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Dominik Eisenbarth
Vom Fachbereich VI
(Geographie / Geowissenschaften)
der Universität Trier
zur Verleihung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
genehmigte Dissertation
Genetische Untersuchungen zur Fortpflanzungsstrategie von
Microtus arvalis und ihre genetische Variabilität auf unterschiedlich
genutzten Flächen
Betreuender: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Paul Müller
Berichterstattender: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Paul Müller
Berichterstattender: PD Dr. Martin Paulus
Datum der wissenschaftlichen Aussprache:
11.02.2003
Trier 2003
Inhaltsverzeichniss I
1. Einleitung ................................................................................................................. 1
2. Untersuchungsgebiete ......................................................................................... 9
2.1 Beschreibung des Untersuchungsgebietes Wahlen ............................. 9
2.1.1 Klima und Witterung in Wahlen ............................................................. 10
2.2 Beschreibung des Untersuchungsgebietes Herl .................................. 11
2.2.1 Klima und Witterung ............................................................................ 13
3. Verbreitung und Ökologie .......................................................................... 15
3.1 Systematik ........................................................................................... 15
3.2 Verbreitung .......................................................................................... 15
3.3 Morphologie und Artdifferenzierung ..................................................... 17
3.4 Ökologie ............................................................................................... 19
4. Material und Methoden ...................................................................................... 21
4.1 Material ......................................................................................................... 21
4.1.1 Puffer und Lösungen für Multilocus-
DNA Fingerprinting und RAPD-PCR
............................................................
21
4.1.2 Enzyme und Längenstandards für
Multilocus-DNA Fingerprinting und RAPD-PCR
...................................................
24
Inhaltsverzeichniss II
4.1.3 Primer für RAPD-PCR ................................................................................. 24
4.1.4 Geräte und Sonstiges für Multilocus-
DNA Fingerprinting und RAPD-PCR
..........................................................
25
4.2 Probenahme und Probenmaterial ............................................................. 27
4.3 Methode des DNA - Fingerprinting ........................................................... 28
4.3.1 DNA Isolierung ............................................................................................ 28
4.3.2 Probegel ...................................................................................................... 29
4.3.3 Bestimmung der Konzentration und
der Reinheit der DNA - Stammlösung
............................................................
29
4.3.4 Restriktionsverdau ....................................................................................... 30
4.3.5 Submarine - Agarose - Gelelektrophorese .................................................. 31
4.3.6 Vakuum Blotting .......................................................................................... 31
4.3.7 Prähybridisierung ......................................................................................... 33
4.3.8 Hybridisierung und Blocking ........................................................................ 33
4.3.9 DIG-Antikörperbehandlung
und Immunologische Detektion
..........................................................................
34
4.4 RAPD-PCR ................................................................................................... 35
4.5 Statistische Auswertung ............................................................................. 36
4.5.1 Anzahl der Banden ...................................................................................... 36
Inhaltsverzeichniss III
4.5.2 Berechnung der Bandsharing-Rate
(BSR) bzw. der mittleren Wahrscheinlichkeit
für eine übereinstimmende Bande
.......................................................
37
4.5.3 Wahrscheinlichkeit Pi, dass
zwei Fingerprints identisch sind
.........................................................................
37
4.5.4 Wahrscheinlichkeit Pg, dass Individuum x
die gleichen Banden aufweist wie Individuum y
..................................................
38
4.5.5 Berechnung des Verwandtschaftkoeffizienten ............................................ 38
4.5.6 Populationsdifferenzierung .......................................................................... 39
4.5.7 Genetische Distanz zwischen Populationen ................................................ 39
4.5.8 Durchschnittliche Allelfrequenz q für eine Bande ........................................ 40
4.5.9 Mittlere zu erwartende Wahrscheinlichkeit,
dass ein Individuum mit seinen Nachkommen
eine gemeinsame Bande hat.
.................................................
40
4.5.10 Mittlere zu erwartende Wahrscheinlichkeit,
dass eine Bande zwischen zwei Vollgeschwistern
übereinstimmt
..............................................
41
5. Ergebnisse und deren Diskussion ................................................................... 42
5.1 Fangmethodik .............................................................................................. 42
5.2 DNA-Isolierung ............................................................................................ 45
5.3 Restriktionsverdau und Fluoreszenzfärbung ........................................... 47
Inhaltsverzeichniss IV
5.4 Auswahl der Species-
Enzym-Sonden Kombination
............................................................................
51
5.5 Somatische Stabilität und
Reproduzierbarkeit der Fingerprints
................................................................
54
5.6 Untersuchungen von Feldmäusen mit
nicht bekanntem Verwandtschaftsgrad an
einem Standort
.....................................................
56
5.6.1 Standort: Zill ................................................................................................. 56
5.6.2 Standort: Hohberg ....................................................................................... 57
5.6.3 Standort: Herl-Brache .................................................................................. 58
5.6.4 Standort: Knospenhof .................................................................................. 59
5.6.5 Standort: Eiden ............................................................................................ 60
5.7 Individualisierungspotential ........................................................................ 62
5.8 Populationsgenetische Aussagen
über Feldmäuse mit nicht bekanntem
Verwandtschaftsgrad
.............................................................
63
5.9 Untersuchung von Feldmäusen
mit bekanntem Verwandtschaftsgrad
..............................................................
70
5.9.1 Mutter ma und ihre Nachkommen a1-a5 ..................................................... 71
5.9.2 Mutter mb und ihre Nachkommen b1-b4 ..................................................... 72
5.9.3 Mutter mc und ihre Nachkommen c1-c3 ...................................................... 74
Inhaltsverzeichniss V
5.9.4 Mutter md und ihre Nachkommen d1-d6 ..................................................... 75
5.9.5 Mutter me und ihre Nachkommen e1-e6 ..................................................... 77
5.9.6 Mutter mf und ihre Nachkommen f1-f4 ........................................................ 78
5.9.7 Aussagen über Reproduktionsstrategien
anhand der erhobenen Fingerprintdaten
....................................................
80
5.10 RAPD-PCR (Williams et al.1990) ............................................................ 83
5.10.1 Artdifferenzierung ...................................................................................... 83
5.10.2 Populationsdifferenzierung ........................................................................ 84
6. Zusammenfassung .............................................................................. 87
7. Danksagung ......................................................................................... 90
8. Literaturverzeichnis ............................................................................. 91
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis VI
Abblidungen:
Abb.1: Schematische Darstellung des Verlaufs des
nichtradioaktiv markierten DNA-Fingerprinting
...........................................
5
Abb.2: Arbeitsschritte der PCR ..................................................................................... 7
Abb.3: Untersuchungsfläche Wahlen Zill 2 ................................................................. 9
Abb.4: Untersuchungsfläche Wahlen Hohberg ........................................................... 9
Abb.5: Lage der Untersuchungsgebiete Herl und Wahlen ......................................... 11
Abb.6: Untersuchungsgebiet Herl ................................................................................ 12
Abb.7: Verbreitung von Microtus arvalis ..................................................................... 16
Abb.8: Verbreitung von Microtus agrestris ................................................................. 16
Abb.9: Foto: Microtus arvalis ....................................................................................... 17
Abb.10: Foto: Microtus agrestris .................................................................................. 17
Abb.11: Molaren von Microtus agrestris mit
„agrestris“ und „exsul-Schlinge“
.................................................................
18
Abb.12: Vakuum Blotter ............................................................................................... 32
Abb.13: Aufbau eines Vakuum Blottes ......................................................................... 32
Abb.14: Holzkastenfalle mit Blechwippe ...................................................................... 43
Abb.15: Hengstlerfalle .................................................................................................. 44
Abb.16: Kunststoffwieselfalle ........................................................................................ 45
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis VII
Abb.17: Probegel mit DNA Isolaten aus Leber,
Muskel, Niere und Mausschwanz
...........................................................
46
Abb.18: Vollständiger und unvollständiger
Restriktionsverdau
...................................................................
48
Abb.19: Restriktionsverdau mit der
Restriktionsendonuklease Hinf I
.....................................................................
50
Abb.20: Multilocus-DNA-Fingerprint von Microtus
arvalis mit dem Restriktionsenzym Hinf I
und der Sonde (GACA)4
.......................................................
52
Abb.21: Multilocus-DNA-Fingerprint von Microtus
agrestris und Microtus arvalis mit dem
Restriktionsenzym Hinf I und der Sonde (GTG)5
............................................
53
Abb.22: Isolation by distance ....................................................................................... 64
Abb.23: Flächennutzungskartierung des
Standortes Wahlen mit den
Untersuchungsflächen Zill und Hohberg
........................................................
65
Abb.24: Flächennutzungskartierung des Standortes
Herl mit den 3 Untersuchungsflächen
Eiden, Knospenhof und Herl-Brache
..................................................
66
Abb.25: Dendrogramm der Clusteranalyse
der Standorte
..................................................................
68
Abb.26: Artunterscheidung von Microtus arvails
und Microtus agrestris mit dem RAPD-
PCR Primer Roth A17
..........................................................
84
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis VIII
Abb.27: Unterschiedliche Bandenmuster der
Standorte Herl, Hohberg und Zill von
Microtus arvalis mit dem Primer A19
.............................................................
85
Abb.28: Unterschiedliche Bandenmuster
von Microtus arvalis in Herl
.....................................................................
85
Tabellen:
Tab.1: Testsysteme und ihr Anwendungsspektrum ................................................... 2
Tab.2: Anzahl der gefangenen
Microtus arvalis pro Standort
...........................................................................
27
Tab.3: Die verwendeten Restriktionsenzyme
mit ihren Erkennungsschnittstellen
.............................................................
48
Tab.4: Bandsharingraten Zill ........................................................................................ 56
Tab.5: Durchschnittliche Fingerprintdaten der
Feldmäuse mit unbekanntem
Verwandtschaftsgrad vom Standort Zill
..........................................................
56
Tab.6: Bandsharingraten Hohberg .............................................................................. 57
Tab.7: Durchschnittliche Fingerprintdaten der
Feldmäuse mit unbekanntem
Verwandtschaftsgrad vom Standort Hohberg
.................................................
57
Tab.8: Bandsharingraten Herl-Brache ........................................................................ 58
Tab.9: Durchschnittliche Fingerprintdaten der
Feldmäuse mit unbekanntem
Verwandtschaftsgrad vom Standort Herl-Brache
............................................
58
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis IX
Tab.10: Bandsharingraten Knospenhof ....................................................................... 59
Tab.11: Durchschnittliche Fingerprintdaten der
Feldmäuse mit unbekanntem
Verwandtschaftsgrad vom Standort Knospenhof
............................................
59
Tab.12: Bandsharingraten Eiden ................................................................................. 60
Tab.13: Durchschnittliche Fingerprintdaten der
Feldmäuse mit unbekanntem
Verwandtschaftsgrad vom Standort Eiden
......................................................
60
Tab.14: Durchschnittliche Bandshraten für
nichtverwandte Individuenpaare
..................................................................
61
Tab.15: Auflistung der Wahrscheinlichkeiten Pi
und Pg für nichverwandte Individuen
.....................................................
63
Tab.16: BSR innerhalb und zwischen den Populationen ............................................. 63
Tab.17: D’ij Werte zwischen den einzelnen Populationen
an den unterschiedlichen Standorten
............................................
67
Tab.18: F`ST Werte zwischen den einzelnen Populationen
an den unterschiedlichen Standorten
..........................................
68
Tab.19: Bandsharingraten der Mutter ma
und ihrer Nachkommen a1-a5
....................................................................
71
Tab.20: Durchschnittliche Fingerprintdaten der
Feldmäuse mit bekanntem
Verwandtschaftsgrad vom Standort Hohberg
.................................................
71
Tab.21: Bandsharingraten der väterlichen
Banden der Nachkommen a1-a5
...................................................................
72
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis X
Tab.22: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden
der Nachkommen a1-a5 mit der Mutter ma bzw. mit
dem putativen Vater oder den putativen Vätern pva
......................................
72
Tab.23: Bandsharingraten der Mutter mb
und ihrer Nachkommen b1-b4
....................................................................
72
Tab.24: Durchschnittliche Fingerprintdaten der
Feldmäuse mit unbekanntem
Verwandtschaftsgrad vom Standort Knospenhof
............................................
72
Tab.25: Bandsharingraten der väterlichen
Banden der Nachkommen b1-b4
...................................................................
73
Tab.26: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden
der Nachkommen b1-b4 mit der Mutter mb bzw. mit
dem putativen Vater oder den putativen Vätern pvb
......................................
73
Tab.27: Bandsharingraten der Mutter mc
und ihrer Nachkommen c1-c3
....................................................................
74
Tab.28: Durchschnittliche Fingerprintdaten der
Feldmäuse mit unbekanntem
Verwandtschaftsgrad vom Standort Knospenhof
............................................
74
Tab.29: Bandsharingraten der väterlichen
Banden der Nachkommen c1-c3
...................................................................
74
Tab.30: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden
der Nachkommen c1-c3 mit der Mutter mc bzw. mit
dem putativen Vater oder den putativen Vätern pvc
.......................................
75
Tab.31: Bandsharingraten der Mutter md
und ihrer Nachkommen d1-d6
....................................................................
75
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis XI
Tab.32: Durchschnittliche Fingerprintdaten der
Feldmäuse mit unbekanntem
Verwandtschaftsgrad vom Standort Knospenhof
............................................
75
Tab.33: Bandsharingraten der väterlichen
Banden der Nachkommen d1-d6
...................................................................
76
Tab.34: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden
der Nachkommen d1-d6 mit der Mutter md bzw. mit
dem putativen Vater oder den putativen Vätern pvd
......................................
76
Tab.35: Bandsharingraten der Mutter me
und ihrer Nachkommen e1-e6
....................................................................
77
Tab.36: Durchschnittliche Fingerprintdaten der
Feldmäuse mit unbekanntem
Verwandtschaftsgrad vom Standort Herl-Brache
............................................
77
Tab.37: Bandsharingraten der väterlichen
Banden der Nachkommen e1-e6
...................................................................
78
Tab.38: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden
der Nachkommen e1-e6 mit der Mutter me bzw. mit
dem putativen Vater oder den putativen Vätern pve
......................................
78
Tab.39: Bandsharingraten der Mutter mf
und ihrer Nachkommen f1-f4
.....................................................................
78
Tab.40: Durchschnittliche Fingerprintdaten der
Feldmäuse mit unbekanntem
Verwandtschaftsgrad vom Standort Herl-Brache
............................................
78
Tab.41: Bandsharingraten der väterlichen
Banden der Nachkommen f1-f4
...................................................................
79
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis XII
Tab.42: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden
der Nachkommen f1-f4 mit der Mutter mf bzw. mit
dem putativen Vater oder den putativen Vätern pvf
........................................
79
Einleitung 1
1. Einleitung
Populationsgenetische Diversitätsstudien bzw. Populationsstruktur-Untersuchungen
illustrieren nicht nur Evolutionsprozesse, sondern liefern Informationen für die biologische
Erhaltung und Bewertung von Ökosystemen (Veith et al. 1999). Unterschiedliche
Landschaftsstrukturen sowie Bewirtschaftungsformen können sich isolierend auf
Populationen auswirken und damit ihre genetische Variabilität beeinflussen (Veith et al.
1999). Die Zusammenhänge von land- bzw. forstwirtschaftlichen
Bewirtschaftungsmethoden auf bestimmte Tier- und Pflanzenpopulationen wurde in den
letzten Jahren von zahlreichen Autoren untersucht (Binet et al. 1997, Dyer et al. 1998,
Malkawi et al. 1999, Müller 1994, 1995, 1996, Vucetich et al. 2001). Genetische
Differenzierungs-, bzw. Anpassungsprozesse wurden dagegen nur in selteneren Fällen
untersucht (Nevo 2001, Pearman 2001, Ross 2001). In diesem Zusammenhang bilden
Rodentia unter anderem auch wegen ihrer hohen Reproduktionsrate und großen
ökologischen Valenz ideale Untersuchungsobjekte für die Indikation von
Flächennutzungswirkungen. Dass darüber hinaus viele Grenzwertbestimmungen und
Risikobewertungen an Rodentia-Systemen erarbeitet wurden, zeigt, dass sie auch als
Modell-Systeme für die Bewertungen von Landnutzungen einsetzbar sind.
Die Fortpflanzungsstrategie spielt natürlich eine entscheidende Rolle für die
Reproduktionsrate und somit für die Populationsgröße. Zum Beispiel bewirken
Mehrfachvaterschaften, d.h. die Nachkommen eines Wurfes stammen von
unterschiedlichen Vätern ab, im Vergleich zu Einfachvaterschaften ein Anwachsen der
effektiven Populationsgröße (Sugg & Chesser 1994, Chesser & Baker 1996).
Mehrfachvaterschaften wurden schon bei verschiedenen Taxa festgestellt ( Tegelström
1991, Avis 1994, Gullberg 1997, Dickinson & Akre 1998, Baker 1999, Wilmer et al. 1999,
Zenuto et al. 1999, Huyvaert et al. 2000, Haydock et al. 2001) nicht jedoch bei Microtus
arvalis.
Deshalb sollen genetische Untersuchungen an freilebenden Microtus arvalis Populationen
durchgeführt mit dem Ziel, etwas über ihre Reproduktionsstrategie zu erfahren und
Zusammenhänge zwischen genetischen Populationsstrukturen und unterschiedlichen
Flächennutzungen herauszufinden.
Auf die Eignung eine solche Fragestellung zu beantworten, wurden verschiedene
molekulargenetische Methoden mit unterschiedlichen Informatonsgehalten getestet,
Multilocus-DNA-Fingerprinting, RAPD-PCR und versuchsweise die Mikrosatelliten-PCR.
Einleitung 2
Von diesen 3 Methoden besitzt das Multilocus-DNA-Fingerprinting den größten und das
RAPD-PCR den kleinsten Informationsgehalt (siehe Tab.1). Testsysteme, die sich mit der
Untersuchung mitochondrialer DNA befassen haben auch einen hohen
Informationsgehalt. Die mitochondriale DNA besitzt z.B. eine höhere Mutationsrate, weil
Reparaturmechanismen fehlen und bietet somit Vorteile in der Identifizierung einzelner
Stämme, da mehr Varietäten unterscheidbar sind. Sie eignen sich jedoch nicht für
Analysen, die Abstammungslinien oder Vaterschaftsnachweise zum Inhalt haben, da sie
überwiegend mütterlich vererbt wird (Davidson et al. 1989, Krawczak & Schmidtke 1994)
Tab.1: Testsysteme und ihr Anwendungsspektrum (verändert nach Krawczak & Schmidtke 1994)
technische
Durchführ-
barkeit
Informa-
tionsge-
halt
Genotyp-
analyse
Vater-
schafts-
nachweis
degra-
dierte
DNA
gemischte
Proben
Sonden
Systeme
multi
locus
++ +++ - +++ - -
single
locus
++ ++ + ++ + ++
PCR
Systeme
Mini-
satelliten
++ + + + + +
Mikro-
satellite
++ + ++ + ++ +
Mitochon-
drien-DNA
+ ++ +++ - ++ -
In der Literatur konnten keine Angaben über die Anwendung von Multilocus-DNA-
Fingerprinting, RAPD-PCR und Mikrosatelliten-PCR auf Microtus arvalis gefunden
werden. Daraus ergab sich die Notwendigkeit die oben genannten genetischen
Untersuchungsmethoden auf Microtus arvalis und die vorhandenen Laborbedingungen zu
optimieren.
Einleitung 3
In der Vergangenheit bis gegen Ende der siebziger Jahre wurden für
populationsgenetische Untersuchungen von Haus- bzw. Wildtieren neben der
Karyotypenanalyse hauptsächlich biochemische Marker, wie zum Beispiel Isoenzyme
oder Allozyme eingesetzt (Ivanov 1989). Ihre Vorteile sind darin zu sehen, dass die
Funktion der Enzyme und ihre Vererbungsmuster weitgehend bekannt ist, und dass sie
relativ kostengünstig sind (Hedrik 1992). Weil die meisten Loci monomorph sind und
dadurch keinen Informationsgehalt besitzen, ist es notwendig, eine hohe Anzahl von
Markern pro Individuum kombiniert mit einer großen Populationsstichprobe zu
untersuchen (Hartl & Reimoser 1988, Wilde et al. 1992, Koller et al. 1993, Allegrucci et al.
1995, Garcia & Benzie 1995, Kantanen et al. 1995, Chan & Sun 1997, Harding et al.
1997). Dadurch ist dieses Verfahren sehr arbeitsaufwendig. Aussagen über
Verwandtschaftsbeziehungen, Vaterschaftsanalysen eingeschlossen, basierend auf
Isoenzymanalysen, sind statistisch unzuverlässig (Chakraborty et al. 1991, Lynch 1991).
Ferner sind die analysierbaren Merkmale von höheren Organismen auf das Gewebe
beschränkt, mit dem auch experimentiert wurde (Pöche et al. 1990, Roewer et al. 1990).
Da die DNA in den Zellkernen aller Körperzellen identisch vorkommt und außerdem im
Vergleich zu Proteinen relativ stabil (Meyer et al. 1995) und unempfindlich ist, war es
sinnvoll, dass eine Verlagerung der Analysen auf die DNA-Ebene erfolgte.
Das Genom der höheren Organismen ist aus codierender DNA (Exons), nichtcodierender
DNA (Introns) und extragener DNA, die vermutlich der Aufrechterhaltung der
Chromosomenstruktur dient, zusammengesetzt. Mindestens 30% bestehen hierbei aus
repetitiven Sequenzen, die in Einzelkopiesequenzen, mittelrepetetiven (1000 bis > 10000
Kopien) und hochrepetetiven Sequenzen (ab einer Million Kopien) unterteilt werden
können (Krawczak & Schmidtke 1994).
Für die codierenden Genloci kommen nur Einzelkopiesequenzen in Betracht. Die
repetetiven Sequenzen (repeats) bestehen aus Basensequenzen unterschiedlicher
Länge, die einzeln oder tandemartig, mehrfach hintereinandergeschaltet im Genom
vorkommen (Schertan 1991, Swatschek 1992). Da diese Sequenzen nicht zu den Exons
zählen, führt die Umordnung ganzer Sequenzteile bzw. Mutationen in diesen Regionen zu
keinen direkten Auswirkungen. Somit weisen Regionen repetetiver Sequenzen eine
größere Diversität als die Einzelkopiesequenzen auf und sind außerdem sehr reich an
interindividueller genetischer Variation (Peters et al. 1991). Daher kommt auch ihre
Bezeichnung „hypervariable regions“ (HVR´s). Die große Variabilität der HVR`s wird
vorwiegend durch die veränderliche Anzahl der mehrfach hintereinandergeschalteten
Wiederholungen (Variable Number of Tandem Repeats: VNTR`s) bestimmt.
Einleitung 4
1985 wurde von Jeffreys et al. (1985a) das DNA Fingerprinting entwickelt. Diese
Methode beruht darauf, dass sogenannte „Restriktions-Fragment-Längen-
Polymorphismen“ (RFLP`s) ihrer Länge nach durch Gelelektrophorese aufgetrennt
werden. RFLP`s entstehen durch hydrolytischen Verdau der genomischen DNA mit einer
häufig schneidenden Restriktionsendonuklease, die nicht innerhalb einer Repeat-Region
schneiden darf. Die Länge der Fragmente beruht zum Einen auf den Änderungen in der
Zahl der tandemartig wiederholten DNA-Einheiten, zum Anderen in den sie flankierenden
Erkennungssequenzen der Restriktionsendonuklease (Jeffreys et al. 1985a, Ryskov et al.
1988). Die im Gel aufgetrennten DNA-Fragmente werden dann auf eine Membran
transferiert. Durch Hybridisierung mit spezifischen DNA-Sonden können viele
hypervariable Loci gleichzeitig erfasst und dargestellt werden (Zischler & Epplen 1989a),
da die repetitiven Sequenzen wiederholt im Genom vorkommen und über das gesamte
Genom verteilt sind (Jeffreys et al 1986, Jeffreys et al.1988, Taylor et al.1991) (vgl.
Abb.1). Das hieraus resultierende Bandenmuster wird als der genetische Fingerabdruck
bezeichnet, der einen sehr hohen Polymorphiegrad zwischen verschiedenen Individuen
aufweist. Identische genetische Fingerprints treten nur bei monozygoten Zwillingen und
Mehrlingen (bzw. Klonen) auf.
Somit handelt es sich beim DNA-Fingerprinting also um die Visualisierung von repetitiven
DNA-Sequenzen, die aus einer kurzen Basenfolge bestehen und unterschiedlich oft
hintereinandergereiht sind. Die dabei entstandenen Banden des DNA-Fingerprints
werden genauso wie Allele nach den Mendel’schen Regeln autosomal weiterverebt
(Jeffreys et al. 1985b, Jeffreys u. Morton 1987a, Ryskov et al. 1988), weshalb alle
Banden eines Nachkommen auf die Eltern zurückzuführen sind (Mutationen
ausgenommen). Da es sich bei den Banden um sichtbargemachte VNTR-Regionen
handelt, also nicht um Einzelkopiesequenzen, werden hierbei nur nichtcodierende DNA-
Loci dargestellt (Epplen 1988, Jeffreys 1985 a + b, Pöche et al 1991).
Einleitung 5
DNA - Isolierung
genomische DNA
Restriktionsverdau Gelelektrophorese
Restriktionsfragmente
Gel
UV - Kontrolle
Gel
Southern - Blot
Membran/Gel
Hybridisierung/Hot wash Antikörperbehandlung
Membran
Farbreaktion
DNA - Fingerprint auf Membran
Abb.1: Schematische Darstellung des Verlaufs des nichtradioaktiv markierten DNA-Fingerprinting
Anhand ihrer Größe und ihres Aufbaus können die VNTR-Regionen als Minisatelliten
oder Mikrosatelliten klassifiziert werden.
Als Minisatelliten werden längere DNA-Sequenzen bezeichnet, die aus 3 bis 29
hintereinandergereihten Wiederholungen von durchschnittlich 16 bis 33 Basenpaaren
(bp) bestehen (Buitkamp et al. 1991b, Peters et al. 1991). Ihre gemeinsame Kernsequenz
beinhaltet zwischen 10 und 15 bp (Jeffreys et al. 1985a). Demgegenüber sind
Mikrosatelliten (Epplen 1988, Haberfeldt et al. 1991) aus nur 2 bis 10 Nucleotiden, die
sich 20 mal bis zu einer Mio. mal tandemartig wiederholen, zusammengesetzt.
Entsprechend den VNTR-Regionen gibt es auch Mini- bzw. Mikrosatellitensonden. Die
Mikrosatelliten- bzw. Oligonukleotidsonden haben gegenüber den Minisatellitensonden
entscheidende Vorteile. So können sie synthetisch hergestellt werden und zeichnen sich
durch konstante Qualität und hohe chemische Reinheit aus (Vergnaud et al. 1991). Auch
sind sie in nicht radioaktiv markierter Form erhältlich, wodurch ihr Einsatz in nicht speziell
überwachten Isotopenlabors möglich gemacht wird (Swatschek 1992). Als Beispiele sind
die Oligonukleotidsonde (GATA)4 und (GTG)5 aufgeführt.
(GATA)4 = GATAGATAGATAGATA
(GTG)5 = GTGGTGGTGGTGGTG
Einleitung 6
Zu den Minisatellitensonden gehören die sogenannten Jeffreys Sonden (Jeffreys et al.
1985b)
33.6: { (AGGGCTGGAGG)3 }18
33.15: (AGAGGTGGGCAGGTGG)29
Die oben genannten Mini- bzw. Mikrosatellitensonden gehören zu den Multilocussonden,
neben denen es auch Singlelocussonden gibt, die besonders für Linkage Analysen
interessant sind (Bruford & Burke 1991, Zischler et al. 1991).
Öffentliche Bekanntheit erlangte das DNA-Fingerprinting hauptsächlich durch seine
Anwendung in der Forensik, in der diese Methode in Bereichen wie
Vaterschaftsnachweisen, Identifikation von Spurenmaterial, Personen und Tätern
eingesetzt und zum Teil kontrovers diskutiert wird (Jeffreys et al. 1985 u. 1991,
Pemperton et Amos 1990, Pöche et al. 1990, Peters et al. 1991). Abstammungs- und
Vaterschaftsnachweise werden zudem in der Tier- und Pflanzenzucht eingesetzt, da in
kontrollierten Züchtungsprogrammen das Wissen um die Verwandtschaftsverhältnisse
potentieller Geschlechtspartner zum Heranzüchten ökonomisch wichtiger Charaktere
oftmals Grundvorraussetzung ist. Auch kann die Aufklärung der
Verwandtschaftsverhältnisse dem vorbeugenden Schutz gefährdeter Arten dienen, um
die eliminierende Wirkung von Inzucht zu vermeiden (Lynch 1991, Dolf et al. 1992,
Douglas 1998, Refseth et al. 1998, Parker et al. 1999, Nagaraju et al. 2001). Eine sehr
große Bedeutung kommt dem DNA-Fingerprinting in der Medizin, beispielsweise im
Bereich der Tumordiagnostik und Tumorgenetik (Lagoda et al. 1989, Nürnberg et al.
1991) zu. Dank der somatischen Stabilität des DNA-Fingerprints und der speziellen
Stabilität metastasierender Tumore eignet sich das DNA-Fingerprinting zum Nachweis
und zur Identifikation von Metastasen (Lagoda et al. 1989).
Eine revolutionäre Entwicklung im Bereich der Molekularen Genetik stellte die von Mullis
entwickelte PCR-Methode (PCR= Polymerase Chain Reaction) dar, die als in vitro-
Methode das Zellreperatursystem im lebenden System imitiert (Mullis & Faloona 1987,
Saiki et al. 1988, Mullis 1990). Die PCR beruht auf einer zyklischen Replikation, bei der in
jedem Zyklus die vorhandene DNA verdoppelt wird. So werden, je nach Methode, die
DNA-Fragmente von der Größe eines einzigen Basenpaares (bp) bis zu 10000 bp (plus
Primer) in Abhängigkeit der Zyklenzahl tausend- bis millionenfach vervielfältigt (Erlicher
1989, White et al. 1989, Erlicher et al. 1991, Arnheim et al. 1992). Wegen ihrer
Einfachheit (siehe Abb.2) hat die PCR seit ihrer Entwicklung für viel Aufsehen gesorgt
Einleitung 7
und in Bereiche der medizinischen Diagnostik, Forensik und in die Populationsgenetik
Einzug gehalten (Hanke 1992, Hummel 1992, Lessa 1992, Graham & Newton 1994,
Welsh & McClelland 1994, Fritsch 1996, Hoelzel et al. 1998).
Is o lie r te D N A
V o r b e r e itu n g d e r
P C R - R e a k tio n A m p lif i ka t ion im
T h erm o c y c le r
G e le lek t ro - p h o r e s e
G e le lek t ro - p h o res e
A m p lif i ka t ion s - p rod u k t
Abb.2: Arbeitsschritte der PCR
Die RAPD-PCR (Williams et al. 1990) stelle eine Sonderform der PCR dar, da Primer
ausgewählt werden deren Bindungsstellen zufällig (randomly) über das Genom verteilt
sind. Primer unterschiedlicher Sequenz und unterschiedlicher Länge haben folglich
unterschiedliche komplementäre Bindungsstellen, deren Anzahl ebenfalls primerabhängig
ist.
Durch Erhitzen wird die Doppelstrang- Template DNA denaturiert und in zwei
Einzelstränge zerlegt, wobei ein rasches Abkühlen ein Reassoziieren der Stränge
verhindert. An für den Primer komplementären Basensequenzen der Einzelstränge kann
sich dieser bei geeigneten Temperaturen anlagern (Annealing). Voraussetzung ist das
Vorhandensein zweier Bindungsstellen innerhalb einer bestimmten Distanz an den
gegenüberliegenden Einzelsträngen. Vom freien 3`-OH-Ende des Primers beginnt die
Polymerase unter Anwesenheit der vier Desoxyribunucleosidtriphosphate (dATP, dCTP,
dGTP, dTTP) die Synthese eines zur Template-DNA komplementären Stranges
(extension, polymerisation nach Lachmund u. Sachse 1994). Dies führt zur Bildung eines
neuen Doppelstranges und somit zur Verdopplung der ursprünglichen Template-DNA pro
Einleitung 8
Zyklus. Die erhaltenen Stränge gehen als Matrize in den nächsten Zyklus ein, was
abhängig von der Zyklenzahl zu einer millionenfachen Vervielfältigung führt. Die
Besonderheit besteht darin, dass sich ab dem dritten Zyklus die Sequenzen zwischen
zwei Primerbindungsstellen plus die der beiden begrenzenden Primer exponentiell
vervielfältigen. Von der Anzahl der zwischen zwei Bindungsorten liegenden Basenpaaren
ist es abhängig, ob es zu einer Amplifikation kommt. Nur wenn innerhalb der zur
Verfügung stehenden Zeit die DNA von einer Bindungsstelle zur nächsten synthetisiert,
erhält man ein Amplifikationsprodukt. Für eine erfolgreiche Amplifikation müssen die
Bindungsstellen innerhalb von 4000 bp liegen, wobei generell 120 Sekunden für eine
Synthese von Fragmenten bis zu einer Größe von 5000 bp als ausreichend gelten.
Im Prinzip funktioniert die Mikrosatelliten-PCR genauso wie das RAPD-PCR, nur das bei
der Mikrosatelliten-PCR definierte Stellen mit bekannter Sequenz, die
Mikrosatellitenregionen (die Größe dieser Regionen liegt meist zwischen 50 und 350
Basenpaaren), vervielfältigt werden. Hierzu kommt ein Primerpaar (je 20 – 25 Basen)
zum Einsatz, welches genau diese Stelle im Genom eingrenzt und den entsprechenden
Mikrosatellitenbereich amplifiziert. Da die Mikrosatellitenmarker codominant sind können
aus der Allelfrequenz und dem Heterozygotiegrad Aussagen über die Variabilität und den
Genfluss zwischen Populationen gemacht werden.
Untersuchungsgebiete 9
2. Die Untersuchungsgebiete
2.1 Beschreibung des Untersuchungsgebietes Wahlen
Die beiden Untersuchungsflächen Zill (Abb.3) und Hohberg (Abb.4) liegen in Wahlen, im
nördlichen Saarland. Sie befinden sich ca. 5 km südöstlich von Losheim und etwa 10 km
nordöstlich von Merzig (Abb.5)
Abb.3: Untersuchungsfläche Wahlen Zill 2
Abb.4: Untersuchungsfläche Wahlen Hohberg
Untersuchungsgebiete 10
Nach der „Naturräumlichen Gliederung Deutschlands“ (Schneider 1972) ist das
Untersuchungsgebiet der sogenannten Wahlener Platte, einer Untereinheit der Merziger
Muschelkalkplatte, zuzuordnen. Die Wahlener Platte bildet den östlichen Ausläufer der
Merziger Muschelkalkplatte und deren Abschluss gegen das Hochwaldvorland. Sie wird
als sanft gewellte Fläche im Niveau 350 m ü. NN charakterisiert, die durch diverse,
verzweigte Systeme von steilwandigen, bewaldeten Talschlüssen gegliedert und von
einer Reihe bewaldeter Kuppen im Süden und Südosten (z.B. Schallenberg 401 m,
Eisenberg 400 m, Oppener Kuppe 396 m) eingerahmt ist.
Der Sockel der Platte und der Kuppen besteht aus dem Hauptbuntsandstein (sm), der in
den Tallagen ansteht. Überlagert wird er von einer ca. 20 m mächtigen Schicht aus
Volziensandstein (so), der die Kuppen aufbaut. Die oberste Schicht, den Stufenbildner
überlagernd und sowohl auf der Platte wie teilweise auch auf den Kuppen vorkommend,
bilden Mergel und Muschelsandstein des unteren Muschelkalks (mu).
Der westliche Teil des Untersuchungsgebietes zeichnet sich durch mit Lößlehm bedeckte
Flächen aus, die einer intensiven landwirtschaftlichen Nutzung (Getreide-, Futteranbau)
unterliegen und somit eine fast komplette Ausräumung aufweisen. Die mit Bodenzahlen
zwischen 40 und 69 als gut bewerteten lehmig-tonigen Böden sind als
Verwitterungsprodukt der Deckschichten unter den periglazialen Verhältnissen der
Würmkaltzeit aus einem Gemisch von Anstehendem, Fließerden und äolisch
abgelagertem Material entstanden (Portz 1992).
In den steileren Hanglagen finden sich unterschiedlich stark verbuschte Streuobstwiesen,
Feldgehölze, Hecken und Gebüsch in ganz unterschiedlichen Sukzessionsstadien, die
oftmals durch Beweidung stark beeinflußt werden. Diese greifen kleinflächig, mosaikartig
ineinander und tragen somit zur Vernetzung der Landschaft bei.
Die bewaldeten Flächen setzen sich hauptsächlich aus in Nadelholzparzellen eingestreute
Perlgras- und Waldmeister-Buchenwälder zusammen (Müller & Paulus 1987).
2.1.1 Klima und Witterung in Wahlen
Laut dem „Deutschen Planungsatlas“, Band Saarland (Minister des Inneren), liegt der
mittlere Jahresniederschlag im Untersuchungsgebiet zwischen 900 und 950 mm/a, wobei
der größte Teil der Niederschläge in den Monaten Juli, August und Dezember fällt. Im
Großen und Ganzen ist die Niederschlagsverteilung jedoch ausgeglichen.
Die mittlere Jahresdurchschnittstemperatur wird im Planungsatlas mit 8,7°C, die mittlere
Januartemperatur mit 0,5°C und die mittlere Julitemperatur mit 15,0°C angegeben. Somit
gehört das Untersuchungsgebiet dem sommerkühlen, humid-subatlantischen Bereich
Mittel- und Westeuropas an. Innerhalb des Saarlandes liegt das Gebiet zwischen den
Untersuchungsgebiete 11
sogenannten klimatischen „Gunsträumen“ (Saar-, Moseltal) und den „Ungunsträumen“
(Hochwald).
Abb.5: Lage der Untersuchungsgebiete Herl und Wahlen
2.2 Beschreibung des Untersuchungsgebietes Herl
Das Untersuchungsgebiet Herl (Abb.6) liegt im Südwesten der Rheinland-Pfalz, etwa 10
km östlich von Trier und ca. 30 km nördlich des Untersuchungsgebietes Wahlen (Abb.5).
Wahlen
Herl
Untersuchungsgebiete 12
Abb.6: Untersuchungsgebiet Herl
Der Landschaftsraum Trier, zu dem Herl gehört, kann in zwei große naturräumliche
Regionen unterteilt werden, dem Rheinischen Schiefergebirge und dem Lothringischen
Stufenland. Die Grenze dieser beiden Regionen verläuft mitten durch die Trierer Talweite
und die Stadt, wobei sie von der Gesteinsgrenze des gefalteten paläozoischen
Grundgebirges (vorwiegend Devonschiefer) gegen jüngere Gesteinsserien gebildet wird.
Die Gesteinsgrenze verläuft vom Südwestrand des Hunsrück über die untere Saar nach
Norden bis zur Saarmündung in die Mosel und durch die Trierer Talweite. Dort umrundet
sie dann in weitem Bogen Bitburg und das Bitburger Gutland. Dann schwenkt sie in die
SW-Richtung zurück und folgt ihr als Südrand der Ardennen über Vianden in Richtung
nördlich von Arlon, gleichzeitig als Nordgrenze der Luxemburger und Ferschweiler
Sandsteinplatten, des Ettelbrücker Stufenlandes sowie der Landschaft „Belgisch-
Lothringen“ (Richter 1983).
Die geomorphologische Gliederung des Landschaftsraumes lehnt sich eng an ihren
geologischen Bau an. So dominieren im devonischen Grundgebirge weite
Flächensysteme mit Trogflächen in 300-400 m ü. NN und Rumpfflächen zwischen 500 m
und 600 m ü. NN. Über diese Rumpfflächen erheben sich nur noch die Härtlingszüge der
Quarzitkämme wie zum Beispiel der Schneifel und des Osburger und Schwarzwälder
Hochwaldes (Richter 1983).
Das Spektrum der Bodentypen entspricht der Gliederung in Landschaftsräume. So
kommen in der Tal- und Senkungszone der Mosel mittel- bis tiefgründige Braunerden vor.
Auf den Terrassen finden wir Parabraunerden , in ebener Lage Lößlehm und an den
Untersuchungsgebiete 13
Steilhängen auf Schiefer Braunerde-Ranker und Rigosole. Die Ertragsmesszahlen liegen
bei 40-60.
Auf den Trogflächen dominieren auf Schiefer mittelgründige Braunerden, an den
Talflanken der steil eingeschnittenen Seitentäler auch Braunranker und an den
Rebhängen Rigosole. Die Ertragsmesszahlen dieser Böden reichen von 33-40.
Die Rumpfflächen weisen mittel- bis flachgründige Braunerden und podsolige Braunerden
auf, die meist einen hohen Skelettanteil besitzen. Die Ertragsmesszahlen liegen hierbei
vorherrschend zwischen 25-35.
Durch den vielfältigen Wechsel von Ausgangsgestein, Boden und Relief entstand eine
vielgestaltige Ackerflur mit Wechsel von Acker, Grünland und Wald, die eine offenen,
insgesamt jedoch waldarmen Charakter hat. Ausnahmen hierzu bilden die weiten
Buntsandsteingebiete vom N-Rand des Moseltales über den Meulenwald bis nach
Herforst-Speicher, sowie die hochgelegenen Waldländer in Eifel und Hunsrück mit Ihren
Rodungsinseln.
Traditionsgemäß hat der Raum Trier eine kleinbäuerlich Struktur und eine
Besitzzersplitterung, die sich aus der Erbsitte der Realteilung ständig regeneriert. Durch
die Flurbereinigung, rückläufige Zahl der landwirtschaftlichen Betriebe und
Besitzkonzentrationen bei den Vollerwerbsbetrieben wurde dieser Zersplitterung zwar
entgegengewirkt, doch verändert hat dies die vorherrschende klein- bis mittelbäuerliche
Agrarstruktur des Trierer Raumes nicht.
Eine Hinwendung zur Grünlandwirtschaft ist daran zu erkennen, dass die Ackerflächen im
Vergleich zu den Dauergrünlandflächen viel stärker geschrumpft sind. Trotz der Abnahme
der Ackerflächen ist eine deutliche Zunahme der Getreide Anbaufläche zu Lasten des
arbeitsintensiveren Hackfruchtanbaus zu verzeichnen (Richter 1983).
2.2.1 Klima und Witterung
Die thermische Bevorzugung der Moseltalzone und des Gutlandes gegenüber den
höheren Gebieten von Hunsrück und Eifel lassen sich deutlich am Temperaturprofil
erkennen. So liegt die Jahresmitteltemperatur in der Moseltalzone bei über 9,0°C, im
Stufenland und auf den Trogflächen zwischen 8,0°C und 9,0°C und in den höheren
Regionen bei unter 8,0°C.
Betrachtet man die Jahresniederschläge, so lässt sich eine umgekehrte Tendenz
erkennen. Während die mittleren Jahresniederschläge in der Eifel und im Hunsrück bei
800 mm bis > 1000 mm liegen, bleiben sie im Stufenland, auf den Trogflächen und
besonders in der zentralen Talzone meist deutlich unter 800 mm. Die höchsten
Monatssummen der Niederschläge werden im Hochsommer, bzw. im Spätherbst
Untersuchungsgebiete 14
registriert, wobei gerade dieses Spätherbst Maximum ein Ausdruck der atlantischen
Klimaprägung ist, die den gesamten Trierer Raum charakterisiert. Das Ausmaß dieser
atlantischen Klimaprägung weist jedoch starke Unterschiede auf. So ist in den Höhen von
Eifel und Hunsrück ein ausgeprägtes atlantisches, feucht-kühles Mittelgebirgsklima zu
finden, während das Stufenland und die Trogflächen etwas wärmer und trockener sind
und die zentrale Talzone der Mosel sogar eine Wärmegasse mit kontinentalem Einschlag
bildet. Diese Wärmegasse ist mit ausschlaggebend für das Schlagwort „Trier sei
Deutschland nördlichster Süden“, was auch anhand der Flora und der Vegetation
festgestellt werden kann.
Verbreitung und Ökologie 15
3.Verbreitung und Ökologie
3.1 Systematik
Microtus arvalis (Pallas, 1779), die Feldmaus, und Microtus agrestris (Linnaeus, 1761),
die Erdmaus, gehören zu der Familie der Wühler (Rodentia: Cricetidae) und der
Unterfamilie der Wühlmäuse (Microtinae) (Urania 2000). Weltweit gibt es etwa 60 Arten
der Gattung Microtus, davon kommen 18 Arten in Europa vor. Diese lassen sich
wiederum in 3 Untergattungen (Chionomys, Microtus und Pitymys) unterteilen. Von diesen
3 Untergattungen ist Microtus mit seinen 6 in Europa vorkommenden Arten (M.agrestris,
M.arvalis, M.cabrerae, M.epiroticus, M.guentheri und M.oeconomus), von denen 4
(M.agrestris, M.arvalis, M.epiroticus, und M.oeconomus) weit verbreitet sind, die
ökologisch wichtigste Wühlmausgruppe (Niethammer 1981).
Die Gattungen Microtus sowie Arvicola gehen auf die fossile Gattung Mimomys zurück,
die vom Pliozän bis ins Altpleistozän belegt ist. Aus ihr hat sich dann wahrscheinlich an
der Grenze vom Oberpliozän zum Altpleistozän die Gattung Allophaiomys entwickelt.
Dadurch, dass sich bei der Gattung Allophaiomys am Vorderlobus des M1 durch seitliche
Einfaltungen weitere Dentindreiecke abgetrennt haben ist die Microtus Gruppe
hervorgegangen. Weitere Dentindreiecke bedeuten eine Vermehrung der Schneidekanten
und somit eine Leistungssteigerung (Chaline 1974).
3.2 Verbreitung
Abgesehen von einigen Randformen in Spanien erstreckt sich das Areal von Microtus
arvalis von den Pyrenäen und der französischen Atlantikküste im Westen bis zum Ob und
dem Altai Gebirge im Osten. Die NS-Ausdehnung ihres Areals liegt in etwa zwischen dem
40° nördl. Breite in Spanien und der Türkei und 60° nördl. Breite in Russland (Abb.7). Ihre
vertikale Verbreitung reicht von Meeresniveau bis 2250m in den Pyrenäen und bis zu
3000m in den westlichen Zentralalpen (Niethammer 1981).
Verbreitung und Ökologie 16
Abb.7:Verbreitung von Microtus arvalis
Der Verbreitungsschwerpunkt von Microtus agrestris liegt nördlicher als der von Microtus
arvalis. Die NS-Ausdehnung reicht von etwa 40° nördl. Breite in Portugal bis zu 70° nördl.
Breite in Skandinavien. Von Westen her erstreckt sich ihr Areal von der Portugisischen
und Französischen Atlantikküste bis zum Ural im Osten. Ein weiteres großes Teilareal
befindet sich in den Altai- und Sajan- Gebirgsländern. Andere Fundorte im Osten, wie
zum Beispiel um die Stadt Sidorovsk, sind eher sporadisch (Abb.8).
In vertikaler Ebene kommt Microtus agrestris von Meeresniveau an bis zu 1950m am
Klausenpass in den Alpen vor (Niethammer 1981).
Abb.8: Verbreitung von Microtus agrestris
Verbreitung und Ökologie 17
3.3 Morphologie und Artdifferenzierung
Laut Niethammer (1981) ist es unmöglich, einen Bestimmungsschlüssel für Microtus Arten
nach äußeren Merkmalen, dem Schädel und den Zähnen getrennt abzugeben. Vielmehr
ist eine genaue Unterscheidung der einzelnen Arten oftmals so schwierig, dass selbst
eine Kombination dieser Merkmale noch nicht ausreicht, und Kenntnisse über die
Herkunft oder das Karyogramm ebenfalls zur Artbestimmung herangezogen werden
müssen.
So ist es auch nicht möglich, Microtus arvalis (Abb.9) und Microtus agrestris (Abb.10)
nach äußeren Merkmalen zu unterscheiden. Es wird zwar in der Literatur beschrieben,
dass dort wo beide Arten sympatrisch verbreitet, sind Microtus arvalis meist etwas kleiner
ist als Microtus agrestris, oder dass der Rücken der Erdmaus weniger grau ist, als der der
Feldmaus (Niethammer 1981, Urania 2000), jedoch sind diese Merkmale so variabel,
dass sie für eine ernsthafte Artunterscheidung nicht in betracht gezogen werden können.
Abb.9: Foto: Microtus arvalis
Abb.10: Foto: Microtus agrestris
Verbreitung und Ökologie 18
Auch die Schädelmerkmale, nach denen die Schädelkapsel von Microtus arvalis etwas
breiter, kürzer und flacher ist und rundere Umrisse hat wie die Schädelkapsel von
Microtus agrestris (Niethammer 1981), können aufgrund ihrer Varianz nicht zur
Artdifferenzierung herangezogen werden.
Ein genaueres Unterscheidungsmerkmal bieten da schon die Zähne. So ist das Gebiss
von Microtus agrestris dadurch charakterisiert, dass der M2 fast immer eine 3. linguale
Zacke, die sogenannte „agrestris-Schlinge“ besitzt. Auch ist der M1 von Microtus arvalis
immer ohne „exsul-Schlinge“ (vgl. Abb.11).
Abb.11: Molaren von Microtus agrestris mit „agrestris“ und „exsul-Schlinge“.
Eine genaue Differenzierung der beiden Arten kann jedoch über die Genetik erfolgen.
Eine Methode, die sich hierzu eignet ist das Erstellen eines Karyogramms. Denn obwohl
beide Arten diploid sind, gibt es doch erhebliche Unterschiede bezüglich ihrer
Chromosomensätze. So hat Microtus arvalis eine Karyotyp von 2n=46 und Microtus
agrestris einen Karyotyp von 2n=50. Auch gibt es große Unterschiede in der Struktur der
Chromosomen. Während bei Microtus agrestris das kleinste Autosomenpaar
metazentrisch und die übrigen akrozentrisch sind, besitzt Microtus arvalis 4 große
submetazentrische Autosomenpaare und 1 subtelozentrisches Autosomenpaar
(Niethammer 1981). Zwei weitere genetische Methoden zur genauen Identifikation der
Arten (RAPD-PCR, Multilocus-DNA-Fingerprinting) werden später noch ausführlich
besprochen (vgl. Kap. 5.3 & 5.10.1)
„agrestris-Schlinge“
„exsul-Schlinge“
Verbreitung und Ökologie 19
3.4 Ökologie
Im folgenden Ökologieteil wird nur Bezug auf Microtus arvalis genommen, da die Ökologie
von Microtus agrestris für diese Arbeit nicht relevant ist.
Microtus arvalis bevorzugt primär offenes, nicht zu feuchtes Grasland mit nicht zu dichter
Vegetation. Sekundär kann sie auch auf Wiesen, Getreidefelder oder Gärten ausweichen
(Stein 1952). In geschlossenen Wäldern, auf Mooren, Sumpfwiesen und in Felsen fehlt
sie ganz.
Sie leben in Gängen mit etwa 3,5cm Durchmesser. Diese lassen sich in Nest- und
Versteckbaue unterscheiden. Die Versteckbaue sind kurze einfache Systeme mit selten
mehr als 3 Zugängen, die oft Fraßkammern enthalten. Die Baue der Feldmaus werden so
angelegt, dass sie möglichst wassergeschützt liegen (Pelikan 1959).
Ihre Nahrung besteht in erster Linie aus den grünen Teilen von Gräsern und krautigen
Dikotylen, aber auch aus Samen, unterirdischen Pflanzenteilen, Rinde, Moosen und
tierischer Nahrung (Niethammer 1981). Laut Stein (1958a) fressen Feldmäuse vermutlich
auch die bei Auseinandersetzungen getöteten Artgenossen. Verzehrt wird die Nahrung an
versteckten Stellen an der Oberfläche oder in Fraßkammern im unterirdischen
Gangsystem (Stein 1958a, Pelikan 1959).
Die Aktionsräume von erwachsenen männl Feldmäusen werden von Reichstein (1960)
mit zwischen 1200-1500m2 angegeben, die von adulten weibl Feldmäusen mit zwischen
300-400m2. Je nach Populationsgröße ändert sich die räumliche Struktur einer
Feldmauspopulation. So sinkt mit steigender Dichte die Reviergröße der Weibchen
soweit, dass sich schließlich 2 oder mehr Weibchen ein Gebiet teilen und darin
fortpflanzen können, womit eine exklusive territoriale Nutzung eines bestimmten Revieres
aufgehoben ist (Frank 1957, Schön 1995).
Weibliche Feldmäuse können bereits in einem Alter von 11-13 Tagen geschlechtsreif
werden. Die männlichen hingegen werden erst deutlich später geschlechtsreif. Bei zu
hoher Feldmausdichte oder anderen widrigen Umständen wie Nahrungsmangel oder
schlechten Witterungsbedingungen stagniert die Entwicklung der im Sommer geborenen
Jungen und die Geschlechtsreife tritt erst mit dem folgenden Frühjahr ein. Die am häufigst
auftretende Tragzeit bei Microtus arvalis liegt zwischen 19-21 Tagen (Frank 1956a). Die
Fortpflanzungszeit liegt in Deutschland je nach Witterung zwischen März und Oktober.
Die in weiblichen Feldmäusen gefundene Embryonenzahl variiert zwischen 1-13, liegt
jedoch in dem Großteil der Fälle zwischen 3-8 Embryonen (Reichenstein 1957, 1960a),
bei bis zu 7 Würfen im Freiland pro Jahr. Da die Fortpflanzungszeit von Microtus arvalis
Verbreitung und Ökologie 20
hauptsächlich auf die Sommermonate beschränkt ist, erreichen sie gewöhnlich ihre
höchste Dichte im Herbst, im Frühjahr hingegen ihren Tiefststand.
Die Höchstdichten des Feldmausbestands ändert sich außerdem von Jahr zu Jahr. Heise
und Stubbe (1987) wiesen eine 2-4 jährige Periodenlänge im Massenwechsel der
Feldmaus nach, wobei der Anteil eines 3 jährigen Zyklus dominierte. Erklärt werden diese
Zyklen durch die Witterung. Aber auch der Nahrungsmangel spielt mit zunehmender
Dichte durch die Verschlechterung der Nahrungsgrundlage der Feldmäuse im Herbst eine
große Rolle. Eine besondere Wirkung auf den Massenwechsel von Microtus arvalis
zeigen starke klimatische Schwankungen und Abweichungen vom langjährigen
Durchschnitt. Hierbei spielt der klimatische Verlauf des Winters und des Frühjahrs eine
wesentlich größere Rolle im Zyklus der Feldmaus als die Sommerwitterung, da hier über
das Überleben der Tiere in der für sie ungünstigen Jahreszeit entschieden wird (Heise &
Stubbe 1987).
Da die Feldmaus in weiten Teilen ihres Areals zu der am häufigst vorkommenden
Säugetierart gehört, spielt sie als Nahrung von Greifvögeln (z.B. Buteo buteo, Falco
tinnunculus), Eulen (z.B. Asio otus) und carnivoren Säugern (z.B. Vulpes vulpes, Mustela
nivalis, Mustela erminea) eine große Rolle. Eine nicht zu unterschätzende Todesursache
ist auch in der Elimination von männl Feldmäusen infolge innerartlicher
Auseinandersetzungen zu sehen. Diese ist natürlich um so größer, je höher die Dichte ist
(Stein 1953b).
Material und Methoden 21
4. Material und Methoden
4.1 Material
4.1.1 Puffer und Lösungen für Multilocus-DNA Fingerprinting und RAPD-PCR
Autoklaviertes H2O deion.
PCR-Puffer 10x 100 mM Tris-HCl (pH 8,8)
15 mM MgCl2
500 mM KCl
1 % Triton X-100
SE - Puffer 25 mM NaCl
75 mM Na2EDTA
1 % SDS
pH 8,0
TBE - Puffer 10x 0,9 M Tris
0,9 M Borsäure
0,1 M Na2EDTA
pH 8,0 - 8,2
=> (Amresco Inc., Solon, Ohio)
TBS - Puffer 0,9 M NaCL
0,1 M Tris
pH 7,5
=> (Amresco Inc., Solon, Ohio)
NaCl - Lösung 6,0 M NaCl
NaAcetat - Lösung 3,0 M NaAcetat
Material und Methoden 22
SSC 6x 0,9 M NaCl
0,09 M Na3Citrat
pH 7,0
=> (Amresco Inc., Solon, Ohio)
Stop - Lade - Mix 100 mg Bromphenolblau / 100 ml
40 % Saccharose
0,1 M EDTA
Bisbenzimidlösung 1 mM = 0,6 mg/ml Bisbenzimid
(Hoechst H33258)
Ethidiumbromidlsg. 1 µg/ml Ethidiumbromid
=> (Boehringer, Ingelheim)
Depurinationslösung 0,25 M HCl
Blottinglösung 0,4 M NaOH
Denaturierungslösung 0,5 M NaOH
1,5 M NaCl
Tris/HCl 0,9 M NaCl
0,1 M Tris
0,05 M MgCl2
pH 9,5
Antikörperlösung 10 µl Antikörperkonjugat in 10 ml TBS - Puffer
=> (Boehringer, Mannheim; Dig Detection Kit)
SSPE 20x 3,0 M NaCl
0,2 M NaH2PO4 x H2O
0,02 M Na2EDTA x 2 H2O
pH 7,4
=> (Amresco Inc., Solon, Ohio)
Material und Methoden 23
Präblocking - Lösung 0,5 % Blocking Reagenz
=> (Boehringer, Mannheim; Dig Detection Kit)
Blocking - Lösung 0,5 % Blocking Reagenz
=> (Boehringer, Mannheim; Dig Detection Kit)
Denhardts - Lösung 100x => (Amresco Inc., Solon, Ohio)
Prähybridisierungslösung 2,5 ml 20x SSPE
0,5 ml 100x Denhardts-Lösung
0,1 ml 10 % SDS
100 µg E. coli DNA (denaturiert und fragmentiert)
auf 10 ml Endvolumen mit sterilem H2O deion.
auffüllen
Hybridisierungslösung 2,5 ml 20x SSPE
0,5 ml 100x Denhardts-Lösung
0,1 ml 10 % SDS
100 µg E. coli DNA (denaturiert und fragmentiert)
140 pmol Sonde
auf 10 ml Endvolumen mit sterilem H2O deion.
auffüllen
Sonden (GTG)5 digoxigenin markiert
(CA)8 digoxigenin markiert
(GATA)4 digoxigenin markiert
(GACA)4 digoxigenin markiert
=> (Firma Biometra, Göttingen)
Färbelösung 10 ml Tris/HCl
200 µl NBT/BCIP in Dimethylformamid
pH 9,5
=> (Boehringer, Mannheim; Dig Detection Kit)
Chloroform p.a. => (Merck, Darmstadt)
Material und Methoden 24
Phenol - Chloroform pH 8,0
=> (Amresco Inc., Solon, Ohio)
Ethanol absolut p.a. => (Merck, Darmstadt)
Ethanol 70 %
4.1.2 Enzyme und Längenstandards für Multilocus-DNA Fingerprinting und RAPD-
PCR
Polymerase DNAZymeII
=> (Firma Biometra)
Restriktionsenzyme Eco R1
Hae III
Hind III
Hinf I
Taq I
=> (Takara Shuzo Co., LTD, Japan)
Längenstandard Hind III verdaute Lambda DNA
=> (Amresco Inc., Solon, Ohio)
100 bp DNA Ladder
=> (Takara Shuzo Co., LTD, Japan)
Proteinase K => (Amresco Inc., Solon, Ohio)
4.1.3 Primer für RAPD-PCR
Kit Roth-A 20 Primer
Kit Roth-B 20 Primer
Kit Roth-C 20 Primer
Kit Roth-D 20 Primer
Kit Roth-180 10 Primer
Kit Roth-280 10 Primer
Material und Methoden 25
Kit Roth-380 10 Primer
Kit Roth-480 10 Primer
4.1.4 Geräte und Sonstiges für Multilocus-DNA Fingerprinting und RAPD-PCR
Agarose Serva for DNA Elektrophoresis – Analytical Grade
=> (Boehringer, Ingelheim)
Agarose Type 1
=> (Amresco Inc., Solon, Ohio)
Elektrophoresekammer: Sub-Cell GT Agarose Gel Electrophoresis System
=> (BIO-RAD, München)
Filme: SW-Film Polaroid Typ 667, ISO 3000
=> (Polaroid GmbH, Offenbach)
Gelgießstand: => (BIO-RAD, München)
Hybridisierungsgefäß: => (Techne, Cambridge, United Kingdom)
Hybridisierungsofen: HB-1D
=> (Techne, Cambridge, United Kingdom)
Kunststoffpipetten: 3 ml
=> (Fischer Labortechnik, Frankfurt)
Mikrowelle: Micromat 135
=> (AEG)
Netzgerät: PowerPac 300
=> (BIO-RAD, München)
Photometer Gene Quant II
=> (Pharma Biotech, Cambridge, U.K.)
Photosystem: Polaroid MP-4, Filter#15 orange
=> (Polaroid GmbH, Offenbach)
Material und Methoden 26
Pipettenspitzen: Plasti - Brand 0,5 - 10µl, 10 - 100µl, 100 - 1000µl
=> (Brand, Wertheim/Main)
Reaktionsgefäße: 1,5 ml
=> (Eppendorf, Hamburg)
2 ml
=> (Biozym, Hess. Oldendorf)
0,2 ml PCR-Gefäße
=> (Biozym, Hess. Oldendorf)
Thermocycler Gene A. PCR System 9700, PE (Applied Biosystems)
=> Perkin Elmer, Norwalk, USA)
UV - Transilluminator: N-90M (INTAS)
=> (Konrad Bender)
Pipetten: 0,5 - 10µl, 10 - 100µl, 100 - 1000µl
=> (Eppendorf, Hamburg)
Waage: Precisa 160 A
=> (PAG Oberlikon AG, Zürich)
Wärmeschrank: U 40
(Memmert, Schwabach)
Zentrifuge: Universal Tischkühlzentrifuge Z 320K
=> (Hermle GmbH & Co., Gosheim)
Material und Methoden 27
4.2 Probenahme und Probenmaterial
Zum Fang der Feldmaus werden drei verschiedene Fallensysteme eingesetzt, die
Holzkastenfalle mit Blechwippe (Abb.14), die Hengstlerfalle (Abb.15) und die Kunststoff-
Wieselfalle mit feingehendem Wippbrett (Abb.16). Die Fallen werden auf den einzelnen
Standorten so ausgebracht, dass sie über die ganze Fläche verteilt sind. Die Mäuse, die
in der Hengstlerfalle und der Kunststoff-Wieselfalle gefangen werden, werden lebend in
einen durchsichtigen Nylonbeutel überführt und auf Gattungsniveau bestimmt. Mäuse, die
in der Holzkastenfalle gefangen worden sind, können durch die Bauart der
Holzkastenfalle bedingt direkt bestimmt werden.
Beködert werden die Fallen mit Haferflocken, Haselnüssen, Erdnussbutter, Katzenfutter
oder Früchtemüsli.
Auf diese Art konnten an den 5 Standorten insgesamt 161 Microtus arvalis gefangen
werden (Tab.2).
Tab.2: Anzahl der gefangenen Microtus arvalis pro Standort
Standort Gefangene
Mäuse
Zill (Brachfläche bei Wahlen) 53
Hohberg (Brachfläche bei Wahlen) 32
Knospenhof (ökologisch, mit Gerste bewirtschaftete Fläche bei Herl) 31
Eiden (intensiv, mit Gerste bewirtschaftet Fläche bei Herl) 19
Herl Brache (Brachfläche bei Herl) 26
Alle dieser 161 Feldmäuse wurden mit der RAPD-PCR, 99 von ihnen mit dem Multilocus-
DNA-Fingerprinting untersucht.
Unter den 161 gefangenen Feldmäusen sind 6 trächtige Weibchen mit zwischen 3 und 6
Föten gewesen.
Nach dem Fang werden die Mäuse der Gattung Microtus getötet und bei –20°C, einzeln
in Gefrierbeuteln verpackt, eingefroren.
Zur Isolierung hochmolekularer genomischer DNA werden den Mäusen in noch
gefrorenem Zustand Muskelgewebe und die Leber entnommen. Nach der Entnahme wird
das Gewebe entweder direkt weiterverarbeitet oder wieder eingefroren.
Material und Methoden 28
4.3 Methode des DNA - Fingerprinting
4.3.1 DNA Isolierung
Die Isolierung chromosomaler DNA aus dem Gewebe von Microtus arvalis wurde mit der
Salz-Chloroform-Methode (Lagoda et al. 1989 bzw. Müllenbach et al. 1989) durchgeführt.
Dazu werden ungefähr 200 mg der tiefgefrorene Leber in einem Mörser unter Zugabe von
flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver zerrieben. Nachdem der Stickstoff verdampft
ist, wird die Probe in ein mit 2,5 ml SE-Puffer gefülltes Zentrifugenröhrchen übertragen.
Der SE-Puffer bricht hierbei die Zellmembran auf und unterdrückt DNase-Aktivitäten.
Danach wird das Gemisch mit 70 µl Proteinase K-Lösung (20 mg/ml), welche die Proteine
verdaut, versetzt und für 12 - 18 h bei 65°C im Hybridisierungsofen inkubiert. Nach einer
Inkubationszeit von 2 h werden wiederum 40 µl Proteinase K hinzupipettiert.
Am folgenden Tag wird diesem Verdau zuerst 0,9 ml 6 M NaCl, welche auf 65° C
vorgewärmt ist, und nach kurzem Schwenken 3,5 ml Phenol-Chloroform hinzugefügt. Das
Zentrifugenröhrchen wird nun zwischen Kühlakkus liegend für 30 Minuten in einem
Überkopfschüttler (kleinste Stufe) gemischt. Durch 30 minütige Zentrifugation bei ca.
5500 U/min wird eine Phasentrennung zwischen der wässrigen und der organischen
Phase erreicht. Möglichst viel von der wässrigen Phase wird nun sehr vorsichtig mit einer
Kunststoffpipette abgehoben und in ein anderes Zentrifugenröhrchen überführt. Die
organische Phase und die Interphase, in welcher sich Proteinreste, degradierte DNA und
RNA absetzen, werden verworfen. Die wässrige Phase wird mit 7 ml eisgekühltem
absolutem Ethanol versetzt und durch leichtes Schwenken wird die DNA zum Ausfallen
gebracht. Mit Hilfe eines sterilen Glashäkchens (= Pasteurpipette, deren Spitze mit einem
Bunsenbrenner zu einem Häkchen gebogen und zugeschmolzen wurde) wird der DNA-
Knäul der wässrigen Phase entnommen und zum Reinigen über Nacht in 70 % igem
Ethanol aufbewahrt.
Zur Isolierung der DNA eignet sich sowohl die Muskulatur als auch die Innereien.
Vorwiegend wurde jedoch die Leber verwendet, da es sich hierbei um ein relativ weiches
Gewebe handelt, welches sehr gut und schnell von der Proteinase K verdaut werden
kann. Die Menge an DNA, die aus der Leber gewonnen werden kann ist um ein
vielfaches höher, als die Menge an DANN, welche aus der gleichen Masse an Muskulatur
bzw. Niere zu isolieren ist.
Material und Methoden 29
4.3.2 Probegel
Zur Überprüfung des Reinheitsgrades und zur Konzentrationsabschätzung der isolierten
DNA wird ein Probegel verwendet. Nach der Elektrophorese erfolgt eine Betrachtung
dieses Gels auf dem Transilluminator. Ist die DNA gut aufgereinigt und hochmolekular,
erscheint diese als klare, scharfe Bande nahe der Auftragstelle. Verunreingungen und
degradierte DNA laufen dieser scharfen Bande als Schmier voraus; die Konzentration
verhält sich ungefähr proportional zur Intensität der Bande.
Zur Herstellung eines 0,8 %-igen Probegels wird 1,2 g Agarose (Serva, Nr. 11404) in
einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben abgewogen, in 150 ml TBE-Puffer suspendiert und in
der Mikrowelle durch Erwärmen aufgelöst. Während die klare Lösung langsam auf 55°C
abkühlt, wird der Gießtrog in den Gelgießstand eingespannt und der Slot-Kamm in etwa 3
cm Entfernung vom Gießtrog-Anfang gesetzt. Ist eine Temperatur von 55°C erreicht,
werden 5 µl Ethidiumbromid zur Agarose hinzupipettiert und gemischt. Die Agarose wird
vorsichtig in den Gießtrog gegossen, wobei auftretende Luftblasen mit einer
Pasteurpipette entfernt werden. Nach Erkalten der Agarose wird diese mit dem Gießtrog
in die Elektrophoresekammer, die mit TBE-Puffer ca. 5 mm über Gelhöhe gefüllt ist,
gesetzt und der Slot-Kamm entfernt. Hierbei muss darauf geachtet werden, dass der
Gießtrog-Anfang mit dem Slot-Kamm auf der Kathodenseite in die Kammer gesetzt wird,
da die DNA negativ geladen ist und somit Richtung Anode wandert. Aus den
Stammlösungen der DNA Proben werden jeweils 20 µl in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß
abpipettiert, mit 4 µl Stop-Lade-Mix versetzt, gemischt und mit einer Pipette (10 - 100 µl)
in die Kammtaschen gefüllt. Die Elektrophorese läuft etwa 120 Minuten bei 50 mA. Nach
dem Ende der Elektrophorese wird das Gel mit dem Gießtrog der Elektrophoresekammer
entnommen, auf dem Transilluminator begutachtet und fotografiert.
4.3.3 Bestimmung der Konzentration und der Reinheit der DNA - Stammlösung
Nachdem der DNA-Gehalt und die Reinheit anhand des Probegels grob abgeschätzt
worden sind, erfolgt eine genaue Qualitäts- und Quantitätsbestimmung an einem UV-
Photometer.
Material und Methoden 30
Die Bestimmung des DNA-Gehaltes erfolgt unter der Annahme, dass 1 OD (optische
Dichte), bei 260 nm gemessen, einer Konzentration von 50 µg/ml (Wieacker und Müller
1985) doppelsträngiger DNA entspricht. Dazu werden 100 µl der DNA-Stammlösung für
die photometrischen Messungen 1:20 verdünnt. Um Verunreinigungen durch Proteine
und aromatischen Aminosäuren feststellen zu können, wird zusätzlich die Extinktion bei
280 nm gemessen. Die Reinheit der DNA ergibt sich aus dem Quotienten der
Extinktionen bei 260 nm und 280 nm. Reine DNA hat einen Wert von 1,8. Werte, die
darunter liegen, weisen auf Verunreinigungen durch Phenol, Chloroform oder Proteine
hin. Werte über 1,8 deuten auf das Vorhandensein von RNA oder degradierter DNA hin.
4.3.4 Restriktionsverdau
Beim Restriktionsverdau wird die doppelsträngige DNA mittels Restriktionsendonukleasen
(DNA-spaltende Enzyme) an kurzen, jeweils spezifischen Erkennungssequenzen
geschnitten. Da diese Erkennungssequenzen in unterschiedlichen Abständen im Genom
vorkommen, entstehen Fragmente unterschiedlicher Länge.
Die genomische DNA wird hierfür in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit dem
Restriktionsenzym Hinf I und der entsprechenden Menge Verdaupuffer versetzt und über
Nacht bei 37°C verdaut.
Am nächsten Morgen werden die Restriktionsfragmente gefällt.
Zum Restriktionsverdau werden bei Raumtemperatur 30 µl Na-Acetat-Lösung (3 M)
gegeben und gemischt. Anschließend werden 500 µl eisgekühlter Ethanol zum Fällen der
Restriktionsfragmente hinzugegeben und die Probe für 30 min im Gefrierschrank bei -
20°C gelagert. Die Lösung wird danach bei 4°C für 30 min mit 14000 U/min zentrifugiert,
so dass der Überstand nach der Zentrifugation verworfen werden kann. Das Pellet wird
zweimal mit 70 %-igem Ethanol gespült und wiederum für 30 min mit 14000 U/min
zentrifugiert. Nachdem der Überstand abermals verworfen und das Pellet bei
Raumtemperatur angetrocknet worden ist, bleibt die fragmentierte DNA zum Auflösen in
20 µl H2O deion. über Nacht im Kühlschrank.
Material und Methoden 31
4.3.5 Submarine - Agarose - Gelelektrophorese
Die durch den Restriktionsverdau erhaltenen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge
werden mittels der Submarinen-Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Hierzu wird eine
elektrische Spannung an ein Gel, welches als ein engmaschiges dreidimensionales Gitter
vorzustellen ist, gelegt. Die einzelnen Fragmente (negativ geladen) wandern in dem
elektrischen Feld bei gleicher Ladung aufgrund ihrer unterschiedlichen Länge
verschieden weit in das Gel in Richtung Anode, wobei lange Fragmente aufgrund der
sterischen Hinderung nicht so schnell durch das Gel wandern können wie kürzere.
Zur Submarinen-Agarose-Gelelektrophorese wird ein 0,8 %iges Agarosegel verwendet.
Dabei werden 1,6 g Agarose in einen 250 ml Erlenmeyer-Kolben eingewogen, in 200 ml
TBE-Puffer suspendiert und in der Mikrowelle aufgelöst. Das weitere Vorgehen wurde
bereits unter dem Punkt Submarine-Agarose-Gelelktrophorese (15 x 15 cm Probegel)
beschrieben, abgesehen von folgenden Abwandlungen:
- bei 55°C werden 1 µl Ethidiumbromid zur Agarose pipettiert und gemischt
- der verwendete Gießtrog hat die Maße 15 x 25 cm
- der Slot-Kamm wird in nur 1 cm Entfernung vom Gießtrog-Anfang gesetzt
- als DNA-Fragment-Längenstandard diente Hind III-verdaute λ-DNA
- die Elektrophorese läuft für 24 h bei 25 mA
Das Ergebnis der Trennung wird über einem UV-Transilluminator begutachtet und
fotografiert. Die durch den DNA-Längenmarker gekennzeichneten DNA-Fragmente
werden mit einer Pasteurpipette ausgestanzt.
4.3.6 Vakuum Blotting
Beim Vakuum Blotting wird mit einem Vakuum Blotter (Abb.12) die negativ geladene DNA
aus dem Agarosegel auf die darunter liegende positiv geladene Nylonmembran
transferiert. Dies geschieht dadurch, dass ein Vakuum erzeugt wird, welches die
Blottinglösung, die als Transportmedium für die DNA dient, durch das Gel und die
Membran transferiert. Da nun die DNA Fragmente größer sind, als die Porengröße der
Nylonmembran, können diese die Membran nicht durchdringen und bleiben an ihr haften.
Material und Methoden 32
Abb.12: Vakuum Blotter
Um den Vakuum Blot ausführen zu können, sind einige Vorbereitungen nötig. Zuerst
werden die Geltaschen mit 1,0 %-iger Agarose verschlossen. Danach wird das Gel in
einer Wanne auf dem Schütteltisch 30 min mit der Denaturierungslösung denaturiert und
anschließend 15 min mit der Blottinglösung inkubiert. Während dieser Zeit werden nun
der Gelgröße entsprechend das Filterpapier und die Nylonmembran zurechtgeschnitten
und zuerst mit destilliertem Wasser angefeuchtet, später dann in der Blottinglösung
getränkt. Der Aufbau des Vakuum Blottes erfolgt so, wie in Abb.13 dargestellt. Eventuell
auftretende Luftblasen zwischen Filterpapier und Membran sind durch Abrollen der
Membran mit einer 10ml Glaspipette zu entfernen.
Abb.13: Aufbau eines Vakuum Blottes
Ist die Apparatur aufgebaut, werden ca. 1,5 l Blottinglösung in das Reservoir über dem
Gel geschüttet. Der Unterdruck wird zwischen 3 und 4 Inches Hg eingestellt. Die durch
Abdichtrahmen
Agarosegel
Gummidichtung mit Fenster
Positiv geladene Nylonmembran
Filterpapier Poröse Platte
Basis Modul
Glaskolben zum Auf- fangen der Blottinglösung
Vakuum Pumpe
Basismodul
Blottinglösung
Material und Methoden 33
das Gel und die Membran gesogene Blottinglösung wird in einem Glaskolben mit
seitlichem Anschluss, der zwischen Blot und Vakuumpumpe geschaltet ist, aufgefangen.
Nach 4 Stunden wird der Vakuum Blot wieder abgebaut und das Resultat auf dem UV-
Transilluminator begutachtet.
Anschließend wird die Membran kurz in 6x SSC gespült und zur DNA Fixierung für 2 h bei
80°C im Trockenschrank gebacken. Die so präparierte Membran kann nun bis auf
Weiteres im Kühlschrank gelagert werden.
4.3.7 Prähybridisierung
Die Prähybridisierung soll unspezifische Bindungen an die Membran verhindern. Hierbei
wird die einzelsträngige DNA mit fragmentierter und denaturierter DNA von Echerischia
coli komplementiert.
Die gebackene Membran wird zuerst mit 70 %-igem Ethanol, dann mit deionisiertem
Wasser und anschließend mit 6 x SSC gespült und mit Hilfe einer Pipette in einem
zylinderförmigen Hybridisierungsgefäß so abgerollt, dass die DNA Seite innen ist. Danach
wird die Membran mit der Prähybridisierungslösung bei 25°C im Hybridisierungsofen
inkubiert.
4.3.8 Hybridisierung und Blocking
Eine Stunde später wird die Prähybridisierungslösung gegen die Hybridisierungslösung
ausgetauscht. Die Hybridisierung erfolgt über einen Zeitraum von 5 Stunden bei 38°C im
Hybridisierungsofen. Beim Hybridisierungsvorgang wird die Mikrosatelliten Sonde
(GACA)4, die mit Digoxigenin markiert ist, an die DNA angelagert. Die sondenspezifische
Hybridisierungstemperatur wird nach folgender Formel berechnet:
Ti = Tm - 10°C
wobei
Ti: Hybridisierungstemperatur der Sonde
Tm: Schmelztemperatur der Oligonukleotid - Sonde = 4 × (Anzahl der Basen
an Guanin und Cytosin) + 2 × (Anzahl der Basen an Adenin und Thymin)
Bsp.:
Sonde (GACA)4 = (GACAGACAGACAGACA)
Material und Methoden 34
Ti = {4 × (GGGG) + 4 x (CCCC) + 2 × (AAAAAAAA)} - 10°C
ð Ti = (4 × 4 + 4 x 4 + 2 × 8) - 10°C = 38°C
Nach der Hybridisierung wird die Membran dreimal je 30 min mit 6 x SSC bei 25°C
gewaschen, um unspezifisch angedockte Sonde abzuwaschen. Anschließend wird die
Membran über Nacht mit 0,5 %iger Blocking-Lösung bei 25°C im Hybridisierungsofen
inkubiert, um unspezifische Bindungen des Antikörpers an die Membran zu verhindern.
4.3.9 DIG-Antikörperbehandlung und Immunologische Detektion
Am nächsten Morgen wird die Blocking Lösung durch zweimaliges kurzes (ca. 5 min)
Spülen in je 20 ml TBS-Puffer bei 25°C entfernt und die Membran gleichzeitig auf den
benötigten pH Wert von 7,5 äquilibriert. Danach wird die Membran ebenfalls bei 25°C für
20 min mit der Antikörperlösung inkubiert, um das Anti-Digoxigenin-Alkalische-
Phosphatase-Konjugat an die hybridisierten, mit Digoxigenin markierten Nukleinsäuren zu
binden. Die Antikörperlösung wird nach der Inkubation verworfen. Zum völligen Entfernen
der Antikörperlösung wird die Membran dreimal je 10 min bei 25°C mit 10 ml TBS-Puffer
gespült. Anschließend wird die gespülte Membran für 15 min mit 10 ml Färbe-Puffer
(ohne Farbstoff) auf pH 9,5 äquilibriert. Die äquilibrierte Membran wird im
Hybridisierungsofen bei 37°C im Hybridisierungsgefäß mit 20 ml Färbe-Lösung
behandelt. In der nachfolgenden Enzym- katalysierten Farbreaktion mit BCIP (5-Brom-4-
chlor-3-indolyl-phosphat) und NBT (Nitroblau-Tetrazoliumsalz) entsteht ein brauner, bei
längerer Behandlung, blauer Niederschlag, der die Hybridmoleküle sichtbar macht. Der
Niederschlag rührt daher, dass die Alkalische Phosphatase Phosphat spaltet und bei
dieser Reaktion Elektronen freigesetzt werden, die den Farbstoffvorläufer NBT in einen
unlöslichen Farbstoff umwandeln. Die Phosphatase-Farbreaktion wird bei pH 9,5 und
Anwesenheit von Magnesium-Ionen durchgeführt. Wenn das Ziel, ein möglichst gutes
Banden / Hintergrund-Verhältnis, was sich nach etwa 30 - 60 Minuten eingestellt hat,
erreicht ist, wird die Farbreaktion durch Waschen mit H2Odeion. beendet. Die Membran mit
den Hybridisierungsmustern wird anschließend getrocknet und lichtgeschützt in einer
Klarsichtfolie aufbewahrt.
Material und Methoden 35
4.4 RAPD-PCR
Für die RAPD-PCR wird dieselbe DNA verwendet, die bereits zuvor mit der Salz-
Chloroform-Methode isoliert und für das Multilocus-DNA-Fingerprinting verwendet worden
ist. Da die Konzentration dieser DNA-Lösung für die RAPD-PCR zu hoch ist, wird ihr ein
Teil entnommen, und auf einen Wert von 0,1 µg DNA pro µl Lösung verdünnt.
Um das Auftreten von unerwünschten Reaktionen zu vermeiden, sollen die Schritte von
der Vorlage der DNA bis zum Einsetzen der Proben in den Thermocycler in möglichst
kaltem Milieu stattfinden. Aus diesem Grund werden alle Vorgänge bis zum Einsetzen der
Proben in den Thermocycler auf Eis durchgeführt.
Je Probe werden 2 µl dieser DNA Lösungen (200 ng Template DNA pro Probe) in
beschriftete und im Eisblock stehende 0,2 ml PCR-Gefäße übertragen.
Der Mastermix für 20 Proben setzt sich aus 400 µl gekühltem H2Obidest., 58 µl Puffer, 58
µl Primer, 12 µl dNTP`s und 6 µl Polymerase, die in einem 1,5 ml Eppendorf
Reaktionsgefäß gemischt werden, zusammen. Pro Probe werden 23 µl dieses
Mastermixes zu den 2 µl DNA Lösung hinzupippetiert und gut vermischt. Die so
vorbereiteten Proben werden nun in den Thermocycler gestellt.
Bevor die 40 Zyklen beginnen, sollte die DNA 5 min auf 94°C erhitzt werden, um sie
vollständig zu denaturieren und um eventuelle Endonukleasen oder sonstige Störfaktoren
zu deaktivieren.
Darauf folgen 40 Zyklen, wobei die DNA bei jedem Zyklus 30 sek bei 94°C denaturiert
wird, die RAPD-Primer sich 1min bei 36°C an die denaturierte DNA anlagern können, und
der DNA Strang zwischen den Primern 2 min bei 72°C synthetisiert wird.
Der letzte Sytheseschritt wird noch für 10 min gehalten. Danach werden die Proben auf
4°C heruntergekühlt.
Die elektrophoretische Auftrennung der Amplifikationsprodukte erfolgt in einem 1,4
%igem Agarosegel. Wie auch beim Probegel wird hierbei ein 15 x 15 cm großes Tray und
ein Slotkamm mit 20 Zähnen verwendet. Um ein 1,4 % iges Gel herzustellen werden 2,1
g Agarose Typ 1 (Amresco Inc., Solon, Ohio) in 150 ml TBE-Puffer unter Hitzeeinwirkung
gelöst. Damit die Amplifikationsprodukte auf dem UV-Transilluminator sichtbar werden,
wurden die Lösung bei 60°C mit 7,5 µl Ethidiumbromid versetzt.
Zu den 25 µl PCR-Proben (2 µl DNA Lösung + 23 µl Mastermix) werden noch 4 µl Stop-
Lade-Mix hinzugegeben. Anschließend werden die Proben in die Taschen des
Agarosegels einpipettiert. Zur elektrophoretischen Auftrennung wird eine Stromstärke von
40 mA über einen Zeitraum von 4 h angelegt, was einer Laufstrecke von etwa 10 cm
Material und Methoden 36
entspricht. Nach der Elektrophorese werden die Amplifikationsprodukte auf dem UV-
Transilluminator betrachtet und fotografisch festgehalten.
4.5 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Fingerprints erfolgte nach den „klassischen“
Auswertverfahren von Lynch (1991), die für codominante Marker im DNA-Fingerprinting
entwickelt wurden.
In die Wertung kamen bei der vorliegenden Arbeit nur Banden, die innerhalb eines
Auswertbereiches von 1000 bis 23500 bp lagen. Diese Banden wurden dann im Hinblick
auf jede Bandenposition mit (I) für anwesend und (0) für nicht anwesend beurteilt, in eine
0/I Matrix übertragen und ausgewertet
4.5.1 Anzahl der Banden
Die durchschnittliche Anzahl von polymorphen Banden (∈) (Banden, die nicht in allen
Individuen vorkommen) pro Individuum, wird aus der Summe der polymorphen Banden
(ni) aller Individuen durch Bildung des arithmetischen Mittels bestimmt.
inx
∑∈=1
ni : Anzahl der polymorphen Banden
x : Stichprobengröße
Zusätzlich dazu wurde die Standardabweichung (s) bestimmt:
( )11
2
2
1−
−=
∑
=∑=
nn
nS
n
iii
n
ixx
Material und Methoden 37
4.5.2 Berechnung der Bandsharing-Rate (BSR) bzw. der mittleren
Wahrscheinlichkeit für eine übereinstimmende Bande
Die Bandsharing-Rate für zwei Individuen x und y berechnet sich aus der doppelten
Anzahl gemeinsamer Banden in ihrem Fingerprint-Profil dividiert durch die Summe der
individuellen Bandenzahlen. Sie entspricht gleichzeitig der mittleren Wahrscheinlichkeit Pb
(von einigen Autoren auch x genannt, u.a.: Jeffreys et al. 1985, Georges et al. 1988),
dass eine Bande bei nichtverwandten Tieren gleichzeitig vorkommt. Verschiedene
Autoren bezeichnen die Bandsharing-Rate auch als Ähnlichkeitskoeffizient, Band-
Similary-Index, Bandsharing-Frequency, Bandsharinglevel oder D-Wert (Nei & Li 1985,
Wetton et al. 1987, Haberfeldt et al. 1991, Lynch 1991, Nybom 1991, Wagner 1995,
Dahle 1996)
yx
xyb
nnn
PBSR+⋅
==2
nx : Zahl der Banden von Individuum x
ny : Zahl der Banden von Individuum y
nxy : Zahl der Banden, die Individuum x und Individuum y gemeinsam haben
4.5.3 Wahrscheinlichkeit Pi, dass zwei Fingerprints identisch sind
Die Wahrscheinlichkeit von zwei absolut identischen Fingerprints (Pi) berechnet sich aus
der Wahrscheinlichkeit, dass eine Position von zwei zufällig ausgewälten Individuen einer
Population identisch ist [ (1 - 2 Pb) + (2Pb2) ], und dem Exponenten N, der die Anzahl der
beurteilten Positionen bezeichnet.
( ) ( )[ ]bb
Ni PPP 2
221 +−=
Pb : Wahrscheinlichkeit, für eine übereinstimmende Bande
N : Anzahl der beurteiten Positionen
Material und Methoden 38
4.5.4 Wahrscheinlichkeit Pg, dass Individuum x die gleichen Banden aufweist wie
Individuum y
Pg gibt die Wahrscheinlichkeit an, dass ein zufällig aus einer Population entnommenes
Individuum x die gleichen Banden aufweist, wie ein Individuum y. Hierbei kann Individuum
y noch zusätzliche Banden zeigen. Somit gibt Pg also nicht die Wahrscheinlichkeit für
identische Muster an.
Pb: Wahrscheinlichkeit für eine übereinstimmende Bande ∈: Durchschnittliche Zahl der polymorphen Banden
4.5.5 Berechnung des Verwandtschaftkoeffizienten
Anhand der Bandsharing-Rate von Individuen einer Population ist es nicht möglich auf die
Verwandtschaftsverhältnisse zu schließen, besonders nicht bei Individuenpaaren mit
geringem Verwandtschaftsgrad (Burke & Bruford 1987, Lynch 1988 & 1991, Jones et al.
1991). Das ist dadurch zu erklären, dass unverwandte Individuen ein gewisses
Hintergrund-Bandsharing aufweisen. Die Gründe dieses Hintergrund-Bandsharing sind
zum Einen darin zu sehen, dass Banden auch bei unverwandten Individuen
übereinstimmen können, wenn die betreffenden Allele per Zufall identisch sind, zum
Anderen kann es sich hierbei auch um komigrierende Banden handeln, die jedoch keine
identischen Allele beinhalten.
Den Zusammenhang zwischen Verwandtschaftskoeffizienten, Bandsharing-Rate und
Hintergrund-Bandsharing stellt folgende Formel dar:
( )eeBSR
r−
−=
1
r : Verwandtschaftskoeffizient
BSR : Bandsharingrate
e : Hintergrund Bandsharing (gemeinsame Banden von nichtverwandten Individuen)
∈= bg PP
Material und Methoden 39
4.5.6 Populationsdifferenzierung
In Analogie zu Wright`s Index der Populationsdifferenzierung, F´ST (1976), gibt Lynch eine
Näherungsformel an, mit der man die Differenzierung von Populationen bestimmen kann.
bw
bST SS
SF −−−= 2
1`
Sb: durchschnittliche BSR für alle Paare der Populationen x und y
Sw: durchschnittliche BSR der Population y
Die Formel geht auf Wight`s „Index of population subdivision“ zurück. Der F´ST Wert ist
definiert als der Bruchteil der genetischen Diversität, der auf ein
Populationsdifferenzierung zurückzuführen ist. Er gilt als Maß der genetischen
Verarmung einer Population und kann in zwei Richtungen berechnet werden. Der Index
berechnet die Abweichung der BSR einer Population von den BSR zwischen den
Populationen. Die hierbei errechneten Werte können zwischen 0 und 1 liegen. Der
Maximalwert von 1 wird dann erreicht, wenn in lokalen Populationen alternierende Allele
fixiert werden und somit ein Verlust jeglicher genetischen Variablität eintritt.
4.5.7 Genetische Distanz zwischen Populationen
Die genetische Distanz (D’ij) zwischen Populationen kann nach Lynch (1991), in Analogie
zu Nei’s Schätzung (1972) auch mit den DNA Fingerprint Daten berechnet werden. Sie ist
definiert als arithmetisches Mittel aller an einem Genort festgestellten genetischen
Distanzen und gilt als Maß für die genetische Unterscheidbarkeit von Populationen. Bei
großer Übereinstimmung strebt dieser Wert gegen 0, bei geringer Übereinstimmung
gegen 1, bzw. formelbedingt gegen ∞.
⋅−≅
```´
ln`SS
Sji
ijijD
Si : durchschnittliche BSR innerhalb der Population x
Sj : durchschnittliche BSR innerhalb der Population y
′Sij : durchschnittliche BSR (zufälliger Individuenpaare) der Populationen y und y
Material und Methoden 40
4.5.8 Durchschnittliche Allelfrequenz q für eine Bande
Bei Vorliegen eines genetischen Gleichgewichtes und unter der Annahme, dass
comigrierende Banden immer dasselbe Allel darstellen und alle Banden Allele eines
Locus sind, ist die mittlere Frequenz für eine Bande gleich der Summe aus heterozygot
und homozygot bedingten Banden. Daraus ergibt sich dann eine durchschnittliche
Allelfrequenz q für eine Bande (Jeffreys et al. 1985, Georges et al. 1988):
q = 1 - )1( uS−
Su: Bansharingrate zwischen nichtverwandten Eltern (Hintergrundbandsharingrate)
4.5.9 Mittlere zu erwartende Wahrscheinlichkeit, dass ein Individuum mit seinen
Nachkommen eine gemeinsame Bande hat.
Ein Individuum hat eine Wahrscheinlichkeit von )2( 2
2
qqq−
homozygot für eine bestimmte
autosomale Bande zu sein (Genotyp +/+). Wenn ein Nachkomme homozygot ist, muss
natürlich auch ein Elternteil diese Bande teilen. Mit einer Wahrscheinlichkeit von
)2()1(2
2qqqq
−−
wird eine Bande erwartungsgemäß heterozygot sein (Genotyp +/-). In der
hälfte der Fälle wird dann die Bande von der Mutter oder vom Vater geerbt. Der Elternteil,
der ein `-` Allel vererbt hat, kann dennoch diese Bande mit dem Nachkommen teilen,
wenn sein anderes Allel `+` ist (Wahrscheinlichkeit q). Daraus folgt die Wahrscheinlichkeit
So, dass eine Bande im Fingerprint eines Nachkommen auch in dem eines Elternteils
vorkommt (Jeffreys et al. 1985, Georges et al. 1988), mit:
So = qqq
−−+
21 2
q: Allelfrequenz
Material und Methoden 41
4.5.10 Mittlere zu erwartende Wahrscheinlichkeit, dass eine Bande zwischen zwei
Vollgeschwistern übereinstimmt
Nach Jeffreys et al. 1985, Georges et al. 1988, Nybom 1990 und Haydock et al. 1996 ist
die mittlere zu erwartende Wahrscheilichkeit, dass eine Bande zwischen Vollgeschwistern
übereinstimmt, gleich:
Ss = )2(4
654 32
qqqq
−+−+
q: Allelfrequenz
Ergebnisse und deren Diskussion 42
5. Ergebnisse und deren Diskussion
5.1 Fangmethodik
Von den 3 eingesetzten Fallensystemen, der Holzkastenfalle mit Blechwippe (Abb.14),
der Hengstlerfalle (Abb.15) und der Kunststoff-Wieselfalle (Abb.16) hat sich die
Kunststoff-Wieselfalle als die zum Fang von Microtus arvalis am besten geeignetste
herausgestellt.
Sowohl bei der Holzkastenfalle, als auch bei der Hengstlerfalle traten bei Nässe massive
Probleme auf. Durch Feuchtigkeit quellte das Holz der Holzkastenfalle so stark auf, dass
die Klappe, welche den Eingang verschließen sollte, blockiert wurde und nach dem
Auslösen des Trittmechanismus (einer Blechwippe) nicht mehr funktionierte. Nach einigen
Witterungswechseln (Aufquellen und Trocknen der Fallen) war das Holz meist so
verzogen, dass sie überhaupt nicht mehr auslöste. Zudem ist es 2 Individuen gelungen
sich durch das Holz wieder in die Freiheit zu nagen. Ohne diese Probleme wäre die
Holzkastenfalle die Optimallösung zum Fang von Microtus arvalis gewesen, denn sie
wurde sehr gerne angenommen. Außerdem ist sie die Falle mit der besten Handhabung.
Sie nicht so groß, sperrig und schwer wie die Kunststoff-Wieselfalle, was das Ausbringen
der Holzkastenfalle sehr erleichtert. Auch ist diese Art von Fallen sehr gut zu beködern,
da der Auslösemechanismus nicht wie bei der Hengstlerfalle mit dem Köder in direkter
Verbindung steht. Somit kann die Falle mit viel Futter versehen, und bei der Beköderung
nicht versehendlich ausgelöst werden. Durch das Drahtgitter, welches die obere
Fallenabdeckung bildet ist eine direkte Ansprache möglich, so dass Fehlfänge direkt
wieder in die Freiheit entlassen werden konnten, ohne vorher, zwecks Bestimmung auf
Gattungsniveau, in einen durchsichtigen Nylonbeutel überführt worden zu sein. Da die
Holzkastenfallen von oben mit einem Blech abgedeckt waren (Feldmäuse fühlen sich in
der Dunkelheit wohlig), außerdem reich beködert waren und von ihrer Größe her
ausreichend sind, wurden nur wenige Mäuse tot in der Holzkastenfalle aufgefunden.
Ergebnisse und deren Diskussion 43
Abb.14: Holzkastenfalle mit Blechwippe (H: 75 mm x B: 60 mm x T: 270 mm)
Bei der Hengstlerfalle handelt es sich um eine Fallenart, bei welcher der Köder auf einer
Plexiglaswippe präsentiert wird. Betritt die Maus die Wippe und geht über einen
bestimmten Punkt hinaus, klappt die Wippe um und der Eingang wird von einer
Plexiglastür verschlossen. Bei Nässe jedoch sammelte sich unter der Plexiglaswippe ein
Feuchtigkeitsfilm, der diese oftmals so stark zurückhält, dass das Gewicht einer Feldmaus
nicht ausreicht die Wippe zum umklappen zu bewegen, um damit den Eingang zu
verschließen. Filterpapierstreifen, die bei Nässe unter die Wippe gelegt wurden,
verbesserten die Ergebnisse geringfügig. Da der Wippmechanismus dieses Fallentypus
sehr sensibel reagiert und der Köder auf diesen Auslösemechanismus gelegt wird, kann
die Hengstlerfalle mit nur wenig Köder ausgestattet werden. Bei der Beköderung selbst
muss aufgepasst werden, dass nichts von dem Köder unter die Wippe gerät, da diese
sonst nicht weit genug umklappt, um den Eingang zu verschließen. Auch getrocknete
Fäkalien sowie Schneckenschleim verkleben oder behindern oft den
Auslösemechanismus, so dass eine ständige Funktionskontrolle und Instandsetzung
(auch bei nicht ausgelöstem Mechanismus) bei dieser Fallenart unerlässlich ist. Die
Mortalität in der Hengstlerfalle war im Vergleich zu den 2 anderen Fallentypen bei weitem
am höchsten. Dies ist darauf zurückzuführen, dass diese Fallen für Microtus arvalis zum
einen zu klein sind, und das Futterangebot mit welchem man diese Fallen beködern kann
sehr spärlich ist. Abhilfe dagegen schaffen entsprechend den Vorschlägen von Halle
(1994), Schutzkästen aus Holz, die auch für Hengstlerfallen erhältlich sind. Diese werden
an der geöffneten Rückwand der Falle befestigt und mit Köder und Nestmaterial bestückt,
damit sich das gefangene Tier dorthin zurückziehen und so in Gefangenschaft einen
längeren Zeitraum überleben kann. Durch diese Maßnahmen werden jedoch die einzigen
Ergebnisse und deren Diskussion 44
Vorteile, die die Hengstlerfalle gegenüber der Holzkastenfalle und im besonderen
gegenüber der Kunststoff-Wieselfalle hat, nämlich ihre geringe Größe und Gewicht (190
gr.) und der relativ niedrige Preis, aufgehoben.
Abb.15: Hengstlerfalle (H: 50 mm x B: 50 mm x T: 145 mm)
Die Kunststoff-Wieselfalle ist eine Wippfalle mit freiliegendem Wippbrett. Geht die Maus
über das Wippbrett und gelangt zu einem bestimmten Punkt, so klappt das Wippbrett um
und versperrt somit den Eingang. Gleichzeitig arretiert ein Eisenbügel das Wippbrett in
genau dieser Position, um zu verhindern, dass die Maus durch Zurücklaufen auf diesem
Wippbrett den Eingang wieder öffnet und ins Freie gelangt. Diese Fallen stellten sich am
fängigsten für Microtus arvalis heraus. Darüber hinaus sind sie witterungsbeständig und
verbissfest, was eine lange Lebensdauer mit sich bringt. Die Mortaliät dieses Fallentyps
war absolut gering, was der Größe dieser Fallen und damit natürlich auch dem
Futterangebot, welches man in dieser Falle unterbringen konnte, zu verdanken ist.
Microtus arvalis hat diese Kunstoff-Wieselfallen sehr gerne angenommen. Dies ist
dadurch zu erklären, dass diese Falle mit einem gelochten verzinktem Stahlblech
abgeschlossen ist, was bewirkt, dass die Wieselfalle ständig durchlüftet ist. Somit stellt
dieses „Gebilde“ für die Maus kein Gefahrenpotetial dar, da sie es ja nur als Röhre
wahrnimmt, die nach beiden Seiten offen ist. Der einzige Nachteil dieser Fallen liegt in der
durch ihre Größe bedingte Unhandlichkeit.
Ergebnisse und deren Diskussion 45
Abb.16: Kunststoffwieselfalle(∅: 95 mm x T: 470 mm)
Als Beifang traten Apodemus spec., Arvicola terrestris, Clethrionomys glareolus,
Micromys minutus, Microtus agrestris und Sorex spec. auf. Wobei Micromys minutus und
Sorex spec. fast ausschließlich mit den Hengstlerfallen gefangen wurden, was auf die
Sensibilität des Auslösemechanismus dieser Fallen rückzuführen ist.
Von den eingesetzten Ködern (Haferflocken, Haselnüsse, Erdnussbutter, Katzenfutter
oder Früchtemüsli) wurde das Früchtemüsli am liebsten angenommen. Probleme
machten in dieser Beziehung Schnecken, die sich über die eingesetzten Köder
hermachten und die Fallen oft leerfrassen.
5.2 DNA-Isolierung
Die DNA Ausbeute, gemessen anhand des Gene Quant II ergab einen durchschnittlichen
Gehalt von 500 µg - 1000 µg chromosomaler DNA. Die Menge an eingesetztem Gewebe
lag hierbei zwischen 150 mg und 200 mg. Ausschlaggebend für die Menge an
chromosomaler DNA, die aus dem Gewebe isoliert werden konnte, war nicht allein die
Masse an eingesetztem Gewebe, sondern auch die Gewebeart spielte hierbei eine
entscheidende Rolle. So konnte aus der Leber die meiste, aus den Muskeln wesentlich
weniger, und aus dem Schwanz die geringste Menge an hochmolekularer genomischer
DNA gewonnen werden.
Die mit dem Gene Quant II gemessene Reinheitsbestimmung ergab durchschnittliche
Werte zwischen 1,75 – 1,90 (vgl. Wieacker & Müller 1985). Diese entsprechen in etwa
Ergebnisse und deren Diskussion 46
den von Lagoda et al. (1989) ermittelten Werten; der die Salz-Chloroform-Methode
entwickelte.
Bei der Überprüfung der DNA im Probegel konnte man eine scharfe Bande unzerstörter
hochmolekularer genomischer DNA erkennen. Aber auch eine leichte Verunreinigung der
Proben mit RNA und einem sehr geringen Teil an degradierter DNA fiel auf. Dies war
aufgrund der hier angewandten Isolierungsmethode (Salz-Chlorform-Methode) nicht
vollständig zu vermeiden.
Leichte Verunreinigungen der DNA durch RNA störten die Fingerprintmuster in keinster
Weise. Auch eine leichte Degradation der DNA hat keine Einfluss auf die
Fingerprintmuster, wie am Beispiel von alten und unter extremen Bedingungen
gelagertem Spurenmaterial gezeigt wurde (Pöche et al. 1990, Roewer et al. 1990). Es
treten hierbei keine zusätzlichen Banden auf, sondern die bereits vorhandenen
hochmolekularen Banden verlieren lediglich an Intensität und bleichen mit zunehmender
Degradation aus.
Das Gewebe, das sich nach dieser Isloierungsmethode sowohl von der Quantität an
gewonnener DNA als auch der Qualität der DNA am schlechtesten eignete, war der
Mäuseschwanz (siehe Abb.17). Bei Leber, Muskelgewebe und Niere wurden mit der Salz-
Chloroform-Methode durchweg gute Ergebnisse erzielt. Da aus der Leber aber bei
gleicher Einwaage mehr DNA isoliert werden konnte, die von der Qualität nicht schlechter
war, als die der Muskeln, wurde hauptsächlich mit Lebergewebe gearbeitet.
Abb.17: Probegel mit DNA Isolaten aus Leber, Muskel, Niere und Mausschwanz. Weißer Pfeil kennzeichnet
die DNA die aus dem Mausschwanz isoliert werden konnte.
Dass die hier erzielte Ausbeute an DNA sehr hoch ist, lässt sich an Vergleichen mit
Mörsch (1992) bzw. Buitkamp (1989) erkennen. Mörsch konnte mit der Salz-Chloroform-
Methode aus zwischen 100 mg und 200 mg Rehgewebe 300 µg – 600 µg (also gerade
Ergebnisse und deren Diskussion 47
mal die Hälfte) gewinnen. Diese Menge entsprach in etwa auch der von Buitkamp
gewonnen DNA Menge, jedoch setzte dieser 4 g Knorpelgewebe ein und benutzte zudem
noch eine andere Isolierungsmethode.
5.3 Restriktionsverdau und Fluoreszenzfärbung
Zur Absicherung, dass genügend DNA pro Probe eingesetzt wurde und der
Restriktionsverdau vollständig stattgefunden hat, ist es unerlässlich, dieses nach der
Elektrophorese und der Anfärbung mit Ethidiumbromid auf dem UV-Tisch zu kontrollieren.
Um optimale Ergebnisse zu erhalten, musste der Restriktionsverdau mit einer Menge von
50 µg bis 60 µg genomischer DNA durchgeführt werden. Geringerer DNA Gehalt führte
nur zu einem, im Verhältnis zum Hintergrund, sehr schwachen Erscheinen einiger
hochmolekularer Banden, was wiederum Schwierigkeiten bei der Auswertung nach sich
zog.
Um einen vollständigen Restriktionsverdau zu gewährleisten, wurden bei EcoR1, Hae III
und Hinf I 2 Units Restriktionsenzym pro µg DNA eingesetzt. Bei Hind III musste die
Enzymkonzentration auf 5 Units Restriktionsenzym pro µg DNA erhöht werden, um
gesichert einen vollständigen Restriktionsverdau zu erhalten. Die 50 µg bis 60 µg DNA
aus der Stammlösung mussten vor dem Restriktionsverdau auf ein Endvolmen von 200 µl
mit H2Odeion. verdünnt werden. Dieselbe DNA Menge, aber in höherer DNA
Konzentrationen, d.h in weniger H2Odeion. gelöst, eingesetzt, führte erst bei stark erhöhter
Zugabe von Restriktionsenzym pro µg DNA regelmäßig zu einem vollständigen Verdau.
Für den Restriktionsverdau kamen die Restriktionsendonukleasen EcoR1, Hae III, Hind III
und Hinf I zum Einsatz (vgl. Tab.3). Von diesen stellte sich Hinf I als das am besten
Geeignetste heraus, um in Kombination mit den im Verlaufe dieser Arbeit getesteten
Sonden, variable genetische Fingerprints zu produzieren. Alle Restriktionsenzyme
erzielten einen vollständigen Verdau, der sich auf dem UV-Tisch als Fluoreszenzschmier
von Restriktionsfragmenten darstellte. Lediglich die Intensitätmaxima der von den
verschiedenen Restriktionsenzymen verdauten DNA lagen in unterschiedlich hohen
molekularen Bereichen (Abb.18).
Ergebnisse und deren Diskussion 48
Tab.3: Die verwendeten Restriktionsenzyme mit ihren Erkennungsschnittstellen, der optimalen
Restriktionsverdautemperatur und der Inaktivierungstemperatur
Restriktionsenzym Erkennungs-
schnittstelle
Optimale Temperatur
für Restriktionsverdau
Inaktivierungs-
temperatur
Eco R1 5’-G↓AATTC-3’ 37°C 65°C
Hae III 5’-GG↓CC-3’ 37°C 85°C
Hind III 5’-A↓AGCTT-3’ 37°C 85°C
Hinf I 5’-G↓ANTC-3’ 37°C 65°C
A B C D E
Abb.18: Vollständiger Restriktionsverdau der DNA von Microtus arvalis mit den Restriktionsenzymen Hae III
(A), Hind I (C), Hinf I (E). Unvollständiger Restriktionsverdau der DNA von Microtus arvalis mit dem
Restriktionsenzym Hind I (B).
Ein vollständiger Restriktionsverdau ist die Grundvoraussetzung um reproduzierbare
Fingerprints zu erhalten. Ein unvollständiger Verdau kann zu Fehlinterpretationen führen
(Nürnberg et al. 1991). Im Gegensatz zu dem vollständigen Restriktionsverdau, der als
kontinuierlicher Fragmentschmier nach der Gelelektrophorese auf dem UV-Tisch zu
Ergebnisse und deren Diskussion 49
sehen ist, tritt beim unvollständigen Verdau eine Bande unverdauter, hochmolekularer
DNA (> 23 kb) auf (Pena et al. 1991). Diese ist auch nachher im Fingerprint als Bande zu
erkennen (Nürnberg et al. 1991). Ein unvollständiger Verdau kann sich im Falle repetitiver
Sequenzen auch in einem leiterartigen Fragmentmuster im Fluoreszenzgel äußern (siehe
Abb.18, B).
Für alle untersuchten Mäuse war ein solcher unvollständiger Verdau auszuschließen, da
bei allen Mäusen, der erwähnte kontinuierliche Fragmentschmier, ein charakteristisches
Indiz für die Vollständigkeit des Restriktionsverdaus auftrat und kein leiterartiges
Fragmentmuster als Zeichen eines unvollständigen Restriktionsverdaus zu erkennen war.
Ferner wurden als Versuch, ob sich etwas am Restriktionsverdaus ändert,
Konzentrationen bis zu 15 Units Restriktionsendonuklease pro µg DNA eingesetzt. Da
sich bei so hohen Konzentrationen an Restriktionsenzym weder am Erscheinungsbild des
Fluoreszenzschmiers, noch am Fingerprint selbst etwas änderte, ist davon auszugehen,
das die eingesetzte Menge von 2 Units pro µg DNA ausreichend war. Nürnberg und
Mitarbeiter benutzten bei ihren Konzentrationsversuchen in der stärksten Konzentration 5
Units pro µg DNA (Nürnberg et al. 1991).
Verschieden hohe DNA Mengen zeigten keinen Einfluss auf das Hybridisierungsmuster.
Lediglich die Intensität der Banden veränderte sich.
Nach dem Hinf I Verdau war bei Microtus agrestris nach der Gelelektrophorese im DNA
Schmier eine fluoreszierende Bande im Bereich von etwa 2000 Basenpaaren (bp) zu
erkennen (siehe Abb.19). Die Fluoreszenzbande war absolut reproduzierbar und bei allen
Microtus agrestris monomorph. Auch eine höhere Enzymkonzentration hatte keinen
Einfluss auf diese Bande. Dass die Sequenzen bereits als Banden im Fluoreszenzschmier
erscheinen, deutet darauf hin, dass es sich hierbei um Sequenzen gleicher Länge
handelt, die sehr oft wiederholt im Genom vorkommen, also repetitive Sequenzen. Pena
et al. stellte 1991 beim Menschen nach einem Restriktionsverdau mit dem Enzym BspR I
bei Männern eine scharfe Bande im Bereich von 3400 bp fest. Sie stammte von repetitiver
DNA des menschlichen Y-Chromosoms und ist auf große Mengen an DNA von gleicher
Fragmentlänge zurückzuführen. Dies wiederum ist nur dann der Fall, wenn es sich um
repetitive Sequenzen (gleiche Länge und somit gleiche Laufstrecke) handelt (Mörsch
1992). Der Beweis, dass es sich hierbei um simpel repetitive DNA Sequenzen handelt,
konnte durch die Hybridisierung mit der Oligonukleotidsonde (GTG)5 erbracht werden.
Denn durch Hybridisierung mit dieser Sonde wurde die Fluoreszenzbande auf der
Membran sichtbar gemacht.
Da sie nur bei Microtus agrestris, nicht aber bei Microtus arvalis auftrat, diente sie als
erstes genetische Unterscheidungsmerkmal der beiden Arten, die ansonsten nur sehr
schwer, durch Untersuchungen des Gebisses, voneinander zu unterscheiden waren.
Ergebnisse und deren Diskussion 50
Leider wurden nur diese beiden Arten der Gattung Microtus gefangen, denn es wäre
interessant gewesen festzustellen, ob diese fluoreszierende Bande als artspezifischer
Marker herangezogen werden könnte. Das Auftreten solcher speciesspezifischer Banden
ist auch von anderen Tierarten (Gelter & Tegelström 1990, Mörsch 1992) beschrieben
worden und wird bei schwer zu unterscheidenden Arten bzw. Gattungen als
Unterscheidungsmerkmal erfolgreich eingesetzt (Anopheles: Yasothornsrikul el al. 1988,
Cervide: Lima de Farina u. Mitarbeiter 1984, Nematoden: Zarlenga et al. 1991, Mosquito:
Kedrova et al. 1991, Passeriformes: Gelter u. Tegelström 1990).
Abb.19: Restriktionsverdau mit der Restriktionsendonuklease Hinf I. Weißer Pfeil kennzeichnet
fluoreszierende Bande bei Microtus agrestris.
Nach der Meinung von Gelter und Tegelström (1990) sind die repetitiven Banden
entweder auf multiple Schnittstellen innerhalb der repetitiven Sequenzen, oder aber auf
das Vorhandensein derselben Schnittstellen in verschieden repetitiven Sequenzen
zurückzuführen. Sie vermuten außerdem, dass die Amplifikation der repetitiven
Sequenzen zu einer Differenzierung dieser Sequenzen und weitergehend zu einer
Isolierung zwischen Species und damit zu einer fortschreitenden Specification führt.
Auch Scherthan (1991) untersuchte diese Fluoreszenzbanden bei Capreolus capreolus.
Auch er führte sie auf repetitive Sequenzen zurück, die er in zwei Arten unterteilte: in eine
„interspersed“ DNA, deren sich wiederholende Sequenzen über das gesamte Genom
verteilt sind, und in die Satelliten DNA, die durch tandemartige Wiederholungen in
Assoziation mit Heterochromation gekennzeichnet ist. Nach Krawczak & Schmidtke
Ergebnisse und deren Diskussion 51
(1994) beläuft sich der Anteil von Satelliten DNA im Säugergenom von wenigen auf bis zu
50 %.
5.4 Auswahl der Species-Enzym-Sonden Kombination
Um die Fragestellung dieser Arbeit beantworten zu können, war das erste Ziel die richtige
Restriktionsenzym-Sonden Kombination für die Feldmaus zu finden, und das Multilocus-
DNA-Fingerprinting auf die vorhandenen Laborbedingungen so anzupassen, dass man
informative und individualspezifische Fingerprints erhält.
Wie entscheidend die Wahl der richtigen Restriktionsendonuklease ist zeigt sich allein
schon daran, dass von den 4 eingesetzten Restriktionsenzymen EcoR1, Hae III, Hind III
und Hinf I nur 2 (Hae III und Hinf I) in Kombination mit den getesteten Sonden ( (CA)8,
(GTG)5, (GACA)4, und (GATA)4 ) überhaupt Fingerprints bei Microtus hervorbrachten. Das
beste Resultat für Microtus arvalis lieferte das Restriktionsenzym Hinf I mit der Sonde
(GACA)4. Hae III lieferte zwar auch Banden in Kombination mit den Oligonukleotidsonden
(CA)8, (GTG)5 und (GACA)4, jedoch waren diese Fingerprints von der Schärfe der
Banden, der Auswertbarkeit oder ihres Polymorphiegrades als qualitativ wesentlich
geringer anzusehen. Somit war die Wahl von Hinf I als Restriktionsendonuklease für alle
weiteren Ansätze durchaus gerechtfertigt. Gegen ein weiteres Ausprobieren von noch
mehr Restriktionsenzymen sprechen der zum Einen nicht unerhebliche finanzielle
Aufwand (Restriktionsenzyme sind sehr teuer), zum Anderen aber auch der zeitliche
Aufwand. Außerdem wurden mit Hinf I so gute Ergebnisse erzielt, dass es fraglich
erschien, ob bei anderen Restriktionsenzymen noch bessere Ergebnisse erzielt werden
könnten.
In der Literatur wird einerseits die Wahl des richtige Restriktionsenzyms für qualitativen
Unterschiede von Fingerprints verantwortlich gemacht (Nybom 1991), andererseits zeigen
andere Autoren (Buitkamp 1989), dass verschiedene Enzyme bei gleicher Sonde lediglich
eine Änderung der Bandenpositionen bewirken. Die Fragmentlängenunterschiede
zwischen den Allelen und die damit verbundenen Bandenmuster bleiben somit erhalten.
Das heißt, dass andere Enzyme bei gleicher Sonde nicht unbedingt andere Fingerprints
bedeuten müssen. Es kommt hierbei darauf an, wo die Erkennungsstellen, an welchen die
Restriktionsenzyme schneiden, liegen. Sind die Sequenzeinheiten lang, verändert sich
das Fingerprintmuster kaum (Beyermann et al. 1992).
Ein weiterer wichtiger Punkt beim Multilocus-DNA-Fingerprinting ist die Wahl der richtigen
Sonde, an die man allgemein folgende Anforderungen stellt: Zum Einen sollte mit der
ausgewählten Sonde ein möglichst großer Molekulargewichtsbereich detektierbar sein.
Ergebnisse und deren Diskussion 52
Da die Anzahl und die Frequenz der polymorphen Banden die Genauigkeit der Methode
bestimmen, muss der Polymorphiegrad der Banden möglichst hoch sein (Gilbert et al.
1991). Das war mit der Enzym-Sonden Kombination Hinf I und (GACA)4 gegeben
(Abb.20). Diese Sonde hybridisierte zwar relativ schwach (d.h. die Banden traten nicht so
deutlich hervor, wie es zum Beispiel bei (GTG)5 der Fall war), es fand sich keine
monomorphe Hybridisierungsbande bei Microtus arvalis und der auswertbare Bereich
reichte von 23500 bp bis zu 1000 bp.
Abb.20: Multilocus-DNA-Fingerprint von Microtus arvalis mit dem Restriktionsenzym Hinf I und der Sonde
(GACA)4
Im Vergleich dazu zeigte die Enzym-Sonden Kombination Hinf I mit der Sonde (GTG)5
zwar auch einen auswertbaren Bereich zwischen etwa 24000 bp und 2500 bp mit sehr
hoher Bandenschärfe, hoher Bandenintensität und einer viel höheren Bandenanzahl;
jedoch war der Polymorphiegrad dieser Kombination bei Microtus arvalis gering. Setzt
man diese Kombination nun bei Microtus agrestris ein ergibt sich wiederum ein völlig
anders Bild. Hier zeigen sich mit Hinf I und (GTG)5 weniger Banden als bei Microtus
arvalis, aber der Polymorphiegrad ist wesentlich höher, so dass diese Enzym-Sonden
Kombination zur genetischen Untersuchung von Microtus agrestris die geeignete wäre
(Abb.21).
Ergebnisse und deren Diskussion 53
Abb.21: Multilocus-DNA-Fingerprint von Microtus agrestris ( Individuen: A, B und F)und Microtus arvalis
(Individuen: C, D, E und G) mit dem Restriktionsenzym Hinf I und der Sonde (GTG)5
Diese großen Unterschiede der Fingerprintmuster sind eventuell dadurch zu erklären,
dass die Sonden (GTG)5 und (GACA)4 in verschiedenen Regionen hybridisieren. So
hybridisiert (GTG)5 beim Menschen hauptsächlich in den R-Banden positiven, GC-reichen
Regionen der menschlichen Autosomen, während die (GACA)4 Sonde hauptsächlich in
den „ nucleolus organizer regions (NOR`s)“ hybridisiert (Zischler et al. 1989a, Roewer et
al. 1990, Nanda et al. 1991, Nürnberg et al. 1991). Diese detektierten Sequenzen sind
nicht codierend und über das gesamte Genom verteilt, wodurch deren Einsatz
Veränderungen im gesamten Genom aufdecken kann (Pöche et al.1991).
Welchen Einfluss die Wahl der richtigen Sonde auf das Ergebnis hat, zeigt auch die Arbeit
von Moritz et al. (1991), der bei der Honigbiene mit der (CAC)5 Sonde
(Komplementärsonde zu (GTG)5, die laut Roewer et al. (1990) absolut identische Muster
wie (GTG)5 erzeugt) kein Hybridisierungssignal bekam, während er mit (GATA)4 gleich für
3 Restriktionsenzyme polymorphe Fragmente und somit individualspezifische Fingerprints
erhielt.
Laut Taylor et al. (1991) ist es möglich, dass die gleiche Sonde bei verschiedenen
Species unterschiedlich stark hybridisieren kann. So wurden mit den Jeffreys Sonden bei
den Koalas in Australien schwächere Hybridisierungen erzielt, wie beim Menschen.
Durch den direkten Einfluss der Sonde auf das Fingerprintmuster ist von ihrer Wahl auch
die Bandsharingrate abhängig. So ermittelte Wolfes et al. (1991) mit der Sonde (GGAT)4
Ergebnisse und deren Diskussion 54
bei nichtverwandten Vögeln eine Bandsharingrate (BSR) von 0,199 und bei der F1
Generation eine BSR von 0,431, während sich mit der Sonde (GACA)4 bei
nichtverwandten Vögeln eine BSR von 0,402 und bei verwandten Tieren eine BSR von
0,773 ergab.
Nach Roewer (1991) ist die Wahl der Sonde aber auch von der Menge an DNA, die
aufgetrennt werden soll und von dem Fragmentlängenbereich in welchem hybridisiert
werden soll abhängig. So hybridisiert (GTG)5 hauptsächlich im hochmolekularen Bereich,
während (GACA)4 und (GATA)4 dafür bekannt sind, hauptsächlich im niedermolekulareren
Bereichen zu hybridisieren. Dies kann bei Microtus arvalis dahingehend bestätigt werden,
dass sich bei der Hybridisierung mit (GACA)4 der größte Teil der Banden in dem Bereich
zwischen 9500 und 1000 bp verteilte, während sich bei der Hybridisierung mit (GTG)5 die
Banden relativ gleichmäßig von 23500 bp bis hin zu 2500 bp verteilten.
Die Eigenschaft der Sonden (GACA)4 und (GATA)4, hauptsächlich in niedermolekulareren
Bereichen zu hybridisieren, spielt eine wichtige Rolle bei teilweise degradierter DNA, die
meist in den niedermolekularen Bereichen noch intakt ist. So haben nach Pöche et al.
(1990) und Roewer et al. (1990) die Oligonukleotidsonden (GACA)4 und (GATA)4 den
besonderen Vorteil, dass sie auch nach langer Lagerung von Spurenmaterial oder
Gewebe, auch bei schon teilweise stattgefundener Degradation der DNA noch
unveränderte Fingerprints liefern.
5.5 Somatische Stabilität und Reproduzierbarkeit der Fingerprints
Am Anfang dieser Arbeit war nicht klar, ob aus der Leber jeder Microtus arvalis genug
DNA für das Multilocus-DNA-Fingerprinting gewonnen werden konnte, oder ob die DNA
der inneren Organe durch Degradation, bzw. apoptotische Prozesse (vgl. Eisenbarth
1999) für diese Methode unbrauchbar geworden ist. Daher musste sichergestellt werden,
dass die hypervariablen Hybridisierungsmuster eine gewebeunabhängige Stabilität
zeigen. Bei einem Vergleich unterschiedlicher Gewebearten von verschiedenen
Individuen dürfen somit die Unterschiede nicht zwischen den einzelnen Gewebearten,
sondern zwischen den einzelnen Individuen auftreten.
Zur Untersuchung dieser somatischen Stabilität wurden 10 Feldmäusen jeweils die Leber,
die Nieren und Muskelgewebe entnommen. Von diesen Gewebetypen wurde dann die
DNA isoliert und Fingerprints angefertigt. Erwartungsgemäß zeigte sich bei allen
Individuen kein Unterschied zwischen den einzelnen Gewebetypen, wohl aber zwischen
den einzelnen Individuen.
Ergebnisse und deren Diskussion 55
Damit konnte auch die somatische Stabilität der DNA aus verschiedenen Geweben der
Feldmaus, die beim Menschen schon mehrfach auch bei Langzeitlagerung des Gewebes
beschrieben wurde (Jeffreys et al. 1985, 1987, Nürnberg et al. 1989, Pöche et al. 1990,
Roewer et al. 1990, 1991), bestätigt werden.
Das es doch zu unterschiedlichen Fingerprintmuster in Abhängigkeit von den
verschiedenen Gewebearten bei einem Individuum kommen kann ist eventuell auf
unterschiedliche Methylierungszustände der DNA zurückzuführen. Da Hinf I jedoch ein
methylierungsunabhängiges Enzym ist und jedes Gewebe gleichartig verdaut, kann
dieses Problem hier weitgehend ausgeschlossen werden.
Diese hier nachgewiesene somatische Stabilität des Gewebes bedeutet jedoch noch
lange nicht, dass in allen Zellen eines Organismus die DNA Sequenzen übereinstimmen
müssen und somatische Mutationen nicht vorkommen können. Nach Jeffreys und
Mitarbeitern (1991) ist die Mutation von Minisatelliten nämlich nicht nur auf die Keimbahn
begrenzt, sondern kommt auch in somatischem Gewebe vor. Sie gehen davon aus, dass
jedes Gewebe eine Mehrzahl an Zellen mit den Minisatelliten-Allelen der beiden
Vorfahren plus eine bestimmte Zahl von Zellen, die verschiedene mutierte neue Längen-
Allele enthalten, beinhalten.
Ein Tumor ist beispielsweise eine Population verwandter Zellen mit sehr heterogenem
Phäno- bwz. Genotyp (Kimmel & Axelrod 1990)
Natürlich ist es nicht auszuschließen, dass sich unter einer Gewebeprobe, die schließlich
nur einen Teil der Zellen eines Gewebes darstellt, Zellklone befinden könnten, die ein
unterschiedliches Fingerprintmuster besitzen könnten. Jedoch muss man nach Nürnberg
et al. (1989) beachten, dass die Vielzahl der Zellen einen Fingerprint bestimmt und dass
wenige eventuell vorhandene mutierte Zellen im Fingerprintmuster nicht sichtbar sind und
somit nicht erfasst werden können.
Um Fehler oder Probleme bei der Auswertung zu minimieren wurden, von jeder Probe
mehrere Fingerprints auf verschiedenen Membranen mit verschieden anderen Proben
kombiniert. Das ist wichtig, da oft gerade die Auswertung zwischen 2 Membranen
Probleme bereiten kann. Aufgrund der Tatsache, dass von jeder Probe mehrere
Fingerprints angefertigt und miteinander verglichen wurden, konnte festgestellt werden,
dass ausnahmslos alle Fingerprints einer Probe absolut identisch und reproduzierbar
waren.
Ergebnisse und deren Diskussion 56
5.6 Untersuchungen von Feldmäusen mit nicht bekanntem
Verwandtschaftsgrad an einem Standort
Alle folgenden Daten beruhen auf der Grundlage der mittels dem Multilocus-DNA-
Fingerprinting hergestellten Fingerprints und der im Teil Material und Methoden
vorgestellten statistischen Auswertverfahren.
5.6.1 Standort: Zill
Tab.4: Bandsharingraten Zill
m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 m11 m12
m1 0,538 0,417 0,429 0,286 0,356 0,487 0,212 0,526 0,364 0,369 0,487
m2 0,667 0,636 0,364 0,583 0,431 0,286 0,449 0,384 0,588 0,289
m3 0,600 0,200 0,501 0,488 0,347 0,522 0,447 0,239 0,355
m4 0,333 0,524 0,362 0,510 0,268 0,651 0,568 0,436
m5 0,458 0,533 0,487 0,395 0,476 0,398 0,482
m6 0,294 0,456 0,584 0,481 0,486 0,443
m7 0,268 0,564 0,458 0,466 0,594
m8 0,398 0,497 0.522 0,489
m9 0,574 0,483 0,397
m10 0,488 0,459
m11 0,443
Tab.5: Durchschnittliche Fingerprintdaten der Feldmäuse mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad vom
Standort Zill
n N ∈ Pb = ∅ BSR Pg Pi
12 62 11,6 (± 0,4) 0,447 (± 0,107) 8,78 ⋅ 10-5 4,34 ⋅ 10-19
n = Anzahl der untersuchten Tiere.
N = Anzahl der beurteilten Positionen der Population Zill (Anzahl der Gesamtpositionen: 328)
∈ = durchschnittliche Anzahl polymorpher Banden pro Individuum.
Pb = mittlere Wahrscheinlichkeit, dass eine Bande in den Fingerprints zweier zufällig aus der Population
entnommenen Tiere gleichzeitig vorliegt.
Pg = Wahrscheinlichkeit, dass der Fingerprint eines zufällig aus der Population entnommenen Tieres alle
Banden aus dem Fingerprint eines anderen aufweist (durchaus jedoch noch zusätzliche).
Pi = Wahrscheinlichkeit, dass 2 zufällig aus einer Population entnommene Individuen identische
Fingerprints haben.
Ergebnisse und deren Diskussion 57
Die 12 untersuchten Feldmäuse an dem Standort Zill besitzen in ihrem gesamten
Auswertbereich zwischen 18000 bp und 1000 bp eine durchschnittliche Anzahl von 11,6
(± 0,4) polymorphen Banden (Banden, die nicht in allen Mustern vorkommen) pro
Individuum. Es wurden insgesamt 62 Positionen untersucht. Die paarweise ermittelten
Bandsharingraten reichen am Standort Zill von 0,200 (m3/m5) bis zu 0,667 (m2/m3)
(Tab.4). Aus diesen paarweise ermittelten Bandsharingraten ließ sich dann eine
durchschnittliche Bandshringrate von 0,447 (± 0,107) berechnen. Daraus wiederum
konnten die beiden Wahrscheinlichkeiten Pg = 8,78 ⋅ 10-5 und Pi = 4,34 ⋅ 10-19 abgeleitet
werden (siehe Tab.5)
5.6.2 Standort: Hohberg
Tab.6: Bandsharingraten Hohberg
m13 m14 m15 m16 m17 m18 m19 m20 m21 m22 m23 m24
m13 0,452 0,875 0,222 0,276 0,250 0,250 0,439 0,478 0,352 0,512 0,367
m14 0,516 0,692 0,429 0,696 0,435 0,540 0,423 0,605 0,334 0,242
m15 0,296 0,345 0,250 0,333 0,452 0,258 0,488 0,249 0,384
m16 0,333 0,632 0,632 0,518 0,498 0,335 0,352 0,522
m17 0,190 0,476 0,338 0,357 0,487 0,487 0,298
m18 0,375 0,457 0,432 0,538 0,356 0,412
m19 0,566 0,437 0,452 0,221 0,385
m20 0,452 0,575 0,323 0,444
m21 0,623 0,484 0,435
m22 0,419 0,432
m23 0,375
Tab.7: Durchschnittliche Fingerprintdaten der Feldmäuse mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad vom
Standort Hohberg n N ∈ Pb = ∅ BSR Pg Pi
12 65 12,4 (± 0,4) 0,426 (± 0,130) 4,26 ⋅ 10-5 1,11 ⋅ 10-19
n = Anzahl der untersuchten Tiere.
N = Anzahl der beurteilten Positionen der Population Hohberg (Anzahl der Gesamtpositionen: 328)
∈ = durchschnittliche Anzahl polymorpher Banden pro Individuum.
Pb = mittlere Wahrscheinlichkeit, dass eine Bande in den Fingerprints zweier zufällig aus der Population
entnommenen Tiere gleichzeitig vorliegt.
Pg = Wahrscheinlichkeit, dass der Fingerprint eines zufällig aus der Population entnommenen Tieres alle
Banden aus dem Fingerprint eines anderen aufweist (durchaus jedoch noch zusätzliche).
Pi = Wahrscheinlichkeit, dass 2 zufällig aus einer Population entnommene Individuen identische
Fingerprints haben.
Ergebnisse und deren Diskussion 58
Am Standort Hohberg wurden wie am Standort Zill ebenfalls 12 Individuen untersucht. Der
Auswertbereich dieses Standortes liegt zwischen 17100 bp und 1000 bp. Insgesamt
wurden in diesem Bereich 65 Positionen beurteilt. Pro Individuum kommen hier
durchschnittlich 12,4 (± 0,4) polymorphe Banden vor. Die Bandsharingraten reichen am
Hohberg von 0,190 (m13/m16) bis 0,875 (m14/m18) (Tab.6). Aus all diesen paarweise
ermittelten Bandsharingraten ergibt sich nun eine durchschnittliche Bandsharingrate
(BSR) von 0,426 (± 0,130), woraus sich nun die Wahrscheinlichkeiten Pg mit 4,26 ⋅ 10-5
bzw. Pi mit 1,11 ⋅ 10-19 ableiten lassen (Tab.7).
5.6.3 Standort: Herl-Brache
Tab.8: Bandsharingraten Herl-Brache
m25 m26 m27 m28 m29 m30 m31 m32 m33 m34 m35 m36 m37 m38
m25 0,267 0,457 0,182 0,316 0,379 0,467 0,297 0,381 0,504 0,626 0,459 0,355 0,187
m26 0,276 0,370 0,375 0,352 0,198 0,298 0,432 0,312 0,364 0,190 0,253 0.333
m27 0,188 0,324 0,264 0,215 0,483 0,581 0,266 0,382 0,370 0,285 0,418
m28 0,686 0,346 0,293 0,222 0,187 0,358 0,457 0,221 0,637 0,343
m29 0,443 0,349 0,618 0,343 0,176 0,188 0,337 0,200 0,432
m30 0,512 0,625 0,188 0,424 0,265 0,686 0,247 0,469
m31 0,264 0,315 0,196 0,283 0,326 0,311 0,324
m32 0,192 0,446 0,310 0,185 0,324 0,391
m33 0,384 0,184 0,243 0,358 0,267
m34 0,254 0,417 0,202 0,186
m35 0,277 0,646 0,344
m36 0,387 0,375
m37 0,283
Tab.9: Durchschnittliche Fingerprintdaten der Feldmäuse mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad vom
Standort Herl-Brache n N ∈ Pb = ∅ BSR Pg Pi
14 83 16,4 (± 0,5) 0,344 (± 0,128) 2,5 ⋅ 10-8 2,31 ⋅ 10-22
n = Anzahl der untersuchten Tiere.
N = Anzahl der beurteilten Positionen der Population Herl-Brache (Anzahl der Gesamtpositionen: 328)
∈ = durchschnittliche Anzahl polymorpher Banden pro Individuum.
Pb = mittlere Wahrscheinlichkeit, dass eine Bande in den Fingerprints zweier zufällig aus der Population
entnommenen Tiere gleichzeitig vorliegt.
Pg = Wahrscheinlichkeit, dass der Fingerprint eines zufällig aus der Population entnommenen Tieres alle
Banden aus dem Fingerprint eines anderen aufweist (durchaus jedoch noch zusätzliche).
Pi = Wahrscheinlichkeit, dass 2 zufällig aus einer Population entnommene Individuen identische
Fingerprints haben.
Ergebnisse und deren Diskussion 59
Der Ausgewertete Bereich, in dem die 83 Positionen beurteilt wurden lag am Standort
Herl-Brache zwischen 23500 bp und 1900 bp. Durchschnittlich kamen hier 16,4 (± 0,5)
polymorphe Banden pro Individuum vor. Die Bandsharingraten der 14 untersuchten
Individuen von reichen 0,176 (m25/m28) bis zu 0,686 (m28/m29) (Tab.8). Aus ihnen
ergabt sich eine durchschnittliche BSR von 0,344 (± 0,128), die zu den beiden
Wahrscheinlichkeiten Pg mit 2,5 ⋅ 10-8 und Pi mit 2,31 ⋅ 10-22 führte (Tab.9).
5.6.4 Standort: Knospenhof
Tab.10: Bandsharingraten Knospenhof
m39 m40 m41 m42 m43 m44 m45 m46 m47 m48 m49 m50 m51 m52
m39 0,485 0,129 0,069 0,118 0,138 0,323 0,276 0,138 0,142 0,074 0,128 0,380 0,305
m40 0,158 0,111 0,195 0,167 0,263 0,156 0,447 0,294 0,167 0,137 0,184 0,422
m41 0,118 0,256 0,118 0,167 0,321 0,158 0,254 0,426 0,197 0,158 0,062
m42 0,703 0,250 0,059 0,356 0,248 0,069 0,335 0,111 0,079 0,216
m43 0,324 0,103 0,138 0,059 0,125 0,202 0,462 0,177 0,262
m44 0,000 0,218 0,153 0,132 0,341 0,059 0,083 0,144
m45 0,073 0,173 0,256 0,058 0,152 0,425 0,117
m46 0,226 0,273 0,103 0,472 0,096 0,059
m47 0,182 0,048 0,049 0,142 0,212
m48 0,235 0,338 0,124 0,138
m49 0,138 0,263 0,318
m50 0,323 0,153
m51 0,213
Tab.11: Durchschnittliche Fingerprintdaten der Feldmäuse mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad vom
Standort Knospenhof n N ∈ Pb = ∅ BSR Pg Pi
14 134 17,4 (± 0,4) 0,202 (± 0,124) 8,19 ⋅ 10-13 2,24 ⋅ 10-23
n = Anzahl der untersuchten Tiere.
N = Anzahl der beurteilten Positionen der Population Knospenhof (Anzahl der Gesamtpositionen: 328)
∈ = durchschnittliche Anzahl polymorpher Banden pro Individuum.
Pb = mittlere Wahrscheinlichkeit, dass eine Bande in den Fingerprints zweier zufällig aus der Population
entnommenen Tiere gleichzeitig vorliegt.
Pg = Wahrscheinlichkeit, dass der Fingerprint eines zufällig aus der Population entnommenen Tieres alle
Banden aus dem Fingerprint eines anderen aufweist (durchaus jedoch noch zusätzliche).
Pi = Wahrscheinlichkeit, dass 2 zufällig aus einer Population entnommene Individuen identische
Fingerprints haben.
Ergebnisse und deren Diskussion 60
Wie von dem Standort Herl-Brache, so wurden auch vom Standort Knospenhof 14
Feldmäuse untersucht. In dem Auswertbaren Bereich von 23200 bp bis 1150 bp wurden
134 Positionen beurteilt. Die durchschnittliche Anzahl polymorpher Banden pro
Individuum betrug 17,4 (± 0,4). Die paarweise ermittelten Bandsharingraten lagen hier
zwischen 0,000 (m44/m45) und 0,703 (m42/m43) (Tab.10). Aus diesen paarweise
ermittelten BSR konnte dann die durchschnittliche Bandsharingrate mit 0,202 (± 0,124)
ermittelt werden, aus der dann im weiteren die beiden Wahrscheinlichkeiten Pg mit 8,19 ⋅
10-13 und Pi mit 2,24 ⋅ 10-23 errechnet werden konnten (Tab.11).
5.6.5 Standort: Eiden
Tab.12: Bandsharingraten Eiden
m53 m54 m55 m56 m57 m58 m59 m60 m61 m62 m63 m64 m65
m53 0,105 0,083 0,080 0,400 0,000 0,286 0,154 0,000 0,314 0,069 0,000 0,185
m54 0,087 0,000 0,000 0,167 0,000 0,252 0,240 0,078 0,142 0,317 0,000
m55 0,138 0,167 0,483 0,240 0,000 0,321 0,119 0,176 0,096 0,121
m56 0,000 0,200 0,000 0,313 0,196 0,000 0,329 0,279 0,136
m57 0,000 0,762 0,082 0,236 0,138 0,057 0,000 0,132
m58 0,000 0,104 0,168 0,184 0,219 0,118 0,049
m59 0,257 0,000 0,325 0,046 0,186 0,304
m60 0,143 0,178 0,000 0,087 0,131
m61 0,080 0,289 0,105 0,193
m62 0,177 0,344 0,080
m63 0,000 0,169
m64 0,257
Tab.13: Durchschnittliche Fingerprintdaten der Feldmäuse mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad vom
Standort Eiden n N ∈ Pb = ∅ BSR Pg Pi
13 125 12,0 (± 0,4) 0,152 (± 0,134) 1,52 ⋅ 10-10 6,54 ⋅ 10-17
n = Anzahl der untersuchten Tiere.
N = Anzahl der beurteilten Positionen der Population Eiden (Anzahl der Gesamtpositionen: 328)
∈ = durchschnittliche Anzahl polymorpher Banden pro Individuum.
Pb = mittlere Wahrscheinlichkeit, dass eine Bande in den Fingerprints zweier zufällig aus der Population
entnommenen Tiere gleichzeitig vorliegt.
Pg = Wahrscheinlichkeit, dass der Fingerprint eines zufällig aus der Population entnommenen Tieres alle
Banden aus dem Fingerprint eines anderen aufweist (durchaus jedoch noch zusätzliche).
Pi = Wahrscheinlichkeit, dass 2 zufällig aus einer Population entnommene Individuen identische
Fingerprints haben.
Ergebnisse und deren Diskussion 61
Am Standort Eiden wurden 13 Feldmäuse untersucht. Bei diesen gab es im Bereich von
22800 bp bis 1000 bp 125 Positionen zu beurteilen. Im Durchschnitt kamen pro
Individuum 12,0 (± 0,4) polymorphe Banden vor. Die paarweise ermittelten
Bandsharingraten reichten von 0,000 (z.B. bei m54/m56) bis zu 0,762 (m57/m59)
(Tab.12). Die daraus resultierende durchschnittliche Bandsharingrate lag somit bei 0,152
(± 0,134). Daraus ließ sich dann für Pg ein Wert von 1,52 ⋅ 10-10 und für Pi ein Wert von
6,54 ⋅ 10-17 errechnen (Tab.13).
Durchschnittlich ergibt sich für alle untersuchten Individuen mit nicht bekanntem
Verwandtschaftsgrad eine BSR von 0,172 (± 0,133). Bedenkt man nun, dass sich unter
diesen Feldmäusen mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad sicherlich eng verwandte
Microtus arvalis (z.B.: m13 und m14 mit einer BSR von 0,875, oder m57 und m59 mit
einer BSR von 0,762) befinden, so muss dieser Wert mit Sicherheit noch nach unten
korrigiert werden. Vergleicht man diesen Wert mit den durchschnittlichen
Bandsharingraten für nichtverwandte Individuenpaare, die ebenfalls mit dem Multilocus-
DNA-Fingerprintverfahren erzielt wurden (siehe Tab.14), fällt auf, dass hier keine zu
hohen Werte ermittelt wurden, die wiederum auf ein mangelndes Auflösevermögen und
damit auf eine geringere Aussagekraft der Methode hindeuten würden.
Tab.14: Durchschnittliche Bandshraten für nichtverwandte Individuenpaare
Natürliche Populationen:
Capreolus capreolus 0,3 Mörsch 1992
Passer domesticus 0,1-0,3 Burke u. Bruford 1987
Ficedula hypolenca 0,2 Wetton et al. 1987
Progne subis 0,2 Morton et al. 1990
Prunella modularis 0,2 Burke et al. 1989
Urocyon littoralis 0,7-1,0 Gilbert et al. 1990
Homo sapiens 0,2 Jeffreys et al. 1985b
Haustiere:
Hühner 0,4-1,0 Kuhnlein et al. 1990
Hunde 0,5 Jeffreys u. Morton 1987a
Katzen 0,5 Jeffreys u. Morton 1987a
Rinder 0,3-0,4 Georges et al. 1988
Pferde 0,3-0,7 Georges et al. 1988
Schweine 0,5-0,7 Georges et al. 1988
Ergebnisse und deren Diskussion 62
Auch die durchschnittliche Anzahl von 14,0 (± 0,4) polymorphen Banden pro Individuum
im gesamten Auswertbereich von 23500 bp bis zu 1000 bp ist mit den von Nybom (1991)
erzielten Ergebnissen (zwischen 10 und 30 Banden), bzw. mit den von Wetton et al.
(1987) erzielten Werten von durchschnittlich 14,3 polymorphen Banden pro Individuum
durchaus vergleichbar.
5.7 Individualisierungspotential
Das diese Methode ein großes Individualisierungspotential besitzt, ist allein schon daran
zu erkennen, dass alle Fingerprints bis auf einen, der im Kapitel „Untersuchung von
Feldmäusen mit bekanntem Verwandtschaftsgrad“ behandelt wird, ein unterschiedliches
Bandenmuster aufweisen. Als Maß für das Individualisierungspotential dieser Methode
und der erzielten speziesspezifischen Hybridisierungsmuster gelten die beiden
Wahrscheinlichkeiten Pg und Pi.
Die Pg Werte, als die Wahrscheinlichkeiten, dass der Fingerprint eines zufällig aus der
Population entnommenen Tieres alle Banden aus dem Fingerprint eines anderen aufweist
(durchaus jedoch noch zusätzliche) betragen 8,78 ⋅ 10-5 für den Standort Zill, 4,26 ⋅ 10-5
für den Standort Hohberg, 2,5 ⋅ 10-8 für den Standort Herl-Brache, 8,19 ⋅ 10-13 für den
Standort Knospenhof und 1,52 ⋅ 10-10 für den Standort Eiden.
Die Wahrscheinlichkeit Pi, dass 2 zufällig aus einer Population entnommene Individuen
identische Fingerprints haben liegt, am Standort Zill bei 4,34 ⋅ 10-19, am Standort Hohberg
bei 1,11 ⋅ 10-19, am Standort Herl-Brache bei 2,31 ⋅ 10-22, am Standort Knospenhof bei
2,24 ⋅ 10-23 und am Standort Eiden bei 6,54 ⋅ 10-17.
Vergleicht man diese Werte nun mit den von anderen Autoren ermittelten
Wahrscheinlichkeiten (siehe Tab.15), so ist festzustellen, dass die hier ermittelten Werte
sehr gering sind. Dies ist wiederum ein Indiz dafür, dass das Individualisierungspotential
dieser Methode, angewandt auf Microtus arvalis, sehr hoch ist. Letztlich kann daran
natürlich auch eine hohe Variabilität der Fingerprintmuster der Feldmäuse abgelesen
werden. Die sehr geringen Wahrscheinlichkeiten Pi und Pg beruhen neben den
durchschnittlichen BSR auf der Anzahl der untersuchten Positionen. Je mehr Positionen
in die Berechnung dieser Wahrscheinlichkeiten eingehen, um so geringer werden ihre
Werte.
Ergebnisse und deren Diskussion 63
Tab.15: Auflistung der Wahrscheinlichkeiten Pi und Pg für nichverwandte Individuen
Species Pg Pi Autor
Schwäne 7,4 ⋅ 10-15-1,2 ⋅ 10-19 Meng et al. 1990
Hunde 5 ⋅ 10-10 Jeffreys u. Morton 1987
Katzen 7 ⋅ 10-7 Jeffreys u. Morton 1987
Rinder 1,7 ⋅ 10-7 - 1,2 ⋅ 10-12 Buitkamp 1989
Geflügel 1,5 ⋅ 10-9 – 8,7 ⋅ 10-17 Hillel et al. 1989
Truthähne 9,4 ⋅ 10-6 Hillel et al. 1989
Amseln 4,8 ⋅ 10-4 Gibbs et al. 1990
Mensch 2 ⋅ 10-8 Schäfer et al. 1988
5.8 Populationsgenetische Aussagen über Feldmäuse mit nicht bekanntem
Verwandtschaftsgrad
Zur Ermittlung der Bandsharingraten zwischen den einzelnen Standorten wurden die
Fingerprints der Feldmäuse von verschiedenen Standorten paarweise miteinander
verglichen. Die daraus ermittelten durchschnittlichen Bandsharingraten (siehe Tab.16)
bildeten dann die Grundlage zur Berechnung der D`ij und F`ST Werte (Tab.17, Tab.18)
Tab.16: BSR innerhalb (grau Unterlegt) und zwischen den Populationen
∅ BSR Zill Hohberg Knospenhof Herl-Brache Eiden
Zill 0,447 0,264 0,111 0,069 0,037
Hohberg 0,426 0,093 0,038 0,092
Knospenhof 0,202 0,094 0,091
Herl Brache 0,344 0,115
Eiden 0,152
Die Ergebnisse in Tab.16 belegen, dass die Bandsharingraten innerhalb eines Standortes
deutlich höher sind als die zwischen den einzelnen Standorten. Einzig der Standort Eiden
weist eine relativ geringe Differenz zu den BSR der anderen Standorte auf. Das ist aber
darauf zurückzuführen, dass die Bandsharingrate innerhalb des Standortes Eiden nicht
hoch ist. Auffallend ist, dass die Bandsharingraten innerhalb der Brachflächen (Zill,
Hohberg, Herl-Brache) wesentlich höher sind als die Bandsharingraten auf den
bewirtschafteten Flächen. Innerhalb der bewirtschafteten Flächen kann man erkennen,
dass die durchschnittliche Bandsharingrate der Feldmäuse des Standorts Knospenhof
(Gerste ökologisch, Herl) eine höhere Bandsharingrate aufweist, wie der Standort Eiden
(Gerste konventionel, Herl).
Ergebnisse und deren Diskussion 64
Die geringen durchschnittlichen BSR (siehe Tab.16) der Wahlener Standorte Zill und
Hohberg zu den Trierer Standorten Knospenhof, Herl-Brache und Eiden lassen sich durch
die geographische Distanz der Flächen zueinander erklären. Bestätigt wird dies durch
Abb.22, in der die genetischen Distanzen aus Tab.17 mit den geographischen Distanzen
in Korrelation gesetzt wurden. Einen Trend für Isolation by distance zeichnet sich zwar ab,
dieser ist jedoch nicht signifikant (P=0,094). Die Berechnungen ergaben, dass 53,2% der
gesamten Varianz auf die geographische Distanz zurückzuführen ist. Beachtet man nun
die geographischen und die genetischen Distanzen (Tab.17) zwischen den Wahlener
Standorten und den Untersuchungsflächen bei Herl, so wird deutlich, dass der Großteil
der 53,2% auf die geographischen Distanzen der Wahlener und der Herler
Untersuchungsflächen zurückzuführen sind.
Isolation by distanceCorrelation: r = 0,72990
Geographische Distanz (km)
Gen
etis
che
Dis
tanz
Dij
(Lyn
ch, 1
991)
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
2,4
0 5 10 15 20 25 30 35
Abb.22: Isolation by distance.
Die beiden Wahlener Standorte Zill und Hohberg liegen nur etwa 400m auseinander
(siehe Abb.23). Dennoch lassen sich auch hier die Populationen eindeutig genetisch
unterscheiden (Abb.25) (die durchschnittliche BSR innerhalb eines Standortes ist höher
als die BSR zwischen den Standorten). Die Hauptfaktoren hierfür sind in einer Strasse,
Feldgehölz und Wald zu sehen, die diese beiden Standorte voneinander trennen. Diese
Isolationsbarrieren reichen bei Microtus arvalis offensichtlich schon aus, damit sich
genetisch zu unterscheidende Populationen ausbilden können
Ergebnisse und deren Diskussion 65
Abb.23: Flächennutzungskartierung des Standortes Wahlen mit den Untersuchungsflächen Zill und Hohberg.
Schwieriger ist jedoch eine Erklärung zu finden, warum die BSR zwischen den
unterschiedlich genutzten Flächen in Trier, trotz ihrer geringen Entfernungen zueinander,
so geringe Werte aufweisen und genetisch voneinander unterschieden werden können
(Abb.25), bzw. warum die durchschnittlichen BSR an den genutzten Standorten
vergleichsweise niedrig sind. Die geographische Distanz ist auszuschließen. Versuche
dazu wurden am Standort Zill durchgeführt. Hierzu wurde dieser Standort wurde in 3
einzelne Flächen unterteilt, die durch selten befahrene Feldwirtschaftswege voneinander
getrennt waren. Der Abstand von der ersten Fläche zu der zweiten Fläche betrug etwa
20m, der Abstand von der zweiten Fläche zur dritten Fläche etwa 200m (siehe Abb.23).
Bei einer Untersuchung dieser Mäuse stellte sich dann heraus, dass die
durchschnittlichen BSR zwischen den Flächen nicht niedriger waren als die
durchschnittlichen BSR innerhalb der einzelnen Flächen. Das wiederum bedeutet, dass
es sich an diesem Standort um eine Population handelt, die genetisch nicht unterteilt
werden kann. Da die Flächen Herl-Brache, Knospenhof und Eiden von ihrer Entfernung
zueinander durchaus mit dem Standort Zill vergleichbar sind (siehe Abb.23, Abb.24) ist
auch bei ihnen in der geographischen Distanz kein Grund dafür zu sehen, dass die BSR
zwischen den einzelnen Standorten so niedrig sind. Auch sind keine Isolationsbarrieren
wie zwischen den Standorten Zill und Hohberg vorhanden, die diese niedrigen
Ergebnisse und deren Diskussion 66
Bandsharingraten zwischen den Populationen erklären können. Ebenfalls können
aufgrund der geringen Distanzen der Flächen zueinander irgendwelche natürlichen
Umweltfaktoren ausgeschlossen werden, die einen Einfluss auf die Genetik der
Feldmäuse besitzen (z.B. erhöhte Radioaktivität, extreme klimatische Unterschiede
zwischen den Flächen, etc.). Bleibt als Grund die unterschiedliche landwirtschaftliche
Nutzungsform. Studien über den Einfluss von unterschiedlichen landwirtschaftlichen
Nutzungsformen auf die Genetik von Kleinsäugern sind mir nicht bekannt, so dass leider
nicht auf bereits vorhandene Literatur zurückgegriffen werden konnte.
Abb.24: Flächennutzungskartierung des Standortes Herl mit den 3 Untersuchungsflächen Eiden, Knospenhof
und Herl-Brache.
Den Einfluss von landwirtschaftlicher Nutzung an den Standorten Eiden und Knospenhof
lässt sich schon an den verglichen mit dem Standort Herl-Brache niedrigen
durchschnittlichen BSR innerhalb der Standorte erkennen (Herl-Brache: 0,344, Eiden:
0,152, Knospenhof: 0,202). Die durchschnittliche BSR ist auf der ökologisch
bewirtschafteten Fläche Knospenhof höher als auf der intensiv bewirtschafteten Fläche
Eiden. Das könnte ein Indiz dafür sein, dass eine verminderte Ausbringung von
Düngemitteln und Pestiziden eine Erhöhung der durchschnittlichen BSR innerhalb einer
Ergebnisse und deren Diskussion 67
Fläche bewirkt. Dies würde sich dadurch erklären lassen, dass durch das Ausbringen von
Pathogenen, die eventuell in Düngemitteln, Jauche und/oder Pestiziden enthalten sind,
ein großer Anteil der Nachkommenschaft der auf dieser Fläche vorkommenden
Feldmäuse stirbt. Diese Microtus arvalis mit hohen BSR untereinander stehen zur
weiteren Reproduktion nicht mehr zur Verfügung, was in einer niedrigeren
durchschnittlichen BSR resultieren würde. Dafür spricht auch die Fangquote auf der
intensiv genutzten Fläche. Im Vergleich mit allen anderen Flächen war diese viel geringer.
Um die 19 Feldmäuse auf dem konventionel genutzten Standort zu fangen mussten die
Fallen über einen wesentlich längeren Zeitraum aufgestellt werden.
Ein anderer Grund könnte in der Attraktivität der Fläche liegen. Durch das intensive
Bewirtschaften einer Fläche könnte die Attraktivität dieser Fläche so weit heruntergesetzt
werden, dass ein Großteil der Nachkommen diese Fläche vor der Reproduktion wieder
verlässt, was nicht zu einer Erhöhung der BSR innerhalb dieser Fläche beitragen würde.
Diese beiden Thesen würden auch die im Vergleich zu den beiden genutzten Standorten
hohe Bandsharingrate am Standort Herl-Brache, auf den keine Düngemittel, Pestizide
oder sonstige Störfaktoren einwirken, erklären.
Trotz dieser niedrigen Bandsharingraten innerhalb der Flächen Knospenhof und Eiden
sind die Bandsharingraten zwischen den einzelnen Flächen noch niedriger, was darauf
hinweist, dass sich hier Populationen gebildet haben, die genetisch unterschieden werden
können. Bestätigt wird dieses Ergebnis durch die D’ij Werte in Tab.17
Tab.17: D’ij Werte zwischen den einzelnen Populationen an den unterschiedlichen Standorten
D’ij Zill Hohberg Knospenhof Herl Brache Eiden
Zill 0,573 0,996 1,737 1,952
Hohberg 1,149 2,310 1,017
Knospenhof 1,031 0,655
Herl Brache 0,687
Die genetische Distanz (D’ij) gilt als Maß für die genetische Unterscheidbarkeit von
Populationen. Bei großer Übereinstimmung strebt dieser Wert gegen 0, bei geringer
Übereinstimmung gegen 1, bzw. formelbedingt gegen ∞.
Die genetische Distanz zwischen den Wahlener Standorten Zill und Hohberg (0,573) ist
erwartungsgemäß wesentlich geringer, als die genetische Distanz zwischen den
Wahlener und den Trierer Standorten (0,996 – 2,310) (Abb.25). Was jedoch auffällt ist die
hohe genetisch Distanz zwischen Herl Brache und dem Knospenhof (1,031) und die dazu
relativ „geringen“ genetischen Distanzen zwischen Knospenhof und Eiden (0,655)
(Abb.25), bzw. zwischen Herl Brache und Eiden (0,687). Dies lässt vermuten, dass
zwischen Herl Brache und Knospenhof schon wesentlich länger kein Austausch von
Ergebnisse und deren Diskussion 68
genetischer Information und/oder einzelnen Individuen mehr stattgefunden hat als
zwischen Knospenhof und Eiden, bzw. zwischen Herl Brache und Eiden.
UPGMA-Dendrogramm (Microtus arvalis)Genetische Distanz (LYNCH 1991, Multilocus DNA Fingerprinting)
Euklidische Distanz
Linkage Distance
Brache Herl
Gerste konvent. Herl
Gerste ökolog. Herl
Brache Hohberg
Brache Zill
1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0
Abb.25: Dendrogramm der Clusteranalyse der Standorte
Der F’ST Wert gilt als Maß der genetischen Verarmung einer Population und kann in zwei
Richtungen berechnet werden. Der Maximalwert von 1 wird dann erreicht, wenn in lokalen
Populationen alternierende Allele fixiert werden und somit ein Verlust jeglicher
genetischen Variablität eintritt.
Tab.18: F`ST Werte zwischen den einzelnen Populationen an den unterschiedlichen Standorten
F`ST Zill Hohberg Knospenhof Herl Brache Eiden
Zill 0,577 0,617 0,627 0,635
Hohberg 0,568 0,612 0,626 0,613
Knospenhof 0,527 0,532 0,532 0,533
Herl Brache 0,532 0,595 0,580 0,574
Eiden 0,526 0,517 0,517 0,511
Wie in der Tabelle 18 zu erkennen ist, liegen alle F’ST Werte zwischen 0,511 und 0,635,
also durchaus im mittleren Bereich, so dass von einer Allelfixierung und einer damit
einhergehenden Abnahme der genetischen Variabilität nicht die Rede sein kann.
Ergebnisse und deren Diskussion 69
Genau so auffallend wie die niedrigen Bandsharingraten der Flächen Eiden und
Knospenhof sind die hohen BSR der Brachflächen Zill und Hohberg, obwohl die
Variabilität zwischen den Fingerprintmustern einzelner Individuen innerhalb einer Fläche
hoch ist (Pg Zill: 8,78 ⋅ 10-5, Pg Hohberg 4,26 ⋅ 10-5). Die Tatsache, dass innerhalb dieser
beiden Standorte eine höhere Ähnlichkeit herrscht wie an den anderen Standorten, ist
eventuell auf die vorher schon angesprochenen Isolationseffekte und einem damit
verringertem Gen-Austausch zurückzuführen. So besteht natürlich die Möglichkeit, dass
Inzuchteffekte an den Standorten Zill und Hohberg eine gewisse Rolle spielen, jedoch
sollten diese nicht zu hoch bewertet werden. Dafür sprechen auch die F`ST Werte aus
Tab. 18, die im mittleren Bereich liegen, und nicht auf eine Fixierung von Allelen
hindeuten.
Diese Isolationseffekte sind am Standort Herl-Brache, der weiträumig nach allen Seiten
offen ist, nicht vorhanden. Dadurch würde sich die niedrigere durchschnittliche BSR
dieses Standortes gegenüber den anderen beiden Brachen erklären.
Die Auswirkungen von Inzuchteffekten auf Fingerprintmuster wurden in diversen
Publikationen veröffentlicht.
So zeigte Nybom 1991, dass bei nordamerikanischen Pflanzen (paw paws) in kleinen
isolierten Gebieten wesentlich höhere Bandsharingraten auftraten als zwischen
Individuen, die über die ganze USA verteilt verglichen wurden. Dadurch wurde in den
Fingerprintmustern Inzucht infolge von Isolation festgestellt.
Ebenfalls in der Haustiergenetik und Haustierzucht konnte nachgewiesen werden, dass
sich Inzucht auf die Bandenmuster auswirkt (Dunnington et al. 1990, Ellegren et al. 1985).
Meistens wird Inzucht, wie bei ingezüchteten Hühnerlinien, anhand von erhöhten
Bandsharingraten festgestellt (Dolf et al. 1992).
Auch beim Nacktmull, einem sozial lebenden Nagetier, wurde aufgrund seiner
Lebensweise ein hoher Grad an Inzucht innerhalb und zwischen den Kolonien
nachgewiesen (Breuer 1991). Dieser Inzuchtgrad ist vergleichbar mit der Inzucht bei
Labor-Nagern über eine Zeitspanne von 60 Generationen (Breuer 1991).
Die Ergebnisse dieses Kapitels belegen, dass das Multilocus-DNA-Fingerprinting sich für
populationsgenetische Fragestellungen eignet. Die Eignung dieser Methode auf
populationsgenetische Fragestellungen wurde auch schon von anderen Autoren
festgestellt. So haben Gilbert et al. (1991) mit Hilfe des Multilocus-DNA-Fingerprinting
Unterschiede bei Löwenpopulationen festgestellt, die sie als Folge unterschiedlicher
demographischer Geschichte der Population gedeutet haben.
Von Tylor et al. (1991) sind in Australien Koalas untersucht worden, die Bandsharingraten
von zwischen 0,750 und 1,000 aufwiesen. Dies ist laut der Autoren darauf
zurückzuführen, dass die Koalas kurz vor der Ausrottung standen und dass somit die
Ergebnisse und deren Diskussion 70
Nachkommen eine schmale genetische Basis haben. Dieser bottleneck-Effekt wurde auch
bei Falco peregrinus in Skandinavien festgestellt (Lifjeld et al.2002)
In fischereiwirtschaflichen Fragestellungen wurde das Multilocus-DNA-Fingerprinting zur
Identifizierung von Stämmen herangezogen (Castelli et al. 1990, Harris et al. 1991,
Bentzen et al. 1993, Wright 1993, Laughlin u. Turner 1994, Heath et al. 1995, O`Reilly u.
Wright 1995, Dahle 1996).
Mit dem Multilocus-DNA-Fingerprinting kann man also die unterschiedliche
demographische Geschichte von Populationen nachvollziehen, bzw. Unterschiede
zwischen Populationen, die diesen Mechanismen in verschieden starkem Maße
ausgesetzt waren, erkennen (Gilbert et al. 1990 und 1991, Taylor et al. 1991 und Ely et al.
1991, Call et al. 1998).
Als Ausblick wäre es hochinteressant, die beiden Flächen Knospenhof und Eiden, bei
gleichbleibender Nutzung, weiter zu beobachten, um zu kontrollieren, ob Veränderungen
in den BSR der Feldmäuse dieser Flächen stattfinden (Gen-Monitoring). Außerdem
sollten ergänzend zu den genetischen Untersuchungen auch toxikologische
Untersuchungen stattfinden, um festzustellen, ob Pathogene und wenn ja, welche
Pathogene auf die Feldmäuse einwirken, und wie diese auf die Flächen gelangen.
Es wäre auch interessant Studien durchzuführen, was nach einem Zusammenbruch einer
Feldmauspopulation passiert. Ob von anderen Flächen neues genetisches Material
hereingetragen wird, oder ob die kommenden Generationen auf einem schmalen Genpool
basieren. Ebenso nachforschenswert wäre in diesem Zusammenhang die Frage, welche
Rolle die Genetik bei einem Zusammenbruch der Feldmauspopulation spielt.
5.9 Untersuchung von Feldmäusen mit bekanntem Verwandtschaftsgrad
Während der Fangaktionen wurden an 3 Standorten 6 trächtige Mäuse mit zwischen 3
und 6 Embryonen gefangen. So wurde am Standort Hohberg eine Maus (ma) mit 5
Embryonen (a1-a5), am Standort Knospenhof wurden 3 Mäuse (mb, mc und md) mit 4
(b1-b4), 3 (c1-c3) bzw. 6 (d1-d6) Embryonen und am Standort Herl-Brache 2 Mäuse (me
und mf) mit 6 (e1-e6), bzw. 4 (f1-f4) Embryonen gefangen.
Da die Fingerprintbanden als Allele betrachtet werden, die nach den Mendelschen Regeln
weitervererbt werden, ist jede Bande eines Nachkommen auf eine Bande eines Elternteils
zurückzuführen. Die Gesamtzahl der Banden des Nachkommen muss aber nicht gleich
der Summe der Elterlichen Banden sein, weil heterozygote Banden nicht auf die
Nachkommen vererbt werden müssen. Fehlt der Fingerprint eines der Eltern, kann man
Ergebnisse und deren Diskussion 71
durch einen Vergleich der Fingerprintbanden von dem bekannten Elternteil und den
Nachkommen (wenn man die Banden des oder der Nachkommen betrachtet) darauf
schließen, welche Banden die Nachkommen vom unbekannten Elternteil geerbt haben
(diese fehlen beim bekannten Elternteil), bzw. welche Banden des bekannten Elternteils
heterozygot sein müssen (diese fehlen dann bei dem oder den Nachkommen) (Mörsch
1992).
5.9.1 Mutter ma und ihre Nachkommen a1-a5
Tab.19: Bandsharingraten der Mutter ma und ihrer Nachkommen a1-a5
ma a1 a2 a3 a4 a5
ma 0,824 0,788 0,500 0,647 0,727
a1 0,903 0,667 0,750 0,774
a2 0,690 0,710 0,800
a3 0,800 0,690
a4 0,581
Tab.20: Durchschnittliche Fingerprintdaten der Feldmäuse mit bekanntem Verwandtschaftsgrad vom Standort
Hohberg
n N ∈ Pb = ∅ BSR Pg Pi
6 24 8,7 (± 0,5) 0,723 (± 0,101) 5,95 ⋅ 10-2 4,64 ⋅ 10-6
n = Anzahl der untersuchten Tiere.
N = Anzahl der beurteilten Positionen der Mutter ma und ihren Nachkommen a1-a5 .
∈ = durchschnittliche Anzahl polymorpher Banden pro Individuum.
Pb = mittlere Wahrscheinlichkeit, dass eine Bande in den Fingerprints zweier zufällig aus der Population
entnommenen Tiere gleichzeitig vorliegt.
Pg = Wahrscheinlichkeit, dass der Fingerprint eines zufällig aus der Population entnommenen Tieres alle
Banden aus dem Fingerprint eines anderen aufweist (durchaus jedoch noch zusätzliche).
Pi = Wahrscheinlichkeit, dass 2 zufällig aus einer Population entnommene Individuen identische
Fingerprints haben.
Im gesamten Auswertbereich von 24200 bp bis 2200 bp gab es 24 zu beurteilende
Positionen mit durchschnittlich 8,7 (± 0,5) polymorphen Banden (Tab.20). Die
Bandsharingraten lagen zwischen 0,500 (a4/a5) und 0,903 (a1/a2) (Tab.19), woraus sich
dann eine durchschnittliche BSR von 0,723 (± 0,101) ergab. Daraus konnte die beiden
Wahrscheinlichkeiten Pg und Pi mit den Werten Pg = 5,95 ⋅ 10-2 und Pi = 4,64 ⋅ 10-6
errechnet werden (Tab.20).
Ergebnisse und deren Diskussion 72
Tab.21: Bandsharingraten der väterlichen Banden der Nachkommen a1-a5
a1 a2 a3 a4 a5
a1 1,000 0,500 0,571 0,400
a2 0,500 0,571 0,400
a3 0,727 0,667
a4 0,500
Tab.22: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden der Nachkommen a1-a5 mit der Mutter ma bzw. mit
dem putativen Vater oder den putativen Vätern pva
ma a1 a2 a3 a4 a5
ma 11 8 7 2 5 6
pva 1 1 5 4 2
Gesamt 9 8 7 9 8
Die BSR der Banden, die von dem putativen Vater, oder den putativen Vätern an ihre
Nachkommen weitergegeben wurden lagen zwischen 0,400 (a1/a5, a2/a5) und 1,000
(a1/a2) (Tab.21). Für 2 Banden, die von der Mutter an keines der Nachkommen
weitervererbt worden sind, und für 9 weitere Banden, die nicht alle Nachkommen haben
ist die Mutter ma heterozygot. 6 weitere Banden sind monomorph, da sie bei allen
Individuen vorkommen. Die 13 heterozygoten Banden (Tab.22), die von väterlicher Seite
an die Individuen weitergegeben wurden, verteilen sich auf 7 Positionen. Eine weitere
Bande ist von dem Vater oder den Vätern an alle weitergegeben worden.
5.9.2 Mutter mb und ihre Nachkommen b1-b4
Tab.23: Bandsharingraten der Mutter mb und ihrer Nachkommen b1-b4
mb b1 b2 b3 b4
mb 0,850 0,810 0,872 0,629
b1 0,810 0,821 0,743
b2 0,878 0,595
b3 0,588
Tab.24: Durchschnittliche Fingerprintdaten der Feldmäuse mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad vom
Standort Knospenhof
n N ∈ Pb = ∅ BSR Pg Pi
5 28 11,2 (± 0,5) 0,760 (± 0,114) 4,63 ⋅ 10-2 3,03 ⋅ 10-6
Ergebnisse und deren Diskussion 73
n = Anzahl der untersuchten Tiere.
N = Anzahl der beurteilten Positionen der Mutter mb und ihren Nachkommen b1-b4.
∈ = durchschnittliche Anzahl polymorpher Banden pro Individuum.
Pb = mittlere Wahrscheinlichkeit, dass eine Bande in den Fingerprints zweier zufällig aus der Population
entnommenen Tiere gleichzeitig vorliegt.
Pg = Wahrscheinlichkeit, dass der Fingerprint eines zufällig aus der Population entnommenen Tieres alle
Banden aus dem Fingerprint eines anderen aufweist (durchaus jedoch noch zusätzliche).
Pi = Wahrscheinlichkeit, dass 2 zufällig aus einer Population entnommene Individuen identische
Fingerprints haben.
Der Auswertbereich der Mutter mb und ihrer Nachkommen b1-b4 liegt zwischen 18500 bp
und 1000 bp. Die Bandsharingraten liegen zwischen 0,588 (b3/b4) und 0,878 (b2/b3)
(Tab.23). Bei den 5 Individuen wurden 28 Bandenpositionen mit durchschnittlich 11,2 (±
0,5) polymorphen Banden berücksichtigt. Die durchschnittliche Bandsharingrate wurde mit
0,760 (± 0,114) berechnet. Daraus ergaben sich für die Wahrscheinlichkeiten Pi und Pg
die beiden Werte Pg = 4,63 ⋅ 10-2 und Pi = 3,03 ⋅ 10-6 (Tab.24).
Tab.25: Bandsharingraten der väterlichen Banden der Nachkommen b1-b4
b1 b2 b3 b4
b1 0,500 0,400 0,571
b2 0,286 0,444
b3 0,333
Tab.26: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden der Nachkommen b1-b4 mit der Mutter mb bzw. mit
dem putativen Vater oder den putativen Vätern pvb
mb b1 b2 b3 b4
mb 11 8 8 8 2
pvb 2 4 1 3
Gesamt 10 12 9 5
Die Bandsharingraten der Nachkommen, berechnet aus den vom Vater oder den Vätern
vererbten Banden, liegen zwischen 0,286 (b2/b3) und 0,571 (b1/b4) (Tab.25). Von den 11
heterozygoten Banden der Mutter wurde eine an keine der Nachkommen weitervererbt. 9
Banden der Mutter waren monomorph und wurden an alle Nachkommen weitervererbt.
Die 10 Banden (Tab.26), die von dem Vater oder den Vätern stammen, verteilen sich auf
7 Positionen. Eine zusätzliche Bande dieses Elternteils kommt bei allen Nachkommen
vor.
Ergebnisse und deren Diskussion 74
5.9.3 Mutter mc und ihre Nachkommen c1-c3
Tab.27: Bandsharingraten der Mutter mc und ihrer Nachkommen c1-c3
mc c1 c2 c3
mc 0,826 0,780 0,683
c1 0,711 0,844
c2 0,650
Tab.28: Durchschnittliche Fingerprintdaten der Feldmäuse mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad vom
Standort Knospenhof
n N ∈ Pb = ∅ BSR Pg Pi
4 29 11,5 (± 0,5) 0,749 (± 0,079) 3,60 ⋅ 10-2 1,15 ⋅ 10-6
n = Anzahl der untersuchten Tiere.
N = Anzahl der beurteilten Positionen der Mutter mc und ihren Nachkommen c1-c3.
∈ = durchschnittliche Anzahl polymorpher Banden pro Individuum.
Pb = mittlere Wahrscheinlichkeit, dass eine Bande in den Fingerprints zweier zufällig aus der Population
entnommenen Tiere gleichzeitig vorliegt.
Pg = Wahrscheinlichkeit, dass der Fingerprint eines zufällig aus der Population entnommenen Tieres alle
Banden aus dem Fingerprint eines anderen aufweist (durchaus jedoch noch zusätzliche).
Pi = Wahrscheinlichkeit, dass 2 zufällig aus einer Population entnommene Individuen identische
Fingerprints haben.
Im Auswertbereich von 23400 bp bis 1000 bp liegen die BSR zwischen 0,650 (c2/c3) und
0,844 (c1/c3) (Tab.27). Daraus ergibt sich eine durchschnittliche Bandsharingrate von
0,749 (± 0,079). An den 29 untersuchten Positionen der 4 Individuen wurde eine
durchschnittliche Anzahl von 11,5 (± 0,5) polymorphen Banden pro Individuum festgestellt
(Tab.28). Für die Wahrscheinlichkeiten Pg bzw. Pi wurden Werte von 3,60 ⋅ 10-2 bzw. 1,15
⋅ 10-6 ermittelt.
Tab.29: Bandsharingraten der väterlichen Banden der Nachkommen c1-c3
c1 c2 c3
c1 0,400 0,833
c2 0,400
Ergebnisse und deren Diskussion 75
Tab.30: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden der Nachkommen c1-c3 mit der Mutter mc bzw. mit
dem putativen Vater oder den putativen Vätern pvc
mc c1 c2 c3
mc 10 9 6 4
pvc 4 2 4
Gesamt 13 8 8
Errechnet man die Bandsharingraten von dem putativen Vater oder den putativen Vätern
und seinen bzw. ihren Nachkommen ergeben sich Werte von 0,400 (c1/c2, c2/c3) und
0,833 (c1/c3) (Tab.29). Die Mutter mc besitzt 20 Banden, von denen 10 heterozygot sind
(Tab.30) und 10 an alle Nachkommen weitergegeben wurden. Die 10 Banden (Tab.30)
des unbekannten oder der unbekannten männl. Elternteile verteilen sich auf 7 Positionen.
2 weitere monomorphe Banden des putativen Vaters oder der putativen Väter sind bei
allen Nachkommen zu finden.
5.9.4 Mutter md und ihre Nachkommen d1-d6
Tab.31: Bandsharingraten der Mutter md und ihrer Nachkommen d1-d6
md d1 d2 d3 d4 d5 d6
md 0,927 0,905 0,821 0,706 0,895 0,778
d1 0,977 0,900 0,743 0,872 0,757
d2 0,927 0,778 0,900 0,737
d3 0,727 0,865 0,686
d4 0,750 0,600
d5 0,824
Tab.32: Durchschnittliche Fingerprintdaten der Feldmäuse mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad vom
Standort Knospenhof
n N ∈ Pb = ∅ BSR Pg Pi
7 25 11,6 (± 0,5) 0,813 (± 0,096) 9,06 ⋅ 10-2 1,16 ⋅ 10-4
n = Anzahl der untersuchten Tiere.
N = Anzahl der beurteilten Positionen der Mutter md und ihren Nachkommen d1-d6.
∈ = durchschnittliche Anzahl polymorpher Banden pro Individuum.
Pb = mittlere Wahrscheinlichkeit, dass eine Bande in den Fingerprints zweier zufällig aus der Population
entnommenen Tiere gleichzeitig vorliegt.
Pg = Wahrscheinlichkeit, dass der Fingerprint eines zufällig aus der Population entnommenen Tieres alle
Banden aus dem Fingerprint eines anderen aufweist (durchaus jedoch noch zusätzliche).
Pi = Wahrscheinlichkeit, dass 2 zufällig aus einer Population entnommene Individuen identische
Fingerprints haben.
Ergebnisse und deren Diskussion 76
Bei diesen 7 Individuen konnte der Bereich zwischen 20000 bp und 1000 bp ausgewertet
werden. Hierbei wurden 25 Positionen berücksichtigt. Die Bandsharingraten reichten von
0,600 (d4/d6) bis 0,977 (d1/d2) (Tab.31). Die durchschnittliche Anzahl polymorpher
Banden betrug 11,6 (± 0,5) pro Individuum. Als durchschnittliche BSR aller Individuen
konnte der Wert 0,813 (± 0,096) ermittelt werden. Für die beiden Wahrscheinlichkeiten Pg
und Pi wurden die Werte Pg = 9,06 ⋅ 10-2 und Pi = 1,16 ⋅ 10-4 errechnet (Tab.32).
Tab.33: Bandsharingraten der väterlichen Banden der Nachkommen d1-d6
d1 d2 d3 d4 d5 d6
d1 0,800 0,800 0,500 0,000 0,000
d2 1,000 0,800 0,500 0,000
d3 0,800 0,500 0,000
d4 0,667 0,000
d5 0,000
Tab.34: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden der Nachkommen d1-d6 mit der Mutter md bzw. mit
dem putativen Vater oder den putativen Vätern pvd
md d1 d2 d3 d4 d5 d6
md 13 12 12 9 5 10 7
pvd 2 3 3 2 1 2
Gesamt 14 15 12 7 11 9
Die Bandsharingraten der putativen Väter bzw. des putativen Vaters mit ihren/seinen
Nachkommen liegen zwischen 0,000 (alle Kombinationen mit d6) und 1,000 (d2/d3)
(Tab.33). Von den 20 Banden mütterlicherseits sind 13 heterozygot, von denen 1 an keine
ihrer Nachkommen weitergegeben wurde. Die restlichen 7 Banden konnten in allen
Nachkommen nachgewiesen werden. Die auf die 6 Nachkommen verteilten 13 Banden
(Tab.34) von dem Vater, bzw. den Vätern verteilen sich auf 5 Positionen. Keine dieser
Banden wurde an alle Nachkommen weitergegeben.
Ergebnisse und deren Diskussion 77
5.9.5 Mutter me und ihre Nachkommen e1-e6
Tab.35: Bandsharingraten der Mutter me und ihrer Nachkommen e1-e6
me e1 e2 e3 e4 e5 e6
me 0,857 0,917 0,605 0,844 0,549 0,538
e1 0,818 0,667 0,829 0,426 0,500
e2 0,578 0,894 0,566 0,593
e3 0,667 0,542 0,571
e4 0,560 0,510
e5 0,737
Tab.36: Durchschnittliche Fingerprintdaten der Feldmäuse mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad vom
Standort Herl-Brache
n N ∈ Pb = ∅ BSR Pg Pi
7 44 14,7 (± 0,5) 0,656 (± 0,148) 2,03 ⋅ 10-3 3,39 ⋅ 10-12
n = Anzahl der untersuchten Tiere.
N = Anzahl der beurteilten Positionen der Mutter me und ihren Nachkommen e1-e6.
∈ = durchschnittliche Anzahl polymorpher Banden pro Individuum.
Pb = mittlere Wahrscheinlichkeit, dass eine Bande in den Fingerprints zweier zufällig aus der Population
entnommenen Tiere gleichzeitig vorliegt.
Pg = Wahrscheinlichkeit, dass der Fingerprint eines zufällig aus der Population entnommenen Tieres alle
Banden aus dem Fingerprint eines anderen aufweist (durchaus jedoch noch zusätzliche).
Pi = Wahrscheinlichkeit, dass 2 zufällig aus einer Population entnommene Individuen identische
Fingerprints haben.
Die Fingerprints der Mutter me und ihrer Nachkommen e1-e6 konnten in einem Bereich
zwischen 21700 und 1000 bp ausgewertet werden. Die hier ermittelten BSR lagen
zwischen 0,426 (e1/e5) und 0,917 (me/e2) (Tab.35). Bei den 7 Individuen wurden
insgesamt 44 Positionen beurteilt. Pro Individuum wurden durchschnittlich 14,7 (± 0,5)
polymorphe Banden nachgewiesen. Die durchschnittliche BSR wurde mit 0,656 (± 0,148)
berechnet und die aus ihr hervorgehenden Wahrscheinlichkeiten mit Pg = 2,03 ⋅ 10-3 bzw.
Pi = 3,39 ⋅ 10-12 festgelegt (Tab.36).
Ergebnisse und deren Diskussion 78
Tab.37: Bandsharingraten der väterlichen Banden der Nachkommen e1-e6
e1 e2 e3 e4 e5 e6
e1 0,500 0,250 0,500 0,000 0,125
e2 0,200 0,667 0,118 0,333
e3 0,400 0,286 0,346
e4 0,235 0,222
e5 0,621
Tab.38: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden der Nachkommen e1-e6 mit der Mutter me bzw. mit
dem putativen Vater oder den putativen Vätern pve
me e1 e2 e3 e4 e5 e6
me 14 9 13 4 10 5 5
pve 1 3 7 3 14 15
Gesamt 10 16 11 13 19 20
Die Bandsharingraten der Nachkommen e1-e6 mit den Banden ihres putativen Vaters
oder ihrer putativen Väter liegen zwischen 0,000 (e5/e1) und 0,667 (e2/e4) (Tab.37). Die
43 Banden (Tab.38) der Väter oder des Vaters sind auf 21 Positionen verteilt. Keine der
väterlichen wurde an alle Nachkommen weitergegeben. Von den 23 Banden der Mutter
sind 14 heterozygot und 9 monomorph.
5.9.6 Mutter mf und ihre Nachkommen f1-f4
Tab.39: Bandsharingraten der Mutter mf und ihrer Nachkommen f1-f4
mf f1 f2 f3 f4
mf 0,579 0,684 0,615 0,683
f1 0,474 0,872 0,683
f2 0,615 0,780
f3 0,810
Tab.40: Durchschnittliche Fingerprintdaten der Feldmäuse mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad vom
Standort Herl-Brache
n N ∈ Pb = ∅ BSR Pg Pi
5 32 12,8 (± 0,5) 0,680 (± 0,118) 7,18 ⋅ 10-3 1,10 ⋅ 10-8
n = Anzahl der untersuchten Tiere.
N = Anzahl der beurteilten Positionen der Mutter mf und ihren Nachkommen f1-f4.
∈ = durchschnittliche Anzahl polymorpher Banden pro Individuum.
Pb = mittlere Wahrscheinlichkeit, dass eine Bande in den Fingerprints zweier zufällig aus der Population
entnommenen Tiere gleichzeitig vorliegt.
Ergebnisse und deren Diskussion 79
Pg = Wahrscheinlichkeit, dass der Fingerprint eines zufällig aus der Population entnommenen Tieres alle
Banden aus dem Fingerprint eines anderen aufweist (durchaus jedoch noch zusätzliche).
Pi = Wahrscheinlichkeit, dass 2 zufällig aus einer Population entnommene Individuen identische
Fingerprints haben.
Im Bereich zwischen 17500 bp und 1000 bp lagen die BSR der Mutter mf mit ihren
Nachkommen zwischen 0,474 (f1/f2) und 0,872 (f1/f3) (Tab.39). Es standen 5 Individuen
zur Verfügung, deren Fingerprints 32 Positionen beinhalten. Die durchschnittlich Anzahl
an polymorphen Banden pro Individuum beläuft sich auf 12,8 (± 0,5). Die
Wahrscheinlichkeiten Pg = 7,18 ⋅ 10-3 und Pi = 1,10 ⋅ 10-8 resultieren unter anderem aus
der durchschnittlichen BSR von 0,680 (± 0,118) (Tab.40).
Tab.41: Bandsharingraten der väterlichen Banden der Nachkommen f1-f4
f1 f2 f3 f4
f1 0,286 0,875 0,750
f2 0,429 0,429
f3 0,875
Tab.42: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden der Nachkommen f1-f4 mit der Mutter mf bzw. mit
dem putativen Vater oder den putativen Vätern pvf
mf f1 f2 f3 f4
mf 12 4 6 5 7
pvf 6 4 6 6
Gesamt 10 10 11 13
Die Bandsharingraten der Nachkommen f1-f4, die sich aus den 30 väterlichen Banden
(Tab.42) ableiten lassen liegen zwischen 0,286 (f1/f2) und 0,875 (f1/f3, f3/f4) (Tab.41).
Diese 30 Banden sind auf 13 Positionen verteilt. 2 Banden vom Vater finden sich in den
Fingerprints aller Nachkommen wieder. Von den 19 Banden (Tab.42) der Mutter sind 12
heterozygot, 2 von diesen kommen überhaupt nicht in den Fingerprints ihrer
Nachkommen vor. Die restlichen 7 Banden erscheinen in den Fingerprints aller
Nachkommen.
Ergebnisse und deren Diskussion 80
5.9.7 Aussagen über Reproduktionsstrategien anhand der erhobenen
Fingerprintdaten
Insgesamt liegen die BSR der sicher verwandten Mäuse zwischen 0,426 und 0,927 (bei
der Mutter und ihren Nachkommen) bzw. zwischen 0,000 und 1,000 (bei dem Vater oder
den Vätern und seinen bzw. ihren Nachkommen). Betrachtet man nun die Verteilung der
heterozygoten Banden zwischen den Eltern und ihren Nachkommen (siehe Tabellen: 22,
26, 30, 34, 38, 42), so fällt auf, dass im Durchschnitt mehr Banden von der Mutter (64%),
als vom Vater (36%) an die Nachkommen weitergegeben werden. Das dies nicht an der
Wahl der Sonde liegt (es könnte ja sein dass diese Sequenzen zu einem hohen
Prozentsatz nur in den weiblichen Tieren von Microtus arvalis vererbt werden) kann an
den Individuen f1 bis f4 gesehen werden, die ja etwa 50% ihrer Banden vom Vater und
50% ihrer Banden von der Mutter geerbt haben.
Durch Vergleiche der väterlichen Bandenmuster der Nachkommen, mit den
Bandenmustern der männlichen Tiere, die an dem jeweiligen Standort gefangen wurden,
konnte kein Vater ermittelt werden, so dass bei allen Nachkommen nur eine Elternteil
bekannt war.
Untersuchungen zur genetischen Verwandtschaft von Individuen innerhalb einer
Population ist eine wichtige Aufgabenstellung in der Populationsgenetik (Burke et al.1991,
Dickinson & Akre 1998, Gompper et al. 1998, Wilmer et al. 1999, Parker et al. 1999,
Huyvaert et al. 2000, Taylor et al. 2000, Baumel 2001, Haydock et al. 2001). Hierbei ist
die wichtigste statistische Größe, die ermittelt werden kann, die Bandsharingrate
zwischen den Individuen. Sie beträgt bei dieser Untersuchung zwischen verwandten
Individuen ersten Grades im Schnitt 0,730 und ist somit deutlich höher, als die
durchschnittliche Bandsharingrate von Individuen mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad
(0,172).
Diese Ergebnisse stimmen tendentiell mit den von Gilbert et al. 1991 ermittelten Werten
von wildlebenden Löwen überein. Er errechnete eine durchschnittliche Bandsharingrate
von 0,796 für verwandte und eine BSR von 0,490 für Löwen mit unbekanntem
Verwandtschaftsgrad. Auch die von Mörsch 1992 bei wildlebenden Rehpopulationen
ermittelten Werte sind mit den in dieser Arbeit herausgefundenen Werten durchaus
vergleichbar. Die Bandsharingraten betrugen bei erstgradig verwandten Rehen im Schnitt
0,640 bzw. bei Rehen mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad 0,275. Bestätigt werden die
hier erzielten Ergebnisse auch von Jarne et al. (1990) der bei verwandten Schnecken
BSR von 0,612 errechnete.
Betrachtet man diese Arbeiten liegt die Vermutung nahe, dass anhand der
Bandsharingrate infolge linearer Regression der Verwandtschaftsgrad abgelesen werden
Ergebnisse und deren Diskussion 81
kann. Zunächst einmal fallen aber nur die wesentlichen höheren Bandsharingraten der
verwandten, gegenüber den Individuen mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad auf. Einige
Autoren haben auch schon versucht die Verwandtschaftsverhältnisse anhand der
Bandsharingrate zu schätzen. So haben Wetton et al. 1987 bei der Untersuchung einer
Haussperling-Population die Schätzung des Verwandtschaftsgrades sehr einfach
gehalten (vgl. auch Hoagland et al. 1991). Für Verwandte ersten Grades wurde eine BSR
von 0,5 festgelegt. Unverwandte Individuen zeigen eine BSR unter 0,25. Da in dieser
Haussperling-Population die meisten BSR unter 0,25 lagen und nur ein Wert von 0,730
bei einer bestimmten Individuenkombination aus den niedrigen Werten hervortrat, konnte
so tatsächlich ein Sperling als Vater eines Jungen, der aus einer extra pair copulation
stammen musste, enttarnt werden. Auch andere soziobiologischen Vorkommnisse sind
schon mit Hilfe des Multilocus-DNA-Fingerprinting aufgeklärt worden (Burke 1989, Burke
et al. 1991, Swatschek 1992, Huyvaert et al. 2000).
Nach dieser These wären also auf jeden Fall zwischen Müttern und ihren Nachkommen
eine BSR von etwa 0,5 zu erwarten gewesen. Zwischen den Nachkommen kann nicht von
einer Bandsharingrate von 0,5 ausgegangen werden, da hier die Möglichkeit von
multiplen Vaterschaften berücksichtigt werden muss, worauf ich aber später noch zu
sprechen kommen werde. Eine BSR von 0,5 zwischen den Müttern und ihren
Nachkommen ist aber relativ selten der Fall. Meist liegt diese Bandsharingrate deutlich
über 0,5 (siehe Tab.: 19, 23, 27, 31, 35, 39). So konnten also auch hier die Ergebnisse
von Jones et al. (1991) bestätigt werden, die bei den Bienenfressern ebenfalls
herausfanden, dass die Verwandtschaft nicht immer direkt über die Bandsharingrate
bestimmt werden kann.
Lynch hat 1991 erkannt, dass zwischen unverwandten Individuen einer Population eine
gewisse Hintergrund-Bandsharingrate (BSR zwischen unverwandten Individuen) besteht
und dass bei der Schätzung des Verwandtschaftsgrades zwischen 2 Individuen diese
Hintergrund-Bandsharingrate berücksichtigt werden muss. Je entfernter die
Verwandtschaft zwischen 2 Individuen umso eher wird der Verwandtschaftsgrad durch die
Bandsharingrate überschätzt. Zur Schätzung des Verwandtschaftsgrades ist die
Hintergrung-Bandsharingrate ein entscheidender Faktor. Als Hintergrund-Bandsharingrate
wurde der Wert 0,172 die durchschnittlichen Bandsharingraten der 5 Standorte (Hohberg,
Zill, Eiden, Knospenhof und Herl-Brache) für Individuen mit unbekanntem
Verwandtschaftsgrad gewählt. Mit der von Lynch (1991) entwickelten Formel BSR = e
+ r ⋅ (1 - e ) (siehe Material und Methode) kann durch einen vorgegebenen
Verwandtschaftskoeffizienten r und eine Hintergrund-Bandsharingrate e eine zu
Ergebnisse und deren Diskussion 82
erwartende BSR für einen durch den Verwandtschaftskoeffizienten bestimmten
Verwandtschaftsgrad errechnet werden.
Für Verwandte ersten Grades (Verwandtschaftskoeffizient r = 0,5) ergibt sich daraus für
die eine zu erwartende BSR von 0,586.
Vergleicht man die ermittelten Werte zwischen den Müttern und ihren Nachkommen (weil
hier ganz sicher ein Verwandtschaftsverhältnis ersten Grades vorliegt) mit der zu
erwartenden BSR, so fällt auf, dass die meisten BSR darüber liegen. Nur 4 (ma/a3: 0,500;
me/e5: 0,549; me/e6: 0,538 und mf/f1: 0,579) dieser 28 Werte (14%) liegen darunter.
Eine weitere Möglichkeit der Berechnung einer zu erwartenden BSR für verwandte
Individuen kann über die Allelfrequenz erfolgen. Ausgehend von einer hier errechneten
Allelfrequenz q = 0,090 ergibt sich eine zu erwartende BSR für verwandte ersten Grades
von 0,566. Dieser Wert weicht nicht stark von dem vorherigen nach Lynch (1991)
ermittelten Wert ab. Aus einem Vergleich der Werte zwischen den Müttern und ihren
Nachkommen geht hervor, dass hier nur 3 (ma/a3: 0,500; me/e5: 0,549 und me/e6: 0,538)
der 28 Werte (11%) darunter liegen.
Nach Haydock et al. (1996) ist es weiterhin möglich über die Allelfrequenz eine zu
erwartende Bandsharingrate für Vollgeschwister zu errechnen.
Dass es multiple Vaterschaften bei verschiedenen Species (Sorex araneus, Apodemus
agrarius, Lacerta agilis) gibt ist unbestritten (vgl. Tegelström 1991, Gullberg 1997, Baker
1999). Diese sind auch oftmals durch das Multilocus-DNA-Fingerprinting belegt worden.
Bei einer Mehrvaterschaft sind die Nachkommen Halbgeschwister. Die nach Haydock et
al. (1996) ermittelte BSR für Vollgeschwister liegt bei 0,576. Vergleicht man diesen Wert
mit den tatsächlich ermittelten Bandsharingraten, so fällt auf, dass die beiden
Nachkommen e5 und e6 mit fast allen anderen Geschwistern (Ausnahme: e6/e2) Werte
aufweisen, die unter der zu erwartenden BSR für Vollgeschwister liegen (vgl. Tab.35).
Untereinander weisen die beiden Geschwister e5 und e6 jedoch eine BSR von 0,737 auf.
Dieser Verdacht, dass es sich bei e5 und e6 um Geschwister handeln könnte, die zu ihren
anderen Geschwistern aber eher in einem Halbgeschwisterverhältnis stehen wird auch
durch die niedrigen, aus väterlichen Banden resultierenden Bandsharingraten (Tab.37)
erhärtet. Die hohe BSR von 0,621 zwischen e5 und e6, aus den väterlichen Banden
errechnet, kann wiederum als Indiz ihrer Vollgeschwisterschaft gewertet werden. Bei
Freilanduntersuchungen sind solche Sachverhalte natürlich sehr schwer nachzuweisen,
da meistens, wenn überhaupt, nur ein Elternteil vorhanden ist. Anhand von
Züchtungsversuchen im Labor, bei welchen die putativen Väter bekannt sind, dürfte es
kein allzu großes Problem darstellen, mit dem Multilocus-DNA-Fingerprinting den
Nachweis für multiple Vaterschaften bei Microtus arvalis zu erbringen.
Ergebnisse und deren Diskussion 83
5.10 RAPD-PCR (Williams et al.1990)
Zusätzlich zu der Methode des Multilocus-DNA-Fingerprinting wurde auch noch die
RAPD-PCR angewendet. Diese Methode hat gegenüber dem Multilocus-DNA-
Fingerprinting den Vorteil, dass sie kostengünstiger ist, mit sehr wenig DNA auskommt
und dass mit ihr sehr schnell Daten erzeugt werden können. Dadurch ist diese Methode
natürlich sehr gut geeignet, um eine große Anzahl von Proben zu untersuchen. Der
Nachteil dieser Methode liegt aber in ihrem wesentlich geringeren Informationsgehalt
gegenüber dem Multilocus-DNA-Fingerprinting. Im Verlauf dieser Arbeit wurden
insgesamt 120 RAPD-PCR-Primer (Roth Kit: 180, 280, 380, 480, A, B, C und D) auf ihre
Eignung bei Microtus arvalis getestet.
5.10.1 Artdifferenzierung
Da eine Unterscheidung zwischen Microtus arvalis und Microtus agrestris nicht anhand
von morphologischen Gesichtspunkten vorgenommen werden kann, erfolgte eine erste
Differenzierung der beiden Arten über die Zähne (siehe: Verbreitung und Ökologie). Die
Präparation des Gebisses und die anschließende Untersuchung brauchten jedoch zuviel
Zeit und waren des öfteren nicht mit Erfolg gekrönt, da auch in den Gebissen eine sehr
hohe Variationsbreite von unterschiedlichen Ausprägungen vorlag. So waren Exsul-
und/oder agrestris- Schlinge bei Microtus agrestris nur noch rudimentär oder überhaupt
nicht mehr vorhanden, bzw. bei Microtus arvalis Zahndeformationen ausgebildet, die
durchaus mit der Exsul- und/oder agrestris- Schlinge hätten verwechselt werden können.
Daraufhin wurden von den eindeutig bestimmbaren Microtus arvalis und Microtus
agrestris Multilocus-DNA-Fingerprints angefertigt. Anhand dieser Fingerprints konnten die
beiden Arten eindeutig als Microtus arvalis und Microtus agrestris unterschieden werden.
Verglich man diese Multilocus-DNA-Fingerprints mit dem Restriktionsverdau, so fiel auf,
dass schon durch die Fluoreszenzbande im Restriktionsverdau eine Artunterscheidung
möglich war (siehe: Restriktionsverdau und Fluoreszenzfärbung). Weil aber auch diese
beiden Möglichkeiten zu kosten- und zeitintensiv waren wurde auf die RAPD-PCR
zurückgegriffen, das heißt, es wurden so lange verschiedene Primer auf die eindeutig
bestimmten Microtus arvalis und Microtus agrestris angewandt, bis ein Primer gefunden
wurde, mit dessen Hilfe die beiden Arten differenziert werden konnten. Das die RAPD-
PCR sehr gut zur Artunterscheidung geeignet ist, belegen auch einige Beispiele aus der
Literatur. So untersuchten Hunt u. Page mit RAPD-PCR (1992) Artdifferenzierungen bei
der Honigbiene, Castiglione et al. (1993) bei Pappeln, Patwary et al. (1994) bei
Kammuschel und Quack (2000) bei Brassen, Rotaugen und Güstern.
Ergebnisse und deren Diskussion 84
Als hierzu bestens geeignet stellte sich der Primer A17 von der Firma Roth (Karlsruhe)
heraus. Er ermöglichte eindeutige und absolut reproduzierbare Ergebnisse in der
Artunterscheidung von Microtus arvalis und Microtus agrestris (siehe Abb.24). Die Qualität
dieser Artunterscheidung mittels RAPD-PCR wurde dadurch gefestigt, dass weder in
einem Restriktionsverdau einer Probe, die durch RAPD-PCR als Microtus arvalis
bestimmt wurde, eine Fluoreszenzbande auftrat, noch später in dem Fingerprint selbst
Banden auftraten, die auf eine andere Species als Microtus arvalis hindeuteten.
Abb.26: Artunterscheidung von Microtus arvails und Microtus agrestris mit dem RAPD-PCR Primer Roth A17
5.10.2 Populationsdifferenzierung
Basierend auf den mit dem Multilocus-DNA-Fingerprinting festgestellten Ergebnissen,
dass es zwischen den einzelnen Standorten, bzw. zwischen den einzelnen
Nutzungsformen Populationsdifferenzierungen gibt, wurde versucht, Primer zu finden, die
diese Ergebnisse bestätigen. Dies macht in Bezug auf eventuell kommende Arbeiten in
diesem Sektor deshalb Sinn, da die Menge an Probenmaterial so groß werden kann, dass
sie nicht mehr mit dem Multilocus-DNA-Fingerprinting zu bewältigen ist.
Warum diese Methode nicht direkt ohne das Multilocus-DNA-Fingerprinting auf diese
Fragestellung hin angewandt wurde, ist mit dem sehr hohen Informationsgehalt des
Multilocus-DNA-Fingerprinting gegenüber dem RAPD-PCR zu erklären. Das heißt, dass
die mit dem Multilocus-DNA-Fingerprinting erzielten Ergebnisse von der Methode her
wesentlich gesicherter sind als die mit dem RAPD-PCR erzielten Ergebnisse. Arbeiten,
bei denen versucht wurde populationsgenetische Fragestellungen mit dem RAPD-PCR zu
beantworten sind schon von diversen Autoren veröffentlicht worden (Macaranas et al.
1995, Caccone et al. 1997, Harding et al. 1997, Quack 2000).
Unter den 120 RAPD-PCR Primern befand sich nur einer, der Primer A19 von der Firma
Roth, der Populationsunterschiede zwischen den Standorten, bzw. zwischen den
Ergebnisse und deren Diskussion 85
unterschiedlich genutzten Flächen aufzeigte (siehe: Abb.25, Abb.26). Diese Unterschiede
zwischen den Standorten, bzw. den unterschiedlich genutzten Flächen waren jedoch
mehr an der Struktur (u.a. die Intensität einzelner Banden) der verschiedenen
Bandenmuster, als an der Vielzahl der polymorpher Banden festzumachen. Das
wiederum ist aber auf das Problem zurückzuführen, dass nur ein Primer gefunden werden
konnte, der die populationsgenetische Unterschiede aufwies. Bei mehreren solcher
Primer, wären natürlich auch mit einer größeren Anzahl von polymorphen Banden zu
rechnen, auf die dann eine statistische Auswertung hätte erfolgen können.
Abb.27: Unterschiedliche Bandenmuster der Standorte Herl, Hohberg und Zill von Microtus arvalis mit dem
Primer A19
Abb.28: Unterschiedliche Bandenmuster von Microtus arvalis in Herl (A: Standort Eiden, B: Standort
Knospenhof, C: Standort Herl-Brache)
Ergebnisse und deren Diskussion 86
Die Reproduzierbarkeit der mit dem RAPD-PCR erzielten Ergebnisse war im Großen und
Ganzen relativ hoch. Ein Problem, welches jedoch öfter auftrat, waren Unterschiede in der
Bandenstärke. Manche Banden erschienen intensiver und manche schwächer. Die
intensiven Banden verursachten keine großen Probleme, da sie auch noch in ihrer
schwächesten Erscheinungsform immer noch gut zu deuten waren. Anders hingegen die
schwachen Banden, die je nach PCR manchmal schwach vorhanden waren, manchmal
jedoch fehlten. Da die Anzahl polymorpher Banden sehr gering war, konnten Proben, bei
denen die schwachen Banden fehlten, oft nicht mehr einem bestimmten Standort zugeteilt
werden.
5.11 Fazit
Abschließend möchte ich feststellen, dass das Multilocus-DNA-Fingerprinting besser
geeignet war, genetische Untersuchungen von verschiedenen Standorten bzw.
Flächennutzungsformen an freilebenden Microtus arvalis durchzuführen als das RAPD-
PCR. Dies ist nicht nur auf den viel höheren Informationsgehalt des Multilocus-DNA-
Fingerprinting, sondern auch auf die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse dieser Methode
zurückzuführen. Das Verfahren wäre geeignet ein genetisches Monitoring von Microtus
arvalis im Hinblick auf bestimmte Umweltfaktoren (Inzucht, Populationsdezimierung,
Isolationsphänomene etc.) durchzuführen, bzw. den Einfluss von Umweltchemikalien auf
das Genom nachzuweisen. Die Grenzen der Anwendung dieser Methode sind jedoch in
der Probenanzahl zu sehen. Wird diese zu hoch, kann sie mit dem Multilocus-DNA-
Fingerprinting nicht mehr bewältigt werden, da es zu lange dauert, mit dieser Methode
einen Fingerprint herzustellen. Eine Alternative zu dem Multilocus-DNA-Fingerprinting
würde ich in der Mikrosatelliten-PCR sehen. Diese Methode wurde von mir versuchsweise
auch auf Microtus arvalis angewandt. Das Problem bestand darin, dass keine Literatur
gefunden werden konnte, in denen Mikrosatelliten-Primer für Microtus arvalis benannt
wurden. Deshalb wurden Mikrosatelliten-Primer von Microtus montebelli (Ischibaschi et al.
1998) und Microtus oeconomus (van de Zande et al. 2000), zweie nahe verwandte Arten,
auf Microtus arvalis angewandt. Leider konnten mit diesen Primern keine Mikrosatelliten
Regionen amplifiziert werden. Aber aufgrund der eindeutigeren statistischen
Auswertbarkeit der Mikrosatellite-PCR gegenüber der RAPD-PCR ist davon auszugehen,
dass diese Methode für populationsgenetische Untersuchungen besser als das RAPD-
PCR geeignet ist und somit eventuell wenigstens auf der Ebene von genetischen
Untersuchungen verschiedener Standorte bzw. Flächennutzungsformen eine Alternative
zu dem Multilocus-DNA-Fingerprinting darstellt.
Zusammenfassung 87
6. Zusammenfassung
Von den 3 eingesetzten Fallensystemen stellte sich die Kunststoff Wieselfalle als die für
den Fang von Microtus arvalis am besten Geeignetste heraus. Sie wurde sehr gerne
angenommen und die Mortalität in diesem Fallentyp war sehr gering. Durch ihre
Witterungsbeständig- und Verbissfestigkeit sind die Funktionsfähigkeit und eine lange
Lebensdauert garantiert. Von den angebotenen Ködern wurde am liebsten das
Früchtemüsli angenommen.
Alle der insgesamt 161 gefangenen Feldmäuse wurden mit der RAPD-PCR Methode
untersucht. Auf 99 dieser Microtus arvalis (65 mit unbekanntem, 34 mit bekanntem
Verwandtschaftsgrad) aus Wahlen und Herl wurde das Multilocus-DNA-Fingerprinting
angewandt.
Für alle verschiedenen Gewebetypen (Leber, Muskel und Niere) eines Individuums waren
die Fingerprintmuster identisch und somit somatisch stabil. Meist wurde jedoch die DNA
aus Lebergewebe isoliert, da sowohl die Qualität, als auch die Quantität der aus ihr
gewonnenen DNA sehr hoch war.
Bereits nach der Gelelektrophorese war zwischen den beiden phänotypisch nicht zu
unterscheidenden Arten Microtus arvalis und Microtus agrestris eine Fluoreszensbande
im Bereich um 2000 bp zu erkennen, die monomorph für alle Microtus agrestris war und
somit als eindeutiges Unterscheidungsmerkmal diente. Da dieses Vorgehen jedoch recht
zeit- und geldaufwendig war, wurde die Artunterscheidung später mit der RAPD-PCR
Methode durchgeführt. Hierbei wurden die besten Ergebnisse mit dem Primer A 17 der
Firma Roth erzielt.
Durch eine Kombination der Restriktionsendonuklease Hinf I mit der Digoxigenin
markierten Multilocus Sonde (GACA)4 gelang es hypervariable und absolut
individualspezifische DNA Fingerprintmuster zu erzielen.
Zusammenfassung 88
Im Fragmentlängenbereich zwischen 23500 bp und 1000 bp ließen sich bei den 65
Microtus arvalis mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad im Schnitt 14,25 polymorphe
Banden pro Individuum nachweisen. Die Anzahl der beurteilten Positionen lag innerhalb
der einzelnen Populationen zwischen 62 und 134. Die Wahrscheinlichkeiten (Pg), dass
alle Banden einer Feldmaus im Fingerprint einer anderen nichtverwandten Feldmaus
vorkamen, betrugen je nach Untersuchungsfläche zwischen 4,26 ⋅ 10-5 und 8,19 ⋅ 10-13.
Die Wahrscheinlichkeiten (Pi), dass zwei Individuen absolut identisch Fingerprintmuster
aufweisen, lag je nach Standort zwischen 6, 54 ⋅ 10-17 und 2,24 ⋅ 10-23. Die hier ermittelten
Wahrscheinlichkeiten Pg und Pi sind verglichen mit den von anderen Arbeiten sehr gering
und sprechen für das hohe Individualisierungspotential dieser Methode, angewandt auf
Microtus arvalis.
Ein Vergleich zwischen den verschiedenen Standorten Zill, Hohberg, Herl-Brache,
Knospenhof und Eiden hat gezeigt, dass die BSR innerhalb dieser Standorte höher waren
als zwischen den einzelnen Standorten, wodurch die einzelnen Populationen voneinander
differenziert werden konnten. Bestätigt wurde diese Differenzierung auch durch die
Clusteranalyse. Das Maß dieser genetischen Differenzierung konnte mit den D`ij Werten
beschrieben werden. Zusätzliche Berechnungen ergaben, dass nur 53,2% der gesamten
Varianz auf die geographische Distanz zurückzuführen sind. Bei Betrachtung der
geographischen und der genetischen Distanzen zwischen den Wahlener Standorten und
den Untersuchungsflächen bei Herl wird deutlich, dass der Großteil der 53,2% auf die
geographischen Distanzen der Wahlener und der Herler Untersuchungsflächen
zurückzuführen sind. Die Gründe bzw. Ursachen der Populationsdifferenzierung der
anderen Standorte wurden diskutiert.
Außer den 65 Feldmäusen mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad konnten noch 34 mit
bekanntem Verwandtschaftsgrad gefangen werden: am Standort Hohberg eine Maus mit
5 Embryonen, am Standort Knospenhof 3 Mäuse mit 3, 4 bzw. 6 Embryonen und am
Standort Herl-Brache 2 Mäuse mit 4 bzw. 6 Embryonen.
Der auswertbare Fragmentlängenbereich von diesen Feldmäusen mit bekanntem
Verwandtschaftsgrad erstreckte sich von 24200 bp bis zu 1000 bp. Erwartungsgemäß
waren hier die durchschnittliche Anzahl polymorpher Banden pro Individuum (11,75), die
Anzahl der beurteilten Positionen (je nach Untersuchungsfläche zwischen 24 und 44) und
die Wahrscheinlichkeiten Pg (zwischen 3,60 ⋅ 10-2 und 7,18 ⋅ 10-3) und Pi (zwischen 1,16 ⋅
10-4 und 3,39 ⋅ 10-12) wesentlich geringer als bei den Feldmäusen mit unbekanntem
Verwandtschaftsgrad.
Zusammenfassung 89
Im Zusammenhang mit der Untersuchung der Fingerprints verwandter Microtus arvalis
konnten für alle Mütter die Banden benannt werden, für die sie heterozygot sein müssen,
da sie in den Bandenmuster der Nachkommen fehlten. Ferner konnte dargelegt werden,
warum zwischen den Nachkommen e5/e6 und den Nachkommen e1, e2, e3 und e4 eine
Halbgeschweisterschaft, und somit eine multiplen Vaterschaft, wahrscheinlicher ist als
eine Vollgeschwisterschaft.
Ein Vergleich zwischen den beiden Methoden Multilocus-DNA-Fingerprinting und RAPD-
PCR zeigte die sehr gute Eignung des Multilocus-DNA-Fingerprinting bei Fragestellungen
die Species- bzw. Populationsdiversiät betreffend sowie bei genetischen
Verwandtschaftsanalysen. Die RAPD-PCR hingegen konnte lediglich bei der genetischen
Charakterisierung verschiedener Arten überzeugen; bei der Populationsdifferenzierung
stieß die Methode jedoch in diesem Fall auf ihre Grenzen.
Danksagung 90
7. Danksagung
Im folgenden möchte ich mich bei all jenen Personen, die am Gelingen und
Zustandekommen dieser Arbeit mitgewirkt haben recht herzlich bedanken. Ohne diese
Personen hätte mir die Beantwortung der dieser Arbeit zugrundelegenden Fragestellung
wahrscheinlich nur halb soviel Freude bereitet.
An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Paul Müller für die
Überlassung des Themas, die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes und die nicht
unerheblichen finanziellen Mittel, mit der er meine Arbeit unterstützte, bedanken.
Für seine Freundschaft, fachkundigen Ratschläge, Diskussionsbereitschaft und die
kritische Durchsicht der Arbeit danke ich Herr Dr. Ralf Kautenburger.
Bei den Herren Dr. Gerhard Wagner, PD. Dr. Martin Paulus und PD. Dr. Roland Klein
möchte ich mich für die Anstellung bei der UPB bedanken, und dafür, dass sie mir genug
Freiraum gelassen haben, meine Promotion zu beenden. Das Arbeiten in einem so
kollegialen Team zusammen mit allen Hiwis der UPB, bei denen ich mich auch an dieser
Stelle bedanke, hat mir sehr viel Spaß gemacht.
Ganz besonderen Dank möchte ich Frau Tanja Rölker aussprechen, die unermüdlich für
alle am Projekt beteiligten Personen DNA isolierte.
Bedanken will ich mich auch bei den Herren Dr. Ortwin Elle sowie Markus Quack, für die
Bereitstellung der Flächennutzungskartierungen der Untersuchungsgebiete bzw.
statistischer Auswertprogramme, die mir die Arbeit sehr erleichterten.
Last but not least möchte ich meiner Freundin Heike Theisen, den Herren Franz Gassert,
Dr. Joachim Krüger und Bernd Fontaine, sowie den technischen Angestellten des
ehemaligen FPP´s Irmtraud Reinert, Gabi Marmann, Renate Engel und Nicole Finkler für
ihre aufmunternden Worte, Hilfsbereitschaft, guten Ratschläge und ein super Arbeitsklima
im Labor Dank sagen.
Literatur 91
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