entwicklung und in vitro-charakterisierung eines
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Entwicklung und In vitro-Charakterisierung eines
Mikrodialysesystems zur intestinalen Anwendung am Menschen
I N AU G U RA L DI S SE R T A TI O N
zur
Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
vorgelegt von
Dana Schönherr
geboren am 12. Mai 1976
in Eisenhüttenstadt
Greifswald, den 15. August 2015
Dekan: Prof. Dr. Klaus Fesser
1. Gutachter: Prof. Dr. Werner Weitschies
2. Gutachter: Prof. Dr. med. Thomas Gramatté
Tag der Promotion: 22. Januar 2016
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis.......................................................................................................... V
1 Einleitung .................................................................................................................... 1
1.1 Ausgewählte Aspekte der Anatomie und Physiologie des Gastrointestinaltraktes
und deren Einfluss auf die Arzneistoffabsorption ..................................................... 1
1.1.1 Anatomie .......................................................................................................... 1
1.1.2 Sekretion .......................................................................................................... 2
1.1.3 Motilität und Transitzeiten ................................................................................ 4
1.1.4 Arzneistoffabsorption........................................................................................ 5
1.2 Einfluss der physikochemischen Eigenschaften des Arzneistoffes und der
Arzneiform auf die Arzneistoffabsorption ................................................................. 7
1.2.1 Physikochemische Eigenschaften des Arzneistoffes ........................................ 7
1.2.2 BCS-Klassifizierung des Arzneistoffes und dessen Einfluss auf die
Formulierung der Arzneiform ............................................................................ 8
1.3 Prinzipien der Untersuchung der intestinalen Arzneistoffabsorption ........................ 9
1.3.1 Indirekte Methoden .......................................................................................... 9
1.3.2 Direkte Methoden ............................................................................................10
1.4 Verwendung der Mikroperfusion mit offenem Fluss zur Bestimmung von
Stoffkonzentrationen ..............................................................................................12
1.5 Verwendung der Mikrodialyse zur Bestimmung von Stoffkonzentrationen ..............13
1.6 Zielstellung .............................................................................................................16
2 Material und Methoden ..............................................................................................19
2.1 Arzneistoffe und Medien .........................................................................................19
2.1.1 Arzneistoffe .....................................................................................................19
2.1.2 Medien und Arzneistofflösungen .....................................................................20
2.2 Entwicklung eines oral anwendbaren Mikrodialysesystems ....................................21
2.3 Versuchsaufbau und Versuchsablauf .....................................................................24
2.3.1 Versuchsaufbau für den kontinuierlichen und diskontinuierlichen Fluss ..........24
2.3.2 Versuchsablauf für den kontinuierlichen und diskontinuierlichen Fluss ............26
Inhaltsverzeichnis
II
2.4 In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems ..............................................................32
2.4.1 Untersuchungen zur Etablierung des Versuchsaufbaus und des
Versuchsablaufes ............................................................................................32
2.4.1.1 Einfluss der Rührgeschwindigkeit und des für die Homogenisation
verwendeten Gerätes auf die relative Wiederfindung ...............................32
2.4.1.2 Einfluss der Equilibrierzeit und der Temperatur auf die relative
Wiederfindung ..........................................................................................32
2.4.2 Bestimmung der Sensitivität des Mikrodialysesystems bei
Konzentrationsänderungen .............................................................................33
2.4.3 Einfluss verschiedener Parameter auf die relative Wiederfindung bei
Anwendung des diskontinuierlichen Flusses ...................................................33
2.4.3.1 Einfluss der Nutzungsdauer auf die relative Wiederfindung ......................33
2.4.3.2 Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Herstellung ...............................33
2.4.3.3 Einfluss des Donor-Mediums auf die relative Wiederfindung ....................34
2.4.3.4 Einfluss des Perfusats auf die relative Wiederfindung ..............................34
2.4.4 Bestimmung der Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Verwendung
biorelevanter Medien .......................................................................................34
2.4.5 Bestimmung der Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Anwendung im
Röhrenmodell ..................................................................................................34
2.5 Adaption und In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems für eine mögliche
humane Anwendung ..............................................................................................36
2.5.1 Adaption des Mikrodialysesystems ..................................................................36
2.5.2 In vitro-Prüfung des adaptierten Mikrodialysesystems .....................................37
2.5.3 Bestimmung des pH-Wertes im Donor-Kompartiment über die Analyse der
Dialysatproben ................................................................................................37
2.5.4 Evaluation der Braun Infusomat® und Perfusor® Space Pumpen .....................37
3 Ergebnisse .................................................................................................................39
3.1 Entwicklung eines oral anwendbaren Mikrodialysesystems ....................................39
3.2 In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems ..............................................................42
3.2.1 Untersuchungen zur Etablierung des Versuchsaufbaus und des
Versuchsablaufes ............................................................................................42
Inhaltsverzeichnis
III
3.2.1.1 Einfluss der Rührgeschwindigkeit und des für die Homogenisation
verwendeten Gerätes auf die relative Wiederfindung ...............................42
3.2.1.2 Einfluss der Equilibrierzeit und der Temperatur auf die relative
Wiederfindung ..........................................................................................43
3.2.2 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Konzentrationsänderungen .............46
3.2.3 Einfluss verschiedener Parameter auf die relative Wiederfindung bei
Anwendung des diskontinuierlichen Flusses ...................................................51
3.2.3.1 Einfluss der Nutzungsdauer auf die relative Wiederfindung ......................51
3.2.3.2 Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Herstellung ...............................52
3.2.3.3 Einfluss des Donor-Mediums auf die relative Wiederfindung ....................53
3.2.3.4 Einfluss des Perfusats auf die relative Wiederfindung ..............................54
3.2.4 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Verwendung biorelevanter Medien ..55
3.2.5 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Anwendung im Röhrenmodell..........57
3.3 Adaption und In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems für eine mögliche
humane Anwendung ..............................................................................................58
3.3.1 Adaption des Mikrodialysesystems ..................................................................58
3.3.2 In vitro-Prüfung des adaptierten Mikrodialysesystems .....................................59
3.3.3 Bestimmung des pH-Wertes im Donor-Kompartiment über die Analyse der
Dialysatproben ................................................................................................60
3.3.4 Evaluation der Braun Infusomat® und Perfusor® Space Pumpen .....................61
4 Diskussion .................................................................................................................63
4.1 Entwicklung eines oral anwendbaren Mikrodialysesystems ....................................63
4.2 In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems ..............................................................67
4.2.1 Untersuchungen zur Etablierung des Versuchsaufbaus und des
Versuchsablaufes ............................................................................................70
4.2.2 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Konzentrationsänderungen .............76
4.2.3 Einfluss verschiedener Parameter auf die relative Wiederfindung bei
Anwendung des diskontinuierlichen Flusses ...................................................83
4.2.4 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Verwendung biorelevanter Medien ..87
4.2.5 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Anwendung im Röhrenmodell..........87
Inhaltsverzeichnis
IV
4.3 Adaption und In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems für eine mögliche
humane Anwendung ..............................................................................................89
4.3.1 Adaption des Mikrodialysesystem ...................................................................89
4.3.2 In vitro-Prüfung des adaptierten Mikrodialysesystems .....................................91
4.3.3 Bestimmung des pH-Wertes im Donor-Kompartiment über die Analyse der
Dialysatproben ................................................................................................91
4.3.4 Evaluation der Braun Infusomat® und Perfusor® Space Pumpen .....................92
5 Zusammenfassung ....................................................................................................95
6 Literaturverzeichnis ....................................................................................................99
7 Anhang .................................................................................................................... 115
7.1 Geräteverzeichnis ................................................................................................ 115
7.2 Chemikalienverzeichnis ........................................................................................ 116
7.3 Materialverzeichnis............................................................................................... 117
Publikationen und Kongressbeiträge .................................................................................. 119
Danksagung ....................................................................................................................... 121
Abkürzungsverzeichnis
V
Abkürzungsverzeichnis
Amoxicillin Amoxicillin-Trihydrat
BCS Biopharmaceutics Classification System
CYP3A4 Cytochrom P450 Enzym 3A4
FaSSIF Fasted State Simulated Intestinal Fluid
FeSSIF Fed State Simulated Intestinal Fluid
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
IMMC Interdigestive Migrating Motor Complex
MP Medicoplast-Schlauch
MRT Magnetresonanztomographie
MW Mittelwert
NaCl-Lösung Isotone Kochsalz-Lösung 0,9 % Braun Infusionslösung
OFM Mikroperfusion mit offenem Fluss
PEPT1 Peptidtransporter 1
RR Relative Wiederfindung
SD Standardabweichung
SF Skalierungsfaktor
USP Arzneibuch der Vereinigten Staaten von Amerika
VS Versilic®-Schlauch
Abkürzungsverzeichnis
VI
Einleitung
1
1 Einleitung
Die Applikation von Arzneistoffen ist auf vielen Wegen möglich. Der orale Applikationsweg
wird für die meisten Arzneistoffe bevorzugt, da dieser als weitgehend sicher gilt und die
Herstellung von oralen Darreichungsformen verhältnismäßig kostengünstig ist. Ein weiterer
Vorteil ist die einfache Anwendbarkeit durch den Patienten selbst, die in einer
vergleichsweise hohen Compliance resultiert. Oral applizierte Arzneistoffe können lokal in
der Mundhöhle, im Magen oder Darm wirken und zudem über die Mund- und Darm-
schleimhaut in den systemischen Kreislauf aufgenommen werden. Dabei ist die orale
Bioverfügbarkeit, also die systemisch verfügbare Arzneistoffmenge, das Resultat aus einem
Zusammenspiel von Liberations- und Absorptionsvorgängen. Dieses Zusammenspiel wird
von verschiedenen Faktoren beeinflusst. Dazu zählen zum einen die anatomischen und
physiologischen Gegebenheiten des Gastrointestinaltraktes und zum anderen die
physikochemischen Eigenschaften des Arzneistoffes und der jeweiligen Formulierung der
Arzneiform. Prinzipiell erfolgt die Aufnahme eines oral verabreichten Wirkstoffes nach
vorheriger Freisetzung aus der jeweiligen Darreichungsform über die Absorption des
gelösten Stoffes aus dem Dünndarm. Für diesen Prozess werden insbesondere die intestinal
vorliegende Arzneistoffkonzentration und der für den Arzneistoff spezifische
Absorptionsprozess als wichtige Größen für das Verständnis der Arzneimittelwirkung
erachtet [1, 2].
Im Folgenden werden die für diese Arbeit relevanten Aspekte der Anatomie und Physiologie
des Gastrointestinaltraktes sowie Kenntnisse über die bisher zur Bestimmung von
Stoffkonzentrationen verwendeten Systeme und Methoden kurz erläutert.
1.1 Ausgewählte Aspekte der Anatomie und Physiologie des Gastrointestinaltraktes
und deren Einfluss auf die Arzneistoffabsorption
1.1.1 Anatomie
Das Verdauungssystem des Menschen besteht aus dem Mund-Rachen-Raum, der
Speiseröhre, dem Magen, dem Dünn- und Dickdarm sowie dem Mastdarm. Der Dünndarm
wird weiter in Duodenum (Zwölffingerdarm), Jejunum (Leerdarm) und Ileum (Krummdarm)
unterteilt. Im tonisierten Zustand hat der Dünndarm eine Gesamtlänge von 250 bis 350 cm
[3, 4] und einen Durchmesser von 1,9 bis 2,5 cm [5]. Das Duodenum stellt den proximalen
Abschnitt mit einer Länge von 20 bis 30 cm dar [3, 4]. Jejunum und Ileum besitzen jeweils
eine Länge von etwa 150 und 200 cm. Der Übergang zwischen beiden
Einleitung
2
Dünndarmabschnitten ist fließend [6]. Eine starke Oberflächenvergrößerung des Dünndarms
um den Faktor 130 wird durch die Faltung der Schleimhaut (Kerckringfalten), durch
fingerförmige Ausstülpungen (Zotten) und Fortsätze an den Enterozyten (Mikrovilli) erreicht
[7]. Da die Anzahl der Kerckringfalten und der Durchmesser in den distalen Bereichen des
Dünndarms abnimmt, verringert sich die verfügbare Absorptionsfläche zum terminalen Ileum
kontinuierlich [5]. Mit einer Gesamtoberfläche von 30 m2 ist der Dünndarm das größte
Absorptionsorgan des menschlichen Körpers [7].
1.1.2 Sekretion
Für die Arzneistoffabsorption ist das zur Verfügung stehende Flüssigkeitsvolumen ein
entscheidender Parameter, da nur gelöster Arzneistoff absorbiert werden kann. Täglich wird
dem Gastrointestinaltrakt ein Flüssigkeitsvolumen von 1,5 bis 2,0 L durch Nahrung und
Getränke zugeführt. Zudem werden im Rahmen der Verdauung über den Tag verteilt
verschiedene Flüssigkeiten in den Verdauungstrakt sekretiert. In Abhängigkeit von der
Nahrungsaufnahme werden bis zu 8 L Speichel, Magensaft, Galle, Pankreas- und
Dünndarmsekret ausgeschüttet [6, 8]. Eine Bilanz ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1: Gastrointestinaler Flüssigkeitshaushalt [6, 9].
Einleitung
3
Für die verschiedenen Funktionen im Verdauungstrakt sind die einzelnen Flüssigkeiten
unterschiedlich zusammengesetzt. Der Speichel enthält α-Amylase zur Stärkespaltung und
besitzt einen pH-Wert zwischen pH 6,8 und 7,3, dem Wirkoptimum der Amylase [6, 10, 11].
Im nüchternen Magen wurden pH-Werte von pH 1 bis 4 gemessen, die durch den Salzsäure-
anteil im Magensaft bedingt sind [12, 13]. Zum Schutz der Magenschleimhaut werden Muzin
und Hydrogencarbonat-Ionen in den Magen sekretiert. Die Hydrogencarbonat-Ionen werden
in der ungemischten Wasserschicht, die überwiegend aus Muzin besteht und sich direkt auf
der Schleimhaut befindet, festgehalten und bilden somit eine Barriere zum Inhalt des
Magens [6, 14]. Postprandial sind im Magen nahrungsabhängig initial pH-Werte von
durchschnittlich pH 5 bis maximal pH 7 messbar, die mit der Zeit wieder absinken [15]. In
den Dünndarm werden Galle, Pankreas- und Dünndarmsaft sekretiert. Im Dünndarmdarm-
sekret sind vor allem schleimhautschützende Muzine, im Gallensaft Gallensäuren und im
Pankreassekret Verdauungsenzyme (Amylasen, Lipasen und Peptidasen) enthalten. In allen
Sekreten sind Hydrogencarbonat-Ionen zur Neutralisierung der Säure und zur Einstellung
des Wirkoptimums der Verdauungsenzyme zu finden. Zum Schutz der Schleimhaut vor
verdauenden Enzymen und pH-Einflüssen ist ebenfalls die ungemischte Wasserschicht
vorhanden [6]. Im nüchternen Dünndarm werden pH-Werte von pH 6,0 bis 8,0 und
postprandial von pH 5,0 bis 6,5 berichtet [12, 13]. Die sezernierten Gallensäuren können
aufgrund ihrer grenzflächenaktiven Eigenschaften mit Nahrungsfetten Mizellen bilden. Diese
sind für die Absorption der enthaltenen Fettsäuren sowie für die in den Mizellen
inkorporierten fettlöslichen Arzneistoffe relevant [16]. Als Ausgleich zur gastrointestinalen
Sekretion wird Wasser aus dem Dünn- und Dickdarm absorbiert und eine kleine Menge mit
dem Faeces ausgeschieden [6]. Diese Flüssigkeitsbewegungen führen jedoch nicht zur
kompletten Füllung des Dünn- oder Dickdarms mit Wasser.
Bereits 2005 wurde von Schiller et al. mit Hilfe von magnetresonanztomographischen
Untersuchungen entdeckt, dass freies Wasser inhomogen im Darmlumen verteilt ist und in
separaten Flüssigkeitsnestern vorliegt [17]. Das Flüssigkeitsvolumen und die Anzahl der
einzelnen Nester sind dabei vom Füllungszustand des Darmes abhängig. Im nüchternen
Zustand liegt das Gesamtvolumen durchschnittlich bei 105 mL mit einem Medianwert von
12 mL pro Nest. Nach Nahrungsaufnahme ist die Anzahl der Flüssigkeitsnester erhöht, aber
deren Einzelvolumen auf 4 mL verringert und das Gesamtvolumen auf durchschnittlich
54 mL halbiert. Nach der Applikation von nicht zerfallenen Kapseln wurde der Flüssigkeits-
kontakt der Kapseln untersucht. Im nüchternen Zustand wurde die Hälfte der applizierten
Kapseln von Flüssigkeit umgeben vorgefunden. Die übrigen Kapseln befanden sich teilweise
von Flüssigkeit umgeben oder ohne direkten Flüssigkeitskontakt und dabei überwiegend im
Dünndarm. Eine Stunde nach der Nahrungsaufnahme wurden nur einzelne Kapseln im
Einleitung
4
Dünndarm detektiert, die hauptsächlich ohne Flüssigkeitskontakt vorlagen [17]. Die fehlende
intestinale Flüssigkeit kann in einem veränderten Freisetzungsverhalten des Arzneistoffes
aus der Arzneiform und einem veränderten Löslichkeitsverhalten des Arzneistoffes
resultieren. Dies kann zu einer Veränderung der intestinalen Arzneistoffkonzentration
und -absorption führen und damit die orale Bioverfügbarkeit entscheidend beeinflussen.
1.1.3 Motilität und Transitzeiten
Im Nüchternzustand wird die peristaltische Aktivität im Gastrointestinaltrakt durch den
INTERDIGESTIVE MIGRATING MOTOR COMPLEX (IMMC) bestimmt. Dabei handelt es sich um
elektrisch stimulierte Muskelkontraktionen mit variabler Intensität [18]. Der IMMC besteht aus
vier Phasen, die sich regelmäßig wiederholen und eine Gesamtdauer von durchschnittlich
2 h aufweisen [18, 19]. Die Phase I ist durch eine geringe Muskelaktivität gekennzeichnet
(30 bis 60 min). Während der Phase II treten für 30 bis 45 min unregelmäßig Kontraktionen
im Gastrointestinaltrakt auf [20]. Diese Phase endet abrupt durch das Auftreten von
rhythmischen Kontraktionen der Muskulatur in der Phase III. Die motorischen Bewegungen
der Phase III werden HOUSEKEEPER WAVES genannt, da der betreffende Abschnitt des
Gastrointestinaltraktes innerhalb von 5 bis 15 min von Nahrungsresten, unverdaulichen
Objekten und Bakterienansammlungen bereinigt wird [18, 20]. Die gastrointestinale
Reinigung wird durch die Sekretion von verschiedenen Verdauungssäften, wie Magensaft,
Galle und Pankreassekret, unterstützt [19]. Die leichten Muskelkontraktionen der Phase IV
(5 min) bilden den Übergang zur Phase I und damit dem Neubeginn des IMMC [20]. Ihren
Ursprung haben die Kontraktionen des Gastrointestinaltraktes im Bereich der Speiseröhre,
des Magens oder des proximalen Dünndarms [18, 21]. Danach wandern die
Kontraktionswellen zyklisch bis zum terminalen Ileum [19]. Die Häufigkeit der Kontraktionen
verringert sich in distalen Bereichen [21, 22].
Durch Nahrungsaufnahme wird der IMMC im gesamten Gastrointestinaltrakt abrupt gestoppt.
Im Magen setzten infolgedessen Kontraktionen ein, die der Phase II des IMMC entsprechen
und im Dünndarm treten unregelmäßige stationäre und propulsive Kontraktionen auf [22, 23].
Die stationären Bewegungen (nicht propulsive Peristaltik, Segmentation und
Pendelbewegungen) im Dünndarm führen zur Durchmischung des Darminhaltes und
ermöglichen damit eine erhöhte Absorption von Stoffen durch die verlängerte Kontaktzeit zur
Schleimhaut. Der Transport des Darminhaltes in distale Abschnitte wird durch die
propulsiven Bewegungen ermöglicht [6].
Die Magenentleerung kann nicht nur durch feste Nahrung verzögert werden, sondern auch
durch kalorische Flüssigkeiten [24]. Die Magenentleerungsrate ist unter anderem von deren
Einleitung
5
Zusammensetzung und Kaloriengehalt abhängig [20, 25-27]. Applizierte Arzneimittel werden
in Abhängigkeit von der Art und Zusammensetzung der Arzneiform nach wenigen Minuten
oder mehreren Stunden aus dem postprandialen Magen entleert [28].
Für den Dünndarm wurden konstante Transitzeiten zwischen 3 und 4 h für die
aufgenommene Nahrung publiziert [28-30]. Dieser Zeitraum wurde ebenfalls für den
postprandialen Transport von Arzneimitteln im Dünndarm bestätigt, wobei inter- und intra-
individuelle Schwankungen zu verzeichnen sind [30]. Die Beschaffenheit der Arzneiform und
der Füllungszustand des Magens haben demnach keinen Einfluss auf die intestinale Transit-
zeit [28]. Bei gesunden Probanden wurde zudem kein Einfluss des Alters ermittelt [29].
1.1.4 Arzneistoffabsorption
Es wird davon ausgegangen, dass nur gelöster Arzneistoff aus dem Dünndarmlumen
aufgenommen wird. Nach der Diffusion des Arzneistoffes zur Intestinalschleimhaut stehen
verschiedene Mechanismen zur Absorption zur Verfügung, die auch gleichzeitig genutzt
werden können. Bis zum Ende des 20. Jahrhunderts wurde der passive Transport durch
Diffusion als Hauptabsorptionsmechanismus für Arzneistoffe angenommen [31, 32]. Dabei ist
sowohl eine parazelluläre als auch eine transzelluläre Aufnahme der Arzneistoffe durch
Diffusion möglich. Die Diffusion ist eine dem Konzentrationsgradienten folgende Bewegung
gelöster Teilchen welche mit dem 1. FICK‘SCHEN GESETZ beschrieben werden kann [33, 34]:
𝐽 = −𝐷𝑑𝑐
𝑑ℎ (Gleichung 1).
Es besagt, dass der Diffusionsstrom (J) über eine definierte Fläche dem
Konzentrationsgradienten (dc/dh) und dem Diffusionskoeffizienten (D) direkt proportional ist.
Der Diffusionskoeffizient kann für runde Partikel mit der STOKES-EINSTEIN-GLEICHUNG
berechnet werden [35, 36]:
𝐷 =𝑅𝑇
6𝜋𝜂𝑟𝑁𝐴 (Gleichung 2).
In diese Gleichung gehen die Gaskonstante (R), die Temperatur (T), die Viskosität (η), der
Radius (r) und die Avogadrokonstante (NA) ein. Der Transport von kleinen hydrophilen
Einleitung
6
Molekülen kann parazellulär durch Poren mit dem Wasserstrom erfolgen, welches auch
SOLVENT DRAG PHENOMENON genannt wird [37, 38]. Zur transzellulären Diffusion durch die
lipophilen Zellmembranen benötigt der Arzneistoff eine gewisse Lipophilie [32], die bei
ungeladenen Stoffen stärker ausgeprägt ist als bei geladenen Stoffen.
In den letzten zwei Dekaden wurden zusätzlich viele intestinale Transporter identifiziert, die
das Ausmaß der Absorption von Arzneistoffen beeinflussen können [31, 32]. Dabei wird
zwischen dem erleichterten und dem aktiven Transport von Stoffen unterschieden. Während
der erleichterte Stofftransport durch einen Transporter entlang des Konzentrationsgradienten
vermittelt wird, erfolgt der aktive Transport unter Verwendung von Energie entgegen des
Konzentrationsgradienten. In der Literatur sind sowohl Aufnahme- als auch Effluxtransporter
für den Dünndarm beschrieben worden. Dabei wurde für einige Transporter eine
regioselektive Verteilung entlang des Darmes nachgewiesen. Für den Peptidtransporter 1
(PEPT1), einem Aufnahmetransporter für Di- und Tripeptide aus der Nahrung sowie für
peptidmimetische Arzneistoffe, wie ß-Lactam-Antibiotika (Amoxicillin, Cefadroxil), ACE-
Hemmer (Captopril, Enalapril und Fosinopril) und Virustatika (Valaciclovir und Oseltamivir)
wurde die Lokalisation anhand von mRNA-Expressionsdaten untersucht [39]. Vom
Duodenum zum Colon wurde ein abnehmendes Vorkommen des Transporters beschrieben
[39-42]. Für das Duodenum, Jejunum und Ileum konnten diese Daten mit Hilfe von
Proteinuntersuchungen bestätigt werden [40]. Es konnte bereits bestätigt werden, dass eine
erhöhte Absorption von Oligopeptiden in proximalen Darmabschnitten erfolgt, sodass von
einem Absorptionsfenster im oberen Dünndarm gesprochen werden kann [43, 44]. Für den
Effluxtransporter ABCB1, besser bekannt als P-Glycoprotein, konnte auf mRNA- und
Proteinebene eine zunehmende Verteilung in den distalen Bereichen des Darms
nachgewiesen werden [39, 40, 45-47]. Dies erklärt die verringerte Absorption von
Arzneistoffen wie Talinolol in distalen Darmabschnitten, da diese durch den ABCB1-
Transporter aus der Zelle zurück in das Lumen transportiert werden [48, 49].
Metabolisierende Enzyme, die in der Darmwand lokalisiert sind, können ebenfalls im distalen
Darmabschnitt verstärkt oder vermindert vorkommen, oder über den gesamten Bereich
gleichmäßig lokalisiert sein. Für das Cytochrom P450 Isoenzym 3A4 (CYP3A4) wurde eine
Abnahme des Vorkommens in distalen Bereichen des Darms ermittelt. Das erhöhte
Vorkommen an CYP3A4 in oberen Dünndarmabschnitten [50] kann zu einer verstärkten
Biotransformation und damit zu einer verringerten Bioverfügbarkeit von Arzneistoffen, wie
zum Beispiel Simvastatin, in proximalen Bereichen führen [51]. Die oben genannten
Beispiele verdeutlichen somit, dass das intestinale Vorkommen von Transportern und
Enzymen eine effektive Absorptionsbarriere darstellen kann und somit die orale
Bioverfügbarkeit von Arzneistoffen verringern kann.
Einleitung
7
1.2 Einfluss der physikochemischen Eigenschaften des Arzneistoffes und der
Arzneiform auf die Arzneistoffabsorption
1.2.1 Physikochemische Eigenschaften des Arzneistoffes
Die physikochemischen Eigenschaften eines Arzneistoffes können die intestinale Absorption
und damit dessen orale Bioverfügbarkeit beeinflussen. Dies ist vor allem für passiv
transportierte Arzneistoffe von Bedeutung, da dieser Prozess unter anderem durch die
Arzneistoffeigenschaften Molekulargewicht, Lipophilie, Löslichkeit und Ladung bestimmt
wird.
Der Zusammenhang zwischen der Lipophilie und der Aufnahme von Stoffen durch eine
Lipidmembran wurde bereits 1899 von Overton beschrieben [52]. Nachfolgende Arbeiten
zeigten, dass der Einfluss des Molekulargewichtes und der Ladung ebenfalls berücksichtigt
werden muss [53, 54]. Die Beeinflussung der Absorption durch den Ionisierungsgrad des
Stoffes kann anhand der HENDERSON-HASSELBALCH-GLEICHUNG beschrieben werden, die
hier für Säuren dargestellt ist [54]:
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + log𝑐𝑖𝑜𝑛𝑖𝑠𝑖𝑒𝑟𝑡
𝑐𝑢𝑛𝑖𝑜𝑛𝑖𝑠𝑖𝑒𝑟𝑡 (Gleichung 3).
Nach der HENDERSON-HASSELBALCH-GLEICHUNG gibt der pKa-Wert eines Stoffes an, bei
welchem pH-Wert die Hälfte des ionisierbaren Arzneistoffes geladen vorliegt. Geladene
Arzneistoffe sind im Allgemeinen besser wasserlöslich, aber schlechter permeabel als die
lipophilere ungeladene Form des Arzneistoffes. Durch den pKa-Wert des Stoffes und den pH-
Wert des Mediums sind somit dessen Lipophilie und Löslichkeit als Einflussfaktoren für die
Absorption festgelegt. Die Kenntnis des pH-Verlaufes im Gastrointestinaltrakt ermöglicht es
dementsprechend Voraussagen zur Löslichkeit eines Arzneistoffes in den betreffenden
Abschnitten des Verdauungstraktes zu treffen, wenn keine weiteren Einflussfaktoren, wie der
Einschluss des Arzneistoffes in Gallensalzmizellen, auftreten. Zusätzlich kann die intestinale
Permeabilität abgeschätzt werden, wenn die Diffusion den Hauptabsorptionsmechanismus
darstellt.
Lipinski et al. haben für den Zusammenhang zwischen physikochemischen Eigenschaften
eines Arzneistoffes und dessen Absorption über passiven Transport eine als RULE OF FIVE
bekannte Regel aufgestellt [55]. Es handelt sich dabei um eine Sammlung von Faktoren, die
die Wahrscheinlichkeit einer verringerten Absorption eines Arzneistoffes im Gastrointestinal-
trakt erhöhen. Dazu zählen ein Molekulargewicht über 500 Da und ein LogP-Wert über 5. Für
Einleitung
8
Stoffe mit mehr als fünf Donatoren und mehr als zehn Akzeptoren von Wasserstoffbrücken,
wird ebenfalls eine verringerte Absorption vorausgesagt, da dies den Transport durch die
lipophilen Membranen hemmt. Als Ausnahme von der Regel werden die Stoffe angesehen,
die Substrate für Transporter sind [55], da hier der passive Transport eine untergeordnete
Rolle bei der Absorption einnimmt.
1.2.2 BCS-Klassifizierung des Arzneistoffes und dessen Einfluss auf die Formulierung der
Arzneiform
Von Amidon et al. wurden die Parameter Löslichkeit und Permeabilität vorgeschlagen, um
das In vivo-Verhalten von Arzneistoffen vorherzusagen [56]. Dafür wurde das
BIOPHARMACEUTICS CLASSIFICATION SYSTEM (BCS) entwickelt. Bei dieser Klassifizierung
werden die Arzneistoffe in Abhängigkeit von ihrer Löslichkeit in Wasser und ihrer intestinalen
Permeabilität in die BCS-Klassen I bis IV eingeteilt (Abbildung 2).
Abbildung 2: Biopharmaceutics Classification System [56].
Für Arzneistoffe mit hoher Löslichkeit und hoher Permeabilität (BCS-Klasse I), hat die
Formulierung der Arzneiform gewöhnlich einen geringen Einfluss auf das In vivo-Verhalten
der Substanz. Bei Stoffen der Klasse II limitieren Ausmaß und Geschwindigkeit der
Freisetzung aus der Arzneiform die Absorption des Arzneistoffes. Dies ist mit Problemen
bezüglich der Löslichkeit oder Lösungsgeschwindigkeit zu erklären. Durch den Zusatz von
Tensiden oder Komplexbildnern, wie zum Beispiel Cyclodextrinen, kann eine Optimierung
der Löslichkeit erreicht werden. Die Verringerung der Teilchengröße kann in einer erhöhten
Lösungsgeschwindigkeit resultieren, wenn dabei keine Aggregate gebildet werden. Die
Permeation ist der kritische Schritt bei der Aufnahme von Arzneistoffen der BCS-Klasse III in
den systemischen Kreislauf. Bei Vorliegen linearer Absorptionsprozesse kann die absolut
Einleitung
9
aufgenommene Arzneistoffmenge erhöht werden, indem die zur Verfügung gestellte Dosis
erhöht wird. Die Arzneistoffe der Klasse IV sind durch eine geringe Löslichkeit und geringe
Permeabilität gekennzeichnet. Um die Eigenschaften dieser Stoffe hinsichtlich der
Absorption zu optimieren, können die bisher beschriebenen Maßnahmen angewendet
werden. Eine reduzierte interindividuelle Bioverfügbarkeit der Arzneistoffe der Klasse IV kann
ebenfalls mit diesen Maßnahmen erreicht werden [57, 58].
Als Besonderheiten einer negativen Beeinflussung der Absorption gelten die Bildung von
unlöslichen Komplexen mit Bestandteilen des Gastrointestinaltraktes, zum Beispiel die
Komplexbildung von Fluorchinolonen und Metallionen, die Instabilität des Arzneistoffes im
Gastrointestinaltrakt, zum Beispiel die Degradation von Erythromycin durch Magensäure
oder die enzymatische Hydrolyse von Peptiden und Proteinen [56, 58].
1.3 Prinzipien der Untersuchung der intestinalen Arzneistoffabsorption
Die Untersuchung von intestinalen Absorptionsprozessen kann über direkte und indirekte
Methoden erfolgen. In beiden Fällen wird ein Arzneistoff an verschiedenen Orten des
Gastrointestinaltraktes in das Lumen eingebracht. Für die Bestimmung der Arzneistoff-
absorption mit der indirekten Methode wird anschließend das Auftreten des Stoffes in der
systemischen Zirkulation über die Erstellung von Blutspiegel- und/oder Urinausscheidungs-
kurven erfasst. Bei Nutzung der direkten Methode wird das Verschwinden des Arzneistoffes
aus dem Darmlumen über die Gewinnung und Quantifizierung von Aspirationsproben
bestimmt [59]. Zur besseren Charakterisierung der Absorptionsprozesse können beide
Methoden auch kombiniert werden.
1.3.1 Indirekte Methoden
Zu den indirekten Methoden zählt die nicht invasive Applikation von modifizierten
Arzneiformen, wie zum Beispiel Tabletten und Kapseln. Je nach Freisetzungsprinzip, zum
Beispiel durch Änderung des pH-Wertes oder bakteriellen Abbau, wird die Freigabe des
Arzneistoffes im Bereich des Dünn- oder Dickdarmes erreicht [60]. Zudem besteht die
Möglichkeit Kapseln mit einem Arzneistoffreservoir zu verabreichen. In Abhängigkeit vom
Kapseltyp kann der Arzneistoff als Lösung, Pulver, Granulat oder Minitablette formuliert in
der Kapsel vorliegen. Die Bestimmung der intestinalen Lokalisation der Kapsel erfolgt
hauptsächlich mit konventionellen Verfahren wie der Fluoroskopie oder Szintigraphie. Nach
Erreichen des vorgesehenen Ortes im Gastrointestinaltrakt erfolgt die Freigabe des
gesamten Kapselinhaltes durch Radiowellen oder magnetische Wechselwirkungen [61]. Von
Einleitung
10
Gröning et al. wurde eine Kapsel entwickelt, die den Arzneistoff über Radiowellen gesteuert
zu unterschiedlichen Zeiten freigeben kann [62].
Den indirekten Methoden wird weiterhin die minimalinvasive Applikation einer Kapsel mit
anhängender einlumiger Sonde zugeordnet. Nachdem die Kapsel oral appliziert wurde, kann
die erreichte Position im Gastrointestinaltrakt durch Befestigung der Sonde im
Wangenbereich des Probanden beibehalten werden. Die Lokalisation im Gastrointestinaltrakt
wird über die applizierte Sondenlänge bestimmt. Dieses System kann sowohl für die
einmalige Applikation von Pulvern oder Pellets als auch für die mehrmalige Applikation von
Lösungen verwendet werden. Dabei können Arzneistofflösungen zeitversetzt an
unterschiedlichen Orten im Gastrointestinaltrakt verabreicht werden, nachdem die Kapsel
über die natürliche Peristaltik zum nächsten Untersuchungsort transportiert wurde. Die
Bestimmung der regionalen Absorption von Arzneistoffen kann mit diesem System jedoch
nur über die Interpretation von Plasmakonzentrationen erfolgen [63].
1.3.2 Direkte Methoden
Die invasive Applikation von mehrlumigen Sonden kann zur direkten Bestimmung der intra-
luminalen Stoffkonzentration genutzt werden. Anfang des 20. Jahrhunderts wurden diese
Systeme zur Bestimmung der Zusammensetzung intraluminaler Flüssigkeiten verwendet
[64]. Die regiospezifische Absorption von Wasser und Nährstoffen, wie Glucose, Proteine
und Fette, wurde ebenfalls bestimmt [65]. Später rückte die Bestimmung der Arzneistoff-
absorption in den Vordergrund [59, 66, 67]. Dabei wurden verschiedene Sonden zur
Untersuchung der Absorption von Arzneistoffen verwendet (Abbildung 3). Bei allen Varianten
wird eine Öffnung der Sonde (Perfusionsport) genutzt, um ein definiertes Darmsegment mit
einer Länge von 10 bis 45 cm mit einer Arzneistofflösung zu perfundieren [68-70].
Einleitung
11
Abbildung 3: Schematische Darstellung verschiedener Sondentypen.
Die Aspiration von Proben (Aspirationsport) erfolgt dann an einer (zweilumige Sonde) oder
mehreren Stellen (drei- und mehrlumige Sonden), wobei die Absorption nur für das definierte
Darmsegment bestimmt werden kann. Für die Untersuchung eines weiteren Darm-
abschnittes ist der Weitertransport des Systems durch die natürliche Peristaltik oder ein
erneutes Applizieren des Systems nötig. Das perfundierte Darmsegment kann durch einen
aufblasbaren Ballon am proximalen Ende oder durch zwei aufblasbare Ballons am
proximalen und distalen Ende vom restlichen Darm abgeschirmt werden. Der Einfluss der
aufblasbaren Ballons auf die Absorption wurde in verschiedenen Studien untersucht. Dabei
wurde kein Unterschied zwischen der Verwendung von Systemen mit aufgeblasenem oder
nicht aufgeblasenem Ballon festgestellt. Weiterhin wird die Physiologie des
Verdauungstraktes kaum durch die applizierten Sonden beeinflusst. Durch den Einsatz von
nicht resorbierbaren Markersubstanzen, wie zum Beispiel Polyethylenglykol, konnte eine
Verbesserung der Genauigkeit der Methode erreicht werden [59, 69, 71-74]. Als kritisch sind
jedoch die angewendeten Flussraten zu betrachten. Die kontinuierliche Perfusion der
Darmsegmente mit Flussraten von bis zu 20 mL/min kann zu einer Dehnung des Darmes
Einleitung
12
führen [66, 75]. In Abhängigkeit von der Flussrate können somit die Peristaltik und die
Durchblutung verändert werden. Der veränderte intestinale Transport kann die Lokalisation
des Arzneistoffes beeinflussen und damit dessen gemessene regionale Konzentration. Eine
Beeinflussung der intestinalen Blutzirkulation kann die natürliche Funktion des Darmes und
damit auch die Absorption des Arzneistoffes beeinträchtigen [71, 76]. Zusätzlich kann der
intestinale Wasserhaushalt durch die kontinuierliche Perfusion verändert werden. Die
einzelnen Flüssigkeitsnester im Dünndarm, die im nüchternen Zustand vorhanden sind [17],
werden durch größere Volumina der Perfusionslösung ersetzt. Damit ändern sich auch die
intraluminalen Bedingungen am Ort der Absorption.
Von Brouwers et al. wurde die Perfusion eines Darmsegments durch die orale Applikation
einer Arzneiform mit Wasser ersetzt [74]. Zur direkten Bestimmung der Arzneistoff-
konzentration im Dünndarm wurden zwei unabhängig voneinander arbeitende Sonden im
Duodenum und Jejunum platziert. Mit diesem Studiendesign konnte der Einfluss der
Freigabecharakteristik der Arzneiform im Zusammenhang mit den dynamischen
Bedingungen im Gastrointestinaltrakt untersucht werden. Die Aspiration von Proben erfolgte
in diesem Fall gleichzeitig im Duodenum und Jejunum. Die aspirierten Probenvolumina
variierten zwischen 0 und 10 mL, sodass der intestinale Wasserhaushalt ebenfalls
beeinflusst wurde [74].
1.4 Verwendung der Mikroperfusion mit offenem Fluss zur Bestimmung von
Stoffkonzentrationen
Eine weitere Möglichkeit zur Bestimmung von Stoffkonzentrationen, ist die Mikroperfusion
mit offenem Fluss (OFM) [77-79]. Bisher wurde diese Technik beim Menschen in der Haut
sowie beim Tier im Gehirn angewendet. Ein OFM-System besteht aus einer Sonde mit
makroskopischen Öffnungen und zwei angeschlossenen Pumpen im PUSH-PULL-Modus
(Abbildung 4). Das Perfusat wird dabei durch das System gepumpt und die Proben werden
mit der gleichen Flussrate aus dem System entfernt. Dabei ist auf die Einstellung und
Beibehaltung einer konstanten Flussrate für beiden Pumpen zu achten. Das System wird
kontinuierlich mit einer geringen Flussrate von 0,25 bis 2 µL/min perfundiert, sodass Proben
über einen längeren Zeitraum von 1 bis 2 h gesammelt werden, insofern sie nicht sofort
online analysiert werden. Die Entfernung der gewonnen Proben aus dem System ist ohne
Beeinflussung des PUSH-PULL-Modus der Pumpen durchzuführen.
Einleitung
13
Abbildung 4: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus Mikroperfusion mit offenem Fluss
(aus [78]).
Im Vergleich zur Mikrodialyse fehlt bei diesen Sonden eine Membran, durch die der
Stoffaustausch vonstattengeht. Stattdessen sind makroskopische Öffnungen zum
Stoffaustausch durch Konvektion vorhanden. Dadurch können größere oder lipophilere
Moleküle, wie zum Beispiel Proteine, aus dem Donor-Kompartiment in die Proben überführt
und später analysiert werden. Ein großer Nachteil ist allerdings die aufwändige
Vorbehandlung der gewonnenen Proben, zum Beispiel durch Flüssig-Flüssig-Extraktion, und
die Analyse der Zielmoleküle mit speziellen Methoden wie der SPE-MS/MS (Festphasen-
extraktion mit Tandem-Massenspektrometer) oder LC-MS/MS (Flüssigkeitschromatographie
mit Tandem-Massenspektrometer) [78, 80]. Dieser Aufwand ist für die Untersuchung der
Stoffkonzentration gerechtfertigt, wenn alternative Techniken, wie zum Beispiel die
Mikrodialyse, zur Probengewinnung nicht eingesetzt werden können.
1.5 Verwendung der Mikrodialyse zur Bestimmung von Stoffkonzentrationen
Die Mikrodialyse ist eine Technik, mit der geringe Konzentrationen eines ungebundenen
Stoffes in Geweben und Organen bestimmt werden können. Grundlage ist der
Stoffaustausch durch eine semipermeable Membran ohne Beeinflussung der beteiligten
Flüssigkeitsvolumina. Die Molekülmassen-Ausschlussgrenze der Membran bezeichnet dabei
die Molekülmasse von Stoffen, die zu 90 % von der Membran zurückgehalten werden, das
Einleitung
14
heißt die Membran nicht passieren können. Ein Stoff mit einer entsprechend geringen
Molekülmasse kann somit aus dem Donor-Kompartiment, zum Beispiel der interstitiellen
Flüssigkeit, in das Akzeptor-Kompartiment, das Perfusat, diffundieren bis sich ein
Gleichgewicht eingestellt hat. Das Perfusat wird nach Passage der semipermeablen
Membran als Dialysat aufgefangen. Im Allgemeinen wird die Perfusionsflüssigkeit mit
Flussraten zwischen 0,1 und 5,0 µL/min kontinuierlich durch das System transportiert [81,
82]. Die verwendeten Flussraten bedingen ein geringes Probenvolumen des Dialysats und
entsprechend große Zeitabstände, um diese Volumen aufzufangen.
1974 erfolgte von Ungerstedt und Pycock der erste Einsatz der Mikrodialyse zur Bestimmung
des Neurotransmitters Dopamin im Gehirn von Ratten [83]. Dabei wurde eine einzelne
Hohlfaserkapillare mit einem Außendurchmesser von 0,25 mm implantiert und kontinuierlich
perfundiert. Der verwendete Aufbau entspricht der Darstellung in Abbildung 5. Die Stabilität
dieser einzeln verwendeten Hohlfaserkapillaren konnte durch einen sehr dünnen, in das
Lumen der Kapillare eingebrachten, Draht erhöht werden [84]. Somit konnte der Einsatz
ebenfalls in weichen, beweglichen Gewebestrukturen wie der Darmwand erfolgen.
Abbildung 5: Einzelne Hohlfaserkapillare (schraffiert) mit angebrachten Schläuchen (aus [85]).
Später wurden häufig Mikrodialysesonden mit definierter Geometrie (konzentrisches oder
lineares Sondendesign, Abbildung 6), Membrandurchmessern und -längen, eingesetzt [81,
86]. Die ersten Mikrodialysesonden mit konzentrischem Design wiesen einen Außen-
durchmesser von 0,5 mm und eine Membranlänge von 2, 4 oder 10 mm auf [87]. Heutzutage
sind Mikrodialysesonden mit Membranaußendurchmessern von 0,24 bis 0,5 mm und
Membranlängen von 1 bis 10 mm kommerziell erhältlich. Dabei sind verschiedene
Membranmaterialien, wie zum Beispiel Cuprophan, Polyarylethersulfon, Polyethersulfon und
Polyacrylnitril verfügbar. Konzentrische Mikrodialysesonden weisen den Vorteil auf, dass sie
über einen einzelnen Zugang im Gehirn, in Blutgefäßen oder in Organen platziert werden
können. Die geringe Flexibilität dieses Sondentyps führt zu einer hohen mechanischen
Stabilität, sodass eine präzise Sondenplatzierung erfolgen kann [88]. Mikrodialysesonden mit
linearem Design sind mit Cuprophan-, Polyethersulfon und Polyacrylnitrilmembranen und
einer Membranlänge von 5 bis 10 mm im Handel erhältlich. Sie werden aufgrund ihres
flexiblen Designs vorwiegend in peripheren Geweben angewendet. Da für diesen Sondentyp
Einleitung
15
ein Ein- und Austritt aus dem Gewebe erfolgt, kann der Untersuchungsort bei der
Implantation genau festgelegt werden [88].
Abbildung 6: Mikrodialysesonden, A: konzentrisches Design, B: lineares Design (aus [89]).
Über die Jahre etablierte sich die Mikrodialysetechnik in der Grundlagenforschung zur
Bestimmung von endogenen Stoffen, wie Adrenalin, Acetylcholin, Histamin, Lactat und
Pyruvat [90-93]. Die Methode wurde nicht nur in verschiedenen Tieren wie zum Beispiel
Raten, Schweinen und Pferden, sondern auch am Menschen eingesetzt [90-92, 94]. Dabei
wurden diverse Gewebe und Organe wie der Dünndarm, das Gehirn, das Herz und die
Lunge untersucht [85]. Die humane Anwendung der Mikrodialyse erfolgte unter anderem, um
die Konzentrationen oral oder intravenös verabreichter Arzneistoffe in der Haut, dem Wirkort
der Substanzen, zu bestimmen [95, 96]. Gemessene Blutspiegelkurven weisen in diesen
Fällen nur eine geringe Korrelation mit der Arzneistoffkonzentration in der Haut auf und damit
mit dessen Wirkung.
Der Gastrointestinaltrakt wurde bereits in Tierstudien mit der Technik der Mikrodialyse
untersucht. Bei Schweinen wurden gewebespezifische metabolische Veränderungen des
Verdauungstraktes mit dieser Technik bestimmt. Dafür wurden die Mikrodialysesonden nach
der Laparotomie mit oder ohne Nadel in der Darmwand oder im Lumen platziert [84, 97]. Zur
Untersuchung der metabolischen Veränderungen des humanen Gastrointestinaltraktes
wurde ebenfalls die intraperitoneale Mikrodialyse genutzt [98, 99]. Die intraperitoneale und
intraluminale Mikrodialyse wurde simultan von Pynnönen et al. in einer Studie am Menschen
angewendet [100]. Dabei wurden die intraluminalen Mikrodialysesonden im Rahmen einer
A B
Einleitung
16
Duodenopankreatektomie durch einen Schnitt in der Darmwand verlegt. Die Notwendigkeit
intraluminale, intramukosale oder intraperitoneale Mikrodialysesonden mit chirurgischen
Maßnahmen am Untersuchungsort zu platzieren, resultiert jedoch in einer fehlenden breiten
humanen Anwendung der Mikrodialysetechnik.
1.6 Zielstellung
Das Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war die Entwicklung und In vitro-
Charakterisierung eines oral anwendbaren Mikrodialysesystems zur Ermittlung von
Arzneistoffkonzentrationen im Dünndarmlumen des Menschen, mit dessen Hilfe die
komplexen Abläufe, die im Rahmen der intestinalen Absorption von Arzneistoffen auftreten,
untersucht werden können.
Das Mikrodialysesystem sollte unter Berücksichtigung der bisher für diesen Zweck
verwendeten Systeme entwickelt werden. Grundlegende Anforderungen waren Flexibilität
und Robustheit des Schlauchsystems, verbunden mit minimalen Durchmessern des
Gesamtsystems. Zudem sollte bei der Auswahl der Materialien darauf geachtet werden, dass
biokompatible Materialen, die gegenüber körpereigenen Stoffen des Gastrointestinaltraktes
und den eingesetzten Arznei- und Hilfsstoffen inert sind, eingesetzt werden und die
kombinierte Anwendung des Systems mit bildgebenden Verfahren, wie beispielsweise der
Magnetresonanztomographie (MRT), gewährleistet werden kann. Intestinale Proben sollten
innerhalb sehr kurzer Zeitabstände mit einem ausreichend großen Volumen und möglichst
ohne Verunreinigung durch vorherige oder nachfolgende Proben gewonnen und quantifiziert
werden. Zur gleichzeitigen Erfassung der lokalen Arzneistoffkonzentration an verschiedenen
Orten sollte das System mehrere Messstellen enthalten. Bei der Entwicklung sollte
außerdem darauf geachtet werden, dass der intestinale Wasserhaushalt nicht beeinträchtigt
wird. Weitere Anforderungen stellten die Reproduzierbarkeit der Herstellung der
Mikrodialysesysteme und der damit bestimmten Ergebnisse dar.
Im Anschluss an die Entwicklung sollte das Mikrodialysesystem umfangreich in vitro
charakterisiert werden. Zur Etablierung des Versuchsaufbaus und des Versuchsablaufes
sollten der Einfluss der Rührgeschwindigkeit und des für die Homogenisation verwendeten
Gerätes sowie der Einfluss der Equilibrierzeit auf die relative Wiederfindung des
Arzneistoffes im Dialysat bestimmt werden. Anschließend sollte die Sensitivität des
Mikrodialysesystems hinsichtlich der quantitativen Arzneistoffbestimmung ermittelt werden.
In weiterführenden Untersuchungen sollte dann der Einfluss der Nutzungsdauer eines
einzelnen Mikrodialysesystems, des Donor-Mediums und des Perfusats auf die relative
Einleitung
17
Wiederfindung ermittelt werden. Abschließend sollte die Sensitivität des Systems unter
Verwendung biorelevanter Bedingungen untersucht werden.
Um die Anwendung des Mikrodialysesystems im Menschen zu ermöglichen, sollte in einem
weiteren Schritt eine Adaption des Systems an die humanen Gegebenheiten erfolgen.
Hierbei lag der Fokus hauptsächlich auf der Anpassung der Größe des Mikrodialysesystems
an die humanen Gegebenheiten. Anschließend sollte die Funktionsfähigkeit des adaptierten
Mikrodialysesystems hinsichtlich der Reproduzierbarkeit der Herstellung und des Einflusses
der verwendeten Materialien überprüft werden. Weiterhin sollte untersucht werden, inwieweit
der pH-Wert im Donor-Kompartiment in den Dialysatproben abgebildet werden kann.
Abschließend stellte sich zudem die Frage, ob die Pumpen der Firma Braun, die zur
Anwendung am menschlichen Körper zugelassen sind, für die Verwendung mit dem
Mikrodialysesystem geeignet sind.
Mit der Entwicklung, Adaption und In vitro-Charakterisierung des Mikrodialysesystems sowie
der Identifizierung von geeigneten Pumpen sollte letztlich ein einsatzfertiges System zur
Bestimmung von intestinalen Arzneistoffkonzentrationen im Menschen zur Verfügung
stehen.
Einleitung
18
Material und Methoden
19
2 Material und Methoden
Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Geräte, Chemikalien und Materialien inklusive
ihrer jeweiligen Bezugsquellen sind im Anhang tabellarisch aufgeführt (Abschnitt 7.1 bis 7.3).
2.1 Arzneistoffe und Medien
2.1.1 Arzneistoffe
Die physikochemischen Eigenschaften der verwendeten Arzneistoffe Paracetamol,
Amoxicillin-Trihydrat (Amoxicillin) und Valsartan sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Tabelle 1: Eigenschaften der Arzneistoffe Paracetamol, Amoxicillin-Trihydrat und Valsartan.
Eigenschaften Paracetamol Amoxicillin-Trihydrat Valsartan
Molekulargewicht 151,2 g/mol
[101]
419,4 g/mol
[101]
435,5 g/mol
[101]
pKa-Wert 9,56
[102]
2,67, 7,11 und 9,55
[103]
3,9 und 4,73
[104]
Löslichkeit in
Wasser
14,7 g/L (20 °C)
23,7 g/L (37 °C)
[105]
4,49 g/L (20 °C)
5,45 g/L (37 °C)
[103]
0,12 g/L bei pH 2,3 (20 °C)
0,71 g/L bei pH 8,4 (20 °C)
[106]
BCS-Klasse I und III
[105, 107]
III
[108]
III
[107]
Chemische
Struktur
3 H2O
Material und Methoden
20
2.1.2 Medien und Arzneistofflösungen
Zur Prüfung des Mikrodialysesystems wurden verschiedene Medien als Lösungsmittel für
den jeweiligen Arzneistoff genutzt. Dabei fanden Phosphatpuffer pH 6,8 USP und Salzsäure
pH 1,2 Anwendung. Um den Einfluss biorelevanter Medien zu untersuchen, wurden ein
Bicarbonatpuffer pH 6,8, angelehnt an die Zusammensetzung der aspirierten humanen
Dünndarmflüssigkeit nach Lindahl et al. [109], Fasted State Simulated Intestinal Fluid
(FaSSIF) und Fed State Simulated Intestinal Fluid (FeSSIF) als Lösungsmittel eingesetzt. Als
Perfusionsmedien wurden Phosphatpuffer pH 6,8 USP und Isotone Kochsalz-Lösung 0,9 %
Braun Infusionslösung (NaCl-Lösung) verwendet. Der pH-Wert der NaCl-Lösung wurde bei
Bedarf mit Natriumhydroxid-Lösung beziehungsweise Salzsäure auf den entsprechenden
pH-Wert eingestellt. Zur Verdünnung der Proben, die FaSSIF und FeSSIF als Lösungsmittel
enthielten, wurden die gallensalzfreien Medien blank FaSSIF und blank FeSSIF verwendet.
Die detaillierte Zusammensetzung der verwendeten Puffer und biorelevanten Medien ist in
den Tabellen 2 und 3 dargestellt.
Tabelle 2: Zusammensetzung des Phosphatpuffers pH 6,8 USP [110] und des Bicarbonatpuffers
pH 6,8.
Phosphatpuffer pH 6,8 USP
Kaliumdihydrogenphosphat, wasserfrei 6,805 g
0,2 M Natriumhydroxid-Lösung 112 mL
Gereinigtes Wasser ad 1000,0 mL
Bicarbonatpuffer pH 6,8
Natriumchlorid 2,66 g
Kaliumchlorid 0,66 g
Calciumchlorid-Dihydrat 0,047 g
0,001 M Salzsäure ad 1000,0 mL
Natriumchlorid-Lösung, gesättigt 16,66 mL
Natriumhydrogencarbonat-Lösung, gesättigt q.s. ad pH 6,8
Material und Methoden
21
Tabelle 3: Zusammensetzung von FaSSIF, blank FaSSIF, FeSSIF und blank FeSSIF [111].
FaSSIF blank FaSSIF FeSSIF blank FeSSIF
SIF® Powder Original* 2,24 g - 11,2 g -
Natriumdihydrogen-
phosphat-Monohydrat 3,95 g 3,95 g - -
Eisessig - - 8,65 g 8,65 g
Natriumchlorid 6,19 g 6,19 g 11,874 g 11,874 g
Natriumhydroxid q.s. ad pH 6,5 q.s. ad pH 6,5 q.s. ad pH 5,0 q.s. ad pH 5,0
Gereinigtes Wasser ad 1000,0 mL ad 1000,0 mL ad 1000,0 mL ad 1000,0 mL
* enthält Natriumtaurocholat und Lecithin im Verhältnis 4:1
Die In vitro-Untersuchungen erfolgten mit Arzneistofflösungen der Konzentrationen 0,02 und
2,00 g/L für Paracetamol und Amoxicillin sowie 0,016 und 0,16 g/L für Valsartan. Für die
Untersuchung der Sensitivität des Mikrodialysesystems wurde mit doppelt so hoch
konzentrierten Lösungen (0,04 und 4 g/L Paracetamol oder Amoxicillin sowie 0,032 und
0,32 g/L Valsartan) gearbeitet. Alle Lösungen wurden vor Beginn der Versuche frisch
hergestellt und bis zur Verwendung vor Licht geschützt aufbewahrt.
2.2 Entwicklung eines oral anwendbaren Mikrodialysesystems
Die Grundlage für die im Rahmen dieser Arbeit erfolgte Entwicklung eines oral anwendbaren
Mikrodialysesystems bildeten die bisher zur Bestimmung von intraluminalen Arzneistoff-
konzentrationen im humanen Dünndarm angewendeten mehrlumigen Sonden (siehe 1.3.2).
Es wurde ein oral anwendbares Mikrodialysesystem (schematische Darstellung in
Abbildung 7) entwickelt, dass überwiegend aus elastischen Schläuchen besteht. Der
verwendete Silikonschlauch Tygon® 3350 ist platinvernetzt und biokompatibel [112]. Das
Schlauchsystem besteht aus einem Zuflussschlauch (Abbildung 7, Z) sowie einem
Ablaufschlauch (Abbildung 7, A) mit einer jeweiligen Länge von 500 oder 2500 mm, einem
Innendurchmesser von 1,85 mm und einem Außendurchmesser von 3,67 mm. Zur
Bestimmung der Arzneistoffkonzentration ist zusätzlich eine flexible Mikrodialyseeinheit
(Abbildung 7, M) enthalten.
Material und Methoden
22
Abbildung 7: Schematische Darstellung des Mikrodialysesystems mit Mikrodialyseeinheit (M),
Zufluss- (Z) und Ablaufschlauch (A).
Die Mikrodialyseeinheit ist aus semipermeablen Hohlfaserkapillaren aus Fresenius
Polysulfon® aufgebaut (Abbildung 8).
Abbildung 8: Fresenius Polysufon® Hohlfaserkapillaren.
Eine einzelne Hohlfaserkapillare besitzt einen Innendurchmesser von 200 µm, eine
Wandstärke von 40 µm und eine Molekülmassen-Ausschlussgrenze von 5000 Da. Die
rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen der Kapillaroberfläche, des Kapillarquer-
schnitts und der porösen Polysulfon-Membran sind in Abbildung 9 A-C dargestellt.
Abbildung 9: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Fresenius Polysufon® Hohlfaser-
kapillaren, A: Kapillaroberfläche, B: Kapillarquerschnitt, C: semipermeable Kapillar-
membran.
Material und Methoden
23
Zur Herstellung einer Mikrodialyseeinheit wurden im finalen Mikrodialysesystem
30 semipermeable Kapillaren an den Enden mit dem Zwei-Komponenten-Epoxid-Klebstoff
Loctite® M-31Cl, der für den Einsatz in Medizinprodukten zugelassen ist, verklebt [113]. Dies
erfolgte zuerst durch Einrollen der mit Klebstoff getränkten Kapillaren in Folie
(Abbildung 10 A) und später durch Einbettung der mit Klebstoff getränkten Kapillaren in einer
Silikonmanschette (Abbildung 10 B und C).
Abbildung 10: Mikrodialyseeinheit während des endständigen Verklebens der Kapillaren, A: Einrollen
in Folie, B und C: Einbetten in Silikonmanschetten.
Alle untersuchten Mikrodialyseeinheiten wurden vor ihrer Verwendung auf Kapillar-
durchlässigkeit untersucht. Dafür wurde die Mikrodialyseeinheit nach dem endständigen
Verkleben mit gereinigtem Wasser perfundiert und der Austritt der Wassertropfen aus jeder
einzelnen Kapillare optisch überprüft (Abbildung 11). Nach dem Entfernen der
überstehenden Kapillaren wurden die Silikonschläuche mit dem Medizinprodukte-Klebstoff
Loctite® 4011 [114] an beiden Enden der Mikrodialyseeinheit fixiert.
Material und Methoden
24
Abbildung 11: Versuchsaufbau für die Überprüfung der Kapillardurchlässigkeit.
Für die Versuchsdurchführung mit dem diskontinuierlichen Fluss (unter 2.3.2 beschrieben)
wurde in das Mikrodialysesystem ein zusätzlicher Schlauch (Abbildung 12, L) eingefügt.
Über diesen Schlauch (Länge: 500 oder 2500 mm, Innendurchmesser: 0,64 mm,
Außendurchmesser: 2,46 mm) wird die Luft zum Abtrennen der Proben im Ablaufschlauch
zugeführt.
Abbildung 12: Schematische Darstellung des Mikrodialysesystems mit Mikrodialyseeinheit (M),
Zufluss- (Z) und Ablaufschlauch (A), sowie einem Schlauch zum Abtrennen der
Proben mit Hilfe von Luftblasen (L).
2.3 Versuchsaufbau und Versuchsablauf
Die In vitro-Untersuchungen wurden mit dem entwickelten Mikrodialysesystem, mit und ohne
zusätzlichen Luftschlauch, durchgeführt. Für die einzelnen Untersuchungen kamen der
Versuchsaufbau und -ablauf mit dem kontinuierlichen und diskontinuierlichen Fluss des
Perfusats zum Einsatz, welche in den folgenden Abschnitten näher erläutert werden.
2.3.1 Versuchsaufbau für den kontinuierlichen und diskontinuierlichen Fluss
Für den Versuchsaufbau mit dem kontinuierlichen Perfusatfluss wurde das
Mikrodialysesystem mit Mikrodialyseeinheit, einem Zu- und Ablaufschlauch verwendet
Material und Methoden
25
(vergleiche Abbildung 7). Die Mikrodialyseeinheit wurde in eine Schottflasche mit Deckel,
gefüllt mit 0,25 L der entsprechenden Arzneistofflösung, eingebracht (Abbildung 13). Das
jeweilige Perfusionsmedium wurde mit einer Flussrate von 1 mL/min mittels einer
Schlauchpumpe kontinuierlich durch das Mikrodialysesystem transportiert. Währenddessen
konnte im Bereich der Mikrodialyseeinheit mit den semipermeablen Kapillaren ein
Stoffaustausch zwischen dem Donor-Kompartiment (Arzneistofflösung in der Schottflasche)
und Akzeptor-Kompartiment (Perfusat) stattfinden. Im Abstand von 1 min wurden
Dialysatproben mit einem Volumen von circa 300 µL manuell in Mikroreaktionsgefäßen
aufgefangen.
Abbildung 13: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus mit kontinuierlichem Fluss.
Der Versuchsaufbau mit dem diskontinuierlichen Fluss des Perfusats wurde unter
Verwendung des Mikrodialysesystems mit einem zusätzlichen Luftschlauch genutzt
(vergleiche Abbildung 12). Die Mikrodialyseeinheit wurde ebenfalls in das Donor-
Kompartiment, das 0,25 L Arzneistofflösung enthielt, eingebracht (Abbildung 14). Eine
Schlauchpumpe wurde zum diskontinuierlichen Transport des Durchflussmediums durch das
Mikrodialysesystem genutzt. Dabei wurde die identische Flussrate von 1 mL/min verwendet.
Während der Fluss des Perfusats pausierte, konnte ein Stoffaustausch zwischen der Lösung
im Donor-Kompartiment und dem Perfusat durch die semipermeablen Kapillaren der
Mikrodialyseeinheit erfolgen. Die Arzneistoffmoleküle konnten bei diesem Versuchsaufbau
über einen variablen Zeitraum von 1, 5 oder 60 min durch die Kapillarmembran diffundieren.
Zeitgleich wurde durch eine weitere Schlauchpumpe für 30 s Luft durch den Luftschlauch in
den Ablaufschlauch gepumpt, um die erhaltenen Proben im Ablaufschlauch voneinander zu
Material und Methoden
26
trennen. Nach Verlassen des Ablaufschlauches wurden die Dialysatproben (circa 300 µL)
einzeln in Mikroreaktionsgefäßen aufgefangen.
Abbildung 14: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus mit diskontinuierlichem Fluss.
Die Arzneistofflösungen im Donor-Kompartiment wurden bei Raumtemperatur (20 °C) oder
bei Körpertemperatur (37 °C, temperiertes Wasserbad) ohne aktive Durchmischung oder
mit einem Magnetrührer beziehungsweise mit einem Horizontalschüttler homogenisiert
verwendet.
2.3.2 Versuchsablauf für den kontinuierlichen und diskontinuierlichen Fluss
Die Charakterisierung des Mikrodialysesystems erfolgte durch Untersuchung des Einflusses
verschiedener Parameter auf die relative Wiederfindung (RR) der Arzneistoffe. In Anlehnung
an frühere Arbeiten [87, 115] wurde das Verhältnis der Konzentration des Arzneistoffes im
Dialysat (cDialysat) zur Konzentration des Arzneistoffes im Donor-Kompartiment (cDonor-Medium)
als relative Wiederfindung definiert. In dieser Arbeit wurde sie nach folgender Gleichung
berechnet:
𝑅𝑅 (%) = 𝑐𝐷𝑖𝑎𝑙𝑦𝑠𝑎𝑡
𝑐𝐷𝑜𝑛𝑜𝑟−𝑀𝑒𝑑𝑖𝑢𝑚 ∙ 100 (Gleichung 4).
Material und Methoden
27
Zur Bestimmung der relativen Wiederfindung des Arzneistoffes wurden die
Versuchsaufbauten mit dem kontinuierlichen und diskontinuierlichen Fluss verwendet. Die
entsprechende Arzneistofflösung wurde in das Donor-Gefäß gegeben und die
Mikrodialyseeinheit in dieses Donor-Kompartiment eingebracht. Dialysatproben wurden beim
Versuchsaufbau mit dem kontinuierlichen Fluss minütlich und beim diskontinuierlichen Fluss
nach einem Zeitraum von 1, 5 oder 60 min aufgefangen. Dieser Zeitraum wurde im Rahmen
dieser Arbeit als Equilibrierzeit definiert. Der zeitliche Ablauf der Experimente mit
kontinuierlichem und diskontinuierlichem Flusses mit einer Equilibrierzeit von 1 min ist in der
Abbildung 15 schematisch dargestellt. Für jeden Einzelversuch wurden 12 Dialysatproben
aufgefangen. Die Ausnahme bildeten die Experimente mit 60 min Equilibrierzeit, bei denen
jeweils drei Proben pro Einzelversuch aufgefangen wurden. Die Probenentnahme (Volumen
300 μL) aus dem Donor-Gefäß erfolgte zu Beginn und am Ende jedes Versuches. Alle
Versuche wurden, wenn nicht anders angegeben, als Dreifachbestimmung durchgeführt.
Abbildung 15: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Experimente, A: kontinuierlicher
Fluss, B: diskontinuierlicher Fluss mit einer Equilibrierzeit von 1 min.
Die Bestimmung der Sensitivität des Mikrodialysesystems erfolgte, indem untersucht wurde,
ob Konzentrationsänderungen im Donor-Kompartiment zeitnah in den Dialysatproben
abgebildet werden können. Die Arzneistoffkonzentration in den Dialysatproben wurde dabei
durch Multiplikation der gemessenen Arzneistoffkonzentration mit dem Skalierungsfaktor
(SF) ermittelt. Der Skalierungsfaktor wurde unter Einbeziehung der relativen Wiederfindung
nach folgender Gleichung berechnet:
𝑆𝐹 (%) = 1
𝑅𝑅 ∙ 100 (Gleichung 5).
Material und Methoden
28
Die Experimente wurden mit dem kontinuierlichen und diskontinuierlichen Fluss mit einer
Equilibrierzeit von 1 min bei Körpertemperatur mit dem Mikrodialysesystem durchgeführt. Bei
diesen Untersuchungen wurde die Mikrodialyseeinheit in ein Donor-Gefäß mit 1 L
Fassungsvermögen eingebracht. 0,25 L arzneistofffreies Medium wurde in das Donor-Gefäß
gegeben, sodass die Mikrodialyseeinheit komplett mit Medium bedeckt war. Nachdem fünf
Dialysatproben gewonnen wurden, erfolgte die Zugabe von 0,25 L Arzneistofflösung, sodass
nach Homogenisation des Mediums (Magnetrührer, 100 Umdrehungen pro Minute) eine
theoretische Konzentration von 0,02 und 2,00 g/L für Paracetamol und Amoxicillin sowie
0,016 und 0,16 g/ L für Valsartan im Donor-Kompartiment resultierte. Nach dem Auffangen
von fünf weiteren Dialysatproben wurden 0,5 L des arzneistofffreien Mediums hinzugefügt,
um die Arzneistoffkonzentration im Donor-Kompartiment zu reduzieren. Es resultierten
theoretische Konzentrationen von 0,01 und 1,0 g/L für Paracetamol und Amoxicillin und
0,008 und 0,08 g/L für Valsartan. Danach wurden fünf weitere Dialysatproben aufgefangen.
Die fehlende Equilibrierzeit beim kontinuierlichen Fluss des Perfusats und die Equilibrierzeit
von 1 min beim diskontinuierlichen Fluss führten zu leicht unterschiedlichen zeitlichen
Abläufen während dieses Versuches (Abbildung 16). Die Probenentnahme (Volumen
300 μL) aus dem Donor-Gefäß erfolgte zu Beginn des Versuches sowie nach Zugabe der
Arzneistofflösung und des arzneistofffreien Mediums. Die Experimente wurden, wenn nicht
anders angegeben, als Dreifachbestimmung durchgeführt.
Abbildung 16: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Experimente zur Bestimmung
der Empfindlichkeit des Mikrodialysesystems, A: kontinuierlicher Fluss,
B: diskontinuierlicher Fluss mit einer Equilibrierzeit von 1 min.
Material und Methoden
29
Vor jedem Versuchsbeginn wurde das Mikrodialysesystem für 10 min equilibriert. Dabei
wurde die in der Donor-Lösung befindliche Mikrodialyseeinheit kontinuierlich perfundiert und
das erhaltene Dialysat verworfen. Nach jedem Versuch wurde die Mikrodialyseeinheit mit
dem entsprechenden Medium oder Phosphatpuffer pH 6,8 USP gespült, um ein
arzneistofffreies Mikrodialysesystem für das nächste Experiment zur Verfügung zu haben.
Nach Versuchsende erfolgte die Reinigung des Mikrodialysesystems durch Spülen mit
gereinigtem Wasser. Anschließend wurde das enthaltene Wasser entfernt und das
Mikrodialysesystem bis zur nächsten Verwendung trocken und vor Beschädigung geschützt
gelagert.
Die Arzneistoffkonzentration in den Proben wurde mit Hilfe der UV-Spektroskopie oder der
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit UV-Detektion bestimmt. Die
Quantifizierung der Arzneistoffe erfolgte bei den in Tabelle 4 gezeigten Wellenlängen und
Retentionszeiten.
Tabelle 4: Detektionswellenlängen und Retentionszeiten der untersuchten Arzneistoffe.
Arzneistoff UV-mini1240 Merck Hitachi HPLC-Anlage Shimadzu HPLC-Anlage
Wellenlänge Wellenlänge Retentionszeit Wellenlänge Retentionszeit
Paracetamol 242 nm 230 nm 2,1 min 242 nm 2,1 min
Amoxicillin 229 nm 230 nm 1,4 min - -
Valsartan 249 nm 230 nm 6,2 min - -
Die UV-metrische Konzentrationsbestimmung der Arzneistoffe in den Dialysat- oder Donor-
Proben mit Phosphatpuffer pH 6,8 USP, Salzsäure pH 1,2, Bicarbonatpuffer pH 6,8 oder
NaCl-Lösung erfolgte nach einer 1:5 beziehungsweise 1:100 Verdünnung gegen eine
Blindprobe unter Verwendung einer Halbmikro-Küvette (Schichtdicke 10 mm) und des
Shimadzu UV-mini1240 Gerätes. Die Verdünnung erfolgte mit den in Tabelle 5 angegeben
Medien. Zusätzlich wurden die im Rahmen der Arbeit erhobenen Daten der Bestimmungs-
grenze tabelliert.
Material und Methoden
30
Tabelle 5: Medien zur Verdünnung der Proben zur UV-metrischen Bestimmung der
Arzneistoffkonzentration sowie die entsprechende Bestimmungsgrenze;
PCM: Paracetamol, AMX: Amoxicillin und VAL: Valsartan, PP: Phosphatpuffer pH 6,8
USP, HCl: Salzsäure pH 1,2, BP: Bicarbonatpuffer pH 6,8.
Arzneistoff/Donor-
Medium//Perfusat
Donor-
Kompartiment Dialysat
Bestimmungsgrenze
(g/L)
PCM/PP//PP PP PP 0,0005
PCM/HCl//PP HCl PP 0,0005
PCM/BP//PP BP PP 0,0005
PCM/PP//NaCl-Lösung PP PP 0,0005
AMX/PP//PP PP PP 0,001
AMX/PP//NaCl-Lösung PP PP 0,001
VAL/PP//PP PP PP 0,0005
VAL/PP//NaCl-Lösung PP PP 0,0004
Die Chromatographie wurde mit einer LiChroCART® 125-4 Säule mit vorgeschalteter
LiChroCART® 4-4 Vorsäule durchgeführt. Die simultane Quantifizierung der Arzneistoffe
Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan erfolgte mit der Merck Hitachi HPLC-Anlage.
Methanol und ein 10-fach verdünnter Phosphatpuffer pH 6,8 USP dienten bei einer Flussrate
von 1 mL/min als Elutionsmittel. Die Eluenten wurden als Gradient durch die Anlage
gepumpt. Der zeitliche Verlauf des verwendeten Gradienten ist in Abbildung 17 A aufgeführt.
Die Proben wurden unverdünnt oder wenn nötig 1:20 verdünnt (Tabelle 6) bei 35 °C
Säulentemperatur vermessen. Das Injektionsvolumen betrug jeweils 30 μL. Die
Quantifizierung von Paracetamol in den Proben der Experimente mit FaSSIF und FeSSIF
erfolgte mit der Shimadzu HPLC-Anlage. Die Proben wurden unverdünnt oder bei Bedarf
1:100 verdünnt vermessen (Tabelle 6). Das Elutionsmittel bestand aus Acetonitril und 0,02 M
Acetatpuffer pH 4,0, dessen Zusammensetzung in Tabelle 7 angegeben ist. Die Analyse
erfolgte bei einer Flussrate von 1,0 mL/min und einer Säulentemperatur von 35 °C. Das
Laufmittel wurde als Gradient durch die Anlage gepumpt (Abbildung 17 B). Pro Probe
wurden 10 μL injiziert. Die entsprechenden Bestimmungsgrenzen sind für alle Arzneistoffe in
Tabelle 5 aufgeführt. Die Integration der Flächen und die Berechnung der Peakhöhen und -
flächen erfolgten bei beiden HPLC-Anlagen mit dem Programm Shimadzu Class VP.
Material und Methoden
31
Abbildung 17: Zusammensetzung des Elutionsmittels, A: für die simultane Analyse von Paracetamol,
Amoxicillin und Valsartan in Phosphatpuffer pH 6,8 USP, B: für die Analyse von
Paracetamol in Fasted State Simulated Intestinal Fluid und Fed State Simulated
Intestinal Fluid.
Tabelle 6: Medien zur Verdünnung der Proben zur Bestimmung der Arzneistoffkonzentration
mittels HPLC sowie die entsprechende Bestimmungsgrenze; PCM: Paracetamol,
AMX: Amoxicillin und VAL: Valsartan, PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP,
FaSSIF: Fasted State Simulated Intestinal Fluid, FeSSIF: Fed State Simulated
Intestinal Fluid.
Arzneistoff/Arzneistoff/
Arzneistoff//Donor-
Medium///Perfusat
Donor-
Kompartiment Dialysat
Bestimmungsgrenze
(g/L)
PCM/AMX/VAL//PP///PP PP PP 0,0005/0,0005/0,00032
PCM//FaSSIF///PP blank FaSSIF blank FaSSIF 0,0005
PCM//FeSSIF///PP blank FeSSIF blank FeSSIF 0,0005
Tabelle 7: Zusammensetzung des 0,02 M Acetat-Puffers pH 4,0.
0,02 M Acetat-Puffer pH 4,0
Natriumacetat, wasserfrei 1,64 g
Eisessig q.s. ad pH 4,0
Gereinigtes Wasser ad 1000,0 mL
A B
Material und Methoden
32
2.4 In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems
Alle Versuche zur Prüfung des Mikrodialysesystems wurden wie unter 2.3.2 beschrieben
durchgeführt. Dabei wurde, wenn nicht anders angegeben, bei Körpertemperatur mit
Phosphatpuffer pH 6,8 USP als Lösungsmittel, als arzneistofffreies Medium und als Perfusat
sowie mit Paracetamol als Arzneistoff gearbeitet. Außerdem wurde der Versuchsablauf
diskontinuierlicher Fluss mit einer Equilibrierzeit von 1 min verwendet. Die Durchmischung
der Arzneistofflösung erfolgte mit einem Magnetrührer bei 100 Umdrehungen pro Minute.
2.4.1 Untersuchungen zur Etablierung des Versuchsaufbaus und des Versuchsablaufes
Für In vitro-Untersuchungen werden Versuchsaufbauten und -abläufe benötigt, die einen
hohen Grad an Standardisierung bieten und reproduzierbare Ergebnisse liefern. Aus diesem
Grund wurden der Einfluss der Homogenisierung des Donor-Mediums sowie der Einfluss der
Equilibrierzeit und der Temperatur auf die relative Wiederfindung des Arzneistoffes bestimmt.
2.4.1.1 Einfluss der Rührgeschwindigkeit und des für die Homogenisation verwendeten
Gerätes auf die relative Wiederfindung
Der Einfluss der Rührgeschwindigkeit und des für die Homogenisation verwendeten Gerätes
wurde mit dem kontinuierlichen Fluss bei Raumtemperatur bestimmt. Es wurden
Experimente ohne und mit Durchmischung der Donor-Lösung durchgeführt. Zur
Homogenisierung diente ein Horizontalschüttler mit 100 Bewegungen pro Minute sowie ein
Magnetrührer mit 100, 200 und 300 Umdrehungen pro Minute. Die ermittelten Werte für die
relative Wiederfindung sind Mittelwerte (MW) aus 3 bis 5 Einzelwerten.
2.4.1.2 Einfluss der Equilibrierzeit und der Temperatur auf die relative Wiederfindung
Weiterhin wurde der Einfluss unterschiedlicher Equilibrierzeiten auf den Stofftransport durch
die Kapillarmembran bei Raumtemperatur und Körpertemperatur untersucht. Die
Verwendung des kontinuierlichen Perfusatflusses entspricht einer Equilibrierzeit von 0 min.
Der Versuchsablauf mit dem diskontinuierlichen Fluss des Perfusats wurde mit variablen
Equilibrierzeiten von 1, 5 und 60 min genutzt. Mit Paracetamol wurden alle Equilibrierzeiten
untersucht. Für Amoxicillin und Valsartan erfolgte die Untersuchung des Einflusses von
1 und 5 min dauernden Equilibrierzeiten auf die relative Wiederfindung. Die erhaltenen
Ergebnisse sind Mittelwerte aus 1 bis 3 Einzeluntersuchungen.
Material und Methoden
33
2.4.2 Bestimmung der Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Konzentrationsänderungen
Die Empfindlichkeit des Mikrodialysesystems wurde mit beiden Versuchsabläufen
untersucht. Der Unterschied bestand in der sofortigen Abtrennung der Dialysatproben im
Ablaufschlauch durch Luftblasen beim diskontinuierlichen Fluss, welche bei der Verwendung
des kontinuierlichen Flusses fehlte. Paracetamol wurde in den Untersuchungen mit dem
kontinuierlichen und diskontinuierlichen Fluss genutzt, während Amoxicillin und Valsartan nur
für die Untersuchungen mit dem diskontinuierlichen Fluss verwendet wurden. Die drei
Arzneistoffe Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan wurden in einem Einzelexperiment auch
simultan verwendet.
2.4.3 Einfluss verschiedener Parameter auf die relative Wiederfindung bei Anwendung des
diskontinuierlichen Flusses
2.4.3.1 Einfluss der Nutzungsdauer auf die relative Wiederfindung
Zur Bestimmung des Einflusses der Nutzungsdauer der Mikrodialysesysteme wurde ein
repräsentatives System an 14 aufeinanderfolgenden Untersuchungstagen für unter-
schiedliche Experimente genutzt. Der Zeitraum der Lagerung wurde dabei nicht
berücksichtigt. An acht verschiedenen Tagen innerhalb dieses Intervalls wurde die relative
Wiederfindung für Paracetamol bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses mit einer
Equilibrierzeit von 1 min bestimmt. Diese Ergebnisse wurden zur Beurteilung der
Nutzungsdauer verwendet. An den anderen Tagen wurde das Mikrodialysesystem für
Experimente mit abweichenden Equilibrierzeiten verwendet. Das Mikrodialysesystem wurde
regelmäßig nach den einzelnen Versuchen und zum Versuchsende gespült und bis zur
Verwendung am nächsten Versuchstag trocken gelagert.
2.4.3.2 Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Herstellung
Alle Mikrodialysesysteme wurden einzeln in Handarbeit hergestellt. Die Reproduzierbarkeit
der Herstellung der jeweiligen Mikrodialysesysteme wurde durch den Vergleich der relativen
Wiederfindung des Arzneistoffes von jeweils acht (Paracetamol) oder vier (Amoxicillin und
Valsartan) verschiedenen Systemen untersucht.
Material und Methoden
34
2.4.3.3 Einfluss des Donor-Mediums auf die relative Wiederfindung
Phosphatpuffer pH 6,8 USP diente im Allgemeinen als Lösungsmittel für die verwendeten
Arzneistoffe und damit als Referenzwert für deren relative Wiederfindung. Der Einfluss von
Salzsäure pH 1,2 und den biorelevanten Medien Bicarbonatpuffer pH 6,8, FaSSIF und
FeSSIF als Lösungsmittel für den Arzneistoff Paracetamol auf den Stofftransport durch die
Kapillarmembran wurde in diesem Experiment untersucht.
2.4.3.4 Einfluss des Perfusats auf die relative Wiederfindung
Aufgrund der geplanten humanen Anwendung des Mikrodialysesystems, wurden
Untersuchungen mit dem Fertigarzneimittel Isotone Kochsalz-Lösung 0,9 % Braun
Infusionslösung (NaCl-Lösung) als Perfusat durchgeführt. Laut Produktspezifikation des
Herstellers kann die NaCl-Lösung pH-Werte zwischen pH 4,5 und 7,0 aufweisen. Um die
Grenzbedingungen im Versuch darzustellen, wurde die NaCl-Lösung vor ihrer Verwendung
mit Salzsäure beziehungsweise Natriumhydroxid-Lösung auf pH 4,5 oder 7,0 eingestellt. Die
Experimente wurden mit den drei Arzneistoffen Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan
durchgeführt.
2.4.4 Bestimmung der Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Verwendung biorelevanter
Medien
Die Sensitivität des Mikrodialysesystems wurde zusätzlich zu dem verwendeten
Phosphatpuffer pH 6,8 USP (siehe 2.4.2) mit Salzsäure pH 1,2 und den biorelevanten
Medien Bicarbonatpuffer pH 6,8, FaSSIF und FeSSIF als Donor-Medium untersucht.
2.4.5 Bestimmung der Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Anwendung im
Röhrenmodell
Eine Annäherung des Versuchsaufbaus an die Anatomie des Dünndarms erfolgte durch die
Anwendung des Mikrodialysesystems im Röhrenmodell. Dafür wurde ein circa 2,5 m langer
Kunststoffschlauch mit einem Innendurchmesser von annähernd 2 cm und einem
Fassungsvolumen von circa 0,6 L als Reservoir für die Donor-Lösung genutzt. Das
Mikrodialysesystem wurde circa 0,5 m tief in den beidseitig offenen Kunststoffschlauch
eingebracht (Abbildung 18). Zur Bestimmung der Paracetamol-Konzentration direkt an der
Mikrodialyseeinheit wurden Proben mit Hilfe eines weiteren Schlauches, dessen Ende auf
Material und Methoden
35
Höhe der Mikrodialyseeinheit platziert war, aus dem Donor-Kompartiment entnommen. Der
Kunststoffschlauch wurde in einem Wasserbad auf Körpertemperatur temperiert. Um eine
mögliche durch die Atembewegung verursachte Durchmischung zu simulieren, wurde der
Kunststoffschlauch mit 12 vertikalen Bewegungen pro Minute leicht bewegt. In diesem
Versuch wurde das Gesamtvolumen der Untersuchungslösungen von 1 L auf 0,4 L
verringert, da die Kapazität des Kunststoffschlauches begrenzt war. Zu Beginn des
Versuches wurde 0,1 L arzneistofffreies Medium über einen Trichter in den
Kunststoffschlauch eingefüllt, sodass die Mikrodialyseeinheit komplett mit Flüssigkeit
bedeckt war. Die anschließende Zugabe der Arzneistofflösung sowie das abschließende
Einbringen des arzneistofffreien Mediums führten zur Füllung des Kunststoffschlauches in
weiter distal liegenden Bereichen.
Abbildung 18: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus für die Bestimmung der Sensitivität
des Mikrodialysesystems bei Anwendung im Röhrenmodell.
Material und Methoden
36
2.5 Adaption und In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems für eine mögliche
humane Anwendung
Die vorgesehene humane Anwendung des Mikrodialysesystems führte zu einer Kooperation
mit dem Medizinproduktehersteller RoweMed (Parchim, Deutschland). In Zusammenarbeit
erfolgte die Adaption des Mikrodialysesystems nach arbeitskreisinternen Vorgaben durch die
Firma RoweMed und anschließend dessen Produktion.
Die Prüfung des adaptierten Mikrodialysesystems und der entsprechenden Pumpen erfolgte,
wenn nicht anders angegeben, bei Körpertemperatur mit Phosphatpuffer pH 6,8 USP als
Lösungsmittel und als Perfusat sowie mit Paracetamol als Arzneistoff. Der Versuchsablauf
des diskontinuierlichen Flusses wurde mit einer Equilibrierzeit von 1 min verwendet. Die
Homogenisierung der Arzneistofflösung erfolgte bei 100 Umdrehungen pro Minute mit einem
Magnetrührer.
2.5.1 Adaption des Mikrodialysesystems
Das bisher verwendete Mikrodialysesystem wurde an die Anwendung im Menschen
angepasst, indem zum einen die Gesamtlänge des Systems verändert wurde und zum
anderen zwei Mikrodialysesysteme in einem Set verarbeitet wurden. Für die Herstellung der
Sets wurden zwei verschiedene biokompatible Silikonschläuche mit Innendurchmessern von
jeweils 1,0 mm für den Zufluss- und Ablaufschlauch (Medicoplast- und Versilic®-Schlauch,
Außendurchmesser 3,0 und 2,0 mm) und 1,0 mm (Medicoplast-Schlauch, Außen-
durchmesser 3,0 mm) sowie 0,5 mm (Versilic®-Schlauch, Außendurchmesser 1,5 mm) für
den Luftschlauch verwendet. Die einzelnen Polysulfon-Kapillaren wurden verklebt, indem sie
in Loctite® M-31Cl Klebstoff eingebettet und von einer Silikonmanschette umhüllt wurden. Die
Prüfung der Kapillardurchlässigkeit der Mikrodialyseeinheiten erfolgte analog der
Prüfungsvorschrift der eigenen Herstellung. Das Verbinden der einzelnen Komponenten und
das Verkleben aller Bestandteile erfolgte mit dem Silikon Elastosil®. Am distalen Ende des
Mikrodialysesystems wurde ein Zuggewicht mit Titankugeln angebracht. Als letzter
Herstellungsschritt wurde eine Sterilisation mit Ethylenoxid durchgeführt. Die hergestellten
adaptierten Mikrodialysesets enthielten pro Set zwei komplett gefertigte, funktionstüchtige
Mikrodialysesysteme, die einzeln für In vitro-Untersuchungen genutzt wurden.
Material und Methoden
37
2.5.2 In vitro-Prüfung des adaptierten Mikrodialysesystems
Zur Beurteilung der externen Herstellung der adaptierten Mikrodialysesysteme durch
RoweMed und des Einflusses der modifizierten Bestandteile wurde die relative
Wiederfindung des Arzneistoffes Paracetamol von acht angefertigten Systemen bestimmt
und mit den Ergebnissen der bisher hergestellten Mikrodialysesysteme verglichen (siehe
2.4.3.2).
2.5.3 Bestimmung des pH-Wertes im Donor-Kompartiment über die Analyse der
Dialysatproben
Zur Bestimmung der Lokalisation der Mikrodialyseeinheit im Magen oder Dünndarm des
Probanden soll der pH-Wert des Dialysats dienen. Aus diesem Grund wurden mit dem
Versuchsablauf des diskontinuierlichen Flusses mit einer Equilibrierzeit von 1 min pro
Versuch jeweils zehn Dialysatproben (300 µL) aufgefangen und pH-metrisch mit der
Hamilton® Minitrode untersucht. Als Durchflussmedien wurden Phosphatpuffer pH 6,8 USP
und NaCl-Lösung pH 5,5 genutzt. Im Donor-Kompartiment wurden jeweils 0,25 L Salzsäure
mit einem eingestellten Wert von pH 1,2; 3,0; 4,0; 5,0 oder Phosphatpuffer pH 6,8 USP
verwendet.
2.5.4 Evaluation der Braun Infusomat® und Perfusor® Space Pumpen
Die humane Anwendung des Mikrodialysesystems erfordert die Nutzung von CE-
zertifizierten Pumpen, die zum Einsatz am Menschen zugelassen sind. Die Braun Infusomat®
und Perfusor® Space Pumpen erfüllen diese Anforderungen. Zusätzlich sind beide Pumpen
im Minutenabstand programmierbar. Zur Beurteilung der Eignung der Braun Infusomat® und
Perfusor® Space Pumpen für den Versuchsaufbau mit dem diskontinuierlichen Fluss wurden
Untersuchungen mit veränderten Versuchsabläufen durchgeführt. Die Infusomat® Space
Schlauchpumpen wurden für diese Experimente mit einem Infusomat® Space Line Set und
die Perfusor® Space Spritzenpumpen mit 20 mL- und 50 mL-Spritzen bestückt. Bei
unterschiedlichen Zeiten für den Transport des Perfusats (15 bis 18 s) und für die
Equilibrierung (42 bis 60 s) wurde die relative Wiederfindung für Paracetamol bei
Verwendung eines repräsentativen Mikrodialysesystems ermittelt. Für diese Versuche
wurden ebenfalls die bisher verwendeten MCP-Schlauchpumpen genutzt, deren Ergebnisse
für die relative Wiederfindung als Referenz dienten. Jedes Ergebnis ist ein Mittelwert aus
jeweils drei Einzelversuchen für die hoch und niedrig konzentrierte Paracetamol-Lösung.
Material und Methoden
38
Ergebnisse
39
3 Ergebnisse
3.1 Entwicklung eines oral anwendbaren Mikrodialysesystems
Das neuartige Mikrodialysesystem (Abbildung 19) wurde entwickelt, um intraluminale
Arzneistoffkonzentrationen im humanen Dünndarm zu bestimmen. Es wurde ein flexibles
aber dennoch robustes System aus biokompatiblen und MRT-geeigneten Materialien
entwickelt und hergestellt.
Abbildung 19: Mikrodialysesystem mit Mikrodialyseeinheit (M), Zufluss- (Z) und Ablaufschlauch (A).
Für das Schlauchsystem wurde ein Schlauch mit einem Innendurchmesser von 1,85 mm
verwendet. Daraufhin wurde der Außendurchmesser der verklebten Kapillaren auf diesen
Durchmesser begrenzt. Die theoretisch für diesen Durchmesser benötigten
Mikrodialysekapillaren wurden mit 43 Stück berechnet. In der Praxis erwies sich diese
Anzahl als nicht praktikabel, da der Klebstoff zwischen den einzelnen Kapillaren ebenfalls
Raum beanspruchte. Daraufhin wurde die Anzahl der Kapillaren reduziert und mit dem
Verkleben durch Einrollen in Folie begonnen. Ein beidseitig verklebtes Kapillarbündel ist in
Abbildung 20 I A abgebildet. Zuerst wurden endständige Verklebungen erzielt, die
undurchlässige oder deformierte Kapillaren beinhalteten. Die Verbesserung der
Herstellungstechnik führte zu Verklebungen, bei denen die Kapillaren durchlässig und
größtenteils von Klebstoff umgeben waren (Abbildung 20 I B). Allerdings ist erkennbar, dass
bei dieser Herstellungstechnik eine tropfenförmige Verklebung der Kapillaren erhalten wurde.
Ergebnisse
40
Daraufhin wurde die Herstellung der endständigen Verklebungen nochmals optimiert. Durch
Einbettung der klebstoffgetränkten Kapillaren in eine Silikonmanschette konnten
Kapillarbündel mit kreisförmigen Verklebungen mit einem Außendurchmesser von 1,85 mm
hergestellt werden (Abbildung 20 II A). In der Abbildung 20 II B sind die Lumen der einzelnen
Kapillaren und das luftblasenfreie Verkleben der semipermeablen Kapillaren erkennbar. Die
finale Mikrodialyseeinheit enthielt 30 Kapillaren.
Abbildung 20: Endständig verklebte Mikrodialysekapillaren, I: Herstellung durch Einrollen in Folie,
II: Herstellung durch Einbettung in Silikonmanschette, A: Detailansicht, B: Querschnitt.
Die hergestellten Mikrodialyseeinheiten wurden vor ihrer Weiterverarbeitung auf Kapillar-
durchlässigkeit untersucht. Dafür wurde die Mikrodialyseeinheit mit gereinigtem Wasser
perfundiert. Dann erfolgte die optische Überprüfung des Austritts der Wassertropfen aus
jeder einzelnen Kapillare (Abbildung 21). Die hergestellten Mikrodialyseeinheiten wurden nur
zur Herstellung von Mikrodialysesystemen genutzt, wenn alle 30 Kapillaren durchlässig
waren. Die in den Versuchen verwendeten Mikrodialyseeinheiten waren circa 12 cm lang
und auf einer Länge von 10 cm für den Stoffaustausch geeignet. Damit ergibt sich eine
berechnete Stoffaustauschfläche von circa 26 cm2 und ein Gesamtkapillarinnenvolumen von
circa 100 µL.
Ergebnisse
41
Abbildung 21: Mikrodialyseeinheit während der Prüfung auf Kapillardurchlässigkeit.
Eine Modifizierung des Mikrodialysesystems für die Versuchsdurchführung mit dem
diskontinuierlichen Perfusatfluss (unter 2.3.2 beschrieben) erfolgte durch das Einfügen eines
zusätzlichen Schlauches zum Abtrennen der Proben durch Luftblasen (Abbildung 22, L).
Abbildung 22: Mikrodialysesystem mit Mikrodialyseeinheit (M), Zufluss- (Z) und Ablaufschlauch (A),
sowie einem Schlauch zum Abtrennen der Proben mit Hilfe von Luftblasen (L).
Für die Anwendung des Mikrodialysesystems im Menschen wird eine Bestimmung der
Arzneistoffkonzentration an verschiedenen Stellen im Dünndarm angestrebt. Durch
Kombination von zwei einzelnen Mikrodialysesystemen kann dies erreicht werden
(Abbildung 23). Zur Stabilisierung der zurücklaufenden Schläuche und zum Vorwärts-
transport des Systems im Dünndarm wurde ein Zuggewicht mit Titankugeln angebracht
(Abbildung 23, G).
Ergebnisse
42
Abbildung 23: Mikrodialyseset mit je zwei Mikrodialyseeinheiten (M), Zufluss- und Ablaufschläuchen,
Schläuchen zum Abtrennen der Proben mit Hilfe von Luftblasen und einem
Zuggewicht (G).
Die nachfolgend beschriebenen Ergebnisse der In vitro-Untersuchungen wurden mit den
Mikrodialysesystemen, die in den Abbildungen 19 und 22 dargestellt sind, durchgeführt.
3.2 In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems
3.2.1 Untersuchungen zur Etablierung des Versuchsaufbaus und des Versuchsablaufes
3.2.1.1 Einfluss der Rührgeschwindigkeit und des für die Homogenisation verwendeten
Gerätes auf die relative Wiederfindung
Der Einfluss der Rührgeschwindigkeit und des für die Homogenisation verwendeten Gerätes
auf die relative Wiederfindung wurde für Paracetamol mit dem kontinuierlichen Fluss ohne
sowie mit Homogenisation bei Raumtemperatur bestimmt. Die fehlende Durchmischung der
Donor-Lösung führte für die niedrig konzentrierte Paracetamol-Lösung zu relativen
Wiederfindungen von 10,0 ± 2,3 % (Abbildung 24). Für die hohe Paracetamol-Konzentration
wurden mit 16,5 ± 7,8 % vergleichsweise höhere Abweichungen zwischen den Einzelwerten
erhalten. Die Homogenisierung der Arzneistofflösung mit einem Horizontalschüttler bei
100 Bewegungen pro Minute führte zu einer höheren relativen Wiederfindung von 27,9 % mit
einer niedrigeren Standardabweichung von 1,1 %. Der Einfluss der Durchmischung bei
Nutzung eines Magnetrührers wurde mit Rührgeschwindigkeiten von 100 bis
300 Umdrehungen pro Minute untersucht. Alle getesteten Rührgeschwindigkeiten wiesen mit
relativen Wiederfindungen im Bereich von 34,0 bis 38,0 % nur einen geringen Unterschied
innerhalb dieser Gruppe auf. Bei der Nutzung der Rührgeschwindigkeiten von 200 und
300 Umdrehungen pro Minute war eine starke Bewegung der Mikrodialyseeinheit durch die
Strömungskräfte des Donor-Mediums zu beobachten. Da solche Kräfte in vivo im nüchternen
Ergebnisse
43
Zustand nicht anzunehmen sind, die Mikrodialysesysteme aber beschädigt werden können
und dadurch eine Mehrfachanwendung in vitro nicht möglich gewesen wäre, wurde für die
nachfolgend aufgeführten Experimente der Magnetrührer mit 100 Umdrehungen pro Minute
eingesetzt.
Abbildung 24: Einfluss unterschiedlicher Rührgeschwindigkeiten und Geräte auf die relative
Wiederfindung (RR) von Paracetamol (PCM) bei Anwendung des kontinuierlichen
Flusses bei Raumtemperatur, HS: Horizontalschüttler, MR: Magnetrührer,
PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP (MW + SD, n = 3 - 5).
3.2.1.2 Einfluss der Equilibrierzeit und der Temperatur auf die relative Wiederfindung
Der Einfluss der Equilibrierzeit auf die relative Wiederfindung wurde für alle drei Arzneistoffe
Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan bei Raum- und Körpertemperatur ermittelt. Für
Paracetamol wurden Untersuchungen mit Equilibrierzeiten von 0, 1, 5 und 60 min
durchgeführt. Das Fehlen einer Equilibrierphase resultierte bei Raumtemperatur in relativen
Wiederfindungen von durchschnittlich 28 %. Die Untersuchungen mit einer Equilibrierzeit von
1 bis 60 min führten zu doppelt so hohen Werten für die relative Wiederfindung, wobei nur
geringe Unterschiede (53,6 bis 60,5 %) zwischen den einzelnen Equilibrierzeiten zu
verzeichnen waren (Abbildung 25 A). Der Anstieg der Untersuchungstemperatur auf 37 °C
führte bei allen Untersuchungen zu einer Erhöhung der relativen Wiederfindung. Für
Versuche ohne Equilibrierung betrug die relative Wiederfindung im Mittel 47,3 %, während
für die Nutzung der Equilibrierzeiten von 1 bis 60 min ein deutlicher Anstieg auf
durchschnittlich 62,7 bis 68,4 % bestimmt wurde (Abbildung 25 B).
Ergebnisse
44
Abbildung 25: Einfluss der Equilibrierzeit auf die relative Wiederfindung (RR) von Paracetamol
(PCM) bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei A: Raumtemperatur und
B: Körpertemperatur, PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP (MW + SD, n = 3, * n = 1,
** nicht bestimmt).
Die Experimente mit Amoxicillin und Valsartan wurden mit einer Equilibrierzeit von 1 und
5 min ausgeführt. Die Ergebnisse für Amoxicillin sind in der Abbildung 26 I A und I B
graphisch dargestellt. Bei Raumtemperatur ergab sich für die Equilibrierzeit von 1 min eine
mittlere relative Wiederfindung von 40,5 % gegenüber einem durchschnittlichen Wert von
43,3 % bei Erhöhung der Equilibrierzeit auf 5 min. Untersuchungen bei Körpertemperatur
resultierten in leicht erhöhten Werten von durchschnittlich 49,6 und 52,5 % für die 1 und
5 minütige Equilibrierzeit. Für Valsartan wurden ähnliche Ergebnisse erhalten. Bei
Raumtemperatur lag die relative Wiederfindung durchschnittlich bei 40,8 % für eine
Equilibrierzeit von 1 min und bei 44,9 % bei 5 min (Abbildung 26 II A). Die
Temperaturerhöhung auf 37 °C resultierte in einem Anstieg der relativen Wiederfindung auf
durchschnittlich 48,2 und 51,3 % (Abbildung 26 II B). Die höher konzentrierten
Arzneistofflösungen wiesen im Allgemeinen etwas niedrigere relative Wiederfindungen als
die geringer konzentrierten Arzneistofflösungen auf.
B
** *
A
Ergebnisse
45
Abbildung 26: Einfluss der Equilibrierzeit auf die relative Wiederfindung (RR) von I: Amoxicillin (AMX)
und II: Valsartan (VAL) bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei
A: Raumtemperatur und B: Körpertemperatur, PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP
(MW + SD, n = 3).
Die geringen Unterschiede in der relativen Wiederfindung zwischen den Equilibrierzeiten von
1 und 60 min für Paracetamol beziehungsweise 1 und 5 min für Amoxicillin und Valsartan
führten, wenn nicht anders angegeben, zur ausschließlichen Anwendung des
diskontinuierlichen Flusses mit einer 1 min andauernden Equilibrierzeit in den nachfolgend
aufgeführten Experimenten.
Zur besseren Veranschaulichung wurden die Ergebnisse für den Einfluss der Temperatur bei
der relevanten Equilibrierzeit von 1 min nochmals herausgestellt (Abbildung 27). Für alle
Arzneistoffe wurde eine höhere relative Wiederfindung bei Körpertemperatur als bei
Raumtemperatur bestimmt. Bei Paracetamol wurde eine Erhöhung der relativen
Wiederfindung von durchschnittlich 53,6 auf 62,6 % ermittelt. Bei Amoxicillin und Valsartan
waren Anstiege der relativen Wiederfindung von jeweils circa 8 % zu verzeichnen.
I A I B
II A II B
Ergebnisse
46
Abbildung 27: Einfluss der Temperatur auf die relative Wiederfindung (RR) von A: Paracetamol
(PCM), B: Amoxicillin (AMX) und C: Valsartan (VAL) bei Anwendung des
diskontinuierlichen Flusses bei Raumtemperatur (RT) und Körpertemperatur (KT),
PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP (MW + SD, n = 3).
3.2.2 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Konzentrationsänderungen
Die Sensitivität des Mikrodialysesystems hinsichtlich der Quantifizierung von
Konzentrationsänderungen in der Donor-Lösung wurde mit dem kontinuierlichen und
diskontinuierlichen Fluss mit den Arzneistoffen Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan
untersucht.
Die Ergebnisse für den Versuch mit Paracetamol bei Anwendung des kontinuierlichen
Perfusatflusses sind in Abbildung 28 dargestellt. Für dieses Experiment wurde zuerst die
Mikrodialyseeinheit in das Donor-Gefäß eingebracht und dann das arzneistofffreie Donor-
Medium hinzugefügt. Anschließend wurden fünf Dialysatproben aufgefangen. Die ersten vier
Dialysatproben bestätigten für beide verwendeten Paracetamol-Konzentrationen die
Arzneistofffreiheit des Donor-Mediums. Allerdings wurde in beiden Versuchen bereits in der
fünften Dialysatprobe Paracetamol quantifiziert. Erst nachdem sich die fünfte Probe im
Ablaufschlauch befand, wurde die Arzneistofflösung hinzugegeben, um die Paracetamol-
A B
C
Ergebnisse
47
Konzentration im Donor-Gefäß auf 0,02 und 2,00 g/L (theoretische Konzentration) zu
erhöhen. Danach wurden fünf weitere Dialysatproben gewonnen. Der erwartete sprunghafte
Anstieg der Paracetamol-Konzentration in der Donor-Lösung konnte in den Dialysatproben
nicht detektiert werden. Es wurden ein gleichmäßiger und moderater Anstieg der
Paracetamol-Konzentration in den Dialysatproben bei den Experimenten mit der niedrig
dosierten Paracetamol-Lösung und ein starker Anstieg bei der höher dosierten Paracetamol-
Lösung beobachtet. Das Maximum wurde erst nach 10 min mit 0,019 g/L (Abbildung 28 A)
und 9 min mit 1,89 g/L (Abbildung 28 B) detektiert, wobei die theoretische Paracetamol-
Konzentration in beiden Versuchen nicht erreicht wurde. Die Zugabe des Donor-Mediums
nach Gewinnung der 10. Dialysatprobe resultierte in geringeren theoretischen Paracetamol-
Konzentrationen von 0,01 und 1,00 g/L. Der erwartete sprunghafte Abfall der Paracetamol-
Konzentration in der Donor-Lösung konnte wiederum nicht in den Dialysatproben
nachgewiesen werden. Stattdessen erfolgte ein gleichmäßiger Abfall in Richtung der Soll-
Konzentration. Diese wurde bei den Untersuchungen der niedrig konzentrierten
Paracetamol-Lösung nach 15 min mit 0,012 g/L noch nicht erreicht. Für die höher
konzentrierte Paracetamol-Lösung war nach 15 min ein Abfall auf 1,07 g/L quantifizierbar.
Beide Paracetamol-Lösungen wiesen zum Teil große Standardabweichungen auf.
Abbildung 28: Vergleich der theoretisch und experimentell bestimmten Konzentrationen von
Paracetamol (PCM) bei Anwendung des kontinuierlichen Flusses bei
Körpertemperatur, maximal theoretische Konzentration von A: 0,02 g/L und
B: 2,00 g/L, PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP (MW ± SD, n = 3).
Der Versuchsablauf des diskontinuierlichen Flusses wurde zuerst mit Paracetamol
untersucht. Dafür wurde die Mikrodialyseeinheit in das Donor-Gefäß eingebracht und die
arzneistofffreie Lösung hinzugefügt. Im Vergleich zum Versuchsablauf mit kontinuierlichem
Perfusatfluss enthielten die fünf aufgefangenen und quantifizierten Dialysatproben keinen
A B
Zugabe der
Arzneistofflösung
Zugabe der
Arzneistofflösung
Zugabe
des Mediums
Zugabe
des Mediums
Ergebnisse
48
Arzneistoff (Abbildung 29). Die Zugabe der Arzneistofflösung und der damit theoretisch
einhergehende Anstieg der Paracetamol-Konzentration (theoretische Konzentrationen von
0,02 und 2,00 g/L) in der Donor-Lösung konnte bei diesem Versuchsaufbau sofort in der
anschließend aufgefangenen Dialysatprobe detektiert werden. Die vier nachfolgend
gewonnenen Dialysatproben wiesen für beide verwendeten Lösungen Paracetamol-
Konzentrationen in Höhe der theoretischen Konzentration auf. Durch Zugabe des Donor-
Mediums wurde die Paracetamol-Konzentration (theoretische Konzentrationen von 0,01 und
1,00 g/L) im Donor-Gefäß verringert. Der erwartete Konzentrationsabfall konnte bei diesem
Versuchsaufbau sofort in der nachfolgend gewonnenen Dialysatprobe praktisch gemessen
werden (Abbildung 29). Die vier zuletzt gewonnenen Dialysatproben wiesen annähernd die
erwartete theoretische Konzentration auf. Für beide Graphen sind wesentlich geringere
Standardabweichungen als bei Anwendung des kontinuierlichen Flusses zu verzeichnen.
Abbildung 29: Vergleich der theoretisch und experimentell bestimmten Konzentrationen von
Paracetamol (PCM) bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei
Körpertemperatur, maximal theoretische Konzentration von A: 0,02 g/L und
B: 2,00 g/L, PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP (MW ± SD, n = 3).
In den Versuchen mit Amoxicillin und Valsartan bei Nutzung des diskontinuierlichen
Perfusatflusses konnten, wie bereits für Paracetamol beschrieben, zuerst fünf
Dialysatproben ohne Arzneistoff gewonnen werden (Abbildung 30). Nach Zugabe der
Arzneistofflösung und damit einem erwarteten Anstieg der Konzentration in der Donor-
Lösung (theoretische Konzentrationen von 0,02 und 2,00 g/L für Amoxicillin und 0,016 und
0,16 g/L für Valsartan) wurde für beide Arzneistoffe und alle Konzentrationen ein starker
Anstieg verzeichnet. Bei Amoxicillin erreichte die Konzentration in den Proben annähernd die
theoretische Konzentration und verblieb dann auf diesem Niveau. Für beide Valsartan-
Lösungen war, verglichen mit der theoretischen Konzentration, eine um circa 15 %
A B
Zugabe der
Arzneistofflösung
Zugabe
des Mediums Zugabe der
Arzneistofflösung
Zugabe
des Mediums
Ergebnisse
49
verringerte Konzentration in den Dialysatproben messbar. Durch Zugabe des Mediums
wurde die Arzneistoffkonzentration im Donor-Gefäß um die Hälfte verringert. Bei den
Untersuchungen mit Amoxicillin und Valsartan wurde, wie bereits für Paracetamol
nachgewiesen, ein Abfall der Arzneistoffkonzentration sofort in der anschließend
gewonnenen Dialysatprobe quantifiziert. Auch bei dieser Konzentrationsveränderung
erreichten die Kurven der Amoxicillin-Lösungen annähernd die erwartete Konzentration,
während für Valsartan leicht erniedrigte Werte gemessen wurden. Die Experimente mit
Amoxicillin führten zu geringeren Standardabweichungen als die Untersuchungen mit
Valsartan.
Abbildung 30: Vergleich der theoretisch und experimentell bestimmten Konzentrationen von
I: Amoxicillin (AMX) und II: Valsartan (VAL) bei Anwendung des diskontinuierlichen
Flusses bei Körpertemperatur, maximal theoretische Konzentration von I A: 0,02 g/L,
I B: 2,00 g/L, II A: 0,016 g/L und II B: 0,16 g/L, PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP
(MW ± SD, n = 3).
Die Arzneistoffe Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan wurden zusätzlich simultan
verwendet und analysiert. Die Experimente wurden jeweils als Einzelversuch für die niedriger
und höher konzentrierte Arzneistofflösung durchgeführt. Zu Beginn des Versuches befand
sich die Mikrodialyseeinheit im Donor-Gefäß mit dem arzneistofffreien Donor-Medium. Die
I A I B
II A II B
Ergebnisse
50
dabei gewonnen Dialysatproben enthielten, wie bereits für die Einzelstoffe mit dem
diskontinuierlichen Fluss nachgewiesen, keinen Arzneistoff (Abbildung 31). Nach Zugabe der
Arzneistofflösung, die alle drei Arzneistoffe in der bisher verwendeten Konzentration enthielt,
konnte ein Anstieg der Arzneistoffkonzentration in den darauffolgend gewonnenen
Dialysatproben gemessen werden. Dabei war bei Verwendung der niedrig konzentrierten
Lösung für Paracetamol und Amoxicillin ein sprunghafter Anstieg und für Valsartan ein
moderater Anstieg zu beobachten. Für Valsartan konnte erst in der 9. Dialysatprobe die
maximale Konzentration bestimmt werden, die dabei noch circa 10 % unter der theoretischen
Konzentration lag. Die Konzentration in den Dialysatproben bewegte sich bei Paracetamol
annähernd auf Höhe der theoretischen Konzentration, während die gemessenen Werte von
Amoxicillin ebenfalls circa 10 % unter der theoretischen Konzentration lagen. Für die
Untersuchung mit der höher konzentrierten Lösung konnte, wie für alle Arzneistoffe erwartet,
ein sprunghafter Anstieg detektiert werden. Die gemessenen Konzentrationen lagen für
Paracetamol und Amoxicillin wie erwartet auf Höhe der theoretischen Konzentration. Für die
Valsartan-Konzentration wurde eine Unterschreitung der theoretischen Konzentration um
circa 10 % ermittelt. Die Verringerung der Arzneistoffkonzentration in der Donor-Lösung
durch Zugabe des arzneistofffreien Mediums wurde sofort in den Dialysatproben gemessen.
Die Ausnahme bildete Valsartan in der niedrig konzentrierten Lösung, bei der ein
langsamerer Abfall der Arzneistoffkonzentration als erwartet ermittelt wurde. Für die niedrig
konzentrierte Arzneistofflösung wurden Paracetamol-Konzentrationen gemessen, die den
theoretischen Konzentrationen entsprachen. Die Amoxicillin-Konzentration lag ebenfalls circa
10 % unter der theoretischen Konzentration und die Valsartan-Konzentration erreichte ab der
13. Dialysatprobe die theoretische Konzentration. Die Arzneistoffkonzentrationen, die bei der
Untersuchung mit der höher konzentrierten Lösung nach Zugabe des Mediums gewonnen
wurden, stimmten alle mit der theoretischen Konzentration überein.
Ergebnisse
51
Abbildung 31: Vergleich der theoretisch und simultan experimentell bestimmten Konzentration von
Paracetamol (PCM), Amoxicillin (AMX) und Valsartan (VAL) in Phosphatpuffer pH 6,8
USP bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei Körpertemperatur, maximal
theoretische Konzentration von A: 0,02 g/L für Paracetamol und Amoxicillin sowie
0,016 g/L für Valsartan, und B: 2,00 g/L für Paracetamol und Amoxicillin sowie
0,16 g/L für Valsartan, (n = 1).
3.2.3 Einfluss verschiedener Parameter auf die relative Wiederfindung bei Anwendung des
diskontinuierlichen Flusses
3.2.3.1 Einfluss der Nutzungsdauer auf die relative Wiederfindung
Die vorgesehene mehrmalige Nutzung der Mikrodialysesysteme für In vitro-Untersuchungen
war mit regelmäßigen Spülvorgängen und einer Lagerung im Trockenen über mehrere Tage
verbunden. Der Einfluss des wiederholten In vitro-Einsatzes der Mikrodialysesysteme wurde
durch die Bestimmung der relativen Wiederfindung eines repräsentativen Mikrodialyse-
systems an verschiedenen Tagen ermittelt. Für acht Tage, innerhalb eines Intervalls von
14 Nutzungstagen, wurde die relative Wiederfindung von Paracetamol bei Anwendung des
diskontinuierlichen Flusses mit einer Equilibrierzeit von 1 min bei Körpertemperatur
bestimmt. Die Zeit für die Lagerung der Mikrodialysesysteme wurde bei den
14 Nutzungstagen nicht berücksichtigt. In Abbildung 32 ist zu erkennen, dass die relative
Wiederfindung zwischen 60,2 und 66,0 % schwankte. Es war kein Trend für steigende oder
sinkende Werte im Verlauf der untersuchten Zeitspanne zu erkennen.
A B
Ergebnisse
52
Abbildung 32: Einfluss der Nutzungsdauer auf die relative Wiederfindung (RR) von Paracetamol
(PCM) bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei Körpertemperatur,
PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP (MW + SD, n = 3).
3.2.3.2 Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Herstellung
Die Reproduzierbarkeit der Herstellung der Mikrodialysesysteme wurde untersucht, indem
die Bestimmung der relativen Wiederfindung für die Arzneistoffe Paracetamol, Amoxicillin
und Valsartan erfolgte. Für Paracetamol resultierten aus dem Vergleich von acht
verschiedenen Mikrodialysesystemen (P1 bis P8) konzentrationsunabhängig Werte von 62,4
bis 68,5 % (Abbildung 33 A). Für Amoxicillin und Valsartan wurden jeweils die Ergebnisse
von vier Mikrodialysesystemen (A1 bis A4 und V1 bis V4) verglichen. Dabei wurden für
Amoxicillin Werte zwischen 45,7 und 52,1 % ermittelt (Abbildung 33 B). Ähnliche Werte für
die relative Wiederfindung von Valsartan (47,1 bis 53,0 %) wiesen ebenfalls auf einen
geringen Unterschied zwischen den Systemen hin (Abbildung 33 C).
Ergebnisse
53
Abbildung 33: Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Herstellung der Mikrodialysesysteme über die
Bestimmung der relativen Wiederfindung (RR) von A: Paracetamol (PCM, P1 bis P8),
B: Amoxicillin (AMX, A1 bis A4) und C: Valsartan (VAL, V1 bis V4) bei Anwendung
des diskontinuierlichen Flusses bei Körpertemperatur, PP: Phosphatpuffer pH 6,8
USP (MW + SD, n = 3).
3.2.3.3 Einfluss des Donor-Mediums auf die relative Wiederfindung
Die Medien Salzsäure pH 1,2, Bicarbonatpuffer pH 6,8, FaSSIF und FeSSIF wurden auf
ihren Einfluss auf den Stofftransport durch die semipermeable Kapillarmembran im Vergleich
zur Anwendung des Phosphatpuffers pH 6,8 USP untersucht. Die Werte der relativen
Wiederfindung von Paracetamol als Arzneistoff und Phosphatpuffer pH 6,8 USP als Donor-
Medium bildeten mit 68,5 und 67,9 % die Referenz für weitere Untersuchungen
(Abbildung 34). Für die Medien Salzsäure pH 1,2, Bicarbonatpuffer pH 6,8 und FaSSIF sind
relative Wiederfindungen von durchschnittlich 66,0 bis 71,2 % zu verzeichnen. Der Einsatz
von FeSSIF als Donor-Medium resultierte in niedrigeren Werten von durchschnittlich 63,4 %.
A B
C
Ergebnisse
54
Abbildung 34: Einfluss des Donor-Mediums auf die relative Wiederfindung (RR) von Paracetamol
(PCM) bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei Körpertemperatur,
PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP, HCl: Salzsäure pH 1,2, BP: Bicarbonatpuffer pH 6,8,
FaSSIF: Fasted State Simulated Intestinal Fluid, FeSSIF: Fed State Simulated
Intestinal Fluid (MW + SD, n = 3).
3.2.3.4 Einfluss des Perfusats auf die relative Wiederfindung
Mit Phosphatpuffer pH 6,8 USP und NaCl-Lösung pH 7,0 und 4,5 als Perfusat wurde dessen
Einfluss auf die relative Wiederfindung der Arzneistoffe Paracetamol, Amoxicillin und
Valsartan untersucht. Für die untersuchten Perfusate wurden für Paracetamol relative
Wiederfindungen zwischen 64,1 und 67,5 % bestimmt (Tabelle 8). Die Untersuchungen mit
Amoxicillin führten zu Werten von 51,3 bis 55,6 %. Für Valsartan konnten ähnliche Werte für
die relative Wiederfindung von 52,2 bis 57,7 % für alle untersuchten Perfusate ermittelt
werden.
Ergebnisse
55
Tabelle 8: Relative Wiederfindung von Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan bei Verwendung
von Phosphatpuffer pH 6,8 USP, NaCl-Lösung pH 7,0 und 4,5 als Perfusat und
Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei Körpertemperatur (MW ± SD (%),
n = 3).
Paracetamol Phosphatpuffer pH 6,8 USP NaCl-Lösung pH 7,0 NaCl-Lösung pH 4,5
0,02 g/L 66,6 ± 1,8 65,5 ± 2,4 66,5 ± 1,7
2,00 g/L 66,7 ± 1,0 67,5 ± 0,3 64,1 ± 1,3
Amoxicillin Phosphatpuffer pH 6,8 USP NaCl-Lösung pH 7,0 NaCl-Lösung pH 4,5
0,02 g/L 55,6 ± 1,3 51,3 ± 0,6 53,7 ± 0,4
2,00 g/L 53,7 ± 0,2 53,6 ± 0,5 54,1 ± 0,5
Valsartan Phosphatpuffer pH 6,8 USP NaCl-Lösung pH 7,0 NaCl-Lösung pH 4,5
0,016 g/L 55,4 ± 2,0 57,7 ± 1,4 57,6 ± 2,7
0,16 g/L 52,2 ± 0,8 56,0 ± 1,0 56,9 ± 0,2
3.2.4 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Verwendung biorelevanter Medien
Die Sensitivität des Mikrodialysesystems, Konzentrationsänderungen im Donor-
Kompartiment in den Dialysatproben abbilden zu können, wurde ebenfalls mit Salzsäure
pH 1,2 und den biorelevanten Medien Bicarbonatpuffer pH 6,8, FaSSIF und FeSSIF als
Donor-Medien überprüft.
In den nachfolgend aufgeführten Graphen sind die Ergebnisse für alle Medien und beide
Paracetamol-Konzentrationen dargestellt (Abbildung 35). Zu Beginn des Versuches enthielt
das Donor-Kompartiment keinen Arzneistoff. In den ersten fünf Dialysatproben ist deshalb
kein Arzneistoff quantifizierbar. Nach Zugabe der Paracetamol-Lösung wurde bei allen
Untersuchungen ein sprunghafter Anstieg der Paracetamol-Konzentration in der
darauffolgenden Dialysatprobe gemessen. Das erreichte Plateau entspricht annähernd den
theoretischen Konzentrationen von 0,02 und 2,00 g/L. Die Halbierung der Paracetamol-
Konzentration im Donor-Kompartiment konnte durch einen schlagartigen Abfall der
Arzneistoffkonzentration in den Dialysatproben gemessen werden. Unabhängig vom
verwendeten Donor-Medium erreichten die Paracetamol-Konzentrationen zum Ende der
Untersuchungen annähernd die angestrebten Konzentrationen von 0,01 und 1,00 g/L.
Ergebnisse
56
Abbildung 35: Vergleich der theoretisch und experimentell bestimmten Konzentrationen Paracetamol
(PCM) mit I: Salzsäure pH 1,2 (HCl), II: Bicarbonatpuffer pH 6,8 (BP), III: Fasted State
Simulated Intestinal Fluid (FaSSIF) und IV: Fed State Simulated Intestinal Fluid
(FeSSIF) als Donor-Medium bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei
Körpertemperatur, maximal theoretische Konzentration von A: 0,02 g/L und
B: 2,00 g/L (MW ± SD, n = 3).
I A I B
II A II B
III A III B
IV A IV B
Ergebnisse
57
3.2.5 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Anwendung im Röhrenmodell
Zur Simulation der anatomischen Verhältnisse des Darmes wurden Untersuchungen in
einem Röhrenmodell durchgeführt. Dabei wurde das Mikrodialysesystem in einen
temperierten Kunststoffschlauch eingebracht und zur Simulation von atmungsindizierten
Darmbewegungen mit 12 Bewegungen pro Minute leicht bewegt. Die ersten fünf
Dialysatproben enthielten, wie bei den vorherigen Versuchen mit dem diskontinuierlichen
Perfusatfluss gezeigt, keinen Arzneistoff (Abbildung 36). Nach Zugabe der Paracetamol-
Lösung erfolgte unabhängig von der verwendeten Konzentration der Lösung ein starker
Anstieg der Paracetamol-Konzentration in den Dialysatproben (Abbildung 36, grüne
Quadrate). Die gemessenen Paracetamol-Konzentrationen waren jedoch fast doppelt so
hoch wie die theoretisch erwarteten Paracetamol-Konzentrationen (Abbildung 36, graue
Quadrate). Die Bestimmung der Arzneistoffkonzentrationen direkt an der Mikrodialyseeinheit
resultierte in abweichenden Paracetamol-Konzentrationen (Abbildung 36, violette Quadrate)
im Vergleich zu den theoretischen Paracetamol-Konzentrationen des Donor-
Kompartimentes. Die Dialysatproben 6 bis 10 ergaben für beide Paracetamol-Lösungen
Konzentrationen, die annähernd 10 % unter der gemessenen Paracetamol-Konzentration an
der Mikrodialyseeinheit lagen sowie sehr hohe Standardabweichungen aufwiesen. Die
Verringerung der Arzneistoffkonzentration im Donor-Kompartiment resultierte in stark
fallenden Paracetamol-Konzentrationen in den Dialysatproben. Dabei verringerte sich die
Paracetamol-Konzentration stärker als es die theoretische Konzentration erwarten ließ. Zum
Ende der Versuchszeit näherte sich die gemessene Paracetamol-Konzentration sehr stark
der an der Mikrodialyseeinheit gemessenen Konzentration an.
Abbildung 36: Vergleich der theoretisch und experimentell bestimmten Konzentrationen von
Paracetamol (PCM) bei Anwendung im Röhrenmodell mit dem diskontinuierlichen
Fluss bei Körpertemperatur, maximal theoretische Konzentration von A: 0,02 g/L und
B: 2,00 g/L, PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP (MW ± SD, n = 3).
A B
Ergebnisse
58
3.3 Adaption und In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems für eine mögliche
humane Anwendung
3.3.1 Adaption des Mikrodialysesystems
Nach erfolgreicher Entwicklung und In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems wurde das
Mikrodialysesystem in Zusammenarbeit mit der Firma RoweMed an die humane Anwendung
angepasst und produziert. Dafür erfolgte zuerst der Transfer des Herstellungsprozesses.
Dabei wurden die Mitarbeiter vor Ort in die Herstellung der Mikrodialyseeinheiten
und -systeme, einschließlich der Prüfung auf Kapillardurchlässigkeit, eingewiesen.
Anschließend erfolgte die Adaption des Mikrodialysesystems nach arbeitskreisinternen
Vorgaben durch die Firma RoweMed. Die Gesamtlänge des Systems wurde auf 4 m
verlängert und zwei Mikrodialysesysteme in einem Set kombiniert (Abbildung 37). Die
Mikrodialysesysteme wurden zuerst mit den Medicoplast-Schläuchen, die gegenüber den
bisher verwendeten Tygon®-Schläuchen einen verringerten Außendurchmesser von 3,0 mm
aufwiesen, hergestellt.
Abbildung 37: Adaptiertes Mikrodialyseset bestehend aus jeweils zwei Mikrodialyseeinheiten (M),
Zufluss- und Ablaufschläuchen, Schläuchen zum Abtrennen der Proben mit Hilfe von
Luftblasen und einem Zuggewicht (G).
Ergebnisse
59
In einem zweiten Schritt konnte der Schlauchaußendurchmesser weiter reduziert werden,
sodass weitere Sets mit Außendurchmessern von 2,0 und 1,5 mm (Versilic®-Schlauch)
angefertigt wurden. Das Verbinden der einzelnen Komponenten erfolgte mit Hilfe von selbst
gegossenen Silikon-Verbindungsstücken aus Elastosil®, das Verkleben wurde mit dem
identischen Silikon durchgeführt. Die Stabilisierung des Mikrodialysesystems und der
Mikrodialyseeinheiten wurde durch anschließendes punktuelles Verkleben der Schläuche
und Verbindungstücke untereinander erreicht. Dabei blieb die bisherige Flexibilität des
Systems erhalten. Die Schläuche wurden am distalen Ende des Mikrodialysesystems in
Silikon eingegossen, um ein Abknicken der Schläuche zu verhindern und um das Anbringen
eines Zuggewichtes mit Titankugeln (Abbildung 38, G) zu ermöglichen. Für die Herstellung
des adaptierten Mikrodialysesystems wurden nachgewiesen biokompatible Materialien
verwendet.
3.3.2 In vitro-Prüfung des adaptierten Mikrodialysesystems
Die reproduzierbare Herstellung der Mikrodialysesysteme bei der Firma RoweMed wurde
durch den Vergleich der relativen Wiederfindung überprüft. Die untersuchten Mikrodialyse-
systeme wurden mit zwei unterschiedlichen Silikonschläuchen hergestellt. Die Systeme MP1
bis MP3 enthielten den Medicoplast-Schlauch und die Systeme VS1 bis VS5 wurden unter
Verwendung des Versilic®-Schlauches hergestellt. Die Untersuchungen mit Paracetamol
ergaben für alle Mikrodialysesysteme Werte von durchschnittlich 62,5 bis 70,2 % für die
relative Wiederfindung (Abbildung 38). Für die verwendeten Schläuche (Medicoplast- oder
Versilic®-Schlauch) konnte kein Einfluss auf die relative Wiederfindung von Paracetamol
nachgewiesen werden.
Ergebnisse
60
Abbildung 38: Prüfung der adaptierten Mikrodialysesysteme hinsichtlich der relativen Wiederfindung
(RR) von Paracetamol (PCM) bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei
Körpertemperatur, MP: Medicoplast-Schlauch, VS: Versilic®-Schlauch, PP: Phosphat-
puffer pH 6,8 USP (MW + SD, n = 3).
3.3.3 Bestimmung des pH-Wertes im Donor-Kompartiment über die Analyse der
Dialysatproben
Zur Bestimmung des pH-Wertes im Donor-Kompartiment wurden Dialysatproben pH-
metrisch untersucht. Dabei wurden arzneistofffreie Medien unterschiedlicher pH-Werte
(Salzsäure pH 1,2, 3,0, 4,0, 5,0 und Phosphatpuffer pH 6,8 USP) als Donor-Medium und
Phosphatpuffer pH 6,8 USP und NaCl-Lösung pH 5,5 als Perfusat genutzt. Die Verwendung
von Salzsäure pH 1,2 führte unabhängig vom Perfusat zu pH-Werten von circa pH 1,3 in den
Dialysatproben (Tabelle 9). Der Anstieg des pH-Wertes im Donor-Medium auf pH 3,0
resultierte wie erwartet in erhöhten pH-Werten von durchschnittlich pH 3,6 in den Proben.
Durch den Einsatz von Salzsäure pH 4,0 und 5,0 sowie Phosphatpuffer pH 6,8 USP wurden
ähnliche pH-Werte von durchschnittlich pH 6,8 und pH 6,6 in den Dialysatproben für das
Perfusat Phosphatpuffer pH 6,8 USP und die NaCl-Lösung pH 5,5 gemessen.
Tabelle 9: Ermittelte pH-Werte in den Dialysatproben bei der Verwendung von Phosphatpuffer
pH 6,8 USP (PP) und NaCl-Lösung pH 5,5 als Perfusat sowie Salzsäure (HCl) pH 1,2;
3,0; 4,0; 5,0 und Phosphatpuffer pH 6,8 USP als Donor-Medium und Anwendung des
diskontinuierlichen Flusses bei Körpertemperatur (n = 1).
Donor-Medium
Perfusat HCl pH 1,2 HCl pH 3,0 HCl pH 4,0 HCl pH 5,0 PP
PP 1,33 3,74 6,84 6,92 6,81
NaCl-Lösung pH 5,5 1,27 3,48 6,44 6,63 6,76
Ergebnisse
61
3.3.4 Evaluation der Braun Infusomat® und Perfusor® Space Pumpen
Die zum Einsatz am Menschen zugelassen Pumpen der Firma Braun (Infusomat® und
Perfusor® Space Pumpen) wurden auf ihre Eignung bei Anwendung mit dem
diskontinuierlichen Perfusatfluss überprüft.
Dafür wurden beide Pumpen zuerst auf ihre Transporteigenschaften bezüglich der Medien
(wässrige Zubereitungen als Perfusat und Luft zum Abtrennen der Dialysatproben im
Ablaufschlauch) untersucht. Dabei zeigte sich, dass der Luftblasendetektor der Infusomat®
Space Schlauchpumpe sofort einen Luftblasen-Alarm auslöste, sobald Luft zum Abtrennen
der Dialysatproben in der Messzelle des Gerätes detektiert wurde. Das Gerät stellte
infolgedessen sofort den Betrieb ein. Demgegenüber erfolgte der Transport des Perfusats
bei Nutzung der Infusomat® Space Pumpe ohne Einschränkungen. Für die Abtrennung der
Dialysatproben im Ablaufschlauch wurde daraufhin ausschließlich die Perfusor® Space
Spritzenpumpe genutzt. Dafür wurde die Pumpe mit einer 50 mL-Spritze bestückt. Das
aufgezogene Luftvolumen betrug 10 bis 50 mL. Die komplett mit Luft befüllte 50 mL-Spritze
führte zu fehlenden Luftblasen zwischen den einzelnen Dialysatproben. Eine Verringerung
des aufgezogenen Luftvolumens auf 25 mL resultierte in abgetrennten Dialysatproben mit
unterschiedlich großen Luftblasen. Außerdem waren innerhalb der Dialysatproben kleine
Luftblasen vorhanden. Eine Abnahme des aufgezogenen Luftvolumens auf 20 und 10 mL
führte zu gleichmäßig abgetrennten, luftblasenfreien Dialysatproben im Ablaufschlauch. Der
Einsatz einer 20 mL Spritze mit einem aufgezogenen Volumen von 20 oder 10 mL führte
zum gleichen Ergebnis.
Aus diesem Grund wurde für die nachfolgenden Untersuchungen die Infusomat® Space
Schlauchpumpe zum Transport des Perfusats und die Perfusor® Space Spritzenpumpe zum
Transport der Luft genutzt. Die eingeschränkte Programmierbarkeit beider Pumpen führte zu
Experimenten mit modifizierten Zeiten für den Transport des Perfusats und die
Equilibrierung. Die maximale Dauer eines Zyklus aus Pump- und Equilibrierzeit betrug dabei
1 min. Die Experimente wurden mit Pumpzeiten von 15 bis 18 s durchgeführt. Als Referenz
dienten die bisher verwendeten Untersuchungen mit den MCP Schlauchpumpen mit einer
Equilibrierzeit von 60 s und einem Fluss des Perfusats von 18 s. Die Ergebnisse, die mit
einem repräsentativen Mikrodialysesystem gewonnen wurden, sind nachfolgend aufgeführt
(Tabelle 10). Die Nutzung der bisher verwendeten MCP Pumpen resultierte in Werten für die
relative Wiederfindung von 69,3 %. Der Einsatz der Infusomat® und Perfusor® Space
Pumpen führte mit einer Pumpzeit von 15 bis 18 s zu sehr einheitlichen relativen
Wiederfindungen von 68,4 bis 70,0 %.
Ergebnisse
62
Tabelle 10: Relative Wiederfindung von Paracetamol bei Verwendung der MCP, Infusomat® und
Perfusor® Space Pumpen bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei
Körpertemperatur (MW ± SD (%), n = 6).
Pumpe zum Transport des Perfusat/
Pumpe zum Setzen von Luftblasen
Equilibrierzeit
(s)
Pumpzeit
(s)
relative
Wiederfindung
MCP/MCP 60 18 69,3 ± 0,7
Infusomat®/Perfusor® 45 15 70,0 ± 1,0
Infusomat®/Perfusor® 44 16 68,4 ± 1,1
Infusomat®/Perfusor® 43 17 69,2 ± 1,6
Infusomat®/Perfusor® 42 18 68,8 ± 1,8
Diskussion
63
4 Diskussion
4.1 Entwicklung eines oral anwendbaren Mikrodialysesystems
Die Mikrodialyse bietet die einzigartige Möglichkeit der Bestimmung von geringen
Konzentrationen eines wasserlöslichen und ungebundenen Stoffes in Geweben und
Organen. Die notwendige Wasserlöslichkeit des Stoffes wird hierbei durch die üblicherweise
verwendeten wässrigen Perfusionsflüssigkeiten, wie zum Beispiel Ringer-Lösung oder
salinen Phosphatpuffer bedingt [82], da ein Übertritt des untersuchten Stoffes ins Perfusat
erfolgen muss. Die Mikrodialysemembran bestimmt mit ihrer spezifischen Porengröße bis zu
welcher Molekülmasse ein Stoff die Membran passieren kann. Häufig werden
Mikrodialysesonden mit einer Molekülmassen-Ausschlussgrenze von 6 bis 100 kDa
eingesetzt. Diese sind für große Moleküle wie Proteine nicht permeabel, sodass nur der
ungebundene Stoff ins Perfusat diffundieren kann [85]. Daher wird mit dieser Methode nur
der Stoffanteil, der durch biologische Membranen diffundieren kann, bestimmt. Die
Mikrodialysetechnik wurde bereits zur Bestimmung von intraluminalen Stoffkonzentrationen
im Darm des Schweins und des Menschen genutzt [84, 97, 100]. Die bisherige Platzierung
der Mikrodialysesonden mit chirurgisch invasiven Verfahren bedingt jedoch eine geringe
Akzeptanz dieser Technik bei der Anwendung im Dünndarmlumen des Menschen. Weitaus
häufiger erfolgt die Bestimmung der intestinalen Konzentration und Absorption eines
Arzneistoffes im Menschen mit mehrlumigen Sonden. Dabei werden definierte Darm-
segmente perfundiert und entsprechende Proben aspiriert [59, 66, 67]. Mit dieser Technik
können jedoch der intestinale Wasserhaushalt und somit die intraluminalen Bedingungen
beeinflusst werden. Durch die Kombination beider Techniken können die genannten
Nachteile behoben werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein oral applizierbares
Mikrodialysesystem zur Bestimmung intestinaler Arzneistoffkonzentrationen entwickelt und in
vitro geprüft. Die vorgesehene humane Anwendung wurde bei der Entwicklung durch die
Verwendung von Materialien, die beständig gegenüber Säuren und Gallensalzen, inert
gegenüber Arzneistoffen und biokompatibel sind, berücksichtigt. Dabei wurde vor allem auf
die Qualität der verwendeten Schläuche, Klebstoffe und Hohlfaserkapillaren geachtet, da
diese den größten Teil des Systems darstellen.
Das neu entwickelte Mikrodialysesystem besteht aus einer flexiblen Mikrodialyseeinheit und
elastischen Schläuchen. Der verwendete Tygon® 3350-Schlauch entspricht der
Biokompatibilitätsprüfung für Medizinprodukte und Implantate der USP mit der Einordnung in
die Klasse VI [110, 112]. Dies bedeutet, dass dieser Schlauch permanent im Blutgefäß-
system oder auf verletzten Geweben angewendet werden kann, da er nicht toxisch, nicht
hämolytisch und nicht pyrogen ist. Die Verbindung der einzelnen Komponenten des Systems
Diskussion
64
erfolgte mit Klebstoffen, deren Biokompatibilität ebenfalls durch Zertifikate der Hersteller
belegt wurde [113, 114].
Die flexible Mikrodialyseeinheit des Systems besteht aus Hohlfaserkapillaren (Fresenius
Polysulfon®) die üblicherweise in Dialysatoren zur Hämodialyse verarbeitet werden und damit
für den Kontakt mit Blut geeignet sind [116-118]. Die verwendeten Polysulfon-Kapillaren
können mit drei unterschiedlichen Methoden, der Behandlung mit gespannten und
gesättigten Wasserdampf, mit Ethylenoxid und mit Gamma-Strahlung, sterilisiert werden. Für
Kapillaren aus Polyacrylnitril oder Polyamid sind nur die Sterilisation mit Ethylenoxid und die
Bestrahlung möglich. Die Sterilisation mit Ethylenoxid kann zu akuten Überempfindlichkeits-
reaktionen bei den Patienten und die Bestrahlung zu strukturellen und optischen
Veränderungen des Polymers sowie zur Freisetzung von Nebenprodukten führen [117]. Da
die Dampfsterilisation in diesem Fall das produkt- und patientenschonendste Sterilisations-
verfahren darstellt, wurde sich im Rahmen der Systementwicklung für die Verwendung der
Polysulfon-Kapillaren entschieden. Das Material, der in der Mikrodialyseeinheit verwendeten
Hohlfaserkapillaren, ist eine Mischung aus Polysulfon und dem Additiv Polyvinylpyrrolidon.
Dabei ist das hydrophile Polyvinylpyrrolidon im hydrophoben Polysulfon eingebettet. Der
Zusatz des Additivs erhöht die Benetzbarkeit der Membranoberfläche und ermöglicht somit
den Einsatz der Kapillaren in wässrigen Medien wie zum Beispiel Blut [116, 119]. Die
Hohlfaserkapillaren des Mikrodialysesystems trennen das Donor-Kompartiment von der
Perfusionsflüssigkeit. Über die enthaltenen Poren der Kapillarmembran (Molekülmassen-
Ausschlussgrenze 5000 Da) ist jedoch ein Stoffaustausch zwischen beiden Kompartimenten
möglich. Im Vergleich zu den bisher verwendeten Schlauchsystemen, die über große
Öffnungen (bis zu 1,8 cm) zur Perfusion und Aspiration verfügen [59, 71], wird der intestinale
Wasserhaushalt durch die Verwendung des Mikrodialysesystems vermutlich nicht
beeinflusst, da es als volumeneutrale Technik beschrieben wird [82]. In diesem
Zusammenhang ist ebenfalls davon auszugehen, dass die einzelnen Flüssigkeitsnester, die
im nüchternen Zustand im Dünndarm vorhanden sind [17], nicht durch eingebrachte oder
entnommene Flüssigkeitsmengen in ihrer Anzahl und ihrem Volumen beeinflusst und lokal
gemessene Arzneistoffkonzentrationen nicht verändert werden. Eine unphysiologische
Dehnung des Dünndarms, die durch hohe Flussraten von bis zu 20 mL/min bei der Perfusion
des entsprechenden Darmabschnittes hervorgerufen werden kann, wird ebenfalls durch die
Verwendung des Mikrodialysesystems vermieden, da in diesem Fall eine geringe
Perfusatflussrate von 1 mL/min innerhalb des Mikrodialysesystems angewendet wird [66,
75]. Es ist dementsprechend davon auszugehen, dass die Absorption des Arzneistoffes
weder durch eine veränderte intestinale Durchblutung noch durch eine veränderte
Darmperistaltik und damit veränderte Lokalisation des Arzneistoffes beeinflusst wird [71, 76].
Diskussion
65
Bei der Entwicklung der Mikrodialyseeinheit bestand die Forderung, dass eine möglichst
große Austauschfläche zur Verfügung stehen sollte. Die angedachte Verwendung von
50 oder 100 Hohlfaserkapillaren in einer Mikrodialyseeinheit konnte nicht umgesetzt werden,
da der Tygon®-Schlauch mit einem Innendurchmesser von 1,85 mm für die Zufluss- und
Ablaufschläuche verwendet werden sollte. Somit konnten theoretisch 43 Kapillaren verbaut
werden, um eine lückenlose Verbindung der Mikrodialyseeinheit mit den Schläuchen zu
erhalten. In der Praxis erwies sich die theoretisch berechnete Anzahl an Kapillaren als nicht
anwendbar, da der verwendete Klebstoff ebenfalls Raum beanspruchte. Die Herstellung von
Mikrodialyseeinheiten erfolgte dementsprechend mit einer reduzierten Anzahl an Kapillaren.
Die Verklebung der Kapillaren erfolgte, indem zuerst die Kapillaren mit Klebstoff umgeben
und dann für den Prozess des Aushärtens, durch Einrollen in Folie, in eine möglichst runde
Form gebracht wurden. Die erhaltenen Verklebungen wiesen teilweise undurchlässige und
deformierte Kapillaren auf. Eine weitere Verringerung der Anzahl an Kapillaren führte zu
Verklebungen mit durchlässigen Kapillaren, die größtenteils von Klebstoff umgeben waren.
Ein großer Nachteil dieser Herstellungstechnik war das tropfenförmige Aussehen der
Verklebung. Die Mikrodialyseeinheit konnte somit nicht in die entsprechenden Schläuche
eingefügt werden. Die optimierte Herstellung der endständigen Verklebung durch Einbettung
der Kapillaren in eine Silikonmanschette konnte dieses Problem beheben. So wies die finale
Mikrodialyseeinheit runde Verklebungen auf und enthielt fertigungsbedingt 30 Kapillaren. Um
die Integrität der Kapillaren und der Verklebung der hergestellten Mikrodialyseeinheiten zu
gewährleisten, wurden alle Einheiten vor der Weiterverarbeitung auf vollständige
Kapillardurchlässigkeit geprüft. Für die Herstellung der Mikrodialysesysteme wurden die
hergestellten Mikrodialyseeinheiten nur verwendet, wenn alle 30 Kapillaren durchlässig
waren und eine Austauschlänge von 10 cm aufwiesen. Dies resultierte in Mikrodialyse-
einheiten mit einer relativ großen Austauschfläche von circa 26 cm2 im Vergleich zu den
häufig eingesetzten kommerziell erhältlichen Mikrodialysesonden. Diese weisen im
Allgemeinen eine Membran mit Austauschlängen von 1 bis 10 mm und Durchmessern von
0,24 bis 0,5 mm auf, sodass eine maximale Austauschfläche von 0,16 cm2 zur Verfügung
steht. Die Austauschlänge der eigens hergestellten Mikrodialyseeinheit ist mit 10 cm im
Vergleich zu den bisher verwendeten Mikrodialysesonden, die kommerziell erhältlich oder
durch die Arbeitsgruppen hergestellt waren, ebenfalls relativ hoch [83, 84, 87, 91, 120], auf
den gesamten Dünndarm, mit einer Länge von 250 bis 350 cm [3, 4], als Untersuchungsort
bezogen, jedoch gering. Somit kann in später durchgeführten Untersuchungen am
Menschen eine ausreichend hohe räumliche Auflösung erreicht werden. Die
eigenentwickelte Mikrodialyseeinheit ermöglichte aufgrund ihrer Dimension die Anwendung
von Flussraten von 1 mL/min. Dies resultierte in Probenvolumina von 300 µL, unabhängig
davon, ob das Mikrodialysesystem mit dem kontinuierlichen oder diskontinuierlichen
Diskussion
66
Perfusatfluss verwendet wurde. Herkömmliche Mikrodialysesonden werden kontinuierlich mit
Flussraten von 1 bis 2 µL/min perfundiert, um eine ausreichend hohe relative Wiederfindung
in den Dialysatproben zu erhalten [82]. Diese Flussraten resultieren in geringen
Probenvolumina von 10 bis 60 µL und langen Zeitintervallen von 10 bis 60 min, um diese
Volumina zu generieren [92, 97, 100, 121, 122]. Chaurasia et al. berichtete bereits, dass
solch kleine Probenvolumina zu Problemen bei der Detektion von geringen Arzneistoff-
konzentrationen mit herkömmlichen analytischen Methoden führen können [82]. Bei
Anwendung des neu entwickelten Mikrodialysesystems konnte das Probenvolumen
vergleichsweise um das 5-fache erhöht werden. Dabei ist die relative Wiederfindung
höchstwahrscheinlich geringer als bei den bisher angewendeten Untersuchungen, allerdings
ist die absolute Wiederfindung aufgrund des großen Probenvolumens erhöht. Somit sollte
auch die Quantifizierung geringer Stoffmengen eines oder mehrerer Analyten in den
Dialysatproben problemlos möglich sein.
Zur zeitgleichen Bestimmung der luminalen Arzneistoffkonzentration an unterschiedlichen
Stellen im Dünndarm können zwei Mikrodialysesysteme in einem Set miteinander kombiniert
werden. Um ein Abknicken der zurücklaufenden Schläuche zu verhindern und zur
selbstständigen intraluminalen Vorwärtsbewegung des Mikrodialysesystems durch die
Peristaltik des Dünndarms, wurde ein Zuggewicht am distalen Ende des
Mikrodialysesystems angebracht. Zur Beschwerung des Zuggewichtes wurde, entgegen den
bisher in Studien verwendeten Materialien Quecksilber und Wolfram [59, 68, 75], Titan
ausgewählt. Dieses Material wurde gewählt, da in verschiedenen Untersuchungen bereits
gezeigt wurde, dass Titanimplantate für die Anwendung im MRT-Gerät gut geeignet sind, da
sie kaum Artefakte produzieren [123]. Eine mögliche Anwendung des Mikrodialysesystems in
Kombination mit bildgebenden Verfahren wie der MRT wurde somit bereits bei der
Entwicklung berücksichtigt. Die Verwendung des Mikrodialysesets bietet einige Vorteile. So
erfolgt bei den bisher verwendeten Systemen, die nur eine Messstelle besitzen, der
Transport des jeweiligen Systems zum nächsten, tiefergelegenen Darmabschnitt durch die
natürliche Peristaltik. Ein erforderlicher Vorwärtstransport von 100 cm kann so 6 bis 18 h
dauern [59]. Alternativ kann zeitversetzt eine erneute Applikation des Systems erfolgen. Dies
bedingt jedoch einen erhöhten zeitlichen Aufwand für Probanden und Mitarbeiter und führt
dementsprechend zu Mehrkosten bei der Untersuchung. Zudem sinkt die Bereitschaft der
Probanden, an solchen Studien zur Bestimmung der intestinalen Arzneistoffkonzentration
und Absorption mitzuwirken und diese zu vollenden. Bei Verwendung des neuen
Mikrodialysesets kann diese Zeit eingespart werden. Im zeitlichen Verlauf kann dann das An-
und Abfluten des Arzneistoffes in den unterschiedlichen Bereichen des Dünndarmes
simultan gemessen und Rückschlüsse auf dessen Absorption gezogen werden. Das von
Diskussion
67
Brouwers et al. verwendete Aspirationssystem ermöglicht ebenfalls die Sammlung von
intestinalen Proben an zwei unterschiedlichen Stellen im Dünndarm. Dafür werden jedoch
zeitgleich zwei Sonden platziert, eine im Duodenum und eine weitere im Jejunum [74]. Es
müssen dementsprechend zwei Sonden oral appliziert, an der entsprechenden Stelle
platziert und deren Position überprüft werden.
Da Perfusions- und Aspirationssysteme mit ähnlichen Dimensionen bereits erfolgreich zur
Bestimmung von intestinalen Arzneistoffkonzentrationen angewendet wurden [59, 68, 74], ist
davon auszugehen, dass die orale Applikation und Anwendung des neu entwickelten
Mikrodialysesystems nahezu ohne Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens der Probanden
erfolgen kann. Der größte Nachteil der bisher zur Untersuchung der intestinalen
Stoffkonzentration verwendeten Mikrodialysesonden, die verringerte Akzeptanz bei den
Probanden durch die Platzierung der Sonden mit chirurgisch invasiven Verfahren [100],
entfällt somit bei der oralen Anwendung des neuartigen Mikrodialysesystems.
Somit lässt sich feststellen, dass ein bewegliches aber dennoch ausreichend robustes
System für die vorgesehene intestinale Anwendung im Menschen zur Verfügung stand,
welches im nächsten Schritt in vitro charakterisiert werden sollte.
4.2 In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems
Das neu entwickelte Mikrodialysesystem wurde mit den Arzneistoffen Paracetamol,
Amoxicillin und Valsartan auf seine Eignung zur intestinalen Bestimmung von
Arzneistoffkonzentrationen untersucht. Die drei Arzneistoffe wurden hinsichtlich ihres
Absorptionsverhaltens im Gastrointestinaltrakt ausgewählt und sollen in einer späteren
Studie am Menschen als Modellsubstanzen dienen.
Als Vertreter der nicht sauren antipyretischen Analgetika zeichnet sich Paracetamol durch
eine fiebersenkende und schmerzstillende Wirkung aus. Diese Wirkungen basieren auf
einem multifaktoriellen Wirkungsmechanismus, der eine selektive Hemmung der
Cyclooxygenase 2, eine Hemmung des Abbaus von Endocannabinoiden, eine Beeinflussung
der Signalgebung durch Serotonin und eine Hemmung der Bildung von Stickstoffmonoxid
umfasst [124-127]. Paracetamol wird aus dem gesamten Dünndarm transzellulär durch
Diffusion absorbiert. Dabei ist die Geschwindigkeit der Arzneistoffabsorption von der
Freisetzung aus der Arzneiform und der Geschwindigkeit der Magenentleerung abhängig
[24, 59, 128]. Die orale Bioverfügbarkeit von Paracetamol liegt dosisabhängig bei 70 bis
90 % und die Halbwertszeit beträgt 1,9 bis 2,5 h. Paracetamol wird vor allem in der Leber
durch Glucuronidierung und Sulfatierung metabolisiert. Ein geringer Anteil von 4 % wird
unverändert renal eliminiert [128]. Aufgrund der gleichmäßigen Absorption entlang des
Diskussion
68
gesamten Dünndarms kann Paracetamol als Referenzsubstanz für die Untersuchung der
regioselektiven Absorption von weiteren Arzneistoffen und zur Bestimmung der
Magenentleerung herangezogen werden.
Amoxicillin ist ein Vertreter der ß-Lactam-Antibiotika, genauer der Aminopenicilline. Es ist ein
selektiver Inhibitor bakterieller Transpeptidasen, die die Quervernetzung der Peptidoglykan-
Einheiten in der Zellwand katalysieren. Durch die Acylierung der Transpeptidasen wird die
Biosynthese der Zellwand inhibiert und damit deren Integrität und Stabilität gestört. Dies
hemmt das Wachstum proliferierender Bakterien und induziert deren Lyse [129, 130].
Amoxicillin weist eine orale Bioverfügbarkeit von 77 ± 17 % auf [131]. Die im Vergleich zu
anderen Penicillinen hohe Bioverfügbarkeit basiert auf der enthaltenen Aminogruppe, die für
die Säurestabilität des Amoxicillins verantwortlich ist [103]. Die intestinale Absorption des
Amoxicillins verringert sich vom Jejunum zum Colon [132]. Zusätzlich ist eine verringerte
AUC nach oraler Gabe von 750 bis 3000 mg Amoxicillin im Vergleich zur AUC von 325 mg
Amoxicillin zu beobachten. Dies spricht neben der passiven Diffusion auch für einen aktiven
Transport des Arzneistoffes [133]. Der Oligopeptid-Transporter PEPT1, der in der apikalen
Enterozytenmembran lokalisiert ist, wurde 1994 als Transporter für Amoxicillin identifiziert
[134]. Der Zusammenhang zwischen der regionalen Absorption von Amoxicillin, vor allen im
oberen Dünndarm, und der Lokalisation von PEPT1 im Darm konnte bereits bestätigt werden
[39, 40]. Amoxicillin wird zu 80 % renal eliminiert und besitzt eine Halbwertszeit von
1,4 ± 0,4 h [133, 135]. Mit seiner schnellen und guten Absorption in proximalen Dünndarm-
bereichen stellt Amoxicillin somit einen guten Modellarzneistoff für Untersuchungen mit
regioselektiv absorbierten Arzneistoffen dar.
Valsartan ist ein Angiotensin-II-Rezeptor Antagonist, der hochselektiv am AT1-Rezeptor-
Subtyp wirkt [136]. Die Blockade des Rezeptors führt unter anderem zu einer Verringerung
der koronaren und renalen Vasokonstruktion der Blutgefäße, zu einer Verminderung der
Aldosteron- und Vasopressinsekretion und damit zu einer erhöhten Natrium- und
Wasserausscheidung. In der Praxis wird Valsartan zur Behandlung der essentiellen
Hypertonie und Herzinsuffizienz eingesetzt [137]. Valsartan wird schnell aus dem Darm
absorbiert. Die orale Bioverfügbarkeit beträgt 39 % [138]. Die hepatische Aufnahme erfolgt
über OATP1B1 und OATP1B3 und die aktive Exkretion in die Galle über MRP2 [139].
Valsartan wird größtenteils unverändert fäkal ausgeschieden und nur zu 10 % durch
Hydroxylierung metabolisiert. Die Halbwertszeit von Valsartan beträgt 7 h [138, 140]. Die am
Absorptionsprozess beteiligten Transporter und Enzyme des humanen Darms konnten bis
jetzt nicht eindeutig identifiziert werden. Untersuchungen im Caco-2-Zellmodell zeigen
jedoch, dass Valsartan ein Substrat von ABCB1 sowie ein Inhibitor von PEPT1 ist [141, 142].
Aus diesem Grund eignet sich Valsartan als Modellarzneistoff für Untersuchungen zur
Diskussion
69
Bestimmung des Einflusses intestinaler Transporter auf die Absorption eines Arzneistoffes.
Zusätzlich können mit der simultanen Gabe von Arzneistoffen die den gleichen Transporter,
wie zum Beispiel PEPT1, beeinflussen, Wechselwirkungen zwischen den einzelnen
Arzneistoffen sowie dem Transporter untersucht werden.
Alle drei Arzneistoffe können gut in einer Studie am Menschen angewendet werden, da
durch ihre langjährige Anwendung die gute Verträglichkeit, Sicherheit und geringe Rate an
Nebenwirkungen bei der Applikation einer Einzeldosis belegt ist [138, 140, 143-145].
Für die In vitro-Untersuchungen wurden Daten über Arzneistoffkonzentrationen benötigt, die
im humanen Dünndarm zu erwarten sind. Dafür wurden Ergebnisse aus zwei Aspirations-
studien am Menschen herangezogen. Aus Untersuchungen bei denen schnelle freisetzende
Kapseln mit Theophyllin, einer BCS-Klasse I-Substanz [146], mit Wasser oral verabreicht
wurden, sind intestinale Arzneistoffkonzentrationen bekannt. Die maximal gemessene
duodenale Arzneistoffkonzentration von 3200 µM entsprach dabei der Konzentration der
verabreichten Kapsel mit 100 mg Theophyllin und den 180 mL verabreichten Wassers [74].
Für Amprenavir, ein Stoff der BCS-Klasse II [147], konnte ebenfalls bestätigt werden, dass
die Applikation von 1200 mg Arzneistoff in Weichgelatinekapseln mit lösungsverbessernden
Hilfsstoffen und 180 mL Wasser zu Konzentrationen führte die annähernd den intestinalen
Konzentrationen entsprachen. So lag die maximal gemessene Konzentration im Duodenum
bei 11 mM und die verabreichte Konzentration wurde mit 13 mM berechnet [148]. Für die
Arzneistoffe Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan, die laut der BCS-Klassifizierung
ebenfalls eine gute Löslichkeit aufweisen kann somit auch initial von einer ungefähren
Übereinstimmung der intestinalen Konzentration mit der verabreichten Konzentration
ausgegangen werden.
Die In vitro-Experimente wurden mit zwei unterschiedlich konzentrierten Lösungen für jeden
Arzneistoff durchgeführt, um den Einfluss der Arzneistoffkonzentration im Donor-
Kompartiment auf den Stoffdurchtritt durch die Kapillarmembran zu ermitteln. Die hohe
Konzentration von 2,00 g/L für Paracetamol und Amoxicillin sowie 0,16 g/L für Valsartan
entsprach der Applikation einer Tablette mit 0,25 L Wasser. Dabei wurde angenommen,
dass eine kommerziell erhältliche Tablette den Arzneistoff in der niedrigsten verfügbaren
Dosis enthielt, wobei keine weiteren Arzneistoffe in der Formulierung enthalten waren. Das
Volumen von 0,25 L wurde in Anlehnung an die Bestimmung der Löslichkeit eines
Arzneistoffes für die Einordnung in das BCS-System gewählt. Es setzte sich aus der Menge
an Wasser, die zur oralen Einnahme einer Arzneiform im Sinne der BCS-Klassifizierung
nötig ist (240 mL) und dem geringen Restvolumen an Magensaft im nüchternen Zustand
Diskussion
70
zusammen [149]. Die hierfür angenommenen 10 mL entsprachen dabei eher dem unteren
Bereich des ermittelten Magenrestvolumens im nüchternen Zustand [17]. Die niedrig
konzentrierten Lösungen entsprachen einem Hundertstel oder einem Zehntel der
Arzneistoffmenge einer Tablette gelöst in 0,25 L Medium, sodass auch für diese Arzneistoff-
konzentration eine UV-metrische Bestimmung realisierbar war.
Die In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems erfolgte hinsichtlich der Bestimmung der
relativen Wiederfindung der Arzneistoffe. Bereits 1982 wurde von Ungerstedt et al. die
relative Wiederfindung als Verhältnis zwischen der Substanzkonzentration im Dialysat und
im Donor-Kompartiment beschrieben und zur Charakterisierung des Dialyseprozesses
genutzt [87, 115]. Es ist bekannt, dass die relative Wiederfindung von vielen Faktoren
beeinflusst wird. Dazu gehören unter anderem Länge, Durchmesser, Material und
Molekülmassen-Ausschlussgrenze der Dialysemembran, die Flussrate des Perfusats, die
Diffusionsgeschwindigkeit des Arzneistoffes in der Membran und im Medium des äußeren
Kompartimentes sowie die Temperatur des Donor-Mediums [81, 88].
Mit der Entwicklung des Mikrodialysesystems waren die Faktoren, die die Dialysemembran
betrafen, bereits durch die Wahl der entsprechenden Hohlfaserkapillaren festgelegt. Die
Polysulfon-Kapillaren weisen eine Molekülmassen-Ausschlussgrenze von 5000 Da auf.
Diese Molekülmassen-Ausschlussgrenze ermöglicht den ungehinderten Transport von
kleinen Molekülen, wie Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan durch die Membran und
verhindert den Transport von größeren Molekülen, wie Proteinen oder anderen
Makromolekülen. Dieses hat den Vorteil, dass Dialysatproben häufig ohne Vorbehandlung
mit der HPLC analysierbar sind [81, 88]. Die verwendete Mikrodialyseeinheit begünstigt mit
ihrer großen Austauschfläche von circa 26 cm2 eine hohe relative Wiederfindung, da sich die
Diffusion des Arzneistoffes nach dem 1. FICK‘SCHEN GESETZ proportional zur Diffusionsfläche
verhält [85]. Die Flussrate von 1 mL/min wurde nach Vorversuchen festgelegt, um in einem
kurzen Zeitintervall ein entsprechend großes Dialysatvolumen von 300 µL zur Arzneistoff-
quantifizierung zur Verfügung zu haben.
4.2.1 Untersuchungen zur Etablierung des Versuchsaufbaus und des Versuchsablaufes
Zu Beginn der In vitro-Untersuchungen wurde der Einfluss der Rührgeschwindigkeit und der
Einfluss des verwendeten Gerätes auf die relative Wiederfindung bestimmt. Die
Untersuchungen wurden mit Homogenisierung bei 100 Bewegungen pro Minute mit einem
Horizontalschüttler, bei 100, 200 und 300 Umdrehungen pro Minute mit einem Magnetrührer
sowie ohne Homogenisierung durchgeführt. Die fehlende Homogenisierung führte zu stark
schwankenden Werten für die relative Wiederfindung von durchschnittlich 14 % bei
Diskussion
71
Verwendung der niedrig und hoch konzentrierten Paracetamol-Lösung, sodass eine
schlechte Reproduzierbarkeit gegeben war. Diese beruhte wahrscheinlich auf der vereinzelt
und unregelmäßig auftretenden Bewegung des Mikrodialysesystems bei der Nutzung und
Probennahme in Verbindung mit einer geringen Diffusionsgeschwindigkeit der
Arzneistoffmoleküle im Donor-Medium. Es ist anzunehmen, dass das große
Konzentrationsgefälle zwischen der Arzneistofflösung und dem Perfusat zu einem
Stoffdurchtritt durch die semipermeable Membran führte und die arzneistofffreien Bereiche
um die Kapillarmembran dann mit Arzneistoffmolekülen aus weiter entfernten Bereichen des
Donor-Mediums aufgefüllt wurden. Dies erfolgte relativ langsam entlang des
Konzentrationsgradienten über die Diffusion der Teilchen, sodass es zu einer Verarmung
des Arzneistoffes in den kapillarnahen Bereichen des Donor-Mediums kommen konnte. Mit
der Homogenisierung des Donor-Mediums wurde dieses Problem behoben und es konnten
reproduzierbare Ergebnisse in den In vitro-Untersuchungen gewonnen werden. Der Einsatz
des Horizontalschüttlers resultierte in einem erhöhten Wert von 28 % für die relative
Wiederfindung. Die ständige horizontale Bewegung des Donor-Kompartimentes, die durch
den Horizontalschüttler verursacht wurde, erschwerte allerdings die einheitliche
Probennahme sowie die Zugabe weiterer Lösungen. Daher erwies sich die Nutzung des
Horizontalschüttlers in der Praxis als unvorteilhaft. Die Verwendung des Magnetrührers zur
Homogenisierung des Mediums im Donor-Kompartiment führte dagegen für alle
untersuchten Rührgeschwindigkeiten (100 bis 300 Umdrehungen pro Minute) zu ähnlichen
Werten für die relative Wiederfindung von durchschnittlich 36 % mit geringen
Standardabweichungen. Die stärkere Bewegung der Mikrodialyseeinheit im Donor-
Kompartiment bei Verwendung von 200 und 300 Umdrehungen pro Minute beruhte auf der
kegelförmigen Kreisströmung des Donor-Mediums. Die dabei auf die Mikrodialyseeinheit
einwirkenden Strömungskräfte können zu einer Beschädigung der Mikrodialyseeinheit
führen, zum Beispiel durch Kollision der Mikrodialyseeinheit mit dem Magnetrührer, und
somit eine mehrmalige In vitro-Nutzung verhindern. Weiterhin kann diese Kreisströmung
nicht mit den Vorwärtsbewegungen des Mikrodialysesystems im nüchternen Dünndarm
verglichen werden. In vivo ist eine schnelle Vorwärtsbewegung des Mikrodialysesystems in
der Phase III des IMMC zu erwarten, da währenddessen gerichtete peristaltische
Kontraktionen zur Bereinigung des Dünndarmes von unverdaulichen Nahrungsresten und
anderen Bestandteilen auftreten. Ein Weitertransport des Mikrodialysesystems erfolgt
wahrscheinlich ebenfalls während der Phase II des IMMC durch die unregelmäßig
auftretenden intestinalen Kontraktionen [20]. Die Hauptbelastung des Mikrodialysesystems
durch die auftretenden Zugkräfte sollte dabei jedoch an den Schläuchen und dem
Zuggewicht hervorgerufen werden. Durch die Materialauswahl für das Zuggewicht und die
Schläuche wurde beides bereits bei der Entwicklung berücksichtigt.
Diskussion
72
Die Verwendung des Magnetrührers in den In vitro-Untersuchungen resultierte in einem
Versuchsaufbau der einen hohen Grad an Standardisierung und Reproduzierbarkeit bot, da
die Homogenisierung des Mediums ab 100 Umdrehungen pro Minute zu einer
gleichmäßigen Verteilung des Arzneistoffes im Medium führte. Deshalb wurde für alle
nachfolgend aufgeführten In vitro-Untersuchungen der Magnetrührer mit 100 Umdrehungen
pro Minute genutzt, um einen Versuchsaufbau zu Verfügung zu haben, der eine
beschädigungsfreie und zuverlässige In vitro-Prüfung des neu entwickelten und adaptierten
Mikrodialysesystems ermöglichte.
Zur Etablierung des Versuchsablaufes wurde der Einfluss der Equilibrierzeit und der
Temperatur auf die relative Wiederfindung des Arzneistoffes in den Dialysatproben
untersucht. Es wurden Experimente mit Equilibrierzeiten von 0 min, welches dem
kontinuierlichen Fluss des Perfusats entsprach, sowie mit Equilibrierzeiten von 1, 5 und
60 min durchgeführt. Die Equilibrierzeit bei Anwendung des diskontinuierlichen Perfusat-
flusses basierte auf dem modifizierten Versuchsablauf mit dem Eibringen von Luftblasen in
den Ablaufschlauch zum Abtrennen der gewonnenen Dialysatproben. Es wurde erwartet,
dass eine Equilibrierzeit von 1 min oder mehr mit einer erhöhten relativen Wiederfindung
verbunden ist, da ein längerer Zeitraum zum Erreichen des Konzentrationsgleichgewichtes
zwischen Donor-Kompartiment und Perfusat zur Verfügung stand.
Für Paracetamol wurde die relative Wiederfindung bei Anwendung einer Equilibrierzeit von
mindestens 1 min im Vergleich zur Anwendung ohne eine Equilibrierphase verdoppelt. Dabei
traten keine großen Unterschiede zwischen den Ergebnissen mit 1 und 60 min dauernden
Equilibrierzeiten auf. Die Erhöhung der Untersuchungstemperatur auf Körpertemperatur
resultierte für alle Equilibrierzeiten in erhöhten Werten für die relative Wiederfindung im
Vergleich zu den Ergebnissen, die bei Raumtemperatur erhalten wurden. Für Amoxicillin und
Valsartan konnten diese Ergebnisse ebenfalls bestätigt werden. Die relative Wiederfindung
für die Equilibrierzeiten von 1 und 5 min waren sehr ähnlich und die Untersuchungen bei
Körpertemperatur führten ebenfalls zu einer Erhöhung der Werte. Die Werte für die relative
Wiederfindung der eingesetzten niedriger konzentrierten Arzneistofflösungen im Donor-
Kompartiment waren im Allgemeinen minimal höher als für die verwendeten höher
konzentrierten Lösungen. Obwohl die Unterschiede größtenteils im Bereich der Streuung der
Werte lagen, ist dies wahrscheinlich auf die geringere Anzahl an Arzneistoffmolekülen im
Donor-Medium zurückzuführen. Beim Durchtritt durch die semipermeable Kapillarmembran
kann somit von einer geringeren Beeinflussung der Moleküle untereinander im Vergleich zur
höher konzentrierten Lösung ausgegangen werden.
Diskussion
73
Der Versuchsablauf mit dem kontinuierlichen Fluss des Perfusats führte über den gesamten
Versuchszeitraum zu einem gleichmäßigen Stoffaustausch zwischen dem Donor-
Kompartiment und dem Perfusat. Der Arzneistoff, der in das Perfusat übertrat, wurde sofort
in den Ablaufschlauch weitertransportiert. Die Flussrate von 1 mL/min bedingte einen
schnellen Weitertransport des Perfusats und damit das unvollständige Erreichen des
Gleichgewichtszustandes zwischen beiden Kompartimenten. Diese Flussrate war jedoch
notwendig, um in einem geeigneten Zeitintervall ausreichend große Dialysatproben für die
quantitative Analytik zu gewinnen.
Der diskontinuierliche Transport des Perfusats mit 1 mL/min führte mit einer Pumpzeit von
18 s zu den vorgesehenen Dialysatvolumina von jeweils 300 µL. Während der Transport des
Perfusats pausierte, wurde die in den Ablaufschlauch transportierte Dialysatprobe durch eine
Luftblase von der nächsten Probe abgetrennt. Zeitgleich erfolgte ein Stoffaustausch
zwischen dem Donor-Kompartiment und dem Perfusat, wobei eine längere Kontaktzeit
zwischen beiden Kompartimenten im Vergleich zum kontinuierlichen Perfusatfluss bestand.
In Abhängigkeit vom Versuch waren 1, 5 oder 60 min für diesen Stoffaustausch vorgesehen.
Anhand der ähnlichen Werte für die relative Wiederfindung für die Equilibrierzeiten von 1, 5
und 60 min kann von einem sehr schnellen Stoffaustausch bereits in der 1. min
ausgegangen werden. Da das Gesamtkapillarinnenvolumen circa 100 µL betrug und das
gewonnene Dialysatprobenvolumen bei 300 µL lag, war die erhaltene relative Wiederfindung
ein Wert, der sich aus zwei Teilwerten zusammensetzte. Für die ersten 100 µL des Dialysats
konnte von einem nahezu vollständigen Erreichen des Equilibriums ausgegangen werden.
Die restlichen 200 µL des Dialysats kamen nur kurz beim kontinuierlichen Weitertransport in
den Ablaufschlauch mit dem Donor-Medium in Berührung. Dies entsprach dem
Stoffaustausch, der unter Verwendung des kontinuierlichen Flusses gegeben war. Somit ist,
für das mit dem diskontinuierlichen Fluss bei 1 mL/min gewonnene Dialysatvolumen von
300 µL, niemals eine relative Wiederfindung von 100 % zu erreichen. Die leicht erhöhten
Werte der relativen Wiederfindung bei einer Equilibrierzeit von 5 und 60 min gegenüber den
Werten die bei einer 1 minütigen Equilibrierzeit gewonnen wurden, können durch die
Diffusion der Arzneistoffmoleküle aus den ersten 100 µL in das nachfolgende Perfusat erklärt
werden. Somit führte das gewonnene Dialysatvolumen von 300 µL im Vergleich zum
Gesamtkapillarinnenvolumen von 100 µL zu einer verringerten Verunreinigung der
nachfolgenden Proben.
Die Anwendung des Versuchsablaufes mit dem kontinuierlichen Fluss ermöglichte die
Verwendung des einfach aufgebauten Mikrodialysesystems, mit Mikrodialyseeinheit sowie
Zu- und Ablaufschlauch. Die unkomplizierte Handhabung während der Untersuchungen
führte wahrscheinlich zur breiten Anwendung dieses Versuchsablaufes bei früheren
Diskussion
74
Untersuchungen von Stoffkonzentrationen mittels Mikrodialysesonden [92, 97, 100, 121,
122]. In diesen Untersuchungen werden häufig Perfusionsraten von 1 µL/min angewendet,
um mit einer einzelnen Mikrodialysekapillare oder Mikrodialysesonde einen vollständigen
Stoffaustausch zwischen dem Donor-Kompartiment und dem Perfusat zu erhalten. Dies
bedingte wiederum größere Abstände von 10 bis 60 min, um ein entsprechend großes
Dialysatvolumen von bis zu 60 µL zur Stoffquantifizierung aufzufangen. Im Vergleich dazu
konnten mit dem neu entwickelten Mikrodialysesystem mit einer Mikrodialyseeinheit, die aus
30 Kapillaren bestand, eine höhere Perfusatflussrate von 1 mL/min angewendet werden und
somit Dialysatproben von 300 µL im Minutenabstand aufgefangen werden.
Der Versuchsablauf mit dem diskontinuierlichen Perfusatfluss von 1 mL/min ermöglichte bei
Nutzung des neu entwickelten Mikrodialysesystems eine Erhöhung der relativen
Wiederfindung des Arzneistoffes in den Dialysatproben. Bisher wurde dieser Versuchsablauf
zur Bestimmung von Stoffkonzentrationen mittels Mikrodialysesonden nicht angewendet.
Dabei ist nicht bekannt, ob der modifizierte Aufbau eines solchen Systems oder die
Handhabung während des Versuches dafür verantwortlich sind. Ein weiterer Vorteil dieses
Versuchsablaufes war die Abtrennung der Proben durch Luftblasen, sodass die Proben
einfach aufgefangen und zugeordnet werden konnten. Die Ergebnisse der relativen
Wiederfindung für die Untersuchungen mit 1, 5 und 60 min dauernden Equilibrierzeiten
unterschieden sich kaum, sodass in den nachfolgenden Experimenten mit einer
Equilibrierzeit von 1 min weitergearbeitet wurde, um eine hohe zeitliche Auflösung bei der
Konzentrationsbestimmung im Donor-Kompartiment zu erhalten.
Bei den Untersuchungen zum Einfluss der Equilibrierzeit, die bei Raum- und
Körpertemperatur durchgeführt wurden, zeigte sich ein Einfluss der Temperatur auf die
relative Wiederfindung der Arzneistoffe. Aus diesem Grund wurden die Ergebnisse, die mit
der relevanten Equilibrierzeit von 1 min ermittelt wurden, nochmals separat dargestellt. Die
Temperierung auf Körpertemperatur führte in allen Experimenten zu erhöhten Werten für die
relative Wiederfindung im Vergleich zur Durchführung bei Raumtemperatur. Dies ist auf die
proportionale Abhängigkeit des Diffusionskoeffizienten von der Temperatur zurückzuführen,
die in der STOKES-EINSTEIN-GLEICHUNG (siehe Gleichung 2) festgeschrieben ist [35, 36].
Danach führt eine Temperaturerhöhung im Donor-Kompartiment zu einer Erhöhung des
Diffusionskoeffizienten des jeweiligen Arzneistoffes und somit zu einer verstärkten Diffusion
der Arzneistoffmoleküle im Donor-Medium und durch die Kapillarmembran. Bei Anwendung
des diskontinuierlichen Perfusatflusses ist der Wert der relativen Wiederfindung aus den
vorher beschrieben Teilwerten, mit vollständiger Equilibrierung für die ersten 100 µL und
unvollständigem Konzentrationsausgleich für die restlichen 200 µL, zusammensetzt. Somit
konnte von den Experimenten bei Raumtemperatur nicht auf die Ergebnisse bei
Diskussion
75
Körpertemperatur geschlossen werden. Mit 7 bis 9 % Unterschied in der relativen
Wiederfindung zwischen beiden Untersuchungstemperaturen war der Einfluss auch nicht zu
vernachlässigen, sodass alle nachfolgenden Untersuchungen ausschließlich bei der im
Dünndarm herrschenden Temperatur von 37 °C durchgeführt wurden.
Bei der Auswertung der Daten, die bei Körpertemperatur und einer 1 minütigen Equilibrierzeit
gewonnen wurden, konnte ebenfalls ein Einfluss der Molekülmasse des Arzneistoffes
festgestellt werden. Zum besseren Vergleich wurden die entsprechenden Ergebnisse in
einem Diagramm zusammengefasst (Abbildung 39).
Abbildung 39: Einfluss der Molekülmasse des Arzneistoffes auf die relative Wiederfindung (RR) bei
Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei Körpertemperatur,
PCM: Paracetamol, AMX: Amoxicillin und VAL: Valsartan, PP: Phosphatpuffer pH 6,8
USP (MW + SD, n = 3).
Die verwendeten Arzneistoffe wiesen Molekülmassen von 151, 365 und 435 g/mol für
Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan auf. Daraus resultieren unterschiedliche
hydrodynamische Durchmesser, die laut der STOKES-EINSTEIN-GLEICHUNG (siehe
Gleichung 2) indirekt proportional zum Diffusionskoeffizienten sind [35, 36]. Somit wurde für
Paracetamol mit einer kleinen Molekülmasse ein größerer Diffusionskoeffizient im Vergleich
zu Amoxicillin und Valsartan erwartet. Folglich wurde für Paracetamol auch mit einem
höheren Wert für die relative Wiederfindung gerechnet, da pro Zeiteinheit mehr Teilchen
durch die Kapillarmembran diffundieren können. Mit den durchgeführten Experimenten
konnte für Paracetamol eine relative Wiederfindung von durchschnittlich 63 % ermittelt
werden. Für Amoxicillin und Valsartan wurden Werte bestimmt, die sich mit durchschnittlich
50 und 49 % nicht stark voneinander unterschieden, allerdings um 13 % gegenüber
Paracetamol verringert waren. Dies bestätigte, dass die Molekülmasse eines Arzneistoffes,
über dessen hydrodynamischen Durchmesser, den Diffusionskoeffizienten beeinflussen
Diskussion
76
kann und damit seinen Transport durch die semipermeable Membran. Die Ergebnisse der
drei verwendeten Arzneistoffe können für eine erste Abschätzung der relativen
Wiederfindung für weitere Arzneistoffe genutzt werden. Allerdings ist es notwendig, den Wert
für jeden Stoff individuell zu bestimmen, da Stoffe mit niedrigeren Molekülmassen
untereinander, mit den Medien oder der Kapillarmembran wechselwirken können und für
Stoffe mit Molekülmassen über 435 g/mol momentan keine Referenzwerte vorliegen.
4.2.2 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Konzentrationsänderungen
Zur weitergehenden Charakterisierung des neu entwickelten Mikrodialysesystems wurde die
Sensitivität des Systems untersucht. Dabei sollte ermittelt werden, ob und wie schnell
Arzneistoffkonzentrationen und Konzentrationsänderungen im Donor-Kompartiment in den
Dialysatproben abgebildet werden konnten. Für diese Untersuchungen wurde die
Mikrodialyseeinheit zunächst in arzneistofffreies Medium eingebracht. Nach der Gewinnung
von fünf Dialysatproben wurde eine arzneistoffhaltige Lösung hinzugefügt und fünf weitere
Dialysatproben aufgefangen. Anschließend wurde die Arzneistoffkonzentration im Donor-
Kompartiment durch erneute Zugabe von arzneistofffreiem Medium halbiert. Nachfolgend
wurden fünf weitere Dialysatproben gewonnen. Die ermittelte Arzneistoffkonzentration wurde
unter Einbeziehung des Skalierungsfaktors berechnet. Obwohl der diskontinuierliche
Perfusatfluss, wie eben beschrieben, einige Vorteile gegenüber dem kontinuierlichen
Perfusatfluss bietet, wurde die Sensitivität, als wichtige Eigenschaft des Mikrodialysesystems
für die spätere Anwendung am Menschen, mit beiden Versuchsabläufen bestimmt.
Die Anwendung des kontinuierlichen Perfusatflusses und Paracetamol als Arzneistoff
resultierte in ermittelten Arzneistoffkonzentrationen in den Dialysatproben, die nicht den
theoretisch im Donor-Kompartiment vorliegenden Konzentrationen entsprachen. Bereits in
der fünften Dialysatprobe wurde Paracetamol nachgewiesen, obwohl zu diesem Zeitpunkt
noch kein Arzneistoff im Donor-Kompartiment vorhanden war. Zusätzlich war lediglich eine
langsame Erhöhung und Verringerung der Arzneistoffkonzentration in den Dialysatproben im
Vergleich zur sprunghaften Änderung der Konzentration im Donor-Kompartiment zu
verzeichnen. Diese Beobachtung lässt sich am wahrscheinlichsten auf die Strömung der
Flüssigkeit im Schlauch zurückzuführen. Es ist anzunehmen, dass während das Perfusat
und später das Dialysat durch den Schlauch transportiert wurden, in den wandnahen
Bereichen der Flüssigkeit Reibungseffekte durch den Kontakt mit dem Schlauch auftraten.
Dies würde zu einer niedrigen Fließgeschwindigkeit der Flüssigkeit in der Nähe der
Schlauchwand und in einer maximalen Fließgeschwindigkeit der Flüssigkeit in der Mitte des
Schlauches führen [150]. Das verwendete Perfusat wäre durch das parabolische
Diskussion
77
Strömungsprofil (Abbildung 40) nicht in der Zusammensetzung verändert worden, da es
ohne weitere Einflüsse aus dem Vorratsgefäß in das Mikrodialysesystem gepumpt wurde.
Abbildung 40: Schematische Darstellung des parabolischen Strömungsprofils in einem Schlauch,
D: Schlauchdurchmesser.
Für das kontinuierlich im Ablauflaufschlauch transportierte Dialysat würde dieses
Fließverhalten jedoch in einer Durchmischung der Proben, die zu unterschiedlichen Zeiten
erhalten wurden und dementsprechend unterschiedliche Bestandteile enthielten, resultieren.
So erfolgte die Zugabe der arzneistoffhaltigen Lösung in das Donor-Kompartiment nachdem
das Dialysat der fünften Probe in den Ablaufschlauch transportiert wurde. Sobald die ersten
Arzneistoffmoleküle im Donor-Medium enthalten waren, konnten sie durch die
Dialysemembran diffundieren. Damit würde dem arzneistofffreien Dialysat das später
gewonnene Dialysat mit einem geringen Arzneistoffanteil im Ablaufschlauch folgen. Durch
das parabolische Strömungsprofil würde sich das arzneistoffhaltige Dialysat während des
Transportes im Ablaufschlauch immer weiter in das vorangegangene arzneistofffreie Dialysat
ausbreiten. Dies würde zu Dialysatproben führen, die Arzneistoff enthielten, obwohl laut
Versuchsablauf noch kein Arzneistoff in der Probe vorhanden war. Für die in der Literatur
beschriebenen Versuche mit Mikrodialysesonden in Kombination mit dem kontinuierlichen
Perfusatfluss ist die Durchmischung der Dialysatproben im Ablaufschlauch von geringerer
Relevanz, da die einzelnen Proben üblicherweise in einem Zeitraum von 10 bis 60 min
aufgefangen werden [92, 97, 100, 121, 122] und im Allgemeinen eine vollständige
Einstellung des Gleichgewichtszustandes zwischen beiden Kompartimenten erfolgt. Somit ist
innerhalb des entsprechenden Probenzeitraums von 10 bis 60 min keine Aussage zur
Erhöhung oder Verringerung der Stoffkonzentration im Donor-Kompartiment möglich,
sondern nur die durchschnittliche Stoffkonzentration in der Probe bestimmbar.
Die hohe Standardabweichung einzelner experimentell bestimmter Daten bei Anwendung
des kontinuierlichen Perfusatflusses ist insbesondere auf die manuelle Zugabe der
Arzneistofflösung und des arzneistofffreien Mediums zurückzuführen. Obwohl die Zugabe
der Paracetamol-Lösung abgeschlossen war bevor die nächste Probe gewonnen wurde, war
die Geschwindigkeit der Zugabe variabel. Damit unterschieden sich die
Diskussion
78
Arzneistoffkonzentrationen im Donor-Kompartiment zu einem definierten Zeitpunkt, was zu
unterschiedlichen Arzneistoffkonzentrationen in den Dialysatproben führte. Bei den
Untersuchungen mit dem kontinuierlichen Perfusatfluss wurde ebenfalls festgestellt, dass die
theoretische Arzneistoffkonzentration weder nach Zugabe der Paracetamol-Lösung noch
nach Verdünnung mit Phosphatpuffer pH 6,8 USP in den Dialysatproben erreicht wurde.
Dies ist auf die kurze Versuchsdauer von jeweils 5 min mit der entsprechend eingestellten
Arzneistoffkonzentration zurückzuführen. Ein kontinuierlicher Perfusatfluss resultierte somit
in einer verzögerten Detektion von Konzentrationsänderungen im Donor-Kompartiment. Die
ermittelten Arzneistoffkonzentrationen in den Dialysatproben bildeten nicht die aktuelle
Arzneistoffkonzentration im Donor-Kompartiment ab, sondern waren eine Mischung aus
Arzneistoffkonzentrationen die zu unterschiedlichen Zeiten gewonnen wurden. Es ist
anzunehmen, dass bei der Nutzung des kontinuierlichen Perfusatflusses in In vivo-Studien
intraluminale Konzentrationsänderungen nicht mit der angestrebten zeitlichen Auflösung von
1 min bestimmt werden können. Die Sensitivität des Mikrodialysesystems unter Verwendung
des kontinuierlichen Perfusatflusses entsprach damit nicht den Anforderungen, die an das
System gestellt wurden.
Die Sensitivität des Mikrodialysesystems wurde ebenfalls mit dem Versuchsablauf des
diskontinuierlichen Perfusatflusses untersucht. Ein zusätzlicher in das Mikrodialysesystem
integrierter Luftschlauch wurde genutzt, um die im Ablaufschlauch aufgefangene Dialysat-
probe durch eine Luftblase von der nachfolgend gewonnenen Probe abzutrennen. Zeitgleich
konnte während der einminütigen Equilibrierzeit ein verlängerter Stoffaustausch zwischen
dem Donor-Kompartiment und dem Dialysat erfolgen. Entsprechend den Erwartungen
zeigten die experimentell ermittelten Arzneistoffkonzentrationen in den Dialysatproben für
den kompletten Versuch und bei beiden Paracetamol-Lösungen eine gute Übereinstimmung
mit der jeweiligen theoretisch im Donor-Kompartiment enthaltenen Arzneistoffkonzentration.
Ein sprunghafter Anstieg oder Abfall der Paracetamol-Konzentration im äußeren
Kompartiment wurde immer sofort in der nachfolgend gewonnenen Dialysatprobe detektiert.
Dies ist höchstwahrscheinlich auf die sofortige Abtrennung der einzelnen Proben durch die
Luftblasen im Ablaufschlauch zurückzuführen, da somit keine Verunreinigung durch die
nachfolgenden Proben durch die parabolische Strömung im Schlauch auftreten konnte. Die
Separation der einzelnen Proben im Ablaufschlauch führte auch zu einer verringerten
Standardabweichung bei den experimentell bestimmten Daten im Vergleich zu den
Ergebnissen, die mit dem kontinuierlichen Perfusatfluss erhoben wurden. Änderungen der
Arzneistoffkonzentration im Donor-Kompartiment konnten mit einer sehr hohen zeitlichen
Auflösung sofort in den Dialysatproben abgebildet werden. Das Mikrodialysesystem wies
damit die angestrebte Sensitivität auf. In humanen Studien könnten somit
Diskussion
79
Arzneistoffkonzentrationen und Konzentrationsänderungen im Darmlumen im geringen
Abstand detektiert werden. Dies ist vor allem vor dem Hintergrund der schnellen Änderung
luminaler Arzneistoffkonzentrationen in einem definierten Darmabschnitt relevant, da
Absorptionsprozesse, Verdünnung mit intestinalen Sekreten sowie der Weitertransport des
Arzneistoffes innerhalb von Sekunden die Gegebenheiten im Dünndarm verändern können.
Bisher werden intestinale Proben im Abstand von 10 bis 20 min gewonnen und deren
Konzentration analysiert [59, 67, 68, 74], wobei Änderungen innerhalb dieses Zeitraumes
wegen der Durchmischung in der Probe nicht bestimmbar sind. Intraindividuelle
Schwankungen der maximalen Arzneistoffkonzentration, die im Dünndarm ermittelt wurden
[74], können somit auch auf dem zur Probengewinnung gewählten Zeitraum beruhen.
Obwohl die Nutzung des diskontinuierlichen Perfusatflusses einige Vorteile bietet, wurde
dies noch nicht in Untersuchungen der Stoffkonzentration mittels Mikrodialysesystemen
angewendet. Die Ursache könnte in dem veränderten Aufbau des Mikrodialysesystems
liegen oder auch in dem modifizierten Versuchsablauf mit der alternierenden Anwendung
von zwei Pumpen. Im Jahr 2011 wurde von Juluru et al. von einem intermittierenden
Versuchsablauf bei Anwendung eines Mikrodialysesystems mit linearer Sonde in der Haut
von Kaninchen berichtet [151]. Die Unterbrechung des Perfusatflusses bezieht sich hierbei
allerdings auf eine 4 bis 54 minütige Pause, in der keine Proben gewonnen werden. Die
Pausen sind in den Versuchsablauf integriert, um bei einer vorgesehenen Anwendung am
Menschen die Bewegungsfreiheit des Probanden zu erhöhen. Nach jeder Pause erfolgt
zunächst eine zweiminütige Spülung des Mikrodialysesystems. Anschließend wird das
Perfusat kontinuierlich mit einer geringen Flussrate von 5 µL/min durch das System
transportiert und die entsprechenden Proben aufgefangen. Diese Durchführung ist nicht mit
dem in dieser Arbeit angewandten diskontinuierlichen Perfusatfluss gleichzusetzen, da im
Gegensatz zu dem im Rahmen dieser Arbeit neu entwickelten Mikrodialysesystem weder die
Zeitspanne für den Stoffaustausch durch die Kapillarmembran vergrößert wird noch eine
Separation der Proben im Ablaufschlauch erfolgt.
Die verbesserte Leistungsfähigkeit des neu entwickelten Mikrodialysesystems mit
zusätzlichem Luftschlauch und die Anwendung des diskontinuierlichen Perfusatflusses mit
einer Equilibrierzeit von 1 min sowie Paracetamol als Arzneistoff entsprachen der
geforderten Sensitivität und führten zur ausschließlichen Nutzung dieses Versuchsablaufes
in den nachfolgend beschrieben Experimenten.
Diskussion
80
Die Sensitivität des Mikrodialysesystems wurde anschließend auch mit den Arzneistoffen
Amoxicillin und Valsartan untersucht. Für die Versuche mit Amoxicillin wurde ebenfalls eine
sofortige Detektion der Konzentrationsänderung im Donor-Kompartiment über die
Bestimmung der Arzneistoffkonzentration in der darauffolgenden Dialysatprobe nach-
gewiesen. Wie erwartet, gab es zwischen den ermittelten Arzneistoffkonzentrationen in den
Dialysatproben und den theoretisch im Donor-Kompartiment vorliegenden Konzentrationen
eine gute Übereinstimmung. Die Verwendung von Valsartan als Modellarzneistoff resultierte
ebenso in einer sofortigen Detektion der Konzentrationsänderung im Donor-Kompartiment in
der nachfolgend gewonnenen Dialysatprobe. Allerdings wurde mit diesem Arzneistoff die
theoretische Konzentration im Donor-Kompartiment nach Zugabe der Arzneistofflösung in
keiner der fünf aufgefangenen Dialysatproben bestimmt und große Standardabweichungen
ermittelt. Als Ursache dieser Abweichungen kommen ein unvollständiges Überführen der
Lösung in das Donor-Kompartiment, ein langsamerer Stoffaustausch durch die
Dialysemembran und Schwankungen im Bereich der normalen Leistungsfähigkeit des
Mikrodialysesystems in Betracht. Die genaue Ursache konnte im Rahmen dieser Arbeit
jedoch nicht mit Sicherheit bestimmt werden. Allerdings wurde festgestellt, dass die Differenz
von circa 15 % zwischen den experimentell ermittelten und theoretischen Werten für die
relative Wiederfindung außerhalb des Schwankungsbereiches, der im Rahmen der
mehrmaligen Nutzung des Mikrodialysesystems auftrat (siehe 3.2.3.1), lag.
Somit erfüllte das Mikrodialysesystem bei der Verwendung von Amoxicillin als Arzneistoff die
gestellten Anforderungen hinsichtlich der Sensitivität. Die Ergebnisse für Valsartan wiesen
große Standardabweichungen sowie Differenzen zu den theoretischen Werten auf. Im
Vergleich zu den Ergebnissen die mit Paracetamol und Amoxicillin gewonnen wurden, wurde
für das Mikrodialysesystems bei Anwendung mit Valsartan eine geringere Sensitivität
ermittelt.
Anschließend wurde die gegenseitige Beeinflussung der Arzneistoffe Paracetamol,
Amoxicillin und Valsartan bei der simultanen Verwendung sowie deren Einfluss auf die
Sensitivität des Mikrodialysesystems untersucht. Dafür wurden ein Einzelversuch mit einer
Lösung, die alle Arzneistoffe in der bisher verwendeten niedrigen Konzentration enthielt, und
ein Einzelversuch mit einer hoch konzentrierten Lösung aller Arzneistoffe durchgeführt. Zur
Berechnung der Arzneistoffkonzentration in den Dialysatproben wurden die vorher in den
Einzelversuchen der Arzneistoffe Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan bestimmten
Skalierungsfaktoren genutzt.
Für Paracetamol und Amoxicillin konnte für beide Untersuchungslösungen, wie für die
Einzelarzneistoffe bereits nachgewiesen, ein sprunghafter Anstieg und Abfall der Arzneistoff-
konzentration in den Dialysatproben gezeigt werden. Die geringe Abweichung der
Diskussion
81
experimentell ermittelten Amoxicillin-Konzentration von der theoretischen Konzentration bei
Verwendung der niedriger konzentrierten Lösung beruhte vermutlich auf einer verringerten
Arzneistoffkonzentration in der zugegebenen Lösung. Für beide Arzneistoffe wurde nach
Zugabe des arzneistoffhaltigen Mediums eine Arzneistoffkonzentration in der darauffolgend
gewonnenen Dialysatprobe bestimmt, die unterhalb der theoretischen Konzentration lag. Die
Differenz war mit hoher Wahrscheinlichkeit auf ein zu langsames Zugeben des
arzneistoffhaltigen Mediums zurückzuführen, da in den nachfolgenden Dialysatproben
annähernd die theoretische Konzentration messbar war. In den Einzelversuchen mit
Paracetamol und Amoxicillin (Abbildung 29 und 30 I) wurde ein Einfluss der
Zugabegeschwindigkeit des Mediums auf die experimentell ermittelte Konzentration in den
Dialysatproben ebenfalls festgestellt, wobei dieser geringer ausgeprägt war. Der Anstieg und
die Verringerung der Valsartan-Konzentration im Donor-Kompartiment wurden mit
Verzögerung in den Dialysatproben nachgewiesen. Darüber hinaus wurde die theoretische
Konzentration nicht erreicht, sodass hier ebenfalls die Ergebnisse der Untersuchungen mit
dem einzelnen verwendeten Arzneistoff bestätigt wurden. Obwohl bisher kein großer Einfluss
der Arzneistoffkonzentration auf die Diffusion der Arzneistoffmoleküle durch die
Kapillarmembran durch unterschiedlich konzentrierte Lösungen gezeigt werden konnte,
unterschieden sich beide Valsartan-Kurven in den Diagrammen mit den drei Arzneistoffen
deutlich voneinander (Abbildung 31). Zusätzlich konnte im Vergleich zu den Ergebnissen, die
mit Amoxicillin gewonnenen wurden, festgestellt werden, dass trotz dem ähnliche Werte für
die relative Wiederfindung ermittelt wurden, offensichtlich Unterschiede beim Stoffdurchtritt
durch die Kapillarmembran bestehen müssen. Als Ursache kann die Molekülstruktur von
Valsartan in Betracht gezogen werden. Valsartan erscheint als langgestrecktes Molekül, das
an einem Ende durch die Anordnung einer lipophilen Seitenkette gegenüber der hydrophilen
Carboxylgruppe große Dimensionen einnimmt (Abbildung 41 A). Für Amoxicillin sind
ähnliche Dimensionen in der Länge des Moleküls vorhanden, wobei die Ausdehnung des
gesamten Moleküls in der Breite viel geringer ausfällt (Abbildung 41 B). Somit wäre eine
Verzögerung bei der Diffusion durch die Poren der Membran durch die gegenseitige
Behinderung der Valsartan-Moleküle aufgrund der Molekülausdehnungen möglich.
Diskussion
82
Abbildung 41: Dreidimensionale Ansicht der Arzneistoffe, A: Valsartan und B: Amoxicillin (Sauerstoff
in rot, Stickstoff in blau, Schwefel in gelb und Wasserstoff in weiß).
Weiterhin könnten Wechselwirkungen des Valsartans mit der Dialysemembran aufgetreten
sein. So berichtet Lonnemann von Wechselwirkungen zwischen den hydrophoben Bereichen
einer Polysulfonmembran und hydrophoben Stoffen, wie zum Beispiel Lipopolysacchariden
[152]. Dies führt zur Adsorption entsprechender Endotoxine an die Kapillarmembran, sodass
sich eine reduzierte Endotoxinpermeabilität ergibt. Über den logP-Wert von Valsartan kann
dieses Verhalten jedoch nicht ausreichend erklärt werden, da für Amoxicillin und Valsartan
ähnliche logP-Werte von circa -1,4 im physiologischen pH-Bereich des nüchternen
Dünndarmes bestimmt wurden [153, 154]. Betrachtet man jedoch die Verteilung der
lipophilen und hydrophilen Bereiche beider Moleküle, so sind Unterschiede zu erkennen.
Während sich bei Amoxicillin die hydrophilen Bereiche relativ gleichmäßig über das gesamte
Molekül erstrecken sind bei Valsartan ausgedehnte lipophile Strukturen zu erkennen.
Aufgrund der ermittelten Ergebnisse kann mit hoher Wahrscheinlichkeit davon ausgegangen
werden, dass Valsartan an die Polysulfonmembran adsorbierte. Vor allem bei geringen
Arzneistoffkonzentrationen im Donor-Kompartiment adsorbierten vermutlich zuerst
Valsartan-Moleküle an der Membran, bevor die Diffusion durch die Kapillaren in das Dialysat
erfolgte (Abbildung 31 A). Bei der Anwendung höher konzentrierter Valsartan-Lösungen
erfolgte wahrscheinlich für eine größere Anzahl an Molekülen der Stoffdurchtritt durch die
Membran, da mehr Moleküle für beide Prozesse zur Verfügung standen (Abbildung 31 B).
Wenn davon ausgegangen wird, dass der adsorbierte Anteil an Valsartan nicht für die
Diffusion zur Verfügung stand, entsprach dies einer erniedrigten Ausgangskonzentration im
Donor-Kompartiment. Dies bedingte wiederum eine verringerte maximal gemessene
Konzentration in den Dialysatproben wie sie bei beiden Kurven ermittelt wurde. Die
Ergebnisse aus eigenen vorangegangenen Adsorptionsuntersuchungen mit Valsartan und
A B
Diskussion
83
Silikonschläuchen [155] ließen diese hydrophoben Wechselwirkungen nicht erkennen.
Inwieweit der Effekt der Molekülstruktur zu einer verringerten Valsartan-Konzentration im
Dialysat beitrug konnte nicht mit Sicherheit bestimmt werden.
Die erhaltenen Ergebnisse belegen, dass keine gegenseitige Beeinflussung der drei
Arzneistoffe Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan bei der simultanen Verwendung der
niedriger oder höher konzentrierten Lösung vorlag. Die Adsorption des Valsartans an die
Kapillarmembran war mit hoher Wahrscheinlichkeit spezifisch für diesen Arzneistoff und auf
Wechselwirkungen zwischen hydrophoben Stoffen zurückzuführen. Die geforderte
Sensitivität des Mikrodialysesystems konnte somit für Paracetamol und Amoxicillin bestätigt
werden. Die Untersuchungen mit Valsartan resultierten in der sofortigen Detektion von
Konzentrationsänderungen, wobei die theoretische Konzentration nicht erreicht wurde. Dies
entspricht bei allen Arzneistoffen den Ergebnissen, die bereits mit den Einzelstoffen erhalten
wurden. Der Einsatz des Mikrodialysesystems in humanen Studien ist somit für die
Arzneistoffe Paracetamol und Amoxicillin möglich. Für Valsartan sollten vorher weitere
Untersuchungen zur Bestimmung des Ausmaßes der vermuteten Adsorption vorgenommen
werden.
Nach Untersuchungen mit dem Versuchsablauf des kontinuierlichen und diskontinuierlichen
Perfusatflusses lässt sich feststellen, dass die Nutzung des diskontinuierlichen Flusses mit
einigen Vorteilen verbunden war. Die gewonnenen Dialysatproben konnten sehr gut durch
die Abtrennung durch Luftblasen in einzelnen Vials aufgefangen werden. Die damit
verbundene Separation von vorherigen und nachfolgenden Proben verhinderte eine
Durchmischung mit diesen Proben. Somit entsprachen die ermittelten Arzneistoff-
konzentrationen in den Dialysatproben der theoretischen Arzneistoffkonzentration im Donor-
Kompartiment. Außerdem konnten Konzentrationsänderungen im Donor-Kompartiment sehr
schnell detektiert werden. Als Ausnahme sind die Ergebnisse von Valsartan zu betrachten,
bei denen in allen Versuchen die theoretische Konzentration unterschritten wurde wurde.
4.2.3 Einfluss verschiedener Parameter auf die relative Wiederfindung bei Anwendung des
diskontinuierlichen Flusses
Die hergestellten Mikrodialysesysteme sollten mehrmalig für verschiedene In vitro-
Untersuchungen verwendet werden. Deshalb wurde ein repräsentatives Mikrodialysesystem
über 14 Versuchstage genutzt und dessen relative Wiederfindung bei Anwendung einer
Equilibrierzeit von 1 min an acht verschiedenen Untersuchungstagen bestimmt. Um
identische Bedingungen im Vergleich zu den Versuchen mit anderen Mikrodialysesystemen
zu gewährleisten, wurde das Mikrodialysesystem nach jedem Einzelexperiment zur
Diskussion
84
Reinigung gespült und am Ende des Versuchstages bis zur nächsten Verwendung im
Trockenen gelagert. Die ermittelten Ergebnisse für die relative Wiederfindung wiesen nur
geringe Schwankungen um den Mittelwert von 63,6 % auf. Im Verlauf der 14 Versuchstage
war für die acht ausgewählten Untersuchungstage kein Trend für steigende oder sinkende
Werte zu erkennen. Somit konnte die uneingeschränkte Funktionalität des Mikrodialyse-
systems für In vitro-Untersuchungen innerhalb eines Untersuchungszeitraumes von
14 Untersuchungstagen bestätigt werden.
Kommerziell erhältliche Mikrodialysesonden wurden bereits mehrfach für In vitro-
Untersuchungen genutzt [156]. In diesen Experimenten wurden die Sonden zwischen den
einzelnen Untersuchungstagen zuerst zur Reinigung gespült und dann zur Lagerung mit
destilliertem Wasser perfundiert. Diese Vorgehensweise hatte ebenfalls keinen Einfluss auf
die Wiederfindung der Analyten.
Obwohl die Funktionsfähigkeit des Mikrodialysesystems über 14 Versuchstage nach-
gewiesen wurde, erfolgte in Abständen die Bestimmung der relativen Wiederfindung der
verwendeten Mikrodialysesysteme, um Hinweise auf eine Fehlfunktion des Systems durch
undichte Verklebungen oder defekte Kapillaren zu erhalten.
Alle Mikrodialysesysteme wurden einzeln in Handarbeit hergestellt. Um die
Reproduzierbarkeit der Systeme zu untersuchen, erfolgte der Vergleich der relativen
Wiederfindung. Dabei wurden die Ergebnisse von acht Mikrodialysesystemen für den
Arzneistoff Paracetamol und von jeweils vier Mikrodialysesystemen für die Arzneistoffe
Amoxicillin und Valsartan voneinander getrennt betrachtet. Für Paracetamol wurde für alle
untersuchten Mikrodialysesysteme ein ähnlicher Wert für die relative Wiederfindung von
65,6 ± 2,2 % bestimmt. Die Ergebnisse für Amoxicillin (48,9 ± 2,5 %) und Valsartan
(50,6 ± 2,5 %) unterschieden sich ebenfalls nur minimal.
Die ermittelten Standardabweichungen der relativen Wiederfindung für verschiedene
Mikrodialysesysteme entsprechen den von Abrahamson et al. ermittelten Abweichungen bei
Verwendung von 14 kommerziell erhältlichen Mikrodialysesonden einer Bauart [157]. Dabei
wurde Glucose, ein Molekül mit ähnlicher Molekülmasse wie Paracetamol, Amoxicillin und
Valsartan, verwendet und interindividuelle Abweichungen bei der relativen Wiederfindung
von durchschnittlich 5 % bestimmt. Dagegen ergaben In vitro-Experimente mit Makro-
molekülen, dass eine große Variabilität der relativen Wiederfindung zwischen einzelnen,
kommerziell erhältlichen Mikrodialysesonden einer Bauart bestand [158]. So wurden bei
diesen Untersuchungen keine signifikanten Änderungen der relativen Wiederfindung
ermittelt, wenn bei unterschiedlichen Temperaturen (20 und 37 °C) gearbeitet wurde. Für das
neu entwickelte Mikrodialysesystem wurden nur geringe Unterschiede hinsichtlich der
Diskussion
85
relativen Wiederfindung bei der Verwendung verschiedener Systeme bestimmt.
Temperaturänderungen resultieren allerdings in Werten für die relative Wiederfindung, die
sich mit 7 bis 9 % deutlich voneinander unterschieden. Somit konnte von einer
reproduzierbaren Einzelherstellung der Mikrodialysesysteme ausgegangen werden.
Die vorgesehene Nutzung des Mikrodialysesystems zur Bestimmung luminaler Arzneistoff-
konzentrationen im Dünndarm des Menschen wurde mit Untersuchungsmedien, die den
humanen intestinalen Flüssigkeiten nachempfunden sind, simuliert. Dabei wurde der Einfluss
eines einfachen Donor-Mediums wie Salzsäure pH 1,2 sowie komplexer zusammengesetzter
Medien wie Bicarbonatpuffer pH 6,8, FaSSIF und FeSSIF auf die relative Wiederfindung von
Paracetamol untersucht. Das bisherige Donor-Medium Phosphatpuffer pH 6,8 USP diente
mit einer relativen Wiederfindung von durchschnittlich 68 % als Referenz. Der Einsatz von
Salzsäure pH 1,2 erfolgte, um die Magenpassage des Mikrodialysesystems bei niedrigen
pH-Werten zu simulieren. Dies entsprach der vorgesehenen Anwendung bei nüchternen
Probanden, da bei jungen gesunden Personen mehrheitlich pH-Werte zwischen pH 1 und 4
gemessen wurden [12, 13]. Bei dieser Untersuchung sollte sowohl die Integrität der Kapillar-
membran nach Versuchsende als auch die Funktionsfähigkeit der Mikrodialyseeinheit
untersucht werden. Die ermittelten Werte für die relative Wiederfindung von durchschnittlich
71 % bestätigten, dass das Mikrodialysesystem auch bei niedrigen pH-Werten eingesetzt
werden kann. Der verwendete Bicarbonatpuffer pH 6,8 imitierte die Hydrogencarbonat-
sekretion im humanen Dünndarm. Dieses stellt das intestinale Hauptpuffersystem dar und
wird über die Kohlensäure- und Bicarbonatkonzentration gesteuert [64]. Das im Puffer
enthaltene Natriumhydrogencarbonat bildet im wässrigen Milieu Kohlensäure, welche zu CO2
und Wasser dissoziieren kann. Das entstehende CO2 wird dann abgegeben und einzelne
CO2-Bläschen könnten den Stofftransport durch die semipermeable Membran durch
Anheften und Verstopfen einiger Poren beeinträchtigen. Die relative Wiederfindung von
durchschnittlich 69 % stimmte mit dem für Phosphatpuffer pH 6,8 USP gewonnenen
Ergebnis sehr gut überein. Ein Einfluss des enthaltenen Hydrogencarbonats auf die
Funktionsfähigkeit der Mikrodialyseeinheit war somit nicht erkennbar. Die biorelevanten
Medien FaSSIF und FeSSIF simulierten neben dem intestinalen pH-Wert und der
Osmolalität auch den emulgierenden Effekt der Gallensalze während der Dünndarmpassage.
Der Anteil der Gallensalze ist bei FeSSIF, dem postprandialen Medium, um das Fünffache
gegenüber FaSSIF, dem Medium für den nüchternen Dünndarm, erhöht [109, 111, 159].
Beide Medien weisen eine Viskosität auf, die der humanen intestinalen Flüssigkeit aus dem
nüchternen Dünndarm entspricht [160]. Für FaSSIF wurde mit 66 % ein Wert für die relative
Wiederfindung bestimmt, der eine gute Übereinstimmung mit dem Referenzwert aufweist.
Somit war unter den simulierten Testbedingungen des nüchternen Dünndarmes in vitro keine
Diskussion
86
Beeinträchtigung der Funktion des Mikrodialysesystems zu beobachten. Der leicht
verringerte Wert von 63 % für die relative Wiederfindung für FeSSIF könnte auf der erhöhten
Osmolalität des Mediums [111] und damit auf der gegenseitigen Beeinflussung der Moleküle
beim Durchtritt durch die poröse Membran beruhen. Ebenso könnten die Adsorption der
enthaltenen Gallensalze an die Kapillarmembran oder die Verstopfung der Poren durch
selbige zu diesem Ergebnis geführt haben. Auch wenn das Mikrodialysesystem zur
Untersuchung intestinaler Arzneistoffkonzentrationen im nüchternen Probanden genutzt
werden soll und die Ergebnisse, die mit FaSSIF gewonnen wurden, keine Beeinträchtigung
des Mikrodialysesystems erkennen lassen, sollte der Einfluss einer erhöhten
Gallensalzkonzentration und der Effekt aufgenommener Nahrung in weiteren Experimenten
untersucht werden.
Die Anwendung des Mikrodialysesystems in Studien am Menschen bedingt die Verwendung
von zugelassenen Arzneimitteln. Daraus ergab sich die Notwendigkeit, das bisherige
Perfusat Phosphatpuffer pH 6,8 USP zu ersetzen. Um den Einfluss des Perfusats auf die
Diffusion der Arzneistoffe durch die Kapillarmembran gering zu halten, sollte die
Zusammensetzung des Perfusats soweit wie möglich der Zusammensetzung des äußeren
Kompartiments entsprechen [81]. Zudem sollte der im Perfusat enthaltene Arzneistoff
möglichst schnell und ohne Probenaufarbeitung mit einer einfachen Analysenmethode
quantifizierbar sein. Nach Abwägung der einzelnen Punkte wurde das Perfusat
Phosphatpuffer pH 6,8 USP durch das Fertigarzneimittel Isotone Kochsalz-Lösung 0,9 %
Braun Infusionslösung (NaCl-Lösung) ersetzt. Die Produktspezifikation des Herstellers gab
den pH-Wert der NaCl-Lösung mit pH 4,5 bis 7,0 an. Um den Einfluss der NaCl-Lösung mit
den möglichen pH-Werten von pH 4,5 bis 7,0 auf die relative Wiederfindung von
Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan bestimmen zu können, wurden die NaCl-Lösungen
vor ihrer Verwendung auf pH 4,5 und 7,0 eingestellt. Für Amoxicillin und Valsartan ist die pH-
abhängige Löslichkeit beider Stoffe aufgrund ihrer Ionisierbarkeit bekannt. Allerdings sind
beide Arzneistoffe im Bereich zwischen pH 4,5 und 7,0 mit minimal 5,45 g/L für Amoxicillin
und 0,54 g/L für Valsartan für die durchgeführten Versuche ausreichend gut löslich [103,
106], sodass keine Beeinflussung der Ergebnisse aufgrund von Löslichkeitsproblemen
erwartet wurde. Für beide NaCl-Lösungen und alle Arzneistoffe wurden im Vergleich zum
bisherigen Perfusat ähnliche Werte für die relative Wiederfindung erhalten. Somit kann die
NaCl-Lösung als Perfusat in den geplanten Studien am Menschen verwendet werden.
Diskussion
87
4.2.4 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Verwendung biorelevanter Medien
Die vorgesehene In vivo-Anwendung des Mikrodialysesystems führte zur Untersuchung der
Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Verwendung der Medien Salzsäure pH 1,2,
Bicarbonatpuffer pH 6,8, FaSSIF und FeSSIF. Der Versuchsablauf mit arzneistofffreiem
Medium im Donor-Kompartiment zu Beginn des Experimentes, Zugabe der Paracetamol-
Lösung und Halbierung der Paracetamol-Konzentration im Donor-Kompartiment wurde, wie
bereits für Phosphatpuffer pH 6,8 USP beschrieben, angewendet. Die Arzneistoff-
konzentration in den Dialysatproben wurde mit dem vorher für Phosphatpuffer pH 6,8 USP
bestimmten Skalierungsfaktor berechnet. Für alle Medien wurden Ergebnisse erhalten, die
mit den theoretischen Werten gut übereinstimmten. Die Detektion von Konzentrations-
erhöhungen und -verringerungen im Donor-Kompartiment erfolgte für alle Medien ohne
erkennbare Verzögerung. Die minimale Abweichung der experimentell ermittelten
Arzneistoffkonzentration in den Dialysatproben die einer Konzentrationsänderung im
äußeren Kompartiment folgten (Probe 6 und 11), war auf die bereits diskutierte manuelle
Zugabe des Mediums innerhalb der einminütigen Equilibrierzeit zurückzuführen und somit
ein Artefakt des Versuchsablaufes.
Für Salzsäure pH 1,2 und die biorelevanten Medien Bicarbonatpuffer pH 6,8, FaSSIF und
FeSSIF wurde die Sensitivität des Mikrodialysesystems bestätigt. Die Ergebnisse belegen,
dass die Funktionsfähigkeit des Mikrodialysesystems im Dünndarmlumen durch die
vorhandenen intestinalen Medien des Gastrointestinaltraktes voraussichtlich nicht
beeinträchtigt wird. Eine nähere Betrachtung weiterer Einflüsse, die aufgrund verschiedener
gastrointestinal sekretierten Flüssigkeiten auftreten können, wie zum Beispiel die
Pufferkapazität oder die Oberflächenspannung, wurde nicht vorgenommen könnte aber
Gegenstand weiter Untersuchungen sein.
4.2.5 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Anwendung im Röhrenmodell
Die Anwendung des Mikrodialysesystems im Röhrenmodell erfolgte, um den In vitro-
Versuchsaufbau besser an die anatomischen Gegebenheiten des menschlichen Organismus
anzupassen. Dabei wurde der Einsatz des Systems im Dünndarm durch die Verwendung
eines Kunststoffschlauches zur Aufnahme der Lösung des Donor-Kompartiments simuliert.
Der Innendurchmesser des Kunststoffschlauches entsprach mit 2 cm annähernd dem
natürlichen Innendurchmesser des Dünndarmes [5]. In Anlehnung an die natürliche
Bewegung der Organe im Bauchraum, bedingt durch die Atmung des Probanden (10 bis
18 Atemzügen pro Minute, [6]), wurde der Kunststoffschlauch leicht bewegt. Für den Versuch
wurden 12 vertikale Bewegungen pro Minute ausgewählt, um eine adäquate Bewegung per
Diskussion
88
Hand ausüben zu können. Die eingesetzten Lösungen wurden mit einem verringerten
Volumen eingesetzt, da das Kunststoffschlauchvolumen nur zur Aufnahme von circa 0,6 L
Medium ausgelegt war. Die verwendeten Paracetamol-Lösungen enthielten den Arzneistoff
in der bislang verwendeten Konzentration, sodass die theoretische Konzentration im Donor-
Kompartiment im Vergleich zu den bisherigen Versuchen identisch war. Für beide
verwendeten Paracetamol-Lösungen konnte, wie in früheren Versuchen bereits nach-
gewiesen, eine Konzentrationserhöhung im Donor-Kompartiment sofort in der nachfolgend
gewonnenen Dialysatprobe detektiert werden. Die experimentell ermittelte Paracetamol-
Konzentration entsprach jedoch nahezu der doppelten theoretischen Konzentration. Die
Zugabe des arzneistofffreien Mediums resultierte in Paracetamol-Konzentrationen in den
Dialysatproben die sich mit leichter Verzögerung dem Nullpunkt näherten. Damit wichen
auch bei dieser Konzentrationsänderung die gemessenen Werte sehr stark von den
theoretischen Werten ab. Für diesen Versuch wurde die Paracetamol-Konzentration im
Donor-Kompartiment ebenfalls in der Nähe der Mikrodialyseeinheit bestimmt und die
ermittelten Werte in die Diagramme eingetragen. Es ist in beiden Diagrammen sehr gut
erkennbar, dass die gemessene Konzentration an der Mikrodialyseeinheit nach Zugabe der
Paracetamol-Lösung nahezu dem Zweifachen der theoretischen Konzentration entsprach.
Die Zugabe des arzneistofffreien Mediums resultierte wiederum in Paracetamol-
Konzentrationen an der Mikrodialyseeinheit, die unterhalb der Bestimmungsgrenze lagen.
Somit entsprach die experimentell ermittelte Paracetamol-Konzentration in den
Dialysatproben annähernd der gemessenen Konzentration an der Mikrodialyseeinheit. Die
unerwarteten Ergebnisse können mit dem Verhalten der Lösung im Kunststoffschlauch
erklärt werden. Zuerst wurde die Mikrodialyseeinheit vom Medium umgeben und der
Kunststoffschlauch manuell mit 12 Bewegungen pro Minute bewegt. Die Paracetamol-
Lösung wurde hinzugefügt, sodass das enthaltene Medium im Kunststoffschlauch weiter
transportiert wurde. Es traten nur geringe Durchmischungseffekte zwischen beiden
Lösungen auf, da die gemessenen Konzentrationen an der Mikrodialyseeinheit nahezu dem
Doppelten der theoretischen Konzentration entsprachen. Die anschließende Zugabe des
arzneistofffreien Mediums resultierte in einem identischen Verhalten der Lösungen. Die
Paracetamol-Lösung wurde weitertransportiert und das nachfolgend zugefügte Medium
umgab die Mikrodialyseeinheit. Der verzögerte Abfall der Paracetamol-Konzentration in den
Dialysatproben nach Zugabe des Mediums ist wahrscheinlich auf die langsamere
Vorwärtsbewegung der Paracetamol-Lösung zurückzuführen, da der Kunststoffschlauch zu
diesem Zeitpunkt zu 70 % mit Lösung gefüllt war. Für diesen Versuchsaufbau konnte die
Sensitivität des Mikrodialysesystems dahingehend bestätigt werden, dass Konzentrations-
änderungen im Donor-Kompartiment gut detektiert wurden und zwar unabhängig davon ob
diese der theoretischen Konzentration entsprachen oder nicht.
Diskussion
89
Mit diesem Versuchsaufbau konnten die physiologischen Bedingungen des Dünndarms nicht
simuliert werden. Der Einfluss der Darmperistaltik hinsichtlich der Durchmischung und des
Vorwärtstransportes der Flüssigkeit wurde nicht berücksichtigt, da die technischen
Möglichkeiten zur Umsetzung nicht vorhanden waren. Der wesentlich relevantere Aspekt des
intestinalen Flüssigkeitshaushaltes wurde in diesem Versuchsaufbau ebenfalls nicht
berücksichtigt, da die bisherige In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems unter idealen
Bedingungen erfolgte. Gleichwohl ist der komplett mit Medium gefüllte Kunststoffschlauch
nicht mit der Flüssigkeitsverteilung im nüchternen Zustand des humanen Dünndarms zu
vergleichen, da freies Wasser bekanntermaßen nur in einzelnen Flüssigkeitsnestern
vorhanden ist [17]. In Abhängigkeit von der Lage der Mikrodialyseeinheit im Dünndarm sind
Arzneistoffkonzentrationen somit mit einer geringeren Sensitivität bestimmbar. Allerdings
wird der Arzneistoff in der vorgesehenen Studie am Menschen mit 240 mL Wasser
verabreicht. Aus MRT-Untersuchungen ist bekannt, dass Wasser schnell aus dem Magen in
den Dünndarm entleert wird [24]. Dies führt zu einem moderaten Volumenanstieg im oberen
Dünndarm, sodass in diesem Bereich ausreichend Wasser für eine normale Funktion des
Mikrodialysesystems zur Verfügung stehen sollte. Die Absorption des Wassers in den
proximalen Dünndarmabschnitten und auch dessen Weitertransport in distale Bereiche
führen dann jedoch zu intestinalen Bedingungen, die in weiteren Experimenten simuliert
werden müssen.
4.3 Adaption und In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems für eine mögliche
humane Anwendung
4.3.1 Adaption des Mikrodialysesystem
In Zusammenarbeit mit dem Medizinproduktehersteller RoweMed wurde das Mikrodialyse-
system nach erfolgreicher Entwicklung und In vitro-Charakterisierung an die humane
Anwendung angepasst. Dabei wurden die arbeitskreisinternen Vorgaben durch die
Mitarbeiter der Firma RoweMed technisch umgesetzt. Die aseptische Herstellung von
Mikrodialysesets, welche aus jeweils zwei Mikrodialysesystemen bestanden, erfolgte mit
biokompatiblen Bestandteilen, um später eine Zertifizierung als Medizinprodukt durchführen
zu können. Die adaptierten Mikrodialysesets wurden mit einer Länge von 4 m hergestellt.
Dies erfolgte in Anlehnung an die Untersuchungen, die von Gramatté mit ähnlichen
Systemen zur Perfusion und Aspiration durchgeführt wurden [59]. Dabei wurde festgestellt,
dass vor allem für Probanden mit weiblichem Geschlecht sowie mit geringer Körpergröße mit
einer Sondenlänge von 3 m das Caecum erreicht wird. Diese Angabe bezieht sich auf die
Länge des Systems ab Zahnreihe. Für Untersuchungen des Dünndarms und zum Anschluss
Diskussion
90
des Systems an die entsprechenden Pumpen wurde das System auf 4 m verlängert. Um die
Anwendung für den Probanden möglichst angenehm zu gestalten, lag der Fokus auf der
Verringerung der Schlauchdurchmesser. Diese weisen bislang einen sehr großen
Außendurchmesser von 2,46 mm für den Luftschlauch und von 3,67 mm für den Zufluss-
und Ablaufschlauch auf. Zu diesem Zweck wurde zuerst der biokompatible Medicoplast-
Schlauch mit einem Innendurchmesser von 1,0 mm und einem Außendurchmesser von
3,0 mm für alle Schläuche des Mikrodialysesystems verwendet. Eine weitere Optimierung
der Schlauchdurchmesser wurde erreicht, indem nachfolgend ausschließlich der Versilic®-
Schlauch mit einem Innendurchmesser von 1,0 mm und einem Außendurchmesser von
2,0 mm für den Zufluss- und Ablaufschlauch und mit einem Innendurchmesser von 0,5 mm
und einem Außendurchmesser von 1,5 mm für den Luftschlauch verwendet wurde. Somit
wurde für das adaptierte Mikrodialyseset, bestehend aus zwei Mikrodialysesystemen, ein
Gesamtaußendurchmesser von 5,5 mm erreicht. Im Vergleich zum Außendurchmesser von
jeweils 4,7 und 5,3 mm der zwei Sonden, die von Brouwers et al. zur Aspiration von Proben
an zwei unterschiedlichen Stellen im Dünndarm verwendet wurden [74], ist der Durchmesser
des Mikrodialysesets mit zwei Messstellen stark minimiert worden. Zusätzlich kann bei
Anwendung des Mikrodialysesets auf die doppelte Applikation und Kontrolle der Lokalisation
der Sonden verzichtet werden. Das Mikrodialysesystem wurde auch dahingehend
verbessert, dass die Verbindung der einzelnen Komponenten durch eigens von RoweMed
hergestellte Verbindungsstücke aus dem Silikon Elastosil® erfolgt. Das Stabilisieren der
Schläuche am distalen Ende des Systems, um ein Abknicken der Schläuche zu verhindern
und ein Anbringen des Zuggewichtes zu ermöglichen, erfolgt ebenso mit diesem Silikon. Die
einzelnen Bestandteile wurden ebenfalls mit diesem Silikon verklebt, um die Anzahl der
verwendeten Materialien gering zu halten. Weiterhin wurden die Schläuche des adaptierten
Mikrodialysesystems punktuell untereinander verklebt, um den Einfluss gedehnter Schläuche
weiter zu minimieren. Zusätzlich wurde durch das Verkleben der Verbindungsstücke vor und
nach der Mikrodialyseeinheit mit den vorhandenen Schläuchen, die Mikrodialyseeinheit vor
den eventuell auftretenden Zugkräften geschützt. Dies ist besonders wichtig, da die
Mikrodialysekapillaren die geringste Zugfestigkeit aller verwendeten Bestandteile des
Mikrodialysesets aufweisen.
Diskussion
91
4.3.2 In vitro-Prüfung des adaptierten Mikrodialysesystems
Die Herstellung von adaptierten Mikrodialysesystemen durch die Firma RoweMed erfolgte
ebenfalls in Handarbeit. Anhand von acht Mikrodialysesystemen wurde die
Reproduzierbarkeit der Herstellung durch den Vergleich der Werte der relativen
Wiederfindung untersucht. Gleichzeitig wurde der Einfluss des verwendeten Schlauches
bestimmt, da drei Mikrodialysesysteme mit Medicoplast-Schläuchen und fünf Systeme mit
Versilic®-Schläuchen hergestellt wurden. Nach Durchführung der Versuche konnte kein
Einfluss des verwendeten Schlauches festgestellt werden, da die ermittelten Ergebnisse für
die relative Wiederfindung von Paracetamol mit 65,6 ± 3,2 % für den Medicoplast-Schlauch
und 66,4 ± 3,9 % für den Versilic®-Schlauch keine Unterschiede aufwiesen. Zur Beurteilung
der reproduzierbaren Herstellung durch die Firma RoweMed erfolgte der Vergleich der Werte
für die relative Wiederfindung mit den bisher hergestellten Mikrodialysesystemen. Diese
wiesen für acht Mikrodialysesysteme eine relative Wiederfindung von durchschnittlich
65,6 ± 2,2 % für Paracetamol auf (siehe 3.2.3.2). Das stimmt sehr gut mit der relativen
Wiederfindung von 66,1 ± 3,7 %, die für die acht adaptierten Mikrodialysesysteme erhalten
wurde überein. Somit kann davon ausgegangen werden, dass die Herstellung durch
RoweMed reproduzierbar war und kein Einfluss des verwendeten Schlauches auf die relative
Wiederfindung erkennbar war. Obwohl für Valsartan keine Untersuchungen durchgeführt
wurden, gilt dies auch für Valsartan, da in vorangegangen Adsorptionsuntersuchungen keine
Wechselwirkungen zwischen Valsartan und dem Versilic®-Schlauch erkennbar waren [155].
4.3.3 Bestimmung des pH-Wertes im Donor-Kompartiment über die Analyse der
Dialysatproben
Die Anwendung des Mikrodialysesystems im Menschen soll nach oraler Applikation des
Systems erfolgen. Im Rahmen der Applikation wird hierbei zunächst das Zuggewicht
geschluckt. Der Vorwärtstransport des kompletten Mikrodialysesystems erfolgt dann durch
die natürliche Peristaltik des Gastrointestinaltraktes. Die Passage des Pylorus ist dabei von
entscheidender Bedeutung. Wenn das Mikrodialysesystem im Magen verbleibt und sich
große Schlauchmengen im Magen sammeln, kann die korrekte Platzierung der
Mikrodialyseeinheit nicht anhand der Markierung auf den außenliegenden Schläuchen
abgelesen werden. Eine mögliche Ansammlung der Schläuche im Magen kann jedoch durch
das Ziehen am oralen Ende der Schläuche identifiziert und behoben werden [59]. Weiterhin
kann die Lokalisation der Messeinheit über eine fluoroskopische Bestimmung [67, 68, 74]
oder eine zusätzlich gelegte Sonde durch einen Gastroenterologen erfolgen. Dies führt
jedoch zu einer weiteren Belastung für den Probanden. Um dies zu vermeiden, wurde
Diskussion
92
untersucht, ob eine Lagebestimmung der Mikrodialyseeinheit im Gastrointestinaltrakt über
den pH-Wert im Dialysat erfolgen kann. Dafür wurden mögliche pH-Werte des Magens mit
Salzsäure pH 1,2 bis pH 5,0 und des Dünndarmes mit Phosphatpuffer pH 6,8 USP simuliert
[12, 13]. Als Perfusat wurden der bisher verwendete Phosphatpuffer pH 6,8 USP sowie eine
NaCl-Lösung mit pH 5,5, welches annähernd dem mittleren pH-Wert der Isotonen Kochsalz-
Lösung 0,9 % Braun Infusionslösung entsprach, eingesetzt. Die Verwendung von Salzsäure
pH 1,2 und pH 3,0 im Donor-Kompartiment resultierte unabhängig vom verwendeten
Perfusat in pH-Werten in den Dialysatproben, die deutlich unter dem pH-Wert des Donor-
Mediums lagen. Eine Erhöhung des Donor-pH-Wertes auf pH 4,0 oder höher führte zu
ähnlichen pH-Werten in den Dialysatproben im Vergleich zu den originalen pH-Werten des
Perfusats. Somit ist die Lokalisation der Mikrodialyseeinheit über die pH-metrische Analyse
der Dialysatproben lediglich bestimmbar, wenn der pH-Wert im Magen unter pH 3,0 liegt.
Dies entspricht bei jungen, gesunden Probanden dem mittleren pH-Wert im nüchternen
Zustand [12]. Des Weiteren kann die erfolgreiche Pyloruspassage durch eine Verfärbung des
Dialysates durch die enthaltene Galle identifiziert werden. Die pH-metrische Identifizierung
der Pyloruspassage sowie die Verfärbung des Aspirates durch Galle wurde bereits in
Perfusionsstudien als Indiz für den Übertritt in den Dünndarm genutzt [59]. Da duodenale
Bestandteile jedoch im nüchternen Zustand durch Retropulsion in den Magen gelangen
können [161], ist eine Bestimmung beider Parameter über einen ausreichend langen
Zeitraum nötig. Die Untersuchung von Dialysatproben im Abstand von 5 bis 10 min sollte
nach 30 min ein aussagekräftiges Ergebnis liefern, da innerhalb dieses Zeitraumes
Ausreißer durch Retropulsion oder konstant erhöhte pH-Werte im Dünndarm bestimmbar
sind [12]. Die anschließende Bestimmung der Lokalisation der Mikrodialyseeinheit im
Dünndarm könnte über die abgelesene Schlauchlänge erfolgen. Ein Austausch des
Zuggewichtes gegen eine ähnlich dimensionierte PillCam® SB [162], einer oral applizierbaren
Kamerakapsel, könnte ebenfalls zur Überprüfung der Lage genutzt werden.
4.3.4 Evaluation der Braun Infusomat® und Perfusor® Space Pumpen
Die bisher mit dem Mikrodialysesystem durchgeführten Untersuchungen wurden mit MCP-
Schlauchpumpen durchgeführt, die für die Nutzung im Labor konzipiert sind. Die Anwendung
des Mikrodialysesystems in humanen Studien erfordert jedoch die Nutzung von CE-
zertifizierten Pumpen, die zum Einsatz am Menschen zugelassen sind. Die Alaris IVAV®
PCAM® Spritzenpumpe, die Braun Infusomat® Space Schlauchpumpe und die Braun
Perfusor® Space Spritzenpumpe entsprechen unter anderem dieser Anforderung. Im
Vergleich zur Alaris IVAV® PCAM® Spritzenpumpe bieten die Pumpen von Braun den Vorteil
Diskussion
93
der Programmierbarkeit. Beide Pumpen der Firma Braun können alternierend im Pump- und
Pausenmodus innerhalb eines Intervalls von 1 min betrieben werden, welches die
Grundvoraussetzung zur Realisierung einer hohen zeitlichen Auflösung in vivo darstellt.
Die Infusomat® Space Schlauchpumpe kann unter Verwendung des Infusomat® Space Line
Sets kontinuierlich betrieben werden, solange das Vorratsgefäß gefüllt ist. Der Transport des
Perfusats im zugehörigen Infusomat® Space Line Set erfolgte ohne Einschränkungen,
wohingegen die Beförderung der Luft zu Problemen mit der Pumpe führte. Sobald die Luft in
der entsprechenden Messzelle der Pumpe detektiert wurde, erfolgte der Luftblasenalarm des
Gerätes und der Betrieb der Pumpe wurde sofort eingestellt. Ein Abschalten dieser Funktion
durch den Hersteller würde zum Verlust der CE-Zertifizierung führen, sodass diese
Möglichkeit nicht in Betracht gezogen werden konnte. Aus diesem Grund wurde untersucht,
ob die Perfusor® Space Spritzenpumpe als Alternative für den Transport der Luft genutzt
werden kann. Das begrenzte Fassungsvermögen einer Perfusor®-Spritze führte zuerst zu
Untersuchungen mit einer 50 mL-Spritze. Dies führte allerdings nicht zur Abtrennung der
gewonnen Dialysatproben im Ablaufschlauch. Die Kompressibilität der Luft führte dazu, dass
die geringen Luftvolumina von 0,5 mL, die je gewonnener Probe zur Abtrennung verwendet
wurden, nicht ausreichten, um die Luft in den Ablaufschlauch zu befördern und dabei die
Dialysatprobe voranzuschieben. Eine Verringerung des aufgezogenen Volumens auf 25 mL
resultierte ebenso in unsauber abgetrennten Proben. Mit einer Minimierung des
aufgezogenen Spritzenvolumens auf 20 und 10 mL konnte dieses Problem behoben werden.
Aufgrund dieser Ergebnisse wurden die Infusomat® Space Schlauchpumpe zum Transport
des Perfusats und die Perfusor® Space Spritzenpumpe zum Abtrennen der Dialysatproben
durch Luft ausgewählt.
Zur Überprüfung der Eignung beider Pumpen hinsichtlich der Anwendung in Kombination mit
dem Mikrodialysesystem wurden Versuche mit einem repräsentativen Mikrodialysesystem
durchgeführt. Als Referenzwert diente die mittlere relative Wiederfindung, die mit den bislang
verwendeten MCP-Schlauchpumpen gewonnen wurde. Der bisher mit den MCP-
Schlauchpumpen genutzte Versuchsablauf, mit einer Equilibrierzeit von 1 min und dem
Transport des Mediums für 18 s bei einer Flussrate von 1 mL/min, musste für die Braun
Pumpen jedoch modifiziert werden. Dies war aufgrund der eingeschränkten
Programmierbarkeit, mit einem automatischen Ablauf von Pump- und Pausenzeiten
innerhalb eines Intervalls von 1 min nötig. Für die durchgeführten Untersuchungen wurden
Equilibrierzeiten von 42 bis 45 s und Pumpzeiten von 15 bis 18 s bei einer Flussrate von
1 mL/min genutzt. Der mit den MCP-Schlauchpumpen ermittelte Referenzwert der relativen
Wiederfindung betrug 69,3 %. Die Ergebnisse, die bei Anwendung der Braun Pumpen
gewonnen wurden, stimmten mit 68,4 bis 70,0 % gut mit dem zuvor bestimmten
Diskussion
94
Referenzwert überein. Die geringe Variation der Werte der Infusomat® und Perfusor® Space
Pumpen ist auf das Zusammenspiel der generell verkürzten Pump- und Equilibrierzeiten
zurückzuführen, wobei eine Verringerung der Equilibrierzeit innerhalb des Intervalls zu einer
gleichzeitigen Erhöhung der Pumpzeit führte. Um möglichst große Dialysatvolumina zur
Arzneistoffquantifizierung zur Verfügung zu haben, sollten die Versuchsabläufe mit einer
Pumpzeit von 17 oder 18 s genutzt werden.
Für die Verwendung in humanen Studien stehen damit zugelassene Pumpen zur Verfügung,
die mit der entsprechenden Programmierung gute Ergebnisse und ein ausreichend großes
Probenvolumen liefern. Als Nachteil ist jedoch das geringe Luftvolumen von maximal 20 mL
in der Spritze zu erwähnen. Für jede Dialysatprobe werden 0,5 mL Luft zum Abtrennen von
der vorherigen Probe genutzt, sodass spätestens nach 40 Proben ein Austausch der Spritze
erfolgen muss. Dafür wird dann eine zweite Perfusor® Space Spritzenpumpe benötigt, da die
vorgeschaltete Programmierung zum Betrieb der Pumpe mehr Zeit in Anspruch nimmt, als
durch die Pause von 30 s zur Verfügung steht.
Zusammenfassung
95
5 Zusammenfassung
Die Applikation von Arzneistoffen erfolgt sehr häufig über die orale Gabe. Die Kenntnis der
Arzneistoffkonzentration im humanen Darm ist somit essentiell für das Verständnis der
oralen Arzneimitteltherapie. Die intestinale Absorption wird von verschiedenen Faktoren
bestimmt. Dazu gehören die anatomischen und physiologischen Gegebenheiten des
Gastrointestinaltraktes sowie die Eigenschaften des Arzneistoffes und der Arzneiform. Das
komplexe Zusammenspiel dieser Faktoren kann die intestinale Konzentration des
Arzneistoffes und folglich dessen Absorption und daraus abgeleitet Wirkung und
Nebenwirkung beeinflussen. Zur Bestimmung der intraluminalen Arzneistoffkonzentration
und zur Charakterisierung des zugehörigen Absorptionsprozesses werden bisher Systeme
und Methoden verwendet, welche die Physiologie des Darmes beeinflussen können oder die
im Rahmen einer chirurgischen Intervention angewendet werden.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung eines
Mikrodialysesystems zur Bestimmung intraluminaler Arzneistoffkonzentrationen im humanen
Dünndarm. Dabei sollte das System die positiven Eigenschaften der bisher verwendeten
Methoden und Systeme kombinieren.
Die verwendeten Materialien wurden so ausgewählt, dass ein flexibles aber dennoch
robustes System aus biokompatiblen Bestandteilen erhalten wurde. Das entwickelte System
kann zudem mit bildgebenden Verfahren, wie der MRT, kombiniert werden. Das neu
entwickelte Mikrodialysesystem besteht letztendlich aus einer Mikrodialyseeinheit sowie
einem Zufluss- und Ablaufschlauch. Die finale Mikrodialyseeinheit ist aus
30 semipermeablen Kapillaren mit einer Austauschlänge von 10 cm zusammengesetzt, über
die der Stoffaustausch zwischen dem Perfusat als Akzeptor-Kompartiment und dem Medium
als Donor-Kompartiment erfolgt. Das System kann hierbei kontinuierlich oder
diskontinuierlich perfundiert werden. Für den diskontinuierlichen Perfusatfluss war es hierbei
nötig, einen zusätzlichen Schlauch in das System zu integrieren, der ein Abtrennen der
gewonnenen Proben im Ablaufschlauch mittels Luftblasen ermöglicht. Die vorgesehene
Anwendung des Mikrodialysesystems in klinischen Studien am Menschen wurde bei dessen
Entwicklung stets berücksichtigt. Die Einbettung der Mikrodialyseeinheit in ein
Schlauchsystem ermöglicht die orale Applikation und vereinfacht damit die Anwendung des
Mikrodialysesystems im Menschen. Mit der Kombination von zwei Mikrodialysesystemen in
einem Set kann weiterhin die gleichzeitige Erfassung von intraluminalen
Arzneistoffkonzentrationen in unterschiedlichen Abschnitten des humanen Darmes erfolgen.
Nach der erfolgreichen Entwicklung des Mikrodialysesystems erfolgte zunächst die
Charakterisierung der Funktionalität des Systems anhand der relativen Wiederfindung des
Zusammenfassung
96
Arzneistoffes in den Dialysatproben. Die Untersuchungen wurden mit den Arzneistoffen
Paracetamol, Amoxicillin-Trihydrat und Valsartan, die aufgrund ihres spezifischen
Absorptionsverhaltens im Gastrointestinaltrakt ausgewählt wurden, und verschiedenen
biorelevanten Donor-Medien sowie Perfusaten durchgeführt. Das Mikrodialysesystem wurde
dabei kontinuierlich oder diskontinuierlich vom Perfusat durchströmt. Bei Verwendung des
diskontinuierlichen Perfusatflusses wurden jedoch vergleichsweise geringere Werte für die
relative Wiederfindung bestimmt. Die Verwendung des diskontinuierlichen Perfusatflusses
resultierte dagegen in einer Equilibrierzeit von 1 bis 60 min, welches einen verlängerten
Stoffaustausch zwischen dem Donor-Kompartiment und dem Perfusat ermöglichte und somit
zu deutlich höheren relativen Wiederfindungen führte. Außerdem wurden die Proben im
Ablaufschlauch unverzüglich durch die Zufuhr von Luft, die über den zusätzlich enthaltenen
Schlauch zugeführt wurde, separiert. Bei Verwendung des kontinuierlichen Perfusatflusses
wurden im Vergleich zum diskontinuierlichen Fluss geringere Werte für die relative
Wiederfindung bestimmt. Ein Anstieg der Equilibrierzeit von 1 auf 5 oder 60 min resultierte
hierbei allerdings nicht in einer deutlichen Erhöhung der relativen Wiederfindung. Für
Amoxicillin und Valsartan wurden ähnliche Werte für die relative Wiederfindung bestimmt,
während für Paracetamol höhere Werte ermittelt wurden, die mit dem geringeren
Molekulargewicht und der damit verbundenen erhöhten Diffusionsgeschwindigkeit erklärt
werden können. Nachdem ein deutlicher Einfluss der Temperatur auf die relative
Wiederfindung nachgewiesen wurde, erfolgte die Durchführung der In vitro-Untersuchungen
ausschließlich bei Körpertemperatur.
Die Sensitivität des Mikrodialysesystems wurde untersucht, um dessen Eignung für In vivo-
Untersuchungen zu bestimmen. Dabei sollte geprüft werden, ob und wie schnell Änderungen
der Arzneistoffkonzentration im Donor-Kompartiment in den Dialysatproben nachweisbar
sind. Bei Anwendung des kontinuierlichen Perfusatflusses erfolgte die Detektion der
Erhöhung und Verringerung der Stoffkonzentration im Donor-Kompartiment verzögert. Im
Gegensatz dazu konnte bei Nutzung des diskontinuierlichen Perfusatflusses mit einer
Equilibrierzeit von 1 min eine Konzentrationsänderung im Donor-Kompartiment sofort in der
nachfolgend gewonnenen Dialysatprobe nachgewiesen werden. Dies wurde für alle
verwendeten Arzneistoffe bestätigt, sodass alle nachfolgenden Untersuchungen mit dem
diskontinuierlichen Perfusatfluss und einer Equilibrierzeit von 1 min durchgeführt wurden.
In den folgenden Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass das Mikrodialysesystem
mehrmalig für In vitro-Untersuchungen genutzt werden konnte. Anhand von acht
untersuchten Mikrodialysesystemen für Paracetamol und jeweils vier Mikrodialysesystemen
für Amoxicillin und Valsartan konnte die reproduzierbare Herstellung der Mikrodialyse-
Zusammenfassung
97
systeme nachgewiesen werden. Die Verwendung unterschiedlicher Donor-Medien und
Perfusate führte zu ähnlichen Ergebnissen.
Die anatomischen Gegebenheiten des Dünndarms wurden durch Untersuchungen in einem
Röhrenmodell simuliert. Erhöhungen oder Verringerungen der Konzentration im Donor-
Kompartiment wurden auch bei dieser Versuchsanordnung ohne zeitliche Verzögerung in
der darauffolgenden Dialysatprobe nachgewiesen. Allerdings entsprach die gemessene
Arzneistoffkonzentration annähernd der doppelten theoretischen Konzentration. Dies beruhte
auf dem Versuchsaufbau, bei dem sich die nacheinander in dem schmalen Kunststoff-
schlauch eingebrachten Lösungen nur minimal vermischten, sodass annähernd deren
Ausgangskonzentration an der Mikrodialyseeinheit vorlag.
In Zusammenarbeit mit dem Medizinproduktehersteller RoweMed erfolgte anschließend die
Adaption des Mikrodialysesystems an die humane Anwendung. Dabei wurden modifizierte
Bestandteile, wie zum Beispiel Schläuche mit verringerten Durchmessern verbaut, um die
Anwendung für den Probanden möglichst angenehm zu gestalten. Die reproduzierbare
Herstellung der adaptierten Mikrodialysesysteme im Vergleich zu den eigenen Mikrodialyse-
systemen wurde anhand ähnlicher Ergebnisse für die relative Wiederfindung nachgewiesen.
Die Möglichkeit, die Lokalisation der Mikrodialyseeinheit im Gastrointestinaltrakt über die pH-
metrische Analyse der Dialysatproben zu bestimmen, wurde anschließend untersucht. Bis zu
einem pH-Wert von pH 3 kann über den erniedrigten pH-Wert in den Dialysatproben der
Rückschluss auf die Lage im Magen gezogen werden. Dies entspricht dem üblicherweise
ermittelten pH-Wert im Magen von pH 2,7 bei nüchternen jungen, gesunden Probanden.
Abschließend wurde die Eignung der Braun Infusomat® und Perfusor® Space Pumpen, die
zur humanen Anwendung zugelassen sind, für die Nutzung in Kombination mit dem
Mikrodialysesystem überprüft, um in einer Studie am Menschen CE-zertifizierte Geräte
einsetzten zu können. Die beschränkte Programmierbarkeit beider Pumpen bei der
Anwendung des diskontinuierlichen Perfusatflusses erforderte eine erneute Modifikation des
Versuchsablaufes. Durch die Reduktion der Pump- und Equilibrierzeiten konnte ein
Versuchsablauf ermittelt werden, der ähnliche Ergebnisse wie mit den bisher verwendeten
Pumpen lieferte.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Mikrodialysesystem zur Bestimmung intestinaler
Arzneistoffkonzentrationen entwickelt und in vitro charakterisiert. Die mit dem
Mikrodialysesystem gewonnenen Daten könnten genutzt werden, um zukünftig das
komplexe Zusammenspiel verschiedener Faktoren während der Arzneistoffabsorption besser
zu verstehen. Mit diesem Wissen könnten Nebenwirkungen und Wechselwirkungen oral
applizierter Arzneistoffe verringert und deren Bioverfügbarkeit erhöht werden.
Zusammenfassung
98
Literaturverzeichnis
99
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Literaturverzeichnis
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Anhang
115
7 Anhang
7.1 Geräteverzeichnis
Gerät Bezugsquelle
Braun Infusomat® Space Schlauchpumpe B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Braun Perfusor® Space Spritzenpumpe B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Class VP Software Version 4.3 und 6.14 Shimadzu Europa GmbH, Duisburg
Fraktionssammler Pharmacia LKB
FRAC-100 Pharmacia, Uppsala (Schweden)
Horizontalschüttler KL-2 m. Uhr Edmund Bühler GmbH, Tübingen
Ismatec® MCP Schlauchpumpe IDEX Health & Science GmbH, Wertheim
LiChroCART® 4-4 Vorsäule (LiChrosper®
100 RP 18, 5 μm) Merck KGaA, Darmstadt
LiChroCART® 125-4 Säule (LiChrosper®
100 RP 18, 5 μm) Merck KGaA, Darmstadt
Magnetrührer Variomag Telesystem Thermo Fisher Scientific Inc., Langenselbold
Merck Hitachi HPLC-Anlage mit L-6200A
Pumpe, AS-2000A Autosampler, L-5025
Säulenthermostat, L-4250 UV/VIS-Detektor
und D-6000 Controller Interface
Merck KGaA, Darmstadt
pH-Messgerät Mettler Toledo FiveEasyTM
FE20 mit pH-Kunststoffelektrode LE438
Mettler-Toledo AG, Schwerzenbach
(Schweiz)
Shimadzu HPLC-Anlage mit LC-20AT
Pumpe, SGU-20A3 Entgaser, SIL-20A
Autosampler, CTO-10ASVP
Säulenthermostat, und SPD-M20A UV/VIS-
Diodenarray-Detektor und CBM-20A
Systemcontroller
Shimadzu Europa GmbH, Duisburg
Shimadzu UV-mini1240 Shimadzu Europa GmbH, Duisburg
Ultraschallbad 142-6009 VWR
pH-Messelektrode Hamilton® Minitrode Hamilton Bonaduz GmbH, Schweiz
Anhang
116
7.2 Chemikalienverzeichnis
Bezeichnung Bezugsquelle Charge
Amoxicillin-Trihydrat
Fagron GmbH & Co. KG, Barsbüttel
AppliChem GmbH, Darmstadt
08G25-M09
2C006763
Calciumchlorid-Dihydrat Fagron GmbH & Co. KG, Barsbüttel 10F23-N08
Eisessig Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe 489150478
Kaliumchlorid Fagron GmbH & Co. KG, Barsbüttel 09I10-N01
Kaliumdihydrogenphosphat,
wasserfrei
AppliChem GmbH, Darmstadt
Neolab
1X003040
6264-010
Natriumacetat, wasserfrei Merck KGaA, Darmstadt A0034968946
Natriumchlorid
AppliChem GmbH, Darmstadt
Caesar & Loretz GmbH, Hilden
Fagron GmbH & Co. KG, Barsbüttel
1X009358
09241023
09/10-N01
Isotone Kochsalz-Lösung
0,9 % Braun B. Braun Melsungen AG, Melsungen 124417641
Natriumdihydrogenphosphat-
Monohydrat Merck KGaA, Darmstadt A403446320
Natriumhydrogencarbonat Fagron GmbH & Co. KG, Barsbüttel 08J22-N03
Natriumhydroxid
AppliChem GmbH, Darmstadt
Merck
Lachema
8T006494
A09915000
502490988
Paracetamol Caesar & Loretz GmbH, Hilden 10065105
Salzsäure Merck KGaA, Darmstadt
Bernd Kraft GmbH, Duisburg
K44568817321
1272038
SIF® Powder Original Biorelevant.com Ltd, Croydon, Surrey
(UK) PHAS1210 045/02
Valsartan Novartis Pharma AG, Basel
(Schweiz) C0015
Anhang
117
7.3 Materialverzeichnis
Bezeichnung Bezugsquelle Charge
Elastosil® M4600 Wacker Chemie AG, München 67350813
Halbmikro-Küvette,
Quarzglas Suprasil® 104-QS Hellma GmbH & Co. KG, Müllheim -
Hohlfaserkapillaren
Fresenius Polysulfon®
Fresenius SE & Co. KGaA, Bad-
Homburg -
Infusomat® Line Set B. Braun Melsungen AG, Melsungen 1K12218SIB
Loctite® 4011 Henkel AG & Co. KGaA, Düsseldorf
L39JAC2404
L31BAB0339
L33LAA4870
Loctite® M-31Cl Henkel AG & Co. KGaA, Düsseldorf LM0CA12922
Medicoplast-Schlauch Medicoplast International GmbH,
Illingen 11140631
20 mL-Spritzen, B. Braun Melsungen AG, Melsungen 0M13048
50 mL-Spritzen, B. Braun Melsungen AG, Melsungen 08H2282028
Titankugeln KGM Kugelfabrik GmbH & Co., Fulda 65731/239/W/
10.05.11
Tygon® 3350-Schlauch;
0,64 mm
Saint-Gobain Performance Plastics,
Beaverton, MI (USA) 687957
Tygon® 3350 2-Stopper-
Schlauch; 0,64 mm
Saint-Gobain Performance Plastics,
Beaverton, MI (USA) 890175
Tygon® 3350-Schlauch;
1,85 mm
Saint-Gobain Performance Plastics,
Beaverton, MI (USA) 785779
Tygon® 3350 2-Stopper-
Schlauch; 1,85 mm
Saint-Gobain Performance Plastics,
Beaverton, MI (USA) 545217
Versilic®-Schlauch; 0,5 mm Saint-Gobain Performance Plastics,
Charny (Frankreich) -
Versilic®-Schlauch; 1,0 mm Saint-Gobain Performance Plastics,
Charny (Frankreich) -
Anhang
118
Publikationen und Kongressbeiträge
119
Publikationen und Kongressbeiträge
Publikationen
D. Schönherr, U. Wollatz, D. Haznar-Garbacz, U. Hanke, K.J. Box, R. Taylor, R. Ruiz,
S. Beato, D. Becker, W. Weitschies; Characterisation of selected active agents regarding pKa
values, solubility concentrations and pH profiles by SiriusT3; Eur J Pharm Biopharm; 92
(2015) 155-170.
Kongressbeiträge
Vorträge
D. Schönherr, U. Hanke, W. Siegmund, S. Beato, D. Becker and W. Weitschies; Intestinal
microdialysis: An experimental challenge to measure local drug concentrations on the
intestinal places of drug absorption; Clinical Pharmacology, a Bridge for Basic Sciences to
Clinical Applications; September 12 - 13, 2013; Greifswald, Germany
D. Schönherr, U. Hanke, W. Siegmund, D. Becker and W. Weitschies; Determinanten der
regionalen Substratkonzentration intestinaler Transporter; Initiation-Workshop -
Compartmental Drug Absorption and Transport (COM_DAT): Pharmakokinetische Konzepte
zur individualisierten Medizin; October 26, 2012; Greifswald, Deutschland
D. Schönherr, U. Hanke, W. Siegmund, D. Becker and W. Weitschies; A new small intestinal
microdialysis system; 8th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and
Pharmaceutical Technology; March 19 - 22, 2012; Istanbul, Turkey
Publikationen und Kongressbeiträge
120
Poster
D. Schönherr, U. Hanke, W. Siegmund, S. Beato, D. Becker and W. Weitschies; In vitro
characterization of a small intestinal microdialysis system; 9th World Meeting on
Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology; March 31 - April 03,
2014; Lisbon, Portugal
D. Schönherr, U. Wollatz, D. Haznar-Garbacz, U. Hanke, K. J. Box, R. Taylor, R. Ruiz, S.
Beato, D. Becker and W. Weitschies; Determination of pKa values and solubility-pH profiles
of selected ß-blockers; 27th AAPS Annual Meeting and Exposition; November 10 - 14, 2013;
San Antonio, TX, USA
D. Schönherr, U. Hanke, W. Siegmund, D. Becker and W. Weitschies; Investigating the
suitability of a new small intestinal microdialysis system in vitro for the determination of drug
concentrations in the small intestine; 26th AAPS Annual Meeting and Exposition; October 14 -
18, 2012; Chicago, IL, USA
D. Schönherr, U. Hanke, W. Siegmund, D. Becker and W. Weitschies; Influence of different
solvents on the applicability of a small intestinal microdialysis system in vivo; Annual Meeting
of the German Pharmaceutical Society; October 11 - 13, 2012; Greifswald, Germany
D. Schönherr, K. Zippert, U. Hanke, W. Siegmund, D. Becker and W. Weitschies;
Development of a microdialysis system for monitoring of drug concentrations in the small
intestine; 25th AAPS Annual Meeting and Exposition; October 23 - 27, 2011; Washington,
D.C., USA
D. Schönherr, K. Zippert, U. Hanke, W. Siegmund, D. Becker and W. Weitschies; In vitro
establishment of a new microdialysis based system for determination of drug concentrations
in the small intestine; Joint Meeting of the Austrian and German Pharmaceutical Societies;
September 20 - 23, 2011; Innsbruck, Austria
Danksagung
121
Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde im Fachbereich Biopharmazie und Pharmazeutische
Technologie des Institutes für Pharmazie der Universität Greifswald unter der Leitung von
Prof. Dr. Werner Weitschies angefertigt. Im Folgenden möchte ich mich für die tatkräftige
Unterstützung, Motivation und die konstruktive Diskussionen bedanken, die maßgeblich zum
Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. Werner Weitschies für das entgegengebrachte
Vertrauen, die Überlassung dieses äußerst interessanten und vielversprechenden Themas,
die exzellenten Arbeitsbedingungen, das stete Interesse am Gelingen dieser Arbeit und die
Möglichkeit an nationalen und internationalen Kongressen teilnehmen zu können.
Ein herzliches Dankeschön geht an Dr. Ulrike Hanke für die fachliche und persönliche
Unterstützung bei der Erstellung und Durchsicht von Abstracts, Postern, Manuskripten,
Diplomarbeiten und dieser Promotionsarbeit.
Ich danke Dr. Christian Loch und Dr. Mirko Koziolek für die Durchsicht dieser Arbeit.
Bei Dr. Gunnar Glöckl möchte ich mich für die stete Diskussions- und Hilfsbereitschaft und
die gute Zusammenarbeit im Rahmen des COM_DAT-Projektes bedanken.
Ich danke Sabine Ristow und Thomas Brand für die Unterstützung bei der alltäglichen
Laborarbeit.
Meinen Diplomanden Katrin Zippert, Andrea Gliemann und Ulrike Wollatz sowie meinen
Wahlpflichtstudenten danke ich für ihr Engagement im Labor.
Ich möchte mich weiterhin bei allen aktuellen und ehemaligen Kollegen für die angenehme
Arbeitsatmosphäre im Arbeitskreis Biopharmazie und Pharmazeutische Technologie
bedanken.
Den beteiligten Partnern des COM_DAT-Projektes aus der Pharmakologie, Prof. Dr. Werner
Siegmund, Prof. Dr. Stefan Oswald und Dr. Eberhard Scheuch, von der Novartis Pharma
AG, Dr. Dieter Becker und Stefania Beato, sowie der RoweMed AG, Dr. Dirk Forberger,
Dipl.-Ing. Frank Dietrich, Dipl.-Ing. Jörg Reibert und Dipl.-Ing. Ulf Bahlke, danke ich für die
konstruktive Zusammenarbeit.
Danksagung
122
Für die finanzielle Unterstützung möchte ich mich bei der Novartis Pharma AG sowie dem
Bundesministerium für Bildung und Forschung im Rahmen des Projektes COM_DAT
(FKZ: 03IPT612X) ganz herzlich bedanken.
Bei der Fresenius SE & Co. KGaA, Bad-Homburg möchte ich mich für die Bereitstellung der
Fresenius Polysulfon® Hohlfaserkapillaren bedanken.
Ich danke meiner Familie und meinen Freunden für ihr Verständnis und den nie abreißenden
Zuspruch während der gesamten Promotion.
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