER 1988).
102 Diskussion
Transmissionselektronenmikroskopisch wurden schwerpunktmäßig Clara-Zellen
untersucht. Es stellten sich nicht alle nicht-zilierte Zellen deutlich dar, insbesondere die
Becherzellen nicht. Es ist bekannt, dass die Clara-Zellen große spezies-abhängige
Unterschiede aufweisen (PLOPPER et al. 1980a). Aufgrund der charakteristischen
sekretorischen Granula konnte die überwiegende Clara-Zellpopulation ultrastrukturell gut
identifiziert werden. Nach PLOPPER et al. (1980a) haben unter den von ihnen untersuchten
Spezies Schafe die meisten Clara-Zellgranula (durchschnittlich 748 Granula pro Zelle),
gefolgt von Pferden (durchschnittlich 477 Granula pro Zelle) und Rindern (durchschnittlich
408 Granula pro Zelle) (PLOPPER et al. 1980c). Bei Labornagern variiert diese Zahl
ebenfalls stark: bei Ratten mit durchschnittlich 427 Granula pro Zelle, Mäusen mit
durchschnittlich 258 Granula pro Zelle und Meerschweinchen mit durchschnittlich 225
Granula pro Zelle (PLOPPER et al. 1980b). Katzen bilden eine Ausnahme, da deren Clara-
Zellen gar keine Granula besitzen (PLOPPER et al. 1980c). Die Ergebnisse dieser Arbeit
zeigen, dass Clara-Zellgranula bei Weißbüschelaffen deutlich weniger zahlreich vorhanden
waren mit Mengen von 2 bis 40 pro Zelle. Bei Menschen werden ebenfalls recht niedrige
Zahlen von 0 bis 17 Granula pro Clara-Zelle genannt (PLOPPER et al. 1980a), so dass hier
eine ähnliche Situation wie bei Weißbüschelaffen vorliegt. Die kleinsten Granula bei
Weißbüschelaffen maßen 100 nm und die größten 500 nm im Durchmesser. Laut PLOPPER
et al. (1980a) sind sie beim Menschen zwischen 110 und 880 nm groß, so dass hier ebenfalls
eine weitgehende Übereinstimmung vorliegt. Vergleichswerte zu anderen Affenspezies
liegen nicht vor.
In dieser Arbeit wurde bei allen Clara-Zellen diffus viel raues und sehr wenig glattes
endoplasmatisches Retikulum gefunden. Ein ähnliches Mengenverhältnis wird beim
Menschen und Rhesusaffen festgestellt (PLOPPER 1983). Einen Gegensatz dazu beschreibt
PLOPPER (1983) bei Maus, Hamster, Ratte, Meerschweinchen, Kaninchen, Schaf, Schwein
und Pferd. Hinsichtlich der zellulären Lokalisation wurde bei den hier dargestellten
Untersuchungen das raue und glatte endoplasmatische Retikulum gleichmäßig im
Zytoplasma verteilt gefunden, während PLOPPER (1983) bei Menschen und Rhesusaffen
abweichend davon apikal nur glattes und perinukleär nur raues festgestellt hat.
Diskussion 103
Bei Menschen wird der Golgi-Apparat luminal oder seitlich des Kerns beobachtet
(PLOPPER et al. 1980a). In dieser Arbeit wurde bei Weißbüschelaffen ebenso der Golgi-
Apparat häufig seitlich des Kerns nachgewiesen. Außerdem wurden in den apikalen
Bereichen des Zytoplasma viele pinozytotische Vesikel gefunden. Das diffuse Auftreten von
Glykogen im Zytoplasma steht im Einklang mit Untersuchungen von (PLOPPER 1983) bei
Rindern, Katzen, Hunden und Frettechen, allerdings füllt Glykogen bei diesen Tieren das
meiste Zytoplasma und ist wesentlich zahlreicher vorhanden als bei Weißbüschelaffen. Bei
Rhesusaffen und bei Menschen ist Glykogen ebenfalls nur selten vorhanden (PLOPPER
1983). Die hier beim Weißbüschelaffen gefundenen Mitochondrien waren elektronendicht
und vom Crista-Typ, was dem Typ entspricht, der auch bei Menschen und Rhesusaffen
vorliegt (PLOPPER 1983).
Die Ergebnisse der Rasterelektronenmikroskopie lieferten Informationen über die
kuppelartige luminale Oberfläche der Clara-Zellen. Die Oberfläche der Clara-Zellen wird
sowohl von zytoplasmatischen Protrusionen als auch von Mikrovilli bedeckt, kann aber auch
sehr glatt sein. Bei Menschen besitzen die Clara-Zellen auch Mikrovilli (LUMSDEN et al.
1984).
Den Sekretionsmodus von Clara-Zellen untersuchten PEAO et al. (1993) in der Rattenlunge.
Mit Hilfe von transmissions- und rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen
beschrieben sie die Phasen der Clara-Zell-Sekretion, und zwar den apokrinen und
merokrinen Sekretionsmodus. Sie konnten bestätigen, dass die „apical caps“ keine Artefakte
sind (PEAO et al. 1993). In dieser Studie bei Weißbüschelaffen konnte nur der apokrine
Sekretionsmodus bei den Clara-Zellen beobachtet werden. Eine neue Erkenntnis über die
Clara-Zellen aus rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen ist, dass die luminale
Oberfläche viele Mikroporen enthält. Es ist denkbar, dass die Clara-Zellen durch diese
Mikroporen einen zusätzlichen merokrinen Sekretionsmodus besitzen, indem sie durch die
Mikroporen ihre Sekrete abgeben. Jedenfalls bleibt die Funktion dieser Mikroporen noch
unklar. Zu diesem Aspekt liegen bislang keine Informationen in der Literatur vor.
Abschließend kann gesagt werden, dass die Resultate der licht- und
elektronenmikroskopischen Untersuchungen des respiratorischen Epithels der
intrapulmonalen Atemwege bei Weißbüschelaffen starke Ähnlichkeiten zeigen mit den
104 Diskussion
Gegebenheiten bei anderen Labortieren und dem Menschen. Zusammenzufassend kann man
also feststellen, dass die Struktur des Bronchialbaums ein dichotomes Verzweigungsmuster
hatte und weitgehend mit der des menschlichen Bronchialbaums übereinstimmte. Allerdings
gab es in der Lungenlappung einige morphologische Unterschiede zwischen Menschen und
Weißbüschelaffen. Die Verteilung der nicht-zilierten Zellen in Bezug auf unterschiedliche
Altersstufen wies keine deutlichen Unterschiede auf. Eine tierartliche Besonderheit bei
Weißbüschelaffen war jedoch die Clara-Zellpopulation, die in hoher Anzahl in allen
Bereichen des respiratorischen Epithels der intrapulmonalen Atemwege auftrat. Die
Becherzellpopulation erschien bei allen Altersgruppen in bronchialen Lokalisationen
weniger prominent als bei anderen Tierarten bzw. dem Menschen. Es ist bekannt, dass die
Hyperplasie der Becherzellen bei Asthma und anderen chronischen Atemwegserkrankungen
ein charakteristisches Zeichen bei der Diagnosestellung ist (PLOPPER u. HYDE 2008).
Wenn man Weißbüschelaffen als Versuchstiermodell für diese Krankheiten verwenden
möchte, sollte man berücksichtigen, dass die Verteilung der nicht-zilierten Clara- und
Becherzellen bei gesunden Weißbüschelaffen und Menschen unterschiedlich sein kann.
Aufgrund dessen sind weitere Untersuchungen zur Verteilung der nicht-zilierten Zellen im
pathologisch veränderten Bronchialepithel nötig. Nur die PNEZ stellten sich charakteristisch
hinsichtlich Morphologie und Verteilung bei Weißbüschelaffen aller Altersstufen dar.
Man kann also festhalten, dass es einige Unterschiede sowohl im Allgemeinen als auch im
Detail gibt zwischen den Lungen von Weißbüschelaffen und Menschen. Im Hinblick auf
eine mögliche Verwendung des Weißbüschelaffen als Tiermodell für Lungenerkrankungen
wie Asthma und COPD scheinen die Ähnlichkeiten jedoch zu überwiegen.
Zusammenfassung 105
5 ZUSAMMENFASSUNG
Victoria Seidel (2012)
Morphologische Untersuchungen an den Atemwegen von Weißbüschelaffen (Callithrix
jacchus) unter besonderer Berücksichtigung von Clara-Zellen.
Im Rahmen der vorliegenden Studie wurden morphologische Untersuchungen an der Lunge
bei Weißbüschelaffen durchgeführt. Es wurden 37 klinisch gesunde Lungen mittels
makroskopischer, histologischer, immunhistochemischer sowie elektronenmikroskopischer
Methoden untersucht. Alle Tiere wurden in eine von 3 Untersuchungsgruppen eingeteilt:
adulte, juvenile und neugeborene Tiere. Aufgrund der Tatsache, dass die nicht-zilierten
Zellen eine wichtige Rolle bei chronischen Atemwegserkrankungen wie Asthma und COPD
spielen, lag der Schwerpunkt dieser Studie auf den nicht-zilierten Zellen in den
intrapulmonalen Atemwegen bei Weißbüschelaffen mit Schwerpunkt bei den Clara-Zellen.
In dieser Arbeit wurde zunächst eine allgemeine makroskopische Beschreibung der Lungen
inklusive Gewicht und Größe bei neugeborenen, juvenilen und adulten Weißbüschelaffen
vorgenommen. Die Lungen von Weißbüschelaffen bestehen aus sechs eigenständigen
Lappen: vier auf der rechten und zwei auf der linken Seite. Bei beiden kranialen
Lungenlappen wurde jeweils eine Einkerbung festgestellt. Die Morphologie des
Bronchialbaumes war bei allen Altersgruppen grundsätzlich ähnlich. Mit Hilfe von
Ausgusspräparaten und nachfolgenden CT-Scans und deren Auswertung mit speziellen
MeVisLab-basierten Bildanalyseverfahren des Fraunhofer Instituts MEVIS in Bremen
konnten die dichotome Verzweigung des Bronchialbaums, die topographischen Verhältnisse
zwischen den einzelnen Bronchien, der Durchmesser der Ausgüsse der Bronchien sowie die
Distanz von der Bifurkation nach distal gezeigt werden. Bei dem Ausgusspräparat von
einem adulten Tier maß der Durchmesser der Trachea ca. 1000 bis 1150 µm, des rechten
Hauptbronchus ca. 850 bis 1150 µm und des linken 600 bis 800 µm, der Durchmesser der
Lobarbronchien von 450 bis 650 µm und der Segmentbronchien zwischen 250 und 550 µm.
Bei dem Ausgusspräparat von einem juvenilen Tier betrug der Durchmesser der Trachea
1000 bis 1150 µm, des rechten Hauptbronchus ca. 800 bis 1050 µm, des linken 650 bis 800
µm, der Lobarbronchien von 350 bis 650 µm und der Segmentbronchien zwischen 250 und
106 Zusammenfassung
500 µm. Bei dem Ausgusspräparat von einem neugeborenen Tier betrug der Durchmesser
der Trachea 700 bis 800 µm, bei rechten und linken Hauptbronchien 500 bis 650 µm, bei
den Lobarbronchien von 250 bis 500 µm und bei den Segmentbronchien zwischen 100 und
300 µm.
Hinsichtlich der Verteilung der nicht-zilierten Zellen konnten die größten Unterschiede in
der dominierenden Clara-Zellpopulation festgestellt werden. Clara-Zellen bei
Weißbüschelaffen kamen im gesamten respiratorischen Epithel der intrapulmonalen
Atemwege vor. Sie sezernierten hauptsächlich CCSP, aber auch die Surfactant-Proteine B
und C. Die mit immunhistochemischen Methoden erzielten Ergebnisse bezüglich CCSP-
positiver Zellen wurden statistisch ausgewertet. Im Bereich des Bronchus erreichten sie von
allen Epithelzellen einen Anteil von 25 % bei adulten Tieren, 27 % bei juvenilen und 16 %
bei neugeborenen Tieren. Im Bereich des Bronchiolus lag der Anteil der Clara-Zellen an der
Gesamtheit von allen Epithelzellen bei adulten Tieren bei 19 %, bei juvenilen bei 27% und
bei neugeborenen bei 17 %. Ultrastrukturell waren der typische apokrine Sekretionstyp
sowie die charakteristischen elektronendichten Granula unterschiedlichen Durchmessers
nachweisbar. Rasterelektronenmikroskopisch konnten auf der Oberfläche Mikrovilli sowie
Mikroporen erkannt werden.
Schleimproduzierende Becherzellen kamen bei Weißbüschelaffen viel seltener als bei
anderen Spezies vor. Außerdem wiesen sie keine deutliche Becherzellmorphologie auf. Mit
Hilfe der histologischen Färbung Alcian Blau konnte nur in einzelnen Becherzellen ein
Nachweis von sauren Mukopolysacchariden erbracht werden. Die PAS-Reaktion stellte
neutrale und saure Mukopolysaccharide in Becherzellen dar. Zusätzlich konnten
Glykogengranula in Basalzellen nachgewiesen werden, besonders bei neugeborenen Tieren.
Die immunhistochemische Färbung mit einem Antikörper gegen MUC5AC konnte die
Becherzellen am zuverlässigsten darstellen. Statistisch wurde gezeigt, dass MUC5AC-
positive Becherzellen im Bereich des Bronchus bei adulten und neugeborenen 4 % der
gesamten Epithelzellen ausmachten, und bei juvenilen etwa 3 %. Im bronchiolären Bereich
waren kaum MUC5AC-positive Zellen vorhanden. Neuroendokrine Zellen bei
Weißbüschelaffen kamen erst in den Segmentbronchien vor, wo sie bei allen Altersgruppen
konstant einen Anteil von 1 % hatten. Bei adulten und juvenilen Tieren nahm der Anteil der
Zusammenfassung 107
neuroendokrinen Zellen in den Bronchiolen auf 2 % zu, bei neugeborenen blieb der Anteil
bei 1 %. Sie konnten vereinzelt oder als NEBs angetroffen werden. Aufgrund der
beschriebenen PNEZ-Morphologie und ihrer geringen Anzahl ist festzustellen, dass diese
Zellen mit denen anderer Labortiere sowie mit denen in menschlichen Lungen
morphologisch überein stimmen.
Abschließend konnte gezeigt werden, dass Weißbüschelaffen trotz einiger Unterschiede in
der Verteilung und Morphologie der nicht-zilierten Zellen dennoch in vielen anderen
morphologischen Aspekten dem Menschen, bezogen auf die Lunge, sehr ähnlich sind, und
scheinen daher ein geeignetes Tiermodell für chronische Atemwegserkrankungen des
Menschen zu sein.
108 Summary
6 SUMMARY
Victoria Seidel (2012)
Morphological investigations on the airway of common marmosets (Callithrix jacchus)
with special consideration given to Clara cells.
In the present study, morphological examinations were performed on the lungs of common
marmosets. Macroscopical, histological, immunohistochemical and electron microscopic
methods were applied on 37 clinically healthy common marmoset lungs. Animals were
assigned to 3 study groups: adult, juvenile and newborn animals. Due to the fact that non-
ciliated cells play an important role in chronic respiratory diseases such as asthma and
COPD, the current study was focused on the non-ciliated cells in the intrapulmonary airways
in common marmosets.
In this study the lungs of newborn, juvenile and adult marmosets were for the first time
described macroscopically, including their size and weight. The lungs of the common
marmoset consist of six separate lobes: four on the right side and two on the left. The cranial
lobes on either side were found to possess a notch. Morphologically, the bronchial tree was
found to be similar in all age groups. By employing a method of producing corrosion lung
casts and performing subsequent CT scans on them, followed by an analysis with special
software, it was possible to show the dichotomous branching of the bronchial tree, the
topographical relationships between each segment, the intraluminal diameter of the segment
and its distance from the bifurcation in the distal direction. The intraluminal diameter of the
trachea of an adult marmoset measured 1000 to 1150 µm, the right bronchus ca. 850 to 1150
µm and the left bronchus 600 to 800 µm, the lobar bronchi 450 to 650 µm, and the
segmental bronchi from 250 to 500 µm. For a juvenile marmoset, the intraluminal diameter
of the trachea was 1000 to 1150 µm, the right bronchus ca. 800 to 1050 µm and the left
bronchus 650 to 800 µm, the lobar bronchi 350 to 650 µm, and the segmental bronchi from
250 to 500 µm. For a newborn marmoset, the intraluminal diameter of the trachea measured
700 to 800 µm, the right and left bronchi ca. 500 to 650 µm, the lobar bronchi 250 to 500
µm, and the segmental bronchi from 100 to 300 µm.
Summary 109
Regarding the distribution of the non-ciliated cells, major differences were present within
the Clara cell fraction. Clara cells in common marmosets were found throughout the
respiratory epithelium of the intrapulmonary airways, and were the dominant cell fraction.
They secreted primarily CCSP, but also surfactant proteins B and C. The results obtained via
immunohistochemistry regarding CCSP-positive cells were evaluated using statistical
methods. Within the bronchus, CCSP-positive cells accounted for 25 % of all epithelial cells
for adult animals, 27 % for juveniles and 16 % for newborn marmosets. In the bronchioles,
Clara cells accounted for 19 % of all epithelial cells in adult, 27 % in juvenile, and 17 % in
newborn marmosets. Ultrastructurally, Clara cells showed an apocrine type of secretion.
They had characteristic electron-dense granules of different diameters in the apical
cytoplasm. Scanning electron microscopy revealed microvilli and micropores on the luminal
surface.
Mucus-producing goblet cells were found to be much less present in common marmosets
than in other species. They also did not show the typical goblet cell morphology. With the
help of the histological staining agent Alcian blue, it was possible to detect acidic
mucopolysaccharides in individual goblet cells. The PAS reaction displayed neutral and
acidic mucopolysaccharides within goblet cells, but also glycogen particles, especially in
basal cells of newborn animals. The immunohistochemical staining with antibodies against
MUC5AC was the most reliable method for the detection of goblet cells. It was shown that,
statistically, MUC5AC-positive goblet cells make up 4 % of all epithelial cells in the
bronchi of adult and newborn marmosets, and 3 % in juveniles. Hardly any MUC5AC-
positive cells were found in the bronchioles.
Neuroendocrine cells in common marmosets were detected in the segmental bronchi, where
they made up 1 % of the epithelial cells across all age groups. In the bronchioles, the
fraction of neuroendocrine cells increased to 2 % in adult and juvenile marmosets, but
remained 1 % in newborn animals. They were encountered either as isolated individual cells
or as a group (NEBs). Neuroendocrine cells showed many similarities with human und
laboratory animal lungs concerning morphology and distribution.
Finally, it can be concluded that the lungs of the common marmoset, despite some
differences in the distribution and morphology of non-ciliated cells, are very similar to the
110 Summary
human lung in many morphological aspects. Therefore, the common marmoset seems to be
an appropriate animal model for human chronic respiratory diseases.
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Anhang 127
8 Anhang
Tabelle 15: Tiermaterial
G-/K- Nr. Geburtsdatum Sektionsdatum Geschlecht
Alter bei
der
Sektion
1 Adult G 8233* 25.05.2003 04.06.2010 männlich 7,03
2 Adult G 8238 29.09.2009 15.06.2010 männlich 0,71
3 Adult G 8375* 04.08.2003 02.02.2011 weiblich 7,50
4 Adult G 8307* 28.12.2003 13.10.2010 männlich 6,80
5 Adult G 8023* 25.01.2001 09.06.2009 weiblich 8,38
6 Adult G 8272* 22.06.2007 12.08.2010 weiblich 3,14
7 Adult G 8111* 27.04.2008 25.11.2009 weiblich 1,58
8 Adult G 8282* 27.05.2003 23.08.2010 männlich 7,25
9 Adult G 8210 30.06.2003 20.04.2010 weiblich 6,81
10 Adult G 8212 06.05.2006 20.04.2010 männlich 3,96
11 Adult G 8216 21.03.2009 20.04.2010 männlich 1,08
12 Adult G 8109 12.01.2002 23.11.2009 weiblich 7,87
13 Adult G 8003 04.08.2002 27.04.2009 männlich 6,73
14 Adult G 8001 22.08.2001 15.04.2009 männlich 7,65
15 Adult G 8217 18.04.2010 15.06.2010 männlich 0,16
16 Adult G 8218 29.09.2009 15.06.2010 männlich 0,71
17 Adult G 8247 06.04.2006 16.06.2010 weiblich 4,20
18 Adult K 2157 ** 01.10.2006 20.10.2010 männlich 4,05
19 Juvenil G 8043* 07.04.2008 15.07.2009 männlich 1,27
20 Juvenil G 8274* 18.06.2010 16.08.2010 männlich 0,16
21 Juvenil G 8369* 29.09.2010 26.01.2011 weiblich 0,33
22 Juvenil G 8370* 29.09.2010 26.01.2011 männlich 0,33
23 Juvenil K 2097/1* 10.04.2009 19.08.2009 männlich 0,36
24 Juvenil K 2097/2
** 10.04.2009 19.08.2009 männlich 0,36
25 Juvenil K 2095 12.03.2009 12.08.2009 männlich 0,42
26 Juvenil K 2085* 29.05.2009 22.06.2009 männlich 0,07
27 Neugeboren K 2151* 30.08.2010 30.08.2010 k.A. 0,00
28 Neugeboren K 2156* 15.10.2010 15.10.2010 k.A. 0,00
29 Neugeboren K 2153* 09.09.2010 09.09.2010 k.A. 0,00
30 Neugeboren K 2082* 01.06.2009 02.06.2009 männlich 0,00
31 Neugeboren K 2075* 06.05.2009 06.05.2009 weiblich 0,00
128 Anhang
32 Neugeboren K 2087* 02.07.2009 02.07.2009 k.A. 0,00
33 Neugeboren K 2152* 06.09.2010 06.09.2010 k.A. 0,00
34 Neugeboren K 2084* 15.06.2009 15.06.2009 männlich 0,00
35 Neugeboren K 2091 12.07.2009 13.07.2009 männlich 0,00
36 Neugeboren K 2163 ** 31.01.2011 01.02.2011 weiblich 0,00
37 Neugeboren K 2114 02.09.2009 03.11.2009 weiblich 0,17
„*“: dieses Tier wurde für die Statistik verwendet;
„**“: dieses Tier wurde für die Korrosionstechnik verwendet.
Histologie
1. Lösungen:
a) Phosphatpuffer
Lösung A (0,2 M):
Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat 27,6 g
Aqua bidest. ad 1000 ml
Lösung B (0,2 M):
Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat 35,6 g
Aqua bidest. ad 1000 ml
Gebrauchslösung (0,1 M, pH 7,4):
Lösung A 100 ml
Lösung B 400 ml
Aqua bidest. 500 ml
b) Fixierlösungen
4%iges neutral gepuffertes Formalin: 35 % ige Formaldehydlösung 114 ml
Aqua dest. 386 ml
Lösung A Phosphatpuffer 100 ml
Lösung B Phosphatpuffer 400 ml
2. Färbungen
a) Hämatoxylin & Eosin-Färbung
1. Entparaffinierung und Rehydratisierung:
Anhang 129
Xylol 1 5 Minuten
Xylol 2 2 Minuten
Xylol 3 2 Minuten
100%iges Ethanol 2 Minuten
96%iges Ethanol 2 Minuten
80%iges Ethanol 1 Minute
70%iges Ethanol 1 Minute
Aqua dest. 1 Minute
2. Zur Kernfärbung:
Hämalaun nach Mayer (Fa. Merck, Darmstadt) 3 Minuten
3. Zum Bläuen fließend wässern 10 Minuten
4. Zur Gegenfärbung:
0,1%iges Eosin
(Fa. ThermoFisher Scientific, Dreieich) 5 Minuten
5. Wässern fließend 5 Sekunden
6. Entwässerung in der aufsteigenden Alkoholreihe:
70%iges Ethanol: 1 Minute
80%iges Ethanol: 1 Minute
96%iges Ethanol: 1 Minute
100%iges Ethanol: 1 Minute
100%iges Ethanol: 2 Minuten
Xylol 1: 1 Minute
Xylol 2: 3 Minuten
Xylol 3: 3 Minuten
7. Eindecken mit Eukitt (Fa. Kindler, Freiburg).
b) Periodic Acid Schiff (PAS)-Reaktion:
1. Entparaffinierung und Rehydratisierung:
Xylol 1: 5 Minuten
Xylol 2: 2 Minuten
Xylol 3: 2 Minuten
100%iges Ethanol: 2 Minuten
96%iges Ethanol: 2 Minuten
80%iges Ethanol: 1 Minute
70%iges Ethanol: 1 Minute
Aqua dest.: 1 Minute
2. 0,5%ig Perjodsäure: 10 Minuten
3. Fließend Aqua dest.: 10 Minuten
130 Anhang
4. Schiff`s Reagenz (Fa. Merck, Darmstadt) 15 Minuten
5. Aqua dest.: wenige Sekunden
6. Fließend Leitungswasser: 10 Minuten
7. Gegenfärbung mit Hämalaun nach Mayer: 30 Sekunden
8. Bläuen in Leitungswasser: 10 Minuten
9. Entwässerung in der aufsteigenden Alkoholreihe:
70%iges Ethanol: 1 Minute
80%iges Ethanol: 1 Minute
96%iges Ethanol: 1 Minute
100%iges Ethanol: 1 Minute
100%iges Ethanol: 2 Minuten
Xylol 1: 2 Minuten
Xylol 2: 3 Minuten
Xylol 3: 3 Minuten
10. Eindecken mit Eukitt (Fa. Kindler, Freiburg).
c) Alcianblau 8 GS:
1. Entparaffinierung und Rehydratisierung:
Xylol 1: 5 Minuten
Xylol 2: 2 Minuten
Xylol 3: 2 Minuten
100%iges Ethanol: 2 Minuten
96%iges Ethanol: 2 Minuten
80%iges Ethanol: 1 Minute
70%iges Ethanol: 1 Minute
Aqua dest.: 1 Minute
2. 3% Essigsäure 3 Minuten
3. Alcianblaulösung 30 Minuten
4. Abspülen in 3% Essigsäure kurz
5. Spülen in Aqua dest.: 1 Minute
6. Zur Kernfärbung: Kernechtrot 5 Minuten
7. Spülen in Aqua dest.: 1 Minute
8. Entwässerung in der aufsteigenden Alkoholreihe:
70%iges Ethanol: 1 Minute
80%iges Ethanol: 1 Minute
96%iges Ethanol: 1 Minute
100%iges Ethanol: 1 Minute
100%iges Ethanol: 2 Minuten
Xylol 1: 2 Minuten
Xylol 2: 3 Minuten
Xylol 3: 3 Minuten
9. Eindecken mit Eukitt (Fa. Kindler, Freiburg).
Anhang 131
Immunhistochemie
1. Etiketten drucken und Reagenzienkarussell bestücken.
2. Reaction Buffer, EZ Prep, LCS, RiboWash und CC sowie Abfallbehälter
kontrollieren.
3. Barcode-Etiketten auf die Objektträger kleben, diese ins Discovery XT (Fa. Roche,
Mannheim, Deutschland) auf die Thermoplates legen.
4. Lauf starten, ab jetzt läuft die IHC-Reaktion vollautomatisch im Gerät nach der
SABC-Methode (Streptavidin-Biotin-Komplex) ab.
5. Aufheizen der Objektträger auf 75°C und Entparaffinierung mit Hilfe der EZ Prep
Solution.
6. Antigendemaskierung: bei Surfactant B für 36 Minuten, bei MUC5AC, NSE, Clara
Cell und Prosurfactant C für 20 Minuten, jeweils mit Cell Conditioning 1 (EDTA
Antigen Retrieval Solution pH 8,4).
7. Zur Hemmung der endogenen Peroxidase 4 Minuten Inhibitor (3% H2O2).
8. Bei MAC387: 20 Minuten Protease 3 (0,02 enzyme unit/ml) als enzymatische
Vorbehandlung.
9. 10 Minuten Option 1 (zum Blockieren unspezifischer Bindungsstellen Ziegenserum
1:5 in PBS verdünnt).
10. Primärantikörperinkubation:
Clara Cell Protein Human: 1:2000 für 32 Minuten
Mucin 5AC: 1:50 für 32 Minuten
Surfactant B: 1:10 für 60 Minuten
Prosurfactant C: 1:400 für 32 Minuten
NSE: 1:400 für 32 Minuten
MAC 387: 1:100 für 32 Minuten
11. 8 Minuten Fixative 1 (20 µl Glutaraldehydlösung 25% in 0,9%iger NaCl-Lösung).
12. Bei Surfactant B: Amplificationkit zur Verstärkung des DAB-Signals, 8 Minuten
Amplifier A und 8 Minuten Amplifier B.
13. 24 Minuten Universal Secondary Antibody (Biotinylierter Sekundärantikörper, ein
so genannter Multi-Link-Antikörper, der sowohl Maus- und
Kaninchenimmunglobuline erkennt).
14. Zur Blockierung von endogenem Biotin 4 Minuten Blocker D.
15. 16 Minuten SA-HRP (Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Komplex).
16. 8 Minuten DAB und H2O2 (enzymhistochemische Reaktion, DAB 2 g/l als
Chromogen und 0,04-0,08% H2O2).
17. 4 Minuten Cooper (Kupfersulfat 5 g/l zur Verstärkung des DAB´s).
132 Anhang
18. Zur Gegenfärbung 4 Minuten Hämatoxylin.
19. Zum Bläuen 4 Minuten Bluing Reagent.
20. Allen Inkubationsschritten im Discovery XT-Färbemodul folgen definierte
Waschschritte mit dem Reaction Buffer von Roche (Cat.950-300).
21. Schnitte aus dem Gerät nehmen, in einer Küvette mit Aqua dest. und Spülmittel
schwenken, um das im Discovery XT verwendete Öl zu entfernen und anschließend
in eine Küvette mit Aqua dest. überführen.
22. Aufsteigende Alkoholreihe:
70%-igem und 80%-igem Ethanol jeweils 30 Sekunden
96%-igem und 100%-igem Ethanol jeweils 1 Minute
100%-igem Ethanol für 2 Minuten
Xylol unter dreimaligem Wechsel (je 2 Minute).
23. Eindecken der Objektträger mit Eukitt (Fa. Kindler, Freiburg).
Korrosionstechnik
Für den Ausguss aus Kunststoff wurde Technovit 7143 (Methylmetacrylat) von der Fa.
Kulzer & Co GmbH, Bad Homburg verwendet.
1. 10 g von gelbem Technovit-Pulver wurde mit 5 g Technovit-Flüssigkeit gemischt.
2. 2 Minuten wurde alles gerührt bis es eine sämige Konsistenz hatte.
3. Ca. 1,5 ml Injektion von Hand mit gleichmäßigem Druck (adultes Tier; juveniles Tier:
ca. 1,1 ml; neugeborenes Tier: ca. 0,8 ml)
4. Ruhe für die Aushärtungszeit ca. 3 Stunden
5. 24 Stunden Polymerisation. Aufbewahrung in Kaliumhydroxid (KOH) 40 % ig im
Trockenschrank bei 55 °C.
6. Spülen mit fließendem Wasser
7. Ausgusspräparat mit transparatem Lack ansprühen
Transmissionselektronenmikroskopie
a) Eponmischung nach LUFT (1961)
Mischung A:
Glycidether 100 (Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 21045) 71,3 g
2-Dodecenylsuccinicacidanhydrid (DDSA)
(Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 20755) 115 g
Anhang 133
Vermischen auf dem Magnetrührer 1 Stunde
Mischung B:
Glycidether 100 (Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 21045) 100 g
Methylacidanhydrid (MNA)
(Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 29452) 89 g
Vermischen auf dem Magnetrührer 1 Stunde
1. Zusammengeben Mischungen A und B (Verhältnis 1:1)
2. Vermischen auf dem Magnetrührer 30 Minuten
3. Eingeben Beschleuniger (DMP) 1,8%
(2,4,6-Tris (dimethylaminomethyl)phenol (Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 36975)
4. Vermischen auf dem Magnetrührer 15 Minuten
b) Eponeinbettung
1. Spülen die Proben in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) bei 4°C 3 x 30 Minuten
2. Nachfixieren in 1 %-iger Osmiumtetroxidlösung in 0,1 M
Phosphatpuffer (pH 7,4) bei 4°C 2 Stunden
3. Spülen in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) bei 4°C 3 x 30 Minuten
4. Dehydrieren in aufsteigender Alkoholreihe bei 4°C:
30 %iges Ethanol 30 Minuten
50 %iges Ethanol 30 Minuten
70 %iges Ethanol 30 Minuten
90 %iges Ethanol 30 Minuten
100 %iges Ethanol 30 Minuten
100 %iges Ethanol 30 Minuten
Isopropanol 30 Minuten
5. Infiltration mit Propylenoxid bei 4°C 2 x 15 Minuten
6. Infiltration mit Propylenoxid-Epon 2:1 bei 10 °C 1 Stunde
7. Infiltration mit Propylenoxid-Epon 1:1 bei 10°C 2 Stunden
134 Anhang
8. Infiltration mit Propylenoxid-Epon 1:2 bei 10°C 4 Stunden
9. Infiltration mit reinem Epon bei 20°C über Nacht
10. Infiltration mit reinem Epon bei 20°C 3 Stunden
c) Methylenblaufärbung nach RICHARDSON et al. (1960)
Lösung A:
Azur II für die Lichtmikroskopie
(Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 9211) 1 g
in Aqua dest. lösen 100 ml
Lösung B:
Di-Natriumtetraborat p. a.
(Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 6306) 1 g
Methylenblau für die Lichtmikroskopie 1 g
(Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 15943)
in Aqua dest. lösen 100 ml
Lösungen A und B (Verhältnis 1:1) mischen, filtrieren und anschließend die
Semidünnschnitte auf der Wärmebank bei 60°C 1 Minute färben.
Rasterelektronenmikroskopie
1. Spülen in 0,1 M Cacodylatpuffer
(der Cacodylatpuffer wird mehrfach gewechselt) 5 Stunden
2. Eingelegen in 1%-ig Osmiumtetroxid auf Eis 2 Stunden
3. Spülen in 0,1 M (Cacodylatpuffer mehrfach gewechselt) 4x30 Minuten
4. Dehydrieren in aufstegender Alkoholreihe:
30%-iges Ethanol 60 Minuten
50%-iges Ethanol 60 Minuten
70%-iges Ethanol im Kühlschrank aufbewahrt über Nacht
90%-iges Ethanol (1 Mal gewechselt) 60 Minuten
100%-iges Ethanol (2 Mal gewechselt) 2 Tage
5. Einlegen in Isoamylacetat (2 Mal gewechselt) 2 Tage
6. Critical Point-Trocknung (4 Mal CO2 gewechselt)
Göttingen, den 08.04.2012
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel „Morphologische
Untersuchungen an den Atemwegen von Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) unter
besonderer Berücksichtigung von Clara-Zellen“ selbständig verfasst habe. Bei der
Anfertigung wurden folgende Hilfsmittel und Hilfen Dritter in Anspruch genommen:
Technisch-methodische Einweisung durch technische Assistentinnen der Abteilung
Infektionspathologie, Deutsches Primatenzentrum Göttingen.
Redaktionelle Überarbeitung durch wissenschaftliche Mitarbeiter und dem Leiter der
Abteilung Infektionspathologie, Deutsches Primatenzentrum Göttingen.
Computertomographie der Ausgusspräparate mit Hilfe von Mitarbeitern des
Universitätsklinikums Göttingen.
Elektronische Datenverarbeitung der CT-Daten von den Ausgusspräparaten mit Hilfe
von MevisLab, insbesondere Herrn Dr. V. Dicken (Fraunhofer MEVIS, Bremen).
Statistische Auswertung mit Hilfe von Mitarbeitern der Abteilung Medizinische
Statistik, Universitätsklinikum Göttingen.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten in Anspruch
genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für
Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation
stehen.
Die vorliegende Dissertation wurde in der Abteilung Infektionspathologie des Deutschen
Primatenzentrums in Göttingen angefertigt und sie wurde bisher nicht für eine Prüfung oder
Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der
Wahrheit entsprechend gemacht habe.
Victoria Seidel
Danksagung
Bedanken möchte ich mich an erster Stelle besonders herzlich bei meinem Doktorvater,
Herrn Prof. Dr. F.-J. Kaup, für die Übergabe eines hochinteressanten Themas und die
uneingeschränkte motivierende Unterstützung bei der Anfertigung der Dissertation. Trotz
seines vollen Terminkalenders war er immer offen und hilfsbereit. Außerdem möchte ich
mich für die Entdeckung der Pathologie als Beruf bedanken, und für das mir
entgegengebrachte Vertrauen die Vorlesungen zu halten.
Frau Dr. K. Mätz-Rensing und Frau Dr. M. Bleyer danke ich herzlich für die
Materialgewinnung. Frau Dr. M. Bleyer und Frau Dr. E. Gruber-Dujardin für die
Ausbildung auf dem Gebiet der tiermedizinischen Pathologie. Frau Dr. M. Bleyer hat die
gewissenhafte, gründliche und zuverlässige Durchsicht meines Manuskripts übernommen.
Ich danke ihr herzlich, denn sie brachte mir sehr viel Geduld entgegen und sorgte mit
wertvollen Ratschlägen für das Gelingen der Arbeit.
Ich danke Frau Dr. C. Schlumbohm für ihre immer guten Ideen und Anregungen im
wissenschaftlichen Bereich. Frau Dr. T. Becker und Frau Dr. A. Schrod möchte ich sehr
danken für ihre professionelle und interessante Einführung in die Welt der Primaten.
Frau I. Roßbach danke ich für ihre immer zuverlässige organisatorische Hilfe.
Besonderen Dank schulde ich Frau N. Schminke und Frau L. Hummel, die mir bei der
Anfertigung aller meiner Proben und Schnitte zur Seite standen. Außerdem bin ich sehr
dankbar für ihre Hilfe bei meiner Einarbeitung in die Histologie, Immunhistochemie und
Elektronenmikroskopie. Sehr herzlich danke ich den Kollegen aus der Sektionshalle, Frau S.
Wienstroth, Frau E. Lischka, Herrn A. Kues und Herrn W. Henkel. Herrn Henkel danke ich
außerdem für seine Unterstützung bei der Anfertigung der zahlreichen Ausgusspräparate
und ihm sowie Frau C. Heckmann für die Hilfe bei der Materialgewinnung. Ebenso bedanke
ich mich bei Frau K. Rohn für die freundliche Unterstützung bei der Durchführung der
rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen.
Außerdem danke ich Herrn Dr. C. Roos und Herrn N. Westphal für die Hilfe bei einigen
Nachweismethoden von Clara-Zellen.
Ebenso möchte ich mich bedanken bei Herrn A. Heutz, Herrn H. Eichenauer und Herrn L.
Washausen für ihre uneingeschränkte Rettungshilfe bei Computerfragen.
Ein ganz besonderer Dank gilt allen Mitdoktoranden, insbesondere Frau K. Lampe aus der
und Frau K. Hoffmann. Herzlichen Dank für ihre Freundschaft und jeden anderen
wertvollen und unterstützenden Beistand. Ich möchte mich bedanken bei Frau J.
Winkelmann und Frau J. König für die Einführung in die Arbeitsgruppe und die große
Freundlichkeit, mit der sie mich aufnahmen. Frau S. Seehase danke ich für ihre Einarbeitung
in das Lungenprojekt und für das Foto, das in dieser Arbeit auf Seite 43 abgebildet wird.
Auch allen nichtgennanten Kollegen danke ich für das schöne Arbeitsklima.
Ich möchte allen Kollegen aus Fraunhofer ITEM und insbesondere Herrn A. Braun und
Herrn S. Knauf für die vielen innovativen Vorschläge im Rahmen unserer Kooperation
danken. Für die Unterstützung bei statistischen Fragen danke ich herzlichst Herrn S.
Schneider. Eine spezielle Erwähnung verdienen Herr Dr. V. Dicken und Herr C. Dullin für
die CT-Auswertung.
Ich möchte einen besonderen Dank an Herrn Prof. Dr. R. Pabst richten für seine wertvollen
Vorschläge und seine uneingeschränkte Unterstützung.
Frau I. Wilke gebührt mein Dank für die Hilfe bei der Bildbearbeitung und ihre freundliche
Unterstützung. Auch möchte ich mich bei meinen Freunden Frau F. Kaup, Frau I. Wilke,
Frau K. Kara, Frau I. Stridde, Herrn A. Shevchenko und Herrn D. Hahn bedanken, die mich
nicht nur tatkräftig unterstützt haben, sondern mich stets aufbauten und für die erforderliche
Abwechslung sorgten.
Ich danke auch herzlich meinen Lehrern aus der Staatlichen Landwirtschaftlichen
Hochschule Iwanowo Frau G. Korneva, Herrn V. Kuvshinov und Frau O. Ganina.
Außerdem danke ich meiner Deutschlehrerin und guten Freundin Frau I. Kuznetsova für ihre
stets konstruktive Kritik, für ihre wertvollen Ratschläge und meine Deutschkenntnisse.
Ich möchte mich auch bei meinen Freundinnen Frau M. Gorodkova, Frau N. Stroyeva, Frau
E. Smirnova, Frau L. Volkova, Frau O. Tarasova und Frau A. Shishkina in der Heimat
bedanken, die mir immer den Rücken gestärkt haben.
Des Weiteren möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, ohne die ein Studium und eine
Doktorarbeit niemals möglich geworden wären. Ich möchte mich ebenso bei meinen
Schwiegereltern für ihre Unterstützung bedanken. Und anschließend danke ich meinem
Mann, der mich durch seine Liebe und Güte die ganze Zeit unterstützt und nie an mir
gezweifelt hat. Daher widme ich ihm diese Arbeit.
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