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Immunhistochemischer Nachweis
des Retinoblastomgenproduktes
und seine Bedeutung als
Prognosefaktor bei Patientinnen
mit primärem Mammakarzinom
Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Medizin
genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Nele Fischer geb. Mundt
aus Hamburg
Berichter: Herr Professor Dr.med. Stefan Biesterfeld
Herr Universitätsprofessor Dr.med. Christian Mittermayer Tag der mündlichen Prüfung: 30. November 2006
Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.
2
Inhaltsverzeichnis
1.Einleitung ______________________________________________________________ 4
1.1 Epidemiologie des Mammakarzinoms __________________________________________4
1.2 Ätiologie des Mammakarzinoms _______________________________________________4
1.3 Prognostische Faktoren ______________________________________________________7
1.4 Potentielle neue Prognosefaktoren _____________________________________________9
1.5 Problemstellung ___________________________________________________________11
2. Methoden _____________________________________________________________ 13
2.1 Material / Patientenkollektiv _________________________________________________13
2.2 Methoden_________________________________________________________________13 2.2.1 Stadieneinteilung ______________________________________________________________ 13 2.2.2 Malignitätsgradierung___________________________________________________________ 16 2.2.3 Biochemischer Östrogen- und Progesteronrezeptorstatus _______________________________ 16 2.2.4 Immunhistochemische Darstellung des Rb-Proteins ___________________________________ 17
3. Ergebnisse ____________________________________________________________ 23
3.1 Allgemeine Daten __________________________________________________________23
3.2 Univariate Überlebensanalyse________________________________________________24 3.2.1 Gesamtüberleben ______________________________________________________________ 25 3.2.2 Beziehung zwischen Gesamtüberleben und Staging ___________________________________ 26 3.2.3 Beziehung zwischen Überleben und Grading_________________________________________ 30 3.2.4 Beziehung zwischen Überleben und dem Hormonrezeptorstatus__________________________ 35 3.2.5 Beziehung zwischen dem Überleben und der immunhistochemischen Analyse des
Retinoblastomgen-Proteins (Rb) _______________________________________________________ 37
3.3 Multivariate Analyse: Cox-Modell ____________________________________________41
3.4 Korrelationen Rb-bezogener Parameter untereinander und mit klinisch-
morphologischen Parametern ___________________________________________________48 3.4.1 Korrelation zwischen RbPP und RbSI ______________________________________________ 48
3
3.4.2 Korrelation zwischen Rb-Parametern und klinisch-morphologischen Parametern_____________ 49
4. Diskussion ____________________________________________________________ 51
4.1 Anerkannte Prognosefaktoren _______________________________________________52
4.2 Das Retinoblastomgen- Protein (pRb) in der Prognostik des Mammakarzinoms ______56
4.3 Multivariate Überlebensanalyse ______________________________________________66
5. Zusammenfassung______________________________________________________ 68
6. Technischer Anhang ____________________________________________________ 70
7. Datensammlung________________________________________________________ 72
8. Literatur______________________________________________________________ 82
9. Danksagungen_________________________________________________________ 99
10. Lebenslauf __________________________________________________________ 100
4
1.Einleitung
1.1 Epidemiologie des Mammakarzinoms
Maligne Erkrankungen nehmen in der Todesursachenstatistik der Bundesrepublik
Deutschland die zweite Position nach den Herz-Kreislauf-Erkrankungen ein. Bei
etwa jeder siebten Frau der westlichen Welt wird die Diagnose Brustkrebs gestellt.
Damit ist das Mammakarzinom die bei Frauen häufigste bösartige Tumorerkran-
kung.
Nach dem jüngsten Bericht der European Society for Medical Oncology (ESMO)
beträgt die jährliche Erkrankungsrate an Brustkrebs in den Ländern der Europäi-
schen Union 105 / 100.000. Die Mortalität wird mit 40 / 100.000 pro Jahr angegeben
[European Society for Medical Oncology (ESMO), 2001]. Auf Deutschland übertra-
gen ergibt sich daraus eine Absolutzahl neu diagnostizierter Mammakarzinome von
etwa 80.000 und Todesfälle von etwa 32.000 jährlich.
Aussagen über Verlauf und Heilungsaussichten der Krankheit machen zu können,
ist für die Betroffenen von großer Bedeutung und kann dazu beitragen, die schwe-
ren therapeutischen Eingriffe zu ertragen und begründete Hoffnung auf Heilung zu
erhalten.
1.2 Ätiologie des Mammakarzinoms
Wie bei den meisten Karzinomen ist es auch beim Mammakarzinom nicht möglich,
das auslösende Agens im Einzelfall zu benennen. Allerdings sind Risikofaktoren
bekannt, die eine Karzinomentwicklung begünstigen.
Die positive Familienanamnese ist ein bekannter Risikofaktor für die Manifestation
der Erkrankung [Anderson et. al.1977; Petrakis et al. 1977]. Für Töchter von präme-
1. Einleitung
5
nopausal erkrankten Müttern, die ein unilaterales Karzinom entwickelt hatten, erhöht
sich das Risiko um das 3-fache, bei bilateraler Erkrankung sogar um das 9-fache.
Fällt die Ersterkrankung einer Frau in die Postmenopause, dann erhöht sich das
Risiko für die folgende Generation nur um das 1,5-fache.
Hormonelle Faktoren spielen in der Pathogenese des Brustkrebses eine wichtige
Rolle. Das Risiko der Karzinomentstehung korreliert mit der kumulativen Exposition
gegenüber Östrogen und möglicherweise auch Progesteron. Frauen mit früher Me-
narche (12. Lebensjahr und früher) und einem rasch regelmäßigen Menstruations-
zyklus tragen ein signifikant höheres Risiko [Henderson et. al. 1974]. Auch ein ho-
hes Menopausenalter (> 55 Jahre) beeinflusst das Brustkrebsrisiko: 40 Jahre Zy-
klusaktivität und mehr zeigen ein doppelt so hohes Risiko wie 30 Jahre und weniger
[Trichopoulos et al. 1972]. Frühe Schwangerschaften (< 20 Jahre) und eine größere
Zahl von Kindern wirken sich risikomindernd aus [MacMahon et al. 1973].
Die Hypothese, dass die Einnahme oraler Kontrazeptiva das Brustkrebsrisiko er-
höht, wird kontrovers diskutiert. Es gibt Studien, die ihnen keinen negativen Effekt
zuschreiben [Arthes et al. 1971; Vessey et al. 1971; Marchbanks et al. 2002], aber
auch solche, die bei frühzeitiger und langer Einnahme ein erhöhtes Karzinomrisiko
feststellen [Olsen et al. 1991].
Epidemiologische Untersuchungen deuten darauf hin, dass Ernährungsgewohnhei-
ten das Mammakarzinomrisiko beeinflussen. Übergewicht geht insbesondere in der
Postmenopause mit einer erhöhten Erkrankungshäufigkeit einher [La Guardiana et
al. 2001]. Die Hauptbedeutung der Ernährung liegt im Kaloriengehalt. Ein gesteiger-
ter Fettkonsum, der zu einem erhöhten Östrogenmetabolismus führt, wird als Ursa-
che der höheren Mammakarzinomraten diskutiert [Van’ter Veer et al. 1991].
Die Theorie, dass Viren eine kokarzinogene Wirkung besitzen, wird durch einige
Arbeiten unterstützt [Hollmann et al. 1972; Sumidaie et al. 1988]. So wurden virus-
ähnliche Partikel in Frauenmilch und humanen Mammakarzinomen nachgewiesen.
Zudem konnte ein gemeinsames Antigen des Mammatumorvirus der Maus (M-MTV)
und des verdächtigen Mammakarzinomvirus des Menschen (H-MTV) isoliert wer-
den. Es gelang die molekulare Hybridisierung zwischen den Nukleinsäuren des mu-
1. Einleitung
6
rinen Mammakarzinomvirus sowie denen von Mammakarzinomen der Frau. Das
Vorkommen dieser Bestandteile scheint in Familien mit erhöhtem Brustkrebsrisiko
gehäuft zu sein.
Neben hormonellen, umwelt- und ernährungsbedingten Einflüssen spielen auch ge-
netische Faktoren für die Entwicklung eines Mammakarzinoms eine Rolle. Lediglich
bei 5%-10 % der Frauen mit Mammakarzinomen liegt eine genetische Disposition
vor. In sogenannten Tumorfamilien hingegen erkranken mehrere Verwandte ersten
Grades über Generationen hinweg an Brustkrebs. In den letzten Jahren (1994/95)
wurden Gene identifiziert, die für das familiär bedingte Mammakarzinom verantwort-
lich sind; BRCA1 und BRCA2 („ Breast cancer gene1 bzw. 2“) sind Tumorsuppres-
sorgene, die die Zelle vor maligner Entartung schützen. Voraussetzung für die Ent-
stehung eines Karzinoms ist der komplette Verlust des Suppressorgens, das in
Form von zwei Allelen vorliegt. Wird die mutierte Form eines Allels des Tumorsup-
pressorgens mit der Keimbahn vererbt, führt eine spontane Mutation im zweiten Al-
lel auf zellulärer Ebene zur Aufhebung der Tumorsuppression und damit zur Trans-
formation der Zelle. Für Trägerinnen von Mutationen im BRCA1–Gen besteht ein
ca. 45%iges Risiko, an Brustkrebs zu erkranken, bis zum Alter von 50 Jahren und
ein 60-85%iges Risiko bis zum Alter von 75 Jahren. Keimbahnmutationen im
BRCA2-Gen gehen vermutlich ähnlich häufig mit einem Mammakarzinom einher
[Zimmermann 2002]
Zusammenfassend kann man sagen, dass die Ätiologie multifaktoriell ist und we-
sentliche Bestandteile noch ungeklärt sind. Eine sichere Abschätzung des Risikopa-
tientenkollektivs ist zur Zeit noch nicht möglich, so dass keine geeigneten Scree-
ning-Verfahren zur Verfügung stehen.
1. Einleitung
7
1.3 Prognostische Faktoren
Die Bestimmung von Prognosefaktoren beim Mammakarzinom hat das Ziel, den
Krankheitsverlauf für die individuelle Patientin abzuschätzen. Durch jeden unabhän-
gigen Parameter wird die Prognose in ihrer Sicherheit verstärkt. Die Aussagekraft
jedes einzelnen Parameters hingegen ist limitiert und sollte in ihrem Wert nicht über-
interpretiert werden.
Die individuellen Prognosen für das Überleben der Patientinnen ergeben sich an-
hand gesicherter Krankheitserkenntnisse. Die Prognose entspricht jedoch keiner
Verlaufsgarantie, sondern einer Vorhersage in die Zukunft auf der Basis von in der
Vergangenheit an klinischen Verläufen gesammelten Erkenntnissen, so daß man
die Grenzen der Vorhersagekraft nicht aus den Augen verlieren sollte.
Die prädiktiven Faktoren ermöglichen möglicherweise auch ein Abschätzen eines
möglichen Therapieerfolges adjuvanter Verfahren. Idealerweise sollten dement-
sprechend z.B. Patientengruppen erfasst werden, die gegen Teiltherapien resistent
sind. Darüber hinaus könnten innerhalb bestimmter Patientengruppen Subgruppen
identifiziert werden, die von einer speziellen modifizierten Therapie profitieren dürf-
ten.
Prognosefaktoren mit gesicherter klinischer Relevanz sind der TNM-Status (Tumor-
größe, axillärer Lymphknotenbefall, Fernmetastasierung, peritumorale Lymphangio-
sis carcinoma, Gefäßinvasion), die Morphologie (Grading, histologischer Typ) und
die Steroidhormonrezeptoren (Östrogenrezeptor, Progesteronrezeptor).
Übereinstimmend werden von diesen Markern in den Consensus-Statements des
NIH (2000), der American Association of Clinical Oncology (ASCO 1996) und der
EORTC-Receptor-and-Biomarker-Group (1995) nur folgende zur routinemäßigen
Bestimmung empfohlen: Tumorgröße, Nodalstatus, histologischer Typ, Grading und
1. Einleitung
8
Steroidhormonrezeptorstatus.
Zusätzlich werden das Alter und der Menopausenstatus im klinischen Alltag als
Prognosefaktoren angewendet.
Bis heute ist der axilläre Lymphknotenstatus der stärkste Prognosefaktor für Rezidiv
und Überleben. Für nodal-negative Karzinome ist die Tumorgröße ein wichtiger er-
gänzender prognostischer Indikator, während bei den nodal-positiven Patientinnen
in der multivariaten Analyse die Tumorgröße vom Lymphknotenbefall „überdeckt“
wird. Zusätzlich korreliert die Anzahl der befallenen Lymphknoten direkt mit dem
Risiko eines Rezidives und des Todes.
Auch morphologische Kriterien sind von hoher prognostischer Bedeutung. Es be-
steht eine eindeutige Abhängigkeit zwischen histologischem Grading und dem rezi-
divfreien Überleben. So haben nodal negative Patientinnen mit G3-Tumoren eine
ebenso schlechte Prognose wie nodal positive Patientinnen (1-3 positive Lymphkno-
ten) und einem G1- oder G2-Grading [GABG III-Studie].
Bestimmte, allerdings insgesamt seltene histologische Subtypen wie tubuläre, papil-
läre und muzinöse Karzinome haben eine signifikant bessere Prognose als klassi-
sche duktale oder lobuläre Karzinome.
Der Östrogen- und Progesteronrezeptorstatus zeigt eine eigenständige Relevanz für
das Gesamtüberleben. Die Patientinnen mit positivem Rezeptorstatus leben signifi-
kant länger. Als prädiktive Faktoren lassen sie bei Positivität eine gute Wirksamkeit
einer hormonellen Therapie erwarten [McCarty et al. 1990, Anderson et al. 1991,
Railo et al. 1993, Sauer 1993, Esteban et al. 1994].
Überdies haben prämenopausale Patientinnen eine ungünstigere Prognose als
postmenopausale Frauen. Nach der St.Gallen-Konsensus-Konferenz 1998 wird au-
ßerdem das Alter einer Patientin < 35 Jahre als Hochrisikofaktor angesehen [Shan-
non, Smith, 2003].
1. Einleitung
9
1.4 Potentielle neue Prognosefaktoren
Die Anforderungen an einen neuen Prognosefaktor, der sinnvoll Eingang in die Rou-
tinediagnostik finden sollte, sind hoch, da die Berücksichtigung nicht relevanter Fak-
toren nur zu einer Verunsicherung der betroffenen Patientin und ihrer behandelnden
Ärzte führte. Voraussetzung für die Anerkennung eines neuen Prognoseparameters
ist, dass seine Relevanz statistisch einwandfrei ist und in unabhängigen Studien
Reproduzierbarkeit belegt werden kann.
Vom College of American Pathologists wurde 1994 eine Subklassifizierung der rele-
vanten Prognosefaktoren durchgeführt [Hermanek et al]:
Gruppe I: TNM-Klassifikation, Histologischer Typ, Grading, Steroidrezeptoren
Gruppe IIa: Proliferationsmarker (Ki67, MIB-1), Mitose-Index, PRF
Gruppe IIb: p53, c-erbB-2, vaskuläre Invasion, Angiogenese
Gruppe III: weitere Faktoren
Aus der Vielzahl der potentiellen Prognosefaktoren -weit über 100 Parameter wer-
den in der Literatur diskutiert- sollen hier nun einige exemplarisch vorgestellt wer-
den:
o Tumorassozierte Proteolysefaktoren wie der Plasminogenaktivator vom Uro-
kinasetyp (uPA) und sein Inhibitor PAI-1 (Plasminogenaktivator-Inhibitor Typ
1) sind die einzigen neuen Faktoren, für die alle Kriterien zur Evaluierung
prognostischer Faktoren erfüllt sind [McGuire 1991].
uPA und PAI-1 tragen zur Invasions- und Metastasierungsfähigkeit von Tu-
morzellen bei. Es konnte gezeigt werden, dass hohe Konzentrationen von
uPA und PAI-1 im Primärtumor mit einem erhöhten Metastasierungsrisiko
und einem kürzeren Gesamtüberleben einhergehen Nodal-nagative Patien-
tinnen mit niedrigem uPA und PAI-1 im Tumor haben eine sehr gute Progno-
1. Einleitung
10
se, so dass eine adjuvante Chemotherapie bei diesen Patientinnen nicht in-
diziert scheint [Harberg et al. 1999, Jänicke et al. 2001]. Die Bestimmung von
uPA und PAI-1 erfolgt auf biochemischem Weg an Tumorfrischmaterial; im-
munhistochemische Verfahren sind wegen offenbar derzeit noch nicht lösba-
rer methodischer Probleme, die sich in einer schlechten Reproduzierbarkeit
niederschlagen, verlassen worden.
o Eine Überexpression des Onkogens HER-2/neu (synonym: c-erbB-2) tritt bei
20-25% aller Patientinnen mit Mammakarzinom auf und ist mit einem ag-
gressiveren Verlauf der Tumorerkrankung korreliert. Retrospektive Analysen
deuten darauf hin, dass eine HER-2/neu-Überexpression mit einer Tamoxi-
fenresistenz einhergeht Eine frühzeitige Bestimmung des HER-2/neu-Status
ist vor allem wertvoll im Hinblick auf eine spätere Therapie mit dem humani-
sierten Antikörper Herceptin (Trastuzumab), der gegen das HER-2/neu-
Onkoprotein gerichtet ist. Er wird derzeit bei metastasierten Mammakarzino-
men eingesetzt. Das mediane Überleben, das Gesamtüberleben, die media-
ne Zeit zur Progression und die Dauer des Ansprechens waren durch die
Kombination von Chemotherapie mit Trastuzumeb im Vergleich zu einer
Chemotherapie allein signifikant verlängert [Slamon et al. 2001]. Auch in der
Monotherapie zeigte Trastuzumab bei vorbehandelten Patientinnen noch ob-
jektive Ansprechraten von 15% in der „Second-“ und „Third-Line“-Therapie
[Cobleigh et al. 1999].
o MIB-1 ist ein monoklonaler Antikörper gegen das Ki-67 Antigen. Das nukleä-
re Antigen Ki-67 wird in allen aktiven Phasen des Zellzyklus exprimiert, somit
werden auch proliferierende Zellen ohne histologisch ersichtliche Kerntei-
lungsfiguren erkannt. In nicht aktiven Zellen hingegen ist Ki-67 nicht nachzu-
weisen [Gerdes et al. 1984,1991]. Eine signifikante Korrelation zwischen dem
Überleben und der Ki-67-Proliferation konnte in verschiedenen Studien ge-
zeigt werden [Pietilainen et al.1996, Querzolin et al. 1996, Sundblad et al.
1996]. Das Überleben nimmt mit Zunahme der Proliferationsfraktion ab.
o Das Tumor-Suppressor-Gen p53 wirkt negativ regulierend auf die Zellprolife-
1. Einleitung
11
ration und spielt insbesondere in der Zelldifferenzierung und dem Zellunter-
gang eine wichtige Rolle [Clarke et al, 1993]. Eine positive Korrelation zwi-
schen p53-Expression; aggressivem Tumorwachstum, negativem Östrogen-
und Progesteronrezeptorstatus und fortgeschrittenem Tumorstadium konnte
gezeigt werden [Bebenek et al. 1998, Radhakrishna Pillai et al. 1998].
o Der immunzytochemische Nachweis disseminierter epithelialer Tumorzellen
im Knochenmark hat als fakultativer Faktor bereits Einzug in die TNM-
Klassifikation gefunden. Nachgewiesen werden Zytokeratinkomponenten, da
sie zum Zytoskelett epithelialer Zellen und davon abstammender Tumorzel-
len gehören und in den Zellen der Hämatopoese nicht exprimiert werden. Pa-
tientinnen mit nachgewiesenen disseminierten Tumorzellen im Knochenmark
haben ein gering erhöhtes relatives Risiko für ein rezidivfreies Überleben
[Funke et al., 1998].
1.5 Problemstellung
Wie schon erläutert, gibt es nur wenige neuere Prognosefaktoren beim Mammakar-
zinom, deren klinischer Nutzen gezeigt werden konnte. Zielsetzung dieser Arbeit
war es, die Expression des Retinoblastomgen-Proteins (Rb) im Hinblick auf seine
prognostische Relevanz an einem gut definierten Patientenkollektiv von Mamma-
karzinomen mit Langzeitverlauf zu untersuchen.
Das Retinoblastom-Gen war das erste Tumorsuppressorgen, welches beim Men-
schen beschrieben wurde. Es liegt auf dem Chromosom 13q14 und kodiert für ein
nukleäres Phosphoprotein (105 kD), das an die DNA bindet und die Zellteilung
hemmt. Das Rb-Protein besitzt verschiedene, funktionell bedeutende Domänen
(Abb. 2.3.1). Die N-terminale Domäne vermittelt die Oligomerisierung von Rb-
Proteinen. Die sog. Rb-Tasche liegt weiter C-terminal. Die Bedeutung der Rb-
1. Einleitung
12
Bindungstasche wird u.a. dadurch deutlich, dass sämtliche in menschlichen Tumo-
ren gefundene Punktmutationen die Bindungstasche betreffen. Mutierte Rb-Proteine
finden sich sowohl in Mamma- als auch z.B. in Blasen-, Prostata- und kleinzelligen
Bronchialkarzinomen.
Das Rb-Gen liegt an einer entscheidenden Schaltstelle, die Proliferation, Differen-
zierung und Apoptose reguliert. Die Tatsache, dass die durch Rb inaktivierten E2F-
Transkriptionsfaktoren in vielen Zellsystemen für den Eintritt in die S-Phase des
Zellzyklus essentiell sind, spricht dafür, dass die Störungen von Rb-Signalwegen
eine wichtige Bedingung für ungeregelte Proliferation von Tumorzellen sind.
Abb. 1.5.1: Domänen und zelluläre Bindungsproteine des Rb-Gens. NLS, nukleäre Lokalisationssequenz; DEADG, Erkennungssequenz für Caspasen (nach Wang, 1997 bzw. Mulligan und Jacks, 1998)
Mit einem monoklonalen Antikörper gegen das Retinoblastomgen-Protein wurde
das Rb-Protein in den untersuchten Fällen immunhistochemisch nachgewiesen.
Die prognostische Validität dieser Untersuchung wurde anhand von Überlebensana-
lysen im Vergleich mit anderen prognostischen Faktoren bestimmt.
13
2. Methoden
2.1 Material / Patientenkollektiv
Für die immunhistochemische Färbung mit dem monoklonalen Antikörper des Reti-
noblastom-Gens dieser retrospektiven Studie wurde Tumormaterial von in der Zeit
von 1988 bis 1990 in das Institut für Pathologie der RWTH Aachen eingesandten
Mammakarzinomen von Patientinnen mit primärem unilateralem Mammakarzinom
ohne vorherige maligne Erkrankung verwendet. Alle Patientinnen wurden nach sei-
nerzeit etablierten stadienorientierten Standardtherapien behandelt. Danach wurde
die betroffene Brustdrüse entweder komplett oder partiell reseziert und eine
Lymphonodektomie durchgeführt, zum Teil gefolgt von adjuvanter Chemotherapie,
Radiotherapie oder anti-östrogener Hormontherapie mit Tamoxifen.
Das Kollektiv bestand ursprünglich aus 125 Fällen, von denen für die hier vorgestell-
te Arbeit nur noch 101 Fälle zur Verfügung standen. Der Grund hierfür war, dass
das in Formalin fixierte und in Paraffin eingebettete Material des Ursprungskollektivs
auch schon anderen Fragestellungen diente und für eine adäquate Beurteilung in
einigen Fällen kein ausreichendes Tumorgewebe mehr vorhanden war. Von den
untersuchten Tumoren waren 46 als duktal, 15 als lobulär und 22 als Mischformen
bzw. Sonderformen nach der WHO eingestuft.
2.2 Methoden
2.2.1 Stadieneinteilung
Verwendet wurde in dieser Arbeit die gebräuchliche Einteilung der Mammakarzino-
me nach der UICC (UICC, 1987):
2. Methoden
14
Postoperative Tumorgröße (pT)
pT0: kein Anhalt für Primärtumor
pTis: Carcinoma in situ
pT1: Tumorgröße < 2 cm
pT1a: Tumorgröße bis 0,5 cm
pT1b: Tumorgröße bis 1 cm
pT1c: Tumorgröße bis 2 cm
pT2: Tumorgröße von 2 bis 5 cm
pT3: Tumorgröße > 5 cm
pT4: Tumoren jeder Größe mit Haut- oder Thoraxinfiltration
pT4a: Infiltration der Brustwand
pT4b: mit Ödem, Ulzeration oder Satellitenmetastase der Haut
pT4c: Kriterien 4a und 4b gemeinsam
pT4d: inflammatorisches Mammakarzinom
pTx: Primärtumor kann nicht beurteilt werden
Postoperativer Lymphknotenstatus (pN)
pN0: keine Lymphknotenmetastasen
pN1: Metastasen in homolateralen axillären Lymphknoten
pT1a: nur Mikrometastasen bis 0,2 cm
pT1b: Metastase größer als 0,2 cm
pN2: Metastasen in homolateralen axillären Lymphknoten, die untereinander oder
an anderen Strukturen fixiert sind
pN3: Metastasen in supra- oder infraklavikulären Lymphknoten
Fernmetastasierung (M)
M0: kein Anhalt für Fernmetastasierung
M1: Nachweis von Fernmetastasierung
2. Methoden
15
Die drei Einzelgrößen lassen sich als postoperatives TNM-Stadium wie folgt zu-
sammenfassen:
Postoperatives TNM-Stadium (pTNM)
pTNM1: pT1 pN0 M0
pTNM2: pT2-3 pN0 M0 und pT1-2 pN1 M0
pTNM3: pT4 pN0 M0, pT3-4 pN1 M0 und pT1-4 pN2-3 M0
pTNM4: pT1-4 pN0-3 M1
Eine weitere wichtige Stadieneinteilung ist die UICC-Stadieneinteilung unter Ver-
wendung der TNM-Klassifikation:
UICC-Stadieneinteilung
Stadium 0: Tis N0 M0
Stadium I: T1 N0 M0
Stadium IIa: T0 N1 (Mikrometa.) M0
T1 N1 (Mikrometa.) M0
T2 N0 M0
Stadium IIb: T2 N1 M0
T3 N0 M0
Stadium IIIa: T0 N2 M0
T1 N2 M0
T2 N2 M0
T3 N1, N2 M0
Stadium IIIb: T4 jedes N M0
jedes T N3 M0
Stadium IV: jedes T jedes N M1
2. Methoden
16
2.2.2 Malignitätsgradierung
Es wurde die gebräuchliche histomorphologische Gradierung nach Bloom und Ri-
chardson (1957) verwendet. Die Beurteilung erfolgte durch einen Pathologen an
HE-gefärbten Routinepräparaten des jeweiligen Mammakarzinoms. Dabei wurden
definitionsgemäß das histomorphologische Erscheinungsbild (tubuläre Differenzie-
rung), das zytologische Erscheinungsbild (Kernpleomorphie) sowie die mitotische
Aktivität (Häufigkeit der Mitosen) subjektiv beurteilt.
Für jedes der drei Beurteilungsmerkmale werden mit abnehmender Differenzierung
ein bis drei Punkte vergeben, wodurch sich ein Minimalwert von drei und ein Maxi-
malwert von neun ergeben. Daraus ergibt sich als Gradierung:
G1: drei bis fünf Punkte
G2: sechs bis sieben Punkte
G3: acht bis neun Punkte
2.2.3 Biochemischer Östrogen- und Progesteronrezeptorstatus
Die Rezeptorbindungskapazität der Mammakarzinome wurde in der Frauenklinik für
Gynäkologie und Geburtshilfe der RWTH Aachen auf biochemischem Wege mit Hil-
fe eines Radioligandenassays bestimmt. Dazu wurde aus 0,3 g bis 0,5 g schweren,
unfixierten Anteilen der Tumoren das Zytosol gewonnen und mit ³H-markiertem 17-
ß-Östradiol bzw. Progesteron ORG 2058 inkubiert. Die spezifische Rezeptorbin-
dungskapazität ergab sich aus der Differenz zwischen der totalen und der unspezifi-
schen Bindungskapazität. Die maximale Bindungskapazität wurde anhand eines
Scatchard-Plots bestimmt und wurde entsprechend den international anerkannten
Vorgaben ab 10 fmol/mg zytosolischem Protein für den Östrogen- und ab 20
fmol/mg zytosolischem Protein für den Progesteronrezeptor als positiv gewertet.
2. Methoden
17
2.2.4 Immunhistochemische Darstellung des Rb-Proteins
Die im Mittelpunkt dieser Arbeit stehende Untersuchung des Proliferationsverhal-
tens der Mammakarzinome im Zusammenhang mit der Expression des Retinobla-
stomproteins wurde mit Hilfe einer immunhistochemischen Methode vorgenommen.
Hierfür wurde die Avidin-Biotin-Affinitätskonjugatmethode (sog. Drei-Stufen-
Sandwich-Technik) verwendet.
Abb. 2.2.3.1: Schematische Darstellung der immunhistochemischen Färbemethode der Avidin-Biotin-Affinitätskonjugatmethode (aus: Böcker et al., 1997)
Dabei kommt es zu vom Prinzip her zu einer Bindung des Primärantikörpers an das
zelluläre Antigen. An den Primärantikörper bindet im zweiten Schritt der mit Biotin
markierte Sekundärantikörper. Im nächsten Schritt wird das Markermolekül in Form
eines löslichen Peroxidase-Konjugates an den Biotinanteil des Sekundärantikörpers
gebunden, um die Färbung zu verstärken. Zur Sichtbarmachung der Peroxidasebin-
dung erfolgt eine Inkubation mit DAB, wodurch ein wasserunlösliches braunes Pro-
2. Methoden
18
dukt entsteht, dass die Antigen-Antikörper-Komplexe nach einer Gegenfärbung mit
Hämalaun direkt lichtmikroskopisch zu beurteilen erlaubt.
Zur Qualitätssicherung müssen bei jedem Färbegang Negativkontrollen mitgeführt
werden, bei welcher die Behandlung mit dem primären bzw. dem sekundären Anti-
körper unterlassen wird. Sinn dieser Art von Negativkontrolle ist die Detektion un-
spezifischer Bindungen.
2.2.4.1 Erstellen der Präparate
Die verwendeten Reagenzien werden auf Seite 70 im Anhang (Kapitel 6) im Detail
beschrieben.
Herstellung der Paraffinschnitte
Von den in Paraffin eingebetteten Tumorpräparaten wurden 3-4 µm dicke Paraffin-
schnitte aus dem Bereich des größten Tumordurchmessers angefertigt. Diese wur-
den auf silanisierte Objektträger aufgebracht und über Nacht in einem Brutschrank
bei 37 °C aufbewahrt. Vor dem eigentlichen Färbevorgang wurden die Präparate
erneut für eine Stunde bei 60 °C getrocknet. Probleme mit der Haftung der Präpara-
te ließen sich so minimieren.
Entparaffinierung in absteigender Alkoholreihe
Dieser Arbeitsschritt erfolgte durch zweimaliges Einstellen der Präparate in Xylol für
jeweils 5 Minuten, zweimaliges kurzes Einstellen der Präparate in 100% Alkohol,
zweimaliges kurzes Einstellen in 96% Alkohol sowie einmaliges kurzes Eintauchen
in jeweils 70% und 50% Alkohol. Schließlich wurden die Präparate mit destilliertem
Wasser gespült.
2. Methoden
19
Blockierung der endogenen Peroxidase
Über 30 Minuten wurden die Präparate in einem 1%-igen H2O2-Methanol-Gemisch
behandelt, um eine unspezifische Peroxidasereaktion zu verhindern. Schließlich
wurden die Schnitte dreimal in Leitungswasser gespült.
Mikrowellenvorbehandlung der Präparate („antigen retrieval“)
Zur Demaskierung des Antigen wurden die Präparate über dreimal 5 Minuten in ei-
nem Citatpuffer (10mM Tri-Natriumcitrat-Dihydrat, pH 6,0) in der Mikrowelle auf 600
Watt gekocht und nach 15-minütigem Abkühlen kurz in verdünnter TBS-Lösung ge-
spült, deren pH-Wert mit 2N HCl zwischen 7,4-7,6 eingestellt wurde.
Auftragen des primären Antikörpers
Die Schnitte wurden mit PBS-Pufferlösung auf Coverplates aufgespannt. Dann wur-
den die Präparate im Normalserum in einem Verhältnis von 1:10 in 2%-iger Milch-
pulver/ PBS-Lösung 15 Minuten eingestellt. Das Einstellen der Objektträger in die-
ses Reagenz verhindert die unspezifische Bindung des Retinoblastomprotein-
Antikörpers.
Bei dem verwendeten Primärantikörper handelt es sich um einen monoklonalen An-
tikörper (Klon G3-245, DPC Biermann) der Klasse IgG 1, der sich gegen das Epitop
in der Region zwischen den Aminosäuren 300-380 des Retinoblastomgen-Proteins
richtet. Pro Schnitt wurden 100 µl des im Verhältnis 1:10 verdünnten Antikörpers
aufgetragen und für eine Stunde im Brutschrank bei 37 °C inkubiert. Anschließend
wurden die Präparate für 5 Minuten mit 2%-iger Milchpulver/ PBS-Lösung gespült.
Aufragen des sekundären Antikörpers
Als sekundärer Antikörper diente ein biotinylierter Horse-Anti-Mouse-Antikörper. Pro
Schnitt wurden 100 µl des im Verhältnis 1:100 mit 2%-iger Milchpulver/ PBS-Lösung
für 30 Minuten inkubiert. Danach wurden die Präparate mit TBS gespült.
2. Methoden
20
Auftragen der Avidin-Biotin-Lösung
Zur Verstärkung der Reaktion erfolgte die Inkubation mit einer Avidin-Biotin-Lösung.
Beide Komponenten wurden laut Vorschrift jeweils 1:50 verdünnt. Dann wurden die
Schnitte für 30 Minuten im Avidin-Biotin-Peroxidase-Reagenz inkubiert, damit eine
Kopplung der Lösung mit dem biotinyliertem Sekundärantikörper erfolgt. Danach
wurden die Präparate wieder mit TBS gespült.
Entwickeln in DAB und Gegenfärbung
Zur Sichtbarmachung der Peroxidase und damit des Rezeptors erfolgte eine Inku-
bation mit DAB (50 µg DAB in 50 ml 0,05 molarem Tris/HCl-Puffer sowie 50 µl 10%-
iges H2O2) für 5 Minuten. Durch die Reaktion von H2O2 mit DAB entstand ein was-
serunlösliches braunes Produkt. Mit Leitungswasser und destilliertem Wasser wur-
den die DAB-Reste von den Präparaten abgespült. Die Schnitte wurden dann kurz
mit Hämalaun gegengefärbt und mit Leitungswasser gebläut. Es folgte die Behand-
lung in der aufsteigenden Alkoholreihe und anschließendes Einstellen der Präparate
in Xylol. Zum Schluss wurden die Schnitte mit Kanadabalsam eingedeckelt.
2.2.4.2 Beurteilung der Präparate mit dem semiquantitativen Remmele-Score
Die Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Mammakarzinomschnitte wurde
mit Hilfe eines Leitz Orthoplan-Mikroskops bei 400facher Vergrößerung (Objektiv:
40x/0,65, Okular: 10x GW Periplan 18, Gesichtsfeldfläche 0,159 mm²) durchgeführt.
Als Bewertungsgrundlage für die semiquantitative Auswertung des immunhistoche-
mischen Nachweises von dem Retinoblastomgen-Protein diente der auch in ande-
ren Publikationen angewandte Immunreaktive Score (IRS) [Gohring et al., 1996,
Beckmann et al., 1996]. Diese Bewertungsgrundlage für die Rb-Expression erfolgte
in Anlehnung an den für die Beurteilung immunhistochemisch dargestellter Östro-
gen- bzw. Progesteronrezeptoren auch in der Krankenversorgung üblichen IRS, den
sogenannten Remmele-Score (Remmele und Stegner 1987).
2. Methoden
21
Die eine Komponente des IRS ist der geschätzte Prozentsatz immunreaktiver Zellen
(Rb-PP):
Rb-PP-Einteilung:
0 = keine positiven Zellen
1 = < 10% positive Zellen
2 = 10-50% positive Zellen
3 = 51-80% positive Zellen
4 = > 80% positive Zellen
Darüber hinaus wurde die Färbeintensität bestimmt (SI = Staining Intensity):
Rb-SI-Einteilung:
0 = keine Färbereaktion
1 = schwache Färbereaktion
2 = mäßige Färbereaktion
3 = starke Färbereaktion
Der immunreaktive Score (Rb-IRS) errechnet sich aus dem Produkt von Rb-PP und
Rb-SI und kann somit die Werte 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9 oder 12 annehmen. Ein fester
Schwellenwert für Positivität des Rb-IRS ist in der Literatur nicht definiert; statt des-
sen wurden in der Überlebensanalyse (s.u.) verschiedene Schwellenwerte erprobt.
2.2.5 Statistische Auswertung der Ergebnisse
Die statistischen Untersuchungen wurden mit dem Programmpaket BMDP (Unter-
programme 1D, 1L, 2D, 2L, 4F) des Department of Biomathematics (BMDP) der
University of California, Statistical Software Inc., Los Angeles, USA (Dixon 1981)
vorgenommen.
2. Methoden
22
An biometrischen Grunddaten standen alle Parameter der deskriptiven Statistik, d.h. Modalwert, Median, Mittelwert, Minimal- und Maximalwert, Varianz, Standardabwei-chung und Variationskoeffizient sowie Angaben zu allen gewünschten Perzentilen zur Verfügung. (BMDP 1D, BMDP 2D).
Beziehungen zwischen kategorisierten Parametern wurden in Mehr-Felder-Tafeln
dargestellt mittels des Pearson Chi2-Test (BMDP 4F) bzw. des Spearman-Rang-
Korrelationstests (BMDP 3S) auf statistische Signifikanz getestet.
Univariate Überlebensanalysen erfolgten unter Berechnung von Kaplan-Meier-
Überlebenskurven (Kaplan und Meier 1958), die mit dem Wilcoxon-Breslow-Test auf
statistische Signifikanz überprüft wurden (BMDP 1L) (Breslow 1970). Angeschlos-
sen wurden multivariate Überlebensanalysen mit Cox-Modellen (Cox 1972) im "for-
ward stepping"-Modus (BMDP 2L), deren Ergebnisse wiederum mithilfe von Kaplan-
Meier-Kurven in einem selbst entwickelten Verfahren validiert wurden.
Statistische Signifikanz wurde jeweils für ein a-Niveau von = 0,05 (Cox-Modelle: =
0,10) angenommen, entsprechend einer Irrtumswahrscheinlichkeit von = 5%
(=10%), die Nullhypothese fälschlich zu verwerfen.
Wegen der in dieser Studie vorliegenden multiplen Testproblematik, welche immer
dann auftritt, wenn anhand eines Kollektivs mehrere statistische Tests bezüglich
verschiedener Zielparameter durchgeführt werden, wurde die statistische Auswer-
tung explorativ angesetzt. Um die als signifikant nachgewiesenen Thesen von dem
hier vorliegenden Kollektiv auf die Grundgesamtheit zu verallgemeinern, sind daher
weitere Studien notwendig.
23
3. Ergebnisse
3.1 Allgemeine Daten
Alter der Patientinnen
Das Alter der 101 Patientinnen betrug bei der Diagnosestellung 58,9 ± 14,4 Jahre. Die jüngste Patientin war 32 und die älteste 95 Jahre. Die Altersverteilung wird in Tabelle 3.1.1 und Abbildung 3.1.1 dargestellt. Tabelle 3.1.1: Altersverteilung des Patientenkollektivs
Alter bis 40 bis 50 bis 60 bis 70 bis 80 > 80
Anzahl 11 11 35 21 12 11
0
5
10
15
20
25
30
35
40
bis 40 bis 50 bis 60 bis 70 bis 80 über 80
Alter
abso
lute
Häu
fig
keit
Abbildung 3.1.1: Altersverteilung des Patientenkollektivs
3. Ergebnisse
24
Menopausenstatus Der Menopausenstatus ist eingeteilt in normal, prä- und postmenopausal und Seni-um: Normal: 18 Fälle Prämenopausal: 8 Fälle Postmenopausal: 28 Fälle Senium: 47 Fälle Histologie Die 101 Fälle sind nach den WHO-Richtlinien in folgende histologische Gruppen eingeteilt: Duktale Karzinome: 64 Fälle Lobuläre Karzinome: 15 Fälle Sonderformen: 22 Fälle
3.2 Univariate Überlebensanalyse
Im Folgenden sind die Überlebensdaten der Patientinnen für die einzelnen Parame-
ter zum einen in der Form von Mehr-Felder-Tafeln dargestellt. Hierbei werden die
medianen Überlebenszeiten der verschiedenen Gruppen innerhalb des jeweiligen
Parameters miteinander verglichen und auf ihre Signifikanz hin untersucht. Zum
anderen sind die Überlebensdaten der Frauen für die einzelnen Parameter mit Hilfe
von Kaplan-Meier-Kurven analysiert. Hierbei werden unterschiedliche Patienten-
gruppen und deren Überleben in Absterbekurven dargestellt.
Die graphische Darstellung veranschaulicht die statistische Aussage über den pro-
gnostischen Wert der einzelnen Parameter in Bezug auf das Gesamtüberleben be-
ziehungsweise die 5- und 10-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit.
3. Ergebnisse
25
3.2.1 Gesamtüberleben
Insgesamt konnten die Überlebensdaten aller 101 Patientinnen ermittelt werden.
Danach lebten gegen Ende des Beobachtungszeitraumes noch 53 Patientinnen
(mittlere Beobachtungsdauer: 10,6 ± 1,0 Jahre), 45 waren nach 3,9 ± 2,8 Jahren
gestorben. Die Überlebensdaten von drei Patientinnen waren nach 6,2 ± 1,0 Jahren
nicht weiter zu ermitteln gewesen. Die 5-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit lag
bei 65,4 %, die für 10 Jahre bei 48,8 %. Das mediane Überleben betrug 9,2 Jahre.
Abbildung 3.2.1: Gesamtüberleben der 101 Patientinnen
3. Ergebnisse
26
3.2.2 Beziehung zwischen Gesamtüberleben und Staging
Die Tabellen bzw. Abbildungen 3.2.2.1 bis 3.2.2.4 zeigen den Einfluss der einzelnen
Staging-Parameter auf das Überleben.
Tabelle 3.2.2.1: Überleben in Beziehung zur Tumorgröße (pT) (p = 0,0398)
pT 1 2 3 4
Anzahl der Patienten 16 61 17 7
verstorbene Patienten 5 33 10 5
mittl. Überleben (Jahre) 9,6 7,7 6,2 4,4
5-Jahres-ÜLW (%) 87,5 68,9 47,1 28,6
10-Jahres-ÜLW (%) 68,2 48,0 41,2 28,6
Abbildung 3.2.2.1: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zur Tumorgröße (pT)
3. Ergebnisse
27
Tabelle 3.2.2.2: Überleben in Beziehung zum Lymphknotenstatus (pN) (p = 0,0005)
pN 0 1
Anzahl der Patienten 49 51
verstorbene Patienten 17 35
mittl. Überleben (Jahre) 9,2 6,0
5-Jahres-ÜLW (%) 79,6 51,0
10-Jahres-ÜLW (%) 68,9 30,5
Abbildung 3.2.2.2: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier für den Lymphknotenstatus (pN)
3. Ergebnisse
28
Tabelle 3.2.2.3: Überleben in Beziehung zur Fernmetastasierung (M) (p = 0,0013)
M 0 1
Anzahl der Patienten 92 8
verstorbene Patienten 45 8
mittl. Überleben (Jahre) 7,9 3,6
5-Jahres-ÜLW (%) 68,5 25,0
10-Jahres-ÜLW (%) 52,7 0,0
Abbildung 3.2.2.3: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zur Fernmetastasierung (M)
3. Ergebnisse
29
Tabelle 3.2.2.4: Überleben in Beziehung zum Staging (pTNM) (p = 0,0002)
pTNM 1 2 3 4
Anzahl der Patienten 11 68 13 8
verstorbene Patienten 1 35 9 8
mittl. Überleben (Jahre) 11,1 7,8 5,4 3,6
5-Jahres-ÜLW (%) 100,0 69,1 38,5 25,0
10-Jahres-ÜLW (%) 90,9 50,6 30,8 0,0
Abbildung 3.2.2.4: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zum Staging (pTNM)
3. Ergebnisse
30
Abschließend lässt sich feststellen, dass die drei Komponenten des TNM-Systems
(pT, pN und M) sowie auch das zusammengefasste TNM-Stadium statistisch signifi-
kante Aussagen zum Überleben der Patientinnen ermöglichen.
Die größte praktische Relevanz kommt dabei dem Lymphknotenstatus zu; Patien-
tinnen ohne Lymphknotenmetastasen verfügen über eine wesentlich bessere Pro-
gnose als Patientinnen, die bereits bei Diagnosestellung eine axilläre Metastasie-
rung aufweisen.
3.2.3 Beziehung zwischen Überleben und Grading
Neben dem Staging soll auch auf das Grading als weiteren wichtigen Prognosefak-
tor des Mammakarzinoms eingegangen werden.
Die Kriterien sind tubuläre Differenzierung, Kernpleomorphie und Mitoseaktivität,
und werden in den Tabellen 3.2.3.1 bis 3.2.3.3 dargestellt. Daraus ergibt sich das
Grading, welches der Tabelle 3.2.3.4 zu entnehmen ist. Die Überlebenskurven sind
in den Abbildungen 3.2.3.1 bis 3.2.3.4 wiedergegeben.
Die histomorphologische Gradierung korreliert deutlich mit den Überlebensdaten. Es
lassen sich unterschiedliche Patientengruppen bilden, deren Überleben signifikant
mit zunehmender Entdifferenzierung abnimmt. Der Effekt tritt allerdings zwischen
G1- und G2-Fällen erst relativ spät ein.
Auch mit der Mitoserate lassen sich statistisch signifikante Ergebnisse erzielen. Bei
den Einzelkomponenten tubuläre Differenzierung und Kernpleomorphie ist die Kor-
relation nicht signifikant. Bei zunehmender Kernpleomorphie (KP2 vs. KP3) ist aller-
dings graphisch ein Überlebensunterschied zu erkennen.
3. Ergebnisse
31
Tabelle 3.2.3.1: Überleben in Beziehung zur tubulären Differenzierung (TD) (p =
0,1319)
TD 1 2 3
Anzahl der Patienten 4 27 58
verstorbene Patienten 0 13 35
mittl. Überleben (Jahre) 11,8 7,9 6,9
5-Jahres-ÜLW (%) 100,0 70,4 56,9
10-Jahres-ÜLW (%) 100,0 55,3 40,7
Abbildung 3.2.3.1: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zur tubulären Differenzie-
rung (TD)
3. Ergebnisse
32
Tabelle 3.2.3.2: Überleben in Beziehung zur Kernpleomorphie (KP) (p = 0,0609)
KP 1 2 3
Anzahl der Patienten 7 36 52
verstorbene Patienten 2 15 32
mittl. Überleben (Jahre) 9,2 8,6 6,7
5-Jahres-ÜLW (%) 71,4 77,8 55,8
10-Jahres-ÜLW (%) 71,4 57,7 41,5
Abbildung 3.2.3.2: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zur Kernpleomorphie (KP)
3. Ergebnisse
33
Tabelle 3.2.3.3: Überleben in Beziehung zur Mitoserate (MIT) (p = 0,0030)
MIT 1 2 3
Anzahl der Patienten 44 33 17
verstorbene Patienten 16 20 12
mittl. Überleben (Jahre) 9,0 7,0 5,2
5-Jahres-ÜLW (%) 77,3 63,6 35,3
10-Jahres-ÜLW (%) 65,5 38,7 26,5
Abbildung 3.2.3.3: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zur Mitoserate
3. Ergebnisse
34
Tabelle 3.2.3.4: Überleben in der Beziehung zu der Gradierung (Grad) (p = 0,0028)
Grad 1 2 3
Anzahl der Patienten 17 46 37
verstorbene Patienten 5 21 26
mittl. Überleben (Jahre) 9,2 8,4 5,8
5-Jahres-ÜLW (%) 76,5 73,9 48,7
10-Jahres-ÜLW (%) 70,6 55,9 31,5
Abbildung 3.2.3.4: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zur Gradierung (Grad)
3. Ergebnisse
35
3.2.4 Beziehung zwischen Überleben und dem Hormonrezeptorstatus
Die Tabellen bzw. Abbildungen 3.2.4.1 und 3.2.4.2 zeigen den Einfluss der beiden
Hormonrezeptorexpressionen auf das Überleben.
Tabelle 3.2.4.1: Überleben in Beziehung zum Östrogenrezeptorstatus (ER) (p = 0,2871)
ER 0 1
Anzahl der Patienten 25 76
verstorbene Patienten 13 40
mittl. Überleben (Jahre) 6,9 7,8
5-Jahres-ÜLW (%) 56,0 68,4
10-Jahres-ÜLW (%) 47,7 49,1
Abbildung 3.2.4.1: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zum Östrogenrezeptor (ER)
3. Ergebnisse
36
Tabelle 3.2.4.2: Überleben in Beziehung zum Progesteronrezeptorstatus (PR) (p = 0,0378)
PR 0 1
Anzahl der Patienten 48 53
verstorbene Patienten 29 24
mittl. Überleben (Jahre) 6,7 8,4
5-Jahres-ÜLW (%) 54,2 75,5
10-Jahres-ÜLW (%) 43,5 53,5
Abbildung 3.2.4.2: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zum Progesteronrezeptor (PR)
3. Ergebnisse
37
Zusammenfassend zeigt sich bei beiden Hormonrezeptoren ein gewisser Effekt auf
das Überleben, welcher aber nur beim Progesteronrezeptor über die gesamte Be-
obachtungsdauer erhalten bleibt. Der Überlebensvorteil für ER-positive Patientinnen
hingegen ist nur innerhalb der ersten ca. fünf Jahre nach Diagnosestellung nach-
weisbar.
3.2.5 Beziehung zwischen dem Überleben und der immunhistochemischen Analyse des Retinoblastomgen-Proteins (Rb)
In der univariaten Kaplan-Meier-Überlebensstatistik wurde die klinische Relevanz
der immunhistochemischen Analyse der Retinoblastomgen-Proteinexpression un-
tersucht, und zwar sowohl für die Einzelkomponenten (RbPP, RbSI), als auch für
den analog nach dem Remmele-Score gebildeten immunreaktiven Score (RbIRS).
Die Tabellen 3.2.5.1 bis 3.2.5.3 zeigen die Beziehung zwischen dem Überleben und
den drei Parametern, in den Abbildungen 3.2.5.1 bis 3.2.5.3 sind die entsprechen-
den Kaplan-Meier-Überlebenskurven dargestellt.
Für das Gesamtüberleben bestand keine statistische Signifikanz (p > 0,05) in Bezug
auf die untersuchten Parameter. Es zeigt sich jedoch die Tendenz, dass bei einem
Prozentsatz von mehr als 50% positiven Zellen (RbPP 3-4) die 5- und 10-Jahres-
Überlebenswahrscheinlichkeit deutlich abnimmt.
Bei Betrachtung der Faktoren Färbeintensität und IRS lassen sich keine Tendenzen
in Bezug auf das Überleben erkennen.
3. Ergebnisse
38
Tabelle 3.2.5.1: Überleben in Beziehung zum Prozentsatz Rb-positiver Zellen (RbPP) (p = 0,1971)
RbPP 0 - 1 2 3 - 4
Anzahl der Patienten 57 33 11
verstorbene Patienten 31 14 8
mittl. Überleben (Jahre) 7,5 8,4 5,9
5-Jahres-ÜLW (%) 63,2 75,8 45,5
10-Jahres-ÜLW (%) 48,2 57,1 27,3
Abbildung 3.2.5.1: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zum Prozentsatz Rb-positiver Zellen (RbPP)
3. Ergebnisse
39
Tabelle 3.2.5.2: Überleben in Beziehung zur Rb-Färbeintensität (RbSI) (p = 0,8765)
RbSI 1 2 3
Anzahl der Patienten 22 54 25
verstorbene Patienten 10 30 13
mittl. Überleben (Jahre) 7,8 7,6 7,3
5-Jahres-ÜLW (%) 63,4 70,4 56,0
10-Jahres-ÜLW (%) 52,2 47,8 48,0
Abbildung 3.2.5.2: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zur Rb-Färbeintensität (RbSI)
3. Ergebnisse
40
Tabelle 3.2.5.3: Überleben in Beziehung zum immunreaktiven Score (RbIRS) (p =
0,9726)
RbIRS IRS 0-1 IRS 2-3 IRS > 3
Anzahl der Patienten 20 39 42
verstorbene Patienten 10 21 22
mittl. Überleben (Jahre) 7,4 7,6 7,6
5-Jahres-ÜLW (%) 60,0 66,7 66,7
10-Jahres-ÜLW (%) 46,8 51,3 47,3
Abbildung 3.2.5.3: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zum immunreaktiven Score (RbIRS)
3. Ergebnisse
41
3.3 Multivariate Analyse: Cox-Modell
Mit Hilfe des Cox-Modells werden die einzelnen klinisch relevanten Parameter (Sta-
ging, Grading, Hormonrezeptorstatus) und die Komponenten der immunhistochemi-
schen Analyse des Retinoblastomgen-Proteins (Prozentsatz positiver Zellen, Färbe-
intensität, immunreaktiver Score) in Bezug auf ihre prognostischen Fähigkeiten und
ihre Unabhängigkeit voneinander untersucht. Dabei werden nur die Parameter mit
zueinander unabhängiger prognostischer Relevanz aufgenommen.
Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen (Tab.3.3.1 bis 3.3.5) schrittweise
dargestellt. Vor Schritt 1 (Tab. 3.3.1) kamen in erster Linie dem Lymphknotenstatus
(p = 0,0003) und dem Grading (p = 0,0014) hohe univariate Relevanz zu.
Tab.3.3.1: Multivariates Cox-Modell unter Einbeziehung der klinischen Parameter, des Hormonrezeptorstatus und der Rb-basierten Parameter; n = 100. Ausgangssituation vor Schritt 1.
Variable Chi² enter Chi² remove p-Wert
pN 12,99 0,0003
Grad 10,25 0,0014
pT 6,43 0,0112
PR 3,35 0,0672
RbIRS 0,56 0,4544
RbPP 0,34 0,5625
ER 0,21 0,6439
RbSI 0,19 0,6637
Als relevanteste Größe wurde zunächst in Schritt 1 der Lymphknotenstatus in das
Cox-Modell aufgenommen (Tab. 3.3.2). Danach verfügte der PR-Status (p = 0,0128)
über die höchste verbliebene univariate Relevanz, die etwas höher war als die der
Gradierung (p = 0,0138).
3. Ergebnisse
42
Tab.3.3.2: Multivariates Cox-Modell unter Einbeziehung der klinischen Parameter, des Hormonrezeptorstatus und der Rb-basierten Parameter; n = 100. Schritt 1.
Variable Chi² enter Chi² remove p-Wert
pN 12,99 0,0003
PR 6,20 0,0128
Grad 6,06 0,0138
pT 3,00 0,0834
ER 1,44 0,2294
RbIRS 0,17 0,6769
RbPP 0,09 0,7623
RbSI 0,01 0,9345
Im Schritt 2 wurde entsprechend der PR-Status aufgenommen (Tab. 3.3.3). Darüber
hinaus kamen nun noch pT (p = 0,0282) und der Gradierung (p = 0,0307) eine
verbleibende univariate prognostische Relevanz zu. Sie wurden in den Schritten 3
und 4 im Cox-Modell berücksichtigt (Tab. 3.3.4 und 3.3.5).
Tab.3.3.3: Multivariates Cox-Modell unter Einbeziehung der klinischen Parameter, des Hormonrezeptorstatus und der Rb-basierten Parameter; n = 100. Schritt 2.
Variable Chi² enter Chi² remove p-Wert
pN 15,84 0,0001
PR 6,20 0,0128
pT 4,82 0,0282
Grad 4,67 0,0307
RbIRS 0,44 0,5065
RbPP 0,20 0,6538
RbSI 0,13 0,7179
ER 0,00 0,9486
3. Ergebnisse
43
Tab.3.3.4: Multivariates Cox-Modell unter Einbeziehung der klinischen Parameter, des Hormonrezeptorstatus und der Rb-basierten Parameter; n = 100. Schritt 3.
Variable Chi² enter Chi² remove p-Wert
pN 12,54 0,0004
PR 8,02 0,0046
pT 4,82 0,0282
Grad 3,53 0,0604
RbIRS 0,80 0,3710
RbPP 0,61 0,4351
RbSI 0,05 0,8229
ER 0,01 0,9310
Tab.3.3.5: Multivariates Cox-Modell unter Einbeziehung der klinischen Parameter, des Hormonrezeptorstatus und der Rb-basierten Parameter; n = 100. Endsituation nach Schritt 4.
Variable Chi² enter Chi² remove p-Wert
pN 9,01 0,0027
PR 6,20 0,0128
pT 3,68 0,0552
Grad 3,53 0,0604
RbPP 0,77 0,3802
RbIRS 0,68 0,4111
ER 0,10 0,7501
RbSI 0,03 0,8721
Danach verfügte kein weiterer Parameter über eine ausreichende univariate pro-
gnostische Relevanz (p > 0,10), um in das Cox-Modell aufgenommen werden zu
können.
In Tab. 3.3.6 sind die statistischen Kenndaten in der Entwicklung des Cox-Modells
dargestellt. Sie demonstrieren über den Anstieg der Chi²-Werte für das global Chi²
von 13,07 auf 27,79 die Relevanz der Modell-Ergebnisse.
3. Ergebnisse
44
Tab.3.3.6: Multivariates Cox-Modell unter Einbeziehung der klinischen Parameter, des Hormonrezeptorstatus und der Rb-basierten Parameter. Übersicht über die Entwicklung der statistischen Kenngrößen von Schritt zu Schritt.
Schritt Improvement Chi² p-Wert Global Chi² p-Wert
1 (pN) 12,99 < 0,001 13,07 < 0,001
2 (PR) 6,20 0,013 19,16 < 0,001
3 (pT) 4,82 0,028 24,09 < 0,001
4 (Grad) 3,53 0,060 27,79 < 0,001
Zur Validierung des Cox-Modells am konkret zugrundeliegenden Datensatz kom-
men zwei Methoden in Betracht, die hier kombiniert angewendet wurden. Da die
beiden zuerst aufgenommenen Größen (pN, PR) jeweils in nur zwei Ausprägungen
vorliegen, bot sich an, sie in ihren vier Kombinationsmöglichkeiten pN0/PR+,
pN0/PR-, pN1/PR+ und pN1/PR- in einer gemeinsamen Kaplan-Meier-Kurve darzu-
stellen. Hierbei ergab sich eine relativ gleichmäßigen Verteilung der Patientinnen
auf die vier Gruppen (Tab. 3.3.7, Abb. 3.3.1)
Tab. 3.3.7: Überleben in Beziehung zum Lymphknotenstatus unter Berücksichtigung des Progesteronrezeptorstatus. N0: p = 0,7081, N1: p = 0,0016
N0/PR- N0/PR+ N1/PR- N1/PR+
Anzahl der Patienten 25 24 23 28
verstorbene Patienten 7 6 19 13
mittl. Überleben (Jahre) 9,1 9,6 4,2 8,0
5-Jahres-ÜLW (%) 72,0 87,5 34,8 64,3
10-Jahres-ÜLW (%) 72,0 74,8 17,4 53,1
3. Ergebnisse
45
Abb. 3.3.1: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zur kombinierten Darstellung des
Lymphknotenstatus und des Progesteronrezeptorstatus
Der Verlauf der Kaplan-Meier-Kurven in Abbildung 3.3.1 veranschaulicht deutlich
die schlechtere Prognose von Patientinnen mit PR-negativen Tumoren, die bei posi-
tivem Lymphknotenbefund (N1, p = 0,0016) allerdings stärker ausgeprägt ist als bei
negativem (N0, p > 0,05).
Die Hinzunahme von pT (4 Ausprägungen) oder des Gradings (3 Ausprägungen) ist
auf die gleiche Weise nicht möglich, da hier 16 bzw. 48 Patientengruppen entstün-
den, die sich statistisch nicht mehr auswerten ließen. Daher wurde als Alternative
ein multivariater Parameter („MP“) entwickelt, der unter Zugrundelegung der im
Cox-Modell ermittelten Koeffizienten der einzelnen Parameter diese in eine additive
3. Ergebnisse
46
mathematische Beziehung setzt. Prinzipiell ist dieses Verfahren für jeden beliebigen
Schritt des Cox-Modells durchführbar, wird hier aber nur für das Endergebnis nach
Schritt 4 im Vergleich zum stärksten Einzelparameter, dem Lymphknotenstatus,
vorgestellt.
Nach Schritt 4 lauten die Koeffizienten für pN 0,91, für PR -0,72, für pT 0,35 und für
den Grad 0,42. Der multivariate Parameter MP ist entsprechend definiert als
MP = 0,91 * pN – 0,72 * PR + 0,35 * pT + 0,42 * Grad.
Auf diese Weise wurde jeder Patientin eine neue Maßzahl zugeordnet. Anhand der
Datenverteilung des MP wurden zwei Gruppen im Verhältnis 49:51, d.h. angepasst
an die Verteilung des Lymphknotenstatus, gebildet. In die Gruppe MP0 fallen die 49
Patientinnen mit den niedrigeren MP-Werten, in die Gruppe MP1 die 51 Patientin-
nen mit den höheren MP-Werten. Die entsprechende Tabelle 3.3.8 und die Abbil-
dung 3.3.2 geben Aufschluß über Datenverteilung und Überlebenskurven.
Tab. 3.3.8: Überleben in Beziehung zum Lymphknotenstatus (Chi² = 12,25, p = 0,0005) bzw. zu MP (Chi² = 25,35, p < 0,0001)
Parameter N0 N1 MP0 MP1
Anzahl der Patienten 49 51 49 51
verstorbene Patienten 17 35 15 37
mittl. Überleben (Jahre) 9,2 6,0 9,7 5,3
5-Jahres-ÜLW (%) 79,6 51,0 86,3 42,9
10-Jahres-ÜLW (%) 68,9 30,5 69,6 28,4
3. Ergebnisse
47
Abb. 3.3.2: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zur kombinierten Darstellung des Lymphknotenstatus N0 und des multivariaten Parameters MP; schraf-fiert: N, durchgezogen: MP
Die Validierung des Cox-Modells nach Schritt 4 läßt nicht nur in Tabelle 3.3.8 höhe-
re 5- bzw. 10-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeiten und längeres mittleres Über-
leben für MP0 gegenüber N0 und für MP1 gegenüber N1 erkennen, sondern auch in
Abbildung 3.3.2 stärker auseinander weichende Überlebenskurven zwischen den
jeweils verglichenen Gruppen N0/MP0 und N1/MP1. Andererseits zeigt sich, dass
der Lymphknotenstatus insgesamt ein so starker Parameter ist, dass sich hier keine
entscheidenden Unterschiede im Überlebensverhalten der Patientengruppen ablei-
ten lassen. Wichtiger dürfte die Aussage aus Tab. 3.3.7 und Abb. 3.3.1 sein, dass in
der Gruppe der N1-Patientinnen der PR-Status eine statistisch signifikante Auftren-
nung in zwei Gruppen unterschiedlichen Überlebens möglich ist (p = 0, 0016,).
3. Ergebnisse
48
3.4 Korrelationen Rb-bezogener Parameter untereinander und mit klinisch-morphologischen Parametern
Abschließend soll die Beziehung von Rb-bezogenen Größen untereinander und mit
den übrigen prognostisch überprüften Parametern dargestellt werden.
3.4.1 Korrelation zwischen RbPP und RbSI
Eine eventuelle Korrelation zwischen RbPP und RbSI wurde in Mehr-Felder-Tafeln
mit verschiedenen Grenzziehungen für die beiden Parameter untersucht. Dabei ließ
sich im Pearson Chi²-Test stets eine signifikante Beziehung nachweisen. Exempla-
risch zeigt dies Tabelle 3.4.1.1 für den Fall, daß jeweils die Ausprägungen 0 und 1
sowie für RbPP auch die Ausprägungen 3 und 4 in einer Gruppe zusammengefaßt
sind (p < 0,0001).
Korrelationen zwischen RbPP oder RbSI mit dem immunreaktiven Score (RbIRS)
wurden nicht berücksichtigt, da der RbIRS aufgrund seiner Definition (RbPP * RbSI)
eine von vornherein abhängige Größe und keine Grundgröße darstellt.
Tab. 3.4.1.1: Beziehung zwischen dem Prozentsatz positiver Zellen (RbPP) und der
Färbeintensität (RbSI); p < 0,0001
RbSI
RbPP
0 und 1 2 3 total
0 und 1 20 33 4 57
2 2 20 11 33
3 und 4 0 1 10 11
Total 22 54 25 101
3. Ergebnisse
49
3.4.2 Korrelation zwischen Rb-Parametern und klinisch-morphologischen Pa-rametern
Nachdem (s.o.) zwischen RbPP und RbSI eine enge statistische Beziehung besteht,
werden im folgenden nur noch exemplarische Korrelationen von RbPP mit klinisch-
morphologischen Parametern dargestellt; für RbSI ergab sich stets ein annähernd
analoges Resultat.
Ein Zusammenhang zwischen RbPP und dem TNM-Stadium (Tab. 3.4.2.1) und sei-
nen Komponenten pT, pN und M lag nicht vor (p > 0,05); mit dem Grading war hin-
gegen eine statistisch signifikante Korrelation gegeben (Tab. 3.4.2.2, p = 0,0275).
Tab.3.4.2.1: Beziehung zwischen RbPP und dem TNM-Stadium (p > 0,05)
pTNM RbPP
1 2 3 4 Total
0 und 1 5 35 9 7 56
2 6 24 2 1 33
3 und 4 0 9 2 0 11
Total 11 68 13 8 100
Tab. 3.4.2.2: Beziehung zwischen RbPP und dem Grading (p = 0,0275)
Grad
RbPP
1 2 3 total
0 und 1 8 26 22 66
2 7 19 7 33
3 und 4 2 1 8 11
Total 17 46 37 100
3. Ergebnisse
50
Eine signifikante Beziehung fand sich darüber hinaus auch zwischen RbPP und der
Mitoseaktivität (p = 0,0117).
Zum Östrogen- bzw. Progesteronrezeptorstatus bestand hingegen keine signifikante
Korrelation (Tab. 3.4.2.3 und 3.4.2.4; p > 0.05).
Tab. 3.4.2.3: Beziehung zwischen RbPP und dem ER-Status (p > 0,05)
ER-Status
RbPP
negativ positiv total
0 und 1 14 43 57
2 6 27 33
3 und 4 5 6 11
Total 25 76 101
Tab. 3.4.2.4: Beziehung zwischen RbPP und dem PR-Status (p < 0,05)
PR-Status
RbPP
negativ positiv total
0 und 1 27 30 57
2 16 17 33
3 und 4 5 6 11
total 48 53 101
51
4. Diskussion
Die Entscheidung zur systemischen adjuvanten Therapie des primären Mammakar-
zinoms wird immer noch obligat anhand der Prognosefaktoren mit gesicherter klini-
scher Relevanz wie Tumorgröße, Lymphknotenstatus, histologischem Tumortyp,
Differenzierungsgrad, Hormonrezeptorstatus und Alter der Patientin gefällt [Empfeh-
lungen für die adjuvante Therapie, St.Gallen / Schweiz 2001]. Das Mammakarzinom
ist aber eine Erkrankung, bei der es wegen der vielen verschiedenen Untergruppen
und der unterschiedlichen Therapieansätze besonders wichtig ist, für die betroffene
Patientin ein individuelles Risikoprofil zu entwickeln. Ziel dabei ist, für jede Frau das
richtige Therapieregime zu erkennen und damit eine Unterversorgung oder eine
ungerechtfertigt übermäßig toxische Therapie zu vermeiden. Deswegen ist es sinn-
voll, zu den etablierten bzw. ohnehin bei der routinemäßigen Aufarbeitung des Tu-
mormaterials anfallenden Größen weitere zu erproben, von denen man sich even-
tuelle neue Aufschlüsse versprechen kann.
Entsprechend ist in der vorliegenden Studie retrospektiv die Expression des Retino-
blastomgenprodukts als potentieller Prognosefaktor hinsichtlich seiner prognosti-
schen Relevanz untersucht worden. Die mit dieser Anwendung erzielten Ergebnisse
sollen im folgenden mit vorhandenen Konzepten aus der Literatur in Beziehung ge-
setzt werden, wobei zunächst auf die derzeit allgemein anerkannten Parameter ein-
gegangen werden soll.
4. Diskussion
52
4.1 Anerkannte Prognosefaktoren
Zu den anerkannten Prognoseparametern gehören insbesondere das TNM-
Stadium, die histologische Gradierung, der Hormonrezeptor- und der Menopausen-
status auf deren Ergebnisse sich im Routinefall die primäre Therapiewahl für die
betroffene Patientin stützt.
Tumorstadium
Die prognostischen Fähigkeiten der Stadieneinteilung nach der TNM-Klassifikation
[UICC,1997] wurden schon in vielen klinischen Studien mit hohen Fallzahlen be-
schrieben [Railo et al. 1993 (n = 327), Niezabitowski et al. 1995 (n = 108), Sundblad
et al. 1996 (n = 238), Eissa et al. 1997 (n = 100), Fernandez-Acenero et al. 1997 (n
= 112), Gago et al. 1998 (n = 205), Mehta et al. 1998 (n = 79), Raabe et al. 1998 (n
= 1335), Narita et al. 1998 (n = 100)].
Die Primärgröße des Tumors korreliert mit dem axillären Lymphknotenbefall. Bei
Patientinnen mit nodal negativen Karzinomen ist die Größe des Primärtumors der
wichtigste prognostische Faktor, während bei nodal positiven Patientinnen der axil-
läre Lymphknotenbefall im Vordergrund steht. Bei einem No-Status und einer Tu-
morgröße unter 1 cm beträgt die 5-Jahresüberlebensrate ca. 95%, sie sinkt auf 75%
für den T2-Tumor der Größe 2-5 cm und nur noch 60% bei einer Tumorgröße >5 cm
[Donegan et al.1980]. Die Bedeutung der TNM-Klassifizierung zeigt sich auch in
einer Untersuchung von Ravaioli [2000], welche den primären Metastasennachweis
in Relation zu den Risikogruppen (UICC-Stadieneinteilung des Mammakarzinoms
unter Verwendung der TNM-Klassifizierung, s. Kapitel 1.3) untersuchte. In der Risi-
kogruppe I fanden sich bei 0,9% der Patientinnen Metastasen, in Gruppe II bei 2,9%
und in Risikogruppe III bei 15,5% Metastasen.
Auch in dieser Arbeit konnte mit der Literatur übereinstimmend eine deutliche Korre-
4. Diskussion
53
lation des TNM-Stadiums mit den Überlebenszeiten der Patientinnen nachgewiesen
werden (p = 0,0002). Ferner hatten die Einzelfaktoren einen signifikanten Einfluß
auf das Überleben. Besonders der Lymphknotenstatus (p = 0,0002), aber auch die
Tumorgröße (p = 0,0398) bestätigten sich, wie in den zitierten Literaturdaten, als
sinnvolle Prognosefaktoren [Balslev et al. 1994, Biesterfeld 1988, Clark et al. 1983,
Layfield et al.1996, Lethaby et al. 1996, Gasparini et al. 1994, Pierga et al. 1996,
Baak et al.1985, Railo et al 1993, Alexieva-Figusch et al. 1988].
Gradierung
Als weiterer, anerkannter Prognoseparameter wird das histomorphologische Gra-
ding nach Bloom und Richardson (1957) verwendet. Es soll die Wachstumsge-
schwindigkeit oder maligne Potenz des Tumors wiedergeben. Dazu werden die hi-
stologische und zytologische Ähnlichkeit des Tumorgewebes zu dem gesunden
Gewebe und die mitotische Aktivität beurteilt. Auch wenn die eingeschränkte Re-
produzierbarkeit von 60 bis 70% aufgrund der subjektiven Beurteilung bemängelt
wurde
[Cutler et al. 1966, Champion und Wallace 1971, Le Doussal et al. 1989, Stenkvist
et al. 1983], konnte eine signifikante Korrelation mit der Prognose in vielen großen
Studien bestätigt werden [Bloom et Richardson 1957 (n = 1409), Tomasino et al.
1993 (n = 71), Gasparini et al. 1994 (n = 195), Russo et al. 1994 (n = 71), Schön-
born et al. 1995 (n = 216), Sundblad et al. 1996 (n = 238), Genestie et al. 1998 (n =
825), Hendson et al. 1991 (n = 22616), Lethaby et al. 1996 (n = 370)]. In den 90er
Jahren wurde das dreistufige Grading von Bloom und Richardson durch Arbeiten
von Elston und Ellis [1991,1993] erweitert, so daß Tubulusbildung, Kernpolymorphie
und auch die Mitoseanzahl in einem Scorewert von jeweils 1-3 mit eingeht. Es er-
gibt sich daraus ein Score von 3 bis 9 (G1= 3-5, G2= 6-7, G3= 8-9). Außerdem for-
dern Elston und Ellis eine doppelte Prüfung, am besten durch zwei unabhängige
Pathologen. Ferner bedarf es auch genau festgelegt Kriterien für unterschiedliche
Mikroskope.
4. Diskussion
54
Vorteil des Grading ist, daß es keinen methodischen Aufwand, sondern „nur“ eine
sorgfältige Analyse erfordert [Page et al. 1995] und außerdem können unter den
nodal positive Patientinnen diejenigen identifiziert werden, die von einer Langzeit-
chemotherapie profitieren [Elston et al.1987, Pinder et al. 1998].
In unserer Studie konnte ebenfalls eine signifikante Korrelation mit dem Gesamt-
grading in der univariaten Überlebensanalyse nachgewiesen werden (p = 0,0028).
Es ließen sich unterschiedliche Patientengruppen bilden, deren Überleben mit zu-
nehmender Entdifferenzierung der Tumorzellen abnahm.
Allerdings zeigte von den einzelnen Komponenten nur die Mitoserate eine klare si-
gnifikante Korrelation (p = 0,0030). Auch in der Literatur wird eine hohe Korrelation
für die Mitoserate mit dem Überleben beschrieben [Genestie et al 1998, Parham et
al. 1992]. Ebenso wie in dieser Studie konnten Genestie et al. keinen signifikanten
Zusammenhang zwischen der tubulären Differenzierung und den Überlebensdaten
feststellen.
Hormonrezeptorstatus
Als ebenso anerkannter Prognoseparameter gilt die Bestimmung des Hormonrezep-
torstatus. Dieser wurde in den späten 70er Jahren bis in die frühen 90er Jahre an-
nähernd ausschließlich biochemisch bestimmt; hierzu wurde aus auf einer Kühlkette
gehaltenen Frischmaterial der Rezeptorengehalt des Zytoplasmas extrahiert und als
Konzentration (fmol/mg Protein) angegeben. Aus der Erfahrung wurden bestimmte
Grenzwerte festgelegt, ab welchen Östrogen- bzw. Progesteronrezeptoren als posi-
tiv zu gelten hatten. Nach einer kurzen Zeitperiode in den frühen 90er Jahren, in
den immunhistochemisch anwendbare Antikörper nur für die Nutzung von Gefrier-
schnitten (und somit nur für ausgewählte Fälle) zur Verfügung standen, haben sich
seit ca. 1995 an Paraffinschnitten applizierbare Antikörper durchgesetzt und die bio-
chemische Methode weitgehend verdrängt. Allerdings markieren die Antikörper am
4. Diskussion
55
Kern und stellen somit andere Eigenschaften der Rezeptoren dar, als die am Zyto-
plasma ansetzende biochemische Methode. Die Korrelation beider Methoden liegt,
ausgedrückt als Konkordanzwert, bei 80% für den Östrogenrezeptor und bei nur
58% für den Progesteronrezeptor (Biesterfeld et al. 1997), so dass noch fraglich ist,
in wie weit wirklich die herkömmliche biochemische Methode, obwohl sie kaum noch
angewandt wird, wirklich entbehrlich ist.
Der prognostische Effekt der Hormonrezeptorbestimmung ist in mehreren Arbeiten
gut belegt [DeSombre et al. 1980, Reiner et al. 1990, Schönborn et al. 1995, Moriki
et al. 1995, Haerslev et al. 1996, Gohring et al. 1996, Molino et al. 1997, Gago et
al.1998, Dao et al. 1980, Foekens et al. 1989]. Ein positiver Hormonrezeptorstatus
korreliert unabhängig von der eingeleiteten adjuvanten Therapie mit einer besseren
Prognose der Patientinnen. Zusätzlich erlaubt er eine Aussage über den Nutzen
einer antihormonellen Therapie im Sinne eines prädiktiven Faktors [Ellis et al. 1998].
Allerdings beschreiben auch einige Autoren das Fehlen einer Korrelation sowohl
zwischen dem Östrogenrezeptorstatus [Gaglia et al. 1993, Gasparini et al. 1994,
Mitze et al. 1995], als auch dem Progesteronrezeptorstatus [Gasparini et al. 1994,
Mitze et al. 1995] und dem Überleben.
In dieser Arbeit korrelierte der Hormonrezeptorstatus mit dem Überlebensdaten in dem Sin-
ne, dass Patientinnen mit positivem Status länger lebten als bei Negativem. Dies war jedoch
nur für den Progesteronrezeptorstatus (p = 0,0378) statistisch signifikant, nicht jedoch für
den Östrogenrezeptor (p = 0,2871). Aus prognostischer Sicht ist folglich eine wertvollere
Aussage vom Progesteronrezeptor zu erwarten. Diese Ergebnisse stimmen mit anderen Un-
tersuchungen überein, die den Progesteronrezeptorstatus im Gegensatz zum Östrogenrezep-
tor als besseren Indikator für eine gute Prognose werten [Kovach et al. 1996, Lethaby et al.
1996, Somlo et al. 1997]. Diese Aussage deckt sich auch mit den Ergebnissen der Konsen-
suskonferenz St. Gallen 1998, in der die Bedeutung des Progesteronrezeptorstatus für die
Unterteilung der einzelnen Risikokollektive herausgestellt wurde.
4. Diskussion
56
4.2 Das Retinoblastomgen- Protein (pRb) in der Prognostik des
Mammakarzinoms
Es ist inzwischen anerkannt, dass Tumorsuppressorgene eine wichtige Rolle in der
Entwicklung von menschlichen Karzinomen spielen [Marshall, 1991]. Das Retino-
blastomgen (Rb) war das jeweils erste Gen, welches überhaupt als Tumor-
suppressorgen identifiziert [Lee et al. 1987, Fung et al. 1987] und vollständig cha-
rakterisiert wurde [Hong et al., 1989], und das erste Gen, welches überhaupt als
solches identifiziert wurde [Lee et al. 1987, Fung et al. 1987].
Die Expression des Retinoblastomgen-Proteins und Strukturveränderungen des
Gens wurden schon in einigen Studien untersucht, in der Hoffnung einen neuen un-
abhängigen Prognoseparameter für das Mammakarzinom zu finden. Zunächst soll
in diesem Zusammenhang die Beziehung zwischen dem Überleben und der im-
munhistochemischen Analyse des Retinoblastomgen-Proteins erläutert werden.
In der univariaten Analyse konnte in unserem Patientenkollektiv keine sinnvolle Be-
ziehung zwischen den Überlebensdaten und den Ergebnissen der immunhistoche-
mischen Analyse der Rb-Expression nachgewiesen werden (p > 0.05). Die publizier-
ten Ergebnisse aus der Literatur zeigen, dass auch bei größeren Fallzahlen als der
eigenen keine grundsätzlich abweichenden Ergebnisse zu erwarten sind (Tabelle
4.2.1).
4. Diskussion
57
Tab. 4.2.1: Einfluß der Rb-Protein-Expression auf das Überleben von Mammakarzi-nomen
Autoren Fallzahl (n) p-Wert
Anderson et al. 1996 233 nicht signifikant
Pietiläinen et al. 1995 205 nicht signifikant
Bern et al. 1995 96 nicht signifikant
Sawan et al. 1992 197 nicht signifikant
Dublin et al. 1998 192 nicht signifikant
Yamashita et al. 1993 77 nicht signifikant
Farabegoli et al. 2005 50 nicht signifikant
Pinto et al. 2005 50 nicht signifikant
Im Folgenden sollen Beziehungen zwischen der Rb-Expression und herkömmlichen
Prognoseparametern diskutiert werden.
In der Literatur wird damit übereinstimmend keine signifikante globale Relation zum
Staging beschrieben [Anderson et al. 1996, Pietilainen et al. 1995, Yamashita et al.
1993]. In der Arbeit von Varley et al. [1989] wurde jedoch beobachtet, daß in inva-
siv-duktalen Karzinomen vom Stadium 1 keine Rb-1-Deletionen auftraten. Es konn-
te jedoch keine Beziehung zwischen Rb-1-Deletionen und einer schlechteren Pro-
gnose gefunden werden. Bezüglich der Tumorgröße und dem Rb-Gen gibt es un-
terschiedliche Untersuchungsergebnisse. Eine nicht signifikante Beziehung wurde in
den Arbeiten von Anderson et al. [1996], Pietilainen et al. [1995], Borg et al. [1992],
Yamashita et al. [1993] und Trudel et al. [1992] für pT beschrieben. Im Unterschied
dazu wurde eine signifikante Korrelation zwischen Tumorgröße und Rb-Expression
in der Untersuchung von Spandios et al. [1992] gefunden.
In einer Arbeit von Berns et al. [1995] wurde die Häufigkeit von Rb-Gen-
4. Diskussion
58
Veränderungen mit Hilfe der Southern-Blotting-Methode nachgewiesen. Die Rb-
Veränderungen wurden signifikant (p = 0,01) häufiger in lymphknotennegativen und
kleinen Tumoren (T1 < 2cm) gefunden. Trotz der Beziehung von Rb-Gen-
Veränderungen zu klinischen Faktoren, welche mit einer besseren Prognose ver-
bunden sind, zeigt sich jedoch kein Unterschied zwischen dem Überleben für Pati-
entinnen mit oder ohne Rb-Veränderungen. Im Unterschied zu den eben genannten
Ergebnissen zeigten immunhistochemische Untersuchungen der Rb-Gen-
Expression eine signifikante Korrelation mit einem positiven Lymphknotenstatus
[Derenzini et al. 2004, Sawan et al. 1992, Varley et al. 1989], aber ebenfalls ohne
Beziehung zum Gesamtüberleben. Übereinstimmend mit den Ergebnissen dieser
Arbeiten und auch in guter Korrelation mit unseren Resultaten fanden Anderson et
al. [1996], Trudel et al. [1992], Yamashita et al. [1993] und Dublin et al. [1998] eben-
falls keine signifikante Korrelation zwischen pRb und dem LK-Status.
In einer Studie von Derenzini et al. [2004] an 335 primären Mammakarzinomen
konnte eine signifikante Beziehung zum Überleben und zum Lymphknotenstatus
gezeigt werden.
Mit abnehmender histologischer Differenzierung nimmt üblicherweise auch die Proli-
ferationsrate zu. In unserer Studie lässt sich eine signifikante Beziehung zwischen
dem Grading und dem Prozentsatz der Rb-positiven Zellen nachweisen (p =
0,0275), während RbIRS und RbSI keine signifikanten Resultate erkennen lassen.
Auch die Mitoserate verhält sich signifikant zu dem Prozentsatz positiver Zellen.
Darüber hinaus wurde in einem Vergleich der Ergebnisse mit denen anderer Dokto-
randen am gleichen Patientenkollektiv deutlich, dass eine Beziehung zur Zahl Rb-
positiver Zellen und der Stärke der Rb-Expression mit der mittleren PCNA-
Expression [Schneider 2001] besteht.
Allgemein sind Grading, Mitoserate und die Expression von Proliferationsmarkern
Größen, von welchen man sich eine Aussage zur Aggressivität des Tumors ver-
spricht. Insofern ist eine Beziehung zu einem Protein, welches die Proliferation
hemmt und Zellen beeinflusst, die die Leistungsfähigkeit zur unkontrollierten Ver-
mehrung haben und so zu einem ansteigenden malignen Potential beitragen, nicht
4. Diskussion
59
unerwartet. Auch in der Literatur wurde ein Zusammenhang zwischen Rb-
Veränderungen und schlechter Differenzierung bzw. vermehrter Aggressivität des
Karzinoms beschrieben [Cordon-Cardo et al.1995].
Passend hierzu wurde eine signifikante Beziehung zwischen der anomalen Expres-
sion des Rb-Gens, der Tumordifferenzierung (invasiv-duktales Karzinom G3), der
Kernpleomorphie und dem Auftreten von DNA-Aneuploidie gefunden [Dublin et
al.1998, Pietiläinen et al. 1995]. Nach Pietiläinen et al. besteht zwischen der verän-
derten Gen-Expression und der Zellproliferation ein deutlicher Zusammenhang,
nachweisbar an der erhöhter S-Phase-Fraktion und einer gesteigerten Mitoseaktivi-
tät. Diese Ergebnisse stimmen gut überein mit einer regulatorischen Basisfunktion
für die Zellproliferation, die man dem Rb-Protein zuschreibt. Auch bei Untersuchun-
gen zu strukturellen Gen-Veränderungen mittels RNA-Blotting wurden Deletionen
des Rb-Gens häufiger in fortgeschrittenen Tumoren mit schlechter Differenzierung
gefunden, jedoch ohne eine signifikante Beziehung zu einer schlechteren Prognose
[Varley et al. 1989]. Eine Studie von Borg et al. [1992] zeigte eine Korrelation von
umschriebenen chromosomalen Allelverlusten (LOH) und hoher S-Phasefraktion
sowie DNA-Aneuploidie.
Da Zeichen der schnellen Zellproliferation, die DNA-Aneuploidie und die schlechte
histologische Differenzierung mit der veränderten Rb-Expression bzw. Strukturver-
äderungen im Rb-Gen zusammenhängen, lassen die Resultate vermuten, dass mit
wachsender genetischer Instabilität Mutationen im Bereich des Rb-Gens häufiger
vorkommen, was zu einer Beziehung von der Rb-Veränderungen und malignen hi-
stologischen Kriterien beiträgt. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf
hin, dass die Rolle der Rb-Mutationen zumindest in den frühen Phasen der Brust-
krebsentwicklung fraglich ist.
Es ist jedoch wichtig zu bedenken, daß die Erforschung des Tumorsuppressorgens
Rb an Mammakarzinomen zu nicht ganz einheitlichen Ergebnissen führte, was an
unterschiedlichen Arbeitsmethoden und unzureichenden Kenntnissen über die Tu-
morentstehung und das Rb-Gen (z.B. evtl. zusätzliche Regulation des Rb-Gens auf
der Transkriptionsebene [Strohmeyer et al. 1991] liegen könnte.
4. Diskussion
60
Auch bei erwähnten Arbeiten in der Tabelle 4.2.1 wurden z.B. unterschiedliche Anti-
körper bzw. Antikörpersysteme benutzt. Außerdem war das Scoring-System der Rb-
Protein-Expression nicht einheitlich gewählt. Pietiläinen et al., Yamashita et al. und
Nielsen et al. definierten drei Gruppen mit fehlender (0), anormaler (1) und normaler
(2) Expression. Anderson et al. und Sawan et al. unterschieden eine Kernfärbung
auf einer 5-Punkte Skala (0 bis 4). Die Arbeitsgruppe Dublin et al. differenzierte
ebenfalls drei Fraktionen mit keiner, schwacher oder starker Kernfärbung, wobei nur
eine fehlende Färbung als anormale Expression angesehen wurde. Marsh und Var-
ley [1998] unterschieden normale Färbeintensität (++, +++) von nicht normaler Fär-
bung (+,-). In unserer Arbeit wiederum wurde Remmele-Score verwendet, der ur-
sprünglich für den Östrogenrezeptor entwickelt worden war [Remmele und Stegner
1987], aber breite Verwendung auch bei anderen Markierungen findet. Außerdem
ist die Interpretation der Ergebnisse erschwert durch die von Zelle zu Zelle unter-
schiedliche Proteinexpression.
Der Hormonrezeptorstatus gilt mittlerweile als einer der Standardfaktoren bei der
Ermittlung der Prognose des Mammakarzinoms. In dieser Arbeit konnten keine si-
gnifikanten Korrelationen des Östogenrezeptorstatus zu den Daten der immunhisto-
chemischen Analyse der Rb-Proteinexpression gefunden werden (p > 0,05). Frühe-
re Studien bestätigen dies in den meisten Fällen [Pietiläinen et al. 1995, Yamashita
et al. 1993, Trudel et al. 1992, Borg et al. 1992, Anderson et al. 1996]. Lediglich die
Ergebnisse von Dublin et al. [1998] zeigen ein signifikant häufigeres Fehlen einer
Rb-Proteinexpression in ER-negativen Tumoren.
Einige Autoren halten pRB für einen Down-Regulator der Proliferation von Mamma-
karzinomzellen in Antwort auf ER- [Watts et al. 1995, Attucci et al. 1996, Foster et
al.1996, Lukas et al. 1996, Dees et al. 1997, Hurd et al. 1997] und PR-Bindungen
[Groshong et al.1997, Musgrove et al. 1997]. Die Tumorsuppressorfunktion von pRb
ist abhängig von seiner hypophosphorylierten aktiven Form. In einer Studie konnte
4. Diskussion
61
gezeigt werden, dass die Inkubation von ER- und PR-positiven Mammakarzinomzel-
len in ein östrogenhaltiges Wachstumsmedium eine Zellproliferation und eine Hy-
perphosphorylierung von pRb bewirkt [Moudgil et al. 2001].
Es ist ein Nachteil der immunhistochemischen Untersuchung, daß sie nicht zwi-
schen der hypophosphorylierten (aktiven) und der phosphorylierten (inaktiven) Form
unterschieden werden kann. Außerdem ist, abhängig von der Spezifität des Antikör-
pers, eine positive Kernreaktion nicht eindeutig als Indikator für die Anwesenheit
von funktionsfähigem Protein zu werten. So könnten Missense-Mutationen oder
kleine Deletionen das Epitop unbeeinflusst lassen, so daß diese nicht von dem Anti-
körper erkannt werden. Problematisch scheint auch, daß mit umschriebenen chro-
mosomalen Allelverlusten (LOH) des Rb-Locus nicht unbedingt eine Mutation, Dele-
tion oder verminderte pRb-Expression einhergeht [Borg et al.1992, Wadayama et
al.1994, Berns et al. 1995].
Die Studie von Botos et al. [2002] untersuchte die Hypothese, daß die Verteilung
von funktionierendem Rb und der Kinetik der Rb-Phoshorylierung unterschiedlich ist
in den Zelllinien; unsterbliches Mammaepithel (MCF-10 A), differenziertes, nicht-
metastasiertes Adenokarzinom (MCF-7) und schlecht differenziertem, metastasier-
tem Adenokarzinom (MDA-MB-231) und, daß diese Unterschiede über den zellulä-
ren Phenotyp informieren können. Es zeigte sich eine schnellere Rb-
Phosphorylierung in MCF-7 im Vergleich zu MCF-10A und eine annährend unregu-
lierte Rb-Dephosphorylierung in der MDA-MB-231-Linie. Diese Ergebnisse unter-
stützen damit die These, daß der Nachweis von hypophoshphoryliertem Rb ein
nützlicherer prognostischer Faktor sein könnte, als das Gesamt-Rb.
Ein Vorteil der immunhistochemischen Methode ist aber, daß die Bewertung der
Komponenten der G1-Phase-Regulation des Zellzyklus direkt in den einzelnen Tu-
morzellen auf der Ebene der Proteine erfolgt. Außerdem sind die Ergebnisse nicht
durch Kontamination mit gesunden Zellen beeinflußt und verlassen sich nicht dar-
auf, das Verhalten des Proteins ausschließlich durch die genetische Information
voraus zusagen.
4. Diskussion
62
Der Progesteronrezeptorstatus zeigt in dieser Arbeit ebenfalls keine signifikante
Korrelation zu den Rb-Parametern. Auch in der Literatur wird dies beschrieben [Mil-
de-Langosch et al. 2001, Anderson et al. 1996, Pietiläinen et al. 1995, Yamashita et
al. 1993, Borg et al. 1992]. Bemerkenswert ist die von Anderson et al. [1996] beo-
bachtete signifikante Korrelation zwischen einer fehlenden pRb-Expression und ei-
nem fehlenden Ansprechen auf eine endokrine Therapie. Allerdings zeigte sich kei-
ne Beziehung zwischen fehlender Rb-Expression und dem Vorhandensein von Ös-
trogen- oder Progesteronrezeptoren. Die Möglichkeit, daß die immunhistologische
pRb-Färbung eine zusätzliche vorhersagende Information zur endokrinen Therapie
liefern könnte, ist verlockend, hier sind jedoch zunächst weitere Studien erforderlich.
Eine signifikante Korrelation konnte zwischen der Färbeintensität (p = 0,0053) und
dem IRS (p = 0,0017) des pRb und der Apoptose gezeigt werden. Diese Beobach-
tung läßt sich durch die Funktion des Rb-Proteins erklären. Wie schon erwähnt, ist
das Proteinprodukt des Retinoblastomgens ein Schlüsselregulator für das Schicksal
der Zelle. Dieser Regulator vermittelt zwischen verbundenen Signalwegen und
spielt eine wichtige Rolle für die Apoptose oder den programmierten Zelltod. Die
Anti-Apoptosefunktion des Rb-Proteins konnte für gesunde und Krebszellen gezeigt
werden. Tatsächlich führt ein Knock-Out des Rb-Gens oder die Expression von vira-
len Onkoproteinen, welche das Rb-Protein inaktivieren zur Apoptose [Morgenbesser
et al. 1994, Pan et al. 1994, Almasan et al. 1995, Truchet et al. 2000]. In der Litera-
tur wurde bisher keine immunhistochemische Auswertung des Rb-Proteins mit der
Apoptose korreliert.
4. Diskussion
63
Tab.4.2.2: Literaturübersicht der Ergebnisse der immunhistochemischen Auswer-tung der Retinoblastomgen-Expression in Mammakarzinomen
Autor Fallzahl (n) Ergebnis
Anderson et al. 1996 233 verminderte Gen-Expression in 21% der Fälle
Pietiläinen et al. 1995 205 abnorme Gen-Expression in 36,6 % der Fälle
Sawan et al. 1992 197 Rb-Gen-Expression in 28% der Fälle negativ
Nielsen et al. 1997 79 keine Gen-Expression in 9% der Fälle
Yamashita et al. 1993 77 in 16% verminderte und in 16% der Fälle keine Ex-pression
Dublin et al. 1998 192 abnorme Gen-Expression in 17% der Fälle
Marsh, Varley 1998 28 Verminderte Expression von pRb in 37% der Fälle
Derenzini et al. 2004 335 hyperphoshoryliertes/ fehlendes pRb in 23,6%
Pinto et al. 2005 50 pRb+ 26% der Fälle
Faßt man die Ergebnisse zusammen, so wurden Veränderungen in 9% bis 36,6%
der Fälle ermittelt. Ähnliche Zahlenwerte zwischen 13% und 25% ergeben sich für
genetische strukturelle Veränderungen auf der Rb-Gen-Ebene (Tab. 4.2.3).
Tab. 4.2.3: Literaturübersicht der Ergebnisse von Rb-Gen-Veränderungen in Mam-makarzinomen
Autor Fallzahl (n) Ergebnis
Bern el al. 1995 96 Strukturveränderungen in 24% der Fälle
Varley et al. 1989 77 Deletion des Rb-Gens in 17% der Fälle
Borg et al. 1992 90 Strukturveränderungen in 25% der Fälle
Bootsma et al. 1993 79 Strukturveränderungen in 13% der Fälle
4. Diskussion
64
Von diesen unterschiedlichen Daten ausgehend ist es schwierig, einen speziellen
Schluss über die Rolle des Rb-Gens beim primären Mammakarzinom zu ziehen. Da
ein Rb1-Allelverlust nicht immer assoziiert ist mit einem Verlust der pRb-Expression
[Borg et al 1992], könnten andere Gene, welche ebenfalls auf dem Chromosom 17q
lokalisiert sind, in Zusammenhang stehen mit der Entwicklung oder dem Fortschrei-
ten von menschlichen Karzinomen. Bedeutend für diese Theorie ist die Auffindung
eines Gens von Schott et al. [1994], welches proximal vom Rb1-Gen (lokalisiert
13q12-q13) lokalisiert ist und den Namen Brush-1 trägt. Es konnte gezeigt werden,
daß umschriebene chromosomale Allelverluste (LOH) dieses Gens in Beziehung
stehen zu einem verminderten Brush-mRNA-Niveau, wohingegen das Rb1-mRNA-
Level unverändert erscheint.
Die zentrale Rolle des Rb-Gens in der Zellproliferation durch die Regulation des
G1/S-Übergangs wurde schon beschrieben [Weinberg, 1995]. Bei der Festlegung
der Zelle zur weiteren Proliferation wird pRb inaktiviert durch die Phosphorylierung
durch cyclin-abhängige Kinasen, dadurch werden Faktoren freigesetzt, welche den
S-Phase Eintritt bewirken.
Viele Studien für unterschiedliche Karzinome haben eine hohe Frequenz von Muta-
tionen im Rb-Gen, Veränderungen im Kontrollmechanismus der Rb-
Phorphorylierung und anormale Expression von pRb aufgedeckt. Eine dieser Ver-
änderungen könnte der entscheidende Schritt in der Krebsentwicklung sein [Lukas
et al. 1995].
Die Bedeutung der Rb-Inaktivierung im Krebs konnte auch durch das Einbringen
von Wildtyp-Rb in Tumorzelllinien mit einem Rb-Verlust nachgewiesen werden; die
Wachstumsrate sank unter beschränkten Serumbedingungen, die Fähigkeit, Koloni-
en im Agar zu bilden, war aufgehoben und die Tumorentwicklung bei Nacktmäusen
war vermindert oder komplett unterdrückt [Huang et al. 1988, Takahasi et al.1991,
Wang et al. 1993].
Cyclin D1, cdk4/6 und p16 bilden ein regulierendes Element in der G1-Phase und
4. Diskussion
65
jede dieser Komponenten ist eine potentielle Zielscheibe für die Fehlregulierung in
der Krebsentstehung mit der Konsequenz der Steigerung der Phosphorylierung und
Inaktivierung von pRb.
Im Mammakarzinom sind die Cyclin-D1-Genamplifikation [Adnane et al. 1989,
Schuuring et al.1992, Buckley et al. 1993] und die Rb-Mutationen weit verbreitet. Es
wurde beschrieben, daß Tumorzelllinien mit Rb-Verlust ein sehr niedriges Level von
Cyclin-D1 [Muller et al.1994] und Cyclin-D/CDK [Bates et al. 1994] aufweisen. Die-
ses spricht für eine selbstregulierende Beziehung zwischen Cyclin-D1 und pRb. Der
signifikante Zusammenhang zwischen der Cyclin D1-Expression und dem schlech-
teren Überleben in den Fällen, welche positiv für pRb waren, ist ebenfalls von be-
sonderer Bedeutung im Hinblick auf die komplexen Interaktionen zwischen Cyclin
D1 und Rb [MacIntosh et al. 1995].
Einige Studien haben die entgegengesetzte Beziehung der Expression von p16 und
pRb beschrieben [Otterson et al. 1994, Shapiro et al. 1995, Yeager et al. 1995, Ueki
et al. 1996], was auf die Existenz einer negativen Rückkopplung zwischen diesen
beiden Proteinen hinweisen könnte.
Auch einige andere zellzyklusassoziierte Proteine stehen im Zusammenhang mit
der pRb-Expression. So zeigt die p27-Expression eine deutliche Reduktion der Ex-
pression in der Abwesenheit von pRb [Gillett et al. 1999], für p53 wurde von Ander-
son et al. [1996] und Sawan et al. [1992] keine signifikante Beziehung zur Rb-
Expression gefunden, wohingegen von MacKay et al. [1988] eine Korrelation be-
schrieben wurde. Eine inverse Beziehung zur pRb-Expression zeigte die Protein-
expression von SOCS-2 (suppressor of cytokine signalling 2) [Farabegoli et
al.2005].
Neueren Studien weisen als weitere Einflußgröße nach, daß das Adhäsionsmolekül
CEACAM1 nicht nur an der Aufrechterhaltung normaler Zellarchitektur beteiligt ist,
sondern auch eine Rolle als Tumorsuppressor spielt. In der Arbeit von Bamberger et
al. [2001] korreliert eine hohe CEACAM1-Expression signifikant mit der Expression
4. Diskussion
66
von Rb-Protein. Dies zeigt die Möglichkeit einer Beziehung zwischen Zelladhäsi-
onsmolekülen und der Zellzyklusregulation, welche eine wichtige Rolle in der Ent-
stehung von Mammakarzinomen spielen könnte.
Landberg et al. [2001], welche die Herunterregulierung des potentiellen Tumorsup-
pressorgens IGFBP-rP1 untersuchten, fanden heraus, daß niedriges IGFBP-rP1
assoziiert ist mit einer pRb-Inaktivierung, schlechter Differenzierung, hohem Cyclin
E und fortgeschrittenem Stadium.
In einer Studie, welche den Mechanismus der Umwandlung von benigner Papillo-
matose zu ductalem Carcinom in situ (DCIS) in Beziehung zur Rb-Expression un-
tersuchte, fand man bei milder Papillomatose pRb in 85% (Rb mRNA 90%) der Fäl-
le, in 52% (mRNA 50,5%) bei schwerer Papillomatose und in den DCIS nur bei
22% (mRNA-Expression 20%) der Fälle. Das Rb-Protein könnte also möglicherwei-
se zum Screening von high-risk-Papillomatose genutzt werden und ein neues Ziel
der Gentherapie für präkanzeröse Läsionen der Brust sein [Niu et al., 2004].
Die pRb-Veränderungen in den malignen Tumoren der Brust sind somit sehr viel-
schichtig und noch lange nicht geklärt.
4.3 Multivariate Überlebensanalyse
Bei der multivariaten Analyse durch das Cox-Regressionsmodell waren für das Ge-
samtüberleben der Lymphknotenstatus, der Progesteronrezeptorstatus und die Tu-
morgröße von statistisch signifikanter Bedeutung.
In der Literatur finden sich ähnliche Resultate: Anderson et al. [1996] nehmen eben-
falls den LK-Status als Erstes auf, bei den Ergebnissen von Berns et al. [1995] und
Pietiläinen et al. [1995] wird die Tumorgröße zuerst aufgenommen. In einer Arbeit
von Donegan et al. [1997], welche die Ergebnisse von 13 Autoren zusammenfasst,
wird beschrieben, dass Lymphknotenstatus, Tumorgröße und Grading die Basis für
4. Diskussion
67
prognostische Aussagen bilden. Der Progesteronrezeptor wird ebenfalls als wichti-
ger Prognosefaktor gesehen [Somlo et al. 1997, Reiner et al. 1990]. Auch Clark et
al. [1983] bestätigte den Lymphknotenstatus und den Progesteronrezeptorstatus als
unabhängige Faktoren, die Tumorgröße wird jedoch nicht in das Regressionsmodell
aufgenommen.
Die Parameter des pRb konnten nicht als unabhängige Prognoseparameter be-
schrieben werden. Dies deckt sich mit den Angaben in der Literatur, wo pRb eben-
falls nicht als unabhängiger Parameter aufgenommen wurde [Pietiläinen et al. 1995,
Berns et al. 1995, Dublin et al. 1998, Anderson et al.1996, Yamashita et al. 1993].
Dementsprechend hat die immunhistochemische Analyse des Retinoblastompro-
teins wohl kaum eine Verwendung im klinischen Alltag der Pathologie, um die indi-
viduelle Prognose für Brustkrebspatientinnen zu bestimmen.
Im Hinblick auf die Vielschichtigkeit der Rb-Veränderungen und die zum Großteil
noch ungeklärten Faktoren der Zellzyklusregulation wird sich aber erst in Zukunft
herausstellen, inwieweit und für welche Art von Fällen eine Rb-Genprodukt-
Bestimmung im klinischen Einzelfall sinnvoll sein kann.
68
5. Zusammenfassung
Das Retinoblastomgen (Rb) ist der Prototyp der Tumorsuppressorgene und das
Genprodukt spielt eine wichtige Rolle für den Zellkontrollzyklus und die Differenzie-
rung der Zelle. Die prognostische Aussagekraft des immunhistochemisch bestimm-
ten Retinoblastomgenproteins (pRB) wurde an 101 Fällen von primären Mamma-
karzinomen mit der TNM-Klassifikation, der histomorphologischen Gradierung und
dem Progesteron- und Östrogenrezeptorstatus verglichen.
Zur Darstellung kam die Proteinexpression durch einen spezifischen monoklonalen
Antikörper mittels der Avidin-Biotin-Affinitätskonjugat-Methode. Die Auswertung der
gefärbten Mammakarzinomschnitte erfolgte mit Hilfe des Lichtmikroskopes durch
zwei unabhängige Untersucher.
Bei der statistischen Analyse wurde das Staging (pTNM = 0,0011, pT = 0,0238, pN
= 0,0008, pM = 0,0098) in seiner prognostischen Signifikanz bestätigt. Die Gültigkeit
für die etablierten Faktoren der Gradierung konnte ebenfalls gezeigt werden (p =
0,0045). Bei den Hormonrezeptoren erwies sich nur der Progesteronrezeptor als
statistisch signifikanter Parameter (p = 0,021). Bei der pRb-Expression in den Zell-
kernen, sowohl als Prozentsatz positiver Zellen quantifizierbar, als auch in die ver-
schiedenen Färbeintensitäten einteilbar, konnte kein signifikanter Zusammenhang
zu dem Gesamtüberleben festgestellt werden. Folglich ergaben sich auch keine
Korrelationen mit dem immunreaktiven Score. Die Beziehung zwischen RbPP und
dem Grading erwies sich als signifikant (p = 0,0275). Zu den anderen klinischen
Routineparametern zeigte sich kein signifikanter Zusammenhang.
In der multivariaten Analyse durch das Cox-Regressionsmodell wurden der Lymph-
knotenstatus (p = 0,0002), der Progesteronrezeptorstatus (p = 0,0076) und die Tu-
morgröße (p = 0,0110) als unabhängige Prognosefaktoren in das Modell aufge-
nommen. Die Parameter des Retinoblastomgenproteins konnten nicht als unabhän-
gige Faktoren aufgenommen werden.
5. Zusammenfassung
69
Zusammenfassend ist zwar, eine schwache Beziehung zwischen der Zellproliferati-
on, der histologischen Differenzierung und der Expression von pRb vorhanden, al-
lerdings spiegelt sich dieser Zusammenhang nicht in dem Überleben der Patientin-
nen wider, so dass zur Zeit pRb nicht als wesentlicher Prognosefaktor des Mamma-
karzinoms empfohlen werden kann.
70
6. Technischer Anhang
Silanisieren von Objektträgern:
1. Einstellen der Objektträger in Aceton für 5 Minuten
2. Trocknen der Objektträger im Brutschrank bei 60 °C
3. Einstellen der Objektträger in einer 10%igen Mischung von 3-Trieth-
oxysilpropylamid in Aceton für 5 Minuten
4. zweimaliges Spülen der Objektträger in Aceton für 3 Minuten
5. Einstellen der Objektträger in Aqua dest. für 2 Minuten
6. Trocknen der Objektträger im Brutschrank bei 60 °C
Inkubation in Xylol / Absteigende Alkoholreihe: Durch die Inkubation in Xylol
werden die Schnitte entparaffiniert, durch die absteigende Alkoholreihe werden sie
rehydriert.
1. 2 x Xylol für je 5 Minuten
2. 2 x 100 %iger Alkohol (kurz)
3. 2 x 96 %iger Alkohol (kurz)
4. 1 x 70 %iger Alkohol (kurz)
5. 1 x 50 %iger Alkohol (kurz)
6. Spülen mit Aqua dest.
Primärer Antikörper: Retinoblastomgenprotein-Anikörper (IgG1), monoklonal
(Klon:G3-245) von DPC Biermann, Naunheim
Sekundärer Antikörper: Biotinylierter Pferd-anti-Maus-Antikörper (IgG), Fa. Vector
Laboratories, Inc. Burlingame, CA
6. Technischer Anhang
71
Rezept für PBS 0,15 M:
8,00 g NaCl, 0,20 g KCl, 1,16 g Na2HPO4, 0,20 g KH2PO4 ad 1000 ml aqua dest.,
auf pH 7,6 titrieren
Rezept für TBS:
53 g NaCl und 12 g Tris ad 1000 ml aqua dest.
Zum Gebrauch 1:10 verdünnen und auf pH 7,4 einstellen
Weitere verwendete Reagenzien:
- Pferde-Normalserum, Fa.Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA
- ABC Elite Kit Peroxidase, Fa.Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA
- Poly-L-Lysin, Sigma Diagnostics, St. Louis, USA
- Magermilchpulver, Fa. Libbys o.ä.
72
7. Datensammlung
Tabelle 7.1: Auflistung von Alter, Menopausenstatus und Staging
Pat.-Nr. Alter Meno pTNM pT pN M
1 47 2 2 2 0 0
2 51 2 3 3 1 0
3 35 1 2 2 0 0
4 38 1 2 2 1 0
6 56 3 4 3 1 1
7 32 2 2 2 1 0
8 33 1 1 1 0 0
9 41 1 2 2 0 0
10 50 3 1 1 0 0
11 41 1 2 2 0 0
12 53 2 1 1 0 0
13 54 3 1 1 0 0
14 55 3 3 3 1 0
15 55 3 2 2 0 0
17 55 3 2 2 1 0
19 64 4 2 2 0 0
20 66 4 2 2 1 0
21 65 4 2 2 0 0
22 66 4 2 1 1 0
23 63 4 1 1 0 0
24 49 2 2 2 0 0
25 51 3 2 2 0 0
26 62 4 2 2 0 0
27 53 3 3 3 1 0
7. Datensammlung
73
Pat.-Nr. Alter Meno pTNM pT pN M
28 34 1 2 2 1 0
31 73 4 2 2 1 0
32 34 1 2 2 0 0
33 54 3 4 3 1 1
34 54 3 2 2 1 0
35 85 4 2 2 1 0
36 58 3 2 2 0 0
37 32 1 2 2 1 0
38 95 4 2 2 0 0
39 65 4 2 2 1 0
40 41 1 3 3 1 0
41 52 3 2 3 0 0
42 39 1 2 2 1 0
43 54 3 2 2 0 0
45 71 4 2 2 0 0
47 74 4 2 1 1 0
49 68 4 1 1 0 0
50 67 4 2 2 0 0
52 63 4 2 2 0 0
53 73 4 1 1 0 0
54 74 4 2 2 0 0
55 66 4 2 2 0 0
56 85 4 2 2 0 0
58 90 4 4 4 0 1
59 54 3 2 3 0 0
60 59 4 3 4 0 0
62 81 4 4 2 0 1
63 54 3 2 2 1 0
7. Datensammlung
74
Pat.-Nr. Alter Meno pTNM pT pN M
64 82 4 1 1 0 0
65 64 4 2 2 1 0
66 63 4 2 2 1 0
67 46 1 2 2 0 0
68 89 4 3 4 0 0
69 66 4 4 4 0 1
71 81 4 2 2 1 0
73 50 2 3 3 1 0
74 45 2 2 2 1 0
75 62 4 2 2 1 0
76 52 3 2 3 0 0
77 80 4 2 2 1 0
78 78 4 3 4 1 0
80 53 3 2 1 1 0
81 56 3 2 2 1 0
82 74 4 4 1
86 83 4 4 1 1
87 45 1 2 2 0 0
88 38 1 3 3 1 0
89 61 4 4 3 1 1
90 55 3 2 2 1 0
91 58 3 2 2 1 0
93 58 3 3 3 1 0
95 54 4 2 2 1 0
96 53 3 1 1 0 0
97 72 4 2 2 1 0
100 49 3 3 3 1 0
101 51 3 2 2 1 0
7. Datensammlung
75
Pat.-Nr. Alter Meno pTNM pT pN M
102 51 3 2 2 0 0
104 53 1 2 2 1 0
105 76 4 2 2 1 0
106 65 4 2 2 0 0
110 53 2 2 3 0 0
111 59 4 3 3 1 0
112 45 1 2 2 1 0
114 82 4 2 2 0 0
115 74 4 2 1 1 0
116 51 1 3 4 1 0
118 38 1 2 2 0 0
119 57 3 4 3 1 1
121 64 4 2 2 1 0
122 54 3 1 1 0 0
123 69 4 2 2 1 0
124 75 4 2 2 0 0
126 66 4 2 2 0 0
127 63 3 2 2 0 0
128 44 1 2 2 1 0
130 35 1 2 2 1 0
131 77 4 1 1 0 0
7. Datensammlung
76
Erläuterungen zu Tabelle 7.1:
• Pat.-Nr: Patientennummer, geordnet nach dem Zeitpunkt der Diagnosestel-
lung
• Alter: Alter der Patientinnen bei Diagnosestellung
• Meno: 1 = normal, 2 = prä-, 3 = postmenopausal, 4 = Senium
• pTNM: postoperatives TNM-Stadium
• pT: postoperative Tumorgröße
• pN: postoperatives Lymphknotenstadium
• M: Stadium der Fernmetastasierung: 0 = keine Fernmetastasierung, 1 =
Fernmetastasierung
7. Datensammlung
77
Tabelle 7.2: Auflistung von Grading, Hormonrezeptorstatus und Rb-Protein Ergeb-
nissen
Nr. TD KP MIT Grad ER PR Rb PP Rb SI Rb
IRS
1 3 3 3 3 1 0 1 2 2
2 3 3 3 3 0 0 1 3 3
3 1 3 2 2 0 0 2 2 4
4 3 3 2 3 1 1 2 2 4
6 3 3 2 3 1 0 0 0 0
7 2 1 1 1 1 1 2 3 6
8 2 2 2 2 1 1 1 1 1
9 2 2 2 2 1 1 1 2 2
10 1 2 1 1 1 0 2 1 2
11 2 1 1 1 1 1 2 2 4
12 2 3 1 2 0 0 2 1 2
13 2 2 2 1 0 2 2 4
14 3 3 2 3 1 1 1 2 2
15 2 3 3 3 1 1 2 3 6
17 3 2 1 2 1 1 2 3 6
19 2 1 2 1 1 2 3 6
20 2 3 1 2 1 1 2 2 4
21 3 2 1 2 1 1 1 2 2
22 3 2 2 2 1 0 2 2 4
23 1 1 1 1 2 2
24 3 3 2 3 0 0 1 2 2
25 3 2 3 3 0 0 3 3 9
26 2 3 1 2 1 1 1 2 2
27 3 3 2 3 0 0 2 2 4
7. Datensammlung
78
Nr. TD KP MIT Grad ER PR Rb PP Rb SI Rb
IRS
28 3 3 3 3 1 1 3 3 9
31 3 3 2 3 1 0 0 0 0
32 1 1 1 1 1 1 2 2
33 3 3 2 3 1 1 1 2 2
34 3 3 2 3 1 1 3 3 9
35 3 1 1 1 1 1 3 3 9
36 2 2 2 1 1 0 1 2 2
37 3 3 2 1 1 1 2 3 6
38 3 3 3 3 0 0 1 3 3
39 3 1 3 1 0 2 2 4
40 3 3 1 2 1 1 1 1 1
41 1 1 2 1 1 0 2 3 6
42 3 3 3 3 0 0 2 2 4
43 3 2 1 2 1 1 1 1 1
45 2 3 2 3 1 1 3 3 9
47 3 3 3 3 1 1 1 1 1
49 3 2 1 2 0 0 1 2 2
50 2 3 1 2 1 0 1 2 2
52 3 1 0 0 0 0
53 3 2 1 2 1 0 2 2 4
54 3 2 1 2 1 1 1 2 2
55 3 3 2 3 1 1 1 1 1
56 2 1 1 1 2 2
58 3 3 3 3 1 1 1 2 2
59 2 3 1 2 1 1 1 2 2
60 3 3 2 3 1 0 1 2 2
62 3 2 1 2 0 0 1 2 2
7. Datensammlung
79
Nr. TD KP MIT Grad ER PR Rb PP Rb SI Rb
IRS
63 3 3 1 2 0 0 1 1 1
64 3 2 1 2 0 1 2 2 4
65 3 2 2 2 1 0 2 2 4
66 3 3 1 2 1 0 1 2 2
67 2 2 1 1 1 1 2 2 4
68 2 2 2 2 1 0 1 2 2
69 3 2 3 3 1 0 1 1 1
71 2 3 2 2 0 0 1 2 2
73 3 2 2 2 1 1 1 2 2
74 3 3 3 3 0 0 3 3 9
75 2 1 1 1 1 0 1 1 1
76 3 3 1 2 1 0 1 2 2
77 2 1 1 1 1 1
78 3 3 2 3 1 1 1 1 1
80 3 3 2 3 1 0 2 2 4
81 2 3 3 1 1 1 2 2
82 3 1 3 1 1 1 2 2
86 1 1 1 2 2
87 2 1 1 1 0 1 0 0 0
88 3 3 3 3 1 0 1 2 2
89 3 2 1 2 1 0 2 2 4
90 3 2 1 2 1 0 2 3 6
91 2 3 3 3 0 0 4 3 12
93 3 3 3 3 0 0 3 3 9
95 3 3 2 3 0 0 1 3 3
96 3 3 2 3 0 0 2 3 6
97 3 2 1 2 1 1 1 2 2
7. Datensammlung
80
Nr. TD KP MIT Grad ER PR Rb PP Rb SI Rb
IRS
100 2 3 2 2 1 1 2 3 6
101 2 1 0 2 2 4
102 3 3 1 2 1 0 3 3 9
104 2 2 1 1 1 1 1 3 3
105 3 2 2 2 1 1 2 3 6
106 3 3 3 3 0 1 3 3 9
110 3 2 1 2 1 1 2 2 4
111 2 2 1 1 1 1 4 2 8
112 2 2 2 2 1 1 2 2 4
114 2 2 1 1 1 1 2 3 6
115 2 3 3 3 0 0 1 2 2
116 3 2 1 2 1 1 1 1 1
118 1 3 1 1 0 0 1 2 2
119 2 3 2 2 1 1 1 2 2
121 3 3 2 3 1 1 1 2 2
122 2 1 1 1 0 0 0 0
123 3 3 1 2 1 1 1 1 1
124 3 2 3 3 0 0 1 2 2
126 3 2 1 2 1 1 2 2 4
127 3 2 1 2 1 1 2 2 4
128 3 2 1 2 1 1 1 1 1
130 3 3 1 2 0 0 1 1 1
131 2 2 2 2 0 0 1 1 1
7. Datensammlung
81
Erläuterungen zu Tabelle 7.2:
• Nr.: Patientennummer, geordnet nach dem Zeitpunkt der Diagnosestellung
• TD: Angaben zur tubulären Differenzierung
• KP: Angaben zur Kernpleomorphie
• MIT: Angaben zur Mitoserate
• Grad: Angaben zur histomorphologischen Gradierung
• ER: biochemischer Rezeptorstatus: 0 = negativ, 1 = positiv
• PR: biochemischer Rezeptorstatus: 0 = negativ, 1 = positiv
• Rb PP: Semiquantitativ bestimmter Prozentsatz Rb-positiver Zellen
• Rb SI: Semiquantitativ bestimmte Färbeintensität Rb-positiver Zellen
• Rb IRS: Immunreaktiver Score; Produkt von Rb-PP und Rb-SI
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9. Danksagungen Vielen Dank an alle, die mir meine Arbeit ermöglicht und erleichtert haben:
Herrn Prof. Dr. med. Stefan Biesterfeld für die gute Betreuung der Arbeit auch über
weitere Distanzen hinaus, so dass außer den fachlichen Fragen auch noch das leib-
liche Wohl berücksichtigt wurde.
Herrn Prof. Dr. med. Ch. Mittermeyer für die Bereitstellung der Räumlichkeiten und
Mittel.
Frau Inge Losen für ihre Hilfe bei der Erstellung der Präparate und beim Erlernen
der immunhistochemischen Färbemethode.
Meinem Mann Robert für die Unterstützung bei den Hindernissen durch den Com-
puter.
Meinen Eltern für die mentale Unterstützung und das Korrekturlesen.
Meinem Sohn Karl, der mir durch die Schwangerschaft genügend Zeit und Muße für
die Fertigstellung der Arbeit verschafft hat.
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10. Lebenslauf Persönliche Daten
Nele Fischer, geb. Mundt Geb. am 28.12.1975 in Hamburg Verheiratet, ein Sohn (Karl, geb. 2003) Evangelisch-lutherisch
Schulbildung
1982-1986 Grundschule in Oslo (Norwegen), Essen (NRW) und Lachendorf (NS) 1986-1987 Orientierungsstufe in Lachendorf 1987-1993 Gymnasium St-Josef-Schule in Jülich (NRW) 1993-1995 Johannes-Althusius-Gymnasium in Emden (NS)
Abitur Juni 1995 Freiwilliges Soziales Jahr
09/95-08/96 Paracelsusklinik in Neuss (NRW) Studium
10/1996 Studienbeginn Humanmedizin an der RWTH-Aachen 08/1999 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 08/2001 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 10/01-09/02 Praktisches Jahr im St.-Antonius-Hospital in Eschweiler 11/2002 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Berufliche Tätigkeit
Seit 1/2004 Ärztin im Praktikum/Assistenzärztin Anästhesie
St.-Antonius-Hospital Eschweiler
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