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Post on 18-Sep-2018
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Gliederung
•Methodische Grundlagen der DNA/RNA-Analytik
•Anwendungen der molekularen Diagnostik:
Assoziation von DNA-Polymorphismen mit Krankheiten oder Krankheitsrisiken
Pharmakogenetik
Tumordiagnostik auf Grundlage von molekularbiologischen Methoden
Untersuchung von DNA
•Southern-Blot•Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-PCR Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung
Sreeningmethoden für Punktmutationen„Single-Strand Conformation Polymorphism PCR“
•DNA-Sequenzierung
Southern Blot: AnwendungenBsp: Sichelzellanämie
RestriktionsenzymMst II..CCTNAGG..
β-Globingen..CCTGAGG..
Mutation..CCTGTGG..
PolymerasePolymerase Chain Chain ReactionReaction (PCR)(PCR)
1111
cyclecycle 11 cyclecycle 22
94°C∼1min 72°C
∼1min
55°C∼1min
94°C∼1min 72°C
∼1min
55°C∼1min
denaturationdenaturation annealingannealing elongationelongation
11
22
11
22
11
22
11
2211
2222
11
22
22
DNA-Template, Primer (sense, antisense)Nukleotide, Puffer, Mg2+, thermostabile DNA-Polymerase
Temperaturen und Zeiten beispielhaft
Bedeutung der Effizienz
N = N0 x En
Effizienz der Reaktion wichtig (oft 70-80%): 80% Effizienz bedeutet etwa 4% der theoretischen Ausbeute
Protein-Polymorphismus in einer Population
Ursache: Akkumulation verschiedener Mutationen (Genpolymorphismen) im Genpool einer Population
Die Phänotyp-Verteilung in einer Population hängt von der Art der zugrunde liegenden Mutation ab
SNP: „single nucleotide polymorphisms“
Ermittlung eines Genotypsdurch die Analyse einer
bekannten Mutation
•RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus)-PCR(Häufigkeit des Einsatzes etwa 25%)
•Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung(Häufigkeit des Einsatzes etwa 50%)
Genchip-Analyse zur gleichzeitigen Erfassungvieler unterschiedlicher Mutationenkommerziell bedingt erhältlich (z.B. CYP450-Array
mit 33 versch. Mutationen)
RFLP-PCRErmittlung der Punktmutation (C/T) bei Nukleotid 677 im MTHFR-Gen
(Methylentetrahydrofolsäure-Reduktase)Bedeutung für den VitB12/Folsäure-Stoffwechsel
(Artheroskleroserisiko über Einfluss auf Homocystein-Konzentration im Serum)
100200300
MN N N N N HO HE NHE
bp
•Amplifikation des DNA Bereiches•DNA-Fragment von 198 bp•Verdauung der DNA mit Hinf I
•Wildtyp: 198 bp•Homozyg. Mutation: 175 bp•Heterozyg. Mutation: 175+198 bp
Real-Time-PCRFluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)
zwischen Hybridisierungssonden
•Methode geeignet zur Quantifizierung von PCR-ProduktenMessung eines zunehmenden Fluoreszenzsignals während der laufenden PCR. Beginn des Signalanstiegs ist das Maß für die Ausgangskonzentration des betreffenden DNA-Bereiches.
•Methode geeignet zur MutationsanalyseNach der abgeschlossenen PCR wird das Schmelzverhalten der FRET-Sonden geprüft. Mutation und Wildtyp haben aufgrund von Basen-Fehlpaarungen verschiedene Schmelzpunkte.
Genotypisierung mittels Schmelzkurvenanalyse
Schmelzkurve45 –75 °C
Ableitung-d[Fluoreszenz]/dT
WTHE
HO
WT
HE
HO
Im Beispiel:FRET-Sonden haben eine 100%ige Übereinstimmung mit der Wildtyp-Sequenz
Aufspüren einer bislangunbekannten Mutation
•SSCP-PCR(single strand conformation polymorphism)
•DNA-Sequenzierung
Schema der SSCP-Analyse
Sequenzabhängigunterschiedliche Ausprägung von einzelsträngigenKonformationen der DNA
Geeignet als Screening-Methode, aberkeine sichere Methode zum Auffinden von Sequenzunterschieden
Bestätigung von Variationen mittels DNA-Sequenzierung
Genotypisierung mittels Sequenzierung der betroffenen Genregion
Nukleotid 677 imMTHFR-Gen
Einbau von Didesoxynukleotiden (ddNTP) in 4 getrennten Reaktionen,Statistisch verteilte Strangabbrüche, Fragmente elektroph. getrennt,Einbau eines 32P- dNTP (dATP) Autoradiographie
Enzymatische Reaktion (DNA-Polymerase):
Automatisierte DNA-Sequenzierung
Diodenlaserzur Detektion
eines Fluoreszenz-Labels
einer automatisiertenDNA-Sequenzierung
mit Online-Übertragung der Sequenzdaten
Automatisierte DNA-Sequenzierung
Detektion einer Heterozygotie durchIdentifikation von charakteristischen Doppelbanden
Nachweis (und Quantifizierung) von RNA
•Hybridisierungsverfahren (semiquantitativ)Northern-Blot
•Amplifikationsverfahren (qualitatitv-quantitativ)Reverse Transkription (RT)-PCR
Isolierung von RNA Synthese einer cDNA (enzymatische Erststrangsynthese mittels reverser Transkriptase)
Durchführung einer (real time) PCR
Increasing role of genotype at other loci
Incr
easi
ngro
leof
env
ironm
ent
and
stoc
hast
icfa
ctor
s
•Tay Sachs•Duchenne dystrophy
•Huntington disease•Cystic fibrosis
•Sickle-cell anemia
•G6PD deficiency•Hemochromatosis
•Acute intermittent porphyria
• α1-Antitrypsin ZZ
•Phenylketonuria
•Apo E-2/E-2 hyperlipoproteinämie
•Type I diabetes mellitus
Assoziation von DNA-Polymorphismen mit Krankheiten oder Krankheitsrisiken
• Alpha-1-Antitrypsin
• Angiotensin converting enzyme (ACE)
• Apolipoprotein B100
• Apolipoprotein E
• Faktor II-Leiden (Prothrombin)
• Faktor V-Leiden
• HFE (HLA-H)
• HLA (Klasse I und Klasse II, zur Typisierung)
• Laktase (Laktosetoleranzstörung)
• MTHFR
• Mukoviszidose
• UDP-Glucuronosyltransferase (Gilbert-Meulengracht)
Häufig untersuchte Gene (Beispiele)
Angiotensin-converting enzyme (ACE)
Insertions (I) / Deletions (D) –Polymorphismus im ACE-Gen
0 20 40 60 80 100 U/l
Häu
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it
0
2
4
6
8
10
12
DD
ID
II
Klinische Bedeutung:Labordiagnostik der Sarkoidose:S-ACE als Surrogatmarker erhöht(Polymorphismus beeinflusst Serumkonz.)
Gendefekt: Risikofaktor kardiovaskulärer Erkrankungen??
Referenzintervalle (Genotyp-abhängig)
ACE Genotyp DD (ca. 25%) 24-89 U/lACE Genotyp DI (ca. 50%) 13-66 U/lACE Genotyp II (ca. 25%) 7-33 U/l
α1-Antitrypsinmangelα1-Antitrypsin: Akute-Phase-Protein aus Hepatozyten,
Aktivitätshemmung von Serinproteasen(PMN-Elastase)>40 AlleleWildtyp (PiM), Mangelallele: 7% PrävalenzWichtige klinisch relevante Mangelallele:PiZ, PiS, PiNullRisiko korreliert mit vermind. Antitryp.-Konz.high risk: PiZZ, PiZNull, PiNullNullincreased risk : PiSZ
Erkrankungen der Leber (Kindesalter): Sekretionsstörung in Hepatozyten bei PiZZ
Lungenemphysem (Erwachsenenalter):Folge einer nicht inhibierten PMN-Elastase-Aktivität
Hereditäre Hämochromatose (HH)Prävalenz in Mitteleuropa: 1:400, häufigste autos. rez. Erbkrankheit
Manifestationsalter: 40-60 Jahre, Hepatomegalie, Leberzirrhose, D. mellitus, dunkle Hautpigmentierung
Mutationen im HFE-Gen (Typ 1-Hämochromatose)Cys 282Tyr (C282Y) homozygot bei ca. 85-95% der HH-Patienten, Compound-Heterozygotie mit His63Asp (H63D) bei 3-8% der HH-Patienten (Prävalenz dieses H63D-Polymorphismus: 13%)
Typ 2-Hämochromatose (Hepcidin, Hämojuvelin): seltene juvenile Form, vor 30. Lebensjahr manifest, geht mitschwerer Kardiomyopathie und Hypogonadismus einher.
Typ 3: (Transferrinrezeptor 2)Typ 4: (basolateraler Eisencarrier Ferroportin 1)
Diagnoseweg bei V.a. hereditäre Hämochromatose
Klinische Hinweise und Transferrinsättigung >60% und S-Ferritin >250-300 ng/l
Gen-Test: Cys282Tyr-Mutation, gegebenenfalls His63Glu_ +
Gentest negativ, aber klin. Verdacht,bzw. zur Bestimmung des Ausmaßes
des Leberschadens
Hämochromatose gesichert
Leberbiopsie mit quantitativer Messungdes Lebereisengehaltes
Aderlasstherapie+
FettstoffwechselLipoproteinstoffwechsel maßgeblich durch Zelloberflächenrezeptoren mitbestimmt
LDL-Rezeptor bindet neben ApoB100 auch Apo E Funktion: Regulation der Cholesterinkonzentration
Cholesterinlieferung für zell. Bedarf, Hormonsynthese
Familiäre Hypercholesterinämie:LDL-Rez.defekte: >100 bislang bekannte Mutationen
(DNA-Sequenzierung)
ApoB100: häufigste Mutation: G10699A (Arg3500Gln)Frequenz: 1 auf 700 Kaukasierbei Heterozygotie erhöhtes S-LDL-Cholesterin,gestörte Bindung an LDL-Rezeptor,Risiko kardiovaskulärer Erkrankungen
FettstoffwechselHyperlipoproteinämie Typ III:
ApoE: ApoE2-Homozygotie ist Voraussetzung zur Ausprägung dieser Fettstoffwechselstörung
Aber: Nur ein kleiner Teil der Homozygoten erkrankt!!!Ansonsten korreliert das Allel E2 mit niedrigeren Cholesterinspiegeln.
ApoE-Allele: E2, E3 und E4 durch Mutat. C112R und R158CIsoformen: E2/2 (1%), E3/3(55%), E4/4, E2/3, E2/4, E3/4 (26%)
Rezeptorbindung E2 bindet nicht , Aktivierung des hepat. LDL-RezeptorsE4-Partikel bewirken das Gegenteil, E4 ist somit potentiell artherogen, E2 protektiv
Assoziation mit M. Alzheimer für E4
ThrombophiliediagnostikStudien gerade bei jungen Thrombophilie-patienten ergaben eine Korrelation von verschiedenen genetischen Polymorphismen vor allem in zwei Genen von Faktoren des Gerinnungssystems : Faktor V (G1691A) Prothrombin (Faktor II, G20210A)
Außerdem konnte eine Korrelation mit einem Polymorphismus (thermolabiles Enzym) der Methylentetrahydrofolsäurereduktase(MTHFR; C611T) gezeigt werden.
ThrombophiliediagnostikFaktor V: G1691A (Arg506Gln), autosom. dominant
(nach Entdeckungsort Faktor V/Leiden genannt)Effekt : verlangsamte Spaltung durch aktiviertes Protein C (APC-Resistenz)Prävalenz: 1:20 für heterozygoten Defekt
Weitverbreitester Risikofaktor für venöse ThrombosenHeterozygotie: ca. fünf- bis zehnfache Erhöhung des Thromboserisikos gegenüber der Normalbevölkerung
Homozygotie: Risiko ca. 100fach erhöht
Weitere Risikofaktoren (z.B. Kombinationsdefekte, Nikotinkonsum, Einnahme oraler Kontrazeptiva) können das Thromboserisiko zusätzlich erheblich erhöhen.
(zusätzlich Ausschluss von Prothrombin-Genmutation, Antithrombin III-, Protein C-, Protein S-Mangel).
PharmakogenetikBeschäftigt sich mit den hereditären Grundlagen der Unterschiede in einer Population bezüglich dem Response auf ein Arzneimittel.
DNA-Sequenzen variieren leicht von Individuum zu Individuum
zahlreiche Polymorphismen
Genetische und damit häufig auch Unterschiede in Proteinzusammen-setzungen verursachen daher bei gleicher Medikation verschiedene systemische Konzentrationsniveaus.
Insgesamt abhängig vonAufnahme, Absorption, Metabolismus (Phase I und Phase II Biotransformations-reaktionen), Clearance und Exkretion
PharmakogenetikEnzym Häufigkeit Medikamente ProblemeCytochrom P450CYP2D6 3-10% viele (Antidepressiva Meist verstärkte CYP2C19 2-5% Neuroleptika, Beta-Blocker.....) WirkungCYP1A2 12%
N-ActeyltransferaseNAT2 50% Isoniazid, Sulfapyridin Überempfindlich-
Dapson, Koffein, Hydralazin keitsreaktionenThiopurinmethyltransf.TPMT 0,3% Azathioprin, Mercaptopurin Leukopenie
Dihydropyrimidin-Dehydr. 5% (Het.) 5-Fluoruracil verstärkte Wirkung(DPD, DPYD)
Glukose-6-Phos.-Dehydr. 1% Sulfonamide, Primaquin Hämolyse
Serum-Cholinesterase 0,04% Succinylcholin Apnoe
Ca-Transport im ER 0,005% Inhalationsanästhetika Maligne Hyperthermie
Siehe MHH-Homepage/MHH-Internes/ CYP P450 Tabelle sowie Einrichtungen/Klinische Chemie/ Analysenspektrum/Pharmakogenetik/
Sinn dieser Analysen abh. von klin. Bedeutung + Durchführbarkeit.
Bsp: Die Cytochrom P450-Genfamilie (CYP) umfasst eine Vielzahl von Isoenzymen, die für die Verstoffwechslung diverser Substanzen verantwortlich sind.CYP 2D6: Von diesem Isoenzym (Debrisoquin-Hydroxylase) sind eine Reihe von Allelen bekannt, die zu einem Verlust der Enzymaktivität führen [CYP2D6*1 (Wildtyp)] („extensive (rapid) Metabolizer“).
CYP2D6*3, *4, *5, *6 („poor (slow) Metabolizer (PM)“) sind in 98% aller Fälle an einem Verlust der CYP2D6-Aktivität beteiligt. Zwei Mangelallelemüssen allerdings nachgewiesen werden.
CYP2D6*2 („intermediate Metabolizer“) in Verbindung mit einem Poor-Metabolizer-Allel. Genduplikationen führen zu „Ultrafast Metabolizer“.
Betroffene Pharmaka: Antidepressiva (z.B. Amitriptylin), Neuroleptika (z.B. Haloperidol), Antiarrhythmika (z.B. Propafenon)
Pharmakogenetik: z.B. CYP 2D6
Pharmakogenetik: z.B. CYP 2D6
UM: ultrafast metabolizerEM: extensive metabolizerIM: intermediate metabolizerPM: poor metabolizer
Pharmakogenetik: z.B. CYP 2D6
3025N =polymorphismnon-polymorphism
inpa
tient
trea
tmen
t day
s
200
150
100
50
0
45
40
5
CYP-abhängige Schwierigkeiten bei der medikamentösen Therapie psychiatrischer Patienten spiegeln sich sogar in der stationären Behandlungsdauer wider.
Höhere BehandlungskostenEM PM/IM
Mutationsnachweise in der molekulargenetischen Tumordiagnostik
•Keimbahnmutationen
•somatische Mutationen
TumordiagnostikNachweis von Keimbahn-Mutationen
Familiäre Disposition bei Krebserkrankungen:Hereditäre Tumoren: ca. 2% aller Krebserkrankungen
Hinweise auf erbliche Disposition für Tumoren:
FamilieZwei oder mehr Verwandte ersten Grades mit demselben TumorZwei oder mehr Verwandte mit seltenen TumorenEvtl. drei oder mehr Tumoren in typischer Assoziation (z.B. Mamma und Ovar)
PatientMultiple Tumoren in einem Organ oder in typischer AssoziationAssoziation von Tumoren mit anderen genetischen Auffälligkeiten oder kongenitalen DefektenTumoren an ungewöhnlichem Ort oder in frühen Lebensjahren
TumordiagnostikNachweis von Keimbahn-Mutationen
Erkrankung GenFam. Retinoblastom rbFam adenomatöse Polyposis (FAP) apcHeredit. kolorektale Karzinome o. Polyposis mlh 1Fam. Brust-/Ovarialkrebs brca 1Fam. Brustkrebs brca 2Li Fraumeni Syndrom p53Multiple endokrine Neoplasie (MEN) Typ1 men 1 (menin)Fam. Medulläres SchilddrüsenkarzinomMEN Typ 2A und 2B retFam. Melanom p16Neurofibromatose Typ 1 nfl 1Neurofibromatose Typ 2 nfl 2Gorlin Sydrom, Basalzellkarzinom ptchVon Hippel-Lindau Syndrom vhlFam. Wilms-Tumor wt 1
TumordiagnostikNachweis von Keimbahn-Mutationen
Diagnostische und präventive Maßnahmen, die den Nachweis einer genetischen Tumordisposition rechtfertigen:
Maßnahme Beispiele
Präventive Diagnostik Koloskopie bei HNPCC und FAP
Vermeidung invasiver diagnost. Ausschluss eines Risikos bei Maßnahmen bei Ausschluss einer Mitgliedern von HNPCC- und FAP-disponierenden Mutation Familien
Präventive therapeutische Maßnahmen Thyreodetektomie bei Patienten aus MEN Typ II-Familien
HNPCC: Hereditäres nicht-polypöses kolorektales KarzinomFAP: Familiäre adenomatöse Polyposis ColiMEN: Multiple endokrine Neoplasie
Tumordiagnostik IINachweis von somatischen Mutationen
Genetische Instabilität in malignen Tumoren:
Entweder kausal für Tumorgenese verantwortlich,und/oder für Tumorprogression verantwortlich!
Wichtige Gene: p53, k-ras
Mutationsanalyse zur Früherkennung von Tumoren.Tumorzellnachweise in Körperflüssigkeiten und Stuhl.
Problem: Vielzahl möglicher Mutationen, Nachweis eines mutierten Allels unter einem Überschuss von Wildtyp-Allelen.
Tumoren: z.B. Kolon-Karzinom, Pankreas-Karzinom
Tumordiagnostik IINachweis von somatischen Mutationen
p53Am häufigsten mutiertes Tumorgen (Tumorsuppressorgenkodiert für Transkriptionsfaktor). Mutationen (meist Punkt-mutationen/missense) fast ausschließlich im Bereich der DNA-bindenden Domäne (Exone 4-8).
Mutiertes P53-Protein häufig mit verlängerter Halbwertszeit,immunhistochemisch im Tumorgewebe nachweisbar.
Mutationen bzw. zelluläre Akkumulationen korrelieren mit geringerer Überlebenszeit des Patienten. (z.B. Mamma-Ca: unabhängiger prognostischer Parameter)
Tumordiagnostik IIINachweis von somatischen Translokationen
(Tumorgene an Bruchstellen von Chromosomen)
Aus technischen Gründen Nachweis von Chromosomenanomalien in Tumoren hämatopoetischer Zellen leichter. Große Mehrzahl bisher gesicherter Chromosomenanomalien bei Leukämien und Lymphomen.
Gen Rearrangement ErkrankungRearrangements, kodierende Sequenz exprimiert und nicht verändertBCL2 t(14;18)(q32;q21) follikuläres Lymphom
Rearrangements, HybridgeneBCR-ABL t(9;22) (q34;q11) CML, B-ALLPhiladelphia-Chromosom zytogenetisch bei bis zu 90% der CML nachweisbar!!!
Nachweis mittels PCR /RT-PCR mit Primern von beiden Seiten der chromosomalen Bruchstelle.
Tumordiagnostik IVNachweis/Quantifizierung zirkulierender Tumorzellen
Nachweis residualer Tumorzellen im peripheren Blut, Knochenmark oder Blutprodukten über Marker (Transkripte, Methylierungsgrad der DNA), welche nicht in hämatopoetischenZellen vorhanden sind.Target: meist Gene klassischer Tumormarker: z.B.
AFP alpha-FetoproteinPSA Prostataspezifisches AntigenCK19 Zytokeratin 19Nachweis mittels RT-PCR o. quantitativer RT-PCRNachweisgrenzen: ca. 1 Tumorzelle unter 106 Zellen
Methylierungsgrad der DNA: (neuerer Trend). DNA von Tumoren ist häufig (spez. in Promorbereichen) hypermethyliert (C 5mC).Nachweis des Methylierungsgrades von ausgewählten Indikatorgenenzum sensitiven Nachweis einer Metastasenbildung.
Experimentelle Doktorarbeit Gemeinschaftsprojekt der Abt. Gastroenterologie und der Klinischen Chemie
Matrixdegradation bei chronischen Lebererkrankungen
Funktionelle Rolle des MMP/TIMP-Systems für die hepatische Regeneration und die Entwicklung chronischer Organschäden an der Leber. Adenovirale hepatischeÜberexpression von MMPs im Mausmodel.Techniken:Immunoassays, Western-Blot in situ-Techniken, (quantitative) RT-PCR, PCR, Genexpression, Genotypanalyse, rekombinante Proteinherstellung in prokaryonten und viralen Expressions-systemen, molecular cloning
Kontakt: Prof. Dr. Ralf Lichtinghagen Tel: 3940; Pieper: 74-2272
Voraussetzungen: Molekularbiologische Vorkenntnisse nicht hinderlich,Teamfähigkeit, Interesse am wissenschaftl. ArbeitenDauer der Labortätigkeit: ca. 1 JahrNovember 2005
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