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Enzymkinetische Charakterisierung niedermolekularer
Verbindungen als Inhibitoren von Serinhydrolasen
Dissertation zur
Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.)
der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
vorgelegt von
Camino María González Tanarro
aus
Valladolid
Bonn 2008
Angefertigt mit Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
1. Referent: Herr Professor Dr. Michael Gütschow
2. Referent: Herr Professor Dr. Gerd Bendas
Tag der Promotion: 14. Oktober 2008
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Dezember 2003 bis April 2008 am
Pharmazeutischen Institut der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn unter
Leitung von Herrn Professor Dr. Michael Gütschow durchgeführt.
Ich möchte mich herzlich bei Herrn Professor Dr. Michael Gütschow bedanken,
sowohl für die intensive Betreuung während meiner gesamten Promotionszeit, als
auch für die stete Diskussionsbereitschaft, die zum guten Gelingen dieser Arbeit
beigetragen hat.
Ebenso danke ich Herrn Professor Dr. Gerd Bendas für die Übernahme des
Koreferates.
Der Deutschen Forschungsgemeinschaft danke ich für die finanzielle Unterstützung
im Rahmen des Graduiertenkollegs 677 „Struktur und molekulare Interaktion als
Basis der Arzneimittelwirkung“.
A mi familia
1. Einleitung
1.1 Acetylcholinesterase und Leukocyten-Elastase als Targets
für die Arzneistoffentwicklung ................................................................
1
1.1.1 Morbus Alzheimer, die cholinergen Hypothese und
Acetylcholinesterase-Inhibitoren ............................................................
1
1.1.2 Inhibitoren der humanen Leukocyten-Elastase ..................................... 9
1.2 Aufgabenstellung ...................................................................................... 13
2 Mehrcylische Thieno-Verbindungen: Synthese und
Cholinesterase-Hemmung
2.1 Synthese .................................................................................................... 14
2.1.1 Synthese der linear anellierten Thieno-Verbindungen 7-10 ................. 14
2.1.2 Synthese der angular anellierten Thieno-Verbindungen 11-14 ............ 15
2.1.3 NMR-spektroskopische Untersuchung der Syntheseprodukte ............ 18
2.2 Enzymkinetische Experimente ................................................................ 22
2.2.1 Bestimmung der Hemmung der Cholinesterasen ................................. 22
2.2.2 Charakterisierung der Hemmung der AChE
aus Electrophorus electricus ...................................................................
23
2.2.3 Charakterisierung der Hemmung der hAChE und der hBChE ............. 52
2.3 Experimenteller Teil .................................................................................. 61
2.3.1 Allgemeines zur Synthese und Strukturanalytik ................................... 61
2.3.2 Cholinesterase-Assays ............................................................................ 62
2.3.3 Synthesevorschriften ............................................................................... 64
2.3.4 Abbildung der NMR Spektren .................................................................. 80
3. Cholinesterase-Hemmung durch heterobivalente
Tacrinabkömmlinge
3.1 Inhibitoren mit einer 1,2,3,4-Tetrahydroacridin-Teilstruktur ................. 97
3.2 Inhibitionsstudien mit Tacrin-Trimethoxybenzen-Heterodimeren ....... 103
3.3 Substratabhängigkeit der Hemmung von 15h und Tacrin .................... 114
3.4 Experimenteller Teil .................................................................................. 122
3.4.1 Spektrophotometrische Experimente ..................................................... 122
3.4.2 Cholinesterase-Assays ............................................................................ 123
4. Untersuchungen zur Hemmung der humanen Leukozyten-Elastase
durch Thieno[1,3]oxazin-4-one
4.1 Mehrcyclische 1,3-Oxazin-4-one als Inhibitoren
von Serinproteasen ..................................................................................
124
4.2 Hemmexperimente mit Thieno[1,3]oxazin-4-onen mit C-Substituenten
in Position 2 ...............................................................................................
127
4.3 HPLC-Untersuchungen an Thienooxazinonen ....................................... 135
4.4 Schlussfolgerungen ................................................................................. 143
4.5 Experimenteller Teil .................................................................................. 143
4.5.1 Spektrophotometrische Experimente und HLE-Assay ......................... 143
4.5.2 HPLC Experimente .................................................................................... 144
5. Untersuchungen zu acylierenden Inhibitoren von Serinhydrolasen
5.1. HPLC-Experimente an Acetylcholinesterase und Chymotrypsin mit
anellierten 1,3-Oxazin-4- onen .................................................................
145
5.2 Schlussfolgerungen ................................................................................. 154
5.3 Experimenteller Teil .................................................................................. 155
6. Hemmung der AChE durch Isothiazol-Verbindungen
6.1 Synthesis von Isothiazol-3-yl-piperazinen und –morpholinen ............. 156
6.2 Inhibitionsuntersuchungen an AChE ...................................................... 157
6.3 Experimenteller Teil .................................................................................. 166
7. Hemmung der humanen Leukocyten-Elastase durch
Haloaryl-substituierte Isothiazol-3(2H)-on 1,1-Dioxide
7.1 Synthese von Isothiazol-3(2H)-on 1,1-Dioxiden ..................................... 167
7.2 Inhibitionsuntersuchungen an humaner Leukozyten-Elastase,
Acetylcholinesterase und Cholesterolesterase .....................................
169
7.3 Experimenteller Teil ..................................................................................
172
8. Zusammenfassung ...................................................................................
174
9. Literaturverzeichnis ..................................................................................
179
10. Abkürzungsverzeichnis ............................................................................ 197
Einleitung
1
1. Einleitung
1.1 Acetylcholinesterase und Leukocyten-Elastase als Targets für die Arzneistoffentwicklung
1.1.1 Morbus Alzheimer, die cholinerge Hypothese und Acetylcholinesterase-Inhibitoren
Der fortschreitende Anstieg der Lebenserwartung unserer Bevölkerung in den letzten
Jahren führt zu einer höheren Inzidenz von Erkrankungen, die für ältere Personen
charakteristisch sind. Das Auftreten von Morbus Alzheimer (MA), einer Form von
Altersdemenz, ist ein typisches Beispiel für diese Tendenz. Diese neurodegenerative
Erkrankung wurde 1906 zum ersten Mal von dem Psychiater und Neuropathologen
Alois Alzheimer beschrieben. Heutzutage sind es 13 Millionen Personen, die weltweit
an dieser Krankheit leiden. Ihre charakteristischen Merkmale sind kognitiver Verlust,
Halluzinationen, Depressionen, Sprachprobleme und die dazu gehörige
Schwierigkeit am alltäglichen Leben teilzunehmen [1]. Die Erkrankung ist durch drei
verschiedene histopathologische Störungen charakterisiert, den Verlust von
kortikalen und subkortikalen Neuronen, die Bildung von extrazellulären senilen
Plaques, die aus Zusammenlagerungen von β-Amyloid-Peptid bestehen, und die
Entstehung von intrazellulären Neurofibrillen [2-4].
Die cholinerge Hypothese zu MA besagt, dass der schleichende Abbau der
kognitiven Leistungsfähigkeit auf den Verlust cholinerger Neurone im Nucleus basalis
Meynert zurückzuführen ist. Beobachtet wurde eine verminderte Konzentration und
Aktivität von Cholin-Acetyltransferase, die die Synthese von dem Neurotransmitter
Acetylcholin katalysiert, und von Acetylcholinesterase (AChE), die für den Abbau von
Acetylcholin im synaptischen Spalt verantwortlich ist [5]. Acetylcholinesterase ist eine
Serinesterase (EC. 3.1.1.7). Sie katalysiert die hydrolytische Spaltung der
Esterbindung von Acetylcholin und hebt damit die Wirkung des Neurotransmitters im
synaptischen Spalt auf. AChE weist zwei Bindungszentren auf, die mit
niedermolekularen Liganden interagieren. Das ist zum einen das aktive Zentrum mit
der katalytischen Triade, bestehend aus einem Glutamat-, einem Histidin- und einem
Serinrest (Glu327, His440, Ser200, Nomenklatur der AChE aus Torpedo californica,
TcAChE) sowie einer Kationenbindungsstelle (hauptsächlich repräsentiert durch
Einleitung
2
Trp84), die mit dem physiologischen Substrat Acetylcholin über Kation-π-
Wechselwirkungen in Kontakt tritt. Die periphere Bindungsstelle (PAS) zum anderen,
hauptsächlich repräsentiert durch Trp279, liegt am Eingang einer tiefen Schlucht,
welche zum aktiven Zentrum führt [6-8]. Von dem peripheren Bindungszentrum wird
angenommen, dass es das physiologische Substrat Acetylcholin am Eingang der
Schlucht vorübergehend bindet. Acetylcholin wird dann über die Aromaten-reiche
Schlucht zum aktiven Zentrum weiterleitet [9-11]. Szegletes et al. fanden, dass
Inhibitoren der PAS eine sterische Blockade des Enzyms ausüben, indem sie die
Passage des Substrates durch den Eingang der Schlucht verlangsamen [12].
Pathophysiologisch spielt die periphere Bindungsstelle eine wichtige Rolle bei der
Bildung von senilen Plaques im Verlauf von Morbus Alzheimer [13].
Die cholinerge Hypothese stellt die Grundlage für wichtige Ansätze in der Therapie
von MA dar. Als diese Hypothese postuliert wurde dachte man an einen ähnlichen
Therapie-Modus wie bei anderen neurodegenerativen Erkrankungen (z:B. Morbus
Parkinson) und versuchte, allerdings erfolglos, die Alzheimer-Patienten mit
“cholinergen Vorläufern“ (hauptsächlich Cholin und Lecithin) zu behandeln [14].
Derzeit stehen nur symptomatische Therapieoptionen zur Verfügung. Hierzu gehört
neben dem NMDA-Antagonisten Memantine die Gruppe der Cholinesterase-
Inhibitoren, deren Wirkung insofern auf der cholinergen Hypothese beruht, als sie
dem Acetylcholin-Mangel entgegenwirken. Acetylcholinesterase-Inhibitoren finden
nicht nur in MA eine Indikation. Das Alkaloid Physostigmin und die analogen
Verbindungen Neostigmin und Pyridostigmin sind dafür Beispiele.
Physostigmin (Anticholium®) wird aus der Kalabarbohne isoliert. Es ist ein reversibler
Inhibitor der AChE. Physostigmin (Abbildung 1.1-1) ist ZNS-gängig und besitzt eine
geringe therapeutische Breite, deswegen wird es nur lokal (am Auge) für die
Therapie des Glaukoms, sowie bei zentralen Vergiftungen durch Cholinolytika, wie
Atropin (Abbildung 1.1-1) eingesetzt [15,16].
Neostigmin und Pyridostigmin haben, im Gegensatz zu Physostigmin, einen
quartären Stickstoff und sind somit nicht ZNS-gängig. Die Indikation von Neostigmin
(Neostig®) beschränkt sich auf Darm- oder Blasenatonie. Pyridostigmin (Mestinon®)
wird bei Myasthenia gravis eingesetzt. Pyridostigmin wurde während des Golf-
Krieges prophylaktisch verabreicht. Es sollte der Reaktion mit Organophosphaten
vorbeugen. Organophosphate werden als Nervengase (wie Sarin) oder Insektizide
verwendet. Sie hemmen die AChE irreversibel [11,15].
Einleitung
N
NO
O
NH
CH3
CH3
CH3
CH3
H
HN
CH3H
O OH
O
NONCH3
CH3
O
CH3
CH3
CH3
NON
CH3
CH3
O
CH3
Physostigmin Atropin
+
Neostigmin
+
Pyridostigmin
+
+
Abb. 1.1-1 Die Acetylcholinesterase-Inhibitoren Physostigmin, Neostigmin und Pyridostigmin und der Antagonist am Acetylcholin-Rezeptor vom Muscarin-Typ Atropin. Tacrin (Cognex®) war das erste zugelassene Therapeutikum für die Behandlung von
Morbus Alzheimer. Es wurde wegen seiner hohen Hepatotoxizität vom Markt
genommen [17]. Die Röntgenstruktur-Analyse von dem Komplex aus Tacrin und
TcAChE zeigte, dass dieser Inhibitor mit der Substrat-Bindungsstelle wechselwirkt
[18]. Im Kapitel 3 der vorliegenden Arbeit werden Tacrin-Dimere vorgestellt, deren
Tacrin-Teilstruktur mit der Substrat-Bindungsstelle interagierte, während eine
elektronenreiche Trimethoxybenzen-Einheit an der PAS gebunden werden sollte.
Rivastigmin (Exelon®) ist ein weiterer AChE-Inhibitor mit Carbamat-Teilstruktur, der
wiederum unter Carbamylierung kovalent an den Serin-Rest des aktiven Zentrums
gebunden wird. Seine Hemmaktivität ist niedriger als die von Physostigmin, aber sein
pharmakologisches Profil ist besser. Rivastigmin besitzt eine längere Wirkdauer und
ist weniger toxisch. Zusätzlich ist es ein „Hirn-Region“-selektiver Cholinesterase-
Inhibitor, der die AChE und die Butyrylcholinesterase (BChE) im Hippocampus und
Cortex zu hemmen vermag [1]. BChE ist auch eine Serinhydrolase, die ebenfalls die
Hydrolyse von Cholinestern (z.B. Acetylcholin) katalysiert. Beide Enzyme weisen
eine hohe Sequenzhomologie (65 % bei den humanen Enzymen [19]) auf, zeigen
allerdings eine unterschiedliche Substratspezifität. In humaner BChE sind Phe295
und Phe297 der humanen AChE gegen Leu286 und Val288 ausgetauscht, und es
steht mehr Raum für den Acylrest des Substrates zur Verfügung, so dass größere
3
Einleitung
4
Substrate besser gebunden und umgesetzt werden können [8,20,21]. Neuere
Untersuchungen weisen darauf hin, dass die Aktivität der BChE steigt, wenn die von
der AChE niedriger wird. Somit sind beide Enzyme in die Regulation des
Acetylcholin-Abbaus eingebunden [22].
Aus Galanthus woronowii (Schneeglöckchen) wird das Alkaloid Galanthamin
(Reminyl®) isoliert. Es ist ein reversibler und kompetitiver Inhibitor der AChE,
allerdings schwächer wirksam als Tacrin, und zeigt sich weniger toxisch. Es wurde
berichtet, dass Galanthamin eine allosterische Modulation der nikotinischen
Acetylcholin-Rezeptoren hervorruft. Die Substanz bindet an einer Stelle des
Rezeptors, die nicht gleich die Acetylcholin-Bindungsstelle ist und verursacht, dass
Acetylcholin eine stärkere Rezeptor-Antwort auslöst. Solche Verbindungen werden
als allosterisch potenzierende Liganden bezeichnet [23-25]. 2005 untersuchten
Roman et al. Galanthamin an nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren und vermuteten,
dass der Effekt hauptsächlich eine Folge des Anstieges von Acetylcholin sei [26].
Piazzi et al. synthetisierten die Verbindung AP2238. Molecular Modelling Studien
zeigten, dass der Benzylrest mit der Kationenbindungsstelle (Trp84) am Grunde der
Schlucht eine π-π−Interaktion ausübt, während die Phenylen-Einheit des Spacers mit
den aromatischen Aminosäuren entlang der Schlucht interagiert. Der Cumarinring
trat mit der PAS in Wechselwirkung. Die Verbindung zeigte eine ähnliche Aktivität
wie Donepezil, aber eine bessere Selektivität für AChE versus BChE. An AChE wirkt
die Substanz als ein Hemmstoff des gemischten Typs mit einem α-Wert von etwa 1
[27].
Einleitung
N
NH2
N
O
MeO
MeO
N
O
ON
CH3
CH3 CH3
CH3
CH3
O
N CH3
OH
MeO
OOCH3
CH3 O
O
CH3
N
AP2238
Rivastigmin
Galanthamin
DonepezilTacrin
Abb. 1.1-2 Acetylcholinesterase-Inhibitoren.
Donepezil (Aricept®) ist ein zugelassenes Therapeutikum in der Behandlung von
Morbus Alzheimer, welches mit der Substrat-Bindungsstelle und zusätzlich mit der
peripheren Bindungsstelle interagiert. Dementsprechend wirkt Donepezil als Inhibitor
des gemischten Typs mit einem α-Wert von ca. 0.5 [27,28]. Donepezil besitzt einen
basischen Stickstoff und einen hydrophoben Substituenten, der die Bindung am
Enzym begünstigt. In der Abbildung 1.1-3 ist der Komplex von Donepezil und
TcAChE im Ausschnitt dargestellt [29]. Es besteht eine hydrophobe Interaktion
zwischen dem Indanonring und Trp279 in der PAS des Enzyms, während der
Benzylrest eine π-π−Wechselwirkung mit Trp84 am Grunde der Schlucht ausübt. Der
positiv geladene Piperidin-Stickstoff stabilisiert den Enzym-Inhibitor-Komplex
zusätzlich durch eine elektrostatische Interaktion mit der negativ geladenen
Carboxylat-Struktur von Asp72 [30,31].
5
Einleitung
Abb.1.1-3 Wichtige Interaktionen zwischen Donepezil und TcAChE [29]. Beide Bilder zeigen den gleichen Enzym-Inhibitor-Komplex (PDB: 1EVE) aus verschiedenen Perspektiven. Die Abbildung wurde mit PyMOL erstellt.
6
Einleitung
7
Im Kapitel 2 der vorliegenden Arbeit werden Verbindungen vorgestellt, für die sich
ein ähnlicher Bindungsmodus wie bei Donepezil und AP2238 vermuten ließ. Sie
besitzen ebenfalls einen basischen, mit einem Benzylrest substituierten Stickstoff.
Im Folgenden werden pathophysiologische Merkmale von Morbus Alzheimer
genannt. Wie bereits erwähnt, ist MA durch die extrazellulären β-Amyloid-Peptid-
Ablagerungen und die intrazellulären Neurofibrillen charakterisiert. Die β-Amyloid-
Ablagerungen, die die diffusen Plaques bilden, bestehen hauptsächlich aus Aβ42, der
längeren und stärker hydrophoben Spezies. Sie entsteht aus dem proteolytischen
Verdau des Amyloid-Präkursor-Proteins (APP). Die genaue Funktion des APP ist
noch nicht bekannt. Es wurde vermutet, dass die sekretierte, lösliche Ektodomäne
des APP als Protease-Inhibitor fungiert, denn die lösliche APP-Form ist funktionell
dem Serinprotease-Inhibitor Protease-Nexin II gleich. Die Synthese von APP erfolgt
im endoplasmatischen Retikulum, dann wird es im Golgi-Apparat glykosyliert und
sulfatiert und schließlich in die Zellmembran eingeschlossen [32,33]. Von dort aus
kann APP in zwei verschiedenen Routen abgebaut werden [34]. Bei der ersten,
nicht-amyloiden Route erleiden die APP-Moleküle einen enzymatischen Verdau
durch die α-Sekretase und anschließend durch die γ-Sekretase, dabei entsteht das
lösliche sAPPα sowie ein Peptid, das aus 83 Aminosäuren besteht und als C83
bezeichnet wird. Es wird durch Proteasen weiter zu mehreren kleinen Peptiden, p3
genannt, degradiert [5]. Bei dieser normalen Prozessierung des APP entstehen
lösliche Spezies, die nicht schädigend sind. ADAM 10 (a disintegrin and
metalloprotease 10) besitzt α-Sekretase-Aktivität und könnte ein mögliches
Therapeutikum für Morbus Alzheimer werden [35].
In der zweiten, amyloiden Route sind die β-Sekretase und die γ-Sekretase für die
Proteolyse von APP verantwortlich. Nach dem enzymatischen Verdau durch die
β-Sekretase entsteht das sAPPβ und ein C99 Peptid. Dieses letztgenannte Peptid
wird durch die γ-Sekretase weiter prozessiert. Es entstehen hauptsächlich zwei
Produkte, Aβ40 und Aβ42 mit 39-40 bzw. 42-43 Aminosäuren. Wegen seiner
stärkeren Aggregationsfähigkeit und seiner ausgeprägten Toxizität spielt Aβ42 eine
wichtigere Rolle in der Pathogenese von MA [5, 36].
Einleitung
Inestrosa et al. konnten beweisen, dass die Aggregation von β-Amyloid durch
Acetylcholinesterase gefördert wird, vermutlich durch eine Interaktion des
β−Amyloids mit der PAS (an Trp279). Die resultierenden Komplexe initiieren die
β-Amyloid-Fibrillogenese. Diese Komplexe aus Acetylcholinesterase und β−Amyloid
sind toxischer als die β-Amyloid-Fibrillen allein [13, 37-40]. Somit besteht neben der
Acetylcholinesterase-Inhibition und der Verhinderung der amyloiden Prozessierung
ein weiterer wichtiger Ansatz in der Behandlung von Morbus Alzheimer, nämlich die
Unterdrückung der Formation der β-Amyloid-Fibrillen. Beispielsweise synthetisierten
Wood et al. das Hexadecyl-N-Methylpiperidiumbromid (Abbildung 1.1-4). Diese
Verbindung konnte selektiv die Formation der β-Amyloid-Fibrillen hemmen [41].
CH3
NCH3
N
NH2 NH2
NCH3
CH3CH3
N NN
ON
O
Cl
Cl
Cl
Cl
NH
N
NH
N
OMe
OMeCH3
CH3
O
O
+
Hexadecyl-N-Methylpiperidinium
+
+
Propidium
+ +
DUO3
Memoquin
Abb.1.1-4 Inhibitoren der Entstehung der β-Amyloid-Fibrillen.
8
Einleitung
9
Auch Inhibitoren der Acetylcholinesterase können die Aggregation von β-Amyloid
einschränken, sofern sie mit der PAS interagieren. Propidium (Abbildung 1.1-4), das
ausschließlich an der PAS bindet, hemmte bei einer Konzentration von 100 µM die
durch humane Acetylcholinesterase ausgelöste Aggregation von Aβ40 um 82 % [42].
Für AP2238 (Abbildung 1.1-2) wurde durch Docking-Studien und kinetische
Messungen eine Bindung im aktiven Zentrum und der PAS postuliert, wie für
Donepezil. Beide Substanzen konnten bei 100 µM die AChE-induzierte Aβ-
Aggregation um 35 % bzw. 22 % inhibieren [27]. Auch Xanthostigmin-Derivate
wurden diesbezüglich untersucht. Die Carbamate dieser Serie zeigten bei 100 µM bis
zu 67 % Hemmung der AChE-induzierten Aβ40-Aggregation, obwohl solche
Inhibitoren im Zuge der Carbamylierung des aktiven Serin-Restes wirken. Für die
Wechselwirkung mit der PAS wurde deshalb die terminale aromatische Teilstruktur
verantwortlich gemacht [43]. Kapkova et al. [44] berichteten über die Aβ-
aggregationshemmende Wirkung von Pyridinium-Derivaten. DUO3 (Abbildung 1.1-4)
hemmte die AChE aus Electrophorus electricus mit einem IC50–Wert von 340 nM und
bei 100 µM die spontane Aggregation von Aβ42 und Aβ40 um 61 % bzw. 55 %.
Kürzlich wurde mit Memoquin (Abbildung 1.1.-4) eine Substanz mit multifunktioneller
Wirkung vorgestellt, die neuroprotektiv, als Radikalfänger, Hemmstoff der β-
Sekretase und auch als Inhibitor des gemischten Typs der humanen AChE (IC50 =
1.55 nM) charakterisiert wurde. Überdies wurde die durch hAChE-induzierte Aβ40-
Aggregation und die spontane Aβ42-Aggregation mit mikromolaren IC50-Werten
inhibiert [45].
Mit peripheren und dualen Inhibitoren der AChE wurde ein neuer therapeutischer
Ansatz formuliert. Liganden, die sowohl mit der Substrat-Bindungsstelle als auch mit
der PAS interagieren, würden die cholinerge Transmission verstärken und zugleich
die Entstehung von ß-Amyloid-Fibrillen unterdrücken [13,27,40,46].
1.1.2 Inhibitoren der humanen Leukocyten-Elastase
Die humane Leukocyten-Elastase (E.C.3.4.21.37) ist eine Serinprotease mit der
katalytischen Triade bestehend aus His41, Asp88 und Ser173. Humane Leukozyten-
Elastase (HLE) wird in neutrophilen Granulozyten als Zymogen synthetisiert. Zur
Aktivierung bedarf es zweier getrennter aminoterminaler Prozessierungen, die von
Einleitung
10
der Signalpeptidase und von Dipeptidylpeptidase-1 katalysiert werden. HLE wird in
ihrer aktiven Form in den azurophilen Granula der neutrophilen Granulozyten
gespeichert. Wie andere neutrophile Proteasen wird HLE entweder intrazellulär in
Phagolysosomen oder, nach Zellaktivierung, extrazellulär freigesetzt.
Es ist bekannt, dass intrazelluläre HLE die Proteolyse von Fremd-Proteinen (z.B. von
Bakterien) ausübt. Mikroorganismen werden durch Neutrophile phagozytiert und
mittels oxidativer und nicht-oxidativer Mechanismen degradiert. Wenn die
Mikroorganismen durch Neutrophile phagozytiert wurden, befinden sie sich in den
Phagolysosomen. Die Phagozytose aktiviert das membrangebundene NADPH-
Oxidase-System, das durch die Ausschüttung von reaktiven Sauerstoff-Spezies
(ROS) den oxidativen Abbau in den Phagolysosomen fördert. Die Phagozytose
aktiviert ebenfalls die Fusion der neutrophilen Granula mit den Phagolysosomen und
somit die Freisetzung von Proteasen (wie HLE) in die Phagolysosomen. Die
Proteasen sind für den nicht-oxidativen Abbau verantwortlich. Die antibakterielle
Aktivität von HLE beschränkt sich auf Gram-negative Bakterien. Knock-out-Mäuse,
die keine Leukocyten-Elastase exprimierten, zeigten eine ausgeprägt schlechtere
Überlebungschance gegenüber Gram-negativen Erregern. Zusätzlich übt HLE eine
Schutzfunktion gegen manche Pilzinfektionen aus [47-49].
Die neutrophilen Granulozyten gelangen durch Transmigration an die Orte der
Entzündung und werden durch inflammatorische Stimuli aktiviert. Die Freisetzung
von Elastase wird durch Cytokine und Chemoattraktantien wie TNF-α, Interleukin-8,
Lipopolysaccharid (LPS) und das bakterielle Zellwand-Tripeptid N-Formyl-Methionyl-
Leucyl-Phenylalanin (fMLP) angeregt [50]. Es kommt zur Freigabe der HLE durch die
Exocytose der Granula. So freigesetzte HLE kann extrazelluläre Matrix-Proteine
abbauen und die Funktion anderer Entzündungszellen beeinflussen. HLE stimuliert
die Sekretion von granulocyte macrophage stimulating factor (GM-CSF), der
Interleukine IL-6 und IL-8 und moduliert damit den weiteren Einstrom von
Neutrophilen zur Entzündungsstelle [47]. Aus diesen Gründen spielt sie eine wichtige
Rolle in Entzündungsprozessen. Sehr hohe HLE-Raten liegen bei chronic obstructive
pulmonary disease (COPD), acute respiratory distress syndrom (ARDS) und
Lungenfibrose vor [51-53].
Unter normalen physiologischen Bedingungen wird die Aktivität von HLE wird durch
endogene Serinprotease-Inhibitoren (auch Serpine genannt) kontrolliert. Ein
gestörtes Gleichgewicht zwischen der Elastase und ihren endogenen Inhibitoren
Einleitung
11
spielt bei verschiedenen Krankheiten, wie Lungenemphysem, chronischer Bronchitis
oder rheumatoider Arthritis eine Rolle. Die Serpine sind aus drei β-Faltblattstrukturen
(A-C) und einer Oberfächen-exponierten reaktiven Schleife, die ein Pseudosubstrat
für HLE darstellt, aufgebaut [54]. Sie können in systemisch wirkende Inhibitoren und
sogenannte Alarm-Proteinase-Inhibitoren unterteilt werden. Zur ersten Gruppe zählt
der α1-Proteinase-Inhibitor (auch α1-Antitrypsin genannt), während SLPI
(sekretorischer Leukocyten-Proteinase-Inhibitor) und Elafin zu den Alarm-
Proteinasen-Inhibitoren gehören. Der α1-Proteinase-Inhibitor wird von den
Hepatozyten synthetisiert, in das Blut sezerniert und besitzt eine Halbwertszeit von
4.4 Tagen. Dieses Protein kann mehrere Proteasen (wie Proteinase 3 und Cathepsin
G) hemmen, aber die HLE stellt das bevorzugte Target dar. Die Inhibition der HLE
durch den α1-Proteinase-Inhibitor erfolgt mittels kovalenter Bindung, indem das
Serpin an der reaktiven Schleife durch den aktiven Serin-Rest der Protease
angegriffen wird. Die Bildung des kovalenten Komplexes aus Serpin und HLE geht
mit einer Translokation der Protease einher, wobei die reaktive Schleife als ein
weiterer Strang in die β-Faltblattstruktur A eingefügt wird. In diesem stabilen Komplex
ist die HLE irreversibel gehemmt. Er wird von hepatischen Rezeptoren erkannt,
passiert die Leber und wird somit aus dem Blutkreislauf entfernt [52,54]. Für HLE ist
der α1-Proteinase-Inhibitor der wichtigste endogene Hemmstoff. In geringerem
Umfang trägt ein anderer systemisch wirkender Proteinase-Inhibitor, α2-
Macroglobulin, zur Hemmung bei, jedoch nicht über eine kovalente Bindung, sondern
über eine strukturelle Versperrung der HLE. SLPI wird von Epithel- und Mastzellen,
Neutrophilen und Makrophagen produziert. Dieser endogene Hemmstoff entfaltet
seine Wirkung in den Schleimhäuten, wo er an Elastin-Fibrillen assoziiert vorliegt und
seine Konzentration die Hälfte des α1-Proteinase-Inhibitors ausmacht.
Es wurden mehrere klinische Studien zur Ersatztherapie mit dem α1-Proteinase-
Inhibitor für die Behandlung von vererbbarem Emphysem mit angeborenem α1-
Proteinase-Inhibitor-Mangel durchgeführt. Diese Substitutionstherapie stellt
heutzutage die wichtigste medikamentöse Behandlung dieser Erkrankung dar, wobei
der α1-Proteinase-Inhibitor aus Spenderblut isoliert wird. Neuere Untersuchungen
haben die Applikation von Alarm-Proteinase-Inhibitoren zum Ziel. Diese bieten
verschiedene Vorteile. So kann SLPI biotechnologisch einfacher gewonnen werden,
da es nicht glykosyliert ist. SLPI und Elafin besitzen überdies eine längere
Einleitung
Halbwertszeit und werden von Matrixmetalloproteinase-8 (MMP-8) nicht inaktiviert
[52].
Bei einem gestörten Gleichgewicht von HLE und ihren endogenen Inhibitoren, das
z.B. bei verschiedenen Entzündungserkrankungen vorliegt, ist die Anwendung von
synthetischen Hemmstoffen der Elastase angezeigt. Niedermolekulare Inhibitoren
von HLE werden seit längerem entwickelt. Sivelestat (Elaspol®) ist der einzige
zugelassene HLE-Inhibitor. Sivelestat (Abbildung 1.1-5) wurde 2002 in Japan für die
Behandlung von akutem Lungenversagen mit systemischen entzündlichen
Lungenschädigungen zugelassen. Der Arzneistoff hemmt die HLE kompetitiv und
besitzt einen IC50-Wert von 44 nM. Die Bioverfügbarkeit von Sivelestat (1.5 % für
Ratten) ist unzureichend, weshalb es parenteral verabreicht wird. Im Darm wird
Sivelestat gespalten, vermutlich durch Esterasen, da nur EI-601 (Abbildung 1.1-5) als
Metabolit nachgewiesen wurde [55-57]. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass
Sivelestat den Knorpel von arthritischen Ratten vor dem Abbau schützen konnte [56].
Nakayama et al. untersuchten mittels Flüssigchromatographie und Elektrospray-
Ionisation-Massenspektrometrie (LC/ESI-MS) den Mechanismus der Inhibition von
human sputum elastase (HSE) durch Sivelestat. Ein reversibler Acylierungs-
Deacylierungs-Mechanismus wurde für die Hemmung des Enzyms durch Sivelestat
postuliert, wobei der Pivaloyl-Rest auf den Serin-Sauerstoff übertragen und EI-601
freigesetzt wird. Das Acylenzym stellt die gehemmte Enzymspezies dar [58].
SNH
NH
OH
O
O
O
OCH3
CH3
CH3 O
OS
NH
NH
OH
O
O
O
OH
O
S
NH
O
CH3
S
O
SO
NN NNH
O
O
CH3CH3
NH
O
O
F
F
FO
HOOC
CH3
Sivelestat EI-601
Midesteine AE-3763
12
Abb. 1.1-5 Strukturformeln von Sivelestat und seinem Metaboliten EI-601 sowie von Midesteine und AE-3763.
Einleitung
13
Midesteine (MR-889) ist ein kompetitiver Inhibitor der Serinproteasen. Die Substanz
besitzt eine gewisse Selektivität für HLE (Ki-Wert = 1.4 µM), aber sie hemmt auch
Chymotrypsin. Midesteine (Abbildung 1.1-5) stand 2005 vor der Zulassung in Italien
für die Indikation chronische obstruktive Lungenerkrankung (COPD). AE-3763
(Abbildung 1.1-5) ist ein reversibler kovalenter Inhibitor der HLE. Dieses Tripeptid-
Derivat besitzt eine elektrophile Kopfgruppe, die vom aktiven Serinrest nukleophil
angegriffen wird. Die Verbindung befindet sich in präklinischen Studien in Japan [56].
Im Kapitel 4 und im Kapitel 7 der vorliegenden Arbeit werden Thieno[1,3]oxazin-4-
one bzw. Isothiazol-3(2H)-on 1,1-Dioxide als Inhibitoren der HLE vorgestellt.
1.2 Aufgabenstellung
Es ist das Ziel der vorliegenden Arbeit, niedermolekulare Substanzen als Inhibitoren
von Serin-Hydrolasen zu untersuchen. Zum Teil wurden die Verbindungen im
Rahmen der Doktorarbeit selbst synthetisiert (Kapitel 2). Die meisten Substanzen
wurden jedoch von Kooperationspartner bereitgestellt oder innerhalb der
Arbeitsgruppe synthetisiert und im Rahmen der Doktorarbeit enzymkinetisch
charakterisiert (Kapitel 3-7). Im Zentrum der Untersuchungen standen die Enzyme
Acetylcholinesterase, Butyrylcholinesterase und humane Leukozyten-Elastase. Wie
oben dargelegt, sind diese Enzyme wichtige Targetstrukturen für die Entwicklung von
Arzneistoffen. In der vorliegenden Arbeit sollten spektrophotometrische Assays
durchgeführt und enzymkinetische Parameter ermittelt werden. Diese Parameter
sollten zur Aufklärung der Enzym-Inhibitor-Wechselwirkung einbezogen werden. Die
biologische Aktivität der verschiedenen Vertreter der einzelnen Serien sollte zur
Aufstellung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen benutzt werden. Der enzymatische
Umsatz von bestimmten Inhibitoren sollte mittels HPLC (high pressure liquid
chromatography) untersucht werden.
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
14
2. Mehrcylische Thieno-Verbindungen: Synthese und Cholinesterase- Hemmung 2.1 Synthese 2.1.1 Synthese der linear anellierten Thieno-Verbindungen 7-10
Auf der Grundlage von Screening-Untersuchungen der Substanzbibliothek des
Arbeitskreises an Acetylcholinesterase fielen cyclische Amidine und Guanidine als
Inhibitoren auf. Es sollte deshalb für eine systematische Untersuchung eine Palette
von acht Repräsentanten solcher heterocyclischer Verbindungen zusammengestellt
werden. Dazu waren präparative Arbeiten nötig.
Die Zielverbindungen 7-10 sind linear anellierten Thieno-Verbindungen mit cylischer
Guanidin-Struktur. Der allgemeine Syntheseweg für die Thieno-Verbindungen 7-10
ist in Schema 2.1-1 aufgeführt. Das Aminothiophen 1b wurde mit
Phenylisothiocyanat und Ethanol bei 80 °C zu dem entsprechenden
Phenylthioureido-Derivat 2b umgesetzt [59]. 2,3,5,6,7,8-Hexahydro-3-phenyl-2-
thioxo-benzothieno[2,3-d]pyrimidin-4(1H)-on wurde an Stelle von 4,5,6,7-Tetrahydro-
2-[3-(phenyl)thioureido]benzo[b]thiophen-3-carbonsäureethylester (2a) zur Synthese
von 3a eingesetzt. Die Thioxo-Verbindung wurde unter Erwärmen in NaOH und
Ethanol gelöst. Nach Zugabe von Methyliodid wurde das Methylthio-substituierte
Thienopyrimidin-4-on 3a erhalten. Analog dazu wurde die Verbindung 3b aus 2b
nach Zugabe von Methyliodid gewonnen [60]. Um Verbindungen 7, 9 und 10 zu
isolieren, wurden 3a und 3b mit Ethylendiamin bzw. 1,3-Diaminopropan 24 Stunden
in einem Laborautoklaven umgesetzt. Dabei erfolgt ein nukleophiler Angriff des
Amins (Ethylendiamin bzw. 1,3 –Diaminopropan) auf den Kohlenstoff C2, und es wird
Methylmercaptan abgespalten. Die weitere Reaktion verläuft wahrscheinlich nach
folgendem Mechanismus. Ein intramolekularer nukleophiler Angriff der terminalen
Aminogruppe auf die Carbonylgruppe liefert unter Ringerweiterung Intermediate, die
durch einen zweiten intramolekularen Angriff unter Abspaltung von Anilin die
Endprodukte 7, 9 und 10 bilden. Verbindung 8 wurde aus der Substanzbibliothek des
Arbeitskreises entnommen.
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
Schema 2.1-1
X SNH2
CO2Et
X SNH-CS-NH-Ph
CO2Et
X S
N
N
S-Me
PhO
X S
N
NH
O
N
X S
N
N
PhO
X S
O
NHNH
N NH-Ph
a
1a X = CH21b X = N-Bn
2a X = CH22b X = N-Bn
3a X = CH23b X = N-Bn
cb
7 X = CH2, n = 2 8 X = CH2, n = 3 9 X = N-Bn, n = 210 X = N-Bn, n = 3
NH-(CH2)n-NH2
(CH2)n
(CH2)n
a) Phenylisothiocyanat, EtOH, 80 °C; b) NaOH, EtOH, 40 °C, Methyliodid; zur Herstellung von 3a wurde anstelle von 2a 5,6,7,8-Tetrahydro-2-thioxo-3-phenyl-benzothieno[2,3-d]pyrimidin-4(3H)-on eingesetzt; c) Ethylendiamin bzw. 1,3- Diaminopropan, 2-Methoxyethanol, 150 °C, 24 h.
2.1.2 Synthese der angular anellierten Thieno Verbindungen 11-14 Die Zielverbindungen 11-14 sind angular anellierte Thieno-Verbindungen mit
cylischer Amidin-Struktur. Der Syntheseweg zu den angular anellierten
Verbindungen 11-14 ist im Schema 2.1-2 aufgeführt. Der Carbonsäureethylester 1a wurde mit Formamid erwärmt, und dies führte zum Ringschluss und somit zur
15
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
Bildung von 4a. Formamid liefert für diese Reaktion den Kohlenstoff in Position-2.
Die Verbindung 5a wurde durch die Chlorierung des Carbonyl-Kohlenstoffs mit
Phosphoroxidchlorid hergestellt. Das chlorierte Benzothienopyrimidin 5a wurde mit
Ethanolamin bzw. 3-Amino-1-propanol zum Hydroxyethylamino- bzw.
Hydroxypropylamino-Benzothienopyrimidin (6a, n=2 bzw. 3) umgesetzt. Analog dazu
wurde Verbindung 6b (n=2) aus dem Hydroxyethylamino-Pyridothienopyrimidin
hergestellt. Letztlich führte die Cyclisierung von 6a (n=2, 3) und 6b (n=2), wieder mit
Phosphoroxidchlorid, zu den Endprodukte 11, 12 bzw. 13. Verbindung 14 wurde zur
Komplettierung der Serie aus der Substanzbibliothek entnommen [61]. Dieser
Syntheseweg [61] zu 11, 13 und 14 wurde vor wenigen Jahren auch von Ghorab [62]
zur Herstellung von 12 benutzt.
Schema 2.1-2
X S
NH
N
O
X S
N
N
Cl
X S
N
N
NH
X SN
NN
SNH2
OOC2H5
b
4a X = CH24b X = N-Bn
dc
a
5a X = CH25b X = N-Bn
6a X = CH2, n = 2 bzw. 36b X = N-Bn, n = 2 bzw. 3
11 X = CH2, n = 2 12 X = CH2, n = 313 X = N-Bn, n = 214 X = N-Bn, n = 3
(CH2)n-OH (CH2)n
1a X = CH21b X = N-Bn
a) Formamid, Rückfluss; b) Phosphoroxidchlorid, 105 °C; c) Ethanolamin bzw. 3-Amino-1-propanol, Rückfluss; d) Phosphoroxidchlorid, 105 °C.
16
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
Der Weg von den Chlor-Verbindungen 5 zu den Endprodukten 11-14 ist prinzipiell
bekannt. Schon 1976 synthetisierten Sinyak et al. das 2,3-Dihydroimidazo[1,2-
c]chinazolin VII (Schema 2.1-3) durch Umsetzung von 4-Chlorchinazolin (I) mit
Ethanolamin zu dem Alkohol IV und nachfolgende Behandlung mit Thionylchorid
(oder Phosphoroxidchlorid) und Natronlauge [63]. Analog gewannen Bahekar et al.
12 Verbindungen des Typs VIII aus den jeweiligen V mit Phosphoroxidchlorid [64].
Als Reaktionspartner der Chlor-Verbindung I wählten Vlasenko et al. 2-Chlor(Brom)-
Ethylamin-Hydrochlorid bzw. -Hydrobromid. Im Alkalischen entstand ebenfalls die
Verbindung VII [65]. Ausgehend von I und der Nitro-Verbindung III erhielten Wagner
und Bunk über IV und VI als Produkte erneut VII sowie IX [66].
Schema 2.1-3
N
R
R
R
NN
N
N
Cl
R
R
R
N
N
NH
R
R
R
ba
I, R1, R2, R3 = HII, R1 = CH3, C2H5, n-C3H7
R2 = H, Br R3 = H, Br, IIII, R1, R2 = H, R3 = NO2
(CH2)2-OH
1 1 1
222
3 3 3
IV, R1, R2, R3 = HV, R1 = CH3, C2H5, n-C3H7
R2 = H, Br R3 = H, Br, IVI, R1, R2 = H, R3 = NO2
VII, R1, R2, R3 = HVIII, R1 = CH3, C2H5, n-C3H7
R2 = H, Br R3 = H, Br, IIX, R1, R2 = H, R3 = NO2
a) Ethanolamin; b) POCl3 / SOCl2.
17
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
2.1.3 NMR-spektroskopische Untersuchung der Syntheseprodukte Die vollständige Charakterisierung der Syntheseprodukte erfolgte mittels
eindimensionaler (1H, 13C) und zweidimensionaler (HSQC) NMR-Spektroskopie
sowie auch durch NOE-Experimente. Für die Zuordnung der Signale der Imidazo-
Reihe war die analoge Hexahydrobenzo-Verbindung 11 von Bedeutung, da von
dieser Verbindung ein NOE-Spektrum aufgenommen wurde (Schema 2.1-4).
Schema 2.1-4
SN
NN
7.90 ppm
3.98 ppm2
3.85 ppm
3
5
NOE Experimente (in d6-DMSO) an dem 2,3,8,9,10,11-Hexahydro-benzothieno[3,2-e]imidazo[1,2-c]pyrimidin (11).
In den Schemata 2.1-4 und 2.1-5 sind charakteristische 1H und 13C NMR-Signale des
9-Benzyl-imidazo[1,2-c]pyrido[4',3':4,5]thieno[3,2-e]pyrimidins (13) dargestellt. Das
Singulett bei 7.92 ppm mit einem Integral für 1H wurde dem Proton an Position 5
zugeschrieben. Zwei Tripletts bei 3.85 und 4.00 ppm konnten mittels 1H und 13C
NMR nicht eindeutig zugeordnet werden. Deswegen wurden die genannten NOE-
Experimente für die Verbindung 11 berücksichtigt (Schema 2.1-4). Es wurde mit der
Frequenz des 5-Protons eingestrahlt, und man bekam ein Kreuzsignal bei 3.98 ppm
(3-H). Die Ergebnisse konnten dann für die Verbindung 13 extrapoliert werden. Somit
gehört das Signal bei der niedrigeren Frequenz (4.00 ppm) zu den Protonen in
Position 3. Die Zuordnung der Resonanzen für die Protonen in den Positionen 8, 10,
11 und die benzylische Gruppe (Schema 2.1-5) erfolgte nach publizierten Daten [67]
für analoge Verbindungen.
18
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
Schema 2.1-5
N SN
NN
3.55 ppm (s)2H
2.72 ppm (t)2 HJ = 5.8 Hz
7.92 ppm (s)1H
2.82 ppm (t)2 HJ = 5.8 Hz
3.85 ppm (t)2 HJ = 10.0 Hz
4.00 ppm (t)2 HJ = 10.0 Hz2
3
5
8
10
11
1H NMR in d6-DMSO: Chemische Verschiebungen, Multiplizität und Kopplungskonstante der Signale der Verbindung 13. Schema 2.1-6
N SN
NN
51.06 ppm
49.23 ppm
25.67 ppm
144.46 ppm
45.33 ppm
53.18 ppm
2
3
5
8
10
11
13C NMR in d6-DMSO: Chemische Verschiebungen der Signale der Verbindung 13.
19
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
Die 13C NMR-Spektren wurden wie folgt ausgewertet. Erneut wurde Verbindung 11
berücksichtigt, für die ein HSQC-Spektrum die 1H NMR-Signale bei 3.85 und 3.98 mit
den 13C NMR-Signalen 53.17 (C-2) und 45.27 (C-3) verband. In Übereinstimmung
mit den Ergebnissen für 11 konnte auch für 13 mittels HSQC die Zuordnung der 1H
NMR-Signale von 3.85 bzw. 4.00 ppm und der 13C NMR Signale von 53.18 bzw.
45.33 ppm für die Position 2 bzw. 3 erfolgen (Schema 2.1-6).
Für die Zuordnung der Signale der Pyrido-Reihe wurde auch hier ein NOE-Spektrum,
diesmal von der Hexahydrobenzo-Verbindung 12, angefertigt (Schema 2.1-7).
Schema 2.1-7
SN
NN
7.16 ppm
3.77 ppm2
3.59 ppm
4
6
NOE Experimente (in CDCl3) an dem 3,4,9,10,11,12-Hexahydro-2H-benzothieno[3,2-e]pyrimido[1,2-c]pyrimidin (12).
Die charakteristischen 1H und 13C NMR-Signale des 10-Benzyl-3,4,9,10,11,12-
hexahydro-2H-pyrido[4',3':4,5]thieno[3,2-e]pyrimido[1,2-c]pyrimidins (14) sind in den
Schemata 2.1-7 und 2.1-8 aufgeführt. Im 1H NMR-Spektrum von Verbindung 14
wurde ein Multiplett zwischen 1.80-1.85 ppm mit einem Integral für 2H den
Wasserstoffen an Position 3 zugeordnet, denn diese koppeln als einzige mit 4
Protonen (Schema 2.1-8). Das Singulett bei 7.55 ppm mit einem Integral für 1H
wurde dem Proton an Position 6 zugeschrieben. Die beiden Tripletts bei 3.39 und
3.86 ppm konnten auch hier anhand des oben genannten NOE-Experiments für die
Verbindung 12 (Schema 2.1-7) zugeordnet werden. Es wurde mit der Frequenz des
6-Protons eingestrahlt, und man bekam ein Kreuzsignal bei 3.77 ppm (4-H). Die
Ergebnisse wurden auf die Verbindung 14 übertragen. Somit gehört das Signal bei
der niedrigeren Frequenz (3.86 ppm) zu dem Proton in Position 4. Die Zuordnung der
Resonanzen für die Protonen in den Positionen 9, 11, 12 und die benzylische
Gruppe (Schema 2.1-8) erfolgte wiederum nach publizierten Daten [67] für analoge
Verbindungen.
20
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
Schema 2.1-8
N SN
NN
3.52 ppm (s)2H
2.68 ppm (t)2 HJ = 5.8 Hz
7.55 ppm (s)1H
2.89 ppm (t)2 HJ = 5.8 Hz
3.39 ppm (t)2 HJ = 5.5 Hz
3.86 ppm (t)2 HJ = 5.7 Hz
1.80-1.85 ppm(m)2 H
2
4
6
9
11
12
1H NMR in d6-DMSO: Chemische Verschiebungen, Multiplizität und Kopplungskonstante der Signale der Verbindung 14.
Schema 2.1-9
N SN
NN
51.30 ppm
49.51 ppm
27.11 ppm
147.37 ppm
46.07 ppm
20.13 ppm
43.79 ppm
2
4
6
9
11
12
13C NMR in d6-DMSO: Chemische Verschiebungen der Signale der Verbindung 14.
21
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
22
Für die Auswertung des 13C NMR-Spektrums war diesmal die Verbindung 12 der
Maßstab, für die es zusätzlich zum NOE-Spektrum ein HSQC-Spektrum gab. Das
NOE-Spektrum wurde in CDCl3 angefertigt. Deswegen wurden HSQC-Spektren in
CDCl3 und d6-DMSO aufgenommen. Die 1H NMR Signale in CDCl3 bei 7.16, 3.77
und 3.59 ppm entsprechen den Signalen bei 7.73, 3.95 und 3.43 ppm in d6-DMSO.
Die 1H NMR-Signale bei 3.43 und 3.95 korrelierten mit den 13C NMR-Signalen 43.04
(C-2) und 46.47 (C-4). Analog dazu konnte auch für 14 mittels HSQC die Zuordnung
der 1H NMR-Signale von 3.39 bzw. 3.86 ppm und der 13C NMR Signale von 43.79
bzw. 46.07 ppm für die Position 2 bzw. 4 erfolgen (Schema 2.1-8 und Schema 2.1-9).
Anders als bei Verbindung 13, wurde bei 14 das Signal mit höhere Frequenz (43.79
ppm) dem Kohlenstoff in Position 2 zugeordnet. 2.2 Enzymkinetische Experimente 2.2.1 Bestimmung der Hemmung der Cholinesterasen
Die Kinetik der Hemmung von Acetylcholinesterase aus Electrophorus electricus
(EeAChE) wurde mittels spektrophotometrischer Methode nach Ellman et al. [68]
bestimmt (Abbildung 2.2-1). Dabei wird die Konzentrationsänderung von Thiocholin,
welches aus dem Acetylthiocholin (ASCh) freigesetzt wurde, über die Zeit verfolgt.
Da das gebildete Thiocholin kein Chromophor besitzt und somit für die
spektrophotometrische Messung ungeeignet ist, wird DTNB (5,5’-Dithio-bis(2-
nitrobenzoesäure)) dem Assay zugesetzt. Die Reaktion von Thiocholin mit
überschüssigem DTNB ergibt das Disulfid 2-Nitro-5-((2-
(trimethylammonio)ethyl)dithio)benzoat und 2-Nitro-5-sulfidobenzoat. Die Aktivität der
AChE wurde auf diese Weise indirekt über die Konzentrationsänderung des
gebildeten 2-Nitro-5-sulfidobenzoats als Extinktionsänderung bei 412 nm über die
Zeit verfolgt. Bei allen Messungen wurde die Reaktion nach eine Vorinkubation von
15 Minuten durch Zugabe von ASCh gestartet.
Die Bestimmung der Aktivität der humanen Acetylcholinesterase (hAChE) erfolgte in
analoger Weise. Beim Assay der humanen Butyrylcholinesterase (hBChE) wurde
Butyrylthiocholin an Stelle von ASCh als Substrat eingesetzt.
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
NS
ON SH O
O
S
NO2
OO
O
OS
NO2
O
OS
NO2
N S
O
OS
NO2
+AChEH2O
Acetylthiocholin
++ -
AcetatThiocholin
-
-
DTNB5,5´Dithiobis-2- nitrobenzoat
-
+
- +
2-Nitro-5-((2-(trimethylammonio)-ethyl)dithio)benzoat
2-Nitro-5-sulfidobenzoat
-
Abb. 2.2-1 Spektrophotometrischer Assay nach Ellman et al.
2.2.2 Charakterisierung der Hemmung der AChE aus Electrophorus electricus
Die Verbindungen 7-14, über deren Synthese in Kapitel 2.1 berichtet wurde, sollten
als Inhibitoren von AChE charakterisiert werden. Die Substanzen sind als cyclische
Amidine bzw. Guanidine aufzufassen. Verbindungen mit cyclischer Amidin- bzw.
Guanidin-Struktur waren in Screeninguntersuchungen unseres Arbeitskreises als
Hemmstoffe von AChE bereits aufgefallen. Weiterhin gibt es Literaturberichte über
eine AChE-hemmende Aktivität von cyclischen Amidinen, Guanidinen und
Amidrazonen, z.B. von Aminopyridazin-Derivaten (I -IV). Verbindung I ist ein potenter
Inhibitor der AChE (IC50 = 120 nM, Electrophorus electricus) mit einer höheren
Selektivität für AChE (gegenüber BChE) im Vergleich zu Tacrin, aber einer
niedrigeren Selektivität im Vergleich mit Donepezil [69]. Durch die Einführung einer
Methyl-Gruppe in Position 5 des Pyridazin-Rings (Verbindung II) wurde die
Hemmaktivität um Faktor 6 erhöht (IC50 = 21 nM, Electrophorus electricus) [69]. Die
23
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
Substanzen I und II wurden von Minaprine (III) abgeleitet. Minaprine wurde
ursprünglich als Antidepressivum entwickelt und ist ein schwacher Inhibitor der AChE
mit einem IC50 von 600 µM. Die Gruppe von Contreras et al. gelangte durch den
Austausch des Morpholin-Rings gegen den N-Benzylpiperidin-Rest (II) zu einer
30000-fachen Aktivitätssteigerung. Bei dem tricyclischen Pyridazin-Derivat IV mit
einem IC50 von 10 nM wurde die Aktivität um den Faktor 60000 gegenüber Minaprine
erhöht.
NN NH N
I
NN NH N
CH3
II
NN NH
NO
CH3
III
NN NH N
IV Abb. 2.2-2 Aminopyridazine mit Hemmaktivität gegenüber AChE.
Die Substanzen I, II und IV können als Hybride aufgefasst werden, da sie die
Pyridazin-Teilstruktur von Minaprine und die N-Benzylpiperidin-Teilstruktur von
Donepezil besitzen [17].
Zu den kürzlich beschriebenen AChE-Hemmstoffen gehören die Substanzen V, VI, VII und VIII mit einer Amidin-Einheit [70-71]. Diese Strukturen wurden aus den
Alkaloiden der chinesischen Pflanze Evodia rutaecarpa abgeleitet. Ihre Amidin-
Struktur wurde für die Hemmaktivität gegenüber Cholinesterasen verantwortlich
gemacht. Für die Substanz V wurde ein IC50 von 7.7 und 4.4 µM für AChE bzw.
BChE ermittelt. Eine gewisse Selektivität für BChE besaß VI mit einem IC50 von 3.4
und 0.5 µM für AChE bzw. BChE. Die stärkere Selektivität gegenüber BChE wurde
VII und VIII zugeschrieben, wobei VII einen IC50 von 7.3 und 0.6 µM für und VIII einen IC50 von 14.9 und 0.1 µM für AChE bzw. BChE zeigten.
24
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
N
N
V
N
N
NH
VI
N
N
VII
N
N
VIII
Abb. 2.2-3 Hemmstoffe der Cholinesterase mit einer Amidin-Struktur.
Im Folgenden wird über die Untersuchung unserer Substanzen 7-14 berichtet. Die
Verbindungen 7 und 8 erwiesen sich als unwirksam gegenüber AChE aus
Electrophorus electricus (EeAChE). Sie wurden bei einer Inhibitorkonzentration von
25 µM als Doppelbestimmung untersucht. Die restlichen Substanzen 9-14 waren
wirksam und wurden bei fünf verschiedenen Konzentrationen zweifach gemessen.
Die Geschwindigkeiten, v, des enzymkatalysierten ASCh-Umsatzes wurden
gegenüber der Inhibitorkonzentration, [I], aufgetragen. Dabei ergaben sich Kurven,
die nicht asymptotisch zur Abszisse verliefen, sondern eine Restaktivität (auch bei
unendlich hoher Inhibitorkonzentration, v[I]→∞) aufwiesen. Der Wert für v[I]→∞ ergab
sich bei einer definierten Substratkonzentration (500 µM) aus der Auftragung von v
gegenüber [I] und einer nichtlinearen Regression nach Gleichung 2.2-1 [67].
∞→∞→ +
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛+
−= [I]
50
[I]0
IC[I]1
)(v
vvv (Gl. 2.2-1)
25
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
Hierbei ist v0 die Geschwindigkeit der enzymkatalysierten Substrathydrolyse in
Abwesenheit des Inhibitors. Der mit Gleichung 2.2-1 ermittelte IC50-Wert entspricht
der Konzentration des Inhibitors, welche die Geschwindigkeit der Reaktion auf
(v0 – v[I]→∞)/2 + v[I]→∞ reduziert. Zur Bestimmung der IC50-Werte wurden prozentuale
Geschwindigkeiten gegenüber den Inhibitorkonzentrationen aufgetragen und somit
prozentuale Werte für v[I]→∞ erhalten.
Um kinetische Parameter zu ermitteln und damit das Verhalten von 9-14 als
Inhibitoren der AChE zu charakterisieren, wurde ein allgemein gültiges kinetisches
Modell benutzt, das in Schema 2.2-1 dargestellt ist. Eine nicht-kompetitive Hemmung
liegt vor, wenn der ESI Komplex inaktiv ist (β=0) und α gleich 1 ist.
Schema 2.2-1
E + S ES E + PkPKs
+IKi +IαKi
ESI EI + PαKs
EI + S βkP
Allgemeines kinetisches Modell der reversiblen Enzymhemmung.
Das Enzym, E, bildet mit dem Substrat, S, den Michaelis-Menten-Komplex, ES.
Dieser Komplex ist fähig, Produkt umzusetzen mit einer katalytischen Konstante kP.
Wenn der Inhibitor, I, um dieselbe Bindungsstelle am Enzym mit dem Substrat
konkurriert, spricht man von kompetitiver Hemmung. Diese Art der Inhibition wird
durch die Dissoziationskonstante Ki charakterisiert und ist im Schema 2.2-2
dargestellt.
26
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
Schema 2.2-2
E + S ES E + PkPKs
+IKi
EI + S
Kinetisches Modell der kompetitiven Enzymhemmung.
Wenn die Bindung des Inhibitors an das Enzym nur dann erfolgt, wenn bereits das
Substrat am Enzym gebunden vorliegt, dann handelt es sich um eine unkompetitive
Hemmung (Schema 2.2-3). Hieraus ergibt sich, dass der Inhibitor an einer anderen
Stelle des Enzyms binden kann, die nicht die Substrat-Bindungsstelle ist. Die
Dissoziationskonstante Ks steht für den binären Komplex ES und die
Dissoziationskonstante αKi für den ternären Komplex ESI. Wenn nicht nur ES,
sondern auch ESI fähig ist, Produkt umzusetzen, wird diese Produktbildung durch die
Geschwindigkeitskonstante βkP charakterisiert. Die Produktbildungskonstante für den
ternären Komplex, βkP, ist allerdings kleiner verglichen mit der
Produktbildungskonstante für den binären Komplex, kP.
Schema 2.2-3
E + S ES E + PkPKs
+IαKi
ESI EI + PβkP
Kinetisches Modell der unkompetitiven Enzymhemmung.
27
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
28
Zur Charakterisierung der Verbindungen 9-14, wurde der Ellman-Assay bei vier
verschiedenen Substratkonzentrationen (250, 500, 750 und 1000 µM) durchgeführt.
Um den Hemmmechanismus der Inhibitoren zu untersuchen, wurde zuerst der
Lineweaver-Burk Plot verwendet. Bei diesem Plot werden die reziproken
Geschwindigkeiten gegenüber den reziproken Substratkonzentrationen aufgetragen.
Dieser Plot ist linear. Es ergibt sich eine Schar von Geraden. Bei der unkompetitiven
Inhibition verlaufen die Geraden parallel. Im Fall der kompetitiven Inhibition kreuzen
sich die Geraden in einem Punkt auf der Ordinaten-Achse. Bei den Inhibitoren des
nicht-kompetitiven Typs kreuzen sich die Geraden in einem Punkt auf der Abszisse.
Bei einer Verschiebung des Schnittpunktes von der Abszisse weg nach oben bzw.
nach unten geht der Hemmtyp zunehmend in eine kompetitive bzw. unkompetitive
Hemmung über (gemischter Typ). Die Verbindungen 9-14 zeigten sich als Inhibitoren
des gemischten Typs (Lineweaver-Burk Plots nicht abgebildet). Aus den Replots der
Lineweaver-Burk Plots sollten die Werte für α, β und Ki ermittelt werden. Die Replots
entstehen aus der Auftragung der Anstiege und der Ordinatenabschnitten (jeweils
aus dem Lineweaver-Burk Plot) gegenüber der Inhibitorkonzentration.
Im Fall der gemischten Hemmung mit (1 < α < ∞) und eines katalytisch aktiven ESI
Komplexes mit (0 < β < 1) sollten die Replots die Form einer Hyperbel zeigen.
Daraus wurde der Name hyperbole gemischte Inhibition abgeleitet [72]. Es ist dann
möglich, durch eine doppelt-reziproke Auftragung der Anstiege und
Ordinatenabschnitte (jeweils aus dem Lineweaver-Burk Plot) den Replot zu
linearisieren und α, β und Ki zu berechnen. Die Replots aus den Messungen von 9-
14 ergaben jedoch keine Hyperbeln sondern Geraden, weswegen die Berechnung
von β nach diesem Verfahren nicht möglich war. Allerdings wurden aus den Replots
α und Ki Werte abgeleitet. Die Werte (nicht gezeigt) stimmten annähernd mit denen
überein, die nach dem unten beschriebenen Verfahren letztlich ermittelt wurden.
Es wurde ein Verfahren angewendet, das speziell für die Auswertung der hyperbolen
gemischten Inhibition von Antonio Baici entwickelt wurde, da die Auftragungen der
Geschwindigkeiten gegenüber den Konzentrationen von 9-14 eine enzymatische
Restaktivität auch bei hohen Inhibitorkonzentrationen vermuten ließen. Also wurden
die erhaltenen Werte aus den Ellman-Assays, mittels des Specific Velocity Plots [73]
analysiert. Dieser Plot zur komplexen Analyse der Inhibitoren 9-14 sollte die
kinetischen Parameter Ki, αKi und β liefern.
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
Die Michaelis-Menten Gleichung 2.2-2 beschreibt das allgemeine kinetische Model,
das im Schema 2.2-1 dargestellt ist.
[ ][ ][ ] [ ] [ ]
[ ]
max
i is
i i
SI K I K
K SI K I K
Vv =
⎛ ⎞ ⎛ ⎞+ +α +⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎜ ⎟ ⎜ ⎟β + α β + α⎝ ⎠ ⎝ ⎠
α (Gl. 2.2-2)
Baici et al. formten die Michaelis-Menten Gleichung 2.2-2 um, und somit entstand die
Gleichung 2.2-3.
[ ] [ ] [ ]
[ ] [ ] [ ] [ ]1
m m i
m i m i
S S IK K KS I S I
K K K K
vV
+ βα
=+ + +
α
(Gl. 2.2-3)
Wenn anstatt der üblichen Substratkonzentration [S], die specific substrate
concentration σ angegeben wird, wobei σ = [S]/Km ist, ergibt sich die Gleichung 2.2-4.
[ ]
[ ] [ ]1
i
i i
IK
I IK K
vV
σ + βσα
=+ σ + + σ
α
(Gl. 2.2-4)
Die Geschwindigkeit in Abwesenheit des Inhibitors, v0, wird gegeben durch die
Michaelis-Menten Gleichung 2.2-5.
[ ]
[ ]1
0 m
m
SK
SK
vV
σ= =
1+ σ+
(Gl. 2.2-5)
29
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
Die relative Geschwindigkeit (Gleichung 2.2-6) wird abgeleitet aus dem Quotienten
zwischen Gleichung 2.2-4 und Gleichung 2.2.-5.
( ) [ ]
[ ] [ ]
1 1
1 1
i
0
i i
IK
I IK K
vv
⎛ ⎞+ σ + β⎜ ⎟α⎝=
⎛ ⎞σ + + +⎜ ⎟α⎝ ⎠
⎠ (Gl. 2.2-6)
Die Plots für die Gleichung 2.2.-6 (v/v0 gegenüber [I] oder σ) sind hyperbolisch [73].
Um die Plots zu linearisieren, wird die reziproke Gleichung 2.2-7 verwendet.
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]
1 11
1 1
i i0 i
i i
IIK K K
I IK K
vv
⎛ ⎞− +⎜ ⎟α σ⎝ ⎠= +
1+ σ+ β + β
α α
(Gl. 2.2-7)
Da der Quotient σ/(1+σ) specific velocity genannt wird, wird die Gleichung 2.2-7 zur
specific velocity Gleichung. Bei dem specific velocity Plot werden v0/v gegenüber
σ/(1+σ) aufgetragen. Es entsteht eine Schar gerade Linien, die im Bereich 0 <
σ/(1+σ) < 1 definiert werden.
Die Werte a bzw. b ergeben sich aus den Intersektionspunkten für σ/(1+σ) = 0 und
für σ/(1+σ) = 1. Die Werte a und b werden durch die Gleichung 2.2-8 bzw. Gleichung
2.2-9 beschrieben.
i0
i
[I]1KInt a [I]1
K
+= =
+ βα
(Gl. 2.2-8)
i1
i
[I]1KInt b [I]1K
+α
= =+ β
α
(Gl. 2.2-9)
30
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
Der Anstieg des Plots wird beschrieben durch die Gleichung 2.2-10.
[ ][ ]
1 1
1
i i
i
IK KAnstieg
IK
⎛ ⎞−⎜ ⎟α⎝=+ β
α
⎠ (Gl. 2.2-10)
Der Anstieg hat einen positiven oder einen negativen Wert, abhängig von den
Werten für Ki und αKi. Wenn Ki < αKi (α > 1) ist der Anstieg negativ. Wenn Ki > αKi (α
< 1) ist der Anstieg positiv. Der Quotient αKi/Ki ergibt den Wert für α.
Bei den Replots des specific velocity Plots werden a(a-1) bzw. b(b-1) gegenüber dem
reziproken Wert der Inhibitorkonzentration (1/[I]) aufgetragen. Die Replots werden
beschrieben anhand der Gleichung 2.2-11 und der Gleichung 2.2-12. Sie
ermöglichen die Berechnung von α, β, αKi und Ki.
[ ]1
-iKa
a -1 Iα α
= +α β α − β
(Gl. 2.2-11)
[ ]1 1
1- 1iKb
b -1 Iα
= +β − β
(Gl. 2.2-12)
Aus dem Ordinatenabschnitt der Gleichung 2.2-12 wurde der Wert für β berechnet.
Dieser Wert wurde eingesetzt, um aus dem Ordinatenabschnitt der Gleichung 2.2-11
den Wert für α zu erhalten. Erst wenn β und α bekannt waren, wurde anhand des
Anstiegs von Gleichung 2.2-11 bzw. Gleichung 2.2-12 den Wert für Ki bzw. αKi
ermittelt.
In der Tabelle 2.2-1 wurden die erhaltenen Werte für 7-14 aufgetragen. Die
Abbildungen 2.2-4 bis 2.2-39 zeigen die Bestimmung der IC50-Werte bei den vier
verschiedenen Substratkonzentrationen, sowie den specific velocity Plot und seine
Replots für die Substanzen 9-14. Für die Analyse wurde ein Km-Wert von 550 ± 40
µM [67] zugrunde gelegt.
31
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
Tab. 2.2-1 Hemmung der AChE durch die Verbindungen 7-14.
X S
N
NH
O
N
(CH2)n
7 X = CH2, n = 2 8 X = CH2, n = 3 9 X = N-Bn, n = 210 X = N-Bn, n = 3
X SN
NN
(CH2)n
11 X = CH2, n = 2 12 X = CH2, n = 313 X = N-Bn, n = 214 X = N-Bn, n = 3
EeAChE
IC50a ± SEM v[I]→∞
c Kie ± SEM αKi
e ± SEM βe
(µM) (%) (µM) (µM)
7 >75b nbd nb nb nb
8 >75b nb nb nb nb
9 1.35 ± 0.06 8.0 1.55 ± 0.09 1.08 ± 0.03 0.084 ± 0.001
10 1.51 ± 0.07 10.5 2.07 ± 0.19 0.98 ± 0.13 0.24 ± 0.02
11 1.75 ± 0.10 3.8 1.32 ± 0.08 2.70 ± 0.59 0.14 ± 0.01
12 2.26 ± 0.15 12.2 1.92 ± 0.12 2.87 ± 0.20 0.17 ± 0.01
13 3.09 ± 0.25 9.9 2.36 ± 0.22 3.88 ± 0.22 0.16 ± 0.01
14 1.73 ± 0.10 7.0 1.50 ± 0.07 2.34 ± 0.17 0.12 ± 0.004
a Werte, die mit Standard Error of the Mean (SEM) angegeben wurden, sind durch Doppelbestimmung bei fünf verschiedenen Inhibitor-Konzentrationen und einer Substratkonzentration von 500 µM entstanden. b Ermittelt aus einer Doppelbestimmung bei einer Inhibitorkonzentration von 25 µM. c Werte für v[I]→∞
wurde als Prozent von v0 berechnet und sind für eine Substratkonzentration von 500 µM angegeben. d nb, nicht bestimmt. e Werte wurden durch Doppelbestimmung bei fünf verschiedenen Inhibitor-Konzentrationen und vier verschiedenen Substratkonzentrationen ermittelt.
32
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
[9] (µM)0 2 4 6 8 10
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-4 Inhibition der EeAChE durch 9. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [9] bei [S] = 250 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 1.44 ± 0.08 µM und v[I]→∞ = 6.0 ± 0.7 %.
[9] (µM)0 2 4 6 8 10
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-5 Inhibition der EeAChE durch 9. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [9] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 1.35 ± 0.06 µM und v[I]→∞ = 8.0 ± 0.9 %.
33
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
[9] (µM)0 2 4 6 8 10
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-6 Inhibition der EeAChE durch 9. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [9] bei [S] = 750 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 1.17 ± 0.07 µM und v[I]→∞ = 11.1 ± 1.4 %.
[9] (µM)0 2 4 6 8 10
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-7 Inhibition der EeAChE durch 9. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [9] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 1.33 ± 0.05 µM und v[I]→∞ = 12.1 ± 1.1 %.
34
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
σ / (1+σ) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
v0/v
0
2
4
6
8
Abb. 2.2-8 Specific velocity Plot für die AChE Hemmung durch 9. Aufgetragen wurde v0/v bei den Inhibitorkonzentrationen 2 µM (○), 4 µM (●), 6 µM (□), 8 µM (■) und 10 µM (△) gegenüber σ/(1+σ) als Mittelwerte einer Doppelbestimmung bei vier unterschiedlichen Substratkonzentrationen (250, 500, 750 und 1000 µM).
1/[9]-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6
a/(a
-1);
b/(b
-1)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
Abb. 2.2-9 Sekundärplot des specific velocity Plots in Abbildung 2.2-8. Aufgetragen wurden a/(a-1) Werte (●), wobei a die Ordinatenabschnitte bei σ/(1+σ) = 0 waren, und analog b/(b-1) Werte (○), wobei b die Ordinatenabschnitte bei σ/(1+σ) = 1 waren, jeweils gegenüber den reziproken Werten der Inhibitorkonzentration, 1/[9].
35
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
[10] (µM)
0 1 2 3 4 5
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-10 Inhibition der EeAChE durch 10. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [10] bei [S] = 250 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 1.61 ± 0.04 µM und v[I]→∞ = 5.0 ± 0.5 %.
[10] (µM)
0 1 2 3 4 5
v (%
)
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-11 Inhibition der EeAChE durch 10. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [10] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 1.51 ± 0.07 µM und v[I]→∞ = 10.5 ± 1.3 %.
36
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
[10] (µM)
0 1 2 3 4 5
v (%
)
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-12 Inhibition der EeAChE durch 10. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [10] bei [S] = 750 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 1.39 ± 0.09 µM und v[I]→∞ = 16.7 ± 2.1 %.
[10] (µM)
0 1 2 3 4 5
v (%
)
60
90
120
150
Abb. 2.2-13 Inhibition der EeAChE durch 10. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [10] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 1.38 ± 0.07 µM und v[I]→∞ = 20.4 ± 2.0 %.
37
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
σ / (1+σ)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
v 0/v
0
1
2
3
4
Abb. 2.2-14 Specific Velocity Plot für die AChE Hemmung durch 10. Aufgetragen wurde v0/v bei den Inhibitorkonzentrationen 1 µM (○), 2 µM (●), 3 µM (□), 4 µM (■) und 5 µM (△) gegenüber σ/(1+σ) als Mittelwerte einer Doppelbestimmung bei vier unterschiedlichen Substratkonzentrationen (250, 500, 750 und 1000 µM).
1/[10]-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5
a/(a
-1);
b/(b
-1)
0
1
2
3
4
Abb. 2.2-15 Sekundärplot des Specific Velocity Plots in Abbildung 2.2-14. Aufgetragen wurden a/(a-1) Werte (●), wobei a die Ordinatenabschnitte bei σ/(1+σ) = 0 waren, und analog b/(b-1) Werte (○), wobei b die Ordinatenabschnitte bei σ/(1+σ) = 1 waren, jeweils gegenüber den reziproken Werten der Inhibitorkonzentration, 1/[10].
38
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
[11] (µM)
0 5 10 15 20 25
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-16 Inhibition der EeAChE durch 11. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [11] bei [S] = 250 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 1.61 ± 0.06 µM und v[I]→∞ = 2.3 ± 0.3 %.
[11] (µM)
0 5 10 15 20 25
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-17 Inhibition der EeAChE durch 11. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [11] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 1.75 ± 0.10 µM und v[I]→∞ = 3.8 ± 0.7 %.
39
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
[11] (µM)
0 5 10 15 20 25
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-18 Inhibition der EeAChE durch 11. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [11] bei [S] = 750 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 2.00 ± 0.04 µM und v[I]→∞ = 6.3 ± 0.3 %.
[11] (µM)
0 5 10 15 20 25
v (%
)
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-19 Inhibition der EeAChE durch 11. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [11] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 2.10 ± 0.06 µM und v[I]→∞ = 6.9 ± 0.6 %.
40
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
σ / (1+σ)
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
v0/v
0
2
4
6
8
10
12
14
Abb. 2.2-20 Specific velocity Plot für die AChE Hemmung durch 11. Aufgetragen wurde v0/v bei den Inhibitorkonzentrationen 5 µM (○), 10 µM (●), 15 µM (□), 20 µM (■) und 25 µM (△) gegenüber σ/(1+σ) als Mittelwerte einer Doppelbestimmung bei vier unterschiedlichen Substratkonzentrationen (250, 500, 750 und 1000 µM).
1/[11]-0.8 -0.4 0 0.4
a/(a
-1);
b/(b
-1)
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
Abb. 2.2-21 Sekundärplot des specific velocity Plots in Abbildung 2.2-20. Aufgetragen wurden a/(a-1) Werte (●), wobei a die Ordinatenabschnitte bei σ/(1+σ) = 0 waren, und analog b/(b-1) Werte (○), wobei b die Ordinatenabschnitte bei σ/(1+σ) = 1 waren, jeweils gegenüber den reziproken Werten der Inhibitorkonzentration, 1/[11].
41
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
[12] (µM)0 2 4 6 8 10 12
v (%
)
30
60
90
120
150
14
Abb. 2.2-22 Inhibition der EeAChE durch 12. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [12] bei [S] = 250 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 2.31 ± 0.14 µM und v[I]→∞ = 6.2 ± 0.9 %.
[12] (µM)
0 2 4 6 8 10 12
v (%
)
30
60
90
120
150
14
Abb. 2.2-23 Inhibition der EeAChE durch 12. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [12] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 2.26 ± 0.15 µM und v[I]→∞ = 12.2 ± 1.5 %.
42
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
[12] (µM)
0 2 4 6 8 10 12
v (%
)
30
60
90
120
150
14
Abb. 2.2-24 Inhibition der EeAChE durch 12. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [12] bei [S] = 750 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 2.68 ± 0.22 µM und v[I]→∞ = 13.5 ± 2.5 %.
[12] (µM)
0 2 4 6 8 10 12
v (%
)
30
60
90
120
150
14
Abb. 2.2-25 Inhibition der EeAChE durch 12. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [12] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 2.53 ± 0.14 µM und v[I]→∞ = 18.1 ± 1.8 %.
43
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
σ / (1+σ)
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
v0/v
0
2
4
6
Abb. 2.2-26 Specific velocity Plot für die AChE Hemmung durch 12. Aufgetragen wurde v0/v bei den Inhibitorkonzentrationen 5 µM (○), 10 µM (●), 15 µM (□), 20 µM (■) und 25 µM (△) gegenüber σ/(1+σ) als Mittelwerte einer Doppelbestimmung bei vier unterschiedlichen Substratkonzentrationen (250, 500, 750 und 1000 µM).
1/[12]-0.4 -0.2 0 0.2 0.4
a/(a
-1);
b/(b
-1)
0
1
2
3
Abb. 2.2-27 Sekundärplot des specific velocity Plots in Abbildung 2.2-26. Aufgetragen wurden a/(a-1) Werte (●), wobei a die Ordinatenabschnitte bei σ/(1+σ) = 0 waren, und analog b/(b-1) Werte (○), wobei b die Ordinatenabschnitte bei σ/(1+σ) = 1 waren, jeweils gegenüber den reziproken Werten der Inhibitorkonzentration, 1/[12].
44
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
[13] (µM)0 5 10 15 20 25
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-28 Inhibition der EeAChE durch 13. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [13] bei [S] = 250 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 2.82 ± 0.21 µM und v[I]→∞ = 5.7 ± 0.8 %.
[13] (µM)0 5 10 15 20 25
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-29 Inhibition der EeAChE durch 13. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [13] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 3.09 ± 0.25 µM und v[I]→∞ = 9.9 ± 1.5 %.
45
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
[13] (µM)0 5 10 15 20 25
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-30 Inhibition der EeAChE durch 13. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [13] bei [S] = 750 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 3.16 ± 0.19 µM und v[I]→∞ = 13.6 ± 1.3 %.
[13] (µM)0 5 10 15 20 25
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-31 Inhibition der EeAChE durch 13. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [13] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 3.27 ± 0.14 µM und v[I]→∞ = 16.1 ± 1.1 %.
46
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
σ / (1+σ)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
v0/v
0
2
4
6
Abb. 2.2-32 Specific velocity Plot für die AChE Hemmung durch 13. Aufgetragen wurde v0/v bei den Inhibitorkonzentrationen 5 µM (○), 10 µM (●), 15 µM (□), 20 µM (■) und 25 µM (△) gegenüber σ/(1+σ) als Mittelwerte einer Doppelbestimmung bei vier unterschiedlichen Substratkonzentrationen (250, 500, 750 und 1000 µM).
1/[13]-0.2 0 0.2
a/(a
-1);
b/(b
-1)
0
1
2
3
Abb. 2.2-33 Sekundärplot des specific velocity Plots in Abbildung 2.2-32. Aufgetragen wurden a/(a-1) Werte (●), wobei a die Ordinatenabschnitte bei σ/(1+σ) = 0 waren, und analog b/(b-1) Werte (○), wobei b die Ordinatenabschnitte bei σ/(1+σ) = 1 waren, jeweils gegenüber den reziproken Werten der Inhibitorkonzentration, 1/[13].
47
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
[14] (µM)0 5 10 15 20 25
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-34 Inhibition der EeAChE durch 14. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [14] bei [S] = 250 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 1.79 ± 0.10 µM und v[I]→∞ = 3.9 ± 0.5 %.
[14] (µM)0 5 10 15 20 25
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-35 Inhibition der EeAChE durch 14. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [14] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 1.73 ± 0.10 µM und v[I]→∞ = 6.0 ± 0.7 %.
48
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
[14] (µM)0 5 10 15 20 25
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-36 Inhibition der EeAChE durch 14. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [14] bei [S] = 750 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 2.04 ± 0.08 µM und v[I]→∞ = 8.9 ± 0.7 %.
[14] (µM)0 5 10 15 20 25
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-37 Inhibition der EeAChE durch 14. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [14] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-1 ergab sich IC50 = 2.05 ± 0.13 µM und v[I]→∞ = 11.8 ± 1.3 %.
49
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
σ / (1+σ)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
v0/v
0
2
4
6
8
10
Abb. 2.2-38 Specific velocity Plot für die AChE Hemmung durch 14. Aufgetragen wurde v0/v bei den Inhibitorkonzentrationen 5 µM (○), 10 µM (●), 15 µM (□), 20 µM (■) und 25 µM (△) gegenüber σ/(1+σ) als Mittelwerte einer Doppelbestimmung bei vier unterschiedlichen Substratkonzentrationen (250, 500, 750 und 1000 µM).
1/[14]-0.6 -0.4 -0.2 0 0.2
a/(a
-1);
b/(b
-1)
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
Abb. 2.2-39 Sekundärplot des Specific Velocity Plots in Abbildung 2.2-38. Aufgetragen wurden a/(a-1) Werte (●), wobei a die Ordinatenabschnitte bei σ/(1+σ) = 0 waren, und analog b/(b-1) Werte (○), wobei b die Ordinatenabschnitte bei σ/(1+σ) = 1 waren, jeweils gegenüber den reziproken Werten der Inhibitorkonzentration, 1/[14].
50
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
51
Die Verbindungen 9-14 zeigten moderate inhibitorische Eigenschaften gegenüber
der AChE aus Electrophorus electricus. Ihre IC50-Werte befanden sich im niedrigen
mikromolaren Bereich. Für alle diese Verbindungen konnte eine Restaktivität (v[I]→∞)
beobachtet werden. Das gab uns ein erstes Indiz ihrer enzymkinetischen
Charakterisierung. Nach der Auftragung der Werte in dem specific velocity Plot und
dessen Sekundärplot konnten die Werte für α und β ermittelt werden (Tabelle 2.2-1).
Die Tatsache, dass für β ein Wert größer 0 gefunden wurde, bestätigt, dass der
ternäre ESI Komplex das Produkt freisetzen kann. Folglich konnten diese
Verbindungen als hyperbole gemischte Inhibitoren charakterisiert werden.
Erwartungsgemäß lagen die β-Werte (0.084 – 0.24, das entspricht 8.4 – 24 %) über
den jeweiligen Werten für v[I]→∞ bei 500 µM Substratkonzentration (Tabelle 2.2-1). Für
ausnahmslos jeden Inhibitor nahmen die Restaktivitäten (v[I]→∞) mit steigender
Substratkonzentration zu. Die entsprechenden Daten sind in den Bildunterschriften
der obigen IC50-Auftragungen angegeben. Dieser Befund ist ein Ausdruck der
zunehmenden Sättigung des Komplexes EI mit S.
Vier Substanzen (11-14) erfüllten die geforderten Voraussetzungen der hyperbolen
gemischten Hemmung mit (1 < α < ∞) und (0 < β < 1) [72].
Anhand der Werte für Ki und αKi war es ersichtlich, dass die angular annellierten
Verbindungen 11-14 einen stärker kompetitiven Anteil der Hemmung aufweisen. Im
Gegensatz dazu sind die linear annellierten Verbindungen 9 und ausgeprägt 10
stärker unkompetitiv wirksam.
Verbindungen, die kompetitiv das Enzym hemmen, konkurrieren mit dem Substrat
um dieselbe Bindungsstelle. Unkompetitiv wirkende Inhibitoren binden an eine
andere Bindungsstelle, die nicht die Substratbindungsstelle ist. Solche Inhibitoren
können einen ternären ESI Komplex mit β ≠ 0 bilden, er ist dann fähig, das Substrat
umzusetzen. Von den untersuchten Substanzen zeigte 10 den stärksten
unkompetitiven Anteil der Hemmung (α = 0.47). Außerdem war die Restaktivität bei
hoher Inhibitorkonzentration besonders hoch (β = 0.24). Demnach würde die Bindung
des Inhibitors 10 nur zu einer Einschränkung der enzymatischen Aktivität führen,
wobei die Hemmung durch die Substratkonzentration relativ wenig beeinflusst wäre.
Die Inhibitoren 11-14 hemmten mit einem stärker kompetitiven Anteil (α-Werte 1.5–
2.0) und zeigten allerdings ein β > 0. Eine mögliche Erklärung für diesen Sachverhalt
ist eine Anlagerung der Substanzen an die periphere Bindungsstelle (PAS) der
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
Acetylcholinesterase. Der resultierende ternäre Komplex würde dann aus dem
Enzym, das das Substrat im aktiven Zentrum und den Inhibitor an der PAS bindet,
bestehen. Der Inhibitor würde mit dem Substrat um die Bindung an der PAS
konkurrieren, woraus der kompetitive Anteil der Hemmung resultieren würde.
2.2.3 Charakterisierung der Hemmung der hAChE und der hBChE Es konnte gezeigt werden, dass die Inhibitoren 9-14 eine moderate Hemmaktivität
gegenüber der EeAChE besaßen. Die Verbindungen wurden deswegen an der
humanen Acetylcholinesterase (hAChE) untersucht. Des Weiteren war es auch
wichtig, ihre Aktivität gegenüber der humanen Butyrylcholinesterase (hBChE) zu
testen. Das aktive Zentrum besteht bei beiden Enzymen (AChE und BChE) aus einer
katalytischen Triade mit dem Aminosäuren Serin, Histidin und Glutamat [20, 74]. Die
periphere Bindungsstelle (PAS) der hAChE ist durch die Aminosäuren Tyr72, Tyr124,
Trp286, Tyr341 und Asp74 charakterisiert. Die PAS der hBChE ist anders aufgebaut
und besitzt eine schwächere Affinität zu den typischen PAS-Liganden der AChE. Die
ersten drei genannten aromatischen Aminosäuren fehlen in der PAS der hBChE, die
durch Tyr332 und Asp70 charakterisiert ist [8, 19]. Da die PAS bei den beiden
Enzymen anders aufgebaut ist, und wir eine Interaktion der Hemmstoffe mit der PAS
vermuteten, sollten die Hemmexperimente mit der hBChE Aufschlüsse über die
Bindung der Inhibitoren an Cholinesterasen erlauben.
Die Charakterisierung der Hemmung der humanen Enzyme hAChE und hBChE
erfolgte analog zu EeAChE. Nur wurde für die Reaktion der hBChE Butyrylthiocholin
als Substrat eingesetzt. Für die Verbindungen konnten keine Restaktivitäten der
humanen Cholinesterasen ermittelt werden, da die Auftragungen nach der Gleichung
2.2-1 negative Werte für v[I]→∞ lieferten (Daten nicht gezeigt). Somit wurden die
Geschwindigkeiten, v, des durch das Enzym katalysierten Acetylthiocholin- bzw.
Butyrylthiocholin-Umsatzes gegenüber der Inhibitorkonzentration, [I], aufgetragen
und durch nichtlinearen Regression nach Gl. 2.2.12 analysiert.
0
50
[I]1IC
vv =⎛ ⎞
+⎜ ⎟⎝ ⎠
(Gl. 2.2.12)
52
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
53
In die Tabelle 2.2-2 wurden die Inhibitionswerte für 7-14 gegenüber hAChE und
hBChE eingetragen. Die Abbildungen 2.2-38 bis 2.2-48 zeigen die Bestimmung der
IC50 Werte für die Substanzen 9-14.
Tab. 2.2-2 Hemmung der hAChE und der hBChE durch die Verbindungen 7-14.
hAChE hBChE
IC50a ± SEM IC50
a ± SEM
(µM) (µM)
7 > 200 > 200
8 > 200 > 200
9 14.2 ± 0.3 > 200
10 5.69 ± 0.55 51.5 ± 10.1
11 56.0 ± 4.5 88.0 ± 1.0
12 20.5 ± 1.9 131 ± 7
13 21.8 ± 1.6 89.9 ± 3.7
14 62.5 ± 6.0 119 ± 14 a Werte, die mit SEM angegeben wurden, sind durch Doppelbestimmung bei fünf verschiedenen Inhibitorkonzentrationen entstanden. Werte ohne SEM sind Mittelwerte einer Doppelbestimmung bei einer Inhibitorkonzentration von 25 µM.
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
[9] (µM)0 5 10 15 20 25
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-40 Inhibition der hAChE durch 9. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [9] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-12 ergab sich IC50 = 14.24 ± 0.33 µM.
[10] (µM)0 2 4 6 8 10
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-41 Inhibition der hAChE durch 10. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [10] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-12 ergab sich IC50 = 5.69 ± 0.55 µM.
54
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
[11] (µM)0 20 40 60 80 100
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-42 Inhibition der hAChE durch 11. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [11] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-12 ergab sich IC50 = 56.0 ± 4.5 µM.
[12] (µM)0 5 10 15 20 25
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-43 Inhibition der hAChE durch 12. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [12] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-12 ergab sich IC50 = 20.5 ± 1.9 µM.
55
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
[13] (µM)0 10 20 30 40 50
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-44 Inhibition der hAChE durch 13. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [13] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-12 ergab sich IC50 = 21.8 ± 1.6 µM.
[14] (µM)0 40 80 120 160 200
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 2.2-45 Inhibition der hAChE durch 14. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [14] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-12 ergab sich IC50 = 62.5 ± 6.0 µM.
56
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
[10] (µM)0 40 80 120 160 200
v (%
)
0
20
40
60
80
100
Abb. 2.2-46 Inhibition der hBChE durch 10. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [10] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-12 ergab sich IC50 = 51.5 ± 10.1 µM.
[11] (µM)0 40 80 120 160 200
v (%
)
0
20
40
60
80
100
Abb. 2.2-47 Inhibition der hBChE durch 11. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [11] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-12 ergab sich IC50 = 88.0 ± 1.0 µM.
57
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
[12] (µM)0 40 80 120 160 200
v (%
)
0
20
40
60
80
100
Abb. 2.2-48 Inhibition der hBChE durch 12. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [12] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-12 ergab sich IC50 = 131 ± 7 µM.
[13] (µM)0 40 80 120 160 200
v (%
)
0
20
40
60
80
100
Abb. 2.2-49 Inhibition der hBChE durch 13. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [13] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-12 ergab sich IC50 = 89.9 ± 3.7 µM.
58
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
[14] (µM)0 60 120 180 240
v (%
)
0
20
40
60
80
100
Abb. 2.2-50 Inhibition der hBChE durch 14. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [14] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 2.2-12 ergab sich IC50 = 119.2 ± 14.2 µM. Die Substanzen 7 und 8 waren gegenüber der humanen AChE erneut wirkungslos,
und alle anderen Substanzen der Serie hemmten wiederum das Enzym. Dabei
zeigten die Verbindungen 9-14 eine bessere Affinität zu der AChE von Electrophorus
electricus als zu der humanen AChE. Während die IC50 Werte für die Hemmung der
EeAChE im niedrig-mikromolaren Bereich lagen, waren sie für die Hemmung der
hAChE um den Faktor 4-40 höher.
Alle Verbindungen erwiesen sich als schlechte Hemmstoffe der hBChE, und drei
Verbindungen waren wirkungslos (7, 8 und 9). Diese Tatsache kann im
Zusammenhang mit den enzymkinetischen Untersuchungen bewertet werden. Für
Inhibitoren des gemischten Typs ist der mögliche Bindungsort die periphere
Bindungsstelle. Da aber die periphere Bindungsstelle der hAChE anders aufgebaut
ist als die der hBChE, können die höheren IC50-Werte für die Hemmung der hBChE
durch eine geringere Affinität der Substanzen zur PAS erklärt werden.
59
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
60
Bislang wird Butyrylcholinesterase, neben Acetylcholinesterase, als ein Target für die
Alzheimer-Therapie angesehen [20]. Man nimmt an, dass beide Enzyme (AChE und
BChE) für die Regulation der Halbwertszeit der Acetylcholin in der cholinergen
Synapse verantwortlich sind. BChE kann an Stelle von AChE die Spaltung von
Acetylcholin im synaptischen Spalt katalysieren und somit einen Verlust der AChE-
Aktivität kompensieren. Auch BChE konnte in den Plaques, Tangles und Amyloid-
haltigen Gefäßen bei Morbus Alzheimer nachgewiesen werden und ihr Vorkommen
korrelierte mit der Entstehung von Amyloid-Plaques und neurofibrillären Tangles in
den Gehirnen von Alzheimer-Patienten [75].
Es wird vermutet, dass AChE und BChE verschiedene Rollen im Zentralen
Nervensystem übernehmen, und funktionelle und morphologische Unterschiede
beider Enzyme wurden beschrieben [75-76], z.B. im Bezug auf die Bildung von
β-Amyloid-Fibrillen in vitro. Hier weisen neuere Untersuchungen auf eine
entgegengesetzte Rolle beider Enzyme hin [77].
Deswegen ist es sinnvoll, mit Inhibitoren Selektivität gegenüber einer der beiden
humanen Cholinesterasen zu erzielen. Außerdem können selektive Inhibitoren als
pharmakologische Werkzeuge in selektiven Cholinesterase-Assays Bedeutung
erlangen, da die BChE-Aktivität unterdrückt wäre und die AChE-Aktivität für
enzymatische Untersuchungen verbleiben würde, und umgekehrt [78].
Die in Tabelle 2.2.-2 aufgeführten IC50-Werte zeigen jedoch für keine Substanz eine
ausreichende Selektivität für hAChE. Der wirksamste Inhibitor (10) hat einen nur 9-
fach höheren IC50-Wert für hBChE.
Ein strukturelles Charakteristikum der Verbindungen 9, 10, 13 und 14 ist ein
basischer, mit einem Benzylrest substituierter Stickstoff. Dieses Strukturelement
findet sich auch im Donepezil [30] und AP2238 [27], wo es zum Grunde der Schlucht
ausgerichtet ist. Auch in Untersuchungen unserer Gruppe zu mehrcyclischen 1,3-
Oxazin-4-onen war das Vorliegen eines basischen, mit einem Benzylrest
substituierten Stickstoffs für die EeAChE-Hemmung wichtig. Bei Verkleinerung der
Benzyl-Gruppe kam es zur Wirkungsabnahme, beim Austausch der N-Benzyl-Einheit
gegen eine Methylengruppe oder Sauerstoff zum Wirkungsverlust [67].
Momentan laufen in unserem Arbeitskreis Untersuchungen zur Ermittlung der α- und
β-Werte von Donepezil, die dann mit den hier beschriebenen Ergebnissen
vergleichend diskutiert werden können.
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
61
2.3 Experimenteller Teil 2.3.1 Allgemeines zur Synthese und Strukturanalytik
Die Verbindungen 7, 9 und 10 wurden mit Hilfe des Laborautoklaven „TinyClave“ von
Büchi Glas Uster synthetisiert.
Schmelzpunkte. Die Bestimmung von Schmelzpunkten erfolgte an einem Gerät der
Firma Gallenkamp und an einer Büchi B-510-Schmelzpunktapparatur.
NMR-Spektroskopie. Die 1H-NMR-Spektren (500 MHz) und 13C-NMR (125 MHz)
wurden am Pharmazeutischen Institut, Poppelsdorf, der Universität Bonn von Frau
M. Schneider, Frau S. Terhart-Krabbe und Frau A. Reiner an einem Bruker Advance
DRX-500 Spektrophotometer in CDCl3 oder DMSO-d6 aufgenommen. Die Zuordnung
der Signale in den 13C-NMR-Spektren erfolgte mit Hilfe von 1H/13C -NMR-
Korrelationsexperimenten (HSQC). HSQC-Messungen wurden die Substanzen 11-14
durchgeführt: NOE (Nuclear Overhauser Effect)- Messungen wurden für die
Substanz 12 durchgeführt. Die Angaben der chemischen Verschiebungen in parts
per million (ppm) beziehen sich auf die δ−Skala. Als interner Standard dienten die
chemischen Verschiebungen der Signale der nicht deuterierten Lösungsmittel: CDCl3
(1H, 7.24 ppm; 13C, 77.00 ppm) und DMSO-d6 (1H, 2.49 ppm; 13C, 39.70 ppm). Die
Kopplungskonstanten (J) sind in Hertz (Hz) angegeben. Zur Wiedergabe der Spin-
Multiplizitäten werden folgende Abkürzungen verwendet: s (Singulett), d (Duplett), t
(Triplett), q (Quartett), quint (Quintett), sept (Septett), m (Multiplett), zentr. m
(zentriertes Multiplett), und br (breites Signal).
Elementaranalyse. Die Elementaranalyse (C,H,N) wurden am Pharmazeutischen
Institut, Endenich, der Universität Bonn von Herrn H. Passgang mit einem VarioEL-
System der Firma Elementar Analysensysteme GmbH durchgeführt.
Dünnschichtchromatographie. Die Reinheit der synthetisierten Verbindungen
wurde zusätzlich mittels analytischer Dünnschichtchromatographie (DC) auf
Aluminiumfolien der Firma Merck, beschichtet mit Kieselgel 60 F254, geprüft. Die
Detektion der Zielverbindungen nach Entwickeln des Chromatogramms erfolgte mit
UV-Licht (254 nm, 366 nm), sowie den nachfolgenden Sprühreagenzien:
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
62
Ehrlich´s Reagenz: 1g p-Dimethylaminobenzaldehyd wurde in einem Gemisch aus
25 mL Salzsäure (36 %) und 75 mL Methanol gelöst.
I2/KI-Lösung: 13 g Jod wurden in einer Lösung von 20 g Kaliumiodid in 30 mL
Wasser unter Schütteln gelöst. Mit Wasser wurde ad 1000 mL
aufgefüllt. Zur Kontraststeigerung wurde die DC-Platte nach
Anwendung der I2/KI-Lösung mit 2 N Salzsäure nachbehandelt.
Spektrophotometrische Experimente. Die UV/Vis-Messungen und alle
spektrophotometrischen Assays erfolgten an einem Cary 50 Bio UV/Vis-
Spektrophotometer bzw. an einem Cary 100 Bio UV/Vis-Spektrophotometer der
Firma Varian, beide mit einem temperierbaren Küvettenhalter ausgestattet. Die
Proben wurden dabei durch die Thermostaten UC-5B bzw. F12-MP von Julabo
temperiert.
Die enzymologischen Untersuchungen wurden mit humaner Acetylcholinesterase
(hAChE) (2790 U/mg), Acetylthiocholiniodid (ASCh) und 5,5´-Dithio-bis(2-
nitrobenzoesäure) (DTNB) von Sigma-Aldrich (Steinheim, Deutschland) durchgeführt.
Acetylcholinesterase (EeAChE) aus dem Zitteraal Electrophorus electricus (1044
U/mg, 1276 U/mg und 1025 U/mg), Acetonitril (HPLC-Qualität) sowie getrocknetes
DMSO (über Molsieb gelagert) waren von Fluka (Deisenhofen, Deutschland).
Humane Butyrylcholinesterase (hBChE) (1162 U/mg) wurde von Lee Biosolutions
(St. Louis, USA) bezogen. Zur Auswertung der kinetischen Daten wurde Grafit v.5.0
(R.J. Leatherbarrow, Erithacus Software, Staines, Großbritanien, 2001) verwendet.
2.3.2 Cholinesterase-Assays Die kinetischen Messungen zur Bestimmung der Enzymaktivität von AChE bzw.
BChE beruhen auf der spektrophotometrischen Bestimmung des Produktes 2-Nitro-
5-sulfidobenzoats bei 412 nm. Der Assay wurde bei 25 °C durchgeführt. Assaypuffer
war 100 mM Natriumphosphat-puffer, pH 7.3, mit 100 mM NaCl. Zusätzlich wurde
DTNB (5,5’-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure)) chromogener Reaktionspartner dem
Assay zugesetzt. EeAChE lag als Stammlösung 100 U/mL in Assaypuffer pH 7.3 vor,
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
63
während hAChE und hBChE als Stammlösungen von 3 U/mL bzw. 10 U/mL im
Assaypuffer vorlagen. Ein Aliquot der AChE- bzw. BChE-Stammlösung wurde „im
Eis“ aufgetaut. Die EeAChE-Stammlösung wurde vor jeder Messung 1:30 mit
eiskaltem Assaypuffer verdünnt. Die hBChE-Stammlösung wurde vor jeder Messung
1:10 mit eiskaltem Assaypuffer verdünnt. Substrat war Acetylthiocholin bzw.
Butyrylthiocholin. Von ASCh wurde Stammlösung von 5, 10, 15 oder 20 mM in
Assaypuffer hergestellt, von Butyrylthiocholin wurde eine Stammlösung von 10 mM in
Assaypuffer bereitet.
In eine Küvette, welche 830 µL temperierten Assaypuffers enthält, werden
nacheinander 50 µL Acetonitril, 10 µL einer Inhibitor-Lösung (gelöst in Acetonitril)
und 50 µL der DTNB-Lösung (7 mM in Assaypuffer) pipettiert. Anschließend werden
10 µL eisgekühlte Enzym-Lösung zugegeben, wiederum gründlich gemischt und
fünfzehn Minuten bei 25 °C inkubiert.
Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von 50 µL ASCh-Lösung (5, 10, 15
oder 20 mM in Assaypuffer) bzw. Butyrylthiocholin-Lösung (10 mM in Assaypuffer)
und gründlichem Mischen gestartet. Die Extinktionszunahme bei 412 nm wurde über
einem Zeitraum von fünf Minuten verfolgt.
Somit ergaben sich in der Küvette folgende Konzentrationen: 350 µM DTNB, 6 %
Acetonitril, 250, 500, 750 oder 1000 µM Substrat, 0.033 U/mL EeAChE bzw. 0.03
U/mL hAChE bzw. 0.01 U/mL hBChE und unterschiedliche Konzentrationen
(abhängig der Konzentration der Stammlösung) an Inhibitor. Die ungehemmte
Reaktion wurde in gleicher Weise bestimmt, nur wurden anstelle der 10 µL Inhibitor-
Lösung 10 µL Acetonitril zugegeben. Das Gesamtvolumem in der Küvette war 1 mL.
Zur Bestimmung der nichtenzymatischen Hydrolyse von Acetylthiocholin wurde
obiger Assay verwendet. Statt der Inhibitor-Lösung wurde Acetonitril und statt der
Enzym-Lösung wurde Assaypuffer zugesetzt. Die Aufnahme der Extinktionszunahme
bei 412 nm erfolgt über einem Zeitraum von 60 Minuten. Die Anstiege bei den
unterschiedlichen Substratkonzentrationen wurden ermittelt und bei allen Messungen
von EeAChE und hAChE entsprechend abgezogen.
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
2.3.3 Synthesevorschriften
6-Benzyl-4,5,6,7-tetrahydro-2-[3-(phenyl)thioureido]thieno[2,3-c]pyridin-3-
carbonsäureethylester (2b)
SNH-CS-NH
CO2Et
N 2
4
3'1''
1'''
2-Amino-6-benzyl-4,5,6,7-tetrahydro-thieno[2,3-c]pyridin-3-carbonsäureethylester
(1b) wurde aus der Substanzbibliothek des Arbeitskreises entnommen. Zu einer
Mischung von Verbindung 1b (9.49 g, 30 mmol) in Ethanol (12 mL) und unter Argon
wurde Phenylisothiocyanat (11.36 g, 10.1 mL, 84 mmol) zugegeben. Die Mischung
wurde 3 h unter Druck auf 80 °C erwärmt. Diese wurde über Nacht bei
Raumtemperatur stehen gelassen. Es fiel ein Niederschlag aus. Dieser wurde
abfiltriert und mit Ethanol (250 mL) gewaschen. Verbindung 2b (10.14 g, 92 %)
wurde erhalten. Schmb.: 176-178 °C. Lit. Schmb.: 174-175 °C [59]. 1H NMR (DMSO-
d6) δ 1.25 (t, J = 7.1 Hz, 3H, CH3), 2.66, 2.76 (jeweils zentr. m, zusammen 4H, 4-H,
5-H), 3.47, 3.64 (jeweils s, zusammen 4H, 7-H, C6H5-CH2), 4.21 (q, J = 7.1 Hz,.2H,
CH2-CH3), 7.21-7.47 (m, 10H, zweimal C6H5), 11.00, 11.79 (jeweils s, zusammen 2H,
NH). 13C NMR (DMSO-d6) δ 14.12 (CH3), 26.50 (C-4), 49.58, 50.72 (C-5, C-7), 60.51,
60.98 (C6H5-CH2, CH2-CH3), 111.39 (C-3), 127.12 (C-4’’’), 124.43, 128.35, 128.77,
128.85 (C-2’’, C-3’’, C-2’’’, C-3’’’), 123.85, 125.89, 129.04 (C-4’’, C-3a, C-7a), 138.46
(C-1’’, C-1’’’), 150.12 (C-2), 165.57 (CO), 175.72 (CS). C24H25N3O2S2 (451.61).
64
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
5,6,7,8-Tetrahydro-2-(methylthio)-3-phenyl-benzothieno[2,3-d]pyrimidin-4(3H)-on (3a)
S
N
N
O
SCH31'
5
2
2,3,5,6,7,8-Hexahydro-3-phenyl-2-thioxo-benzothieno[2,3-d]pyrimidin-4(1H)-on
wurde an Stelle von 4,5,6,7-Tetrahydro-2-[3-(phenyl)thioureido]benzo[b]thiophen-3-
carbonsäureethylester (2a) zur Synthese von 3a eingesetzt. Diese Verbindung wurde
aus der Substanzbibliothek des Arbeitskreises entnommen. In einer Mischung von
Ethanol (15 mL) und 1 M NaOH (5 mL) wurde 2,3,5,6,7,8-Hexahydro-3-phenyl-2-
thioxo-benzothieno[2,3-d]pyrimidin-4(1H)-on (1.05 g, 3.3 mmol) unter Rühren und
Erwärmen gelöst. Es wurde filtriert und das Filtrat auf Raumtemperatur abgekühlt.
Unter Rühren wurde Methyliodid (0.57 g, 0.25 mL, 4 mmol) zugegeben. Als die
Niederschlagsbildung beendet war, wurde abgesaugt, und das DC-reine Rohprodukt
wurde mit Wasser gewaschen. Verbindung 3a (0.98 g, 91 %) wurde erhalten.
Schmb.: 235-236 °C. Lit. Schmb.: 222-223 °C [79]. 1H NMR (DMSO-d6) δ 1.72-1.82
(m, 4H, 6-H, 7-H), 2.42 (s, 3H, CH3), 2.73, 2.80 (jeweils zentr. m, zusammen 4H, 5-H,
8-H), 7.36-7.39 (m, 2H, 2’-H, 6’-H), 7.52-7.57 (m, 3H, 3’-H, 4’-H, 5’-H). 13C NMR
(DMSO-d6) δ 15.28 (CH3), 21.89, 22.62 (C-6, C-7), 24.55, 25.30 (C-5, C-8), 118.49
(C-4a), 129.44, 129.59 (C-2’, C-3’, C-5’, C-6’), 129.88 (C-4’), 130.91, 131.01 (C-4b,
C-8a), 136.01 (C-1’), 157.56, 158.47 (C-2, C-9a), 161.74 (CO). C17H16N2OS2
(328.46).
65
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
7-Benzyl-5,6,7,8-tetrahydro-2-(methylthio)-3-phenyl-pyrido[4',3':4,5]thieno[2,3-
d]pyrimidin-4(3H)-on (3b)
S
N
N
O
SCH3
N
1'
5
2
1''
In einer Mischung von Ethanol (15 mL) und 1 M NaOH (5 mL) wurde Verbindung 2b
(2.25 g, 5 mmol) unter Rühren und Erwärmen gelöst. Es wurde filtriert und das Filtrat
auf Raumtemperatur abgekühlt. Unter Rühren wurde Methyliodid (0.78 g, 0.34 mL,
5.5 mmol) zugegeben. Als die Niederschlagsbildung beendet war, wurde abgesaugt,
und das DC-reine Rohprodukt wurde mit Wasser gewaschen. Verbindung 3b (1.9 g,
91 %) wurde erhalten. Schmb.: 208-209 °C. Lit. Schmb.: 205-206 °C [60]. 1H NMR
(CDCl3-d6) δ 2.46 (s, 3H, CH3), 2.83 (t, J = 5.7 Hz, 2H, 6-H), 3.04 (zentr. m, 2H, 5-H),
3.65 (s, 2H, 8-H), 3.73 (s, 2H, C6H5-CH2), 7.24-7.52 (m, 10H, zweimal C6H5). 13C
NMR (CDCl3-d6) δ 15.60 (CH3), 25.54 (C-5), 49.78, 51.53 (C-6, C-8), 61.90 (C6H5-
CH2), 118.63 (C-4a), 127.30, 128.83 (C-4b, C-8a), 128.38, 129.04, 129.12, 129.69
(C-2’, C-3’, C-2’’, C-3’’), 129.91, 130.04 (C-4’, C-4’’), 135.76, 137.93 (C-1’, C-1’’),
158.28, 158.51 (C-2, C-9a), 163.02 (CO). C23H21N3OS2 (419.57).
66
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
5,6,7,8-Tetrahydro-benzothieno[2,3-d]pyrimidin-4(3H)-on (4a)
SN
NHO
1
2-Amino-4,5,6,7-tetrahydro-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureethylester (1a) wurde
aus der Substanzbibliothek des Arbeitskreises entnommen. Verbindung 1a (22.5 g,
100 mmol) wurde mit Formamid (100 mL) 4 h unter Rückfluss erhitzt. Beim Erkalten
fiel ein Niederschlag aus, der abgesaugt, mit Wasser und Wasser/Ethanol
gewaschen und getrocknet wurde. Verbindung 4a (9.7 g, 47 %) wurde als DC-reines
Rohprodukt erhalten. Lit. Schmb.: 263-265 °C [80]. 1H NMR (CDCl3-d6) δ 1.81-1.91
(m, 4H, 6-H, 7-H), 2.79, 3.01 (jeweils zentr. m, zusammen 4H, 5-H, 8-H), 8.01 (s, 2-
H). 13C NMR (CDCl3-d6) δ 22.16, 22.86 (C-6, C-7), 25.16, 25.62 (C-5, C-8), 123.27
(C-4a), 15.60 (CH3), 25.54 (C-5), 49.78, 51.53 (C-6, C-8), 61.90 (C6H5-CH2), 118.63
(C-4a), 131.47, 134.59 (C-4b, C-8a), 142.74 (C-2), 159.19 (C-9a), 162.56 (CO).
C10H10N2OS (206.27).
67
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
4-Chlor-5,6,7,8-tetrahydro-benzothieno[2,3-d]pyrimidin (5a)
S
N
N
Cl
1
In einem Ölbad wurde die Mischung aus Verbindung 4a (5.0 g, 24.2 mmol) und
Phosphoroxidchlorid (22.16 g, 37 mL, 145 mmol) unter Rückfluss und
Feuchtigkeitsabschluss 6 h am Sieden gehalten. In einer Abdampfschale wurde mit
heißem Luftstrom über 2 h das Volumen der Lösung verringert. Es wurde mit
Eis/Wasser und NaHCO3 versetzt. Die Lösung (600 mL) wurde auf pH 4 eingestellt.
Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das
Rohprodukt wurde aus n-Hexan umkristallisiert, um Verbindung 5a (2.48 g, 46 %) zu
erhalten. Schmb. 106-109 °C. Lit. Schmb.: 108-111 °C [80]. 1H NMR (DMSO-d6) δ
1.81-1.87 (m, 4H, 6-H, 7-H), 2.87, 2.99 (jeweils zentr. m, zusammen 4H, 5-H, 8-H),
8.78 (s, 1H, 2-H). 13C NMR (DMSO-d6) δ 21.76, 22.01 (C-6, C-7), 25.55, 25.94 (C-5,
C-8), 126.77, 128.09, 139.78 (C-4a, C-4b, C-8a), 151.92 (C-2), 152.41, 168.18 (C-4,
C-9a). C10H9N2SCl (224.71).
68
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
4-[(2-Hydroxyethyl)amino]-5,6,7,8-tetrahydro-benzothieno[2,3-d]pyrimidin (6a, n=2)
S
N
N
NH
OH
1
1'
Im Ölbad wurde Verbindung 5a (550 mg, 2.5 mmol) mit Ethanolamin (1.26 g, 1.25
mL, 20.6 mmol) 2 h zum Sieden gebracht. Nach dem Erkalten wurde der Ansatz auf
Wasser (50 mL) gegossen, unter Eiskühlung mit verd. HCl auf pH 6 eingestellt und
abgesaugt. Das getrocknete Rohprodukt wurde aus Ethanol umkristallisiert, um
Verbindung 6a (n=2) zu erhalten (0.51 g, 82 %). Schmb. 106-109 °C. Lit. Schmb.:
108-111 °C [80]. 1H NMR (DMSO-d6) δ 1.78-1.84 (m, 4H, 6-H, 7-H), 2.75, 2.92
(jeweils zentr. m, zusammen 4H, 5-H, 8-H), 3.53-3.59 (m, 4H, 1’-H, 2’-H), 4.78 (t, J =
5.5 Hz, 1H, NH), 6.42 (br s, 1H, OH), 8.23 (s, 1H, 2-H). 13C NMR (DMSO-d6) δ 22.09,
22.25 (C-6, C-7), 25.01, 25.69 (C-5, C-8), 42.99 (C-1’), 59.46 (C-2’), 115.64, 126.63,
131.46 (C-4a, C-4b, C-8a), 152.83 (C-2), 157.09, 164.57 (C-4, C-9a). C12H15N3OS
(249.34).
69
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
4-[(3-Hydroxypropyl)amino]-5,6,7,8-tetrahydro-benzothieno[2,3-d]pyrimidin (6a, n=3)
S
N
N
NH
OH
1
1'
3-Amino-1-propanol (5.40 g, 5.5 mL, 72 mmol) und Verbindung 5a (1.83 g, 8.1 mmol)
wurde am Ölbad unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur
wurde die Mischung unter Eiskühlung mit Wasser (100 mL) verdünnt, und mit 1 M
HCl wurde pH 6 eingestellt. Ein gelblicher Niederschlag fiel aus, wurde abgesaugt,
mit Wasser gewaschen und aus Ethanol/Wasser (1:5) umkristallisiert. Verbindung 6a
(n=3) wurde erhalten (1.40 g, 66 %). Schmb. 176-178 °C. Lit. Schmb. 180-182 °C
[62]. 1H NMR (DMSO-d6) δ 1.74 (quint, J = 6.4 Hz, 2H, 2’-H), 1.78-1.83 (m, 4H, 6-H,
7-H), 2.74, 2.90 (zentr. m, zusammen 4H, 5-H, 8-H), 3.51-3.56 (m, 4H, 1’-H, 3’-H),
4.67 (t, J = 4.9 Hz, 1H, NH), 6.67 (br s, 1H, OH), 8.23 (s, 1H, 2-H). 13C NMR δ 22.12,
22.24 (C-6, C-7), 25.00, 25.67 (C-5, C-8), 31.60 (C-2’), 38.81 (C-1’), 59.54 (C-3’),
115.55, 126.65, 131.26 (C-4a, C-4b, C-8a), 152.89 (C-2), 156.92, 164.46 (C-4, C-
9a). C13H17N3OS (263.36).
70
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
7-Benzyl-4-[(2-hydroxyethyl)amino]-5,6,7,8-tetrahydro-pyrido[4’3’:4,5]thieno[2,3-
d]pyrimidin (6b, n=2)
S
N
N
NH
OH
N 1
1'
1''
7-Benzyl-4-chlor-5,6,7,8-tetrahydro-pyrido[4’3’:4,5]thieno[2,3-d]pyrimidin (5b) wurde
aus der Substanzbibliothek des Arbeitskreises entnommen. Verbindung 5b (880 mg,
2.8 mmol) wurde mit Ethanolamin (5.06 g, 5.0 mL, 83 mmol) versetzt und unter
Rückfluss am Ölbad 2 h zum Sieden gebracht. Nach dem Erkalten wurde Wasser
(100 mL) zugegeben. Der halbfeste Niederschlag wurde abgetrennt und mit 1 M HCl
gelöst. Nach dem Alkalisieren wurde erneut ein halbfester Niederschlag erhalten.
Dieser wurde aus Ethylacetat/n-Hexan umkristallisiert. Man erhält 260 mg (27 %) der
Verbindung 6b (n=2). Schmb. 119-123 °C. Lit. Schmb. 113-116 °C [61]. 1H NMR
(DMSO-d6) δ 2.80 (t, J = 5.7 Hz, 2H, 6-H), 3.01 (t, J = 5.7 Hz, 2H, 5-H), 3.56 (zentr.
m, 4H, 1’-H, 2’-H), 3.65 (br s, 2H, 8-H), 3.71 (s, 2H, C6H5-CH2), 4.78 (zentr. m, 1H,
NH), 6.44 (zentr. m, 1H, OH), 7.25-7.37 (m, 5H, C6H5), 8.25 (s, 1H, 2-H). 13C NMR δ
25.81 (C-5), 43.04, 48.91 (C-1’, C-2’), 51.51, 59,46 (C-6, C-8), 60.54 (C6H5-CH2),
115.18 (C-4a), 125.36, 129.11 (C-4b, C-8a), 127.25 (C-4’’), 128.43, 128.88 (C-2’’, C-
3’’), 138.33 (C-1’’), 153.08 (C-2), 157.16, 164.95 (C-4, C-9a). C18H20N4OS (340.45).
71
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
2,3,6,7,8,9-Hexahydro-benzothieno[2,3-d]imidazo[1,2-a]pyrimidin-5(11H)-on (7): Allgemeine Vorschrift zur Herstellung von linear anellierten Verbindungen 7-10.
SNH
ON
N 1
Zu einer Lösung von Verbindung 3a (0.98 g, 3 mmol) in 2-Methoxyethanol (12 mL)
wurde Ethylendiamin (11.54 g, 12.8 mL, 192 mmol) zugegeben. Die Mischung wurde
in einem geschlossenen Reaktionsgefäß bei 150 °C über 24 h gerührt. Nach dem
Abkühlen wurde die Mischung auf Eiswasser (150 mL) gegossen, und der
Niederschlag wurde abgesaugt. Das Rohprodukt wurde aus Toluol umkristallisiert,
und man erhält Verbindung 7 (0.69 g, 93 %). Eine Analysenprobe wurde durch
Umkristallisation aus Ethanol erhalten. Schmb. 261-267 °C (Kristallumwandlung bei
196-201 °C). 1H NMR (DMSO-d6) δ 1.68-1.78 (m, 4H, 7-H, 8-H), 2.57-2.60, 2.74-2.77
(jeweils m, zusammen 4H, 6-H, 9-H), 3.61, 4.01 (jeweils t, J = 8.7 Hz, J = 8.7 Hz,
zusammen 4H, 2-H, 3-H), 7.72 (s, 1H, 11-H). 13C NMR (DMSO-d6) δ 22.06, 22.86 (C-
7, C-8), 24.33, 25.38 (C-6, C-9), 40.06, 42.12 (C-2, C-3), 114.00 (C-5a), 125.15,
130.14 (C-5b, C-9a), 155.88, 157.00 (C-10a, C-11a), 166.02 (C-5). C12H13N3OS
(247.32). Elementaranalyse: ber. C 58.28, H 5.30, N 16.99, S 12.97; gef. C 58.74, H
5.46. N 16.50, S 12.52.
72
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
2,3,4,7,8,9,10,12-Octahydro-6H-benzothieno[2,3-d]pyrimido[1,2-a]pyrimidin-6-on (8).
SNH
ON
N1
Verbindung 8 wurde aus der Substanzbibliothek des Arbeitskreises entnommen und
spektroskopisch charakterisiert. 1H NMR (DMSO-d6) δ 1.67-1.77 (m, 4H, 8-H, 9-H),
1.88-1.91 (m, 2H, 3-H), 2.55-2.57, 2.73-2.76 (jeweils m, zusammen 4H, 7-H, 10-H),
3.27-3.25, 3.84 (m, t, J = 5.8 Hz, zusammen 4H, 2-H, 4-H), 7.71 (s, 1H, 12-H). 13C
NMR (DMSO-d6) δ 19.85 (C-3), 22.11, 22.90 (C-8, C-9), 24.33, 25.42 (C-7, C-10)
38.64, 38.82 (C-2, C-4), 112.23 (C-6a), 123.83, 130.21 (C-6b, C-10a), 150.02,
157.67 (C-11a, C-12a), 165.10 (C-6). C13H15N3OS (261.35).
73
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
8-Benzyl-2,3,6,7,8,9-hexahydro-imidazo[1,2-a]pyrido[4',3':4,5]thieno[2,3-d]pyrimidin-
5(11H)-on (9).
SNH
ON
N
N
1
1'
Zu einer Lösung von Verbindung 3b (1.26 g, 3 mmol) in 2-Methoxyethanol (12 mL)
wurde Ethylendiamin (11.54 g, 12.8 mL, 192 mmol) zugegeben. Das Rohprodukt
wurde aus 2-Methoxyethanol umkristallisiert, und man erhielt Verbindung 9 (0.38 g,
38 %). Schmb. 222-225 °C. 1H NMR (DMSO-d6) δ 2.70 (t, J = 5.7 Hz, 2H, 7-H), 2.82
(t, J = 5.7 Hz, 2H, 6-H), 3.45 (s, 2H, 9-H), 3.62, 4.00 (jeweils t, J = 8.8 Hz, zusammen
4H, 2-H, 3-H), 3.65 (s, 2H, C6H5-CH2), 7.23-7.34 (m, 5H, C6H5), 7.80 (s, 1H, 11-H). 13C NMR (DMSO-d6) δ 25.74 (C-6), 40.08, 42.10 (C-2, C-3), 49.35 (C-7), 51.00 (C-9),
61.11 (C6H5-CH2), 113.60 (C-5a), 122.85, 128.54 (C-5b, C-9a), 127.15 (C-4’),
128.37, 128.89 (C-2’, C-3’), 138.38 (C-1’), 156.02, 156.93 (C-10a, C-11a), 166.50 (C-
5). C18H18N4OS (338.43). Elementaranalyse: ber. C 63.88, H 5.36, N 16.55, S 9.47;
gef. C 64.20, H 5.89, N 16.43.
74
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
9-Benzyl-2,3,4,7,8,9,10,12-octahydro-6H-pyrido[4',3':4,5]thieno[2,3-d]pyrimido[1,2-
a]pyrimidin-6-on (10).
SNH
ON
N
N
1
1'
Zu einer Lösung von Verbindung 3b (1.26 g, 3 mmol) in 2-Methoxyethanol (12 mL)
wurde 1,3-Diaminopropan (14.23 g, 16 mL, 192 mmol) gegeben. Das Rohprodukt
wurde aus 2-Methoxyethanol umkristallisiert, und man erhielt Verbindung 10 (125
mg, 11 %). Schmb.: 202- 207 °C, Kristallumwandlung bei 193-197 °C. 1H NMR
(DMSO-d6) δ 1.88-1.93 (m, 2H, 3-H), 2.70 (t, J = 5.7 Hz, 2H, 8-H), 2.79-2.81 (m, 2H,
7-H), 3.44 (s, 2H, 10-H), 3.65 (s, 2H, C6H5CH2), 3.84 (t, J = 5.8 Hz, 2H, 2-H or 4-H),
7.30-7.33 (m, 5H, C6H5), 7.76 (s, 1H, 12-H). Ein Signal (2H, 2-H or 4-H) wird durch
das Wasser-Signal verdeckt (3.20-3.40). 1H NMR (CDCl3) δ 2.02-2.07 (m, 2H, 3-H),
2.83 (t, J = 5.8 Hz, 2H, 8-H), 3.03 (t, J = 5.8 Hz, 2H, 7-H), 3.44-3.48, 4.01 (m, t, J =
5.8 Hz, total 4H, 2-H, 4-H), 3.55 (s, 2H, 10-H), 3.72 (s, 2H, C6H5CH2), 6.42 (s, 1H,
12-H), 7.27-7.37 (m, 5H, C6H5). 13C NMR (DMSO-d6) δ 19.79 (C-3), 25.80 (C-7),
38.63, 38.84 (C-2, C-4), 49.39, 51.06 (C-8, C-10), 61.13 (C6H5-CH2), 111.76 (C-6a),
121.47, 128.64 (C-6b, C-10a), 127.15 (C-4’), 128.37, 128.90 (C-2’, C-3’), 138.42 (C-
1’), 150.91, 157.68 (C-11a, C-12a), 165.77 (C-6). C19H20N4OS (352.46).
Elementaranalyse ber. für C19H20N4OS × H2O: C 61.60, H 5.99, N 15.12; gef. C
61.99, H 5.66, N 15.03.
75
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
2,3,8,9,10,11-Hexahydro-benzothieno[3,2-e]imidazo[1,2-c]pyrimidin (11).
Allgemeine Vorschrift zur Herstellung von angular anellierten Verbindungen 11-14.
SN
NN
1
Phosphoroxidchlorid (3 mL) wurde zu Verbindung 6a (n=2) (0.50 g, 2 mmol) getropft.
Die Mischung wurde unter Rückfluss am Ölbad 1 h zum Sieden erhitzt. Nach dem
Abkühlen wurde Eiswasser (50 mL) und Ethanol (20 mL) zugesetzt. Die Mischung
wurde noch einmal kurz erhitzt und filtriert. Zu dem Filtrat wurde unter Eiskühlung 1M
NaOH zugegeben, bis ein pH von 9 eingestellt war. Der Niederschlag wurde
abgesaugt und mit Wasser (100 mL) gewaschen. Verbindung 11 wurde gewonnen
(310 mg, 67 %). Lit. Schmb. 132-133 °C [61]. 1H NMR (DMSO-d6) δ 1.67-1.80 (m,
4H, 9-H, 10-H), 2.65-2.69, 2.74-2.78 (jeweils m, zusammen 4H, 8-H, 11-H), 3.83 (t, J
= 9.9 Hz, 2H, 2-H), 4.00 (t, J = 9.9 Hz, 2H, 3-H), 7.90 (s, 1H, 5-H). 13C NMR (DMSO-
d6) δ 22.01, 22.70 (C-9, C-10), 24.49, 25.44 (C-8, C-11), 45.27 (C-3), 53.17 (C-2),
117.22 (C-11b), 130.47, 131.36 (C-7a, C-11a), 144.20 (C-5), 150.70, 157.56 (C-6a,
C-11c). C12H13N3S (231.32).
76
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
3,4,9,10,11,12-Hexahydro-2H-benzothieno[3,2-e]pyrimido[1,2-c]pyrimidin (12).
SN
NN1
Phosphoroxidchlorid (1.5 mL) wurde zu Verbindung 6a (n=3) (0.26 g, 1 mmol)
getropft. Die Mischung wurde unter Rückfluss am Ölbad 1 h zum Sieden erhitzt.
Nach dem Abkühlen wurde Eiswasser (25 mL) und Ethanol (10 mL) zugesetzt. Die
Mischung wurde noch einmal kurz erhitzt und filtriert. Zu dem Filtrat wurde unter
Eiskühlung 1M NaOH zugegeben, bis ein pH von 9 eingestellt war. Der Niederschlag
wurde abgesaugt und mit Wasser (100 mL) gewaschen. Das Rohprodukt wurde mit
verd. HCl gelöst und mit NaOH umgefällt. Verbindung 12 wurde gewonnen (115 mg,
47 %). Schmb. 139-144 °C. Lit. Schmb. >280 °C [62]. 1H NMR (DMSO-d6) δ 1.67-
1.77 (m, 4H, 10-H, 11-H), 1.86-1.92 (m, 2H, 3-H), 2.67-2.72, 2.84-2.88 (jeweils m,
zusammen 4H, 9-H, 12-H), 3.43 (t, J = 5.7 Hz, 2H, 2-H), 3.95 (t, J = 5.4 Hz, 2H, 4-H),
7.73 (s, 1H, 6-H); 1H NMR (CDCl3) δ 1.69-1.78 (m, 4H, 10-H, 11-H), 1.89-1.94 (m,
2H, 3-H), 2.64-2.67, 2.87-2.90 (jeweils m, zusammen 4H, 9-H, 12-H), 3.51 (t, J = 5.7
Hz, 2H, 2-H), 3.77 (t, J = 5.8 Hz, 2H, 4-H), 7.16 (s, 1H, 6-H); 13C NMR (DMSO-d6) δ
19.59 (C-3), 22.08, 22.40 (C-10, C-11), 24.87, 26.60 (C-9, C-12), 43.04 (C-2), 46.47
(C-4), 120.05 (C-12b), 130.84, 132.27 (C-8a, C-12a), 144.70, 155.87 (C-7a, C-12c),
146.81 (C-6). C13H15N3S (245.35).
77
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
9-Benzyl-2,3,8,9,10,11-hexahydro-imidazo[1,2-c]pyrido[4',3':4,5]thieno[3,2-
e]pyrimidin (13).
SN
NN
N
1
1`
Phosphoroxidchlorid (2 mL) wurde zu Verbindung 6b (n=2) (0.26 g, 0.76 mmol)
getropft. Die Mischung wurde unter Rückfluss am Ölbad 1 h zum Sieden erhitzt.
Nach dem Abkühlen wurde Eiswasser (25 mL) und Ethanol (10 mL) zugesetzt. Die
Mischung wurde noch einmal kurz erhitzt und filtriert. Zu dem Filtrat wurde unter
Eiskühlung 1M NaOH zugegeben, bis ein pH von 9 eingestellt war. Der Niederschlag
wurde abgesaugt und mit Wasser (100 mL) gewaschen. Das Rohprodukt wurde aus
Toluol umkristallisiert, und man erhielt Verbindung 13 (129 mg, 53 %). Schmb. 68-78
°C. Lit. Schmb. 78-79 °C [61]. 1H NMR (DMSO-d6) δ 2.72 (t, J = 5.8 Hz, 2H, 10-H),
2.82 (t, J = 5.8 Hz, 2H, 11-H), 3.55 (s, 2H, 8-H), 3.67 (s, 2H, C6H5-CH2), 3.85 (t, J =
10.0 Hz, 2H, 2-H), 4.00 (t, J = 10.0 Hz, 2H, 3-H), 7.23-7.35 (m, 5H, C6H5), 7.92 (s,
1H, 5-H); 13C NMR (DMSO-d6) δ 25.67 (C-11), 45.33 (C-3), 49.23 (C-10), 51.06 (C-
8), 53.18 (C-2), 60.9 (C6H5-CH2), 116.79 (C-11b), 127.19 (C-4’), 128.39, 128.91 (C-
2’, C-3’), 128.85, 129.14 (C-7a, C-11a), 138.29 (C-1’), 144.46 (C-5), 150.57, 158.20
(C-6a, C-11c). C18H18N4S (322.44).
78
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
10-Benzyl-3,4,9,10,11,12-hexahydro-2H-pyrido[4',3':4,5]thieno[3,2-e]pyrimido[1,2-
c]pyrimidin (14).
SN
NN
N
1
1`
Verbindung 14 wurde aus der Substanzbibliothek des Arbeitskreises entnommen und
spektroskopisch charakterisiert. Schmb. 150-151°C [61]; 1H NMR (DMSO-d6) δ 1.80-
1.85 (m, 2H, 3-H), 2.68 (t, J = 5.8 Hz, 2H, 11-H), 2.89 (t, J = 5.8 Hz, 2H, 12-H), 3.39
(t, J = 5.5 Hz, 2H, 2-H), 3.52 (s, 2H, 9-H), 3.65 (s, 2H, C6H5-CH2), 3.86 (t, J = 5.7 Hz,
2H, 4-H), 7.13-7.33 (m, 5H, C6H5), 7.55 (s, 1H, 6-H);13C NMR (DMSO-d6) δ 20.13 (C-
3), 27.11 (C-12), 43.79 (C-2), 46.07 (C-4), 49.51 (C-11), 51.30 (C-9), 60.96 (C6H5-
CH2), 120.98 (C-12b), 127.14 (C-4’), 128.37, 128.84 (C-2’, C-3’), 128.62, 129.86 (C-
8a, C-12a), 138.34 (C-1’), 143.44, 154.77 (C-7a, C-12c), 147.37 (C-6). C19H20N4S
(336.46).
79
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
2.3.4 Abbildung der NMR Spektren 6-Benzyl-4,5,6,7-tetrahydro-2-[3-(phenyl)thioureido]thieno[2,3-c]pyridin-3-carbonsäureethylester (2b in DMSO-d6, 25 °C).
0.93
03
0.84
79
10.2
31
1.98
48
1.93
631.
9454
2.01
921.
9567
3.00
00
Inte
gral
11.7
948
10.9
993
7.47
30
7.20
95
4.22
734.
2128
4.19
894.
1850
3.63
543.
4690
2.76
042.
6564
1.26
201.
2482
1.23
37
(ppm)1.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.0
1.98
48
4.22
734.
2128
4.19
894.
1850
(ppm)4.20
1.93
63
1.94
54
3.63
54
3.46
90
(ppm)3.6
2.01
92
1.95
67
2.76
04
2.65
64
(ppm)2.7
3.00
001.
2620
1.24
82
1.23
37
(ppm)
175.
7198
165.
5669
150.
1185
138.
4609
129.
0416
128.
8473
128.
7700
128.
3536
127.
1205
125.
8853
124.
4340
123.
8452
111.
3866
60.9
792
60.5
152
50.7
232
49.5
753
26.5
019
14.1
206
(ppm)0102030405060708090100110120130140150160170180
129.
0416
128.
8473
128.
7700
128.
3536
127.
1205
125.
8853
124.
4340
123.
8452
(ppm)124126128130
80
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
5,6,7,8-Tetrahydro-2-(methylthio)-3-phenyl-benzothieno[2,3-d]pyrimidin-4(3H)-on (3a in DMSO-d6, 25 °C).
3.00
24
1.97
05
2.00
522.
0000
2.88
44
4.04
45
Inte
gral
7.56
517.
5253
7.38
417.
3652
2.80
772.
7957
2.73
082.
7188
2.41
62
1.81
301.
7254
(ppm)1.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
2.00
52
2.00
00
2.80
772.
7957
2.73
082.
7188
(ppm)2.70
2.88
442.
4162
(ppm)2.40
4.04
45
1.81
30
1.72
54
(ppm)1.80
3.00
24
1.97
05
7.56
51
7.52
53
7.38
417.
3652
(ppm)7.47.5
161.
7405
158.
4672
157.
5552
136.
0144
131.
0063
130.
9132
129.
8802
129.
5868
129.
4381
118.
4942
25.3
004
24.5
490
22.6
219
21.8
923
15.2
804
(ppm)102030405060708090100110120130140150160
131.
0063
130.
9132
129.
8802
129.
5868
129.
4381
(ppm)129.0130.0131.0
81
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
7-Benzyl-5,6,7,8-tetrahydro-2-(methylthio)-3-phenyl-pyrido[4',3':4,5]thieno[2,3-d]pyrimidin-4(3H)-on (3b in DMSO-d6, 25 °C).
0.93
03
0.84
79
10.2
31
1.98
48
1.93
631.
9454
2.01
921.
9567
3.00
00
Inte
gral
11.7
948
10.9
993
7.47
30
7.20
95
4.22
734.
2128
4.19
894.
1850
3.63
543.
4690
2.76
042.
6564
1.26
201.
2482
1.23
37
(ppm)1.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.0
1.98
48
4.22
734.
2128
4.19
894.
1850
(ppm)4.20
1.93
63
1.94
54
3.63
54
3.46
90
(ppm)3.6
2.01
92
1.95
67
2.76
04
2.65
64
(ppm)2.7
3.00
001.
2620
1.24
82
1.23
37(ppm)
162.
1766
158.
8994
157.
5235
138.
2368
135.
9291
129.
9496
129.
6204
129.
4380
128.
9583
128.
6272
128.
4249
127.
2314
118.
1690
60.8
740
50.9
987
49.1
252
25.5
660
15.3
259
(ppm)102030405060708090100110120130140150160
129.
9496
129.
6204
129.
4380
(ppm)129.6130.0
129.
9496
129.
6204
129.
4380
128.
9583
128.
6272
128.
4249
127.
2314
(ppm)128.0129.0
82
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
5,6,7,8-Tetrahydro-benzothieno[2,3-d]pyrimidin-4(3H)-on (4a in DMSO-d6, 25 °C).
0.93
53
0.93
28
1.99
371.
9955
4.00
00
12.2
276
7.96
63
2.86
792.
8553
2.84
332.
7317
2.71
982.
7072
1.81
201.
7131
(ppm)2.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.0
0.93
28
Inte
gral
7.96
63
(ppm)7.98.0
1.99
37
1.99
55
2.86
792.
8553
2.84
33
2.73
172.
7198
2.70
72
(ppm)2.7
4.00
00
Inte
gral
1.81
20
1.71
31
(ppm)1.71.8
162.
5528
157.
7985
144.
9592
132.
2369
130.
9562
122.
8355
25.4
624
24.5
643
22.5
896
21.8
937
(ppm)2030405060708090100110120130140150160
83
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
4-Chlor-5,6,7,8-tetrahydro-benzothieno[2,3-d]pyrimidin (5a in DMSO-d6, 25 °C).
0.76
07
2.00
001.
9981
4.02
00
Inte
gral
8.77
91
3.00
632.
9811
2.88
082.
8644
1.86
151.
8180
(ppm)1.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.0
2.00
00
1.99
81
3.00
632.
9811
2.88
082.
8644
(ppm)2.93.0
4.02
00
1.86
15
1.81
80
(ppm)
168.
1840
152.
4144
151.
9168
139.
7794
128.
0920
126.
7696
25.9
389
25.5
483
22.0
094
21.7
556
(ppm)2030405060708090100110120130140150160170
84
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
4-[(2-Hydroxyethyl)amino]-5,6,7,8-tetrahydro-benzothieno[2,3-d]pyrimidin (6a, n=2 in DMSO-d6, 25 °C).
0.81
16
0.92
14
0.95
22
4.04
85
1.95
69
2.00
00
4.01
81
Inte
gral
8.23
20
6.41
65
4.78
894.
7776
4.76
69
3.59
383.
5320
2.93
062.
9218
2.91
042.
7579
2.74
662.
7384
1.84
581.
8414
1.78
211.
7777
(ppm)1.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.5
0.92
14
Inte
gral
6.41
65
(ppm)6.4
0.95
22
4.78
894.
7776
4.76
69
(ppm)4.8
4.04
85
3.59
38
3.53
20
(ppm)
1.95
692.
9306
2.92
182.
9104
(ppm)2.90
2.00
002.
7579
2.74
662.
7384
(ppm)2.75
4.01
81
1.84
14
1.78
211.
7777
(ppm)1.8
164.
5737
157.
0894
152.
8327
131.
4604
126.
6347
115.
6433
59.4
605
42.9
951
25.6
890
25.0
090
22.2
473
22.0
926
(ppm)2030405060708090100110120130140150160
85
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
4-[(3-Hydroxypropyl)amino]-5,6,7,8-tetrahydro-benzothieno[2,3-d]pyrimidin (6a, n=3 in DMSO-d6, 25 °C).
0.81
06
0.92
36
0.98
72
4.06
52
1.99
472.
0000
3.95
931.
9224
Inte
gral
8.22
88
6.67
696.
6662
6.65
61
4.67
994.
6704
4.66
03
3.56
353.
5112
2.91
112.
8922
2.75
102.
7321
1.83
061.
7752
1.77
081.
7575
1.74
491.
7329
1.71
97
(ppm)1.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.5
0.92
366.
6662
6.65
61
(ppm)
0.98
72
4.67
994.
6704
4.66
03
(ppm)4.7
4.06
523.
5635
3.51
12
(ppm)3.5
1.99
472.
9111
2.89
22
(ppm)2.90
2.00
002.
7510
2.73
21
(ppm)
3.95
93
1.92
24
1.83
06
1.77
521.
7708
1.75
751.
7449
1.73
291.
7197
(ppm)1.80
164.
4587
156.
9169
152.
8922
131.
2621
126.
6467
115.
5481
59.5
379
38.8
059
31.5
972
25.6
732
25.0
031
22.2
413
22.1
244
(ppm)2030405060708090100110120130140150160170
38.8
059
(ppm)38.039.040.0
86
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
7-Benzyl-4-[(2-hydroxyethyl)amino]-5,6,7,8-tetrahydro-pyrido[4’3’:4,5]thieno[2,3-d]pyrimidin (6b, n=2 in DMSO-d6, 25 °C).
0.84
65
5.14
66
0.94
05
0.97
52
1.96
951.
9770
4.09
96
2.04
49
2.00
00
Inte
gral
8.25
41
7.37
287.
2486
6.43
99
4.78
584.
7751
4.76
50
3.70
853.
6467
3.58
373.
5377
3.02
083.
0094
2.99
812.
8153
2.80
392.
7926
(ppm)2.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.5
1.96
95
1.97
70
4.09
96
3.70
85
3.64
67
3.58
37
3.53
77
(ppm)3.603.70
2.04
49
2.00
00
3.02
083.
0094
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81
2.81
532.
8039
2.79
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(ppm)2.802.903.00
0.97
524.
7858
4.77
514.
7650
(ppm)4.8
164.
9542
157.
1587
153.
0825
138.
3340
129.
1149
128.
8810
128.
4329
127.
2473
125.
3559
115.
1753
60.5
410
59.4
605
51.5
103
48.9
071
43.0
426
25.8
079
(ppm)102030405060708090100110120130140150160170
87
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
2,3,6,7,8,9-Hexahydro-benzothieno[2,3-d]imidazo[1,2-a]pyrimidin-5(11H)-on (7 in DMSO-d6, 25 °C).
0.78
68
2.00
00
1.99
36
1.98
47
2.27
39
4.21
85
Inte
gral
7.72
58
4.02
934.
0130
3.99
473.
6297
3.61
203.
5950
2.76
612.
7541
2.74
212.
5972
2.58
522.
5732
1.77
771.
6781
(ppm)1.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.5
2.00
00
Inte
gral
4.02
934.
0130
3.99
47
(ppm)4.0
1.99
363.
6297
3.61
203.
5950
(ppm)3.60
1.98
47
2.27
39
2.76
612.
7541
2.74
21
2.59
722.
5852
2.57
32
(ppm)2.62.7
166.
0248
157.
0021
155.
8779
130.
1379
125.
1557
114.
0016
42.1
207
25.3
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24.3
269
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638
22.0
569
(ppm)2030405060708090100110120130140150160170
88
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
2,3,4,7,8,9,10,12-Octahydro-6H-benzothieno[2,3-d]pyrimido[1,2-a]pyrimidin-6-on (8 in DMSO-d6, 25 °C).
0.91
28
1.98
54
2.17
51
1.97
761.
9146
2.07
164.
0000
Inte
gral
7.71
51
3.84
843.
8365
3.82
51
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233.
2616
3.24
962.
7573
2.74
472.
7333
2.57
512.
5631
2.55
11
1.92
581.
9138
1.90
251.
8912
1.87
921.
7613
1.68
50
(ppm)0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.0
1.98
54
3.84
843.
8365
3.82
51
(ppm)3.80
2.17
51
3.27
233.
2616
3.24
96
(ppm)
1.97
76
2.75
732.
7447
2.73
33
(ppm)
1.91
46
2.57
512.
5631
2.55
11
(ppm)2.6
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16
1.91
381.
9025
1.89
121.
8792
(ppm)1.9
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001.
7613
1.68
50
(ppm)1.7
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150.
7213
130.
2133
123.
8353
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2332
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277
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433
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293
24.3
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055
22.1
125
19.8
523
(ppm)2030405060708090100110120130140150160170
38.8
277
38.6
433
(ppm)3839
89
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
8-Benzyl-2,3,6,7,8,9-hexahydro-imidazo[1,2-a]pyrido[4',3':4,5]thieno[2,3-d]pyrimidin-5(11H)-on (9 in DMSO-d6, 25 °C).
0.60
44
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2.00
00
4.07
01
2.01
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2.00
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Inte
gral
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054.
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(ppm)4.0
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3.63
733.
6190
3.60
26
(ppm)3.6
2.01
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Inte
gral
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19
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03
2.82
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2.69
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(ppm)2.72.8
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156.
9327
156.
0247
138.
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8929
128.
5479
128.
3734
127.
1541
122.
8559
113.
6051
61.1
179
51.0
107
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611
42.1
068
25.7
524
(ppm)2030405060708090100110120130140150160170
90
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
9-Benzyl-2,3,4,7,8,9,10,12-octahydro-6H-pyrido[4',3':4,5]thieno[2,3-d]pyrimido[1,2-a]pyrimidin-6-on (10 in DMSO-d6, 25 °C)
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97
5.09
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1.83
29
2.00
94
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242.
0000
2.23
240.
7481
Inte
gral
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2.80
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(ppm)1.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.5
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(ppm)
2.00
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(ppm)
2.13
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2.00
00
2.80
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7951
2.71
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(ppm)2.72.8
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128.
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128.
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1482
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7573
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9008
128.
6470
128.
3695
127.
1482
(ppm)127128129130
91
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
9-Benzyl-2,3,4,7,8,9,10,12-octahydro-6H-pyrido[4',3':4,5]thieno[2,3-d]pyrimido[1,2-a]pyrimidin-6-on (10 in CDCl3, 25 °C)
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00
2.18
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2.07
06
2.26
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Inte
gral
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3.71
943.
7087
3.55
363.
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3.44
84
3.04
113.
0292
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292.
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4.00
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9955
(ppm)4.00
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7087
(ppm)3.70
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(ppm)
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Inte
gral
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3.02
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127.
3341
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38.8
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20.3
811
(ppm)2030405060708090100110120130140150160
129.
3365
129.
2295
128.
3809
127.
3341
(ppm)127128129130
92
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
2,3,8,9,10,11-Hexahydro-benzothieno[3,2-e]imidazo[1,2-c]pyrimidin (11 in DMSO-d6, 25 °C).
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94
2.01
832.
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2.00
242.
0000
4.05
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Inte
gral
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113.
9903
3.97
013.
8667
3.84
653.
8257
2.77
742.
7611
2.74
592.
6867
2.67
472.
6589
1.79
161.
6882
(ppm)1.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.0
2.01
834.
0111
3.99
033.
9701
(ppm)4.00
2.01
113.
8667
3.84
653.
8257
(ppm)
2.00
242.
7774
2.76
112.
7459
(ppm)
2.00
002.
6867
2.67
472.
6589
(ppm)2.70
4.05
87
1.79
16
1.68
82
(ppm)1.80
157.
5632
150.
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144.
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131.
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130.
4731
117.
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45.2
791
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22.7
053
22.0
153
(ppm)2030405060708090100110120130140150
93
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
3,4,9,10,11,12-Hexahydro-2H-benzothieno[3,2-e]pyrimido[1,2-c]pyrimidin (12 in DMSO-d6, 25 °C).
0.85
97
1.91
74
1.97
35
2.01
44
2.00
00
2.04
18
4.08
42
Inte
gral
7.73
34
3.96
383.
9531
3.94
24
3.44
313.
4318
3.42
04
2.87
202.
8594
2.84
802.
7081
2.69
682.
6848
1.91
381.
8685
1.76
951.
6781
(ppm)1.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.0
1.91
74
3.96
383.
9531
3.94
24
(ppm)
1.97
353.
4431
3.43
183.
4204
(ppm)
2.01
44
2.87
202.
8594
2.84
80
(ppm)
2.00
002.
7081
2.69
682.
6848
(ppm)2.70
2.04
181.
9138
1.86
85
(ppm)1.9
4.08
42
1.76
95
1.67
81
(ppm)1.7
155.
8760
146.
8116
144.
7081
132.
2733
130.
8418
46.4
706
43.0
486
26.6
010
24.8
702
22.4
039
22.0
807
19.5
965
(ppm)2030405060708090100110120130140150
155.
8760
146.
8116
144.
7081
132.
2733
130.
8418
(ppm)130135140145150155
94
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
9-Benzyl-2,3,8,9,10,11-hexahydro-imidazo[1,2-c]pyrido[4',3':4,5]thieno[3,2-e]pyrimidin (13 in DMSO-d6, 25 °C).
0.92
23
5.01
80
1.99
63
2.00
00
1.97
831.
9632
1.96
461.
9508
Inte
gral
7.91
55
7.34
577.
2385
4.02
124.
0010
3.98
143.
8718
3.85
103.
8308
3.66
883.
5471
2.83
232.
8203
2.80
902.
7308
2.72
012.
7081
(ppm)2.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.5
1.99
63
2.00
00
4.02
124.
0010
3.98
14
3.87
183.
8510
3.83
08
(ppm)3.9
1.97
83
1.96
32
3.66
88
3.54
71
(ppm)3.60
1.96
46
1.95
08
2.83
232.
8203
2.80
90
2.73
082.
7201
2.70
81
(ppm)2.70
158.
1758
150.
5706
144.
4701
138.
2884
129.
1288
128.
9127
128.
8592
128.
3953
127.
1958
116.
7991
60.9
177
53.2
133
51.0
583
49.2
343
45.3
286
25.6
692
(ppm)30405060708090100110120130140150160
95
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen
96
10-Benzyl-3,4,9,10,11,12-hexahydro-2H-pyrido[4',3':4,5]thieno[3,2-e]pyrimido[1,2-c]pyrimidin (14 in DMSO-d6, 25 °C).
1.00
79
5.08
82
1.99
33
1.97
261.
9607
1.98
68
1.98
29
1.95
37
2.00
00
Inte
gral
7.53
86
7.33
947.
2348
3.86
993.
8585
3.84
723.
6473
3.52
193.
4015
3.39
083.
3794
2.90
602.
8941
2.88
27
2.68
672.
6753
2.66
40
1.84
951.
8382
1.82
691.
8149
1.80
35
(ppm)1.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.0
1.99
333.
8699
3.85
853.
8472
(ppm)
1.97
263.
6473
(ppm)
1.96
073.
5219
(ppm)
1.98
683.
4015
3.39
083.
3794
(ppm)3.40
1.98
292.
8941
2.88
27(ppm)2.9
1.95
372.
6753
2.66
40
(ppm)
2.00
00
1.84
951.
8382
1.82
691.
8149
1.80
35
(ppm)1.80
154.
7757
147.
3747
143.
4491
138.
3479
129.
8585
128.
8434
128.
6154
128.
3656
127.
1443
120.
9824
60.9
614
51.3
081
49.5
139
46.0
780
43.7
941
40.2
908
40.2
016
40.1
263
40.0
331
39.9
598
39.8
666
39.7
952
39.7
000
39.5
335
39.3
670
39.2
004
27.1
165
20.1
318
(ppm)2030405060708090100110120130140150160
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
3. Cholinesterase-Hemmung durch heterobivalente Tacrinabkömmlinge
3.1 Inhibitoren mit einer 1,2,3,4-Tetrahydroacridin-Teilstruktur Tacrin, ein potenter Inhibitor von Acetylcholinesterase und Butyrylcholinesterase, war
das erste zugelassene Therapeutikum für die Behandlung von Morbus Alzheimer.
Tacrin erhöht die cholinerge Aktivität und gleicht damit den Verlust cholinerger
Neuronen in bestimmtem Umfang aus. Tacrin bindet an das aktive Zentrum beider
Cholinesterasen.
In den letzten Jahren wurden in vielen Arbeitsgruppen Homo- und Heterodimere des
Tacrins synthetisiert und untersucht. Tacrin war der erste AChE-Hemmstoff, der als
Teilstruktur von linkerverknüpften Dimeren konzipiert wurde. Die Dimere bestehen
aus zwei identischen oder unterschiedlichen Teilstrukturen bekannter AChE-
Inhibitoren, die mittels eines Linkers, z.B. einer Oligomethylenkette unterschiedlicher
Länge, verknüpft sind. Das Ziel beim Design derartiger Dimere ist es, die Interaktion
mit dem aktiven Zentrum und gleichzeitig mit der peripheren Bindungsstelle von
AChE zu gewährleisten. Meistens besitzen diese Dimere stärkere inhibitorische
Eigenschaften als die Teilstrukturen selbst [17]. In der Abbildung 3.1-1 sind die
Inhibitionswerte einer Reihe von Bis-Tacrinen aufgeführt.
N R
RNH
N
NH
R
R
2
1
(CH2)3
X
(CH2)3
3
4
I, X = CH2, R1 = R2 = R3 = R4 = H
IC50 = 0.07 nMa
Ki = 6 nMc
Ki = 0.06 nMd
Ki = 3.7 nMd
IC50 = 0.2 nMa,IC50 = 1.5 nMb, Ki = 1.3 nMb
II, X = CH2, R1 = R3 = H; R2 = R4 = ClIII, X = CH2, R1 = R2 = Cl, R3 = R4 = HIV, X = N-Me, R1 = R2 = R3 = R4 = HV, X = N-Me, R1 = R2 = Cl, R3 = R4 = H
Abb. 3.1-1 Inhibitionswerte für verschiedene Tacrin-Homodimere. aAChE aus Rattenhirn [81], bAChE aus fetalem Rinderserum [82], cAChE aus fetalem Rinderserum [83], dAChE aus fetalem Rinderserum [84].
97
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
98
Besondere Beachtung fand das Tacrin-Homodimer Bis(7)-Tacrin (I). Auch Dimere mit
einem Spacer von 8-10 Methyleneinheiten bzw. 5-6 Methyleneinheiten waren
bessere Hemmstoffe als Tacrin selbst (IC50 der Hemmung der AChE (Ratte): 223
nM; IC50 der Hemmung der BChE (Ratte): 92 nM) [82]. Als weitere positive
Eigenschaft besitzen diese Dimere eine höhere Selektivität für AChE gegenüber
BChE, in Vergleich mit Tacrin, dafür wurde die zusätzliche Bindung an der
peripheren Bindungsstelle verantwortlich gemacht. Bis-Tacrine, die über einen
Ethylen-, Trimethylen- und Tetramethylen-Spacer verfügen, und somit zu kurz waren,
um mit der peripheren Bindungsstelle zu interagieren, zeigten eine ähnliche oder
sogar niedrigere Hemmaktivität als Tacrin [85-86]. Ein starker Hemmstoff dieser
Serie war zunächst das Tacrin-Homodimer Bis(7)-Tacrin (I). Bei dieser Substanz
wurden zwei Tacrin-Einheiten mittels einer Heptamethylen-Kette verknüpft. Sie war
an AChE (Ratte) 149-mal stärker aktiv als Tacrin und war selektiv für AChE
gegenüber BChE (IC50 für BChE: 149 nM).
Die Bis(7)-6-Chloro-Tacrin-Verbindung II war potenter and selektiver für AChE als
Bis(7)-Tacrin (I) [81]. Die einfache Chlor-Substitution in Position 6 jeder
Struktureinheit des Dimers führte demnach zu leicht besseren Inhibitionswerten.
Savini et al. publizierten einen Ki-Wert für Tacrin an der AChE (Rind) von 40 nM,
während für das 6,8-Dichlortacrin ein Ki-Wert von 1 nM ermittelt wurde. Allerdings
führte die Dimerisierung von 6,8-Dichlortacrin mit Tacrin (III) nicht zu einer
Aktivitätssteigerung verglichen mit dem Homodimer I. Unter der Voraussetzung, dass
der stärkere Hemmstoff als Teilstruktur eines Dimers das aktive Zentrum besetzt, ist
dies ein überraschendes Ergebnis [83].
Um diesen Ansatz der dualen Bindung zu validieren, wurden Verbindungen
konzipiert, die einen protonierbaren Stickstoff mittig in der Kette besitzen. Diese
Struktur kann π-Kationen-Wechselwirkungen zu aromatischen Resten entlang der
Schlucht ausprägen. Die Verbindungen IV und V sind Vertreter dieser neuen Klasse
von Hemmstoffen. Das Homodimer IV war zwei bzw. drei Größenordnungen aktiver
als I bzw. Tacrin. IV zeigte eine 100-fache Selektivität für AChE gegenüber BChE.
Die Einführung der Dichlorsubstitution (in V) führte nicht zu der erwünschten
Aktivitäts- bzw. Selektivitäts-Steigerung verglichen mit I [84].
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
N
NH
(CH2)n
Y
Y = Ph VI, n = 7, IC50 = 210 nMa n = 8, IC50 = 20000 nMa
Y = NMe2
Y = 4-Aminopyridyl
Y = 4-Aminoquinolinyl
VIII, n = 7, IC50 = 52 nMb
IX, n = 7, IC50 = 12.8 nMb
X, n = 7, IC50 = 10.1 nMb
n = 8, IC50 = 47 nMb
n = 8, IC50 = 13.6 nMb
n = 8, IC50 = 8.8 nMb
Y = NH2 VII, n = 7, IC50 = 319 nMb n = 8, IC50 = 89.4 nMb
Abb. 3.1-2 Inhibitionswerte für verschiedene Tacrin-Heterodimere gegenüber AChE aus Rattenhirn, a [85], b [82].
Carlier et al. und Pang et al. [82,86-87] berichteten über die Hemmaktivität von den
Tacrin-Heterodimeren VI-X mit dualem Bindungsmodus (Abbildung 3.1-2). Bei den
Heterodimeren wird die Bindung der Tacrin-Einheit im aktiven Zentrum postuliert,
während die andere Teilstruktur mit der peripheren Bindungsstelle eine π-π oder π-
Kationen-Interaktion ausüben sollte. Wie im Fall der Homodimere konnte auch hier
bestätigt werden, dass die Spacerlänge einen direkten Einfluss auf die Hemmaktivität
besaß. Einen Alkylen-Gruppe mit 7-8 C-Atomen erwies sich als der ideale Linker für
die 4-Aminopyridyl- und 4-Aminoquinolinyl-Tacrin Dimere [82]. Für die 4-
Aminoquinolinyl-Tacrin Verbindung (X, n=8) konnte eine 25-fach höhere Aktivität als
bei Tacrin ermittelt werden. Es wurde außerdem gezeigt, dass mit zunehmender
Strukturverwandtschaft des peripheren Liganden mit Tacrin bessere Inhibitionswerte
erzielt wurden [82], wie beim Vergleich der Heptamethylenverbindungen, VII (319
nM) > VIII (52 nM) > IX (12.8 nM) > X (10.1 nM) > I (1.5 nM), und auch bei den
Octamethylenverbindungen; VII (89.4 nM) > VIII (47 nM) > IX (13.6 nM) > X (8.8 nM)
> I (1.5 nM), deutlich wird [82].
99
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
N
NH2
NH
O
CH3 NH2
CH3
O
NH
O
NHn-Bu
(CH2)10
NH
HN
XI XII XIIIIC50 = 114 nM IC50 = 8.8 nM IC50 = 500,000 nM
Abb. 3.1-3 Inhibitionswerte von (-)-Huperazin A (XI), dem Tacrin-Huperazin-Dimeren XII und XIII gegenüber AChE aus Rattenhirn [88].
(-)-Huperazin A (XI) ist ein potenter und selektiver Inhibitor der AChE, der zusätzlich
eine neuroprotective Wirkung aufweist. Carlier et al. synthetisierten das Hetero-Dimer
XII durch Verknüpfung von Tacrin mit einem Baustein, der eine vereinfachte
Huperazin-Struktur darstellt. Der Gruppe gelang es, durch diese Heterodimerisierung
zu einer 13-fach, 25-fach und mehr als 50000-fach höheren Hemmaktivität als bei
Huperazin A, Tacrin bzw. dem 5-Aminobutyl-substituierte Derivat XIII zu kommen.
Allerdings wurde bei XII die Aktivität des Homodimeren I gegenüber AChE nicht
erreicht [88].
CH3 R
CH3
NH
(CH2)5 NH
N XIV, R = CO2CH3, Ki = 6.4 nMXV, R = NH2, Ki = 15.7 nM
Abb. 3.1-4 Inhibitionswerte von den Verbindungen XIV und XV gegenüber hAChE [89].
Gemma et al. synthetisierten die Tacrin-Huperzin A-Hybride XIV und XV (Abbildung
3.1-4) mit dem Ziel einer dreifachen Interaktion, mit dem aktiven Zentrum, der
peripheren Bindungsstelle und zusätzlich mit den aromatischen Resten in der
Schlucht der AChE. Dieser komplexe Bindungsmodus konnte mittels Molecular
Modelling bestätigt werden [89].
100
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
N
NH
O
N
NH
XVIIC50 = 6.0 nMa
NH
OMe
OMe
O
NH
XVII
IC50 = 25 nMb Abb. 3.1-5 Inhibitionswerte für Tacrin-Donepezil-Dimere XVI und XVII, aAChE aus Rattenhirn [90], bAChE aus humanen Erythrozyten [91].
Die Verbindung XVI besitzt neben der Tacrin-Teilstruktur einen N-Benzyl-Piperidin-
Rest, wie auch Donepezil. Die Inhibitionsstudien ergaben eine 37-fache
Aktivitätssteigerung gegenüber Tacrin und eine Hemmwirkung in derselben
Größenordnung wie bei dem Homodimer I. Mit Molecular Modelling-Studien wurde
gezeigt, dass der Benzyl-Rest eine π-π−Interaktion mit dem Trp84 in der Nähe des
aktiven Zentrums ausübt und der protonierte Piperidin-Stickstoff mit Phe330 in der
Mitte der Schlucht durch eine Kationen-π Interaktion gebunden wird. Der Tacrin-Rest
tritt seinerseits mit dem Trp279 an der peripheren Bindungsstelle in π-π Wechsel-
wirkung, während die Amid-NH-Gruppe eine Wasserstoffbrücken-Bindung mit dem
Tyr121 eingeht [90].
Bei Neuropharma S.A. wurde das Heterodimer XVII synthetisiert, das die
Dimethoxyindanon-Teilstruktur von Donepezil mit einem dem Tacrin ähnlichen Rest
über eine Aminoheptylen-Kette verbindet. Der IC50 für BChE (0.6 nM) war niedriger
als für AChE, womit die Verbindung eine ähnliche Selektivität wie Donepezil besitzt.
Es wurden Propidium-Verdrängungsstudien durchgeführt, da das Propidium ein
selektiver Ligand für die periphere Bindungsstelle darstellt. Im Gegensatz zu
Donepezil schaffte es XVII nicht, Propidium aus der peripheren Bindung zu
verdrängen [91].
101
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
N
NHCl
Cl
(CH2)6
NH
O
NH
R
XVIII, R = H IC50 = 0.008 nMa
IC50 = 7.8 nMb
IC50 = 0.04 nMa
IC50 = 25 nMb XIX, R = OCH3
Abb. 3.1-6 Inhibitionswerte für Tacrin-Melatonin-Dimere XVIII und XIX, ahAChE und bhBChE [92].
Die Hybridisierung von Tacrin mit Melatonin, einem bekannten Radikalfänger, führte
zu den sehr potenten Inhibitoren XVIII und XIX, mit einer außerordentlichen
Selektivität für AChE gegenüber BChE. Rodríguez-Franco et al. ermittelten ein IC50-
Wert von 350 nM (hAChE) und 40 nM (hBChE) für Tacrin. Anhand eines
Fluoreszenzassays wurde die zusätzliche Wirkung von XVIII und XIX als
Antioxidantien gezeigt. Als Standard diente Trolox, ein Vitamin E-Analogon. Es
wurde anhand des PAMPA-BBB-Assays auch demonstriert, dass die Verbindungen
XVIII und XIX die Blut-Hirn-Schranke überwinden können. Als Vergleich dienten 20
zugelassene Arzneistoffe [92].
Bivalente Tacrinabkömmlinge wurden in unserem Arbeitskreis von Dr. Paul W.
Elsinghorst synthetisiert [93]. Die Tacrin-Einheit sollte das aktive Zentrum erreichen,
während eine elektronenreiche Trimethoxybenzen-Einheit mit der peripheren
Bindungsstelle interagieren sollte. In Docking-Studien mit Naturstoffen aus der
Arisugacin- und der Territrem-Familie, die elektronenreiche aromatische Einheiten
besitzen, wurde eine π-π Interaktion mit Trp279 der AChE aus Torpedo californica
gezeigt [94]. Dieser Ansatz konnte von Ucar et al. bestätigt werden, die Aromaten
unterschiedlicher Elektronendichte verglichen [95]. Die Linker unserer Verbindungen
beinhalten eine Carbonsäureamid- und eine Hydrazid-Funktion, die
Wasserstoffbrückenbindungen zur Mitte der Schlucht, z.B. mit Tyr121, eingehen
könnten.
102
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
3.2 Inhibitionsstudien mit Tacrin-Trimethoxybenzen-Heterodimeren Die Verbindungen 15a-15i und 16a-16f (Abbildung 3.2-1) wurden im Rahmen der
vorliegenden Arbeit an Acetylcholinesterase und Butyrylcholinesterase aus
verschiedenen Spezies (Electrophorus electricus, Torpedo californica und Homo
sapiens) untersucht.
MeO
MeOOMe
NH
ONH
NH
O
N
m
n
OMe
NH
O
m
MeO
NH
NMeO
S
N
ON
CH3
CH3
CH3
15b-i m = 0, n = 1-816b-f m = 2, n = 1-5
15a m = 016a m = 2
AS-1397
Abb. 3.2-1 Struktur der Tacrin-Trimethoxybenzen-Heterodimere und von AS-1397.
Die Geschwindigkeiten, v, des durch das Enzym katalysierten Acetylthiocholin- bzw.
Butyrylthiocholin-Umsatzes wurden gegenüber der Inhibitorkonzentration, [I],
aufgetragen und durch nichtlinearen Regression nach Gleichung 3.2-1 analysiert.
0
50
[I]1IC
vv =⎛ ⎞
+⎜ ⎟⎝ ⎠
(Gl. 3.2-1)
In die Tabelle 3.1-1 wurden die Ergebnisse der Hemmstudien eingetragen. Die
Abbildungen 3.2-2 bis 3.2-16 zeigen die Bestimmung der IC50-Werte für die
Substanzen 15a-15h, 16a-16-f und AS-1397.
103
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
104
Tab. 3.2-1 Hemmung der AChE durch heterodimere Tacrin-Derivate.
IC50a ± SEM (nM)
n EeAChE TcAChE b hAChE hBChE
Selektivität (IC50 hAChE/
IC50 hBChE)
15a - 2584 ± 58.2 21.1 ± 09 386 ± 24 1.70 ± 0.18 227
15b 1 114 ± 15 163 ± 13 51.6 ± 2.1 27.6 ± 1.0 1.87
15c 2 119 ± 1.9 49.5 ± 2.0 89.2 ± 6.2 12.8 ± 1.1 6.97
15d 3 63.0 ± 1.9 26.3 ± 2.0 241 ± 8 7.13 ± 0.46 33.8
15e 4 23.5 ± 1.0 18.1 ± 2.1 17.0 ± 1.4 1.68 ± 0.15 10.1
15f 5 26.2 ± 2.0 55.7 ± 4.3 18.2 ± 0.6 0.969 ± 0.098 18.8
15g 6 8.37 ± 0.49 25.2 ± 0.8 5.65 ± 0.31 0.523 ± 0.018 10.8
15h 7 3.25 ± 0.22 17.2 ± 0.3 5.24 ± 0.20 0.293 ± 0.014 17.9
15ib 8 2.73 ± 0.25 5.99 ± 0.44 5.08 ± 0.22 1.38 ± 0.04 3.68
16a - 262 ± 5.4 40.1 ± 2.1 365 ± 21 12.1 ± 0.3 30.2
16b 1 140 ± 11 40.1 ± 4.3 40.7 ± 3.5 24.0 ± 0.6 1.70
16c 2 70 ± 10 68.9 ± 4.4 135 ± 5 6.03 ± 0.33 22.4
16d 3 62.4 ± 5.0 158 ± 1 72.1 ± 1.6 0.226 ± 0.018 319
16e 4 55.7 ± 2.9 102 ± 4 59.00 ± 0.52 0.139 ± 0.011 424
16f 5 26.8 ± 2.1 39.8 ± 1.0 8.39 ± 0.14 0.141 ± 0.004 59.5
AS-1397 k.H.c 34700 ± 2600 k.H. 3370 ± 340b 12000d
a IC50-Werte sind durch Doppelbestimmung bei mindestens vier verschiedenen Konzentrationen entstanden. b Daten wurden von Paul W. Elsinghorst ermittelt. c k.H. = keine Hemmung bei 100 µM. d Literaturangabe [96].
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
[15a] (µM)0 2 4 6 8 10
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.2-2 Inhibition der EeAChE durch 15a. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [15a] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 2584 ± 58.2 nM.
[15b] (nM)0 40 80 120 160 200
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.2-3 Inhibition der EeAChE durch 15b. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [15b] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 114 ± 15 nM.
105
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
[15c] (nM)0 200 400 600 800 1000
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.2-4 Inhibition der EeAChE durch 15c. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [15c] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 119 ± 2 nM.
[15d] (nM)0 20 40 60 80 100
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.2-5 Inhibition der EeAChE durch 15d. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [15d] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 63.0 ± 1.9 nM.
106
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
[15e] (nM)0 10 20 30 40 50
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.2-6 Inhibition der EeAChE durch 15e. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [15e] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 23.5 ± 1.0 nM.
[15f] (nM)0 10 20 30 40 50
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.2-7 Inhibition der EeAChE durch 15f. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [15f] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 26.2 ± 2.0 nM.
107
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
[15g] (nM)0 2 4 6 8 10
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.2-8 Inhibition der EeAChE durch 15g. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [15g] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 8.37 ± 0.49 nM.
[15h] (nM)0 2 4 6 8 10
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.2-9 Inhibition der EeAChE durch 15h. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [15h] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 3.25 ± 0.22 nM.
108
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
[16a] (nM)0 200 400 600 800 1000
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.2-10 Inhibition der EeAChE durch 16a. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [16a] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 263 ± 5 nM.
[16b] (nM)0 50 100 150 200 250
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.2-11 Inhibition der EeAChE durch 16b. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [16b] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 140 ± 11 nM.
109
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
[16c] (nM)0 100 200 300 400 500
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.2-12 Inhibition der EeAChE durch 16c. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [16c] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 70 ± 10 nM.
[16d] (nM)0 40 80 120 160 200
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.2-13 Inhibition der EeAChE durch 16d. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [16d] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 62.4 ± 5 nM.
110
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
[16e] (nM)0 20 40 60 80 100
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.2-14 Inhibition der EeAChE durch 16e. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [16e] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 55.7 ± 3 nM.
[16f] (nM)0 20 40 60 80 100
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.2-15 Inhibition der EeAChE durch 16f. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [16f] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 26.8 ± 2 nM.
111
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
[AS1397] (µM)0 15 30 45 6
v (%
)
0
20
40
60
80
100
0
Abb. 3.2-16 Inhibition der TcAChE durch AS1397. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [AS1397] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 34.7 ± 3 µM.
Die heterodimeren Substanzen sollten beide Bindungsorte, das aktive Zentrum und
die periphere Bindungsstelle, besetzen. Somit könnte man gleichzeitig die
Acetylcholin-Hydrolyse und die Bildung von senilen Plaques verhindern. Weiterhin
wurden die Substanzen so konzipiert, dass π-π−Interaktionen zu der peripheren
Bindungsstelle und insbesondere zum aromatischen Rest von Trp279 möglich sein
sollten. Da diese Aminosäure bei Butyrylcholinesterase durch Alanin ersetzt ist [31],
wurde mit einer Selektivität der Tacrin-Trimethoxybenzen-Heterodimere für
Acetylcholinesterase gerechnet. Diese wurde jedoch nicht durch die Messungen
bestätigt.
Aus den kinetischen Daten geht hervor, dass die Verbindungen aus der
Trimethoxybenzamid-Reihe (15) stärkere Inhibitoren der Acetylcholinesterase aus
Electrophorus electricus waren, als die Verbindungen aus der Trimethoxyphenyl-
propionsäureamid-Reihe (16). Dies gilt sowohl für den Vergleich von Substanzen, die
den gleichen ω−Aminocarbonsäure-Baustein enthalten, z.B. 15e versus 16e, als
auch für Substanzen mit derselbe Spacerlänge, z.B. 15h versus 16f. Die besten
Inhibitoren, 15h und 15i, haben ein Spacer, bei dem 11 oder 12 Atome verknüpft
sind. Das traf auch für die andere Serie von Verbindungen zu, in der sich 16f mit
112
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
113
einer Gesamtspacerlänge von 11 Atomen als der beste Inhibitor erwies. In diesen
Serien von Heterodimeren erbrachte demnach eine Heptylen-analoge Linkerlänge
nicht den optimale Abstand der Bausteine. Die erwähnten, gegenüber hAChE
wirksamsten Verbindungen (15h, 15i, 16f) zeigten allerdings keine Selektivität für
hAChE gegenüber humaner Butyrylcholinesterase (s.u.).
Der Trend der Aktivitätssteigerung mit Verlängerung der Linkerstruktur bei
Acetylcholinesterase aus Electrophorus electricus und in weitem Umfang bei dem
humanen Enzym wurde bei Acetylcholinesterase aus Torpedo californica nicht
beobachtet. Wenn man die Reihenfolge der Aktivität der Derivate 15 auflistet, sind
die Resultate für die Acetylcholinesterae aus Electrophorus electricus (a, b, c, d, e, f, g, h, i) denen der humanen Acetylcholinesterase (a, d, c, b, f, e, g, h, i) ähnlicher als
die von Acetylcholinesterase aus Torpedo californica (b, f, c, d, g, a, e, h, i). Die
Substanz mit der am weitesten ausgedehnten Linkerstruktur, 15i, erwies sich als der
potenteste Hemmstoff gegenüber den drei Acetycholinesterasen.
Entgegen unserer Erwartung erreichten alle Substanzen der Serien 15 und 16
gegenüber humaner Butyrylcholinesterase IC50-Werte im niedrig nanomolaren oder
sogar picomolaren Bereich. Einige Vertreter zeigten eine z.T. deutliche Selektivität
für Butyrylcholinesterase, und 15a, 16d und 16e könnten als inhibitorische Hilfsstoffe
in selektiven Cholinesterase-Assays eingesetzt werden [78]. Um diese Daten mit
denen eines etablierten Hemmstoffes zu vergleichen, wurde das Ethopropazin-
Analogon AS-1397 [96] (Abbildung 3.2-1) in die Messungen einbezogen. Mit AS-1397 in einer Konzentration von 100 µM konnte keine Hemmung der humanen
Acetylcholinesterase erzielt werde, aber eine Butyrylcholinesterase-Hemmung im
niedrig-mikromolaren Bereich. Der Selektivitätswert für AS-1397 aus der Literatur
[96] ist 50-mal höher als im Falle unserer Verbindungen 15a, 16d und 16e. Trotzdem
kann eingeschätzt werden, dass die Selektivität der genannten Substanzen für
Butyrylcholinesterase bemerkenswert ist, auch unter der Berücksichtigung der
Literaturwerte für andere hochwirksame Cholinesterase-Inhibitoren [84,97].
Während für die Acetylcholinesterase-Hemmung die Trimethoxybenzamid-
Verbindungen (15) den Trimethoxyphenylpropionsäureamid-Derivaten (16)
überlegen waren, wurde ein entgegengesetzter Trend für Butyrylcholinesterase
aufgefunden. Hier hatten 16d-f IC50-Werte unter 250 pM.
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
3.3 Substratabhängigkeit der Hemmung von 15h und Tacrin Zur enzymkinetischen Charakterisierung der Verbindung 15h und Tacrin wurde der
Ellman-Assay bei vier verschiedenen Substratkonzentrationen durchgeführt und
mittels Lineweaver-Burk Plot ausgewertet, indem die reziproken Geschwindigkeiten
gegenüber den reziproken Substratkonzentrationen aufgetragen wurden. Im Fall der
kompetitiven Inhibition kreuzen sich die Geraden in einem Punkt auf der Ordinate
und bei den nicht-kompetitiven Inhibitoren in einem Punkt auf der Abszisse. Eine
Verschiebung dieses Schnittpunktes in den ersten bzw. vierten Quadranten zeigt
gemischte Hemmung mit zunehmend kompetitivem bzw. zunehmend
unkompetitivem Charakter an. Die Verbindung 15h und Tacrin sollten diesbezüglich
untersucht werden und aus den Replots der Lineweaver-Burk Auftragungen sollten
die Werte für α, und Ki ermittelt werden. Die Replots beinhalten die Auftragung der
Anstiege und der Ordinatenabschnitte (jeweils aus dem Lineweaver-Burk Plot)
gegenüber der Inhibitorkonzentration [72]. Nachfolgend werden für 15h die
Auftragungen zur Ermittlung der IC50-Werte bei verschiedenen Substrat-
konzentrationen (Abb. 3.3-1 – 3.3-4), der Lineweaver-Burk Plot und seine Replots
(Abb. 3.3-5 – 3.3-7) dargestellt, gefolgt von den analogen Abbildungen für Tacrin.
[15h] (nM)0 2 4 6 8 10
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.3-1 Inhibition der EeAChE durch 15h. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [15h] bei [S] = 250 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 3.41 ± 0.28 nM.
114
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
[15h] (nM)0 2 4 6 8 10
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.3-2 Inhibition der EeAChE durch 15h. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [15h] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 3.25 ± 0.22 nM.
[15h] (nM)0 2 4 6 8 10
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.3-3 Inhibition der EeAChE durch 15h. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [15h] bei [S] = 750 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 3.25 ± 0.24 nM.
115
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
[15h] (nM)0 2 4 6 8 10
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.3-4 Inhibition der EeAChE durch 15h. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [15h] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 3.47 ± 0.23 nM.
1/S (1/µM)-0.006 -0.004 -0.002 0 0.002 0.004 0.006
1 / v
(1/
%)
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
Abb. 3.3-5 Lineweaver-Burk Plot für die AChE Hemmung durch 15h. Aufgetragen wurde 1/v bei den Inhibitorkonzentrationen 2 nM (○), 4 nM (●), 6 nM (□), 8 nM (■) und 10 nM (△) gegenüber 1/S als Mittelwerte einer Doppelbestimmung bei vier unterschiedlichen Substratkonzentrationen (250, 500, 750 und 1000 µM).
116
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
[15h] (nM)-4 0 4 8
Ans
tiege
0
4
8
12
12
Abb. 3.3-6 Sekundärplot des Lineweaver-Burk Plots in Abbildung 3.3-5. Aufgetragen wurden die Anstiegswerten (●) des Lineaweaver-Burk Plots gegenüber der Inhibitorkonzentration, 1/[15h].
[15h](nM)-4 0 4 8
Abs
chni
tte
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
12
Abb. 3.3-7 Sekundärplot des Lineweaver-Burk Plots in Abbildung 3.3-5. Aufgetragen wurden die Abschnittswerten (●) des Lineaweaver-Burk Plots gegenüber der Inhibitorkonzentration, 1/[15h].
117
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
[Tacrin] (nM)0 20 40 60 80 100
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.3-8 Inhibition der EeAChE durch 16g. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [16g] bei [S] = 250 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 25.6 ± 1.00 nM.
[Tacrin] (nM)0 20 40 60 80 100
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.3-9 Inhibition der EeAChE durch 16g. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [16g] bei [S] = 500 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 26.6 ± 0.84 nM.
118
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
[Tacrin] (nM)0 20 40 60 80 100
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.3-10 Inhibition der EeAChE durch 16g. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [16g] bei [S] = 750 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 29.0 ± 1.29 nM.
[Tacrin] (nM)0 20 40 60 80 100
v (%
)
0
30
60
90
120
150
Abb. 3.3-11 Inhibition der EeAChE durch 16g. Auftragung der Geschwindigkeitswerte als Mittelwerte einer Doppelbestimmung versus [16g] bei [S] = 1000 µM in Prozent. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei [S] = 500 µM und [I] = 0 definiert. Nach Gleichung 3.2-1 ergab sich IC50 = 27.1 ± 1.57 nM.
119
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
1/S (1/µM)-0.006 -0.004 -0.002 0 0.002 0.004 0.006
1 / v
(1/%
)
0
0.02
0.04
0.06
0.08
Abb. 3.3-12 Lineweaver-Burk Plot für die AChE Hemmung durch Tacrin. Aufgetragen wurde 1/v bei den Inhibitorkonzentrationen 20 nM (○), 40 nM (●), 60 nM (□), 80 nM (■) und 100 nM (△) gegenüber 1/S als Mittelwerte einer Doppelbestimmung bei vier unterschiedlichen Substratkonzentrationen (250, 500, 750 und 1000 µM).
[Tacrin] (nM)-20 0 20 40 60 80 100
Ans
tiege
0
4
8
12
16
Abb. 3.3-13 Sekundärplot des Lineweaver-Burk Plots in Abbildung 3.3-12. Aufgetragen wurden die Abschnittswerten (●) des Lineaweaver-Burk Plots gegenüber der Inhibitorkonzentration, 1/[Tacrin].
120
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
[Tacrin] (nM)-40 -20 0 20 40 60 80 100
Abs
chni
tte
0
0.003
0.006
0.009
0.012
0.015
0.018
Abb. 3.3-14 Sekundärplot des Lineweaver-Burk Plots in Abbildung 3.3-12. Aufgetragen wurden die Abschnittswerten (●) des Lineaweaver-Burk Plots gegenüber der Inhibitorkonzentration, 1/[Tacrin].
Mittels der sekundären Plots der Lineweaver-Burk-Auftragung wurden die Werte für
Kiu, Kic bzw. α ermittelt.
Aus den Schnittpunkten der Geraden der Anstiege bzw. Abschnitte mit der Abszisse
von 15h gegenüber der Inhibitorkonzentration (Abbildung 3.3-6 und 3.3-7) wurde ein
Kic von 2.39 ± 0.47 nM bzw. Kiu von 2.06 ± 0.79 nM ermittelt. Der Quotient aus Kic
durch Kiu ergab einen Wert für α = 1.16. Aus der Auftragung der Anstiege bzw.
Abschnitte von Tacrin gegenüber der Inhibitorkonzentration (Abbildung 3.3-13 und
3.3-14) wurde ein Kic von 0.023 ± 0.003 nM bzw. Kiu von 0.041 ± 0.004 nM erhalten
und somit ein Wert für α = 0.56 berechnet.
Aus dem α-Wert geht hervor, dass Tacrin die AChE kompetitiv hemmt. Es konkurriert
mit dem Substrat um die Bindung am Enzym. Nochi et al. ermittelten einen α-Wert
von 1.88 für die Hemmung der EeAChE durch Tacrin [28]. Weiterhin wurde Tacrin in
dem Enzym-Inhibitor-Komplex mit EeAChE gegenüber dem Indolring von Trp84
gefunden [18]. Diese Aminosäure ist ein wichtiger Bestandteil der
Kationenbindungsstelle von Acetylcholinesterase, wo sie mit der quartären
Ammoniumstruktur von Acetylcholin interagiert. Somit nimmt Tacrin den Platz des
Substrates im aktiven Zentrum ein [8].
121
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
122
Verbindung 15h ist ein Inhibitor des gemischten Typs und demnach fähig, an das
Enzym zu binden, auch dann, wenn das Substrat schon gebunden ist. Somit lässt
sich vermuten, dass 15h mit der PAS des Enzym-Substrat-Komplexes interagieren
kann.
Die Verbindungen 15 und 16 bilden einen neuen Typ von Tacrin-Heterodimeren. Sie
hemmen die AChE und die BChE im niedrigen nanomolaren Bereich. Einige von
ihnen (16e, 16d) zeigen bemerkenswerte Selektivitätswerte von über 300 für BChE.
Weitere heterodimere Tacrin-Derivate mit gleicher Linker-Architektur und Gallamin-
abgeleiteten Einheiten wurden innerhalb unseres Arbeitskreises hergestellt und als
Cholinesterase-Inhibitoren und Liganden an M2-muskarinischen Rezeptoren
untersucht [98].
3.4 Experimenteller Teil
3.4.1 Spektrophotometrische Experimente
Die UV/Vis-Messungen und alle spektrophotometrischen Assays erfolgten an einem
Cary 50 Bio UV/Vis-Spektrophotometer bzw. an einem Cary 100 Bio UV/Vis-
Spektrophotometer der Firma Varian, beide mit einem temperierbaren Küvettenhalter
ausgestattet. Die Proben wurden dabei durch die Thermostaten UC-5B bzw. F12-MP
von Julabo temperiert.
Die enzymologischen Untersuchungen wurden mit humaner Acetylcholinesterase
(hAChE) (2790 U/mg), Acetylthiocholiniodid (ASCh), 5,5´-Dithio-bis(2-
nitrobenzoesäure) (DTNB) und Tacrin-hydrochlorid-Hemihydrat von Sigma-Aldrich
(Steinheim, Deutschland) durchgeführt. Acetylcholinesterase (EeAChE) aus dem
Zitteraal Electrophorus electricus (1276 U/mg und 1025 U/mg), Acetonitril (HPLC-
Qualität) sowie getrocknetes DMSO (über Molsieb gelagert) waren von Fluka
(Deisenhofen, Deutschland). Humane Butyrylcholinesterase (hBChE) (1162 U/mg)
wurde von Lee Biosolutions (St. Louis, USA) bezogen. Zur Auswertung der
kinetischen Daten wurde Grafit v.5.0 (R.J. Leatherbarrow, Erithacus Software,
Staines, Großbritanien, 2001) verwendet.
Tacrinabkömmlinge als Cholinesterase-Inhibitoren
123
3.4.2 Cholinesterase-Assays Die Enzymaktivität von AChE bzw. BChE wurde spektrophotometrisch bestimmt.
Das Produkt 2-Nitro-5-sulfidobenzoats wurde dazu bei 412 nm detektiert. Der Assay
wurde bei 25 °C durchgeführt. Assaypuffer war 100 mM Natriumphosphat-Puffer, pH
7.3, mit 100 mM NaCl. DTNB wurde als chromogener Reaktionspartner dem Assay
zugesetzt. Die Enzyme lagen als Stammlösungen in Assaypuffer in folgenden
Konzentrationen vor, EeAChE 100 U/mL, hAChE 3 U/mL und hBChE 10 U/mL.
In eine Küvette, welche 830 µL temperierten Assaypuffers enthält, werden
nacheinander 50 µL Acetonitril, 10 µL einer Inhibitor-Lösung (gelöst in Acetonitril)
und 50 µL der DTNB-Lösung (7 mM in Assaypuffer) pipettiert. Anschließend werden
10 µL eisgekühlte Enzym-Lösung zugegeben, wiederum gründlich gemischt und
fünfzehn Minuten bei 25 °C inkubiert.
Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von 50 µL ASCh-Lösung (5, 10, 15
oder 20 mM in Assaypuffer) bzw. Butyrylthiocholin-Lösung (10 mM in Assaypuffer)
und gründlichem Mischen gestartet. Die Extinktionszunahme wurde über fünf
Minuten verfolgt.
Somit ergaben sich in der Küvette folgende Konzentrationen: 350 µM DTNB, 6 %
Acetonitril, 250, 500, 750 oder 1000 µM Substrat, 0.033 U/mL EeAChE bzw. 0.03
U/mL hAChE bzw. 0.01 U/mL hBChE und unterschiedliche Konzentrationen an
Inhibitor. Die ungehemmte Reaktion wurde in gleicher Weise bestimmt, nur wurden
anstelle der 10 µL Inhibitor-Lösung 10 µL Acetonitril zugegeben. Das
Gesamtvolumem in der Küvette war 1 mL.
Die nichtenzymatischen Hydrolyse von Acetylthiocholin und Butyrylthiocholin wurde
in Abwesenheit des jeweiligen Enzyms ermittelt und bei allen Messungen
abgezogen.
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
124
4. Untersuchungen zur Hemmung der humanen Leukozyten-Elastase durch Thieno[1,3]oxazin-4-one 4.1 Mehrcyclische 1,3-Oxazin-4-one als Inhibitoren von Serinproteasen
Humane Leukozyten-Elastase (HLE) ist eine Serinprotease, welche aus den
azurophilen Granula der neutrophilen Granulozyten freigesetzt wird und praktisch
alle Typen von Matrixproteinen abbauen kann [43]. Als endogener Gegenspieler der
Elastase agiert z.B. α1-anti-Trypsin. Ein fehlendes Gleichgewicht der Elastase und
ihrer endogenen Inhibitoren ist charakteristisch für verschiedene Krankheiten, wie
Lungenemphysem, chronische Bronchitis oder rheumatoide Arthritis.
3,1-Benzoxazin-4-one I mit N-, O- und S-Substitution in Position 2 wurden als
Alternativsubstrat-Inhibitoren der HLE beschrieben (Abbildung 4.1-1). Der Begriff
Alternativsubstrat-Inhibitor bedeutet, dass diese Art von Inhibitoren wie Substrate
vom Enzym umgesetzt werden, wobei eine schnelle Acylierung des aktiven
Serinrestes und eine langsame Deacylierung des intermediären Acyl-Enzyms II erfolgt [99-101]. Es konnte gezeigt werden, dass die Einführung kleiner Alkyl-
Gruppen gebunden über ein N, O oder S-Atom an die Position 2 des Benzoxazinon-
Gerüstes potente Inhibitoren ergab. Kurze Alkylketten in Position 5 führten zur
weiteren Verstärkung der Hemmung, denn diese Substitution erbrachte eine
Stabilisierung des Acyl-Enzyms und somit eine langsame Deacylierung [99].
Auch Benzoxazinone mit einer Kohlenstoff-Substitution in Position 2 wurden als
potente Inhibitoren der HLE beschrieben. Der Mechanismus der Interaktion mit dem
Enzym wurde auch mittels UV-Vis-Spektren näher untersucht [100]. Dazu wurde das
Spektrum eines ausgewählten Inhibitors (I, mit Valin-Substitution an Position 2)
aufgenommen. Anschließend wurde HLE zugesetzt und die Veränderung des
Spektrums interpretiert als Bildung des Acylenzyms II. Durch den Einsatz eines
überschüssigen Peptidaldehyd-Inhibitors konnte die Rückbildung von I demonstriert
werden. So konnte bewiesen werden, dass solche Benzoxazinone über die
reversible Bildung eines kovalenten Intermediates die HLE hemmen. Bei diesen
Intermediaten handelt es sich um die Acyl-Enzyme II. Sie entstehen, wenn der
Serinrest des katalytischen Zentrums nukleophil den Carbonyl-Kohlenstoff des
Oxazinons angreift. Diese Acyl-Enzyme können entweder unter Ringschluss die
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
originalen Benzoxazinone zurückbilden, oder unter dem Einfluss von Wasser die
ringoffenen Anthranilsäure-Derivate III liefern. Diese Deacylierungsreaktionen setzen
das intakte Enzym wieder frei. Des Weiteren wurden diese Benzoxazinone in einem
Inhibitionsassay bei verschiedenen Substrat- wie auch Inhibitor-Konzentrationen
untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sie sich kinetisch wie kompetitive
Hemmstoffe der HLE verhalten [100]. Die Struktur der entsprechenden Acyl-Enzym-
Komplexe mit Pankreas-Elastase wurde für zwei Valin-abgeleitete Benzoxazinone
mittels Röntgenkristallstrukturanalyse bestätigt [102].
Die Bildung eines Acyl-Enzym-Komplexes konnte auch bei der Hemmung von
Chymotrypsin durch 2-Ethoxy- und 2-Trifluormethyl-Benzoxazinon (I, R = OC2H5;
CF3) gezeigt werden [103]. Dazu wurde das jeweilige Benzoxazinon mit
Chymotrypsin in Puffer inkubiert. Es wurden dann zu verschieden Zeiten UV-Vis-
Spektren aufgenommen. Es konnte für beide Verbindungen geschlossen werden,
dass der Mechanismus der Hemmung zur Bildung einer ringoffenen Verbindung III führte. Für das 2-Methyl-3,1-benzoxazin-4-on (I, R = CH3) wurde die analoge Enzym-
Inhibitor-Wechselwirkung postuliert, wobei das entsprechende Produkt III dünnschichtchromatographisch nachwiesen wurde. Für 2-Amino-3,1-benzoxazin-4-
on IV konnte ein interessanter Mechanismus aufgeklärt werden, demzufolge das
Acyl-Enzym V durch schnelle Deacylierung das cyclische Produkt VI liefert [103].
C
N
O
O
R
N
O
O
NH2
CO-OSer
NH-CO- NH-CO-
COOH
CO-OSer
NH-CO- NH
NH
O
O
B F
+ Ser-OH
- Ser-OHR
+ H2O
- Ser-OH
+ Ser-OH
- Ser-OHNH2
- Ser-OH
I
R
IV V
5
2
5
2
VI
IIIII
Abb. 4.1-1 Inhibitionsmechanismus der Benzoxazinone an HLE [91].
125
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
126
Innerhalb unseres Arbeitskreises wurden auch in der Vergangenheit UV-Vis-
Spektren benutzt, um die durch Cholesterolesterase (CEase) katalysierte Umsetzung
von Thieno[1,3]oxazin-4-onen zu untersuchen [67]. CEase gehört zur Gruppe der
Serinesterasen. Das ausgewählte Oxazinon wurde mit der 730-fach höheren
Enzymmenge als in Assay inkubiert. Es wurde in 10 Minuten-Intervallen ein
Spektrum aufgenommen, und eine Verschiebung des Absorptionsmaximums zu
kürzeren Wellenlängen konnte beobachtet werden. Das deutete darauf hin, dass das
aktive Serinrest nukleophil den Carbonyl-Kohlenstoff angreift und sich nach
hydrolytischer Spaltung die entsprechende Thiophencarbonsäure bildete. Das
Absorptionsmaximum des Thienooxazinons lag bei 350 nm. Somit wurde die
Hydrolyse des Ausgangstoffes bei 350 nm mit und ohne CEase aufgezeichnet [67].
3,1-Benzoxazin-4-one [104] und strukturanaloge Thieno[2,3-d][1,3]oxazin-4-one
[105-106] mit einer Kohlenstoff-Substitution in Position 2 wurden als Hemmstoffe im
mikro- bis nanomolaren Bereich für die Proteasen von HSV-1, HSV-2, VCV und CMV
beschrieben. Diese Herpes-Proteasen gehören auch zur Gruppe der Serinproteasen.
Jarvest et al. [104] konnten bei zwei Benzoxazinonen mittels MALDI-TOF-
Massenspektroskopie die Formation von Acylenzymen der HSV-1-Protease zeigen.
Für Thienoxazinone mit einer Endion-Struktur in dem 2-Substituenten wurde ein
dualer Acylierungs-Alkylierungs-Mechanismus angenommen. Demnach wird das
Enzym unter Ringspaltung acyliert und ein nucleophiler Cysteinrest reagiert im Sinne
einer Michael-Addition mit der Seitenkette [106].
Der Begriff Bioisosterie wurde vor mehr als fünfzig Jahren von Friedman eingeführt.
Als Bioisostere werden Verbindungen angesehen, welche strukturell ähnlich sind und
gleiche biologische Aktivität aufweisen. Dieses Konzept wurde seitdem häufig bei der
Suche von Leitstrukturen eingesetzt [107]. Deswegen wurde auch in dieser Arbeit
der Benzol-Ring gegen einen Thiophen-Ring ausgetauscht. In Kapitel 2 wurde die
Synthese und Evaluierung von Thieno-anellierten Pyrimidinen vorgestellt. In diesem
Kapitel werden Ergebnisse zur Untersuchung der Wechselwirkung von HLE mit
Thienooxazinonen beschrieben. Diese Substanzen wurden von
Kooperationspartnern synthetisiert und sind –wie die Substanzen in Kapitel 2– nach
dem Prinzip der Bioisosterie entwickelt worden. Dieser Benzol-Thiophen-Austausch
ist ein häufig praktizierter bioisosterer Ersatz. Gütschow et al. synthetisierten
Thienooxazinone und untersuchten ihre Aktivität gegenüber der HLE. Aus diesen
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
127
Arbeiten entstanden verschieden substituierte Thienooxazinone mit
Hemmeigenschaften gegenüber der HLE, die denen der Benzoxazinone vergleichbar
waren. Die Einführung des Thiophenringes führte zu einer Erhöhung der
Elektronendichte am Carbonyl-Kohlenstoff, welches sich in einer höheren Stabilität
des Oxazinon-Rings, sowie einer Verringerung der Acylierungs- und der
Deacylierungsrate wiederspiegelte [108-109].
In den letzten Jahren sind einige weitere Publikationen zur Herstellung von C- [110-
116] und N-substituierten [117] Thieno[2,3-d][1,3]oxazin-4-onen erschienen, die
Angaben zur Herstellung bzw. auch zur Hemmung der TNF-α-Synthese [117] und zu
antifungalen [115] oder entzündungshemmenden Eigenschaften [116] solcher
Heterocyclen machen.
4.2 Hemmexperimente mit Thieno[1,3]oxazin-4-onen mit C-Substituenten in Position 2
Eine Reihe von Thieno[1,3]oxazin-4-onen wurde gegenüber humaner Leukozyten-
Elastase (HLE) gemessen. Die Verbindungen stammten aus den Arbeitskreis Prof.
Dr. D. Briel aus dem Institut für Pharmazie der Universität Leipzig. Die Synthesen
wurden von Frau Dr. Anastasiya Rybak durchgeführt.
Die kinetischen Messungen zur Bestimmung der Enzymaktivität beruhen auf der
spektrophotometrischen Bestimmung des Produktes para-Nitroanilin (pNA) bei 405
nm und 25 °C. Als Substrat diente MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-NHNp (Np: para-
Nitrophenyl). Assaypuffer war 50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7.8, mit 500 mM
NaCl. Die Enzymkonzentration betrug 25 ng/mL.
Zeigten die Verlaufskurven der Freisetzung von pNA in Anwesenheit von Inhibitoren
einen linearen Verlauf, wurde eine lineare Regression durchgeführt. Die Anstiege der
Regressionsgeraden sind steady-state Geschwindigkeiten in Anwesenheit
unterschiedlicher Inhibitor-Konzentration (v) bzw. in Abwesenheit des Inhibitors (v0).
Die IC50-Werten wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse gemäß Gleichung
4.1-1 erhalten,
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
128
0
50
[I]1IC
vv =⎛ ⎞
+⎜ ⎟⎝ ⎠
(Gl. 4.1-1)
wobei [I] die Inhibitor-Konzentration ist. Der Km-Wert von HLE für das Substrat MeO-
Suc-Ala-Ala-Pro-Val-NHNp wird mit 53 μM angegeben [118].
Wurde nur eine Inhibitorkonzentration eingesetzt, so wurde der IC50-Wert nach
Gleichung 4.1-2 berechnet.
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ −
=1
vv0
50[I]IC (Gl. 4.1-2)
Die Substanzen aus Leipzig wurden in einen Screeningassay zunächst bei einer
Konzentration in Doppelbestimmung gemessen. Die Konzentration, bei der die
Messung durchgeführt wurde, wurde in Abhängigkeit der Löslichkeit gewählt (10 oder
20 µM). Da 22, 23, 29, 33 und 34 keine gute Löslichkeit aufwiesen, konnte bei diesen
Verbindungen keine Messung durchgeführt werden. Solche Substanzen, die besser
löslich waren und gute Inhibitionswerte zeigten, wurden bei 4 bzw. 5 verschiedenen
Inhibitorkonzentrationen untersucht. Als inaktiv wurden Substanzen angesehen, die
einen IC50-Wert von über 40 µM aufwiesen.
Verbindungen 17, Methyl-substituiert in Position 2 und Phenyl-substituiert in Position
6, zeigte sich als inaktiv (Tab. 4.2-1). Sie wurde bei einer Inhibitorkonzentration (10
µM) gemessen. Durch den Austausch des Oxazin-Sauerstoffs gegen den Thiazin-
Schwefel (Verbindung 19) konnte ebenfalls keine Hemmung gegenüber HLE erzielt
werden. 19 wurde auch bei einer Inhibitorkonzentration (10 µM) gemessen.
Ausgehend von Verbindung 17 wurde eine Methylgruppe in Position 5 eingeführt. Die
somit erzeugte Verbindung 18 zeigte sich bei einer Inhibitorkonzentration von 20 µM
als inaktiv. Der Austausch der Methylgruppe in Position 2 gegen eine Trifluormethyl-
(Verbindung 20) bzw. Trichlormethyl-Gruppe (Verbindung 21) führte nicht zu einer
Aktivitätssteigerung.
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
Tab. 4.2-1 Hemmung der HLE durch Thieno[1,3]oxazin-4-one.
Verbindung Strukturformel IC50 (µM)
nach Doppelbestimmung
17
N CH3
O
O
S
Bei einer Inhibitorkonzentration
(10 µM)
> 40
18
N CH3
O
O
S
CH3
Bei einer Inhibitorkonzentration
(20 µM)
> 40
19
N CH3
S
S
S
Bei einer Inhibitorkonzentration
(10 µM)
> 40
20
N
OF
FF
O
S
CH3
Bei einer Inhibitorkonzentration
(20 µM)
> 40
21
N
O
O
Cl
Cl
ClS
CH3
Bei einer Inhibitorkonzentration
(20 µM)
> 40
22
N
O
O
O
O
CH3
S
CH3
Bei einer Inhibitorkonzentration
(20 µM)
---
129
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
130
Ausgehend von Verbindung 18 wurde der Methylrest in Position 2 durch andere
voluminöse Gruppen ersetzt (Tab. 4.2-2). Verbindung 24 mit einer Ethyl-Substitution
zeigte sich als die erste wirksame Substanz mit einem IC50-Wert von 8.8 µM. Er
wurde bei 4 verschiedenen Inhibitorkonzentrationen (4, 8, 12 und 16 µM) bestimmt.
Diese Verbindung konnte nicht unter Assaybedingungen über 16 µM in Lösung
gebracht werden. Auch die Propyl- und Butyl-Substitution bei Verbindung 25 bzw. 26
führte zu guten inhibitorischen Eigenschaften. Verbindung 25 erzielte einen IC50-Wert
von 5.6 µM und Verbindung 26 einen IC50-Wert von 13 µM. Beide wurden bei einer
Inhibitorkonzentration, 5 bzw. 10 µM, geprüft. Das 2-Phenyl-substitutierte Derivat 28
hemmte die HLE nicht. Aber mittellange 2-Alkylketten führten zur inhibitorischen
Wirksamkeit, wobei besonders 27 mit Isopropyl-Substitution ein sehr guter Inhibitor
mit einem IC50-Wert von 6.0 µM war. Er wurde bei 5 verschiedenen Konzentrationen
(1, 2, 3, 4 und 5 µM) bestimmt. Die Methyl- und Halomethyl-Gruppen erbrachten
keine Enzymhemmung, somit stellt die Isopropyl-Gruppe in Position 2 einen
geeigneten Rest dar.
Bei der Verbindung 27 traten Löslichkeitsprobleme auf, deswegen wurde die
Hemmkurve bei 1-5 µM erstellt, obwohl bei einen IC50-Wert von 6.0 µM eine
passende Hemmkurve Werte zwischen 2-10 µM aufweisen sollte.
In der Abbildung 4.2-1 ist die Inhibition der Verbindung 24 gegenüber HLE
dargestellt. Die Daten sind Mittelwerte aus einer zweifachen Bestimmung. Bei dieser
Substanz wurde auch der Mechanismus der Inhibition näher untersucht.
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
Tab. 4.2-2 Hemmung der HLE durch Thieno[1,3]oxazin-4-one.
Verbindung Strukturformel IC50 ± SE (µM)
nach Doppelbestimmung
23
N
O
O
S
CH3
Bei einer Inhibitorkonzentration
(20 µM)
---
24
N
O
O
CH3
S
CH3
Bei vier Inhibitorkonzentrationen
(4, 8, 12 und 16 µM)
8.8 ± 0.1
25
N
O
O
CH3
S
CH3
Bei einer Inhibitorkonzentration
(5 µM)
5.6
26
N
O
O
CH3
S
CH3
Bei einer Inhibitorkonzentration
(10 µM)
13
27
N
O
O
CH3
CH3S
CH3
Bei fünf Inhibitorkonzentrationen
(1, 2, 3, 4 und 5 µM)
6.0 ± 0.5
28
N
O
O
S
CH3
Bei einer Inhibitorkonzentration
(10 µM)
> 40
131
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
132
[24] (µM)0 5 10 15 20
Enz
ymak
tivitä
t (%
)
0
20
40
60
80
100
120
Abb. 4.2-1 Inhibition der HLE durch Verbindung 24. Auftragung der relativen Geschwindigkeiten versus [24]. Die Geschwindigkeitswerte (in Prozent) waren Mittelwerte einer Doppelbestimmung bei einer Substratkonzentration von 100 µM. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit bei einer Substratkonzentration von 100 µM in Abwesenheit des Inhibitors gewertet. Eine nichtlineare Regression nach Gl. 4.1-1 ergab IC50 = 8.8 ± 0.1 µM. Bei den Verbindungen 30 und 31 (Tab. 4.2-3) wurde das Thienooxazinon-
Ringsystem um einen Tetrahydrobenzoring vergrössert, einmal mit einer Phenyl-
Substitution in Position 7 und einmal ohne. In beiden Fällen äußerte sich diese
zusätzliche Anellierung in einer guten Hemmaktivität, wobei die Tetramethylenkette
(in 30) sogar zu einer besseren Aktivität als das 5-Methyl-6-Phenyl-
Substitutionsmuster (in 24) führte. Die Substanz 31 war der einzige, in 2-Position
unsubstituierte Vertreter, der eine ausreichende Löslichkeit aufwies.
Es wurde gefunden, dass sich sowohl der Tetrahydrobenzoring als auch eine Ethyl-
Substitution an Position 2 der Thienooxazinone als vorteilhaft zeigte. Weitere
Substanzen, die man synthetisieren könnte, würden den Tetrahydrobenzoring an der
linken Seite des Thienooxazinon-Systems und einen zusätzlichen Propyl-, Butyl-
oder Isopropyl-Substituenten an Position 2 besitzen.
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
133
Tab. 4.2-3 Hemmung der HLE durch Thieno[1,3]oxazin-4-one.
Verbindung Strukturformel IC50 ± SE (µM)
nach Doppelbestimmung
29
Bei einer Inhibitorkonzentration
(20 µM)
---
N
O
O
S
30
N
O
O
CH3
S
4.1 ± 0.2
31
Bei fünf Inhibitorkonzentrationen
(4, 8, 12, 16 und 20 µM)
N
O
O
S
14.5
Bei vier Inhibitorkonzentrationen
(4, 8, 12 und16 µM)
32
N
O
O
CH3
SS
NCCH3
(25 µM)
> 40
33
S
Bei einer Inhibitorkonzentration
O
OCH3
S
N
O
O
CH3
NC
Bei einer Inhibitorkonzentration
(20 µM)
---
34
Bei einer Inhibitorkonzentration
(25 µM)
---
SS
N ONH2
O
O
CH 3
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
134
ine Erklärung des
hibitionsmechanismus war ein Ziel dieser Studie. Es wurde untersucht, ob die
Thienooxazinone als alternative Substrate umgesetzt wurden (Abbildung 4.2-2).
Nicht nur die Ermittlung der Inhibitionswerte, sondern auch e
In
N
O
S
O
S
CO-OSer
NH-CO- S NH-CO-
COOH
R2
R R1 R11
+ H2O+ Ser-OHR2 R2
R3 - Ser-OH - Ser-OHR3 R3
Abb. 4.2-2 Möglicher Inhibitionsmechanismus der
Um diesen Mechanismus zu verifizieren, wurden UV-Techniken gewählt. Die
Umsetzung des Inhibitors sollte anhand yklischer Spektren beobachtet werden.
Dafür sollten die Assaybedingungen angewende
Unterschied, dass in der Küvette die hundertfache Enzymkonzentration des Assays
vorliegen sollte. Bei einer Enzymkonzentration wie im Assay würde das Enzym durch
die Verbindung inhibiert, und die Umsetzung als alternatives Substrat könnte nicht
beobachtet werden. Es wurden UV-Vis-Spektren de
zusätzlich der korrespondierenden Thiophencarbonsäuren 35 bzw. 36 aufgenommen
(Abbildungen 4.2-3, 4.2-4).
Thienooxazinone an HLE.
z
t werden, allerdings mit dem
r Verbindungen 24 und 30 und
N
O
S
CH3
CH3
O
S
CH3COOH
NH-COC2H5
N
O
S
CH3
O
S
COOH
NH-COC2H5
+ Ser-OH+ H2O- Ser-OH
24 35
+ Ser-OH+ H2O- Ser-OH
30 36 Abb. 4.2-3 Postulierte Umwandlung der Thienoxazinone 24 bzw. 30 zu den korrespondierenden Thiophencarbonsäuren 35 bzw. 36.
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
135
en
erbindungen 35 und 36 geprüft werden. Aber die UV-Vis-Spektren der
Thienooxazinone besaßen Absorptionsmaxima bei ähnlichen Wellenlängen wie die
korrespondierenden ringoffenen Verbindungen (Abbildung 4.2-4). Eine mögliche
Umwandlung konnte deshalb mittels UV-Vis-Spektren nicht demonstriert oder
ausgeschlossen werden.
Es wurden auch Spektren der Thienooxazinone 24 und 30 (20 µM) in Anwesenheit
von HLE (2.5 µg/mL) im Abstand von 30 Minuten aufgenommen (Daten nicht
abgebildet). Es sollte die Umwandlung von 24 und 30 zu den ringoffen
V
0,4 0,4
0,3
Wellenlänge (nm)250 300 350 400
Abs
0,1
0,2
Wellenlänge (nm)250 300 350 400
Abs
0
0,1
0,2
Abb. 4.2-4 UV-Vis-Spektren der Verbindung 30 (links) und 36 (rechts), aufgenommen in 50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7.8, mit 500 mM NaCl und 2 % DMSO bei einer Konzentrati
0,3
onen von 20 µM.
HPLC-Untersuchungen an Thienooxazinonen
Die Chromatographie wurde als weitere Methode erwählt, um den Mechanismus der
Inhibition zu untersuchen. Dafür wurden die Verbindungen 24 bzw. 30 jeweils unter
Assaybedingungen mit HLE versetzt, wobei die hundert- bzw. die zweihundertfache
Enzymkonzentration verwendet wurde. Die Proben wurden bei 25°C inkubiert und
bei 300 rpm in einem Thermomixer geschüttelt. In 30 Minuten-Abständen wurden die
Proben mittels High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) untersucht. Parallel
dazu wurde in Kontrollansätzen die nicht-enzymatische Hydrolyse in Abwesenheit
von HLE verfolgt, indem auch in 30 Minuten-Intervallen Aliquote injiziert wurden.
robenvorbereitung für die HPLC. Die Substanzen 24 und 30 sowie ihre
4.3
PHydrolyse-Produkte 35 bzw. 36 wurden in einer Konzentration von 20 µM im
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
136
rüft.
PLC Bedingungen und Auswertung. Es wurde eine Reversed Phase (RP)-Säule
eingesetzt. Das Fließmittel setzte sich zusammen aus
Mobile Phase A: Wasser: Acetonitril: Trifluoressigsäure (450: 50: 0.3)
Mobile Phase B: Wasser: Acetonitril: Trifluoressigsäure (50: 450: 0.3).
Die Trifluoressigsäure (TFA) diente zur Protonierung der Thiophencarbonsäuren. Es
erfolgte eine Gradientenelution:
0 min 30 % B 70 % A
5 min 40 % B 60 % A
11 min bis 13 min 70 % B 30 % A
8 min bis 25 min 90 % B 10 % A
ngoffenen Verbindungen erfolgte die Detektion bei 310 nm.
u prüfen, wurde die
bnahme der Area Under the Curve (AUC) des jeweiligen Oxazinons (24 bzw. 30)
are
bnahme von 30.
Assaypuffer (Phosphat-Puffer 50 mM NaCl 500 mM pH 7.8) gelöst. Die
Konzentration an DMSO betrug 4 %. Im Assay betrug die Konzentration an DMSO
1.5 %, sie wurde hier aus Löslichkeitsgründen erhöht. Es wurde UV-
spektrophotometrisch überprüft, dass bei der Erhöhung der DMSO-Konzentration
(von 1.5 % auf 4 %) die Geschwindigkeit der enzymkatalysierten Hydrolyse von
MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA nicht beeinflusst wird (Daten nicht abgebildet). Die
Aktivität des in den HPLC-Experimenten eingesetzten Enzyms wurde mit dem
chromogenen Substrat gep
H
1
27 min bis 30 min 30 % B 70 % A
Die Flussrate betrug 1 mL/min. Wegen der Absortionsmaxima der Oxazinone und der
ri
Um zunächst eine mögliche Reaktion in Abwesenheit von HLE z
A
gegenüber der Zeit aufgenommen (Abbildung 4.3-1).
Die Retentionszeiten für die Verbindungen 24 und 30 lagen bei 22.3-23.5 Minuten
bzw. bei 19.7-19.9 Minuten. Die korrespondierenden Säuren 35 und 36 wurden
separat injiziert. Die Retentionszeiten für diese ringoffenen Verbindungen lagen bei
15.9-16.8 Minuten bzw. 14.0-14.2 Minuten. Eine Bildung der entsprechende Säuren (35 bzw. 36) konnte jedoch überraschender
Weise nicht detektiert werden und ist deswegen nicht aufgetragen. Aus den
Messwerten in Abbildung 4.3-1 lassen sich folgenden Parameter durch nicht-line
Regression ermitteln, eine Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung von 0.0113
min–1 ± 0.0008 für die Abnahme von 24 und von 0.0034 min–1 ± 0.0005 für die
A
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
AU
C (m
AU
*min
)
1
2
3
4
0 50 100
0
t (min)
150 200
4 und 30 in
on 30 (20 µM).
Abb. 4.3-1 HPLC-kontrollierte Abnahme der Konzentration von 2Abwesenheit von HLE. Die schwarzen Kreise zeigen die Reaktion von 24 (20 µM), die weißen Kreise die Reaktion v
4
3
137
t (min)0 50 100 150 200
Abb. 4.3-2 HPLC-kontrollierte Abnahme der Konzentration von 24 und 30 in Anwesenheit von HLE (2.5 µg/mL). Die schwarzen Kreise z
AU
0
1
C (m
AU
*
2
min
)
eigen die Reaktion von 24 (20 µM), die weißen Kreise die Reaktion von 30 (20 µM).
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
138
Anschließend wurden die Substanzen mit HLE inkubiert (Abbildung 4.3-2). Die
Geschwindigkeitskonstanten betrugen 0.0101 min–1 ± 0.0003 für 24 und 0.0032 min–1
± 0.0003 für 30. Beide lagen im selben Bereich wie die der nicht-enzymatischen
Reaktion. Die hohe Enzymkonzentration (2.5 µg/ml) beschleunigte demnach den
Abbau beider Substanzen nicht. Der Peak der korrespondierenden Säuren wurde
zwar beobachtet, allerdings mit jeweils kleinem AUC, das nicht proportional zur
Abnahme des Thienooxazinon zunahm. Um sicher zu stellen, dass die Enzymmenge
den Verlauf der Reaktion nicht beeinflusst, wurden die Experimente mit 5 µg/mL
HLE, d.h. der zweihundertfachen Konzentration des Assays, durchgeführt (Abbildung
4.3-3). Die Geschwindigkeitskonstante für die Verbindung 24 von 0.0107 min–1 ±
0.0008 lag in derselben Größenordnung wie bei den vorangegangenen
neut nicht beobachtet werden.
en Ergebnissen konnte abgeleitet werden, dass der Abbau der Substanzen
und die Bildung der Hydrolyseprodukte
nicht ermittelt werden konnte. Der in Abbildung 4.2-2 und Abbildung 4.2-3 skizzierte
Mechanismus konnte nicht bestätigt werden.
Experimenten. Dies galt auch für Verbindung 30 mit einem Wert von 0.0038 min–1 ±
0.0004. In diesen Messungen konnte die entsprechende Zunahme der
korrespondierenden ringoffenen Verbindungen er
Aus dies
von der Enzymkonzentration unabhängig ist
t (min)0 50 100 150 200
0
AU
C (m
AU
*min
)
1
2
3
4
bb. 4.3-3 HPLC-kontrollierte Abnahme der Konzentration von 24 und 30 in nwesenheit von HLE (5 µg/mL). Die schwarzen Kreise zeigen die Reaktion von 24 0 µM), die weißen Kreise zeigen die Reaktion von 30 (20 µM) mit.
AA(2
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
139
Die
, ob aus dem jeweiligen Oxazinon ggf.
in anderes Produkt entstand, wurde nun das HPLC-Programm bei verschiedenen
Wellenlängen gefahren. Zusätzlich wurden die Thienooxazinone in Wasser anstelle
von Puffer gelöst um zu verhindern, dass mögliche Reaktionen zwischen den
Verbindungen und den Pufferbestandteilen zu anderen Produkten führen. Die
Analyse der Chromatogramme im Bereich 250-350 nm bei 9 verschiedenen
Wellenlängen gab keine Hinweise auf andere Produkte. Dieser Befund steht
offensichtlich im Widerspruch zu dem ermittelten Abbau der Thienooxazinone.
Wurden die Thienooxazinone nicht vollständig eluiert? Um diese Frage zu
beantworten musste geklärt werden ob (i) dafür Löslichkeitsgründe oder (ii)
Adsorptionsvorgänge eine Rolle spielen könnten.
Löslichkeit der Thienooxazinone. Wie erwähnt, wurden die Proben unter
konstantem Schütteln (300 rpm) im Ther . Wenn die
nicht erklären.
Zusätzlich wurde der Anteil an organischem Lösungsmittel in den Inkubationen
Nach Auswertung der HPLC-Experimente stellten sich die Fragen, ob (i) die
erwarteten Thiophencarbonsäuen nicht vollständig eluiert wurden, oder ob (ii) an
deren Stelle andere Produkte entstanden, oder ob (iii) die Thienooxazine nicht
quantitativ erfasst wurden. Wurden die Thiophencarbonsäuren nicht vollständig eluiert? Die
Thiophencarbonsäuren 35 und 36 wurden in drei verschiedenen Konzentrationen in
die HPLC injiziert und es wurden AUC-Werten in direkter Proportionalität zur
eingesetzten Konzentration erhalten (Daten nicht abgebildet). Um eine Interaktion
der Oxazinone und der zugehörigen Carbonsäure auszuschließen, wurden sowohl
Verbindung 24 als auch 30 mit der zugehörige Thiophencarbonsäure, 35 bzw. 36,
gelöst und zusammen injiziert. In beiden Fällen konnten zwei getrennte Peaks im
Chromatogramm erfasst werden. Schließlich wurden 24 und 30 in Assaypuffer und
DMSO (4 %) gelöst und mit Natronlauge bis auf pH 14 versetzt. Durch die alkalische
Behandlung sollte der Oxazinonring der beiden Verbindungen geöffnet werden.
Chromatogramme zeigten jeweils einen Peak, nämlich den von 35 bzw. 36 (Daten
nicht abgebildet). Somit konnte gezeigt werden, dass die Thiophencarbonsäuren 35
bzw. 36 quantitativ mittels HPLC unter den gewählten Bedingungen erfasst werden.
Entstanden andere Produkte? Um zu prüfen
e
momixer bei 25 °C aufbewahrt
Verbindungen 24 und 30 nicht vollständig gelöst vorliegen sollten, würden sich durch
das Schütteln ggf. unterschiedliche AUC-Werte in den Chromatogrammen ergeben,
die kontinuierliche Abnahme der Peaks ließ sich damit jedoch
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
140
xazinon-Peaks registriert, ohne dass die Peaks der
mittel
gesteigert, indem die DMSO-Konzentration von ursprünglich 2 % schrittweise auf 4
%, 10 % und 20 % erhöht wurde. Parallel dazu wurde die Anfangskonzentration der
Thienooxazinone von 20 µM auf 8 µM und schließlich 4 µM erniedrigt. Erneut wurde
dann die Abnahme der O
Thiophencarbonsäuren proportional zunahmen. Die mittels HPLC ermittelte
Abnahme der Thienooxazinon-Konzentration war demnach nicht durch
Löslichkeitsprobleme verursacht.
Adsorption an aktiven Oberflächen. Es sollte zuerst eine mögliche Adsorption der
Thienooxazinone an der Oberfläche der Reaktionsgefäße überprüft werden.
Deswegen wurde die Lösung von 24 in Quarzglas-Küvetten anstelle der
Polypropylen-Gefäße aufbewahrt. Die ersten beiden aufeinander folgenden
Chromatogramme hatte einen gleich großen Peak für 24. Das dritte Chromatogramm
nach 90 Minuten zeigte einen Peak mit einem kleineren AUC-Wert als die beiden
vorangegangenen. Dieser Befund sprach für einen möglichen Adsorptionsvorgang
an Gefäßoberflächen. In den nachfolgenden Untersuchungen wurden Quarz-
Küvetten für die Inkubationen eingesetzt. Bekanntlich können Proteine an der
Gefäßwand adsorbiert werden [119], dass aber unsere niedermolekularen
Thienooxazinone adsorbiert werden könnten, wurde zuerst nicht vermutet.
Um eine mögliche Adsorption in der Probenschleife festzustellen, wurde nach der
Aufnahme eines Chromatogramms von 24 (20 µM) die C18-HPLC-Säule durch eine
Kunststoffkapillare ersetzt, d.h. die Probenschleife direkt mit dem Detektor
verbunden. Es wurden zwei neue Fließmittel vorbereitet. Das erste bestand aus 95
% Acetonitril und 5% Wasser, das zweite aus 95 % Wasser und 5 % Acetonitril.
Zuerst wurde 30 Minuten mit dem ersten Fließmittel eluiert und dabei auch nur
dieses Fließmittel injiziert. Danach wurde 30 Minuten mit dem zweiten Fließ
eluiert und auch hier nur dieses Fließmittel injiziert. In beiden Fällen konnten keine
Peaks beobachtet werden, d.h. die Verbindung 24 wurde nicht in der Probenschleife
adsorbiert.
Daraufhin wurde die C18-Säule wieder zwischen die Probenschleife und den Detektor
geschaltet, das erste Fließmittel injiziert und mit diesem Fließmittel 30 Minuten
eluiert. Da ein Peak mit einer Retentionszeit von 5.82 Minuten erhalten wurde,
konnte bestätigt werden, dass die Thienooxazinone von der C18-Säule nicht
vollständig eluiert wurden.
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
141
Es wurde darauf die C18-Säule durch eine C6-Phenyl-Säule ersetzt, die Verbindung
24 (20 µM) injiziert, mit dem Standard-Fließmittel eine Gradientenelution
durchgeführt und ein Peak nach einer Retentionszeit von 19.92 bzw. 19.94 Minuten
registriert. Erneut wurde das Fließmittel mit 95 % Acetonitril-Anteil injiziert und mit
diesem Fließmittel 30 Minuten eluiert. Wiederum wurde keine flache Basislinie
sondern ein Peak nach 10.35 Minuten beobachtet, was für die unvollständige Elution
von 24 auch von der C6-Phenyl-Säule sprach. Für die nachfolgenden
Untersuchungen wurde wieder die C18-Säule eingesetzt.
Nunmehr sollte die Elutionskraft des Fließmittels verstärkt werden. Da der Anteil von
Acetonitril (81 % zwischen 18 und 25 Minuten) nicht erhöht werden sollte [119],
wurde Tetrahydrofuran (THF) zu dem Fließmittel B zugesetzt. Es wurde sukzessiv
0.01 %, 0.1 %, 0.2 %, 0.5 %, 1 % bis 2 % an THF zugefügt um den richtigen Anteil
festzustellen, denn ein zu hoher THF-Anteil führt auch zu einer schlechteren
Chromatographie [119]. Somit setzte sich das neue Fließmittel wie folgt zusammen
Mobile Phase A: Wasser: Acetonitril: TFA (475: 25: 0.3)
Mobile Phase B: Wasser: Acetonitril: THF: TFA (25: 465: 10: 0.3).
HPLC-Experimente nach Änderung des Fließmittels. Durch die Zugabe von THF
zur mobilen Phase B wurde die Elutionskraft des Fließmittels erhöht, so dass die
Verbindung 24 nicht mehr an der C18-Säule adsorbiert wurde. Die Retentionszeit von
24 betrug 17.33-17.35 Minuten. Die Inkubationsexperimente in Abwesenheit und
Anwesenheit von HLE sind in den Abbildungen 4.3-4 (1. Experiment) und 4.3-5 (2.
Experiment) dargestellt. Das Oxazinon 24 wurde über 4 Stunden in Quarz-Küvetten
ohne HLE und mit 5 µg/ml HLE, der 200-fachen Konzentration des Assays, inkubiert.
Aliquote wurden jede Stunde injiziert und in beiden Fällen (mit und ohne Enzym)
konnte keine Degradation der Substanz beobachtet werden. Damit konnte schließlich
gezeigt werden, dass Verbindung 24 relativ stabil war und nicht vom Enzym
umgesetzt wurde. Der ursprünglich mittels HPLC ermittelte Abbau der Oxazinone
reflektierte nur die Kinetik der Adsorption der Substanzen an der HPLC-Säule und
möglicherweise auch am Reaktionsgefäß.
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
142
AU
C (m
AU
*min
)
1
2
3
4
t (min)0 50 100 150 200 250
0
Abb. 4.3-4 HPLC-Bestimmung der Konzentration von 24 (20 µM) im ersten Inkubationsexperiment in Abwesenheit (schwarze Kreise) und Anwesenheit (weiße Kreise) von HLE (5 µg/mL).
AU
C (m
AU
*min
)
1
2
3
4
t (min)0 50 100 150 200
0
Abb. 4.3-5 HPLC-Bestimmung der Konzentration von 24 (20 µM) im zweiten Inkubationsexperiment in Abwesenheit von HLE.
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
143
ym-Inhibitor-Komplex. Für
t.
zym näher zu untersuchen,
en Inhibitor- und
n an einem Cary 50 Bio UV/Vis-
Spektrophotometer der Firma Varian, mit einem temperierbaren Küvettenhalter
ausgestattet. Die Proben wurden dabei durch die Thermostaten UC-5B temperiert.
Die enzymologischen Untersuchungen wurden mit humaner Leukozyten-Elastase
(HLE) und MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-NHNp von Bachem (Bubendorf, Schweiz)
4.4 Schlussfolgerungen
Es konnte gefolgert werden, dass der Mechanismus der Inhibition für Verbindung 24 nicht über die Bildung eines Acyl-Enzyms-Komplexes verlief. Zwar inhibierte 24 die
HLE im niedrig-mikromolaren Bereich, ist aber kein Alternativsubstrat des Enzyms,
denn eine HLE-katalysierte Umsetzung von 24 wurde nicht beobachtet. Vermutlich
agieren auch die strukturverwandten C-substituierten Thienooxazinon-Inhibitoren 27,
30 und 31 nicht über einen kovalenten Enz
Thienooxazinone mit N-, O- oder S-Substitution in Position 2 wurde demgegenüber
eine Alternativsubstrat-Hemmung beschrieben [67]
Wahrscheinlich wirken also die hier untersuchten Substanzen, ohne dass sie eine
kovalente Bindung zur HLE ausbilden. Für 24 beispielsweise wurde ein IC50-Wert
von 8.8 ± 0.1 µM ermittelt. Dabei wurde der Inhibitor bei vier verschiedenen
Konzentrationen gemessen. Die Substratkonzentration wurde allerdings nicht variier
Um die Art der Interaktion zwischen Inhibitor und En
könnte in weiterführenden Experimenten mit unterschiedlich
Substrat-Konzentrationen gemessen werden. Ein Verfahren zur Analyse solcher
Daten, der Specific Velocity Plot, wurde im Kapitel 2 der vorliegenden Arbeit
beschrieben. Damit könnte der kompetitive bzw. unkompetitive Anteil der Hemmung
ermittelt und somit auch Schlussfolgerungen über die Bindung der Inhibitoren an
HLE gezogen werden.
4.5 Experimenteller Teil 4.5.1 Spektrophotometrische Experimente und HLE-Assay Die UV-Spektren wurden auf einem Cary 50 Bio der Firma Varian unter Verwendung
von Präzisionsquarzküvetten Suprasil der Firma Hellma aufgenommen. Die
spektrophotometrischen Assays erfolgte
Thieno[1,3]oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren
144
durchgeführt. HLE war von früheren Studien des Arbeitskreises verfügbar [108]. HLE
wurde aus humanen Leukozyten präpariert und mittels Affinitäts-Chromatographie
unter Verwendung eines inmobilisierten Inhibitors gereinigt. Zur Auswertung der
kinetischen Daten wurde Grafit v.5.0 (R.J. Leatherbarrow, Erithacus Software,
Staines, Großbritanien, 2001) verwendet.
Assaypuffer für die Bestimmung von HLE war Natriumphosphat-Puffer 50 mM, NaCl
500 mM, pH 7.8. Eine Stammlösung des Substrates MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-NHNp
wurde in DMSO bereitet und mit Assaypuffer verdünnt. Das Enzym lag als
Stammlösung 50 µg/mL in 100 mM Natriumacetat/Essigsäure-Puffer pH 5.5 vor. Die
Aliquote der Stammlösung wurden am Messtag im Eis aufgetaut. Die Stammlösung
wurde vor jede Messung 1:100 mit Assayp ffer verdünnt (5 µL + 495 µL).
nd gründlich gemischt. Anschließend wurden 50 µL
isgekühlte Enzym-Lösung (500 ng/mL) zugegeben, wiederum gründlich gemischt,
und die Reaktion wurde 15-20 Minuten verfolgt. Dazu wurde die Extinktionszunahme
bei 405 nm gemessen. Somit ergaben sich in der Küvette folgende Konzentrationen:
100 µM Substrat, 25 ng/mL Elastase, 1.5 % DMSO und unterschiedliche
Konzentrationen an Inhibitor. Das Gesamtvolumen in der Küvette war 1 mL. Die
ungehemmte Reaktion wurde in gleicher Weise bestimmt, nur wurden anstelle der 10
µL Inhibitor-Lösung 10 µL DMSO zugegeben.
4.5.2 HPLC Experimente Die HPLC-Chromatogramme wurden an einem HPLC-Gerät der Firma Dionex
(Pumpensystem P580) mit UV-Detektor und mit einer Phenomenex Gemini 5 µ C18
äure (TFA) waren von Fluka
eisenhofen, Deutschland). Tetrahydrofuran (THF) war von Acros Organics (Geel,
Belgium). In einer typischen Messung wurde die Verbindung 24 (20 µM) in
Assaypuffer und Acetonitril mit HLE inkubiert. Die finale Konzentration war 2 %
Acetonitril und 2.5 µg/mL bzw. 5 µg/mL HLE. Die Lösung wurde bei 25 °C aufbewahrt
und Aliquote von 10 µL wurden injiziert. Die Flussrate betrug 1 mL/min und die
Detektion erfolgte bei 310 nm. Die Fließmittel sind im Text aufgeführt.
u
In eine Küvette, welche 890 µL temperierten Assaypuffers enthielt, wurden
nacheinander 10 µL einer Inhibitor-Lösung (gelöst in DMSO) und 50 µL der Substrat-
ösung (2 mM) gegeben uL
e
bzw. Gemini 5 µ C6-Phenyl, beide 250 × 4.60 mm aufgenommen.
Acetonitril (HPLC-Qualität) und Trifluoressigs
(D
Acylierende Inhibitoren von Serinhydrolasen
145
5. Untersuchungen zu acylierenden Inhibitoren von Serinhydrolasen
5.1. HPLC-Experimente an Acetylcholinesterase und Chymotrypsin mit anellierten 1,3-Oxazin-4-onen
Die in diesem Kapitel untersuchten anellierten 1,3-Oxazin-4-one entstammen aus
Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden
vier 1,3-Oxazin-4-one (36, 37, 38 und 40) im Bezug auf eine enzymkatalysierte
Umsetzung und die spontane Hydrolyse untersucht. Es wurden dafür die
Serinhydrolasen Acetylcholinesterase (AChE) aus Electrophorus electricus und
Chymotrypsin aus Rind eingesetzt. Im Kapitel 4 der vorliegenden Arbeit wurde
bereits über HPLC- und UV-Techniken zur Analyse der Umsetzung von anderen 1,3-
Oxazin-4-onen durch HLE berichtet.
Die inhibitorische Aktivität von 36 und 37 (Tabelle 5.1-1) gegenüber
Cholesterolesterase aus Rind und AChE wurde spektrophotometrisch von Dr.
Markus Pietsch untersucht [55]. Verbindung 36 war gegenüber AChE wirkungslos.
Die Benzyl-Verbindung 37 hemmte die AChE mit einem Ki-Wert im unteren
mikromolaren Bereich nach einem Mechanismus des gemischten Typs mit einem
ausgeprägt unkompetitiven Charakter (α = 0.37). Gegenüber Cholesterolesterase
verhielten sich die Verbindungen umgekehrt, 37 war wirkungslos, und die Hemmung
durch 36 (Ki = 2.15 µM) kann wegen struktureller Analogie mit anderen
cycloaliphatisch verbrückten 2-Dialkylamino-thieno[2,3-d][1,3]oxazin-4-onen als
Alternativsubstrat-Inhibition eingestuft werden [55,120].
Der Mechanismus der AChE-Inhibition sollte nun zusätzlich mittels HPLC untersucht
werden. In dem gewählten HPLC-System wurden Rf-Werte von 21.0 min bzw. 5.4
min für 36 bzw. 37 ermittelt: Es war von Interesse, ob AChE den Lactonring der
Substanzen 36 und 37 spaltet (Abbildung 5.1-1). Dazu wurde die 100-fache Menge
an AChE im Vergleich zu den Inhibitionsstudien [55] eingesetzt. Von jedem
Inkubationsexperiment wurden in 60 Minuten-Intervallen Chromatogramme
aufgenommen. Eine Inkubation der Verbindungen 36 und 37 mit 3.33 U/mL AChE
ergab auch nach 3.5 Stunden keine Veränderung der Ausgangssubstanzen
(Abbildung 5.1-2). Dies deutet darauf hin, dass diese beiden Thienooxazinone die
AChE nicht acylieren und nicht als entsprechende Carbonsäuren freigesetzt werden.
Acylierende Inhibitoren von Serinhydrolasen
146
Tab. 5.1-1 Hemmung der AChE (Electrophorus electricus) und der
Cholesterolesterase (Rind) durch Thieno[1,3]oxazin-4-one [55].
IC50 bzw. Ki Verbindung Strukturformel
AChE Cholesterolesterase
36
SN
OO CH3
NCH3
IC50
> 50 µM
Ki = 2.15
± 0.19 µM
37
SN
OO CH3
NCH3
N
IC50 = 0.89
± 0.02 µM
Ki = 1.70 ±
0.12 µM
Ki
> 50 µM
O
O
NRN
RNH
O
O
O
E
RN
R
NH
OH
O
ORN
R
+ H2O+ E-OH
- E-OH
1
2 - E-OH
I II III
1
2
1
2
Abb. 5.1-1 Umsetzung von 1,3-Oxazin-4-onen durch Serinhydrolasen nach einem Acylierungs-Deacylierungs-Mechanismus. Intermediär bildet sich ein Acylenzym aus, welches durch Wasser zum nativen Enzym und einer Harnstoffsäure gespalten wird.
Acylierende Inhibitoren von Serinhydrolasen
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0-5,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0 Compound 4 #194 [modified by Camino] UV_VIS_2mAU
min
3,839 - 20,965
WVL:267 nm
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0-5,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0 Compound 5 #180 [modified by Camino] UV_VIS_2mAU
min
2,937 - 5,408
WVL:267 nm
Abb.5.1-2 Chromatogramme von 36 (oben) und 37 (unten) jeweils bei 25 µM nach 3.5-stündiger Inkubation bei 25 °C in 100 mM Natriumphosphat-Puffer, 100 mM NaCl, pH 7.3 mit 3.33 U/mL AChE. Das Benzoxazinon 38 ist ein potenter Inhibitor der Serinproteasen Chymotrypsin und
Cathepsin G (Tabelle 5.1-2), der die Enzyme mit einer „slow-binding“-Kinetik hemmt
[121]. Es wurde bereits gezeigt, dass ein Analogon von 38, 2-Benzoylamino-4H-3,1-
benzoxazin-4-on, durch Chymotrypsin zu 3-Benzoylchinazolin-2,4(1H,3H)-dion
umgewandelt wird, wobei ein entsprechendes intermediäres Acyl-Enzym postuliert
wurde [122]. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte die Chymotrypsin-katalysierte
Umwandlung von 38 mit HPLC-analytischer Methode verfolgt werden. Auch in
diesem Fall wurde eine bedeutend höhere Enzymkonzentration (5 µg/mL) als bei der
Bestimmung der Hemmwirkung (0.1 µg/mL [121]) verwendet.
147
Acylierende Inhibitoren von Serinhydrolasen
148
Tab. 5.1-2 Hemmung von Serinproteasen durch 3,1-Benzoxazin-4-one.
Verbindung Strukturformel Ki
38 N
O
O
NH
CH3
O
Ki = 0.3 nMa
Ki = 0.98 nMb
39 NH
CH3 COOH
NH
O O
-
40 N
O
OCH3
NC6H5
CH3
Ki = 29 nMc
Ki = 49 nMd
41 OH
O
NHCH3
NC6H5
O
CH3
-
a humanes Cathepsin G [121], b Chymotrypsin (Rind) [121], c humane Chymase [123], d Chymotrypsin (Rind) [123]
HPLC Bedingungen für 38. Es wurde eine Reversed Phase (RP)-Säule eingesetzt.
Das Fließmittel setzte sich zusammen aus
Mobile Phase A: 50 mM Triethylammoniumacetat-Puffer, pH 7.0.
Mobile Phase B: 15 % mobiler Phase A und 85 % Acetonitril.
Es erfolgte eine Gradientenelution:
0 min 20 % B 80 % A
15 min 60 % B 40 % A
15 min bis 45min 60 % B 40 % A
45 min bis 47 min 20 % B 80 % A
47 min bis 50 min 20 % B 80 % A
Acylierende Inhibitoren von Serinhydrolasen
149
Die Flussrate betrug 1 mL/min, und die Detektion erfolgte bei 240 nm. Die
Retentionszeit für 38 unter den gewählten Reaktionsbedingungen betrug 21.7
Minuten.
Die Substanz 39 wurde als ein mögliches Produkt der Reaktionen von 38 vermutet.
Verbindung 39 wurde aus der Substanzbibliothek entnommen [122] und in die HPLC-
Analyse einbezogen. Ihr Rf-Wert betrug 11.3 Minuten. Sie konnte unter den
Produkten der enzymatischen wie auch der nicht-enzymatischen Reaktion gefunden
werden. Auf die Auswertung der Entstehung von 39 wurde verzichtet, weil noch
andere Produkte, u.a. möglicherweise durch Folgereaktionen von 39 gebildet,
detektiert wurden.
Die Konzentration von 38 wurde als Fläche unter der Kurve (AUC) gegen die Zeit
aufgetragen (Abbildung 5.1-3). Die Datenpunkte waren das Ergebnis einer Einfach-
bestimmung an zwei verschiedenen Tagen und wurden nach einem
Geschwindigkeitsgesetz 1. Ordnung ausgewertet. Es ergaben sich Geschwindig-
keitskonstanten von 0.004 min-1 und 0.011 min-1 in Abwesenheit bzw. Gegenwart von
Chymotrypsin. Demnach wird 38 durch Chymotrypsin deutlich schneller abgebaut als
unter den Bedingungen der nicht-enzymatischen Hydrolyse.
Dieses Resultat geht konform mit dem „slow-binding“-Verhalten von 38 und anderen
2-Alkoxy-, 2-Alkylamino- und 2-Benzoylamino-substituierten 3,1-Benzoxazin-4-onen,
die als acylierende Serinprotease-Inhibitoren charakterisiert wurden [121]. Für solche
acylierenden Hemmstoffe wurde in den Inhibitionassays mit Serinproteasen
typischerweise eine zeitabhängige Hemmung beobachtet [99,103]. Auf Grund des
Substrat-ähnlichen Umsatzes von 38 durch Chymotrypsin kann dieser Hemmstoff als
Alternativsubstrat-Inhibitor bezeichnet werden.
Acylierende Inhibitoren von Serinhydrolasen
150
Zeit (min)
0 60 120 180 240 300 360
AU
C (m
AU
*min
)
0
2
4
6
8
10
Abb. 5.1-3 Hydrolyse von Verbindung 38 (20 µM) in Abwesenheit ( ) und Gegenwart ( ) von Chymotrypsin (5 µg/mL). Die Reaktion erfolgte in 50 mM HEPES-Puffer, 500 mM NaCl, pH 7.0 in Anwesenheit von 4 % Acetonitril bei 25 °C.
Das Benzoxazinon 40 hemmte die humane Chymase und Chymotrypsin aus Rind,
jeweils mit einem Ki-Wert im nanomolaren Bereich (Tabelle 5.1-2). Diese Substanz
erzielte zwar keine Selektivität gegenüber einer der beiden Serinproteasen, nicht
desto trotz war es interessant, den enzymkatalysierten Umsatz des Hemmstoffes
mittels UV-Spektroskopie und HPLC näher zu untersuchen. Die Abbildung 5.1-4
zeigt in nacheinander aufgenommenen UV-Spektren die Reaktion von 40 mit Chymotrypsin. Das Enzym wurde in der 100-fach höheren Konzentration (25 µg/mL)
als im Assay eingesetzt. Es konnte somit gezeigt werden, dass die Substanz einer
Chymotrypsin-katalysierten Umwandlung unterlag, und es wurde vermutet, dass es
sich dabei um eine Acylierungs-Deacylierungs-Reaktion handelte (Abbildung 5.1-1).
Acylierende Inhibitoren von Serinhydrolasen
Abb. 5.1-4 Zyklische Spektren der Umsetzung von 40 (50 µM) durch Chymotrypsin (25 µg/mL) in 0.1 M Phosphat-Puffer, 0.1 M NaCl, pH 8.0 bei 25 °C. Die Spektren wurden in Intervallen von 90 Minuten aufgenommen. Der Pfeil zeigt das zuerst aufgenommene Spektrum. Um dieses Verhalten zu bestätigen, wurden zusätzlich HPLC-Experimente
durchgeführt. Die Substanz 40 wurde in Anwesenheit von Chymotrypsin (25 µg/mL)
und ohne Enzym inkubiert. Die ringoffene Verbindung 41 wurde separat injiziert, um
das Spaltprodukt der Umsetzung eindeutig zu charakterisieren.
HPLC Bedingungen für 40. Es wurde eine Reversed Phase (RP)-Säule eingesetzt.
Das Fließmittel setzte sich zusammen aus
Mobile Phase A: Wasser: Acetonitril: Trifluoressigsäure (450: 50: 0.3)
Mobile Phase B: Wasser: Acetonitril: Trifluoressigsäure (50: 450: 0.3).
Die Trifluoressigsäure (TFA) diente zur Protonierung der ringoffene Verbindung 41.
Es erfolgte eine Gradientenelution:
0 min 30 % B 70 % A
5 min 40 % B 60 % A
11 min bis 13 min 70 % B 30 % A
18 min bis 20 min 90 % B 10 % A
20 min bis 22 min 30 % B 70 % A
22 min bis 25 min 30 % B 70 % A
Die Flussrate betrug 1 mL/min, und die Detektion erfolgte an einem isosbestischen
Punkt bei 267 nm.
151
Acylierende Inhibitoren von Serinhydrolasen
152
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0-5,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0 Compound 6 #244 [modified by Camino] Compound 6 25µM UV_VIS_2mAU
min
0,573 - 11,994
7,601 - 14,816WVL:267 nm
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0-5,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0 Compound 6 #243 [modified by Camino] UV_VIS_2mAU
min
3,937 - 11,996
1,526 - 14,822
WVL:267 nm
Abb. 5.1-5 Chromatogramme von 40 (25µM) nach 3-stündiger Inkubation bei 25°C in 0.1 M Phosphatpuffer, 0.1 M NaCl, pH 8.0 ohne Chymotrypsin (oben) und mit 25 µg/mL Chymotrypsin (unten).
Acylierende Inhibitoren von Serinhydrolasen
Die Retentionszeiten für die Verbindungen 40 und 41 lagen bei 14.8 Minuten bzw.
bei 12.0 Minuten. Die Abbildung 5.1-5 (oben) zeigt das Chromatogramm nach drei
Stunden Inkubation des Benzoxazinons 40 in Abwesenheit von Chymotrypsin. Ein
wesentlich schnellerer Umsatz der Verbindung 40 wurde nach drei Stunden
Inkubation mit 25 µg/mL Chymotrypsin beobachtet (Abbildung 5.1-5, unten).
Die Ergebnisse der HPLC-Untersuchungen sind in den Abbildungen 5.1-6 und 5.1-7
zusammengestellt. Die erste Abbildung zeigt die Entstehung der ringoffenen
Verbindung 41 in An- und Abwesenheit von Chymotrypsin, während die zweite den
Abbau des Hemmstoffs darstellt.
Zeit (min) 0 200 400
AU
C (m
AU
*min
)
0
2
4
6
8
10
Abb. 5.1-6 Bildung der Verbindung 41 (25 µM) in Abwesenheit ( ) und Gegenwart ( ) von Chymotrypsin (25 µg/mL). Die Reaktion erfolgte in 0.1 M Phosphatpuffer, 0.1 M NaCl, pH 8.0 bei 25 °C.
153
Acylierende Inhibitoren von Serinhydrolasen
154
Zeit (min)0 100 200 300 400 500
AU
C (m
AU
*min
)
0
2
4
6
8
10
Abb. 5.1-7 Abbau der Verbindung 40 (25 µM) in Abwesenheit ( ) und Gegenwart ( ) von Chymotrypsin unter den in Abbildung 5.1-6 genannten Bedingungen. Zu den voranstehenden Abbildungen ist zu bemerken, dass die AUCs des
Benzoesäure-Derivates 41, vornehmlich in den Chromatogrammen nach 300
Minuten, zu niedrig ausfallen. Wie im Kapitel 4 diskutiert, sind möglicherweise
Absorptionsprozesse für dieses Verhalten verantwortlich. Trotzdem wird deutlich,
dass die enzymkatalysierte Umsetzung von 40 schneller als die Hydrolyse-Reaktion
verlief und dass sich die Benzoesäure 41 bei beiden Prozessen bildete.
5.2 Schlussfolgerungen
Chymotrypsin vermochte die Benzoxazinon-Hemmstoffe 38 und 40 umzusetzen.
Dieses Verhalten konnte mittels UV-Spektroskopie bzw. HPLC aufgeklärt werden.
Damit konnte der Mechanismus der Enzym-Inhibitor-Interaktion im Sinne eines
Acyltransfers (Abbildung 5.1-1) erhärtet werden. Ein kinetisches Modell für derartige
Alternativsubstrat-Inhibitoren wurde von Pietsch und Gütschow publiziert [120].
Die Thienooxazinone 36 und 37 wurden von der Acetylcholinesterase nicht
gespalten. Die Substanz 36 zeigte keine Aktivität gegenüber AChE, sie wird
demnach nicht im aktiven Zentrum gebunden und deshalb nicht umgesetzt. 37
hingegen hemmte das Enzym, verhielt sich jedoch nicht wie ein Substrat-ähnlicher
Inhibitor. Diese Verbindung wurde als Hemmstoff des gemischten Typs mit einem
Acylierende Inhibitoren von Serinhydrolasen
155
stärkeren unkompetitiven Anteil charakterisiert [55]. Wir vermuten, dass die Wirkung
von 37 auf den Benzyl-Rest am basischen Stickstoff zurückzuführen ist und dass der
Benzyl-Rest wie beim Donepezil [31] zum Grunde der Schlucht der AChE
ausgerichtet ist. Auf Wirkstoffstrukturen mit Benzyl-Substituenten an basischen
Stickstoffatomen wurde bereits in Kapitel 2 der vorliegenden Arbeit eingegangen.
Wenn der Benzyl-Rest von 37 aber zum Grunde der Schlucht hin ausgerichtet ist,
dann orientiert sich die spaltbare Lactonstruktur in Richtung Ausgang der Schlucht
und kann nicht vom aktiven Serin-Rest angegriffen werden.
Neben der Tatsache, dass unterschiedliche Enzyme bei den Untersuchungen
eingesetzt wurden (AChE für 36 und 37; Chymotrypsin für 38 und 40) ist zu
beachten, dass sich die heterocyclischen Verbindungen in ihrer intrinsischen
Reaktivität unterscheiden. Der Austausch des Benzolrings durch eine Thiophen-
Einheit in 36 und 37 erhöht die Elektronendichte an der Carbonyl-Struktur und
stabilisiert den Oxazinon-Ring (vgl. auch Kapitel 4). In unserem Arbeitskreis wurde
bereits über den Einfluss eines bioisosteren Benzen-Thiophen-Ersatzes auf die
Stabilität von anellierten 1,3-Oxazinonen berichtet [109]. Allerdings können
Thieno[1,3]oxazin-4-one von Serinhydrolasen gespalten werden und dann als
Alternativsubstrat-Inhibitoren fungieren. Dies wurde für die Hemmung von HLE [108-
109], Cathepsin G [124] und Cholesterolesterase [55,120,125] berichtet. Im Falle der
Acetylcholinesterase und der hier untersuchen Verbindungen 36 und 37 traf dies
jedoch nicht zu.
5.3 Experimenteller Teil Die UV-Spektren wurden mit einem UV/Vis-Spektrophotometer Cary 50 Bio (Varian)
mit Präzisionsquarzküvetten Suprasil (Hellma) aufgenommen. Acetylcholinesterase
aus Electrophorus electricus (1044 U/mg), Chymotrypsin (Rind), Acetonitril (HPLC-
Qualität) sowie Trifluoressigsäure (TFA) waren von Fluka (Deisenhofen,
Deutschland).
Die HPLC-Chromatogramme wurden an einem HPLC-Gerät der Firma Dionex
(Pumpensystem P580) mit UV-Detektor und mit einer Inertsil-Säule 5 µ C18 250 ×
4.60 mm aufgenommen. Die experimentellen Details sind in Kapitel 5.1 aufgeführt.
Isothiazole als AChE-Inhibitoren
6. Hemmung der AChE durch Isothiazol-Verbindungen
6.1 Synthesis von Isothiazol-3-yl-piperazinen und –morpholinen
Die in diesem Kapitel untersuchten Substanzen wurden von Dr. Janine Wolf aus dem
Arbeitskreis von Prof. Dr. B. Schulze, Institut für Organische Chemie der Universität
Leipzig, hergestellt. Die synthetischen Arbeiten betreffen Untersuchungen zur
Chemie von Isothiazolen. Es wurde gefunden, dass 2,4,5-Triarylisothiazolium-
Perchlorate (I) nach Reaktion mit sekundären Aminen eine Umwandlung zu
aminosubstituierten Isothiazol-Derivaten erfahren. Es wurde vermutet, dass die Salze
I in Anwesenheit von Kalium-tert.-butylat in Tetrahydrofuran zu den Carbenen II deprotoniert werden, die spontan mit Morpholin oder Piperidin zu IV reagieren
könnten [126]. DeHope et al. zeigten, dass die Carbene II nicht stabil sind und
deswegen nicht isoliert werden können. Sie isomerisieren zu 2-Imino-2H-thieten (III) [127]. Die Reaktion des Triphenyl-substituierten Imino-2H-thietes III (Ar = Ph) mit
Morpholin bei Raumtemperatur ergab nach Ringöffnung ein Thioketon [127], weshalb
die Umwandlung von I zu IV nicht über III erfolgt war. Außerdem wurde I (Ar = Ph)
mit dem Lithiumsalz von Morpholin behandelt, und es entstand IV [127]. Für die
Entstehung von IV aus I ergeben sich demnach zwei Möglichkeiten, die durch Basen
assistierte Addition der sekundären Amine oder einer Insertionsreaktion in die NH-
Bindung der sekundären Amine, durch die die kurzlebigen Carbene II abgefangen
werden könnten [126-128].
SNAr
Ar
Ar
SNAr
Ar
Ar
S
Ar
Ar
N Ar
SNAr
Ar
Ar
H NR2+
ClO4
-
I
**
II III IV Abb. 6.2-1 Vorstufen I, II und III zur Synthese von IV.
156
Isothiazole als AChE-Inhibitoren
Die in den Tabellen 6.2-1 bis 6.2-6 aufgeführten Isothiazole wurden durch Reaktion
entsprechender Isothiazolium-Perchlorate I mit Morpholin, Piperazin oder
monosubstituierten Piperazinen in Anwesenheit von Kalium-tert.-butylat in absolutem
THF erhalten [129]. Sie wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit als Hemmstoffe
der Acetylcholinesterase aus Electrophorus electricus untersucht.
6.2 Inhibitionsuntersuchungen an AChE
Die Hemmaktivität der Isothiazole wurde gegenüber AChE ermittelt, dafür wurde die
spektrophotometrische Methode nach Ellman [68] verwendet. Es wurde die
Konzentrationsänderung von Thiocholin, welches aus dem Substrat Acetylthiocholin
(ASCh) freigesetzt wird, vermessen. Zu diesen Zweck diente 5,5`-Dithio-bis(2-
nitrobenzoesäure) (DTNB) als chromogener Reaktionspartner. Die Messung erfolgte
bei 25°C und die Extinktionszunahme bei 412 nm wurde aufgenommen. Die Enzym-
Stammlösung (100 U/mL) wurde mit Assaypuffer (100 mM Natriumphosphatpuffer,
pH 7.3, 100 mM NaCl) verdünnt. Die Enzymkonzentration in der Küvette betrug
0.033 U/mL. Nach einer Vorinkubationszeit von 15 Minuten wurde die Reaktion durch
Zugabe von ASCh gestartet. Die Anstiege der linearen Verlaufskurven wurden
ermittelt. Sie sind steady-state Geschwindigkeiten, v, und wurden mit der
Reaktionsgeschwindigkeit in Abwesenheit des Inhibitors, v0, verglichen. Zuvor
wurden v und v0 um den Betrag der nichtenzymatischen Hydrolyse von ASCh
korrigiert. Es wurden prozentuale Geschwindigkeiten errechnet und v0 = 100 %
gesetzt. Die Geschwindigkeiten, v, wurden gegenüber der Inhibitorkonzentration, [I],
aufgetragen und durch nichtlinearen Regression nach Gl. 6.2-1 analysiert.
0
50
[I]1IC
vv =⎛ ⎞
+⎜ ⎟⎝ ⎠
(Gl. 6.2-1)
Wurde nur eine Inhibitorkonzentration eingesetzt, so wurde der IC50-Wert nach
Gleichung 6.2-2 berechnet.
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ −
=1
vv0
50[I]IC (Gl. 6.2-2)
157
Isothiazole als AChE-Inhibitoren
In den Tabellen 6.2-1 bis 6.2-6 sind die Strukturformeln der Isothiazole und ihre IC50-
Werte aufgeführt. Die Morpholino-Verbindung 42 (Tabelle 6.2-1) zeigte keine Aktivität
gegenüber AChE. Auch eine 4-Methyl- (43) oder eine 2,6-Difluor-Substitution (45)
verbesserten die Hemmeigenschaften nicht. Die 2-Nitro-substituierte Morpholino-
Verbindung 44 konnte nicht unter Assaybedingungen gelöst werden und wurde somit
nicht bestimmt.
Tab. 6.2-1 Hemmung der AChE durch Isothiazol-3-yl-morpholine
Verbindung Strukturformel IC50 (µM)
nach Doppelbestimmung
42
SN
N
O
H
Bei einer Inhibitorkonzentration
(25 µM)
> 100
43
SN
N
O
CH3H
Bei einer Inhibitorkonzentration
(25 µM)
> 100
44
SN
N
O
H
NO2
Nicht löslich
45
SN
N
O
F
F
H
Bei einer Inhibitorkonzentration
(25 µM)
> 100
158
Isothiazole als AChE-Inhibitoren
Ausgehend von 45 wurde eine 4-Methoxy-Gruppe in den Phenylring in Position 5 des
Isothiazols eingebracht. Die somit entstandene Substanz 46 (Tabelle 6.2-2) besaß
ebenfalls keine Aktivität. Wenn anstelle der zweifachen Fluor-Substitution in 45 aber
Chlor in denselben Positionen eingeführt wurde (47), ergab sich ein IC50-Wert von 31
µM. Eine zusätzliche 4-Methoxy-Gruppe im Phenylring in Position 5 des Isothiazols
führte zum Verlust der Aktivität (48). Wenn ein Chlor-Substituent von Position 6 auf 5
verschoben wurde, blieb die Wirksamkeit erhalten (47 versus 49).
Tab. 6.2-2 Hemmung der AChE durch Isothiazol-3-yl-morpholine
Verbindung Strukturformel IC50 (µM)
nach Doppelbestimmung
46
SN
N
O
F
F
MeO
H
Bei einer Inhibitorkonzentration
(25 µM)
> 100
47
SN
N
O
Cl
Cl
H
Bei einer Inhibitorkonzentration
(25 µM)
31
48
SN
N
O
Cl
Cl
MeO
H
Bei einer Inhibitorkonzentration
(25 µM)
> 100
49
SN
N
O
Cl
Cl
H
Bei einer Inhibitorkonzentration
(15 µM)
30
159
Isothiazole als AChE-Inhibitoren
So wie die Morpholino-Verbindung 42, zeigte auch das analoge Piperazin-Derivat 50
keine Wirkung (Tabelle 6.2-3). Ausgehend von 50 brachte die Einführung einer Nitro-
Gruppe in Position 2 (Verbindung 51) eine Hemmaktivität in niedrigen mikromolaren
Bereich.
Tab. 6.2-3 Hemmung der AChE durch Isothiazol-3-yl-piperazine.
Verbindung Strukturformel IC50 (µM)
nach Doppelbestimmung
50
SN
N
NH
H
Bei einer Inhibitorkonzentration
(25 µM)
> 100
51
SN
N
NH
H
NO2
Bei einer Inhibitorkonzentration
(25 µM)
16
Bei der Verbindung 52 (Tabelle 6.2-4) wurden an den Piperazinring zwei Isothiazol-
Strukturen mit demselben Substitutionsmuster eingeführt. Diese symmetrische
Substanz besaß eine schwache Aktivität gegenüber AChE. Die Hemmung des
Enzyms verstärkte sich etwas durch Halogenierung (53, 54), wobei die 2,6-Dichlor-
substituierte Verbindung 54 einen IC50-Wert von 16 µM aufwies.
160
Isothiazole als AChE-Inhibitoren
Tab. 6.2-4 Hemmung der AChE durch Isothiazol-3-yl-piperazine
Verbindung Strukturformel IC50 (µM)
nach Doppelbestimmung
52
SN
N
N
SN
H
H
Bei einer Inhibitorkonzentration
(10 µM)
61
53
SN
N
N
SN
H
H
F
FF
F
Bei einer Inhibitorkonzentration
(10 µM)
30
54
SN
N
N
SN
H
H
Cl
ClCl
Cl
Bei einer Inhibitorkonzentration
(10 µM)
16
In den Tabellen 6.2-5 und 5.2-6 sind unsymmetrisch substituierte Piperazin-Derivate
aufgeführt. Ausgehend von Verbindung 55 (Tabelle 6.2-5), die eine schwache
Aktivität hatte, wurde eine Nitro-Gruppe in Position 2 des 2-Phenylrings eingeführt.
Die resultierende Substanz 56 zeigte mit einem IC50-Wert von 10 µM eine stärkere
Enzymhemmung als 55. Wieder führte also eine 2-Nitro-Substitution im 2-Phenylring
zur Wirkungsverstärkung (vgl. Tabelle 6.2-3, 50 versus 51). Eine zweifache Fluor-
Substitution (57) führte nicht zur Aktivitätssteigerung im Vergleich zu 55.
161
Isothiazole als AChE-Inhibitoren
Tab. 6.2-5 Hemmung der AChE durch Isothiazol-3-yl-piperazine
Verbindung Strukturformel IC50 (µM)
nach Doppelbestimmung
55
SN
N
N
CF3
H
Bei einer Inhibitorkonzentration
(10 µM)
77
56
SN
N
N
CF3
H
NO2
Bei fünf verschiedenen Inhibitorkonzentrationen
(10, 20, 30, 40 und 50 µM)
10.1 ± 0.8
57
SN
N
N
CF3
F
H
F
Bei einer Inhibitorkonzentration
(10 µM)
56
Die Verbindung 58 (Tabelle 6.2-6) trägt einen 4-Methoxybenzyl-Rest am
Piperazinring, zusätzlich wieder eine 2-Nitro-Gruppe im 2-Phenylrest. Dies war die
wirksamste Substanz der Serie mit einem IC50-Wert von 7.58 µM. Die N-Benzyl-
Substitution an einem basischen Stickstoff kann man auch bei anderen potenten
Inhibitoren der AChE wie Donepezil [30] und AP2238 [27] finden. Aus einem
Vergleich von drei 2-Nitrophenyl-Derivaten, 59 versus 56 (Tabelle 6.2-5) versus 58,
kann geschlussfolgert werden, dass der voluminöse Diarylmethyl-Rest in 59 aus
162
Isothiazole als AChE-Inhibitoren
sterischen Gründen die Affinität zum Enzym verringert, da 56 und 58 mit kleineren
Substituenten wirksamer waren. Bei den beiden Diarylmethan-Derivaten erwies sich
erneut die Nitro-Substitution als vorteilhaft (59 versus 60).
Die Abbildungen 6.2-2 und 6.2-3 zeigen die Ermittlung der IC50-Werte der besten
Inhibitoren, 56 und 58, beide aus der Piperazin-Reihe.
Tab. 6.2-6 Hemmung der AChE durch Isothiazol-3-yl-piperazine
Verbindung Strukturformel IC50 (µM)
nach Doppelbestimmung
58
SN
N
N
OMe
H
NO2
Bei fünf verschiedenen Inhibitorkonzentrationen
(10, 20, 30, 40 und 50 µM)
7.58 ± 0.53
59
SN
N
N
F F
H
NO2
Bei einer Inhibitorkonzentration
(10 µM)
44
60
SN
N
N
F F
H
F
Bei einer Inhibitorkonzentration
(10 µM)
> 100
163
Isothiazole als AChE-Inhibitoren
[56] (µM)0 15 30 45 6
Enz
ymak
tivitä
t (%
)
0
20
40
60
80
100
120
0
Abb. 6.2-2 Inhibition der AChE durch Verbindung 56. Auftragung der relativen Geschwindigkeiten versus [56]. Die Geschwindigkeitswerte (in Prozent) waren Mittelwerte einer Doppelbestimmung bei einer Substratkonzentration von 500 µM. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit in Abwesenheit des Inhibitors gewertet. Eine nichtlineare Regression nach Gleichung 6.2-1 ergab IC50 = 10.1 ± 0.8 µM.
[58] (µM)0 15 30 45 6
Enz
ymak
tivitä
t (%
)
0
20
40
60
80
100
120
0
Abb. 6.2-3 Inhibition der AChE durch Verbindung 58. Der Assay wurde wie bei Abbildung 6.2-2 beschrieben durchgeführt, und es wurde ein IC50–Wert von 7.58 ± 0.53 µM erhalten.
164
Isothiazole als AChE-Inhibitoren
165
Die drei Substanzen 51, 56 und 58 besitzen eine 2-Nitrogruppe im 2-Phenylrest und
zwei unsubstituierte Phenylreste in 4- und 5-Position. Sie unterschieden sich nur
durch die Substitution am terminalen Piperazin-Stickstoff. Die unsubstituierte
Verbindung 51 zeigte mit einem IC50-Wert von 16 µM eine gute Aktivität gegenüber
der AChE. Die Einführung einer 4-Trifluormethyl-phenyl-Gruppe am Piperazin in 56
verbesserte die Hemmeigenschaften. Allerdings zeigte sich 58 mit einem 4-
Methoxybenzyl-Rest am Piperazin als der beste Inhibitor dieser Reihe. Wir vermuten
deshalb, dass ein basischer Stickstoff und ein hydrophober Substituent die Bindung
am Enzym begünstigen. Auf die Bedeutung dieses Strukturmotivs für die AChE-
Hemmung wurde bereits in den Kapiteln 2 und 3 hingewiesen. Donepezil, ein
zugelassener Inhibitor des gemischten Typs, übt eine π-π Interaktion zwischen dem
Indanonring und Trp279 (AChE aus Torpedo californica) in der PAS des Enzyms
aus, während der Benzylrest durch eine π-π Wechselwirkung mit Trp84 in der Basis
der tiefen Schlucht gebunden wird. Der positiv geladene Piperidin-Stickstoff von
Donepezil stabilisiert den Enzym-Inhibitor Komplex zusätzlich durch eine
elektrostatische Interaktion mit der negativ geladenen Carboxylat-Struktur von Asp72
[31]. Analog zu diesem Bindungsmodus könnte der 4-Methoxybenzyl-Rest und der
basische terminale Piperazin-Stickstoff in 58 mit Trp84 bzw. mit Asp72 interagieren.
Somit würde der Isothiazol-Anteil der Substanz in Richtung Ausgang der Schlucht
orientiert sein und die drei Aryl-Reste mit der PAS in Wechselwirkung treten können.
Es wäre interessant, weitere enzymkinetische Untersuchungen mit verschiedenen
Substrat-Konzentrationen durchzuführen, um den Mechanismus der Enzym-Inhibitor-
Interaktion weiter aufzuklären. Man könnte erwarten, dass sich 58 wie Donepezil
verhalten würde, nämlich als ein Inhibitor des gemischten Typs. Auch Molecular
Modelling Studien wären zu empfehlen, um die mögliche π-π Wechselwirkung der
drei sperrigen Aryl-Reste mit aromatischen Aminosäureseitenketten der PAS zu
beleuchten. Piazzi et al. führten Docking-Studien mit der Substanz AP2238 durch,
die ebenfalls einen Benzylrest an einem basischen Stickstoff besitzt. Dieser
orientierte sich zu dem Grunde der Schlucht, während die aromatische Cumarin-
Einheit mit Trp286 (humane AChE, entspricht Trp279 der AChE aus Torpedo
californica) interagierte [27]. In unserem Arbeitskreis wurden Gallamin-Tacrin-
Heterodimere synthetisiert, bei denen die Tacrin-Einheit zum aktiven Zentrum
ausrichtet ist, während zwei der drei quartären Stickstoffe der Gallamin-Einheit mit
Isothiazole als AChE-Inhibitoren
166
der PAS in Wechselwirkung treten [98]. Im Bezug auf Verbindung 58, könnte das
starre Gerüst mit den drei sperrigen Aryl-Resten mit dem Trp279 und eventuell auch
anderen Aminosäuren der PAS eine π-π Interaktion eingehen. Inhibitionsstudien mit
58 gegenüber Butyrylcholinesterase könnten weitere erste Indizien der
Wechselwirkung mit Trp279 liefern, da diese Aminosäure in Butyrylcholinesterase
durch Alanin ersetzt ist.
6.3 Experimenteller Teil Die spektrophotometrischen Assays erfolgten an einem Cary 50 Bio UV/Vis-
Spektrophotometer bzw. an einem Cary 100 Bio UV/Vis-Spektrophotometer der
Firma Varian, beide mit einem temperierbaren Küvettenhalter ausgestattet. Die
Proben wurden dabei durch die Thermostaten UC-5B bzw. F12-MP von Julabo
temperiert.
Acetylthiocholiniodid (ASCh), 5,5´-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB), wurden
von Sigma-Aldrich (Steinheim, Deutschland) bezogen. Acetylcholinesterase aus
Electrophorus electricus (1276 U/mg und 1025 U/mg) und Acetonitril waren von
Fluka (Deisenhofen, Deutschland). Zur Auswertung der kinetischen Daten wurde
Grafit v.5.0 (R.J. Leatherbarrow, Erithacus Software, Staines, Großbritanien, 2001)
verwendet.
AChE-Assay. Der Assay zur Ermittlung der Aktivität von AChE aus Electrophorus
electricus wurde bei 25 °C in 100 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7.3, mit 100 mM
NaCl durchgeführt. Das Produkt 2-Nitro-5-sulfidobenzoat wurde bei 412 nm
detektiert. DTNB lag in einer 7 mM Lösung in Assaypuffer und AChE als
Stammlösung 100 U/mL in Assaypuffer vor. In eine Küvette, welche 830 µL
temperierten Assaypuffers enthielt, wurden 50 µL Acetonitril, 10 µL einer Inhibitor-
Lösung (gelöst in Acetonitril) und 50 µL der DTNB-Lösung (7 mM in Assaypuffer)
pipettiert. Anschließend wurden 10 µL eisgekühlte Enzym-Lösung zugegeben,
wiederum gründlich gemischt und fünfzehn Minuten bei 25 °C inkubiert. Die
enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µL ASCh-Lösung (10 mM in
Assaypuffer) gestartet. Die Extinktionszunahme wurde über fünf Minuten verfolgt. Es
ergaben sich in der Küvette folgende Konzentrationen: 350 µM DTNB, 6 %
Acetonitril, 500 µM Substrat, 0.033 U/mL AChE. Bei der ungehemmten Reaktion
wurde anstelle der Inhibitor-Lösung Acetonitril zugegeben.
Isothiazol-3(2H)-on 1,1-Dioxide
167
7. Hemmung der humanen Leukocyten-Elastase durch Haloaryl-substituierte Isothiazol-3(2H)-on 1,1-Dioxide
7.1 Synthese von Isothiazol-3(2H)-on 1,1-Dioxiden
Die in diesem Kapitel untersuchten Substanzen wurden von Alexander Eifeld aus
dem Arbeitskreis von Prof. Dr. B. Schulze, Institut für Organische Chemie der
Universität Leipzig, hergestellt. Die synthetischen Arbeiten betreffen Untersuchungen
zur Chemie von Isothiazolen, die halogenierte aromatische Substituenten in Position
2 besitzen. Im ersten Syntheseschritt erfolgte eine Cyclokondensation der
Thiocyanate I mit den entsprechenden aromatischen Amine II-IV. Es ergaben sich
die Pyridinyl-substituierten Isothiazolium-Salze V und VI und die Pentafluoro-
Verbindung VII. Im zweiten Schritt wurden die Pyridinyl-Isothiazol-3(2H)-on 1,1-
Dioxide 61-66 und das Pentafluorophenyl-Derivat 67, nach 8-stündiger Oxidation von
V-VII mit Eisessig und Wasserstoffperoxid bei 80°C, isoliert. Diese einfache Zwei-
Schritt-Synthese erlaubte die Herstellung von Isothiazol-3(2H)-on 1,1-Dioxiden mit
mono- oder mehrfach halogenierten (meist fluorierten) aromatischen Substituenten in
Position 2 mit moderaten bis guten Ausbeuten.
Prinzipiell können in Position N-2 substituierte Saccharin-Derivaten nach N-
Alkylierung mit Alkylhalogeniden erhalten werden. Im Gegensatz dazu wurde vor
kurzem berichtet, dass die Mitsunobu-Reaktion mit Alkoholen die O-Alkylierung
favorisiert [130]. Die N-Arylierung von Saccharin wurde mit Triphenylbismut und
Kupferacetat in Anwesenheit von Pyridin oder Triethylamin erreicht [131]. 2-
Phenylsaccharin wurde ebenfalls durch N-Arylierung mit 2-Silylphenyltriflat in
Anwesenheit von Cäsiumfluorid erhalten [132]. Eine Arylierungsreaktion von 4,5,6,7-
Tetrahydrosaccharin [133] zu den entsprechenden Tetrahydro-Verbindungen wurde
bislang nicht publiziert. Ashe et al. untersuchten eine Serie von N-Aryl-Saccharinen
als Inhibitoren der humanen Leukocyten-Elastase (HLE) und Rinder-Chymotrypsin
[134]. Die besten inhibitorischen Eigenschaften gegenüber HLE erzielte das
Pentafluorophenyl-Saccharin (IC50-Wert = 3 µM). Dieses Ergebnis veranlasste die
Synthese und enzymkinetische Untersuchung der Tetrahydrosaccharine mit
Haloaryl-Einheit (61-64 und 67).
Isothiazol-3(2H)-on 1,1-Dioxide
168
Schema 7.1-1
R
R
CHO
NCS
N
R R
RNH2
N
NH2
FF
FF
NH2
FF
FF
F
N
R R
RNS
NF
F
FF
NS
R
R
NS
FF
F
FF
N
R R
RNS
O
OO
NF
F
FF
NS
R
R
O
OO
NS
FF
F
FF
O
OO
1
2 I
3 4
5
AcOH/HClO4
II
AcOH/HClO4
III
AcOH/HClO4
IV
3 4
5
+
AcOH/H2O2
V
ClO4-
+
1
2
ClO4-
AcOH/H2O2
VI
+
AcOH/H2O2
VII
ClO4-
3 4
51
2
61, R3 = R4 = H, R5 = Cl62, R3 = R4 = H, R5 = Br63, R3 = R4 = F, R5 = H
64, R1R2 = -(CH2)4-65, R1 = R2 = CH366, R1 = C6H5, R2 = CH3
67
Syntheseweg zu den Verbindungen 61-67.
Isothiazol-3(2H)-on 1,1-Dioxide
169
7.2 Inhibitionsuntersuchungen an humaner Leukozyten-Elastase, Acetylcholinesterase und Cholesterolesterase
Die Hemmaktivität der Isothiazole gegenüber humaner Leukocyten-Elastase (HLE)
wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ermittelt. Zusätzlich wurden zwei
verschiedene Serinesterasen, Acetylcholinesterase (AChE) und Cholesterolesterase
(CEase) in die spektrophotometrischen Inhibitionsstudien eingeschlossen, um die
Selektivität der Verbindungen zu untersuchen.
Über die Hemmaktivität von Isothiazol-3(2H)-on 1,1-Dioxiden wurde in der Literatur
schon berichtet. Zum Beispiel wurden Saccharin-Derivate mit einer Abgangsgruppe
in Position 2 als Enzym-aktivierte Inhibitoren der HLE beschrieben [135-137]. Hlasta
et al. synthetisierten Saccharin-Abkömmlinge als Hemmstoffe der HLE, die zusätzlich
zu der hervorragenden Hemmeigenschaft, eine gute Stabilität im Blut aufwiesen
[138-140].
Die IC50-Werte der Verbindungen 61-67 gegenüber HLE wurden bei 25 °C ermittelt.
Als Substrat fungierte MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-NHNp (Np: para-Nitrophenyl) in einer
Konzentration von 100 µM. Assaypuffer war 50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7.8,
mit 500 mM NaCl. Das Produkt para-Nitroanilin (pNA) wurde bei 405 nm quantifiziert.
Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität der AChE aus Electrophorus electricus
erfolgte bei 25 °C in 100 mM Natriumphosphat-Puffer, 100 mM NaCl, pH 7.3. Die
Konzentrationen von dem Substrat ASCh und von DTNB betrugen 500 µM bzw. 350
µM. Nach einer Vorinkubation über 15 Minuten bei 25 °C wurde das Produkt 2-Nitro-
5-sulfidobenzoat dazu bei 412 nm detektiert.
Bei dem Assay zur Ermittlung einer Hemmung von CEase aus Rinderpankreas
wurden das Substrat para-Nitrophenylbutyrat und Natriumtaurocholat in
Konzentrationen von 200 µM bzw. 6 mM eingesetzt. Die enzymatische Reaktion
wurde bei 25 °C durch Enzym-Zugabe gestartet und die Bildung des Produktes para-
Nitrophenolat bei 405 nm verfolgt.
Die Tabelle 7.2-1 zeigt die Ergebnisse der Inhibitionsassays.
Isothiazol-3(2H)-on 1,1-Dioxide
170
Die IC50-Werten der HLE-Hemmung durch 64 und 66 wurden durch nichtlineare
Regressionsanalyse gemäß Gleichung 7.2-1 erhalten,
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛+
=
50
0
IC[I]1
vv (Gl. 7.2-1)
wobei [I] die Inhibitor-Konzentration ist. Es wurden in Doppelbestimmungen fünf
verschiedene Inhibitor-Konzentrationen bei 64, neun verschiedene bei 66 verwendet.
Für die restlichen Verbindungen (61-63, 65 und 67) wurde der IC50-Wert nach der
Gleichung 7.2-2 abgeschätzt, dafür wurden bei einer Inhibitor-Konzentration (25 µM
oder 50 µM) Doppelbestimmungen durchgeführt.
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ −
=1
vv0
50[I]IC (Gl. 7.2-2)
Tab. 7.2-1 Hemmung von Serin-Hydrolasen durch Isothiazol-3(2H)-on 1,1-Dioxide.
IC50 ± SEM Verbindung
HLE AChE CEasea
61 >100 µM >100 µM >100 µM
62 >100 µM >100 µM >100 µM
63 >100 µM >100 µM >100 µM
64 2.3 ± 0.2 µM >100 µM >100 µM
65 >100 µM >100 µM >100 µM
66 33 ± 1 µM >100 µM >100 µM
67 >100 µM >100 µM >100 µM
a Die Messungen wurden von Stephanie Hautmann durchgeführt.
Isothiazol-3(2H)-on 1,1-Dioxide
Für die HLE-Hemmung erwies sich die Tetrafluorpyridin-4-yl-Substitution als
vorteilhaft verglichen mit der Pentafluorphenyl-Sustitution (64 versus 67). Die
konzentrationsabhängige Enzym-Inhibition von HLE durch Verbindung 64 ist in
Abbildung 7.2-1 dargestellt. Die Einführung anderer Halopyridinyl-Reste führte nicht
zur Enzym-Hemmung (61-63 versus 64). Darauf wurde der Tetrafluoropyridin-4-yl-
Rest beibehalten und die Tetramethylenkette in 64 durch eine Dimethyl- (65) oder
4-Phenyl-5-Methyl-Substitution (66) ersetzt. Diese Modifikationen erbrachten jedoch
nicht eine Aktivitätssteigerung gegenüber HLE.
Somit hemmte nur die Verbindung 64 die HLE in niedrig-mikromolaren Bereich und
zeigte Selektivität im Bezug auf die beiden Serinesterasen AChE und CEase, die
nicht inhibiert wurden. Aus diesen Ergebnissen lässt sich schließen, dass die
Tetrafluoropyridin-4-yl-Einheit erfolgversprechend in andere Strukturen von
potenziellen Inhibitoren von Serinproteasen eingeführt werden könnte.
[64] (µM)0 1 2 3 4 5
v (%
)
0
20
40
60
80
100
Abb. 7.2-1 Inhibition der HLE durch Verbindung 64. Auftragung der relativen Geschwindigkeiten versus [64]. Die Geschwindigkeitswerte (in Prozent) waren Mittelwerte einer Doppelbestimmung bei einer Substratkonzentration von 100 µM. Als 100 % Wert wurde die Geschwindigkeit in Abwesenheit des Inhibitors gewertet. Eine nichtlineare Regression nach Gl. 7.2-1 ergab IC50 = 2.3 ± 0.2 µM.
171
Isothiazol-3(2H)-on 1,1-Dioxide
172
7.3 Experimenteller Teil Die spektrophotometrischen Assays erfolgten an einem Cary 50 Bio UV/Vis-
Spektrophotometer bzw. an einem Cary 100 Bio UV/Vis-Spektrophotometer der
Firma Varian, beide mit einem temperierbaren Küvettenhalter ausgestattet. Die
Proben wurden dabei durch die Thermostaten UC-5B bzw. F12-MP von Julabo
temperiert.
HLE war von früheren Studien des Arbeitskreises verfügbar [108]. MeO-Suc-Ala-Ala-
Pro-Val-NHNp stammte von Bachem (Bubendorf, Schweiz). Acetylthiocholiniodid
(ASCh), 5,5´-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB), Cholesterolesterase (CEase)
aus Rinderpankreas, Natriumtaurocholat und para-Nitrophenylbutyrat wurden von
Sigma-Aldrich (Steinheim, Deutschland) bezogen. Acetylcholinesterase aus
Electrophorus electricus (1276 U/mg und 1025 U/mg), Acetonitril sowie getrocknetes
DMSO waren von Fluka (Deisenhofen, Deutschland). Zur Auswertung der
kinetischen Daten wurde Grafit v.5.0 (R.J. Leatherbarrow, Erithacus Software,
Staines, Großbritanien, 2001) verwendet.
HLE-Assay. Assaypuffer für die Bestimmung von HLE war Natriumphosphat-Puffer
50 mM, NaCl 500 mM, pH 7.8. Eine Stammlösung des Substrates MeO-Suc-Ala-Ala-
Pro-Val-NHNp wurde in DMSO bereitet und mit Assaypuffer verdünnt. Das Enzym lag als Stammlösung 50 µg/mL in 100 mM Natriumacetat/Essigsäure-Puffer pH 5.5
vor. Die Aliquote der Stammlösung wurden am Messtag im Eis aufgetaut. Die
Stammlösung wurde vor jede Messung 1:100 mit Assaypuffer verdünnt (5 µL + 495
µL). Es wurde die Extinktionszunahme über 10 Minuten bei 405 nm gemessen. Es
ergaben sich in der Küvette folgende Konzentrationen: 100 µM Substrat, 25 ng/mL
Elastase, 1.5 % DMSO und unterschiedliche Konzentrationen an Inhibitor. Das
Gesamtvolumen in der Küvette war 1 mL. Die ungehemmte Reaktion wurde in
gleicher Weise bestimmt, nur wurden anstelle der 10 µL Inhibitor-Lösung, 10 µL
DMSO zugegeben.
AChE-Assay. Der Assay wurde wie in Kapitel 6 beschrieben durchgeführt.
Isothiazol-3(2H)-on 1,1-Dioxide
173
CEase-Assay. Der Assaypuffer war 100 mM Natriumphosphat, 100 mM
Natriumchlorid, pH 7.0. Eine Stammlösung der CEase (2.44 mg/mL) in Assaypuffer
wurde vorbereitet und 1:20 verdünnt. Direkt vor Beginn der Messung wurde eine
1:122 Verdünnung bei 0 °C aufbewahrt. Natriumtaurocholat (12 mM) wurde in
Assaypuffer gelöst und bei 25 °C gelagert. Stammlösungen von den zu
untersuchenden Substanzen und von para-Nitrophenylbutyrat (20 mM) wurden in
Acetonitril bereitet. In eine Küvette, welche 430 µL temperierten Assaypuffers
enthielt, wurden nacheinander 500 µL Natriumtaurocholat-Lösung, 40 µL Acetonitril,
10 µL der para-Nitrophenylbutyrat-Stammlösung und 10 µL der Inhibitor-Lösung
zugegeben. Anschließend wurde fünf Minuten bei 25 °C inkubiert. Die enzymatische
Reaktion wurde durch Zugabe von 10 µL CEase (1 µg/mL) gestartet. Somit ergaben
sich folgende Endkonzentrationen, 200 µM para-Nitrophenylbutyrat, 6 mM
Natriumtaurocholat, 10 ng/mL CEase und 6 % Acetonitril. Die Extinktionszunahme
bei 405 nm wurde über 6 Minuten verfolgt.
Zusammenfassung
8. Zusammenfassung
Es war das Ziel der vorliegenden Arbeit, niedermoleklare Substanzen als Inhibitoren
von Serin-Hydrolasen zu charakterisieren. Im Zentrum der Untersuchungen standen
die Enzyme Acetylcholinesterase (AChE), Butyrylcholinesterase (BChE) und humane
Leukozyten-Elastase (HLE), die wichtige Targetstrukturen für die Entwicklung von
Arzneistoffen darstellen.
Mehrcyclische Thieno-Verbindungen. Im Screening fielen cyclische Amidine und
Guanidine als AChE-Inhibitoren auf. Es sollten deshalb Repräsentanten solcher
heterocyclischer Systeme synthetisiert und untersucht werden.
X S
N
NH
O
N
(CH2)n
7 X = CH2, n = 2 8 X = CH2, n = 3 9 X = N-Bn, n = 210 X = N-Bn, n = 3
X SN
NN
(CH2)n
11 X = CH2, n = 2 12 X = CH2, n = 313 X = N-Bn, n = 214 X = N-Bn, n = 3
Die Zielverbindungen 7-14 sind anellierte Thieno-Verbindungen mit cylischer
Guanidin- bzw. Amidin-Struktur. Für die Synthese von 7, 9 und 10 wurde der
entsprechende 2-Aminothiophen-3-carbonsäureethylester mit Phenylisothiocyanat
und nachfolgend mit Methyliodid zu dem jeweiligen 2-(Methylthio)-3-
phenylthieno[2,3-d]pyrimidin-4(3H)-on umgesetzt. Diese wurden mit Ethylendiamin
bzw. 1,3-Diaminopropan in einem Laborautoklaven zur Reaktion gebracht. Es erfolgt
zunächst ein nukleophiler Angriff des Amins auf den Kohlenstoff C2 und
Methylmercaptan wird abgespalten. Die weitere Reaktion verläuft wahrscheinlich
über einen intramolekularen nukleophilen Angriff der terminalen Aminogruppe auf die
Carbonylgruppe unter Ringerweiterung und schließlich über einen zweiten
intramolekularen Angriff unter Abspaltung von Anilin zu den Endprodukten 7, 9 und
10.
Die Kinetik der Hemmung von Acetylcholinesterase aus Electrophorus electricus
(EeAChE) und humaner Acetylcholinesterase (hAChE) wurde mittels
spektrophotometrischer Methode nach Ellman bestimmt. Beim Assay der humanen
Butyrylcholinesterase (hBChE) wurde Butyrylthiocholin an Stelle von Acetylthiocholin
(ASCh) als Substrat eingesetzt.
174
Zusammenfassung
Zur Bestimmung der IC50-Werte für EeAChE wurden die prozentualen
Geschwindigkeiten des enzymkatalysierten ASCh-Umsatzes gegenüber der
Inhibitorkonzentration aufgetragen. Dabei ergaben sich Kurven, die nicht
asymptotisch zur Abszisse verliefen, sondern eine Restaktivität (auch bei unendlich
hoher Inhibitorkonzentration) aufwiesen. Die erhaltenen Werte aus den Ellman-
Assays wurden mittels des Specific Velocity Plots analysiert. Dieser Plot sollte die
kinetischen Parameter Ki, αKi und β liefern. Die Verbindungen 9-14 zeigten moderate
inhibitorische Eigenschaften gegenüber der EeAChE (IC50-Werte: 1.35 - 3.09 µM).
Die Tatsache, dass für β ein Wert größer 0 gefunden wurde, bestätigt, dass der
ternäre ESI-Komplex das Produkt freisetzen kann. Wegen der Werte für Ki und αKi
sind die angular anellierten Verbindungen 11-14 Inhibitoren des gemischten Typs mit
einem stärker kompetitiven Anteil der Hemmung und die linear anellierten
Verbindungen 9 und ausgeprägt 10 Inhibitoren des gemischten Typs mit einem
stärker unkompetitiven Anteil. Das inhibitorische Potenzial der Substanzen
gegenüber den humanen Cholinesterasen hAChE und hBChE war geringer
ausgeprägt.
Für 9, 10, 13 und 14 wird ein ähnlicher Bindungsmodus wie für Donepezil, ein
zugelassener Inhibitor des gemischten Typs, diskutiert, denn sie besitzen ebenfalls
einen hydrophoben Substituenten an einem basischen Stickstoff.
Cholinesterase-Hemmung durch heterobivalente Tacrinabkömmlinge. Die
Verbindungen 15a-15i und 16a-16f mit einer 1,2,3,4-Tetrahydroacridin-Teilstruktur
wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit an Acetylcholinesterase aus
verschiedenen Spezies (Electrophorus electricus, Torpedo californica und Homo
sapiens) und humaner Butyrylcholinesterase untersucht. Die Verbindungen wurden
von Dr. Paul Elsinghorst, Universität Bonn, synthetisiert.
MeO
MeOOMe
NH
ONH
NH
O
N
m
n
OMe
NH
O
m
MeO
NH
NMeO
15b-i m = 0, n = 1-816b-f m = 2, n = 1-5
15a m = 016a m = 2
175
Zusammenfassung
Die heterodimeren Substanzen hemmten die o.g. Cholinesterasen im niedrigen
nanomolaren Bereich. Während für die AChE-Hemmung die Trimethoxybenzamid-
Verbindungen (15) den Trimethoxyphenylpropionsäureamid-Derivaten (16)
überlegen waren, wurde ein entgegengesetzter Trend für BChE aufgefunden.
Verbindung 15h und Tacrin wurden gegenüber EeAChE bei vier verschiedenen
Substratkonzentrationen gemessen und mittels Lineweaver-Burk Plot ausgewertet.
Aus dem α-Wert geht hervor, dass Tacrin das Enzym kompetitiv hemmt (α = 0.56).
Verbindung 15h (α = 1.16) ist ein Inhibitor des gemischten Typs.
Thieno[1,3]oxazin-4-one HLE-Inhibitoren. 3,1-Benzoxazin-4-one mit N-, O- und S-
Substitution in Position 2 wurden als Alternativsubstrat-Inhibitoren der humanen
Leukozyten-Elastase (HLE) beschrieben. In dieser Arbeit wurden 17 mehrcyclische
1,3-Oxazin-4-one als HLE-Inhibitoren charakterisiert. Die Verbindungen, bei denen
der Benzol-Ring gegen einen Thiophen-Ring ausgetauscht wurde und sich ein Alkyl-
oder Aryl-Rest in Position 2 befindet, wurden von Frau Dr. Anastasiya Rybak,
Universität Leipzig, synthetisiert. Die kinetischen Messungen beruhen auf der
spektrophotometrischen Bestimmung des Produktes para-Nitroanilin, das aus dem
chromogenen Substrat MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-NHNp enzymatisch freigesetzt
wird.
N
O
O
CH3
S
30
N
O
O
CH3
S
CH3
24
Bei der Verbindung 30 (IC50 = 4.1 µM) liegen mit dem Tetrahydrobenzoring und der
Ethyl-Gruppe für die HLE-Hemmung geeignete Teilstrukturen vor. Die HPLC wurde als Methode erwählt, um den Mechanismus der Inhibition näher zu
untersuchen. Dafür wurde die Verbindung 24 (IC50 = 8.8 µM) unter Assay-
bedingungen mit HLE versetzt, wobei die hundert- bzw. die zweihundertfache
Enzymkonzentration verwendet wurde. Parallel dazu wurde in Kontrollansätzen die
nicht-enzymatische Hydrolyse in Abwesenheit von HLE vermessen. Es konnte
gefolgert werden, dass 24 kein Alternativsubstrat des Enzyms ist, denn eine HLE-
katalysierte Umsetzung von 24 wurde nicht beobachtet.
176
Zusammenfassung
Isothiazole als AChE-Inhibitoren. Aus einer Reihe von Isothiazol-Verbindungen,
die von Dr. Janine Wolf, Universität Leipzig, hergestellt wurde, erwiesen sich 51 (IC50 = 16 µM), 56 (IC50 = 10 µM) und 58 (IC50 = 7.6 µM) als Hemmstoffe der EeAChE.
SN
N
NH
H
NO2
51
SN
N
N
CF3
H
NO2
56
SN
N
N
OMe
H
NO2
58
Den o.g. Substanzen sind die 2-Nitrogruppe im 2-Phenylrest und die beiden
unsubstituierten Phenylreste in 4- und 5-Position gemeinsam. Sie unterschieden sich
nur durch die Substitution am terminalen Piperazin-Stickstoff. Es wird vermutet, dass
bei 58 der basische Stickstoff und der hydrophobe Substituent die Bindung am
Enzym begünstigen. Analog zu dem Donepezil-Bindungsmodus könnten der
terminale Piperazin-Stickstoff und der 4-Methoxybenzyl-Rest mit den Aminosäuren
Trp84 bzw. mit Asp72 der AChE interagieren, und somit würden die drei Aryl-Reste
mit der peripheren Bindungsstelle des Enzyms in Wechselwirkung treten.
Isothiazol-3(2H)-on 1,1-Dioxide. Die Hemmaktivität von Haloaryl-substituierten
Isothiazol-Derivaten gegenüber HLE, EeAChE und Cholesterolesterase (CEase)
wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ermittelt. Die Substanzen wurden von
Alexander Eifeld, Universität Leipzig, bereitgestellt. Bei dem Assay zur Ermittlung
einer Hemmung von CEase aus Rinderpankreas wurden das chromogene Substrat
para-Nitrophenylbutyrat eingesetzt.
NF
F
FF
NS
O
OO
64
177
Zusammenfassung
178
Aus dieser Serie hemmte nur 64 die HLE (IC50 = 2.3 µM) und zeigte Selektivität im
Bezug auf die beiden Serinesterasen AChE und CEase, die nicht inhibiert wurden.
Aus diesen Ergebnissen lässt sich schließen, dass die Tetrafluoropyridin-4-yl-Einheit
erfolgversprechend in andere Strukturen von potenziellen Inhibitoren von
Serinproteasen eingeführt werden könnte.
Ein Teil der vorgestellten Ergebnisse sind in folgenden Arbeiten enthalten:
Elsinghorst, P.W.; González Tanarro, C.M.; Gütschow, M. Novel heterobivalent
tacrine derivatives as cholinesterase inhibitors with notable selectivity toward
butyrylcholinesterase. J. Med. Chem., 2006; 49, 7540-7544.
Wolf, J.; González Tanarro, C.M.; Gütschow, M.; Sieler , J. Schulze, B. Synthesis of
isothiazol-3-yl-morpholines and –piperazines and inhibitory activity towards
acetylcholinesterase. Helv. Chim. Acta, 2008, 91, 35-45.
Zakharova, V.M.; González Tanarro, C.M.; Gütschow, M.; Hennig, L.; Sieler, J.;
Schulze, B. Synthesis of N,N´-linked bisazaheterocycles with sulfonamide structure
via oxidation of S,N-heteroaromatic cations. Synthesis, 2008, 7, 1133-1141.
Eifeld, A.; González Tanarro, C.M.; Frizler, M.; Sieler, J.; Schulze, B.; Gütschow, M.
Synthesis and elastase-inhibiting activity of 2-pyridinyl-isothiazol-3(2H)-on 1,1-
dioxides. Bioorg. Med. Chem. in revision.
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Literaturverzeichnis
197
10. Abkürzungsverzeichnis
Aβ Amyloid-beta-Peptid
AChE Acetylcholinesterase
ADAM a disintegrin and metalloprotease
APP Amyloid-Präkursor-Protein
ARDS acute respiratory distress syndrom
ASCh Acetylthiocholin
Asp Aspartat
AUC area under curve
BChE Butyrylcholinesterase
Bn Benzyl
br breites Signal
CEase Cholesterolesterase
CMV Cytomegalovirus
COPD chronic obstructive pulmonary disease
DC Dünnschichtchromatographie
DMSO Dimethylsulfoxid
DTNB 5,5’-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure)
E Enzym
EeAChE Acetylcholinesterase aus Electrophorus electricus
et. al. et altera
EtOH Ethanol
fMLP N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin
Glu Glutaminsäure
GM-CSF granulocyte macrophage stimulating factor
hAChE humane Acetylcholinesterase
hBChE humane Butyrylcholinesterase
His Histidin
HLE humane Leukocyten-Elastase
HPLC high pressure liquid chromatography
HSE human sputum elastase
HSV Herpes simplex Virus
HSQC heteronuclear single quantum correlation
Literaturverzeichnis
198
Hz Hertz
I Inhibitor
IL Interleukin
Int. intercept
LC/ESI-MS Flüssigchromatographie und Elektrospray-Ionisation-
Massenspektrometrie
LPS Lipopolysaccharid
m Multiplett
MA Morbus Alzheimer
MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight
MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA
Methoxysuccinyl-Alanyl-Alanyl-Prolyl-Valin-para-Nitrophenylanilid
MMP Matrixmetalloproteinase
NADPH Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat
NMDA N-Methyl-D-Aspartat
NMR nuclear magnetic resonance
NOE nuclear Overhauser effect
Np para-Nitrophenyl
P Produkt
PAMBA-BBB parallel artificial membrane permeability assay for blood-brain
barrier
PAS peripheral anionic site
PDB protein data bank
Phe Phenyl
pNA para-Nitroanilin
POCl3 Phosphoroxidchlorid
ppm parts per million
ROS reactive oxygen species
s Singulett
S Substrat
Schmb. Schmelzbereich
SEM standard error of the mean
Ser Serin
SLPI secretase leukocyte proteinase inhibitor
Literaturverzeichnis
199
SOCl2 Thionylchlorid
t Triplett
TcAChE Acetylcholinesterase aus Torpedo californica
TFA Trifluoressigsäure
THF Tetrahydrofuran
Trp Tryptophan
Tyr Tyrosin
UV-Vis ultraviolet-visible
Val Valin
VCV Varicella zoster Virus
zentr. m zentriertes Multiplett
ZNS zentrales Nervensystem
Selbständigkeitserklärung
Hiermit erkläre ich ehrenwörtlich, die vorliegende Dissertation mit dem Thema
„Enzymkinetische Charakterisierung niedermolekularer Verbindungen als Inhibitoren
von Serinhydrolasen“ selbständig und ohne unerlaubte fremde Hilfe angefertigt zu
haben. Ich habe keine anderen als die im Literaturverzeichnis angeführten Quellen
benutzt und sämtliche Textstellen oder Bilder, die aus veröffentlichten Schriften
entnommen wurden, als solche kenntlich gemacht. Ebenfalls sind alle von anderen
Personen bereitgestellten Materialien, Daten oder erbrachte Dienstleistungen als
solche gekennzeichnet.
Ich erkläre außerdem, daß diese Dissertation weder in gleicher noch in anderer Form
bereits in einem anderen Prüfungsverfahren vorgelegen hat.
Bonn, den 02.05.2008
201
Danksagung
“In the depth of winter I finally learned that there was in me an invincible summer”
Albert Camus
An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit
beigetragen haben. Auch wenn ich unzählige Seite schreiben wurde, wurde ich nicht
meine tiefe Dankbarkeit zum Ausdruck bringen können.
Ich danke Prof. Dr. M. Gütschow, dass ich in der Zeit im seinem AK viel fürs Leben
gelernt habe.
Ich danke meinem gesamten Arbeitskreis für sämtliche Hilfestellungen. Insbesondere
danke ich Sonja und Angelika. Ihr habt eine spürbare Lücke im AK hinterlassen. Alle
Anfänge sind schwierig. Ich hatte das immense Glück, dass Sonja da war. Ich danke
dir, Sonja, für deine Fröhlichkeit, deine spontane Art und dein Optimismus. Ich danke
dir für die gemeinsamen Mittagspausen, wo du immer ein offenes Ohr für mich
hattest. Unfassbar, dass du so mutig warst und mit mir gefahren bist, direkt nach
dem ich den Führerschein bekam. Angelika war „definitiv“ eine richtige Bereicherung
unseres Arbeitskreises. Ich danke Angelika für ihre menschliche Wärme, für ihre
Einfühlsamkeit und für die angenehme Zusammenarbeit im Praktikum. Angelika, du
bist Mega-cool! Ich danke Stephi, weil sie so freundlich und herzlich ist, dass mit ihr
die Sonne im AK scheint. Ihr danke ich auch für die Hilfe bei der Messung der
Leipziger Verbindungen. Weiterhin möchte ich Paul für seine bedingungslose
Hilfsbereitschaft bei der Arbeit danken. Ich danke ihm auch für die Bereitstellung von
den im Kapitel 3 aufgeführten Verbindungen und für die Zusammenarbeit an der
gemeinsamen Publikation. Ich danke Jürgen für seine Hilfe im Synthese-Labor. Ich
danke Agnieszka und Manuela. Beide verbreiteten eine angenehme Atmosphäre im
AK und ich danke euch dafür. Und am Wochenende oder immer wo es spät bei der
Arbeit wurde, konnte ich auf der Gesellschaft von Reik zählen, danke. Ich danke
Mihiret für die Hilfe bei den Donepezil-AChE Interaktionsbildern. Ich danke dir, Ralf,
ganz herzlich für die tolle Zusammenarbeit und dafür, dass du mir stets in allen
kleinen und großen Problemen zur Seite gestanden hast. Mit dir hat das Praktikum
203
richtig Spaß gemacht! Astrid Maas möchte ich für die Zusammenarbeit bei der
Fraunhofer Gesellschaft danken. Ein Dankeschön an Meryem, mit der die Arbeit so
viel lustiger wurde. Ein besonderer Dank an Lenka für unsere gemeinsamen
Gespräche auf Spanisch. Sie hat mich in schwierigen Zeiten stets zugehört. Sie hat
mir zwei großartige Geschenke hinterlassen. Eins davon ist ihre Freundschaft.
Marion, Sabine und Annette sei der Dank für die Messung der NMR-Spektren.
Anastasya Rybak, Janine Wolf und Alexander Eifeld danke ich für die Synthese der
Verbindungen, die in Kapitel 4, 6 bzw. 7 aufgeführt wurden. Ich danke Valerjia M.
Zakharova für die Zusammenarbeit an der gemeinsamen Publikation. Des Weiteren
danke ich allen Mitarbeitern (auch ehemalige) des Pharmazeutischen Instituts.
Ich danke Dr. Jürgen Busch, dass er mir die Hand reichte und mir eine Stelle anbot
als mein Stipendium endete und ich am Verzweifeln war. Ohne dich hätte ich das
nicht geschafft. Meine lieben Kolleginnen des goldenen Horns, Wulla, Edith, Maria,
Agnes und Anne vielen Dank! Ihr seid ein tolles Team! Meine lieben Oliver und
Beate, ihr habt mich in eure Familie mit offenen Armen empfangen. Ihr habt mir eure
kleine Charlotte („la niña de mis ojos“) und eure Gwendolyn anvertraut. Ich erinnere
mich so gerne an den Nächte mit den Baby-phon und an unseren gemeinsamen
Abendessens mit Dr. Heiko Gamba, den besten Mitbewohner, den man haben kann.
Die Zeit in Klingelpütz werde ich nie vergessen. Ich liebe euch von Herzen! Ein
großer, besonderer und herzlicher DANK möchte ich an Wulla, Jorgos und Marina
aussprechen. Ihr seid mehr als Freunde. Wie soll ich euch danken? Wulla, ich hätte
mir nie eine bessere Schwester vorstellen können. Ich bin mit dir durch dick und
dünn gegangen. Ich hoffe, du weiß, dass das Gewissen, das du auf meiner Seite
warst, hat mir die Kraft gegeben, um weiter zu machen. Du warst stets da, in alle
Lebenslagen. Dir danke ich von tiefsten Herzen! Jorgos, ich weiß, ich bin eine
„spanische burra“ aber ich kann wahre Freundschaft erkennen. Danke, Jorgos dass
du mir so viel Vertrauen entgegen gebracht hast. Du hast stets an mir geglaubt, auch
wenn ich dabei war, der Glaube an mich selbst zu verlieren. Liebe Marina, du hast
mich immer aufgemuntert. Wir haben zusammen so vieles durch gestanden, unsere
gemeinsamen Gespräche, als wir über Gott und die Welt philosophiert haben, sind
mir richtig ans Herz gewachsen. Das Beste nach einem anstrengenden Tag, war das
Gefühl nach Hause zu kommen, wenn ich bei euch in der Alteburg war. A María por
ser mi amiga durante los últimos 13 años, porque has estado siempre ahí
incondicionalmente y porque sé que pase lo que pase, siempre seremos amigas.
204
Muchas gracias por todos tus consejos. Qué hubiera hecho sin ti en Alsatia, en la
Klingelpütz y hasta ahora! No sé cómo lo haces, pero al final, siempre tienes razón.
Muchas gracias Enrique, porque sé que te preocupas de mi como si fueras mi
hermano mayor. Crees que no me doy cuenta? Me ha dado la vida, en momentos de
estrés, el ir a verte a la Bodega. Gracias por estar siempre a mi lado, abrirme las
puertas de tu casa, por tantas cosas. Eres una persona especial y tu amistad me es
muy importante. Jeni, me acuerdo muchísimo de cuando bodegueábamos juntas, de
nuestras aventuras por la Uni de Bonn, de cuando éramos el trio lá, lá, lá, de cuando
contabas chistes verdes en el Arcadia. Cómo te echo de menos! Qué bien nos lo
hemos pasado! Gracias por escucharme y porque seguimos siendo amigas aunque
ya no vivas aquí. Ana, lo hemos conseguido! Este trabajo es tan mio como tuyo.
Muchísimas gracias porque me has apoyado en todas las circunstancias de mi vida,
porque has reido y llorado conmigo, por las llamadas de teléfono nocturnas, por esas
tardes de domingo en Rodenkirchen... Es un honor y un orgullo ser tu amiga. No he
conocido en mi vida una persona tan noble y tan entregada a su familia y amigos
como tú. De verdad que te admiro. Gracias por escucharme y comprenderme,
porque te sabes poner siempre en mi lugar, porque eres como eres. Muchísimas
gracias Sergio! Has sido un gran apoyo, no sé cómo lo hubiera conseguido sin ti. Sé
que no ha sido nada fácil estar a mi lado durante el doctorado. Te agradezco
infinitamente tu compresión, tu cariño, tus intentos de animarme cuando creía que ya
no podía más, tu sentido del humor... Este doctorado ha merecido la pena sólo por
el hecho de haberte conocido. No me puedo imaginar un compañero mejor para el
resto de mi vida. Gracias de corazón por quererme tanto!
De manera muy especial, dedico este trabajo a mi familia. Si soy lo que soy y estoy
donde estoy, se lo debo todo a mi familia. Cada persona escoge a sus amigos, pero
no a su familia. Yo os escogeria a vosotros una y mil veces! Habeís tenido una
paciencia increíble conmigo y habeís sido un apoyo incondicional. Por eso os lo
dedico, porque soís maravillosos. A mi abuela Ignacia, que ha sido una alegria en mi
vida. Después de vivir tantos años en el extranjero, me has hecho siempre sentir
como si no me hubiera ido nunca. Me gustaría que pudieras vivir conmigo este
momento. A mi padre que tuvo siempre una fe ciega en mi, que me animaba
siempre que me daba la “neura”, que me daba los mejores consejos y me
comprendia. Ojalá estuvieras aquí! Yo sé que este momento te haria más ilusión a ti
que a mí misma. A mi hermano Nacho, gracias, gracias y mil veces gracias! Porque
205
206
me has ayudado a poner los pies en el suelo, porque me has apoyado siempre,
porque has intentado inculcarme tu filosofia de vida, que me ha ayudado siempre
tanto. Gracias por dejarme ver el mundo con tus ojos. A mi madre que me conoce
mejor que nadie en este mundo, la quiero dar especialmente las gracias. Eres la
mejor! Si me he sentido abatida, siempre he pensado en ti. Gracias, eres una madre
excepcional y nos has antepuesto a Nacho y a mi ante todo. Eres un ejemplo de
entrega y dedicación. Saber que estás ahí, me hace sentir que no estoy sola.
Aunque estamos a 2000 km de distancia, te siento muy cerca de mi. Gracias por
todo lo que has hecho y haces por mi, porque eres una luchadora y la persona más
optimista y valiente que pueda haber conocido. Esto va por tí! GRACIAS MAMÀ!!
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