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Hemmung der Aldehyddehydrogenase durch Extrakt des Pilzes Lepiota aspera in vitro
Klinikum rechts der Isar - Abteilung für klinische Toxikologie und Giftnotruf München
Katrin Romanek
Toxikologie
Case report. Oktober 2013:
Pat: Herr und Frau H. (74J und 72J)Anamnese: zusammen selbst gesammeltes Pilzgericht gegessen (vermeintlich Riesenchampignon; weiße Lamellen, braune Kappe) weniger als 20 min gebraten, gut vertragen. 4 Stunden später genossen beide 0,5 Liter Bier.Symp: Kurz darauf Flush, Atemnot, Kopfschmerzen, Tachykardie, hypertensive Entgleisung (bei vorbekannter art. Hypertonie)Therapie: durch NA Diagnose eines ACS und Transport auf kardiologische Intensivstation. Dort äußerte die Patientin einen Zusammenhang mit Pilzgericht, daraufhin Verlegung Toxikologie mit V.a. Coprinus-Syndrom.Verlauf: unter symptomatischer Therapie rasch regrediente Symptome. Entlassung am Folgetag in beschwerdefreiem Zustand.Pilzreste wurden von Fr. Haberl als Lepiota aspera identifiziert.
Im Verlauf dann weitere 5 Fälle Zürich / München / Erfurt
Toxikologie
Coprinus Syndrom:
Beim Coprinus-Syndrom handelt es sich um eine besondere Form der Pilzvergiftung. Coprin hemmt den Alkoholabbau auf der Stufe des Acetaldehydes durch Inhibierung der Acetaldehyddehydrogenase (ALDH2). Reversible, lästige, Effekte des kombinierten Verzehrs von Pilzen zusammen mit Alkohol sind spätestens seit 1906 für den Faltentintling beschrieben.
Auslösende Pilze:Faltentintling (Coprinus atramentarius) Glimmertintling (Coprinus micaceus)V.a.Netzstieliger Hexenröhrling (Boletus luridus)V.a.Keulenfüßiger Trichterling (Clitocybe clavipes) V.a. Ochsen-Röhrling (Boletus torosus)
Symptome treten nur in Kombination mit Alkohol auf:starkes Herzrasen Blutdruckanstieg Schweißausbrüche Kreislaufstörungen Zittern KopfschmerzenPruritusÜbelkeit und ErbrechenGesichtsrötung, livide Färbung der Haut
Toxikologie
Acetaldehydsyndrom:
- Coprin Syndrom 1914 bei Arbeitern in Kalkstickstoff- Produktion beschrieben- 1937 bei Arbeitern in der Gummiindustrie: Disulfiram wurde als Antioxydans beim Vulkaniseren eingesetzt
- Disulfiram (Antabus ®). Inhibition von ALDH2; (gewünschter Effekt zur Alkoholentwöhnung)
- ebenso Cyanamid (Düngemittel, chemische Industrie)- Metronidazol- Cephalosporine- Sulfonylharnstoffe- Chloralhydrat- Daidizin aus Ginseng
- 46% der Japaner und 56% der Chinesen sind von einem Polymorphismus der ALDH2 betroffen. Sie sind Träger eines dominanten Allels des ALDH2-Gens, bei dem an Position 487 der Aminosäuresequenz das Glutamat gegen Lysin ausgetauscht ist. Das mutierte ALDH2 kann Acetaldehyd weniger effektiv verarbeiten als das Wildtyp-Protein und wird selbst schneller abgebaut. Dadurch kommt es leichter zu einer Anhäufung des Acetaldehyds im Körper und damit zu den mit Alkoholkonsum verbundenen Vergiftungserscheinungen (Flush-Syndrom). Die betroffenen Personen sind somit empfindlicher gegenüber den negativen Auswirkungen des Alkoholkonsums.
Disulfiram
Toxikologie
Aldehydehydrogenase (ALDH):
Aldehyddehydrogenasen sind Enzyme, die Aldehyde oxidieren
Sie spielen eine wichtig Rolle in vielen Metabolischen und Regulatorischen Prozessen
Beim Menschen existieren 3 Untergruppen und 19 Isoenzyme
Aldehyddehydrogenasen kommen hauptsächlich in der Leber vor. Dort findet man sie entweder im Zytosol (ALDH-1) oder in den Mitochondrien (ALDH-2). Innerhalb des Stoffwechsels wird Ethanol von Alkoholdehydrogenasen (ADH) in das toxische Acetaldehyd umgewandelt. Aldehyddehydrogenase wandelt das toxische Acetaldehyd zum nicht-toxischen Acetat (Essigsäure) um.
Metabolisch: - ALDH2: Leber: (Mitochondrien) Alkohol- Abbau Gehirn: Dopamin- Synthese
- ALDH1-3: viele Gewebe u.a. Cornea / LinseAbbau toxischer Aldehyd bei Lipid Peroxydation
Regulatorisch: - ALDH: Retinol- Synthese (essentieller Regulatorwährend Embroygenese)
ALDH2: Octamer-Komplex mit NAD-Molekülen
Tumortherapie: Tumorzellen und vor allem Tumor-Stammzellen zeigen eine Resistenz gegenüber Chemotherapie bei erhöhter ALDH-Aktivität. => Resensibilisierung durch Disulfiram; macht Tumor-Stammzellen sensibel für Chemotherapeutika.
Toxikologie
Hemmung durch Keulenfuß-Tricherling (Clitocybe clavipes):
Kawagishi H(1), Miyazawa T, Kume H, Arimoto Y, Inakuma T.Aldehyde dehydrogenase inhibitors from the mushroom Clitocybe clavipes.J Nat Prod. 2002 Nov;65(11):1712-4.
Toxikologie
Hemmung durch Durianfrucht (Durio zibethinus):
Toxikologie
Hemmung der ALDH durch Lepiota aspera / Echinoderma asperum(Spitzschuppiger Stachelschirmling) ?
Familie: ChampignonverwandteGattung: SchirmlingeVorkommen: häufig in Laub- und Nadelwäldern, an Wegrändern und in Gärten vor. Die Fruchtkörper erscheinen von Sommer bis Herbst.
Speisewert: keiner, Stachelschirmlinge sind giftig bis ungeniessbarVerwechslung: Champignons, Parasolpilze, Perlpilz
Toxikologie
Fragestellung: Hemmt Lepiota aspera ALDH in vitro ?
Acetaldehyd- Dehydrogenase aus Hefe
Bildung von NADH bei 340 nm im Photometer verfolgt
NADH = Nicotinamidadenindinukleotid
Toxikologie
Leerwert: NADH-Bildung bei 340 nm :
Diag Leerwert (Acetaldehyd 450 µmol/l; NAD 450 µmol/l; ALDH: 1887 U/l)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 10 20 30 40 50 60
MW blank
NADH µmol/L
Minuten
Toxikologie
Chloroform Extrakt enthält wenig-, Wasser Extrakt viel Hemmsubstanz
Diag Lasp A7
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 10 20 30 40 50 60
MW L asp A 7 WasserMW L asp A7 ChlrMW blank
NADH µmol/L
Minuten
Toxikologie
Konzentrationsabhängigkeit der Hemmung ?
E aspera extract Dilution: AcAld=450 mmol/l NADH=450 mmol/l yALDH=1887 U/l
0
50
100
150
200
0 10 20 30 40 50 60minutes
NA
DH
µm
ol/l
0 µl - E aspera extract
2 µl - E aspera extract
3 µl - E aspera extract
4 µl - E aspera extract
6 µl - E aspera extract 8 µl - E aspera extract 10 µl - E aspera extract
Toxikologie
Koppaka V, et alPharmacol Rev. 2012 Jul;64(3):520-39.
NA
DP
+
Zusatz von 2-Sulfanylethanol (Mercaptoethanol) Verhindert die Hemmung der ALDH durch L. aspera- Extrakt
Extrakt A + MeSH
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 10 20 30 40 50 60
1-Leer-MW2-A-MS-10-MWx2-A-MS-50-MW1-Leer-MS-MW
mit Mercaptoethanol
Extrakt A
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 10 20 30 40 50 60
1-Leer-MW2-A-10-MW2-A-50-MW
ohne Mercaptoethanol
Mercaptoethanol hebt die Hemmung des Pilz-Extraktes auf, konkurriert möglicherweise um aktives Cystein des ALDH-Enzyms.
Toxikologie
13-Feb-15 NAD=666µM AcAld=456µM - L asp7 - Aufhebung d Hemmung durch Et-SH
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 10 20 30 40 50 60
Minuten
NA
DH
µm
ol/l
ohne Pilz
mit Pilz Mecaptoethanolzusatznach 32 Minuten
mit Pilz ohneMecaptoethanolzusatz
Toxikologie
Cephadex-Säule: trennt nach Molekülgröße
L asp. Trennung je 2 x 2 ml Fraktion zusammengefasst
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 20 40 60 80 100 120 140
ml Fraktion
OD
10 min M30 min M44,5 min M59,5 min M
Toxikologie
1. Ultra Performance Liquid Chromatography 2. Elektrospray- Ionisation Massenspektroskopie
Die Molmassen 201/203 konnte gefunden werden, zeigten aber eine zu Coprin verschiedene Summenformel. Damit ist Coprin definitiv auszuschließen.
C9 H19 O3 N2undC10 H17 O4
Toxikologie
Und die anderen Pilze?
A bisporus
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 10 20 30 40 50 60
A bisporus 10 MW
ohne Pilz MW
P ostreatus
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 10 20 30 40 50 60
ohne Pilz MWP ostreatus 10 µl MW
B edulis
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 10 20 30 40 50 60
ohne Pilz MWB edulis 10µl MWB edulis 50 µl MW
B edulis
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 10 20 30 40 50 60
ohne Pilz MWB edulis 10µl MW
Zuchtchampignon, Agaricus bisporus
Austernseitling, Pleurotus ostreatus
Steinpilz, Boletus edulis
sehr geringe Hemmung
sehr geringe Hemmung
??
Toxikologie
in vitro gewisse Hemmung bei hohen Konzentrationen – klinische Bedeutung unbekanntTeilweise erniedrigte Alkoholtoleranz beschrieben
BräunlicherStäubling (Lycoperdon umbrinum)
Toxikologie
Diag B lur wässr extrakt
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 10 20 30 40 50 60
MW B lur 52 WasserMW blank
Diag Lycoperd umbr
0
20
40
60
80
100
120
140
0 10 20 30 40 50 60
MW Lyc um 42 WasserMW Lyc um 42 ChlorfMW blank
Netzstieliger Hexen-Röhrling (Boletus luridus)
Hemmt in vitro
klinische Bedeutung:Einzelfälle in der mykologischen Literatur beschriebeneigene Erfahrung: keine Alkoholintoleranz (Menge ?)
Hemmt in vitro
Chloroform- undWasserextrakt(bisher nicht bekannt, Einzelfall in Schweiz)
Toxikologie
Diag B rhodop wässr extrakt
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 10 20 30 40 50 60
MW B rhodp Wasser
MW blank
B Rub 82 wasser
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
0,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000
MW BolRub82 WasserMW BLANK
Blaufleckender Purpur-Röhrling (Boletus rhodopurpureus)
Weinroter Purpur-Röhrling (Boletus rubrosanguineus)
hemmt
geringe Hemmung starke Eigenfärbung
Toxikologie
Keulenfußtrichterling, Clitocybe clavipes
Clitocybe clavipes Nr 50
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 20 30 40 50 60
Zeit
OD
MW CliCla50 WasserMW CliCla50 ChlorMW BLANKMW BLANK
frische Extrakte Wasser u Chloroform
Keine Hemmung ?
Clitocybe clavipes Nr 51
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 20 30 40 50 60
Zeit
OD
MW CliCla51 WasserMW CliCla51 ChlorMW BLANK
frischer Extrakt (Wasser)
frischer Extrakt (Chloroform)
hemmt doch!
Toxikologie
Fazit:
diverse Pilze enthalten Substanzen, die die ALDH in vitro hemmen
- Faltentintling: (C. atramentarius) – Coprin ; länger bekannt
- C. clavipes: in mykologischer Literatur beschriebenHemmstoff isoliertin vitro an Einzelexemplaren nachvollziehbar/nicht nachvollziehbar
- L. aspera: - bisher nur klinische Fälle - Von uns erstmals Nachweis einer in vitro Hemmung- Die Hemmung ist konzentrationsabhängig- Die Hemmung ist mit Sulfid (Mercaptoethanol) aufhebbar- Es konnten die Summenformeln C9H19O3N2 und C10H17O4als mögliche Hemmsubstanzen isoliert werden
Offene Fragen: Standort ? Subspezies ? Alter ? Lagerung ? Bioresorption?
Toxikologie
Danke!
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