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Tierartenspezifische Analytik in
Futtermitteln – Rechtlicher Hintergrund
und aktueller Stand
Dr. Jutta Zagon
Abteilung 5 Lebensmittelsicherheit
NRL für tierisches Protein in Futtermitteln
Karlsruher Futtermitteltag – 25.06.2013 Seite 2
Standorte
Das BfR verfügt über
Standorte in:
Berlin-Jungfernheide
Berlin-Marienfelde
Alt-Marienfelde / Versuchsgut
Page 3 Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013
NRL für tierisches Protein in Futtermitteln
- Mikroskopische Analyse / LVU Institut für
Futtermitteluntersuchung
Oldenburg, Dr. Michael Egert
- PCR
- Immunologische Verfahren
- Massenspektroskopie / GC / LC
- Methodenentwicklung & Validierung
Externe
Kooperation
Standort Jungfernheide, Berlin
Abteilung 5, Prof. Dr. Dr. A. Lampen
Lebensmittelsicherheit
Karlsruher Futtermitteltag – 25.06.2013 Seite 4
Bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) Chronologie einer Pandemie
Erster Fall UK
> 180.000 infizierte Rinder in 25 Ländern *
* Inklusive USA, Canada
1986 2007 2000-2002
Erste Fälle DE
Keine neuen Fälle DE
Seit 2010
http://www.oie.int/animal-health-in-the-world/bse-specific-data/
Stand: 28. März 2013
2001 “TSE-Verordnung” VO (EG) Nr. 999/2001
27. Juni 1994 Verf.verbot an Wiederkäuer 94/381/EG
1992
> 35.000 Fälle UK
2012
3 Fälle UK
Page 5 Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013
Verfütterungsverbot - gesetzlicher Hintergrund
VO (EG) No. 999/2001
„TSE-Verordnung“
Verfütterungsverbot für
tierisches Protein an
Wiederkäuer / verarbeitetes
tierisches Protein (VTP) an
andere Nutztiere als
Wiederkäuer außer Pelztiere
VO (EG) No. 1069/2009
„Hygiene-VO für
tierische Nebenprodukte“
„Kannibalismus-Bann“
Page 6 Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013
Ausnahmen für Einzel- und Mischfuttermittel
Wiederkäuer Nicht-
Wiederkäuer
außer
Fische
Aquakultur
Eier, Eiprodukte, Milch,
Milcherzeugnisse, KolostrumZ Z Z
Hydrolysierte Proteine von Nicht-
Wiederkäuern oder aus Häuten und
Fellen von Wiederkäuern
Z Z Z
Nicht-Wiederkäuer-Kollagen u.
GelatineZ Z Z
Pflanzl. Produkte mit geringen
Kontaminationen an
Knochensplittern
Z Z Z
Fischmehl (a. i. Milchaustauscher) NZ / Z Z Z
Di- und Tricalciumphosphat
tierischen UrsprungsNZ Z Z
Blutprodukte von Nicht-
WiederkäuernNZ Z Z
Verarbeitetes Protein (VTP) von
Nicht-Wiederkäuern NZ NZ Z
Nutztiere außer PelztiereVorgeschriebene
Produktionsweise/
getrennte
Produktionsstrecken
ab. 1. Juni 2013
VO (EG) Nr. 56/2013
Page 7 Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013
Tierarten/gruppen-spezifische Analytik erforderlich!
VO (EG) Nr. 56/2013
VTP von Nichtwiederkäuern in
der Aquakultur wieder erlaubt
Ruminantennachweis erforderlich ab
1. Juni 2013
Zukünftige Lockerungen?
VTP von Geflügel an Schweine (v.v.)?
Nur möglich wenn validierte
Nachweismethoden vorliegen!
„Lifting the
Feedban“
Zweite EU-
TSE-Roadmap
Ausschließlich VTP der Kategorie 3
Rückverfolgbarkeit muss gesichert sein über
tierart-spezifische Methoden (PCR)
Keine Intraspezies-Verfütterung („Kannibalismus“)
Strikt getrennte Produktionsstrecken
Page 8 Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013
Gesetzlich vorgeschriebene Analytik
Mikroskopie
und
PCR
VO (EG) Nr. 51/2013
vom 16. Januar 2013
(Änderung des Anhang VI der
VO (EG) Nr. 152/2009)
Page 9 Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013
• Nur noch qualitative Methode, LOD ≤ 0,1 % (VTP) w/w
Mikroskopiemethode gemäß VO 152/2009
- letztmalig verändert durch VO 51/2013 -
• Färbung (z.B. Horn, Haare, Knochen) optional
• Positives Ergebnis bei ≥ 5 tierischen Partikeln
• Methode detailliert in VO beschrieben
• Zusätzliche SOPs auf Webseite EURL-AP veröffentlicht
Page 10 Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013
Exponentielle Amplifikation:
21 = 2 Kopien 22 = 4 Kopien 23 = 8 Kopien 24 = 16 Kopien 235 = 34 Mrd. Kopien
Zielsequenz
35-50
Zyklen Zyklus 2 Zyklus 4 Zyklus 3 Zyklus 1
Real-Time PCR – Eine Zielsequenz wird amplifiziert
Page 11 Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013
1. Denaturierung (95 °C)
2. Primer- und Sondenanlagerung (60 °C)
3. Verlängerung mit Verdrängung der Sonde (Elongation)
4. Exonukleaseaktivität schneidet Sonde (60 °C)
Fluoreszenz
TaqManTM-Technologie
Page 12 Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013
Offizielle PCR-Methode zum Ruminantennachweis
• SOP verknüpft mit VO (EG) Nr. 51/2013
- Legal Sources and SOPs“ - http://eurl.craw.eu/ -
• Redundante Zielsequenz (SINE-Fragment) ~ 200.000 cp / Zelle
LOD ≤ 0,1 % (VTP) w/w
• Plasmidstandards zur „Cut-off“-Bestimmung sind auf Anfrage vom
EURL-AP beziehbar!
• Gefahr von Kreuzkontaminationen! Bestimmung eines „Cut-off“-Wertes
notwendig!
• Extraktionsmethode vorgeschrieben (Wizzard)
Page 13 Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013
• Teilnehmer: 26 NRLs davon verwertbare Ergebnisse aus 21 Laboren
• 76.2 % der Labore: alle Analysen korrekt; kein Problem mit DNAs
• 23.8 % der Labore (5/21) lieferten falsch-positives Ergebnis mit 1 %
Schwein-VTP-Probe (Matrixprobe)
Ruminanten-PCR im „Implementation
Test“ - 2012 (EURL-AP)
• 4 Matrixproben: 3 x 0.1 % w/w entweder Schaf oder Rind-VTP
1 x 1 % w/w Schwein-VTP in Pflanzenmatrix
• 6 DNA-Extrakte: 4 x 0.1-0.2 % w/w entweder Schaf oder Rind-VTP
1 x 1 % oder 5 % w/w Schwein-VTP in Pflanzen-DNA
1 x Blank – 100% Pflanzenextrakt
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• Final Report – Mai 2013
Erste Laborvergleichsuntersuchung (LVU)
2013 – Ruminanten-PCR
• Teilnehmer: 27 NRLs – Deadline 5. April 2013
• 4 Matrixproben – 2 x 0.1 % w/w TVP-Rind (137 oC) in „Aquafeed“
2 x „Aquafeed“ frei von Ruminanten-TVP
1 Zusatzprobe 0.1 % w/w TVP-Schaf oder
0.1 % w/w TVP-Schwein in Pflanzenmatrix
• 92.5 % (25/27) der Labore: alle 4 Matrixproben korrekt
• 81.5 % (22/27) der Labore: alle 5 Proben (4 + 1 Zusatzprobe) korrekt
• 0.7 % falsch negative Befunde
• Problemprobe 0.1 w/w TVP-Schwein: 3/11 Laboren falsch pos. Ergebnis
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• Performance ist gut
Schlussfolgerungen EURL-AP – LVU PCR 2013
• Methode ist in den NRLs etabliert
• Falsch-positive Ergebnisse sind möglicherweise auf
Kontaminationen in den Laboren zurückzuführen
• Falsche Ergebnisse durch:
- Abweichungen vom Protokoll (speziell bei Cut-off-Bestimmung)
- mangelnde Homogenisierung der Proben
- unpassender Thermocycler (Glaskapillaren)
- Cut-off-Bestimmung war nicht auswertbar
Page 16 Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013
Vorgehensweise bei der
Untersuchung von
Futtermitteln für die Aquakultur
Page 18 Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013
EURL-SOP „Operational Schemes for the combination of
light microscopy and PCR“
No further analysis
Feed or feed material
for aquaculture and
fur animals
Is the feed or feed
material intended to
fur animals
Is the feed or feed
material known to
contain terrestrial
PAP
PCR Light microscopy
Further analysis
required (under
validation by EURL-AP)
Detection of particles from
terrestrial origin?
No prohibited
consituents of
terrestrial origin
detected
Presence of DNA?
-
-
-
-
+
+
+ +
Prohibited constituents
of terrestrial animals
detected
Page 19 Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013
Kombination Mikroskopie – PCR?
Fluorescence in situ hybridization (FISH)
- Knochensplitter sedimentieren
- Probe erhitzen – DNA denaturieren
- Einzelsträngige DNA +
- Fluoreszenzmarkierte Sonde
- Visueller artspezifischer Nachweis
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Alternativen zur PCR
• Immunologische Verfahren?
- Selektivitäts- und Sensitivitätsprobleme
- „Proprietary Methods“ – nicht mehr gewünscht
als Standardmethoden
• Massenspektroskopische Verfahren?
- Noch keine Ringversuchsdaten
- Apparativ aufwendig
- Mit hitzestabilen Markern aber zukünftiges Potential
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Rindermehl (145 oC) Geflügelmehl
Fischmehl Schweinemehl
Identifizierung hitzestabiler Proteine
2-D-Gelelektrophorese
Rindfleisch 100 oC
Page 22 Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013
Neue hitzestabile Markerproteine –
das Knochenprotein Osteocalcin (OC)
1 10 20 30 40 49
17 21 24
Posttranslationale
Carboxylierung
Artspezifischer
Bereich
Gla Gla Gla
• Stabiles Knochenprotein, in fossilen Knochen (Neandertaler) nachweisbar
Artspezifischer
Bereich
• MALDI-TOF/HR-Q-TOF/MS : Schwein und Rind: spezifischer Nachweis in
Fleisch-/Knochenmehlen möglich (Balizs et al., 2011)
• Immunologischer Nachweis von Rind in FKM (145 oC) möglich (Kreuz et al., 2012)
Karlsruher Futtermitteltag – 25.06.2013 Seite 23
Peptidliganden statt Antikörper – Selektion durch Phage-Display
Phage Display über Panning-Runden
M13 Phagenpartikel
Phage display mit kommerziellen Bibliotheken Phage libraries: Ph.D.-7, Ph.D.-12 (New England Biolabs) Bsp. für Zielmoleküle: Osteocalcin, Fibrinopeptide B, MBM* Rindspezifisch
* Meat and bone meal
Page 24 Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013
Identifizierung von VTP-Markerproteinen, z.B.
☞ Bovines Osteocalcin ☞ Bovines Fibrinopeptide B ☞ Bovines Troponin
Vorarbeit
Vorteil: Keine Antikörper notwendig
Phage Display
Ziel
Selektion und Identifizierung von hoch-affinen Peptidbindern
Entwicklung einfacher Assays, ähnlich ELISA
Page 25 Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013
Aptamere - neue Wege in der Analytik
Einzelsträngige DNA- oder RNA-Oligonukleotide
Dreidimensionale Struktur → hochaffine und spezifische Bindung von
Targetmolekülen
Zahlreiche Targetmoleküle:
– Ionen
– Nukleotide, Oligonukleotide, Nukleinsäuren
– organische Farbstoffe
– Cofaktoren
– Glykoproteine
– Kohlenhydrat
– Aminosäuren, Peptide, Proteine
– Antibiotika
– Viren
– ganze Zellen
Struktur eines Aptamers
gegen humanes Thrombin
(nach Bock, 1992)
Page 26 Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013
Aptamer-basierter Thrombinnachweis in sprühgetrocknetem Plasma
Thrombin
– Serinprotease des Gerinnungssystems im Blutplasma
– spaltet Fibrinogen zu Fibrin
– inaktive Vorstufe: Prothrombin
Aptamer gegen humanes Thrombin von Bock et al. (1992)
– DNA-Sequenz 5´-GGTTGGTGTGGTTGG-3´
– Kombiniert mit einem Rinder-Thrombin/Prothrombin-AK
– Aufbau eines Sandwich-ELONA
Sandwich-ELONA:
• 15-mer DNA-Aptamer (Bock, 1992),
biotinyliert/auf Strep-Platte gebunden
• bovines Thrombin/Plasma
• sheep anti-Thrombin (HRP)
Page 27 Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013
Aptamere sind für ihr Target sehr spezifisch und weisen es mit hoher
Empfindlichkeit nach
– Thrombin: 10 ng/ml
– Prothrombin: 20 ng/ml (Einsatz von Faktor Xa erforderlich)
Sprühgetrocknetes bovines Plasma
– erfolgreiche rindspezifische Detektion im Sandwich-ELONA möglich
– Prinzipielle Eignung gezeigt
Blutmehl
– vom eingesetzten Thrombin-Aptamer nicht „erkannt“ (Prozessierungsgrad!)
Ausblick und Ziele
– Gezielte Herstellung von Aptameren gegen prozessierte Proteine
– Aufbau von kommerziell unabhängigen Nachweissystemen
– Einsatz z.B. in der Biosensor-Technik
Ausblick
Karlsruher Futtermitteltag – 25.06.2013 Seite 28
Fazit
• PCR-basierte Methoden werden auch zukünftig vorrangig entwickelt und eingesetzt
- Geflügel-spezifische und Schwein-spezifische Systeme in der
Validierung (EURL-AP)
• Kombination Mikroskopie/PCR (FisH)? - unter Validierung (EURL-AP)
• Spektroskopische Methoden auf dem Vormarsch aber noch
nicht ausgereift – zukünftige Rolle noch nicht absehbar
• Einsatz immunologischer Methoden oder Ersatzmethoden zu
Antikörpern wird von deren Sensitivität , Spezifität , Herstellbarkeit
abhängen. Validierte kommerzielle Kits erreichten die Sensitivität
von 0.1 % w/w nicht.
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