optimierung der osteogenen differenzierung mesenchymaler ... · technische universitÄt mÜnchen...
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TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN
Klinik und Poliklinik für Unfallchirurgie
Experimentelle Unfallchirurgie
Klinikum rechts der Isar
Optimierung der osteogenen Differenzierung
mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe
Isabel F. Kerler
Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin der Technischen
Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Medizin
genehmigten Dissertation.
Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. E. J. Rummeny
Prüfer der Dissertation:
1. apl. Prof. Dr. A. K. Nüssler
Eberhard-Karls-Universität Tübingen
2. Univ.-Prof. Dr. P. Biberthaler
Die Dissertation wurde am 06.06.2014 bei der Technischen Universität
München eingereicht und durch die Fakultät für Medizin am 17.12.2014
angenommen.
Meinen lieben Eltern
Inhaltsverzeichnis
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Inhalt
1 Abkürzungsverzeichnis .......................................................................... 5
2 Einleitung .............................................................................................. 9
2.1 Knochenaufbau und Knochenstoffwechsel..............................................................9
2.2 Tissue Engineering: Klinischer Hintergrund und osteogene Differenzierung von Ad-
MSCs ......................................................................................................................15
2.3 Supplemente zur osteogenen Differenzierung ......................................................18
2.3.1 Phosphat- und Calciumlieferanten ..................................................................18
2.3.2 Vitamin D3 .......................................................................................................19
2.3.3 Dexamethason ................................................................................................20
2.3.4 BMP 2 und BMP 7............................................................................................21
3 Zielsetzung........................................................................................... 24
4 Materialien und Methoden ................................................................. 25
4.1 Verbrauchsmaterialien ..........................................................................................25
4.2 Geräte und Software .............................................................................................26
4.3 Steriles Arbeiten ....................................................................................................27
4.4 Zellisolation ...........................................................................................................27
4.4.1 Isolation und Kultivierung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe .......27
4.4.2 Isolation und Kultivierung von Osteoblasten aus Knochen ...............................29
4.5 Zellzahlbestimmung ...............................................................................................31
4.5.1 Sulforhodamin B (SRB) Färbung .......................................................................31
4.5.2 Zellzahlbestimmung (Neubauer Zählkammer) und Aussäen einer bestimmten
Zellzahl pro cm2 ...............................................................................................33
4.6 Kultur und Differenzierung ....................................................................................36
4.6.1 Passagieren .....................................................................................................36
4.6.2 Adipogene und chondrogene Differenzierung mittels industriell hergestellter
Medien ............................................................................................................37
4.6.3 Herstellung verschiedener Medien für die osteogene Differenzierung ............37
4.6.4 Medienübersicht .............................................................................................39
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4.6.5 BRE: Smad 1/5/8 Reporterassay ......................................................................40
4.6.6 Normalisierung der Luciferasemessung mittels Lowry Proteinmessung ...........42
4.7 Polymerase Kettenreaktion (PCR): Charakterisierung auf mRNA-Ebene ...............45
4.7.1 Isolation von mRNA aus Zellen ........................................................................45
4.7.2 Bestimmung von Menge und Reinheit der RNA ...............................................47
4.7.3 Überprüfung der Integrität der RNA ................................................................48
4.7.4 Synthese von komplementärer DNA (cDNA) ....................................................49
4.7.5 Polymerase Kettenreaktion (PCR) ....................................................................49
4.7.6 Gelelektrophorese ...........................................................................................54
4.8 Vitalitäts- und Viabilitätsbeurteilung mittels alamarBlue® Assay .........................55
4.9 Funktionelle Charakterisierung..............................................................................56
4.9.1 Nachweis osteogener Eigenschaften ...............................................................56
4.9.1.1 Messung der Aktivität der Alkalischen Phosphatase (AP)..........................56
4.9.1.2 Alkalische Phosphatase (AP-) Färbung ......................................................60
4.9.1.3 Van Kossa Färbung ...................................................................................62
4.9.1.4 Alizarin Rot Färbung .................................................................................64
4.9.2 Nachweis chondrogener Eigenschaft: Alcianblau Kernechtrot Färbung ...........67
4.9.3 Nachweis adipogener Eigenschaft: Ölrot O Färbung ........................................68
4.10 Densitometrische Auswertung ..............................................................................70
4.11 Statistische Auswertung ........................................................................................70
5 Ergebnisse ........................................................................................... 71
5.1 Zellzahltest.............................................................................................................71
5.2 Chondrogene und adipogene Differenzierung mit industriell erzeugten Medien..73
5.3 Ad-MSCs exprimieren osteoblastentypische Oberflächenrezeptoren ...................74
5.4 Vier Zusätze im osteogenen Basisdifferenzierungsmedium ..................................75
5.5 2,5 % FCS im Medium verspricht die besten Differenzierungserfolge ...................77
5.6 Vitamin D3 verbessert die osteogenen Differenzierungseigenschaften des
Basisdifferenzierungsmediums, Dexamethason hingegen nicht............................79
5.6.1 Bestimmung nicht toxischer Vitamin D3 Konzentrationen ................................80
Inhaltsverzeichnis
Seite | 3
5.6.2 Bestimmung nicht toxischer Dexamethason Konzentrationen .........................81
5.6.3 Vitamin D3 induziert die AP-Aktivität ...............................................................82
5.6.4 Beste Induktion der Matrixmineralisierung durch kombinierten Einsatz von
Vitamin D3 und Dexamethason ........................................................................84
5.7 BRE Reporterassay und Zugabe von BMP 2 und/oder BMP 7 ................................87
5.7.1 Zugabe von BMP 2 und/oder BMP 7 verbessert die AP-Aktivität nicht .............87
5.7.2 Zugabe von BMP 2 und / oder BMP 7 verbessert die Matrixmineralisierung
nicht ................................................................................................................88
5.7.3 BRE Reporterassay ..........................................................................................89
5.8 Ad-MSCs exprimieren osteoblastentypische Gene nach osteogener
Differenzierung ......................................................................................................91
6 Diskussion............................................................................................ 95
7 Zusammenfassung und Ausblick ....................................................... 107
8 Abbildungsverzeichnis ....................................................................... 109
9 Tabellenverzeichnis ........................................................................... 111
10 Informationen zu den Primern .......................................................... 112
10.1 Alk 1 ..................................................................................................................... 112
10.2 Alk 2 ..................................................................................................................... 112
10.3 Alk 3 ..................................................................................................................... 112
10.4 Alk 5 ..................................................................................................................... 112
10.5 Alk 6 ..................................................................................................................... 113
10.6 TGF-ß-RII .............................................................................................................. 114
10.7 BMPRII ................................................................................................................. 114
10.8 IGF1R ................................................................................................................... 114
10.9 IGF2R ................................................................................................................... 115
10.10 RetinoidXR ß ........................................................................................................ 115
10.11 GAPDH ................................................................................................................. 115
10.12 BMP 4 .................................................................................................................. 115
10.13 BSP 2 .................................................................................................................... 116
10.14 MGP ..................................................................................................................... 116
Inhaltsverzeichnis
Seite | 4
10.15 OSF 2 .................................................................................................................... 117
10.16 Alkalische Phosphatase ....................................................................................... 117
10.17 Osteoprotegerin .................................................................................................. 117
10.18 BMP 2 .................................................................................................................. 118
10.19 Osteopontin ......................................................................................................... 118
10.20 Osteocalcin .......................................................................................................... 119
10.21 Vitamin D ............................................................................................................. 119
10.22 Osteoprotegerin .................................................................................................. 120
10.23 RANKL .................................................................................................................. 120
11 Literaturverzeichnis ........................................................................... 121
12 Danksagung ....................................................................................... 129
Abkürzungsverzeichnis
Seite | 5
1 Abkürzungsverzeichnis
ActR-II ..................................................Aktivin Rezeptor Typ II
ActR-IIB ................................................Aktivin Rezeptor Typ II B
Ad-MSCs ...............................................Adipose derived Mesenchymal Stem Cells
(Fettgewebstammzellen)
ALCAM .................................................activated leukocyte cell adhesion molecule
Alk ........................................................Activine-receptor like kinase
AMHR-II ................................................Anti Müller Hormon Rezeptor Typ II
AP .........................................................Alkalische Phosphatase
ATP .......................................................Adenosintriphosphat
BMP .....................................................Bone Morphogenetic Protein
BMPRII .................................................Bone Morphogenetic Protein Receptor Typ II
B-MSCs .................................................Bone marrow derived mesenchymal stem cells
(Knochenmarkstammzellen)
bp .........................................................Basenpaare
BRE .......................................................BMP Response Element
BSA .......................................................Bovines Serum Albumin
BSP 2 ....................................................Bone Sialoprotein 2
C2C12...................................................murine Myoblasten Zelllinie
Ca .........................................................Calcium
ca. ........................................................circa
CD ........................................................Cluster of Differentiation
cDNA ....................................................komplementäre Desoxyribonukleinsäure
cm ........................................................Zentimeter
cm2 .......................................................Quadratzentimeter
CO2 .......................................................Kohlenstoffdioxid
ddH2O ..................................................zweifach destilliertes, nicht steriles Wasser
DEPC.....................................................Diethylpyrocarbonat
Dex. ......................................................Dexamethason
Abkürzungsverzeichnis
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dH2O .....................................................destilliertes Wasser
DMEM ..................................................Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMSO ...................................................Dimethylsulfoxid
DNA ......................................................Desoxyribonukleinsäure
D-PBS ...................................................Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline
EDTA ....................................................Ethylendiamintetraacetat
EZM ......................................................extrazelluläre Matrix
FACS .....................................................Fluorescence Activated Cell Sorting
FCS .......................................................Fetales Kälberserum
g ...........................................................Gramm
g ...........................................................Vielfaches der Erdbeschleunigung
GAPDH .................................................Glycerinaldehyd-3-phosphat
GMP-Richtlinien ...................................Good Manufacturing Practice guidelines
h ..........................................................Stunde
H2O .......................................................Wasser
HEPES ...................................................4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure
HTM-Zellen ...........................................humane Trabekelwerkszellen
IGF .......................................................insuline like growth factor
kD ........................................................kilo Dalton
M .........................................................Molar
M-CSF ...................................................Macrophage Colony-Stimulating-Factor,
dt.: Monozytenkolonien-stimuliernder Faktor
MEM ....................................................Minimum Essential Medium Eagle
Mg ........................................................Magnesium
mg ........................................................Milligramm
MGP .....................................................Matrix gla Protein
min .......................................................Minute
ml .........................................................Milliliter
mM ......................................................Millimolar
Mr .........................................................relative molekulare Masse
mRNA ...................................................messenger Ribonukleinsäure
Abkürzungsverzeichnis
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MSC ......................................................Mesenchymale Stammzelle
N ..........................................................biologische Replikate (Spenderanzahl)
n ...........................................................technische Replikate pro Spender
NF-κB ....................................................nuclear factor ‘kappa-light-chain-enhancer’ of
activated B-cells
ng .........................................................Nanogramm
nm ........................................................Nanometer
nM........................................................Nanomolar
nmol .....................................................Nanomol
OC ........................................................Osteocalcin
OD ........................................................optische Dichte
OP ........................................................Osteopontin
OP-1 .....................................................Osteogenic Protein-1 = BMP 7
OPG ......................................................Osteoprotegerin
OSF 2 ....................................................Osteoblast Specific Factor 2
OSS .......................................................Osteoblasten aus Spongiosa
OSÜ ......................................................Osteoblastenkultur aus dem Kollagenaseüberstand
PBS .......................................................Phosphate-Buffered Saline
PCR .......................................................Polymerase Kettenreaktion
pH ........................................................negativ dekadischer Logarithmus der
Wasserstoffionen-Aktivität
pNP ......................................................4 Nitrophenol
pNPP ....................................................4-Nitrophenylphosphat
PDIA3 ...................................................Protein Disulfidisomerase A3
R² .........................................................Bestimmtheitsmaß
RANK ....................................................Rezeptor Aktivator des Nuklearfaktor κ B
RANKL ..................................................Rezeptor Aktivator des Nuklearfaktor κ B Ligand
RLU .......................................................Relative Light Unit
RNA ......................................................Ribonukleinsäure
RT .........................................................Raumtemperatur
RT-PCR ..................................................Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion
Abkürzungsverzeichnis
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runx2 ....................................................Runt-related transcription factor 2
s ...........................................................Sekunde
S ...........................................................Svedberg
SDS .......................................................Sodiumdodecylsulfat
Smad ....................................................Sma- and Mad-related protein
sRANKL .................................................löslicher Rezeptor Aktivator des Nuklearfaktor
κ B Ligand
SRB .......................................................Sulforhodamin B
TBE .......................................................Tris-Borat-EDTA-Puffer
TGF-β....................................................Transforming Growth Factor β
TGF-βRI.................................................Transforming Growth Factor β Rezeptor Typ I
TGF-βRII................................................Transforming Growth Factor β Rezeptor Typ II
TRIS ......................................................Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
V ..........................................................Volt
λ ...........................................................Einheit für die Wellenlänge des Lichts
°C .........................................................Grad Celsius
µg.........................................................Mikrogramm
µl ..........................................................Mikroliter
µm ........................................................Mikrometer
µM .......................................................Mikromolar
µmol .....................................................Mikromol
# ...........................................................Probennummer
Einleitung
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2 Einleitung
2.1 Knochenaufbau und Knochenstoffwechsel
Das menschliche Skelett besteht durchschnittlich aus 208 Knochen. Es bildet zusammen mit
knorpeligen Skelettelementen den passiven Stütz- und Bewegungsapparat des Körpers und
erfüllt eine Schutzfunktion für die inneren Organe. Daneben stellen die Knochen den
Bildungsort der Blutzellen dar, beteiligen sich an verschiedenen Stoffwechselprozessen und
sind das größte körpereigene Phosphat- und Calciumreservoir (Felsenberg 2001, S. 488;
Lüllmann-Rauch 2003, S. 133).
Zur exemplarischen Darstellung des Knochenaufbaus wird ein langer Röhrenknochen, wie
das Femur, näher betrachtet. An einem Röhrenknochen kann anatomisch ein Schaftbereich
(Diaphyse) von einer proximalen und distalen Epiphyse unterschieden werden. Die beiden
knorpeligen Epiphysenfugen grenzen während der Wachstumsphase den Schaft von den
Epiphysen ab, verknöchern jedoch im Erwachsenenalter. Weitere makroskopisch erkennbare
Merkmale sind die äußere, homogen erscheinende Rindenschicht (Substantia compacta) und
die nach innen anschließende Substantia spongiosa. Die Spongiosa ist ein Gitterwerk aus
dünnen, traktoriell ausgerichteten Platten und Bälkchen (Trabekel) dessen Zwischenräume
von Knochenmark und Fett ausgefüllt werden. (Lüllmann-Rauch 2003, S. 122-130; Aumüller
2010, S. 184-186)
Der Knochen besteht mikroskopisch betrachtet aus Knochenzellen und extrazellulärer
Matrix, davon entfallen 70 % auf einen anorganischen und 30 % auf einen organischen
Anteil. Der anorganische Teil besteht vor allem aus Hydroxylapatit-Kristallen sowie Chloride
und Fluoride. Die organische Knochensubstanz wird zu 95 % aus Typ-I-Kollagenfibrillen
(bestehend aus drei Ketten, die sich zu einer Tripelhelix vereinen) und zu 5 % aus
nichtkollagenen Proteinen (siehe unten) gebildet (Felsenberg 2001, S. 488). Dieser Verbund
aus druckfesten Mineralkristallen und zugfesten Kollagenfibrillen verleiht dem Knochen
seine biegefeste Eigenschaft. Die wichtigsten nichtkollagenen Proteine des Knochens sind:
- Osteoprotegerin (OPG) wird von Osteoblasten sezerniert, um den Knochen vor
Abbau zu schützen. OPG ist der Schlüsselfaktor für die Inhibition der
Osteoklastendifferenzierung, -fusion und -aktivität. Es bindet sRANKL und
antagonisiert dieses dadurch (Haima 2013, S. 4). Glukokortikoide wirken umgekehrt:
Einleitung
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sie hemmen die Bildung von OPG und stimulieren diejenige von RANKL, dadurch
fördern sie den Knochenabbau (Brabnikova Maresova, Pavelka et al. 2012, S. 354;
Clarke 2012, S. 167).
- sRANKL wird von Osteoblasten sezerniert und ist der lösliche Rezeptor-Aktivator des
nuclear factor (NF)-κB Liganden. Es stimuliert die Bildung reifer Osteoklasten und
fördert somit den Knochenabbau. Die Zellaktivierung wird durch die Bindung von
sRANKL an den osteoklastischen Membranrezeptor RANK (NF-κB) induziert (Haima
2013, S. 4).
- Knochenspezifische Alkalische Phosphatase (AP) ist außen an der Plasmamembran
von Osteoblasten lokalisiert. Dieses membrangebundene Enzym spielt bei der
Mineralisation der extrazellulären Knochenmatrix eine wichtige Rolle; der
Mechanismus ist jedoch noch nicht ausreichend geklärt. Außerdem kann AP als
biochemischer Knochenmarker in der Beurteilung des Knochenumsatzes und zum
Therapiemonitoring verwendet werden (hohe AP-Konzentrationen können ein
Hinweis auf vermehrte Knochenneubildung sein)(Haima 2013, S. 4).
- Bone Sialoprotein (BSP) ist ein wichtiges Strukturprotein der Knochenmatrix und
wird normalerweise nur in mineralisiertem Bindegewebe von Knochen und Zähnen
exprimiert (Fisher, Whitson et al. 1983, S. 12723). BSP 2 ist die im Menschen
vorkommende Variante und ist auch bekannt unter „cell-binding sialoprotein“ oder
„integrin-binding sialoprotein“. BSP 2 unterstützt die Bindung von Osteoblasten an
die EZM und stimuliert dadurch die Bildung von Hydroxylapatit-Kristallen (Mansson,
Carey et al. 1995, S. 1071; Haima 2013, S. 4).
- Osteocalcin wird von Osteoblasten in der Phase der Mineralisation sezerniert, ist
Vitamin K-abhängig und kann durch Vitamin D3 stimuliert werden. Es ist ein calcium-
bindendes Protein und zieht Osteoklasten an (Siddiqi, Burrin et al. 1997, S. 753;
Haima 2013, S. 4).
- Osteopontin ist ein Adhäsionsprotein, das Osteoklasten in der mineralisierten Matrix
verankert. Osteopontin ist wie auch Osteonectin nicht knochenspezifisch, sondern
findet sich noch in weiteren Geweben (Butler 1989, S. 123; Haima 2013, S. 4).
- Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden eine Ligandengruppe, die zur TGF-β-
Familie gehört (Wozney 1989, S. 267). Sie fungieren als Zytokine und besitzen die
Fähigkeit die Knochen- und Knorpelbildung zu induzieren und zu regulieren.
Einleitung
Seite | 11
Außerdem spielen sie eine wichtige Rolle in der Differenzierung von Nervengewebe
und in der Genese fast aller Organe, wie beispielsweise Lunge, Niere, Haut oder
Gonaden (Hogan 1996, S. 1580). Zum Beispiel tritt bei der genetisch vererbten
Fibrodysplasia ossificans progressiva eine erhöhte BMP 4 Expression in Lymphozyten
auf, die zur Verknöcherung von Muskelgewebe führt (Van den Wijngaard, Pijpers et
al. 1999, S. 1432).
- Proteoglykane sind sehr große Moleküle und bestehen zu 95 % aus Kohlenhydraten
und 5 % aus Protein. Aufgrund der starken negativen Ladung können Proteoglykane
besonders viel Wasser binden und erlangen dadurch raumfüllende Eigenschaften
(Pschyrembel 2004, S. 1492).
Die dreidimensionale Anordnung der EZM legt fest, ob es sich um einen Geflecht- oder
Lamellenknochen handelt.
Der Geflechtknochen, auch Faserknochen genannt, ist die unreife Vorstufe des
Lamellenknochens und ist vor allem während der Knochenentwicklung oder Frakturheilung
zu finden. Die Kollagenfibrillen sind in Bündeln miteinander verflochten, so dass man sich die
Knochenstruktur wie verknöchertes Bindegewebe vorstellen kann.
Im Verlauf des natürlichen Knochenumbaus wird der Geflechtknochen durch den
biomechanisch hochwertigeren Lamellenknochen ersetzt. Die lamellare Anordnung der
Matrixbestandteile sowie die enge räumliche Beziehung zwischen Gefäßen und
Knochenlamellen werden besonders in der Kompakta deutlich. Beide Strukturen zusammen
bilden eine Baueinheit, das sogenannte Osteon (Durchmesser 250-350 µm, Länge bis zu 1
cm). Im Zentrum eines Osteons befindet sich der sogenannte Havers’sche Kanal
(Durchmesser mind. 20 µm), in dem neben Vene und Nerv ein Gefäßast der Arteria nutricia
verläuft. Diese dringt von außen durch die Kortikalis in den Markraum ein und versorgt die
Gefäße des Knochenmarks. Die Havers-Gefäße sind durch Gefäße in den querverlaufenden
sogenannten Volkmann-Kanälen miteinander verbunden. Um das Havers-Gefäß sind 5-20
Speziallamellen konzentrisch angeordnet. Die Kollagenfibrillen laufen dabei spiralig um den
Havers’schen Kanal, während die Osteozyten zwischen den Lamellen eingemauert sind.
Weiter unterscheidet man äußere und innere Generallamellen, sie sind nicht um ein Gefäß
angeordnet und umgeben die Kompakta parallel zur äußeren und inneren Oberfläche.
Schaltlamellen (interstitielle Lamellen) sind Reste unvollständig abgebauter Spezial- oder
Einleitung
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Generallamellen und sind der Beweis für die stetigen Umbauvorgänge im Knochen.
(Benninghoff 1985, S. 135-137; Lüllmann-Rauch 2003, S. 129-131; Schünke 2005, S. 35).
In der gefäßlosen Spongiosa sind die flächigen Lamellen parallel zur Trabekeloberfläche
angeordnet. Ein Trabekel ist höchsten 300 µm dick, somit können die Osteozyten per
diffusionem von den Gefäßen aus dem Markraum versorgt werden (Lüllmann-Rauch 2003, S.
130).
Abbildung 1: Mikroskopischer Aufbau eines Röhrenknochens Die Abbildung zeigt die Baueinheit eines Röhrenknochens, das Osteon; die versorgenden Blutgefäße verlaufen in der Kompakta in den präformierten längsverlaufenden Havers’schen Kanälen und in quer angeordneten Volkmann-Kanälen; nach außen (links) schließt das Periost die Kompakta ab, nach innen (rechts) beginnt die Spongiosa. Modifizierte Abbildung nach www.servier.com/Powerpoint-image-bank.
Folgende drei Zelltypen werden unterschieden:
1. Osteoblasten entstehen über ihre Vorstufe, den Osteoprogenitorzellen, aus
mesenchymalen Stammzellen. Ihre Hauptaufgaben sind die Bildung, Organisation und
Mineralisierung der EZM sowie die Synthese von Kollagen und weiteren
Knochenproteinen. Diese Aufgaben erfüllen sie in mehreren Arbeitsschritten:
Zellproliferation: Bildung der EZM
Osteon
äußereGenerallamellen
Schaltlamellen
Volkmann-Kanal mit Gefäßen
Periost
Havers‘scher Kanal mit Gefäßen
Spongiosa
Kompakta
Osteozyt
Einleitung
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Reifung der EZM: Synthese von Proteinen (z.B. knochenspezifische Alkalische
Phosphatase)
Mineralisation der EZM: die AP-Expression wird herrunterreguliert, dafür
nimmt die Genexpression für Sialoprotein, Osteopontin und Osteocalcin zu
nach der Fertigstellung der Knochenmatrix gibt es drei Optionen für die
Osteoblasten: etliche werden von einer neu gebildeten Lamelle
„eingemauert“ und werden dadurch zu Osteozyten, über 50% sind überflüssig
und gehen durch Apoptose zugrunde und die restlichen wenigen reihen sich
in einem inaktiven Zustand in das Endost ein (Benninghoff 1985, S. 138-139;
Lüllmann-Rauch 2003, S. 126-127).
2. Osteozyten werden bis auf eine schmale Zone, die mit Kollagen und interstitieller
Flüssigkeit gefüllt ist, komplett von mineralisierter Matrix umgeben. Von jeder
einzelnen Zelle gehen viele Knochenkanälchen (Canaliculi) ab, die mit den
Nachbarzellen durch Gap junctions in Verbindung stehen. Dieses Hohlraumsystem
gewährleistet per diffusionem die Aufrechterhaltung des Zellmetabolismus und die
Kommunikation untereinander. Ihre Funktion ist noch nicht ausreichend geklärt, aber
es konnte beobachtet werden, dass Areale, in denen die Osteozyten abgestorben
sind, von Osteoklasten abgeräumt werden. (Benninghoff 1985, S. 139; Lüllmann-
Rauch 2003, S. 125-126; Schünke 2005, S. 15)
3. Osteoklasten sind eine Spezialform der Makrophagen. Sie entstehen durch Fusion von
bis zu 100 einkernigen Vorläuferzellen, die denen der Monozyten entsprechen und
sind für die Knochenresorption verantwortlich. Die Arbeitsweise der Osteoklasten
umfasst folgende Schritte:
Mineralienauflösung: Osteoklasten bilden in dem Bereich, welcher der
Knochenoberfläche aufliegt, einen Faltensaum zur Oberflächenvergrößerung.
In dieser geriffelten Oberfläche befindet sich eine H+-ATPase mit der ein
saures Mikromilieu (pH ca. 4,5) zur Auflösung der Calciumverbindungen
erzeugt wird. Die komplette Lysezone ist nach außen durch eine
Versiegelungszone abgegrenzt.
Gleichzeitig sezernieren die Osteoklasten lysosomale Enzyme (z.B. Cathepsin
K, Tartrat-resistentes Isoenzym der sauren Phosphatase = TRAP 5b) zur
Zerlegung der organischen Matrix.
Einleitung
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Osteoklasten nehmen die Matrix-Fragmente mittels Rezeptor-vermittelter
Endozytose auf, transportieren sie durch den Zellleib und schleusen sie auf
der gegenüberliegenden, nicht osteoklastisch tätigen Seite wieder aus.
Zur Proliferation von Osteoklastenvorläuferzellen sezernieren Osteoblasten
Wachstumsfaktoren (TGF-, RANKL) und Zytokine (z.B. M-CSF) (Fuller, Lean et al. 2000,
S. 2445). Zusätzlich interagieren die Blasten und Klasten über RANK direkt miteinander,
was die Fusion und Reifung der Osteoklasten anregt. Osteoprotegerin aus den
Osteoblasten unterbindet diese Interaktion. Nach Calcitoninbindung löst sich der
Osteoklast von der Knochenmatrix und der Faltensaum verschwindet. (Benninghoff
1985, S. 140-141; Lüllmann-Rauch 2003, S. 127-129; Pschyrembel 2004, S. 1331)
Das Endost überzieht die innere Knochenoberfläche. Es besteht aus einer dünnen Schicht
von nicht-mineralisierten Kollagenfibrillen und einer Schicht lining cells. Diese umfassen
mesenchymale Stammzellen, Osteoprogenitorzellen, ruhende Osteoklasten und –blasten
werden bei Umbau- oder Reparaturmaßnahmen aktiviert (Lüllmann-Rauch 2003, S. 129).
Das Periost überzieht die äußere Knochenoberfläche, ist gut vaskularisiert und innerviert. Es
weist die gleichen Zellen wie das Endost auf.
Jährlich werden etwa 10% der gesamten Knochenmasse umgebaut (remodelling), um das
Skelett vor Materialermüdung zu schützen, Mikroschäden zu reparieren und es an die
funktionelle Beanspruchung anzupassen.
Neben den mechanischen Aspekten haben auch Hormone einen großen Einfluss auf den
Knochenstoffwechsel (Lüllmann-Rauch 2003, S. 129):
Östrogen hemmt die Osteoblasten-induzierte Rekrutierung der Osteoklasten, somit
ist der Östrogenmangel bei postmenopausalen Frauen eine der maßgeblichen
Ursachen für Osteoporose (Lüllmann-Rauch 2003, S. 133).
Parathormon aus der Nebenschilddrüse erhöht Osteoblasten-vermittelt die
Rekrutierung und Aktivität der Osteoklasten, die durch eine gesteigerte
Knochenresorption den Serumcalciumspiegel erhöhen (Lüllmann-Rauch 2003, S. 133;
Haima 2013, S. 6).
Calcitonin, das in den C-Zellen der Schilddrüse gebildet wird, ist der Gegenspieler des
Parathormons. Durch direkte Osteoklastenhemmung bewirkt es eine schnelle jedoch
Einleitung
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nur kurz dauernde Senkung der Calcium- und Phosphatkonzentrationen im Serum
(Benninghoff 1985, S. 147; Lüllmann-Rauch 2003, S. 133; Haima 2013, S. 6).
Vitamin D3 (siehe Kapitel 2.3.2)
2.2 Tissue Engineering: Klinischer Hintergrund und osteogene
Differenzierung von Ad-MSCs
Adäquate Therapiemöglichkeiten für Patienten mit größeren Knochendefekten, z.B. bedingt
durch ein Trauma oder nach Tumorextraktion, die nicht durch körpereigene
Reparaturmaßnahmen geheilt werden können, stellen ein großes Problem in der
orthopädischen und unfallchirurgischen Versorgung dar. Der derzeitige klinische Standard ist
die auto- und allogene Knochentransplantation (Kao and Scott 2007, S. 513). Für den
Patienten ist die autogene Behandlungsmethode jedoch mit einem erhöhten Risiko für
Infektion und Morbidität durch den zusätzlichen operativen Eingriff verbunden (Brawley and
Simpson 2006, S. 342; Chen, Chen et al. 2006, S. 496; Silva, Cortez et al. 2006, S. 420; Chou,
Mann et al. 2007, S. 199). Der Einsatz allogener Transplantate bringt die Gefahr einer Graft-
versus-Host Reaktion mit sich (Wheeler, Haynie et al. 2001, S. 251; Wheeler 2005, S. 36;
Kode, Mukherjee et al. 2009, S. 377). Alternativ werden auch alloplastische Ersatzverfahren
angewendet, die jedoch lediglich als Defektfüller dienen und bei einem ausbleibenden
osteoinduktiven Einbauprozess sich lockern können. Im Tiermodel konnten große
Knochendefekte durch Beschichtung der Implantate mit osteogenen Wachstumsfaktoren
erfolgreich überbrückt werden (Pelled, Ben-Arav et al. 2010, S. 13-14; Vertenten, Gasthuys
et al. 2010, S. 153-157). Übertragungsversuche in den klinischen Alltag sind bis jetzt
allerdings gescheitert.
Das Tissue Engineering eröffnet für diese Patientengruppe eine neue, risikoarme und
vielversprechende Behandlungsmöglichkeit. Ziel ist nicht nur die Wiederherstellung der
Funktionalität der betroffenen Extremität sondern eine vollständige Genesung durch den
Einsatz körpereigener histogener Zellen auf biokompatiblen Trägermaterialien (Egana, Fierro
et al. 2009, S. 1191; Schmidt-Rohlfing, Tzioupis et al. 2009, S. 786). Anfänglich kamen vor
allem autogene primäre Osteoblasten zum Einsatz, die jedoch nicht in ausreichender Menge
gewonnen werden konnten. Somit hat sich in den letzten Jahren die Verwendung
mesenchymaler Stammzellen etabliert. Studien belegen das ubiquitäre Vorkommen
mesenchymaler (adulter) Stammzellen in verschiedenen Geweben und Organen wie
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Knochenmark, Muskel, Gehirn, Haut und subkutanem Fettgewebe (Kakudo, Shimotsuma et
al. 2008, S. 191). Per definitionem charakterisiert man Stammzellen durch ihre Fähigkeit zur
Selbstreplikation und somit spielen sie eine Schlüsselrolle in der Aufrechterhaltung der
Homöostase im Knochen-, Knorpel-, Muskel-, Band-, Fett- und Stromagewebe (Bruder, Fink
et al. 1994, S. 283). Ein weiteres Merkmal mesenchymaler Stammzellen ist deren Plastizität,
d.h. sie sind in der Lage in verschiedene Gewebetypen zu differenzieren (Pittenger, Mackay
et al. 1999, S. 143; Mizuno 2009, S. 56).
Bezüglich der osteogenen Differenzierungslinie können sich mesenchymale Stammzellen in
sogenannte Osteoprogenitorzellen, Vorläuferzellen einiger Knochenzellen, weiter
differenzieren. Osteoprogenitorzellen stellen die Ausgangsform für die
Weiterdifferenzierung in Osteoblasten, Osteozyten und „lining cells“ dar (Clarke 2008, S.
134).
Abbildung 2: Die mesenchymale Stammzelle (modifiziert nach Takada, Kouzmenko et al. 2009, S. 444) Die mesenchymale Stammzelle kann durch ihre Plastizität in unterschiedlich spezialisierte Gewebe differenzieren.
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Gimble et al. haben vorgeschlagen, dass Stammzellen für den Einsatz in der regenerativen
Medizin folgende Kriterien erfüllen sollten (Gimble 2003, S. 1249-1250; Gimble, Katz et al.
2007, S. 1249-1250):
zur Reduktion des perioperativen Risikos für den Spender müssen die Stammzellen
durch minimal invasive Extraktionsmethoden gewonnen werden können
aus dem zur Verfügung stehende Gewebe sollen mit standardisierten Methoden eine
große Zahl von Zellen (im Millionenbereich) isoliert werden können
eine Differenzierung in verschiedene Gewebe soll durch regulierbare und
reproduzierbare Methoden gewährleistet werden
Gewährleistung sicherer und effektiver auto- und allogener Transplantations-
möglichkeiten
die Zellen müssen gemäß aktueller GMP-Richtlinien (Good Manufacturing Practice
guidelines; EU-Richtlinie 2003/94/EC) verarbeitet werden können
Traditionell werden MSCs aus dem Aspirat einer Knochenmarkbiopsie gewonnen. Diese ist
jedoch sehr schmerzhaft, geht mit einem nicht zu unterschätzenden periinterventionellen
Risiko für den Patienten einher und liefert nur eine geringe Menge an Material, wenn
Folgeerscheinungen wie Anämien vermieden werden sollen (Bain 2003, S. 949).
Subkutanes Fettgewebe hingegen kann leicht in Lokalanästhesie in ausreichenden Mengen
entnommen werden. Es ist möglich aus einem Gramm Fettgewebe ca. 5 x 103 Zellen zu
isolieren, etwa 500 mal so viel wie aus Knochenmark (Coleman 2006, S. 117). Zudem
verringert der Gebrauch von adulten Stammzellen Akzeptanzprobleme der Methoden bei
den Patienten oder Konflikte mit den aktuell geltenden Gesetzen in Deutschland.
Allen geforderten Punkten kann mit Fettgewebsstammzellen nachgekommen werden und
somit stellen sie eine gute Alternative zu den Knochenmarkstammzellen dar. Zur
Überprüfung ob Ad-MSCs auch für das Tissue Engineering von Knochen verwendbar sind,
werden sie auf ihre Oberflächenrezeptoreigenschaften untersucht und mit verschiedenen
Substanzen stimuliert, um die osteogene Differenzierung zu induzieren.
Für diese Arbeit wird abdominelles bzw. Hüftfett verwendet, das nach vorheriger Aufklärung
und schriftlicher Zustimmung der Patienten während der Operation entnommen wird.
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2.3 Supplemente zur osteogenen Differenzierung
Damit den Zellen auch die benötigten Nähr- und Signalstoffe zur osteogenen Differenzierung
zur Verfügung stehen, werden verschiedene Supplemente für die nachfolgenden
Experimente verwendet. Dies erfolgt einerseits in Anlehnung an bereits publizierte
Protokolle zur osteogenen Differenzierung und andererseits durch den Einsatz von
Substraten, die Osteoblastenkulturmedien zugesetzt werden (Hattori, Sato et al. 2004, S. 4;
Kroeze, Knippenberg et al. 2011, S. 233).
2.3.1 Phosphat- und Calciumlieferanten
Hydroxylapatit-Kristalle bilden die Hauptkomponente des mineralisierten Matrixanteils und
bestehen aus Calcium und Phosphat.
Als Phosphatlieferanten werden -Glycerolphosphat (siehe Abbildung 3) und
L-Ascorbinsäure-2-phosphat (siehe Abbildung 4) eingesetzt, wobei letzteres die Zugabe von
HEPES (siehe Abbildung 5) erfordert, um einer pH-Wert-Entgleisung entgegenzuwirken.
Das zweiwertige Calcium wird als Calciumchloridsalz (siehe Abbildung 6) zugegeben.
Abbildung 3: β-Glycerolphosphatdinatrium Salzhydrat (von Sigma Aldrich)
Abbildung 4: L-Ascorbinsäure-2-phosphatsesquimagnesium Salzhydrat (von Sigma-Aldrich)
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Abbildung 5: HEPES (von Sigma-Aldrich)
Abbildung 6: Calciumchloriddihydrat (von Sigma Aldrich)
2.3.2 Vitamin D3
Vitamin D3 (Cholecalciferol) (siehe Abbildung 7) ist ein Hormon, das im menschlichen
Organismus die intestinale Ca2+-Aufnahme und dessen Einbau in den Knochen reguliert.
Somit erhöht es die Effizienz des Calciums (Haima 2013, S. 6). Biochemisch handelt es sich
dabei um ein Steroid, das durch UV-Licht oder enzymatisch in seine aktive Form, das 1,25-
Dihydroxycholecalciferol umgewandelt wird.
Die elementare Bedeutung von Cholecalciferol im Knochenstoffwechsel wird am
Krankheitskomplex der Vitamin-D-Mangelerscheinungen deutlich. Eine Hypovitaminose
führt zu Mineralisierungsstörungen des Skeletts und kann sich je nach Lebensalter in
unterschiedlichen Krankheitsbildern äußern: Säuglinge und Kinder erkranken an der
sogenannten Rachitis, bei der eine Störung der enchondralen Ossifikation vorliegt, die von
schweren Knochendeformationen bis hin zu Tetanien und Krampfanfällen führen kann.
Im Erwachsenenalter äußert sich dieser Vitaminmangel als Osteoporose (verminderte
Knochensubstanz und mikroarchitektonischer Stabilitätsverlust) oder Osteomalazie (erhöhte
Weichheit des Knochens und Verbiegungstendenz). Erstere kann Spontanfrakturen mit sich
bringen, bei letzterer kommen als weitere Komplikation noch Deformationen hinzu
(Pschyrembel 2004, S. 1933-1934; Rassow 2012, S. 278).
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Abbildung 7: Cholecalciferol (von Sigma-Aldrich)
2.3.3 Dexamethason
Zusammen mit anderen Hormonen verzögern Glukokortikoide wie das Dexamethason (siehe
Abbildung 8) in physiologischen Dosen das Längenwachstum von Röhrenknochen durch
Proliferationshemmung von Osteoblasten und der Differenzierung von Knorpelzellen in den
Epiphysenfugen (Rassow 2012, S. 595). Im medizinischen Alltag weisen sie ein weites
Behandlungsspektrum für die verschiedensten Indikationen auf. Jedoch wird bei einer
Langzeittherapie ihr immunsuppressives Potential von einer großen Anzahl unerwünschter
Nebenwirkungen begleitet, die in ihrer vollen Ausprägung als Morbus Cushing bekannt sind.
Im Bereich der Knochen können sehr hohe Dosen, auch wenn sie nur kurzfristig zum Einsatz
kommen, zu Osteoporose oder aseptischen Knochennekrosen im Kopfbereich von Humerus
und Femur führen (Kaiser 2002, S. 137-138).
In vielen Publikationen konnte Dexamethason dennoch die osteogene Differenzierung
mesenchymaler Stammzellen nicht nur induzieren sondern auch signifikant verbessern
(Koehler, Alge et al. 2013, S. 4150; Ma, Zhang et al. 2013, S. 1403).
Abbildung 8: Dexamethason–Cyclodextrin-Komplex (von Sigma-Aldrich)
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2.3.4 BMP 2 und BMP 7
Diese beiden Vertreter aus der Familie der BMPs werden seit einigen Jahren in Form von
rekombinanten humanen Proteinen klinisch zur Anwendung gebracht. Zum Einsatz kommt
dabei das rekombinante humane BMP-2 (rh-BMP-2) InductOs® der Firma Wyeth und das rh-
BMP-7 Osigraft® der Firma Olympus vormals Stryker. Ersteres ist zugelassen bei akuten
Tibiafrakturen sowie zur monosegmentalen anterioren lumbalen Spondylodese bei
Erwachsenen mit degenerativem Bandscheibenvorfall und einem erfolglosen 6 monatigen
konservativen Therapieversuch. Letzteres wird bei seit mindestens 9 Monaten bestehenden
Pseudarthrosen nach Tibiafrakturen eingesetzt.
Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind eine Ligandengruppe, die zur TGF-β-Familie
gehört (Wozney 1989, S. 267). Im klinischen Alltag finden BMP 2 und BMP 7 Einsatz bei der
Behandlung von großen Knochendefekten oder Frakturheilungsstörungen (Wildemann,
Burkhardt et al. 2007, S. 1; Schmidmaier, Capanna et al. 2009, S. 41).
BMP 2 ist ein potentes osteoinduktives Zytokin, das die Bildung von Knochen und Knorpel in
Verbindung mit osteokonduktiven Trägern wie Kollagen und synthetischem Hydroxylapatit
induziert. Zusätzlich zur osteogenen Aktivität spielt BMP 2 eine wichtige Rolle bei der
kardialen Morphogenese (Hill 2013, S. 41).
BMP 7 auch bekannt als Osteogenic Protein-1 oder OP-1 ist eine wirksame osteogene
Substanz, die in Anwesenheit geeigneter Trägerstoffe (z.B. eines Kollagenschwammes oder
synthetischem Hydroxylapatit) zur Behandlung von Knochendefekten eingesetzt wird. BMP 7
induziert die Knorpel- und Knochenbildung, ist an der Regulation des Calciumhaushaltes
sowie der Knochenhomöostase beteiligt (Hill 2013, S. 41).
Für die Signaltransduktion der Mitglieder der TGF-β Superfamilie werden jeweils ein TGF-β
Rezeptor Typ I (Alk 1-7) und Typ II Rezeptor (TGF-β, ActR-II, ActR-IIB, BMPRII und AMHR-II)
(Massague 1998, S. 753; Inman, Nicolas et al. 2002, S. 65-66) benötigt (siehe Abbildung 9).
Die BMPs vermitteln ihre Signale lediglich über Alk 1, Alk 2, Alk 3 und Alk 6 der Typ I
Rezeptoren sowie BMPR-II, ActR-II und ActR-IIB der Typ II Rezeptoren. Nach Bindung des
BMP-Liganden an einen der Typ I Rezeptoren verbindet sich dieser Komplex intrazellulär mit
dem entsprechenden Typ II Rezeptor. Der konstitutiv aktivierte (phosphorylierte) Typ II
Rezeptor aktiviert nun den Typ I Rezeptor durch die Übertragung des Phosphatrests (Piek,
Heldin et al. 1999, S. 2109; Chen, Deng et al. 2012, S. 273-274). Der aktivierte Typ I Rezeptor
erkennt die fünf zytoplasmatisch rezeptorregulierten Smad-Proteine (R-Smads 1, 2, 3, 5, 8).
Einleitung
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Die Bindung eines BMP-Liganden aktiviert R-Smad 1, 5 und 8 (Piek, Heldin et al. 1999, S.
2109) wohingegen TGF-β, Nodal oder Activin über R-Smad 2 und 3 die Signaltransduktion
vermitteln (Ross and Hill 2008, S. 384-385). Smad 4 wird nicht von Liganden kontrolliert und
kann mit allen aktivierten R-Smads Komplexe bilden. Somit unterstützt es als common-
mediator Smad-Protein (co-Smad, Smad 4) bei der Signaltransduktion in den Zellkern. (Ross
and Hill 2008, S. 385-386)
Die I-Smads (Inhibitory Smads) bestehend aus Smad 6 und 7 wirken auf die
Signalübertragung inhibierend. Diese binden zum einen an den Typ-I-Rezeptor und hindern
somit die Aktivierung der R-Smads oder erkennen zum anderen direkt aktivierte R-Smads
und beeinflussen dadurch die Komplexbindung mit co-Smad. Smad 6 inhibiert die BMP-
Signaltransduktion wohingegen Smad 7 zusätzlich den TGF-β- und Activin-Signalweg hemmt.
(Ross and Hill 2008, S. 386, 393)
Abbildung 9: Schematische Darstellung des BMP- und TGF-β Signallings Die Ligandenbindung aktiviert im Zellinneren die R-Smad Phosphorylierung, dabei übermitteln die BMPs ihre Aktivierung über Smad 1/5/8 und TGF-β über Smad 2/3, zusammen mit dem co-Smad wird die Information in den Zellkern weitergeleitet. I-Smad 6 wirkt inhibitorisch auf das Smad 1/5/8 Signalling wohingegen Smad 7 beide Signalwege beeinflussen kann. (modifiziert nach Horbelt, Denkis et al. 2012, S. 470)
TGF-βRII:- BMPRII- ActR-II- ActR-IIB
BMP
Smad 4
TGF-βRI:- Alk 1- Alk 2- Alk 3- Alk 6
TGF-βRI TGF-βRII
TGF-β
Smad 1/5/8 Smad 1/5/8 Smad 2/3Smad 2/3P P
Smad 4
R-SmadP
Smad 4
Smad 6
Smad 7
Einleitung
Seite | 23
Die Arbeitsgruppe um Kang schleuste in C2C12-Zellen einen rekombinanten Adenovirus, der
alle 14 BMPs exprimiert. Anschließend injizierten sie diese in den Quadrizeps von
Nacktmäusen. In den Gruppen von BMP 2, 6, 7 und 9 (siehe Abbildung 10) konnten sie
sowohl radiologisch als auch histologisch die Ossifikation des Muskels an dieser Stelle
nachweisen (Kang, Sun et al. 2004, S. 1314).
Abbildung 10: orthotope Ossifikation bei BMP 2, 6, 7 und 9 C2C12 Zellen mit rekombinantem Adenovirus, der alle 14 BMPs exprimiert, wurden in den Quadrizeps der Nacktmäuse injiziert. Nach 3 Wochen konnte röntgenologisch bei den mit BMP 2, 6, 7 und 9 stimulierten Gruppen Knochengewebe nachgewiesen werden (Kang, Sun et al. 2004, S. 1314). Kontrollgruppe: GFP = Grün Fluoreszierendes Protein, das Dreieck zeigt die Injektionsstelle
Lange Zeit waren nur BMP 2 und BMP 7 rekombinant herstellbar und für die klinische
Anwendung zugelassen, deshalb beschränken wir uns auf diese beiden Faktoren.
Zielsetzung
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3 Zielsetzung
Knochenmarkstammzellen waren lange die vielversprechendste Quelle von mesenchymalen
Stammzellen. Sie sind jedoch nur in geringen Mengen verfügbar, wenn das hämatopoetische
Gleichgewicht nicht zerstört werden soll. Zusätzlich ist deren Extraktion mit einem nicht zu
vernachlässigenden interventionellen Risiko verbunden.
Ziel dieser Arbeit war es deshalb mesenchymale Stammzellen aus Fettgewebe zu isolieren
und diese osteogen zu differenzieren. Ad-MSCs sind in großen Mengen verfügbar und
können risikoarm und einfach von jedem Patienten gewonnen werden.
Zur Überprüfung welche Substanzen von den Zellen aufgenommen werden können, müssen
diese zunächst mittels Bestimmung von Oberflächenrezeptoren charakterisiert werden.
Anschließend sollen die Zellen mit verschieden zusammengesetzten Medienkonstellationen
stimuliert werden, um ein osteogenes Differenzierungsprotokoll zu erstellen. Ein weiteres
Ziel ist es möglichst preisgünstige Supplemente zu verwenden, was vor allem für den
späteren klinischen Einsatz eine entscheidende Rolle spielt. Abschließend werden die
differenzierten Stammzellen bezüglich ihrer exprimierten osteoblastentypischen Gene noch
mit primären Osteoblasten verglichen.
Im Überblick sollen also folgende Ziele verfolgt werden:
1. Grundcharakterisierung der Ad-MSCs:
a. Expression von Oberflächenrezeptoren
b. chondrogene Differenzierung
c. adipogene Differenzierung
2. Erstellung eines optimierten osteogenen Differenzierungsprotokolls durch Testung
verschiedener osteogener Mediensupplemente auf:
a. AP-Aktivität
b. Matrixmineralisierung
c. Expression osteoblastentypischer Gene
Bei der Charakterisierung der osteogenen Eigenschaften dienen primäre humane
Osteoblasten als Goldstandard.
Materialien und Methoden
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4 Materialien und Methoden
4.1 Verbrauchsmaterialien
Material Hersteller/Bezugsadresse
Aqua Spüllösung (ddH2O) DeltaSelect, Dreieich
Cell Culture Flask 175 cm² with filter cap SPL Life Sciences, Gyeonggi-do, Korea bestellt bei PAA Laboratories GmbH, Cölbe
Cell scraper 13 mm blade, 20 mm blade PAA, München
Cellstrainer PAA, München
Cryo-Tubes 2 ml PAA, München
Cuvetten: Uvette 220-1600 nm, 50-2000 µl Eppendorf, Hamburg
DMSO Sigma, München
Einmalspritzen, 2-teilig, steril, 10 ml, 20 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Ethanol 70 % zur Desinfektion Apotheke, MRI
Ethanol 99,8 % Apotheke, MRI
Formaldehyd Apotheke, MRI
Glaspipette, serologisch, steril 5 ml, 10 ml,
25 ml, 50 ml
SPL Life Sciences, Gyeonggi-do, Korea bestellt bei PAA Laboratories GmbH, Cölbe
HCl zum Einstellen des pH Wertes Merck, Darmstadt
Konische Röhrchen, Polypropylen, steril,
15 ml, 50 ml
BD Falcon™, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg
NaOH zum Einstellen des pH Wertes Merck, Darmstadt
Pasteurpipetten Glas groß 230 mm, 150 mm NeoLab, München
PCR 8er-Strips mit separatem Deckelstreifen, PP, autoklavierbar, DNase-, DNA- und RNase-frei
Brand GmbH & Co KG, Wertheim
Pipettenspitzen epT.I.P.S. Standard 0.1-10 μl, 2-200 μl, 50-1000 μl
Eppendorf AG, Hamburg
Safe-Lock Reaktionsgefäße 0.5 ml, 1.5 ml,
2.0 ml Eppendorf AG, Hamburg
Skalpell B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Steriles Wasser B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Sterilfilter PAA, München
Wasserstabil Carl Roth, Karlsruhe
Zellkulturplatte, 48 Vertiefungen, Flachboden
mit Deckel
BD Falcon™, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg
Zellkulturplatte, 96 Vertiefungen, Flachboden mit Deckel
SPL Life Sciences, Gyeonggi-do, Korea bestellt bei PAA Laboratories GmbH, Cölbe
Zellkulturschalen Falcon, 353003
Zellkulturschalen 10 cm Corning Omnilab, München
Tabelle 1: Übersicht über die verwendeten Materialien
Materialien und Methoden
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4.2 Geräte und Software
Gerät Hersteller
8-Kanal Pipette Research® (variabel) 300 μl Eppendorf AG, Hamburg
Absaugpumpe: Vacusafe comfort IBS Integra Biosciences, Fernwald
Autoclav: 2540 SL Systec, Wettenberg
Bench BDK (Luft- und Raumtechnik GmbH), Sonnenbühl-Genkingen
BioPhotometer Eppendorf, Hamburg
Einkanal Pipette Research® (variabel)
2,5 μl, 20 μl, 100 μl, 200 μl, 1000 μl Eppendorf AG, Hamburg
ELISA-Reader: FluoStar OMEGA BMG LabTec,
Gel Kammer: Wide Mini Sub Cell 6R Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Graph Pad Prism www.graphpad.com
Image J NIH, USA-Bethesda
Inkubator: Hera Cell 150 Haereus, Thermo Fisher Scientific
Intas Gel Jet Imager Intas Science Imaging Instruments GmbH, Göttingen
Kühl- und Gefrierschränke
- 80 °C - 20 °C No Frost Premium + 4 °C profi line
Sanyo, Bad Nenndorf Liebherr, CH – Bulle Liebherr, CH – Bulle
Laborabzug-7561 DIN 12924 Klasse 2 Köttermann Systemlabor, D-Uetze/Hänigsen
Luer-Zange Materialwirtschaft Klinikum MRI
Magnet Mixer: MR Hei-Mix L Heidolph, Schwabach
Mastercycler ep gradient S Eppendorf AG, Hamburg
Microsoft Excel Microsoft Office 2010
Mikroskope: Axiovert 40 CFL Eclipse TS 100
Zeiss, Berlin Zeiss, Berlin
Mikrowelle TechnoStar, Bremen
NanoDrop 1000, Spectrophotometer Thermo Scientific, USA – Wilmington
Neubauer Zählkammer Carl Roth, Karlsruhe
Ph-Meter: PB-11 Sartorius, Göttingen
Photo-Dokumentation für PCR-Gel Intas, München
pipetus® Pipettierhilfe Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co. KG, Eberstadt
PowerPac™ HC Power Supply Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Primer Blast www.pubmed.com
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, US-New York
Vortex-Genie 2 Carl Roth, Karlsruhe
Waage: EG 220-3 NM Kern & Sohn, Balingen-Frommern
Wasserbad Memmert Gmbh Co Kg, Schwabach
Zentrifugen :
Centrifuge 5804R Centrifuge 5417R
Eppendorf, Hamburg Eppendorf, Hamburg
Tabelle 2: Übersicht über die verwendeten Geräte
Materialien und Methoden
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4.3 Steriles Arbeiten
Zur Vermeidung von Kontaminationen aber auch zum Eigenschutz werden die Zellen
ausschließlich unter sterilen Bedingungen isoliert und kultiviert. Dafür werden alle Versuche
in einer sterilen Werkbank durchgeführt. Ein vertikaler, laminarer Luftstrom mit eingebauten
HEPA (high efficiency particulate air) Filter und UV-Lampe, die am Ende eines jeden
Arbeitstages für 30 min eingeschaltet wird, ermöglichen nahezu keimfreies Arbeiten.
Zusätzlich ist gründliches Händewaschen vor Arbeitsbeginn, das Tragen von Handschuhen
und die Händedesinfektion mit Ethanol 70 % essentiell. Zu Beginn der Tätigkeit werden die
Flächen der Werkbank sowie alle verwendeten Materialien mit Ethanol 70 % abgesprüht.
Nicht sterile Lösungen, die mit den Zellen in Kontakt kommen, werden entweder steril
filtriert oder bei 120 °C für 20 min autoklaviert. (Schantz and Ng 2004, S. 4-7)
4.4 Zellisolation
4.4.1 Isolation und Kultivierung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe
Benötigte Materialien:
DMEM High Glucose (4,5 g/L) PAA, Pasching, Austria (E15-883) mit 2 mM stabilem Glutamin
FCS Gold EU approved (FCS) PAA (A15-151) (für alle nachfolgenden Versuche gilt: FCS muss vor der Verwendung für 30 min auf 56 °C erhitzt werden, um das Komplement zu inaktivieren)
Penicillin/Streptomycin PAA (P11-010) Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA (H15-002) Kollagenase Typ: CLS II 330 U/mg Biochrom AG, Berlin (CII-22)
Durchführung der Methode:
Herstellung des Ad-MSC Kulturmediums mindestens 24 h vor Beginn der Isolation, um eine
mögliche Kontamination ausschließen zu können:
Endkonzentration
500 ml DMEM 50 ml FCS 10 % 5 ml Penicillin/Streptomycin 100 U/L
Materialien und Methoden
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Das Fettgewebe wird gewogen und in einer Zellkulturschale mit steriler Pinzette und Skalpell
zerkleinert. Anschließend gibt man das Fett in ein 50 ml Reaktionsgefäß, füllt mit D-PBS auf,
vermischt beides gut durch vorsichtiges Schütteln und zentrifugiert alles für 10 min bei
430 x g, 22 °C, ohne Beschleunigung oder Bremse. Das Fettgewebe schwimmt nach der
Zentrifugation oben und die auszuwaschenden Blutbestandteile haben sich als Pellet am
Boden gesammelt. Nun wird D-PBS und Pellet mit einer autoklavierten Glaspipetten
abgesaugt und der Waschschritt zwei- bis dreimal wiederholt, um eine Verunreinigung der
Kultur durch andere Zellarten zu minimieren.
Zwischenzeitlich kann die Kollagenase-Lösung hergestellt werden, man benötigt 1 ml Lösung
pro 1 g Fett:
Endkonzentration
0,6 mg Kollagenase CLS II 0,06 % 1 ml D-PBS
miteinander vermischen und die Lösung durch einen Sterilfilter zum Fettgewebe geben. Um
optimale Voraussetzungen für die Kollagenase zu schaffen inkubiert man das Gefäß im
Wasserbad (37 °C) für 30-60 min unter wiederholtem Schütteln bis eine Fettemulsion
entstanden ist. Zum Stoppen der Enzymwirkung in diesem Ansatz gibt man nun 10 ml
Kulturmedium zu, mischt es durch vorsichtiges Schwenken unter und zentrifugiert alles für
10 min bei 600 x g, 22 °C mit einer mittleren Beschleunigungs- und Bremsstärke. Das oben
aufschwimmende Fett kann mit der Pinzette abgenommen und der flüssige Überstand
abgesaugt werden. Das Pellet wird mit 12 ml warmem D-PBS resuspendiert und, um
verbleibendes Bindegewebe zu entfernen, durch einen Zellfilter mit einer Porengröße von
200 µm in ein neues 50 ml Gefäß gefiltert. Nach Zugabe von 15 ml Kulturmedium kann die
Zellsuspension in eine Kulturflasche mit 175 cm2 gegeben werden. Inkubation der Zellen bei
37 °C und 5 % CO2 mit anschließendem Mediumwechsel nach 12-24 h, um nicht adhärente
Zellen (z.B. Erythrozyten) zu entfernen, danach im Intervall von 5 Tagen wechseln. Sind am
Folgetag im Lichtmikroskop viele frei schwimmende Zellen zu erkennen ist ein Waschschritt
mit D-PBS vor der erneuten Mediumzugabe empfehlenswert.
Materialien und Methoden
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4.4.2 Isolation und Kultivierung von Osteoblasten aus Knochen
Benötigte Materialien:
MEM-EARLE PAA, Pasching, Austria (E15-024) HAM’S F-12 PAA (E15-016) FCS Gold EU approved (FCS) PAA (A15-151) Penicillin/Streptomycin PAA (P11-010) Glutamin PAA (M11-006) L-Ascorbinsäure-2-phosphatsesquimagnesium
Salzhydrat (MW: 289,54 g/mol) Sigma, München (A8960) ß-Glycerolphosphatdinatrium Salzhydrat
(MW: 216,04 g/mol) Sigma (G9891) Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA (H15-002) Kollagenase Typ: CLS II 330 U/mg Biochrom AG, Berlin (CII-22)
Durchführung der Methode:
Herstellung des MEM-EARLE/HAM’s F12 Kulturmediums vor Beginn der Isolation:
1. L-Ascorbinsäure-2-phosphat Stocklösung
Endkonzentration
128 mg L-Ascorbinsäure-2-phosphat (MW: 289,54 g/mol) 0,05 mM 10 ml D-PBS sterile Filtration
20 Aliquots á 0,5 ml abfüllen und bei -20 °C aufbewahren
2. β-Glycerolphosphat Stocklösung
Endkonzentration
108 mg ß-Glycerolphosphat (MW: 216,04 g/mol) 0,05 mM 10 ml D-PBS sterile Filtration
20 Aliquots á 0,5 ml abfüllen und bei -20 °C aufbewahren
3. MEME/HAM’s F12 Kulturmedium
Endkonzentration
500 ml einer 1:1 Mischung aus MEME und HAM’s F12 50 ml FCS 10 % 5 ml Penicillin/Streptomycin 100 U/L 0,5 ml L-Ascorbinsäure-2-phosphat Stocklösung 0,005 mM 0,5 ml ß-Glycerolphosphat Stocklösung 0,005 mM
Materialien und Methoden
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Das Knochenfragment (in dieser Arbeit werden ausschließlich Femurköpfe verwendet) gibt
man in eine Zellkulturschale. In ein 50 ml Reaktionsgefäße (A) werden 40 ml D-PBS
vorgelegt. Da man zum Bearbeiten des Knochens diesen in die Hand nehmen muss, ist die
Verwendung von sterilen Handschuhen erforderlich. Nun mit einer Knochenzange nach Luer
kleine Fragmente aus dem Spongiosa- und Markbereich gewinnen und sofort in das
vorbereitete Gefäß (A) geben (der restliche Knochen muss als Sondermüll entsorgt werden).
Zum Waschen der Knochenstücke füllt man das Gefäß (A) bis 50 ml mit D-PBS auf,
verschließt und schwenkt es vorsichtig und saugt mit einer sterilen Glaspipette
Fetttröpfchen und D-PBS ab. Diesen Waschvorgang wiederholt man solange bis der Knochen
weitestgehend fett- und blutfrei ist. Als nächstes bereitet man die Kollagenase-Lösung zu,
man benötigt 1 ml Lösung pro 1 ml Knochen:
Endkonzentration
0,7 mg Kollagenase CLS II 0,07 % 1 ml D-PBS
miteinander vermischen und steril filtriert in Gefäß (A) geben. Anschließende Inkubation im
Wasserbad bei 37 °C für eine Stunde unter mehrmaligem Schwenken.
Den Überstand aus Gefäß (A) abnehmen und in ein neues Gefäß (B) geben, die
Knochenfragmente in (A) werden dann noch weitere zweimal mit D-PBS gewaschen und die
Waschlösung wieder in (B) überführt. Gefäß (B) zentrifugiert man für 10 min bei 600 x g,
20 °C ohne Beschleunigung oder Bremse, saugt den Überstand ab und resuspendiert das
Pellet in 25 ml MEME/HAM’s F12 Medium. Abschließend gibt man die Zellsuspension in eine
Kulturflasche mit 175 cm2, diese aus dem Kollagenaseüberstand stammenden Osteoblasten
tragen die Bezeichnung OSÜ. Die Knochenfragmente aus Gefäß (A) füllt man ebenso in ein
Zellkulturflasche (175 cm2) und gibt 25 ml Medium hinzu, die Zellen, die aus der Spongiosa
heraus wachsen werden als Osteoblasten aus der Spongiosa (OSS) bezeichnet. Beide
Flaschen werden nun bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Mediumwechsel am nächsten Tag und
dann alle 5 Tage.
Materialien und Methoden
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4.5 Zellzahlbestimmung
4.5.1 Sulforhodamin B (SRB) Färbung
SRB bindet unter sauren Bedingungen an Oberflächenproteine und findet Verwendung bei
der Erstellung von Wachstumskurven, Toxizitätstests und der Normalisierung von
Enzymaktivitäten ohne die Zellen dabei zu lysieren.
Benötigte Materialien:
Ethanol 99,8 % Apotheke, MRI Essigsäure 99,8 % Sigma, München (695084) Sulforhodamin B Natriumsalz Sigma (S9012) TRIS (hydroxymethyl)-aminomethan Sigma (T87602)
Durchführung der Methode:
Herstellung der benötigten Lösungen:
1. 1 % Essigsäurelösung
Endkonzentration
10 ml Essigsäure 1 % 990 ml ddH2O
2. Sulforhodamin B (SRB-) Lösung
Endkonzentration
1 g Sulforhodamin B (MW: 580,65 g/mol) 0,4 % 250 ml 1 % Essigsäurelösung Lösung ist wiederverwendbar in brauner Flasche lagern
3. 10 mM ungepufferte TRIS-Lösung (pH = 10 – 10,5)
Endkonzentration
1,2 g TRIS-aminomethan (MW: 121,14 g/mol) 10 mM 1 L dH2O
Zu Beginn saugt man das Medium von den Zellen ab und fixiert diese für 1 h bei -20 °C mit
Ethanol. Das Ethanol wird wieder abgesaugt und die Zellen mit SRB-Lösung bedeckt:
50 µl pro Well einer 96-Well-Platte 300 µl pro Well einer 48-Well-Platte 600 µl pro Well einer 24-Well-Platte
Materialien und Methoden
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Zur Inkubation der Färbelösung die Platte lichtdicht abdecken und für 30 min auf den
Schwenkinkubator stellen. Anschließend wird die wiederverwendbare SRB-Lösung zurück in
die Flasche gegeben und der überschüssige, nicht gebundene Farbstoff viermal mit
1 % Essigsäurelösung abgewaschen. Im Lichtmikroskop ist nun eine pinke Färbung der Zellen
zu erkennen (siehe Abbildung 11).
Abbildung 11: Zellen nach SRB-Färbung Lichtmikroskopische Aufnahme von Zellen nach Färbung mit SRB-Lösung (Vergrößerung: 10 X).
Zur Quantifizierung das SRB vollständig auf dem Schwenkinkubator mit 10 mM
ungepufferter TRIS-Lösung lösen
100 µl pro Well einer 96-Well-Platte 200 µl pro Well einer 48-Well-Platte 400 µl pro Well einer 24-Well-Platte
und die optische Dichte (OD) bei = 565 nm (OD des SRB) (siehe Abbildung 12) und
= 690 nm (Störeinflüsse, z.B. durch eventuelle Beschädigungen an der verwendeten Platte)
messen. Zur Berichtigung der Messwerte bildet man die Differenz aus beidem:
OD565 nm – OD690 nm. Das Ergebnis stellt eine relative Bestimmung der Oberflächenproteine
der fixierten Zellen dar und dient somit als relative Zellzahlbestimmung (Skehan, Storeng et
al. 1990, S. 1107).
Materialien und Methoden
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Abbildung 12: Spektraluntersuchung der SRB-Lösung Die Abbildung zeigt das Absorptionsmaximum der SRB-Lösung bei 565 nm.
Arbeitsschritt Lösung Dauer / Temperatur
Fixierung Ethanol 1 h / -20 °C
Färbung SRB-Lösung 30 min, lichtdicht, Shaker / RT
Waschen 1 % Essigsäure 4 x
Farbstoff lösen / Quantifizierung
10 mM ungepufferte TRIS-Lösung
bis der Farbstoff vollständig gelöst ist / RT
Tabelle 3: Arbeitsschritte der SRB-Färbung Übersicht über die einzelnen Arbeitsschritte der SRB-Färbung.
4.5.2 Zellzahlbestimmung (Neubauer Zählkammer) und Aussäen einer bestimmten
Zellzahl pro cm2
Benötigte Materialien:
Neubauer Zählkammer Laboroptik GmbH, Bad Homburg Trypan blau 0,5 % Biochrom AG, Berlin (L6323) Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA, Pasching, Austria (H15-002) Ethanol 70 % Apotheke MRI
Wellenlänge [nm]
Ab
sorp
tio
n
Materialien und Methoden
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Durchführung der Methode:
Zum Aussäen einer bestimmten Anzahl von Zellen pro Flächeneinheit, muss erst die
Gesamtzellzahl der Zelllösung nach dem Resuspendieren des Pellets ermittelt werden. Dazu
entnimmt man der Zellsuspension 30 µl und vermischt diese gut mit 30 µl Trypan blau
Stocklösung:
Endkonzentration
1 ml Trypan blau 0,5 % 0,125 % 3 ml D-PBS
Abbildung 13: Schematische Darstellung einer Neubauer Zählkammer Die schematische Darstellung zeigt die Interferenzlinien, die zwischen Zählkammer und Deckglas entstehen, wenn man dies nach Befeuchten mit der Atemluft mit sanftem Druck von vorne aufschiebt (modifiziert anhand der Herstellerangaben). Vergrößerte Darstellung der Zählnetze siehe nächste Abbildung.
Die speziell für Zellzählungen entwickelte Neubauer Zählkammer (siehe Abbildung 13) wird
wie folgt vorbereitet: zuerst Zählkammer und Deckglas mit Ethanol säubern. Anschließend
beides mit Atemluft befeuchten und das Deckglas mit sanftem Druck von vorne auf die
Zählkammer schieben (Vorsicht: Bruchgefahr des Deckglases). Die Ausbildung von
Interferenzlinien („Regenbogenlinien“) auf beiden Außenstegen zeigt, dass das Deckglas
richtig aufsitzt und somit der Abstand zwischen Mittelsteg und Deckglas 0,1 mm beträgt.
Nun gibt man die Trypan blau-Zelllösung mit einer Pipette an die Grenze zwischen Deckglas
und Zählkammer, welche durch die Kapillarwirkung in den Spalt zwischen Deckglas und
Kammerboden gesogen wird. Es ist darauf zu achten, dass keine Luftblasen zwischen
Kammer und Deckglas verbleiben. Die so beschickte Zählkammer kann nun unter dem
Mikroskop ausgezählt werden, wobei blau gefärbte Zellen tot sind und nicht mitgezählt
werden.
GrundplatteBeschriftungsfeld
Außensteg
Zählnetze
Deckglas Interferenzlinien
Materialien und Methoden
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Abbildung 14: Vergrößerte Darstellung des eingravierten Zählnetzes auf einer Neubauer Zählkammer (modifiziert anhand der Herstellerangaben)
(a) schwarze Punkte: Zellen, die mitgezählt werden, graue Punkte: Zellen, die nicht mitgezählt werden (b) empfohlene Zählrichtung (c) großes Quadrat (insgesamt 9 pro Zählnetz) (d) kleines Quadrat (insgesamt 16 in jedem großen Quadrat eines Zählnetzes)
Alle Zellen, die innerhalb der 16 kleinen Quadrate plus diejenigen, welche auf bzw. an zwei
der vier Begrenzungslinien liegen werden in Pfeilrichtung zusammengezählt. Auf diese Weise
werden die je neun großen Quadrate der zwei Zählnetze ausgezählt, anschließend addiert
und die Zellzahl wie folgt berechnet:
Gesamtzellzahl G:
Anzahl der lebenden Zellen L:
Vitalität VI [%]:
n: Mittelwert aller gezählten Zellen
m: Mittelwert aller lebenden Zellen
VF: Verdünnungsfaktor (hier: 2) V: Volumen der Zellsuspension 104: Faktor der Zählkammer
Materialien und Methoden
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Um eine definierte Anzahl von Zellen pro cm² auszusäen, wird als nächstes die insgesamt
benötigte Zellzahl B berechnet:
Mit dem letzten Rechenschritt
ermittelt man die Menge an Zellsuspension, die in das Behältnis zuzugeben ist.
4.6 Kultur und Differenzierung
4.6.1 Passagieren
Benötigte Materialien:
Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA, Pasching, Austria (H15-002) Trypsin-EDTA (1 X) PAA (L11-004) Kulturmedium für die jeweilige Zellart
Durchführung der Methode:
Als Erstes das Kulturmedium mit einer sterilen Glaspipette absaugen und 20 ml warmes
D-PBS für 5 min in die Flasche geben, um Mediumreste, die das Trypsin inaktivieren würden,
auszuwaschen. Bei sehr hoher Konfluenz (80-100 %) sollte dieser Waschschritt ein zweites
Mal wiederholt werden. Nach erneutem Absaugen der Waschlösung Trypsin (2 ml auf eine
175 cm² Flasche) hinzugeben, durch Schwenken verteilen bis der Boden vollständig bedeckt
ist und die Flasche für 5 min bei 37 °C inkubieren lassen. Zum Lösen von noch am Plastik
adhärenten Zellen vorsichtig mit der Handinnenfläche gegen die Seitenwände klopfen.
Mikroskopisch kontrolliert man ob alle Zellen eine kugelige Form angenommen haben und
frei in der Flüssigkeit schwimmen, dies sind sichere Zeichen, dass sie sich vom Boden gelöst
haben. Ist das nicht der Fall muss die Inkubationszeit um 5 min verlängert werden. Um nun
das Trypsin zu inaktivieren und die Zellen gesammelt in ein Reaktionsgefäß überführen zu
können, die Zellen mit warmem Kulturmedium vom Flaschenboden spülen. Dazu 15 ml
Materialien und Methoden
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Medium in eine serologische Pipette aufnehmen, dabei die Flasche so halten, dass der
Flaschenhals schräg nach oben zeigt und mehrmals mit diesen 15 ml Medium die Zellen vom
Flaschenboden abspülen. Anschließend die Zellsuspension in ein Reaktionsgefäß geben und
für 7 min bei 600 x g, RT mit mittlerer Beschleunigungs- und Bremsstärke zentrifugieren.
Nach dem Absaugen des Überstands und Resuspension des Zellpellets in warmem
Zellkulturmedium werden die Zellen gezählt (siehe Kapitel 4.5.2) und auf neue Flaschen oder
Schalen verteilt.
4.6.2 Adipogene und chondrogene Differenzierung mittels industriell hergestellter
Medien
Benötigte Materialien:
Preadipocate Growth Medium (PGM)-2 Bulletkit (PT-9502 & PT-8202) Lonza, Walkersville (PT-8002) Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation Medium (Ready-to-use) PromoCell, Heidelberg (C-28012)
Durchführung der Methode:
Der Versuch wird mit Ad-MSCs zweier Spender durchgeführt. Zuerst wird pro Spender eine
48-Well Platte mit Ad-MSCs bestückt. Nach 12 h wird jede Platte zur Hälfte mit dem
adipogenen und chondrogenen Medium (200 µl pro Well) beimpft und für 22 Tage bei 37 °C
und 5 % CO2 kultiviert, wobei alle 4 Tage die Differenzierungsmedien erneuert werden. Die
im Anschluss durchgeführten Färbungen sind in den Kapiteln 4.9.2 und 4.9.3 beschrieben.
4.6.3 Herstellung verschiedener Medien für die osteogene Differenzierung
Benötigte Materialien:
L-Ascorbinsäure-2-phosphatsesquimagnesium Salzhydrat (MW: 289,54 g/mol) Sigma, München (A8960)
ß-Glycerolphosphatdinatrium Salzhydrat (MW: 216,04 g/mol) Sigma (G9891)
HEPES (MW: 238,31 g/mol) Sigma (H4034) Calciumchloriddiyhdrat (MW: 147,02 g/mol) Sigma (C3881) Dexamethason (MW: 392,47 g/mol) Sigma (D2915) Cholecalciferol (MW: 384,65 g/mol) Sigma (95230)
Materialien und Methoden
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DMEM High Glucose (4,5 g/L) PAA, Pasching, Austria (E15-883) mit 2 mM stabilem Glutamin
FCS Gold EU approved (FCS) PAA (A15-151) 100 U/L Penicillin/Streptomycin PAA (P11-010) DMSO (Dimethylsulfoxid) Sigma (41639) Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA (H15-002)
Durchführung der Methode:
Zu Beginn werden die Stocklösungen für die einzelnen Substanzen angesetzt, dabei sollte
deren Konzentration so gewählt werden, dass sich einerseits der Stoff vollständig löst
andererseits aber nur eine kleine Menge zum Ad-MSC Kulturmedium (Herstellung siehe
Kapitel 4.4.1) zugeben werden muss. Am besten eignen sich daher Lösungen die 100- bis
2000fach so hoch konzentriert sind wie die gewünschte Endkonzentration.
Tabelle 4 gibt eine Übersicht über die verwendeten Konzentrationen in den jeweiligen
Stocklösungen und Differenzierungsmedien.
Substrat [c]
Stocklösung [c] im Differenzierungs-
medium Lösungsbasis
L-Ascorbinsäure-2-phosphat 100 mM 200 µM Ad-MSC Kulturmedium
HEPES 2,5 M 25 mM Ad-MSC Kulturmedium
ß-Glycerolphosphat 1 M 10 mM Ad-MSC Kulturmedium
CaCl2 1,5 M 1,5 mM Ad-MSC Kulturmedium
Dexamethason 100 µM 100 nM D-PBS
Cholecalciferol 10 mM 5 µM DMSO
Tabelle 4: Mediensupplemente Konzentrationen der Stocklösungen und Differenzierungsmedien sowie Lösungsbasen für das jeweilige Mediensupplement.
Der Mediumwechsel von Ad-MSC Kulturmedium erfolgt in einem 5 tägigen und der von
Differenzierungsmedium in einem 4 tägigen Intervall.
Materialien und Methoden
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4.6.4 Medienübersicht
Ad-MSC Kulturmedium: DMEM High Glucose (4,5 g/L) mit 2 mM stabilem Glutamin
+ 100 U/L Penicillin/Streptomycin + 10 % FCS Funktion: Kultur der Ad-MSCs
Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS: DMEM High Glucose (4,5 g/L) mit 2 mM stabilem Glutamin
+ 100 U/L Penicillin/Streptomycin + 2,5 % FCS Funktion: Basis zur Herstellung der verschiedenen Medien zur osteogenen Differenzierung und als Kontrolle
Basisdifferenzierungsmedium: Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS + 200 µM L-Ascorbinsäure-2-phosphat + 25 mM HEPES + 10 mM β-Glycerolphosphat + 1,5 mM CaCl2
Funktion: Induziert die osteogene Differenzierung und wird zur
Optimierung mit weiteren Supplementen (Dexamethason, Vitamin D3, BMP 2 und BMP 7) kombiniert
Optimiertes osteogenes Basisdifferenzierungsmedium Differenzierungsmedium: + 5 µM Vitamin D3
Funktion: Medium, das die besten Ergebnisse bei der osteogenen Differenzierung von Ad-MSCs erzielt
Materialien und Methoden
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4.6.5 BRE: Smad 1/5/8 Reporterassay
Zur Analyse des TGF-β Signallings werden die Zellen mit Adenovirus Typ 5 infiziert. Das BMP
Response Element (BRE) dient als Promotor, an den phosphoryliertes Smad1/4 als
Transkriptionsfaktor bindet (Hata, Seoane et al. 2000, S. 230). Mit Ad5-BRE-Luc infizierte Ad-
MSCs bilden Luciferase, wenn Smad1/4 phosphoryliert, also der Smad1/5/8-Signalweg vom
BMP-Liganden aktiviert wird (siehe Abbildung 15).
Abbildung 15: Smad 1/5/8 Luciferase Reporter Assay Nach Rezeptoraktivierung wird der Smad 1/5/8-Komplex phosphoryliert und induziert zusammen mit Smad 4 die Luciferase Expression. Das anschließend zugesetzte Luciferase Substrat wird von der gebildeten Luciferase gespalten wobei ein Lichtsignal entsteht (in Anlehnung an: Massague 2000, S. 170).
Benötigte Materialien:
Ad5-BRE-Luc Virus bereitgestellt von Prof. S. Dooley Rekombinantes Humanes BMP 2 PeproTech, Hamburg (120-02) Rekombinantes Humanes BMP 7 PeproTech, Hamburg (120-03) Cell Culture Lysis reagent 5 x und Promega, USA (E153A) Luciferase Substrate
TGF-βRII
BMP
Alk 1
Smad 1Smad 5
Smad 8Smad Phosphorylierung
Smad 4
BRE Reporter Sequenz
Luciferase Expression
Rezeptoraktivierung durch Ligandenbindung
Lichtsignal
Luciferase Substrat
Materialien und Methoden
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Durchführung der Methode:
50.000 Ad-MSCs werden in jedem Well von zwei 12 Well Platten ausplattiert und für 24 h
inkubiert. Auf 7,5 ml Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS gibt man 600 µl Virussuspension und
beimpft jedes Well mit 300 µl dieses Ansatzes. Am nächsten Tag wird das Medium abgesaugt
und entsprechend der S2-Richlinien autoklaviert entsorgt. Nach Entfernung des
Virusüberstandes gelten S1-Richtlinien. Je zwei Wells werden mit 500 µl verschiedener
Konzentrationen von BMP 2 und/oder BMP 7 (siehe Tabelle 5) stimuliert. Als Grundmedium
für die verschiedenen BMP-Konzentrationen und für die Kontrollgruppe wird das
Basisdifferenzierungsmedium verwendet.
Nach 48 stündiger Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2 werden die Zellen lysiert. Der
Zelllysepuffer muss vor Gebrauch im Verhältnis 1:4 mit ddH2O verdünnt werden. Das
Medium wird abgesaugt und je 30 µl Lyselösung werden in ein Well gegeben, durch
Schwenken auf dem Wellboden gut verteilt und anschließend friert man die Platten bei
-80 °C für mindestens 12 h ein.
Nun können die Zellen entweder mit einer Pipettenspitze oder einem zugeschnittenem
Zellschaber vom Wellboden abgekratzt werden und in je ein Eppendorf-Reaktionsgefäß
pipettiert werden. Anschließend werden die Proben bei 4 °C und 14.000 g für 10 min
zentrifugiert.
Für die Luciferasemessung werden 10 µl vom Überstand in eine 96 Well Platte gegeben, für
die Lowry Proteinmessung (siehe Kapitel 4.6.6) benötigt man 2 µl pro Well.
BMP 2 BMP 7 BMP 2 + 7
5, 10, 50, 100 ng/ml 5, 10, 50, 100 ng/ml 5, 10 ng/ml
Tabelle 5: Verwendete BMP-Konzentrationen Eingesetzte BMP-Konzentrationen bei der Überprüfung der Aktivierung des TGF-β Signallings mittels BRE Reporterassay.
Vor Zugabe des Luciferasesubstrates sollten die Einstellungen am Elisa reader vorgenommen
werden: Lumineszenz Messung des durch die Luciferase gebildeten Lichtes mit einem
maximalen gain (4000); da die Enzymaktivität ihren Peak zeitabhängig erreicht, wird die
Messung mindestens sechs Mal wiederholt, um einen aussagekräftigen Mittelwert zu
erhalten. Die Messwerte werden in Relative Light Units angegeben (RLU).
Zur Berechnung der RLU pro µg Protein benötigt man die Proteinmenge der gemessenen
Proben (siehe Kapitel 4.6.6). Die gemessene RLU jedes einzelnen Wells wird durch die
Materialien und Methoden
Seite | 42
dazugehörige Proteinmenge geteilt, abschließend wird noch der Mittelwert aus allen einzeln
gemessenen RLU/µg Protein für jede BMP-Konzentration und -Konstellation ermittelt.
4.6.6 Normalisierung der Luciferasemessung mittels Lowry Proteinmessung
Die Proteinmenge wird mittels der von Lowry veröffentlichten Folin Phenol Methode
bestimmt (Lowry, Rosebrough et al. 1951, S. 265-268).
Benötigte Materialien:
Bovines Serum Albumin (BSA) Sigma, München (A4503) Na-K-Tartrat Sigma (228729) CuSO4*6H2O Sigma (31293) Na2CO3 Sigma (S2127) 1 M NaOH Merck, Darmstadt (109137) Folin Reagenz Sigma (47641)
Durchführung der Methode:
Herstellung der benötigten Lösungen:
1. 10 µg/µl BSA Stocklösung:
Endkonzentration:
50 mg BSA 10 μg/μl 5 ml ddH2O
Zur Berechnung der Standardkurve benötigt man verschiedene BSA-Konzentrationen, die
wie in Tabelle 6 dargestellt, zubereitet werden:
BSA Stocklösung 8 μg/μl 6 μg/μl 4 μg/μl 2 μg/μl 1 μg/μl 0 μg/μl
10 μg/μl BSA Stock 800 μl 600 μl 400 μl 200 μl 100 μl 0 μl
ddH2O 200 μl 400 μl 600 μl 800 μl 900 μl 1000 μl
Tabelle 6: Pipettierschema der BSA-Konzentrationen zur Erstellung der Standardkurve Übersicht über die verschiedenen Konzentrationen von BSA Stock und ddH2O zur Erstellung einer Standardkurve.
Aliquots der BSA Stocklösung können bei -20 °C gelagert werden.
2. Na-K-Tartrate Stocklösung:
Endkonzentration:
2 g Na-K-Tartrate 2 % 100 ml ddH2O in brauner Flasche lagern
Materialien und Methoden
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3. CuSO4 Stocklösung:
Endkonzentration:
1 g CuSO4 * 6 H2O 1 % 100 ml ddH2O in brauner Flasche lagern
4. Na2CO3 Stocklösung:
Endkonzentration:
20 g Na2CO3 2 % 900 ml ddH2O 100 ml 1 M NaOH 100 mM
5. Lösung A:
Endkonzentration:
20 µl Na-K-Tartrate Stocklösung 1 % 20 µl CuSO4 1 % 1,96 ml Na2CO3 98 % immer frisch vor Gebrauch herstellen!
6. Lösung B:
Endkonzentration:
100 µl Folin Reagenz 1 mg/dl 2,9 ml ddH2O immer frisch vor Gebrauch herstellen!
Es werden je 2 µl der Probe in ein Well einer 96 Well Platte pipettiert. Zur gleichzeitigen
Erstellung der Standardkurve werden als Triplikate je 2 µl jeder BSA Konzentration
(Tabelle 6) in ein Well einer 96 Well Platte pipettiert. Dann gibt man 150 µl Lösung A in jedes
Well (Probe und Standardkurve) und lässt alles für 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
Anschließend werden 30 µl von Lösung B zugegeben, gut gemischt, um eine
Präzipitatbildung zu vermeiden, und es folgt ein weiterer Inkubationsschritt von 1 – 2 h bei
Raumtemperatur. Anschließend ist zu beobachten, wie sich die gelbe Lösung allmählich blau
verfärbt. Je intensiver die Blaufärbung umso mehr Protein ist in der Probe. Die Absorption
wird mit dem Elisa Reader bei = 750 nm gemessen.
Materialien und Methoden
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Zur Berechnung der Proteinmenge muss zuerst die Geradengleichung anhand der
Standardkurve (siehe Abbildung 16) ermittelt werden. Nun wird die Geradengleichung nach
x aufgelöst, die gemessenen Werte für y eingesetzt. Als Ergebnis erhält man die
Proteinmenge der Probe in µg/µl.
Zum Beispiel:
Abbildung 16: Beispiel einer Standardkurve der BSA-Lösung Das Diagramm zeigt ein Beispiel für eine Standardkurve der BSA-Lösung, dabei ist auf der Abszisse die BSA-Konzentration in µg/µl und auf der Ordinate die Absorption bei λ = 750 nm dargestellt.
Standardkurve BSA
0 2 4 6 80.0
0.2
0.4
0.6
y = 0,05905x + 0,04360
R2 = 0,9893
BSA [µg/µl]
OD
[
= 7
50
nm
]
Materialien und Methoden
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4.7 Polymerase Kettenreaktion (PCR): Charakterisierung auf mRNA-
Ebene
4.7.1 Isolation von mRNA aus Zellen
Benötigte Materialien:
peqGOLD TriFast Peqlab, Erlangen (30-2020) Chloroform Roth, Karlsruhe (6340.1) Isopropanol Apotheke, MRI 70 % und 99,8 % Ethanol Apotheke, MRI Diethylpyrocarbonat (DEPC) Sigma, München (D5758) TRIS (hydroxymethyl) aminomethan Sigma (T87602) Borsäure Sigma (B7901) Ethylendiamintetraacetat (EDTA) SIGMA (E51343 Glycerol Sigma (G5516) Isopropanol Apotheke, MRI Bromphenol Blue Sigma (114391) ddH2O Apotheke, MRI
Durchführung der Methode:
Folgende Lösungen müssen vor Beginn der Isolation hergestellt werden:
1. DEPC H2O
Endkonzentration
1 ml DEPC 0,1 % 1 l ddH2O für 1 h bei 37 °C inkubieren, anschließend autoklavieren und abkühlen lassen.
2. 10 X Tris-Borat-EDTA-Puffer (TBE)
Endkonzentration
540 g TRIS-aminomethan (MW: 121,14 g/mol) 0,89 M 275 g Borsäure (MW: 61,83 g/mol) 0,89 M 37,3 g EDTA (MW: 372,24 g/mol) 20 mM 5 L H2O auf pH 8,3 einstellen
Materialien und Methoden
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3. PCR Ladepuffer (5 X)
Endkonzentration
1 mg Zyanoblau 25 ml 10 X TBE 5 X 5 ml Glycerol 10 % 20 ml H2O
Während der gesamten Isolation ist unter dem Abzug zu arbeiten, da einige der
verwendeten Substanzen gesundheitsschädlich sind. Die Zellen wurden bis zu einer nahezu
100 %igen Konfluenz kultiviert. Zu Beginn wird das Medium vorsichtig von den Zellen
gesaugt, TriFast zugegeben und gleichmäßig über den Boden verteilt:
500 µl TriFast / 25 cm² Zellkulturflasche 1000 µl TriFast / 75 cm² Zellkulturflasche 1500 µl TriFast / 175 cm² Zellkulturflasche
Die Zellen werden gründlich mit einem Zellschaber vom Plastikboden abgeschabt und die
Suspension in ein steriles Eppendorf-Gefäß überführt. Soll die Isolation zu einem anderen
Zeitpunkt fortsetzen werden, können die Zellen bei -80 °C eingefroren werden, andernfalls
wird die Zelllösung für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Bei allen nachfolgenden
Bearbeitungsschritten werden die Proben stets auf Eis gelagert. Nach Zugabe von 100 µl
Chloroform je 500 µl TriFast wird alles für 15 s vermischt und eine weitere Inkubationspause
von 5-10 min eingelegt. Während der anschließenden Zentrifugation bei 14.000 x g, 4 °C für
10 min wird in einem weiteren Eppendorf-Reaktionsgefäß 250 µl Isopropanol je 500 µl
TriFast vorbereitet. Nach der Zentrifugation den RNA-haltigen Überstand (obere, klare
Schicht) (Abbildung 17 a) vorsichtig in das bereitgestellte Eppendorf-Gefäß pipettieren.
Beides wird vermischt, für 10 min auf Eis inkubiert und erneut wie oben zentrifugiert. Die
RNA setzt sich unten als gelartiges meist nicht sichtbares Pellet ab (Abbildung 17 b).
Materialien und Methoden
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Abbildung 17: (a) Phasentrennung nach dem ersten Zentrifugationsschritt (b) gelartiges Pellet enthält RNA Das linke Reaktionsgefäß ist eine schematische Darstellung der Phasentrennung nach dem ersten Zentrifugationsschritt, wobei der wässrige Überstand die RNA enthält. Rechts ist ein Gelpellet am Gefäßboden zu erkennen, das sich nach Zentrifugation des RNA-Überstands mit Isopropanol vermischt, absetzt.
Die flüssige Phase über der RNA wird abgeschüttet, 1 ml Ethanol 70 % zugegeben, im
Anschluss wieder wie oben beschrieben zentrifugiert und der Überstand abgegossen. Diesen
Waschschritt ein weiteres Mal wiederholen, danach das Pellet in 30 µl DEPC H2O
resuspendieren und den verbleibenden Alkohol bei offenem Deckel verdampfen lassen
(10-15 min). Die RNA wird bei -20 °C gelagert bis sie genutzt wird.
4.7.2 Bestimmung von Menge und Reinheit der RNA
Diese beiden Kriterien werden mit dem NanoDrop Spectrophotometer bestimmt. Zu Beginn
muss das Gerät geeicht werden, dazu ermittelt man den Blindwert von DEPC-H2O.
Anschließend je 1 µl der zu messenden Probe auftragen und gleichzeitig die optische Dichte
bei 230, 260 und 280 nm messen. Anschließend berechnet das Programm folgende
Quotienten:
260/280: diesen Quotienten nennt man auch primären Reinheitsparameter. Der
Richtwert für reine DNA liegt bei 1,8 und für reine RNA bei 2,0. Liegen diese
Werte niedriger, spricht dies für eine Verunreinigung durch Proteine, Phenol oder
andere Stoffe, die bei 280 nm absorbieren.
RNA
Proteine RNA
a b
DNA
Materialien und Methoden
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260/230: dieser Quotient repräsentiert den sekundären Reinheitsparameter. Der
Sollwert liegt zwischen 1,8 bis 2,2. Niedrigere Werte können z.B. durch eine
Verunreinigung mit Kohlenhydraten und / oder Phenol verursacht sein.
Zusätzlich berechnet das Programm über eine modifizierte Beer-Lambert Gleichung die RNA-
Menge in ng/µl. Für weitere Informationen zum Gerät siehe Benutzerhandbuch.
4.7.3 Überprüfung der Integrität der RNA
Mittels Gelelektrophorese (siehe Kapitel 4.7.6) wird die Intaktheit der mRNA überprüft.
Zunächst wird anhand der in Kapitel 4.7.2 bestimmten RNA-Menge berechnet, welches
Volumen der RNA-Probe 0,5 µg RNA enthält. Das ermittelte Volumen der Probe wird mit
DEPC-H2O bis auf ein Gesamtvolumen von 10 µl aufgefüllt. Nach Zugabe von 3 µl PCR-
Ladepuffer werden 10 µl von jeder Probe und 2 µl des pUC19-Markers auf ein 1,5 %iges
Agarosegel geladen und für 40 min bei 60 V an den Power Supply angeschlossen. In der
anschließenden Fotodokumentation zeigt die intakte mRNA zwei klare Banden (28S und 18S
ribosomale RNA), ist sie jedoch degradiert sind nur weiße Schlieren zu erkennen. Ein Beispiel
für intakte RNA zeigt Abbildung 18.
Abbildung 18: Beispiel einer Gelelektrophorese mit intakter RNA (invers dargestellt) Rechts ist der pUC19-Marker zu erkennen. Die aufgetragenen RNA-Proben weisen je 2 Banden, 28S und 18S ribosomale RNA auf, was für die Intaktheit der RNA spricht.
28S
18S
Proben Marker
Materialien und Methoden
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4.7.4 Synthese von komplementärer DNA (cDNA)
Zur Charakterisierung der Zellen mittels PCR muss nun die zuvor gewonnene mRNA in cDNA
umgeschrieben werden.
Benötigte Materialien:
Transcriptor High Fidelity cDNA synthesis Kit Roche, Basel (5081955) DEPC-H2O (Herstellung siehe Kapitel 4.7.1)
Durchführung der Methode:
Siehe bitte mitgelieferte Gebrauchsanweisung. Ziel ist es 1 µg RNA in einem Arbeitsgang
umzuschreiben. Die so hergestellte cDNA wird mit DEPC-H2O auf eine Endkonzentration von
5 ng/µl verdünnt und bei -20 °C gelagert.
Eine anschließende PCR (siehe Kapitel 4.7.5) mit dem Primer für Glycerinaldehyd-3-
phosphat-dehydrogenase (GAPDH), dem house keeping gene, das in jeder Zelle vorhanden
ist, gibt Aufschluss über die Intaktheit und relative Quantität der cDNA.
4.7.5 Polymerase Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase Kettenreaktion ermöglicht die selektive in vitro Amplifikation bestimmter
DNA-Abschnitte durch Nachahmung der in vivo DNA-Replikation.
Benötigte Materialien:
Primer forward und reverse MWG Operon 10 X Reaktionspuffer BD Axon,Kaiserslautern (22466) (Mg2+-frei, Detergenz-frei) Magnesiumchlorid 25 mM Axon,Kaiserslautern (22466) Taq Polymerase 1000 U Axon,Kaiserslautern (22466) dNTP-Mix 10mM je Nukleotid Axon,Kaiserslautern (24478)
Durchführung der Methode:
Die Primer wurden mit dem auf www.pubmed.com verfügbaren Primer Blasts erstellt und
von MWG Operon hergestellt (weitere Informationen zu den verwendeten Primern siehe
Kapitel 10).
Die in Pulverform gelieferten Primer müssen vor dem Gebrauch in DEPC-H2O gelöst werden.
Das vom Hersteller empfohlene Mischungsverhältnis findet man auf einer mitgelieferten
Liste (in unserem Fall 50 pmol/µl). Die Stocklösung sollte bei -80 °C gelagert werden und
Materialien und Methoden
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wird für die PCR im Verhältnis 1:10 mit DEPC-H2O verdünnt. Die Verdünnung kann wie alle
anderen PCR Reagenzien bei -20 °C aufbewahrt werden.
Die nachfolgende Tabelle beinhaltet die benötigten Reagenzien und Volumina pro
Reaktionsgefäß zur Durchführung der PCR.
Reagenz Menge/Reaktionsgefäß
Template 5 µl (bei schwachem Signal kann die Menge erhöht werden, DEPC-H2O Volumen anpassen)
DEPC- H2O 8,4 µl (bei Erhöhung des Templatevolumens anpassen: Template + DEPC-H2O müssen 13,4 µl ergeben)
10 X Reaktionspuffer BD 2 µl
Magnesiumchlorid 2 µl
Primer forward 1 µl
Primer reverse 1 µl
dNTP-Mix 0,5 µl
Taq Polymerase 0,1 µl
Gesamtvolumen 20 µl
Tabelle 7: PCR-Reagenzien und Volumina pro Reaktionsgefäß Liste der PCR-Reagenzien mit den entsprechenden Mengenangaben pro Reaktionsgefäß.
Nun werden alle PCR-Zusätze in der aufgelisteten Reihenfolge in spezielle RNase-freie
Reaktionsgefäße pipettiert, wobei darauf zu achten ist, dass sowohl die verwendeten
Substanzen als auch der hergestellte Ansatz stets auf Eis zu lagern sind. Als Probentemplate
wird cDNA von Ad-MSCs, als positive Kontrolle primäre humane osteoblastäre cDNA und als
negative Kontrolle DEPC H2O verwendet. Die Zeit- und Temperatureinstellungen am
Mastercycler (siehe Tabelle 8) sowie eine Zykluszahl von 35 wurden nach einigen
Probedurchläufen für alle getesteten Primer einheitlich beibehalten.
Phase Temperatur Dauer
1. Erste Denaturierung 95 o C 4 min
2. Denaturierung 95 o C 30 s
3. Primerhybridisierung variabel 30 s
4. Elongation 72 o C 30 s
5. Letzte Elongation 72 o C 10 min
Tabelle 8: Zeit- und Temperatureinstellungen am Mastercycler Einzelne PCR-Phasen mit den benötigten Temperatur- und Zeiteinstellungen am Mastercycler.
35 X
Materialien und Methoden
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Im Denaturierungsschritt werden die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen der
DNA aufgebrochen. Die erste Denaturierung, auch Initialisierung genannt, dauert jedoch
länger als alle darauf folgenden, um zu gewährleisten, dass nur noch DNA-Einzelstränge
vorliegen und die Primer vollständig voneinander getrennt sind.
Als nächstes folgt die Primerhybridisierung, bei der sich die Primer („Startpunkte der
Replikation“) an die DNA anlagern. Die dabei benötigte Temperatur ist für die einzelnen
Primer unterschiedlich. Sie hängt maßgeblich von der Primerlänge sowie von der Anzahl der
durch drei Wasserstoffbrücken verbundenen Guanin-Cytosin Basenpaare ab, je mehr G-C
Paare umso höher ist die Hybridisierungstemperatur.
In der letzten Phase, der Elongation, amplifiziert die thermostabile DNA-Polymerase die
Einzelstränge zu Doppelsträngen. Die Temperatur hängt von der verwendeten Polymerase
ab. Man geht davon aus, dass die DNA-Polymerase etwa 1000 bp/min anlagern kann,
dementsprechend ist die Dauer des Elongationsschritts anzupassen. Die Dauer des letzten
Elongationsschritts sollte wieder länger gewählt werden, um noch nicht vollständige
Amplifikationen abzuschließen.
Durch das exponentielle Wachstum der DNA-Stränge sind nur etwa 35 Wiederholungen der
Schritte 2-4 nötig, um ausreichend Kopien für weitere Versuche zu erhalten.
In der nachfolgenden Tabelle sind die Primersequenzen, Hybridisierungstemperatur und
Amplicongröße für jeden Primer aufgelistet:
Materialien und Methoden
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Gen Akzessions-nummer
Sequenz 5' -> 3' Hybridisierungs-temperatur [°C]
Amplicon-größe [bp] Forward Primer Reverse Primer
BMP / TGF-β Signalweg
Alk 1 / TGF-β-RI (Smad1/5/8) NM_001077401.1 GCT CAG ACA CGA CAA CAT CC ATT GCG GCT CTT GAA GTC G 60 256
Alk 2 / activin A type II receptor precursor
NM_001616.3 CTT GCA TTG CTG ACT TTG G CCA ATT TCC TCC TCA AAT GG 60 253
Alk 3 / BMPR-IA NM_004329.2 CAC TGC CCC CTG TTG TCA TAG ATC CTG TTC CAA ATC ACG ATT GT 57 179
Alk 5 / TGF-β-RI (Smad2/3) NM_004612.1 TGT TGG TAC CCA AGG AAA GC AAC ATC GTC GAG CAA TTT CC 60 287
Alk 6 / BMPR-IB NM_ 001203 CTT TTG CGA AGT GCA GGA AAA T TGT TGA CTG AGT CTT CTG GAC AA 52 130
TGF-β-RII NM_003242.5 ATG CTG CTT CTC CAA AGT GC AGG TTG AAC TCA CGT TCT GC 54 258
Bone morphogenetic protein receptor, type II (BMPRII)
NM_001204.6 CCA CCT CCT GAC ACA ACA CC GAC CTT GTT TAC GGT CTC CTG 56 154
Insulin-like growth factor-Rezeptoren
Insulin-like growth factor 1 receptor precursor (IGF-I R)
NM_00875.3 TCG ACA TCC GCA ACG ACT ATC AGG GCG TAG TTG TAG AAG AGT TT 57 241
Insulin-like growth factor 2 receptor (IGF-II R)
NM_000876.2 GTG GAA GTG TGG ATA TTG TCC AG
ACA GCT CAC TGT TGT GTT GAA 57 146
Vitamin D Rezeptoren
Retinoid X Rezeptor NM_021976.3 TGG GCT CTC CCT TTC CAG T GAT TGC ACA TAG CCG TTT GCC 57 236
Vitamin D Rezeptor NM_000376 GAC ATC GGC ATG ATG AAG GAG GCG TCC AGC AGT ATG GCA A 54 158
House keeping Gene
Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase
NM_002046.3 GTC AGT GGT GGA CCT GAC CT AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG 54 419
Materialien und Methoden
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Gen Akzessions-nummer
Sequenz 5' -> 3' Hybridisierungs-temperatur [°C]
Amplicon- größe [bp] Forward Primer Reverse Primer
Osteoblastäre Marker
Alkalische Phosphatase (AP) NM_000478.4 ACG TGG CTA AGA ATG TCA TC CTG GTA GGC GAT GTC CTT A 53 475
Bone morphogenetic protein 2 precursor (BMP 2)
NM_001200 CCC CCT ACA TGC TAG ACC TGT CAC TCG TTT CTG GTA GTT CTT CC 60 150
Bone morphogenetic protein 4 preprotein (BMP 4)
NM_130851 TGG TCT TGA GTA TCC TGA GCG GCT GAG GTT AAA GAG GAA ACG A 60 130
Bone Sialoprotein 2 (BSP 2) NM_004967 TGA CTC ATC CGA AGA AAA TGG AG CTG GAT TGC AGC TAA CCC TGT 60 202
Matrix gla protein (MGP) NM_000900 AGA TGG AGA GCT AAA GTC CAA GA GTA GCG TTC GCA AAG TCT GTA 60 102
Osteocalcin (OC) NM_000711 CAC TCC TCG CCC TAT TGG C GCC TGG GTC TCT TCA CTA CCT 62 138
Osteopontin / BSP1 NM_000582 CTC CAT TGA CTC GAA CGA CTC CGT CTG TAG CAT CAG GGT ACT G 60 257
Osteoprotegerin (OPG) NM_002546.3 CCG GAA ACA GTG AAT CAA CTC AGG TTA GCA TGT CCA ATG TG 60 313 Osteoblast Specific factor 2 (OSF 2)
NM_006475 TAA GTT TGT TCG TGG TAG CAC C GTG TGG GTC CTT CAG TTT TGA TA 60 140
RANKL NM_033012.3 TCC CAA GTT CTC ATA CCC TGA CAT CCA GGA AAT ACA TAA CAC TCC
56 245
Tabelle 9: Informationen über die verwendeten Primer Tabellarische Auflistung von Akzessionsnummer, Primersequenzen, Hybridisierungstemperatur und Amplicongröße für das jeweilige Gen.
Nach Ablauf des PCR-Programms werden die Proben mittels Gelelektrophorese (siehe Kapitel 4.7.6) ausgewertet.
Materialien und Methoden
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4.7.6 Gelelektrophorese
Bei der Gelelektrophorese werden mittels eines Agarosegels, das in einer ionischen
Pufferlösung liegt und an ein elektrisches Feld angeschlossen ist, die DNA- bzw. RNA-Stränge
ihrer Größe nach getrennt. Zusätzlich wird ein Marker aufgetragen, dessen DNA-Fragmente
validiert sind und somit als Referenz eine Größeneinschätzung der untersuchten Proben
erlaubt.
Benötigte Materialien:
peqGOLD Universal Agarose Peqlab, Erlangen (35-1020) Borsäure Sigma, München (B7901) TRIS (hydroxymethyl) aminomethan Sigma (T87602) Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Sigma (E51343) Ethidiumbromid Lösung 500 µg/ml Sigma (E1385) pUC19-Marker ready-to-use Roth, Karlsruhe (T149.1)
Durchführung der Methode:
Herstellung des 1 X TBE: 1:10 Verdünnung des 10 X TBE (siehe Kapitel 4.7.1) mit dH2O.
Hauptbestandteil des Gels ist das Polysaccharid Agarose, dessen Moleküle ein engmaschiges
Netz bilden, das die Wanderung der geladenen Teilchen erschwert. Die Porengröße dieses
Netzes lässt sich durch Konzentrationsänderungen der Agarose variieren. Üblich sind
Agarosekonzentrationen zwischen 1,5 bis 2 %, wobei für kleine geladene Teilchen ein hoher
Agaroseanteil im Gel gewählt werden sollte und umgekehrt. Für die nachfolgenden Versuche
wurde ausschließlich 1,9%iges Agarosegel verwendet (nur am speziell eingerichtetem
Ethidiumbromidplatz arbeiten, Nitrilhandschuhe verwenden und Verbrauchsmaterialien
sowie Gel im Sondermüll entsorgen):
Endkonzentration
1,9 g Agarose 1,9 % 100 ml 1 X TBE
aufkochen lassen, bis die Agarose vollständig gelöst und eine klare Flüssigkeit entstanden ist.
Nach der Zugabe von 7 µl Ethidiumbromid das Gel auf den vorbereiteten Gelschlitten gießen
und abkühlen lassen (ca. 30 min). Nun den Kamm, der kleine Taschen im Gel ausspart,
vorsichtig herausziehen und den Schlitten in die mit 1 X TBE gefüllte Kammer einsetzen. Die
Kammer muss mindestens bis 0,5 cm über dem Niveau der Geloberfläche mit Puffer
aufgefüllt werden.
Materialien und Methoden
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Zum Befüllen der einzelnen Taschen wird die Probe (20 µl) mit 5 µl Ladepuffer (pUC19-
Marker ready-to-use) vermischt und 8 µl dieser Mischung in die Tasche pipettiert. Sind alle
Proben in die Taschen eingebracht, die Kathode probennah und die Anode probenfern
anschließen und die Einstellungen am Power Supply vornehmen. Als Standardeinstellung
wurde in dieser Arbeit eine Spannung von 90 V für 30 min gewählt.
Zur Auswertung und Fotodokumentation wird der Intas Gel Jet Imager verwendet.
Abbildung 19: Beispielbild einer Gelelektrophorese (invers dargestellt) Links ist eine inverse Darstellung eines Gelelektrophoresebildes mit deutlich sichtbaren Primerdimeren zu sehen, rechts ist eine Referenzabbildung des pUC19-Markers vergrößert abgebildet.
4.8 Vitalitäts- und Viabilitätsbeurteilung mittels alamarBlue® Assay
alamarBlue® ist ein wasserlöslicher, gering toxischer Indikator zur quantitativen Bestimmung
von Zellproliferationsraten und hilft bei der Viabilitätsbeurteilung nach toxischen Einflüssen
auf die Zellen. Wachsen die Zellen so geben sie Wasserstoffionen an ihre Umgebung ab und
reduzieren diese dadurch. Findet jedoch kein Wachstum statt so bleibt das
Umgebungsmilieu oxygeniert. Der alamarBlue®-Mechanismus beruht auf einer Redox-
Reaktion, bei aktivem Zellmetabolismus (viele H+-Ionen vorhanden) wechselt der
wasserlösliche Indikatorfarbstoff Resazurin vom oxygenierten Zustand (blau, nicht
fluoreszierend) in die reduzierte Form Resorufin (rot, fluoreszierend) (vgl.
Herstellerangaben).
bp
501489404331
24219014711111067
34 (2x)
Primerdimer
Materialien und Methoden
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Benötigte Materialien:
alamarBlue® Reagenz Biozol, Eching (BZL727) Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA, Pasching, Austria (H15-002)
Durchführung der Methode:
Dem Medium wird 1/10 seines Volumens an alamarBlue® Reagenz zugegeben und die Zellen
bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Bei hohem Zellmetabolismus kann der Farbumschlag bereits
nach 30 min sichtbar sein. Abschließend wird die Resorufinfluoreszenz bei = 544 nm und
= 590 nm gemessen. Die Viabilität wird immer als prozentuale Angabe im Vergleich zur
Kontrollgruppe aufgeführt.
4.9 Funktionelle Charakterisierung
4.9.1 Nachweis osteogener Eigenschaften
Zum Vergleich der verschiedenen osteogenen Differenzierungsmedien und zum Nachweis
der abgelaufenen Matrixmineralisierung werden folgende Methoden herangezogen:
4.9.1.1 Messung der Aktivität der Alkalischen Phosphatase (AP)
Die Alkalische Phosphatase ist ein in Leber, Knochen und Plazenta produziertes Enzym und
kann vor allem im wachsenden Knochen und Gallenflüssigkeit in hohen Konzentrationen
nachgewiesen werden. Der Reaktionsmechanismus beruht auf einer Phosphatabspaltung
durch die Alkalische Phosphatase. Das farblose Substrat 4 Nitrophenolphosphat (pNPP) wird
in das gelb gefärbte 4 Nitrophenol (pNP) umgesetzt.
Benötigte Materialien:
4 Nitrophenolphosphatdinatriumsalz Sigma, München (71768) Hexahydrat (pNPP) -20 °C
4 Nitrophenollösung (pNP) 10 mM Sigma (N7660) Glyzin Sigma (G8898) Trizma-base Sigma (T1503) Magnesiumchlorid Hexahydrat (MgCl2 * 6 H2O) Sigma (M2670)
Materialien und Methoden
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Durchführung der Methode:
Herstellung des AP-Aktivitätspuffers (pH = 10,5):
Endkonzentration
3,75 g Glyzin (MW: 75,07 g/mol) 50 mM 12,11 g Trizma-base (MW: 121,12 g/mol) 0,1 M 203 g Magnesiumchlorid (MW: 203,31 g/mol) 1 M 1 L H2O pH auf 10,5 mit NaOH einstellen
Nun berechnet man das benötigte Volumen:
100 µl pro Well einer 96-Well-Platte 250 µl pro Well einer 48-Well-Platte 500 µl pro Well einer 24-Well-Platte
Nach Ermittlung des benötigten Gesamtvolumens kann die gleiche Menge AP-
Substratlösung zubereitet werden:
Endkonzentration
2 mg 4 Nitrophenolphosphat (MW: 371,12 g/mol) 2 mg/ml 1 ml AP-Aktivitätspuffer (pH = 10,5)
Zuvor muss zur Bestimmung des Substratumsatzes der AP folgende Standardkurve (siehe
Abbildung 20) pipettiert und photometrisch die Extinktion bei λ = 405 nm ermittelt werden.
Abbildung 20: Schema zum Pipettieren der AP-Aktivität Standardkurve
Pipettierstandards, die zur photometrischen Bestimmung des Substratumsatzes der AP-Aktivität benötigt werden.
500 µl von 1
500 µl von 2
500 µl von 3
500 µl von 4
500 µl von 5
500 µl von 6
500 µl von 7
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1000 µM 500 µM 250 µM 125 µM 62,5 µM 31,25 µM 15,62 µM 7,81 µM 0
jeweils 500 µl AP-Aktivitäts-Puffer vorlegen
900 µl AP-Aktivitäts-Puffer +100 µl 4 Nitrophenollösung 10 mM
1000 µl AP-Aktivitäts-Puffer
Materialien und Methoden
Seite | 58
Somit kann jedem Extinktionswert eine bestimmte Substratkonzentration zugeordnet
werden. Die Werte können dann mittels der Software Microsoft Excel in einem
Punktdiagramm gegeneinander aufgetragen werden, wobei die Substratkonzentration auf
der Abszissenachse und die Extinktion auf der Ordinate dargestellt wird. Durch die
Messpunkte wird eine Gerade gelegt und deren Funktion in der Form
bestimmt (siehe Abbildung 21).
Abbildung 21: Beispiel einer Standardkurve für die AP-Aktivität Standardkurve der AP-Aktivität, wobei auf der x-Achse die Konzentration des 4 Nitrophenol (pNP) aufgetragen wird und auf der y-Achse die dazugehörigen gemessenen Extinktionswerte.
Die Geradengleichung wird wie folgt nach x aufgelöst werden:
Zur Ermittlung der Substratkonzentration der Proben in µM muss der gemessene
Extinktionswert für y eingesetzt werden.
Das Kulturmedium vorsichtig von den Zellen absaugen, die AP-Substratlösung hinzugeben
und alles bei 37 °C inkubieren. Gleichzeitig wird AP-Substratlösung ohne Zellen zur
Standardkurve AP-Aktivität
0 100 200 300 400 5000
1
2
3
y = 0,005407x + 0,06280
R2 = 0,9978
pNP [µM]
OD
[
= 4
05
nm
]
Materialien und Methoden
Seite | 59
Ermittlung des Blindwertes und als negative Kontrolle inkubiert. Zur Messung werden immer
100 µl pro Well in einer 96-Well-Platte verwendet. Die Inkubationszeit variiert je nach
vorhandener Enzymmenge (30 min bis Stunden), sobald jedoch eine Gelbfärbung erkennbar
ist, kann mit einer Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von = 405 nm (siehe
Abbildung 22) die gebildete 4 Nitrophenolmenge genau bestimmt werden. Durch
Verrechnung mit den Blindwerten (AP-Substratlösung ohne Zellen) und Einsetzen der
Extinktionswerte für y in die oben angeführte Gleichung ergibt sich die
Substratkonzentration in µM.
Abbildung 22: Spektraluntersuchung der AP-Substrat-Lösung Die Abbildung zeigt das Absorptionsmaximum der AP-Substrat-Lösung bei 405 nm
Zum Normalisieren der AP-Aktivität auf die Zellmenge folgt im Anschluss eine Sulforhodamin
B Färbung (siehe Kapitel 4.5.1).
Wellenlänge [nm]
Ab
sorp
tio
n
Materialien und Methoden
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4.9.1.2 Alkalische Phosphatase (AP-) Färbung
Durch diese Methode kann das Zytoplasma von AP-positiven Zellen blau angefärbt werden.
Benötigte Materialien:
Echtblausalz Chroma, Münster (1A-140) Naphthol AS-MX-phosphatdinatriumsalz Sigma, München (N5000) 99,9 % Dimethylformamid Merck, Darmstadt (102375) Trizma-base Sigma (T1503) Magnesiumchlorid Hexahydrat (MgCl2 * 6 H2O) Sigma (M2670) Formaldehyd Merck (818708)
Durchführung der Methode:
Herstellung der Lösungen:
1. 0,1 M Tris Puffer (pH = 8,5)
Endkonzentration
12,11 g Trizma-base (MW: 121,12 g/mol) 0,1 M 1 L dH2o pH auf 8,5 mit HCl einstellen
2. AP-Färbepuffer
Endkonzentration
5 ml 99,9 % Dimethylformamid 0,5 % 407 mg MgCl2 * H2O (MW: 203,31 g/mol) 2 mM 1 L 0,1 M Tris Puffer
3. Formaldehyd (3,7%)
Endkonzentration
20 ml Formaldehyd (37%) 3,7 % 180 ml dH2O
4. AP-Färbelösung
Endkonzentration
0,6 mg Echtblausalz 0,06 % 0,1 mg Naphthol AS-MX-phosphat disodium Salz 0,01 % 1 ml AP-Färbepuffer filtrieren wegen Flockenbildung
Materialien und Methoden
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Zur Fixierung der Zellen saugt man das Kulturmedium vorsichtig ab und bedeckt den
Wellboden für 10 min mit 3,7 % Formaldehyd (unter dem Abzug arbeiten). Das benötigte
Gesamtvolumens der AP-Färbelösung beträgt:
100 µl pro Well einer 96-Well-Platte 250 µl pro Well einer 48-Well-Platte 500 µl pro Well einer 24-Well-Platte
Das Formaldehyd abnehmen (Sondermüll!), die AP-Färbelösung zugeben und für 30 min bei
37 °C inkubieren lassen. Anschließend die Färbelösung absaugen und nun kann unter dem
Lichtmikroskop die Blaufärbung der Zellen beobachtet werden (siehe Abbildung 23).
Arbeitsschritt Lösung Dauer / Temperatur
Fixierung 3,7 % Formaldehyd 10 min / RT
Färbung AP-Färbelösung 30 min / 37 °C
Tabelle 10: Arbeitsschritte der AP-Färbung Übersicht über die einzelnen Arbeitsschritte der AP-Färbung.
Abbildung 23: osteogen differenzierte Fettstammzelle in AP-Färbung dargestellt (Vergrößerung: 20 X) Die Alkalische Phosphatase wird in der Zelle durch die AP-Färbung blau sichtbar.
Materialien und Methoden
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4.9.1.3 Van Kossa Färbung
Mit dieser Färbung können die extrazelluläre Kollagen-Matrix und deren Mineralisierung
dargestellt werden, wobei sich das Mineral dunkelbraun bis schwarz färbt.
Benötigte Materialien:
Ethanol 99,8 % Apotheke, MRI Silbernitrat Merck, Darmstadt (1512) Natriumcarbonat Sigma, München (S2127) Formaldehyd 35 – 37 % Merck (818708) Natriumthiosulfat Pentahydrat (Na2S2O3) Merck (6516)
Durchführung der Methode:
Herstellung der Lösungen:
1. 3 % Silbernitratlösung:
Endkonzentration
15 g Silbernitrat (MW: 169,9 g/mol) 3 % 500 ml dH2O
2. Natriumcarbonat-Formaldehydlösung
Endkonzentration
50 g Natriumcarbonat (MW: 105,99 g/mol) 5 % 250 ml Formaldehyd 35 – 37 % ~ 10 % 750 ml dH2O
3. 10 % Natriumthiosulfatlösung
Endkonzentration
100 g Natriumthiosulfat Pentahydrat (MW: 248,21 g/mol) 10 % 1 L dH2O
Zu Beginn wird das Medium abgeschüttet und die Zellen mit 99,8 % Ethanol für eine Stunde
bei -20 °C fixiert. Nun wird das Ethanol abgeschüttet und die Zellen dreimal unter
Leitungswasser gewaschen (mit schwachem Wasserstrahl, der nur den Wellrand trifft). Je
nach Wellgröße gibt man im Färbeschritt für 30 min bei Raumtemperatur folgende Menge
der 3 %igen Silbernitratlösung hinzu:
Materialien und Methoden
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100 µl pro Well einer 96-Well-Platte 250 µl pro Well einer 48-Well-Platte 500 µl pro Well einer 24-Well-Platte
Es folgt ein weiterer Waschschritt mit Leitungswasser wie oben beschrieben und nun gibt
man für 2 min Natriumcarbonat-Formaldehydlösung zur Reduktion des Silbernitrats hinzu.
Im Anschluss an einen weiteren Waschschritt wird für 5 min mit einer 10 %
Natriumthiosulfatlösung überschüssiges Silbernitrat entfernt. Noch dreimal mit
Leitungswasser spülen bevor das Färbeergebnis fotodokumentiert werden kann (siehe
Abbildung 24).
Arbeitsschritt Lösung Dauer / Temperatur
Fixierung 99,8 % Ethanol 1 h / - 20 °C
Waschen Leitungswasser 3 x
Färbung 3 % Silbernitratlösung 30 min / RT
Waschen Leitungswasser 3 x
Reduktion Natriumcarbonat-Formaldehydlösung
2 min / RT
Waschen Leitungswasser 3 x
überschüssiges Silbernitrat entfernen
10 % Natriumthiosulfatlösung 5 min / RT
Waschen Leitungswasser 3 x
Tabelle 11: Arbeitsschritte der van Kossa Färbung Übersicht über die einzelnen Arbeitsschritte der van Kossa Färbung.
Abbildung 24: osteogen differenzierte Fettstammzelle in van Kossa Färbung dargestellt (Vergrößerung: 10 X) Mineralbestandteile werden durch die van Kossa Färbung dunkelbraun bis schwarz angefärbt.
Materialien und Methoden
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4.9.1.4 Alizarin Rot Färbung
Diese Methode ermöglicht eine Färbung der angereicherten Calciumionen und deren
quantitative Bestimmung mittels einer Absorptionsmessung.
Benötigte Materialien:
Alizarin Rot S Sigma, München (5533) Hexadecylpyridiumchloridmonohydrat Sigma (9002) Ethanol 99,8 % Apotheke, MRI Durchführung der Methode:
Herstellung der benötigten Lösungen:
1. 0,5 % Alizarin Rot Lösung (pH = 4,0)
Endkonzentration
500 mg Alizarin Rot S (MW: 342,3 g/mol) 10 mM 100 ml H2O auf pH 4,0 einstellen im Wasserbad 37 °C lösen, ist max. 2 Monate haltbar
2. Cetylpyridiumchloridlösung 10 %
Endkonzentration
10 g Hexadecylpyridiumchloridmonohydrat 10 % (MW: 358,01 g/mol) 100 ml H2O
Zur Bestimmung der Standardkurve wird folgendes Pipettierschema angewandt und die
Extinktion der einzelnen Proben bei λ = 562 nm bestimmt:
Standard # Cetylpyridiumchlorid
10% [µl] Alizarin Rot Lösung
0,5% [µl] Konzentration
[µmol]
1 1000 0 0
2 999,32 0,68 1
3 996,6 3,4 5
4 993,16 6,84 10
5 982,9 17,1 25
6 965,8 34,2 50
7 931,6 68,4 100
8 863,2 136,8 200
9 794,8 205,2 300
10 726,4 273,6 400
Tabelle 12: Schema zum Pipettieren der Alizarin Rot Standardkurve Pipettierstandards zur photometrischen Bestimmung der Alizarin Rot Konzentration in der extrazellulären Matrix .
Materialien und Methoden
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Mittels der erstellten Standardkurve (siehe Abbildung 25) kann jedem ermittelten
Extinktionswert eine bestimmte Konzentration Alizarin Rot zugeordnet werden. Die
Extinktion des Standard # 1 stellt den Blindwert der Messung dar. Mittels der Software
Microsoft Excel werden Extinktion und Konzentration in einem Punktdiagramm
gegeneinander aufgetragen, wobei die Extinktion auf der Ordinate und die Alizarin Rot
Konzentration auf der Abszisse dargestellt werden. Es wird eine Gerade durch die einzelnen
Messpunkte gelegt und deren Funtkion in der Form y = mx + c ermittelt. Man erhält
folgendes Diagramm:
Abbildung 25: Beispiel einer Standardkurve für Alizarin Rot Mittels der Standardkurve kann jedem gemessenen Extinktionswert die zugehörige Alizarin Rot Konzentration zugeordnet werden.
Die Geradengleichung wird wie folgt nach x aufgelöst:
Um die Alizarin Rot Konzentration der Proben in µmol berechnen zu können muss der
gemessene Extinktionswert für y eingesetzt werden.
Standardkurve Alizarin Rot
0 100 200 300 4000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
y = 0.0009399x + 0.03843
R2 = 0,9934
Alizarin Rot [µmol]
OD
[
= 5
62
nm
]
Materialien und Methoden
Seite | 66
Das Medium wird abgeschüttet und die Zellen mit 99,8 % Ethanol für eine Stunde bei -20 °C
fixiert. Danach wird das Ethanol abgenommen und die Zellen vorsichtig dreimal mit
Leitungswasser gewaschen. Zur Färbung der Zellen gibt man für 10 min 0,5 % Alizarin Rot
Lösung dazu, wäscht danach zweimal mit Leitungswasser und lässt alles bei Raumtemperatur
5 bis 10 min trocknen. Zur Quantifizierung wird der Farbstoff mit 10 % Cetylpyridium-
chloridlösung (150 µl / 48-Well) vollständig gelöst und die Absorption bei = 562 nm (siehe
Abbildung 26) gemessen.
Abbildung 26: Spektraluntersuchung der Alizarin Rot Färbelösung
Die Abbildung zeigt das Absorptionsmaximum der Alizarin Rot Färbelösung bei = 562 nm.
Arbeitsschritt Lösung Dauer / Temperatur
Fixierung 99,8 % Ethanol 1 h / -20 °C
Waschen Leitungswasser 3 x
Färbung 0,5 % Alizarin Rot Lösung 10 min / RT
Waschen Leitungswasser 2 x
Trocknen 5 - 10 min / RT
Farbstoff lösen / Quantifizierung
10 % Cetylpyridium-chloridlösung
bis der Farbstoff vollständig gelöst ist / RT
Tabelle 13: Arbeitsschritte der Alizarin Rot Färbung Übersicht über die einzelnen Arbeitsschritte der Alizarin Rot Färbung.
Wellenlänge [nm]
Ab
sorp
tio
n
Materialien und Methoden
Seite | 67
4.9.2 Nachweis chondrogener Eigenschaft: Alcianblau Kernechtrot Färbung
Histologisch können saure Mukosubstanzen mit der Alcianblau Kernechtrot Färbung
nachgewiesen werden. Diese Mukosubstanzen (Glykosaminoglykane) lassen sich mit
Alcianblau-Lösung, die einen pH-Wert von 2,5 hat, anfärben. Kollagene Fasern sind hier
tiefblau, die Kerne leuchtend rot und das Zytoplasma blassrosa bis schwach bläulich (Welsch
2005, S. 7).
Benötigte Materialien:
Essigsäure 99,9 % Roth, Karlsruhe (3738.4) Alcianblau Roth (74240) Kernechtrot-Aluminiumsulfatlösung Roth (N069.1) 3,7 % Formaldehyd Lösung Fischar, Saarbrücken (6398013)
Durchführung der Methode:
Herstellung der Alcianblau Färbelösung:
Endkonzentration
1 g Alcianblau 1 % 3 ml Essigsäure 3 % 97 ml Wasser
Die Zellen werden mit 3,7 % Formaldehyd für 10 min fixiert (unter dem Abzug arbeiten) und
anschließend zweimal mit dH2O gewaschen. Zuerst färbt man mit Alcianblau für 30 min,
schüttet dieses ab und wäscht verbleibende Farbreste vorsichtig mit Leitungswasser ab. Im
zweiten Färbeschritt gibt man die Kernechtrot-Aluminiumsulfatlösung für 5 min auf die
Zellen und wäscht erneut zweimal mit Leitungswasser. Das Färbeergebnis kann nun
fotografisch dokumentiert werden (siehe Abbildung 27).
Arbeitsschritt Lösung Dauer / Temperatur
Fixierung 3,7 % Formaldehyd 10 min / RT
Waschen dH2O 2 x
Färbung 1 Alcianblau Lösung 30 min / RT
Waschen Leitungswasser 2 x
Färbung 2 Kernechtrot-Aluminiumsulfatlösung 5 min / RT
Waschen Leitungswasser 2 x
Tabelle 14: Arbeitsschritte der Alcianblau Kernechtrot Färbung Übersicht über die einzelnen Arbeitsschritte der Alcianblau Kernechtrot Färbung.
Materialien und Methoden
Seite | 68
Abbildung 27: Alcianblau Kernechtrot (Vergrößerung: 10 X) Ad-MSCs nach chondrogener Differenzierung mit Alcianblau Kernechtrot Lösung gefärbt,
die Zellkerne stellen sich rot und die Knorpelfasern blau dar.
4.9.3 Nachweis adipogener Eigenschaft: Ölrot O Färbung
Ölrot O ist ein fettlöslicher Farbstoff und färbt neutrale Lipide in kultivierten Zellen und der
Spongiosa rot.
Benötigte Materialien:
Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA, Pasching, Austria (H15-002) 3,7 % Formaldehyd Lösung Fischar, Saarbrücken (6398013) Ölrot O Sigma, München (O0625) Isopropanol Apotheke, MRI
Durchführung der Methode:
Herstellung der benötigten Lösungen:
Ölrot O Stocklösung:
Endkonzentration:
0,7 g Ölrot O (MW: 408,51 g/mol) 0,35 % 200 ml Isopropanol
Ölrot O Arbeitslösung:
Endkonzentration:
6 ml Ölrot O Stocklösung 0,2 % 4 ml ddH2O
Materialien und Methoden
Seite | 69
Zuerst wird das Medium vorsichtig abgesaugt und die Zellen mit 3,7 % Formaldehyd (unter
dem Abzug arbeiten) für 5 min bei Raumtemperatur fixiert. Das Formaldehyd wird abgesaugt
(Sondermüll) und die Zellen wie folgt mit Ölrot O Arbeitslösung bedeckt:
50 µl pro Well einer 96-Well-Platte 200 µl pro Well einer 48-Well-Platte 500 µl pro Well einer 24-Well-Platte
Nach 15 minütiger Schüttelinkubation bei Raumtemperatur, werden die Zellen dreimal mit
Leitungswasser gewaschen. Nun sind unter dem Mikroskop die rot angefärbten Fettvakuolen
gut zu identifizieren (siehe Abbildung 28).
Arbeitsschritt Lösung Dauer / Temperatur
Fixierung 3,7 % Formaldehyd 5 min / RT
Färbung Ölrot O Arbeitslösung 15 min / RT / Shaker
Waschen Leitungswasser 3 x
Tabelle 15: Arbeitsschritte der Ölrot O Färbung Übersicht über die einzelnen Arbeitsschritte der Ölrot O Färbung.
Abbildung 28: Ölrot O Färbung Ad-MSCs nach adipogener Differenzierung mit Ölrot O gefärbt. Die Fettvakuolen
sind rot angefärbt und deutlich zu erkennen (Vergrößerung: 20 X).
Materialien und Methoden
Seite | 70
4.10 Densitometrische Auswertung
Benötigte Software:
Image J; NIH, USA-Bethesda, public domain (http://rbs.info.nih.gov/ij/)
Auswertung:
Die Intensität der einzelnen Banden des Agarosegels ist das semiquantitative Maß der
Genexpression. Die densitometrische Auswertung der Intensität der Banden erfolgte mit der
Software Image J. Dabei rechnet das Programm die im .jpg-Format dargestellten
Bandensignale nach Subtraktion des Hintergrundes in eine Pixelzahl um. Die
Pixelintensitäten werden durch die jeweilige Expositionszeit geteilt, um sicher zu stellen,
dass die Signale im linearen Belichtungsbereich liegen. Werte im Detektionslimit und
Sättigungsbereich werden aus der Berechnung herausgenommen. Als interner Standard wird
GAPDH verwendet. Dazu wird jeweils das Verhältnis der Bandenintensität des jeweiligen
Gens und der GAPDH-Intensität gebildet. Die Ergebnisse werden mit dem Programm
Microsoft Excel gespeichert.
4.11 Statistische Auswertung
Die Versuche werden mit mindestens 3 Spendern (N ≥ 3) und in Triplikaten (n = 3) oder
Quadruplikaten (n = 4) durchgeführt. Die genaue Anzahl der Spender wird bei jedem Versuch
explizit aufgeführt. Die Ergebnisse aller durchgeführten Methoden werden im
Softwareprogramm Microsoft Excel aufgelistet. Die statistischen Analysen und die
Diagrammerstellung erfolgt mit dem Programm Graph Pad Prism. Die Daten werden
zunächst mit dem Shapiro-Wilk-Test auf Normalverteilung untersucht. Der Vergleich der
Ergebnisse erfolgt als parameterfreie Varianzanalyse (ANOVA). Ergeben sich signifikante
Unterschiede der Gruppen wird basierend auf der Verteilung der Daten der Dunnett’s Test
oder Bonferroni-Test als Post hoc-Verfahren angewendet. Für alle Analysen wird ein
Signifikanzniveau von p < 0,05 gewählt.
Ergebnisse
Seite | 71
5 Ergebnisse
5.1 Zellzahltest
Um für die nachfolgenden Versuche die Parameter der Reproduzier- und Vergleichbarkeit zu
gewährleisten, muss die maximal verwendbare Zellzahl pro cm² ermittelt und anschließend
als Standard festgelegt werden.
Für diesen Versuch wurde eine 96 Well Platte verwendet. In je drei Wells wurden 2.000
Zellen gegeben und die Zellzahl immer um weitere 2.000 Zellen bis auf 30.000 Zellen pro
Well gesteigert. Zur Kontrolle wurden die verbleibenden drei Wells nur mit Medium
bestückt. Nach einer Inkubationsdauer von 24 h bei 37 °C bei 5 % CO2 wurde mittels
alamarBlue® (siehe Kapitel 4.8) und SRB-Färbung (siehe Kapitel 4.5.1) ermittelt, wie viele
Zellen mit steigender Anzahl noch überleben bzw. adhärieren können.
Abbildung 29: Bestimmung der Zellviabilität mittels alamarBlue® R² = 0,9391, N = 3, n = 3; Die Darstellung zeigt, dass die Viabilität der Zellen bis 24.000 Zellen/cm
2 ansteigt, darüber hinaus
sinkt sie jedoch wieder ab.
Zellviabilität (alamarBlue®)
0 10000 20000 300000
20000
40000
60000
Zellzahl
alam
arB
lue®
[Ex
/Em
= 5
44
/59
0 n
m]
Ergebnisse
Seite | 72
Abbildung 30: Bestimmung der Zelladhärenz mittels SRB-Färbung R² = 0,9256, N = 3, n = 3; Bis zu einer Dichte von 26.000 Zellen/cm2 können die Zellen adhärieren, darüber hinaus beginnen sie zu verklumpen.
Bis 24.000 Zellen pro cm2 zeigte die alamarBlue® Messung (Abbildung 29) einen nahezu
linearen Anstieg. Die am Vortag in diesen Wells ausgesäten Zellen hatten weder Platz- noch
Nährstoffmangel. Ab jedoch 26.000 Zellen pro cm2 fielen die alamarBlue® Werte stark ab,
was ein beginnendes Absterben der Zellen signalisiert.
Ein ähnliches Bild lieferte die nachfolgende Adhärenzuntersuchung mittels SRB-Färbung
(Abbildung 30) bei der ebenso ein annähernd linearer Geradenverlauf bis 26.000 Zellen pro
cm2 und ein anschließender Abfall der gemessenen Werte zu beobachten war.
Dies zeigt, dass der Metabolismus bereits vor der maximalen Adhärenz sinkt, bedingt z.B.
durch Nährstoff- und O2-Mangel oder aber auch durch Kontaktinhibition (Seluanov, Hine et
al. 2009, S. 19352).
Da die folgenden Versuche auf einen Zeitraum von bis zu 21 Tage ausgelegt waren und die
Zellen im Wachstumsstadium weder einem Platz- noch Nährstoffmangel ausgesetzt werden
sollen, wurde eine Zellzahl von 10.000/cm² festgelegt (dies entspricht 4.000 Zellen pro Well
einer 96 Well Platte).
Zelladhärenz (SRB-Färbung)
0 10000 20000 300000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Zellzahl
SRB
OD
= 5
65
nm
- 6
90
nm
Ergebnisse
Seite | 73
5.2 Chondrogene und adipogene Differenzierung mit industriell
erzeugten Medien
Zum Beweis, dass es sich bei den aus Fettgewebe isolierten Zellen auch wirklich um MSCs
handelt, wurde die chondrogene und adipogene Differenzierungsfähigkeit mittels industriell
hergestellter Medien überprüft (siehe Kapitel 4.6.2).
Zellen aus Passage drei wurden in eine 48 Well Platte ausgesät und je eine Hälfte der Platte
mit chondrogenem bzw. adipogenem Medium stimuliert. Der Mediumwechsel fand in einem
viertägigen Intervall statt, nach 24 Tagen wurden die Zellen fixiert und mittels Alzian Blau
Kernechtrot bzw. Ölrot O gefärbt.
Bei den chondrogen stimulierten Zellen war bereits nach 10 Tagen morphologisch die
beginnende Ausbildung von faserartigen Strukturen zu erkennen. Nach weiteren zwei
Wochen war das typische Stammzellbild verschwunden und alle Zellen hatten sich
faserförmig angeordnet. In der Alzian Blau Kernechtrot Färbung (siehe Kapitel 4.9.2) der
Präparate zeigten sich kollagene Fasern blau und die Kerne rot (Welsch 2005, S. 7). Die
unstimulierten Kontrollzellen blieben morphologisch unverändert, es färbten sich lediglich
die Zellkerne rot (siehe Abbildung 31).
Abbildung 31: Kontrollgruppe und chondrogen stimulierte Fettgewebsstammzellen nach Alzian Blau Kernechtrot Färbung Die linke lichtmikroskopische Aufnahme zeigt unstimulierte Zellen (Kontrollgruppe), Kreis = Zellkern (Vergrößerung: 10 X). Die rechte lichtmikroskopische Aufnahme zeigt mit chondrogenem Medium stimulierte Zellen nach der Alzian Blau Kernechtrot Färbung, Kreis = Zellkern, Pfeil = Kollagene Fasern (Vergrößerung: 10 X)
Ergebnisse
Seite | 74
Die Differenzierung in Richtung adipogen war im Mikroskopbild erst nach ca. 16 Tagen zu
beobachten. Bereits im Nativpräparat konnte man viele kleine, in Gruppen angeordnete
Fettvakuolen erkennen, die sich in der Ölrot O Färbung leuchtend rot darstellten. In der
Kontrollgruppe waren keine Fettvakuolen sichtbar (siehe Abbildung 32).
Abbildung 32: Kontrollgruppe und adipogen stimulierte Fettgewebsstammzellen nach Ölrot O Färbung Die linke lichtmikroskopische Aufnahme zeigt unstimulierte Zellen (Kontrollgruppe; Vergrößerung: 10 X), die rechte zeigt mit adipogenem Medium stimulierte Zellen nach der Ölrot O Färbung mit eingeschlossenen Fettvakuolen (Vergrößerung: 10 X)
5.3 Ad-MSCs exprimieren osteoblastentypische Oberflächenrezeptoren
Zur Ermittlung der Zelleigenschaften wurden die undifferenzierten Ad-MSCs auf Expression
osteogener Oberflächenrezeptoren mittels RT-PCR untersucht. Primäre humane
Osteoblasten aus Knochen wurden als positive Kontrolle verwendet. Untersucht wurden die
TGF- Rezeptoren Typ I und II, der BMP Rezeptor Typ II, die Rezeptorentypen I und II des
insuline like growth factors wie auch der Retinoid X Rezeptor β und Vitamin D Rezeptor. Als
„house keeping gene“ wurde die Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase bestimmt.
Nach abgelaufener RT-PCR wurden die Proben wie folgt auf das Elektrophoresegel
aufgetragen:
Ergebnisse
Seite | 75
Abbildung 33: Bestimmung der Oberflächenrezeptoren auf Ad-MSCs und Osteoblasten Die Abbildung (invers dargestellt) zeigt die Ergebnisse der Gelelektrophorese für die verschiedenen Oberflächenrezeptoren, nachgewiesen mittels RT-PCR; Ad-MSCs = Proben der vier verschiedenen Spender, OSÜ = humane Osteoblasten aus dem Kollagenaseüberstand, die als positive Kontrolle dienen, H2O = negative Kontrolle, puC19 Marker.
Ad-MSCs waren für alle untersuchten Gene positiv. Somit können BMPs, Vitamin D3 und IGF
aufgenommen werden. Die Signalstärke (Expressionslevel) der Rezeptoren war zwischen Ad-
MSCs und Osteoblasten vergleichbar. Lediglich Alk 1 wurde in Ad-MSCs stärker exprimiert als
in Osteoblasten. Alk 2, IGF-I Rezeptor und Vitamin D Rezeptor wurden in Ad-MSCs
schwächer exprimiert als in Osteoblasten. Am Beispiel des Vitamin D Rezeptors war deutlich
zu erkennen, dass die Expressionslevel jedoch unter den einzelnen Spendern stark variierten.
5.4 Vier Zusätze im osteogenen Basisdifferenzierungsmedium
Zur Herstellung eines Basismediums für die osteogene Differenzierung wurden die
Supplemente, die auch in Osteoblastendifferenzierungsmedien verwendet werden, getestet.
Dazu wurde in Anlehnung an ein im Labor verwendetes Differenzierungsprotokoll (Ehnert,
Baur et al. 2010, S. 7) das Basismedium für die nachfolgende osteogene Differenzierung in
mehreren Versuchen durch Weglassen einzelner Zusätze variiert:
L-Ascorbinsäure-2-phosphat (c = 200 µM), -Glycerolphosphat (c = 10 mM), HEPES
(c = 25 mM) und CaCl2 (c = 1,5 mM), wobei HEPES eine Pufferfunktion bei der Zugabe von
Ascorbinsäure erfüllt.
Ad-MSCs H2O MarkerOSÜ
Alk 1
Alk 2Alk 3
Alk 5
Alk 6
IGF-I R
IGF-II R
TGF-RII
Retinoid-R
GAPDH
VitaminD-R
BMPRII
TGF-RI
β
Ergebnisse
Seite | 76
Als Mediumgrundlage diente Ad-MSC Kulturmedium mit 2,5 % FCS.
Folgende Medienkonstellationen wurden untersucht:
Basisdifferenzierungsmedium 1 2 3 4
L-Ascorbinsäure-2-phosphat 200 µM
X X
HEPES 25 mM
X X
ß-Glycerolphosphat 10 mM
X
X
CaCl₂ 1,5 mM X X X
Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS X X X X
Tabelle 16: Auflistung der im Versuch verwendeten Medienzusammensetzungen Übersicht über die verwendeten Supplemente zur Herstellung der vier verschiedenen Basisdifferenzierungsmedien.
Es wurden in einer 48 Well Platte Ad-MSCs von vier verschiedenen Spendern ausplattiert.
Am nächsten Tag wurden jeweils vier Wells mit Basisdifferenzierungsmedium 1-4 stimuliert,
Mediumwechsel nach vier Tagen und Messung der AP-Aktivität am Tag acht (siehe
Abbildung 34).
Mit Basisdifferenzierungsmedium 1 stimulierte Zellen wiesen eine AP-Aktivität von im
Schnitt 11 nmol/h auf.
Durch die Zugabe von -Glycerolphosphat und CaCl2 (Basisdifferenzierungsmedium 2)
konnte die AP-Aktivität auf ca. 12 nmol/h leicht aber dennoch nicht signifikant erhöht
werden.
Im Basisdifferenzierungsmedium 3 wurden L-Ascorbinsäure-2-phosphat, HEPES und CaCl2
als Zusätze verwendet was ebenfalls eine Enzymaktivitätssteigerung auf durchschnittlich 14
nmol/h bewirkte.
Im Basisdifferenzierungsmedium 4 kamen alle vier Zusätze zum Einsatz was zu einem
signifikanten Anstieg der AP-Aktivität auf 18 nmol/h führte (p < 0,05 im Vergleich zum
Basisdifferenzierungsmedium 1).
Eine Verdünnungsreihe von Ascorbinsäure zeigte, dass bei einer Konzentration unter 200 µM
Ascorbinsäure die Zellen nicht beginnen zu differenzieren (hier nicht gezeigt).
Ergebnisse
Seite | 77
Abbildung 34: Zugabe verschiedener Supplemente und Ermittlung der AP-Aktivität N = 4, n = 4; Basisdifferenzierungsmedium 4 weist mit p < 0,05 (*) im Vergleich zu Basisdifferenzierungsmedium 1, in dem keine Zusätze enthalten sind, eine signifikant höhere AP-Aktivität auf.
Basisdifferenzierungsmedium 4 hat den höchsten Anstieg in der AP-Aktivität und wird
deshalb in den weiteren Versuchen zum Einsatz kommen, wobei es dort nur noch als
Basisdifferenzierungsmedium bezeichnet wird.
5.5 2,5 % FCS im Medium verspricht die besten Differenzierungserfolge
Für diesen Versuch wurden die Zellen in eine 48 Well Platte ausplattiert und je 6 Wells
wurden mit 0 %, 1 %, 2,5 %, 5 %, 10 % und 15 % FCS-Konzentration in DMEM + 2 mM
L-Glutamin + 100 U/L Penicillin/Streptomycin versetzt. Nach einer Stimulationsdauer von 16
Tagen wurde die AP-Aktivität (Abbildung 35) bestimmt sowie die Zellviabilität mittels
alamarBlue® (Abbildung 36). Nach 24 Tagen wurde die gebildete mineralisierte Matrix durch
die Alizarin Rot Färbung (Abbildung 37) ermittelt.
Basisdifferenzierungsmedium 1 2 3 4
L-Ascorbinsäure-2-phosphat 200 µM X X
HEPES 25 mM X X
ß-Glycerolphosphat 10 mM X X
CaCl₂ 1,5 mM X X X
Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS X X X X
Basisdifferenzierungsmedium (AP-Aktivität)
0
5
10
15
20
25
pN
P [
nm
ol/
h]
*
Ergebnisse
Seite | 78
Abbildung 35: AP-Aktivität bei verschiedenen FCS-Konzentrationen
Zu Beginn steigt die AP-Aktivität mit zunehmender FCS-Konzentration zügig an und erreicht ihr Maximum bei 5 % FCS. Danach nimmt die AP-Aktivität mit steigender FCS-Konzentration wieder ab. Die Medien mit 1 %, 2,5 %, 5 % und 10 % FCS weisen eine signifikant höhere AP-Aktivität auf mit p < 0,01 (**) bzw. p < 0,001 (***) im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne FCS-Zugabe.
Abbildung 36: Zellviabilitätsmessung mittels alamarBlue® Bis 10 % FCS im Medium steigt die Viabilität an, wobei bereits ab 5 % ein Plateau erkennbar wird, darüber hinaus nimmt die Viabilität wieder ab. Alle FCS-Konzentrationen weisen im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne FCS-Zugabe eine signifikant (***; p < 0,001) höhere Viabilität auf.
Serumtest (AP-Aktivität)
0% 1% 2,5% 5% 10% 15%0
5
10
15
20
25
30
35
**
***
***
***
FCS im Serum
pN
P [
nm
ol/h
]
Serumtest (alamarBlue®)
0% 1% 2,5% 5% 10% 15%0
1000
2000
3000
4000
5000
***
***
*** ***
***
FCS im Serum
alam
arB
lue®
[Ex
/Em
= 5
44
/59
0 n
m]
Ergebnisse
Seite | 79
Abbildung 37: Matrixmineralisierung bei verschiedenen FCS-Konzentrationen
Oben: Die Matrixmineralisierung erzielt in den mit Serum versetzten Medien signifikant niedrigere Werte p < 0,001 (***) im Vergleich zum Medium ohne FCS.
Unten: Van Kossa Färbung der Ad-MSCs nach Behandlung mit den verschiedenen FCS Konzentrationen. Es ist deutlich zu erkennen, dass in der Gruppe ohne FCS (links) die größte Menge an mineralisierter Matrix angefärbt werden konnte.
5.6 Vitamin D3 verbessert die osteogenen Differenzierungs-
eigenschaften des Basisdifferenzierungsmediums, Dexamethason
hingegen nicht
Zur weiteren Verbesserung des osteogenen Basisdifferenzierungsmediums wurden die zwei
Supplemente - Vitamin D3 und Dexamethason - die in zahlreichen Publikationen aufgelistet
werden, zuerst näher auf ihre zelltoxischen und osteogenen Eigenschaften untersucht.
Serumtest (Alizarin Rot)
0% 1% 2,5% 5% 10% 15%0
20
40
60
80
100
600
800
1000
FCS im Serum
****** ***
******
Aliz
arin R
ot [µ
M]
Ergebnisse
Seite | 80
5.6.1 Bestimmung nicht toxischer Vitamin D3 Konzentrationen
Bei der Herstellung der Stocklösungen trat das Problem auf, dass Vitamin D3 sich nicht
vollständig in Ad-MSC Kulturmedium lösen ließ. Deshalb musste auf Ethanol (reinst) und
DMSO ausgewichen werden. Beide Substanzen weisen aber zellschädigende Eigenschaften
auf, weshalb ein Toxizitätstest der Optimierung des Differenzierungsmediums vorgeschaltet
werden musste.
In eine 96 Well Platte wurden jeweils 10.000 Zellen (sehr hohe Zellzahl auf kleiner Fläche,
dies stellt hier jedoch kein Problem dar, da die Zellen nur 48 Stunden in Kultur gehalten
wurden) von vier Spendern gebracht.
Die Vitamin D3 Stocklösungen wurden in einer Konzentration von je 10 mM mit den
Lösungsgrundlagen Ethanol (reinst) und DMSO angesetzt. Beginnend mit 20 µM Vitamin D3
in Ad-MSC Kulturmedium wurde eine serielle 1:2 Verdünnung angefertigt, so dass die Zellen
24 Stunden nach dem Ausplattieren mit je 100 µl pro Well folgender Vitamin D3
Konzentrationen beimpft wurden:
0 µM (Kontrolle), 0,3125 µM, 0,625 µM, 1,25 µM, 2,5 µM, 5 µM, 10 µM, 20 µM
Nach 24 Stunden wurde mittels alamarBlue® die Viabilität der Zellen untersucht:
Abbildung 38: exemplarische Darstellung des Viabilitätsverlaufes eines Spenders N = 4, n = 3; DMSO (rote Kurve) als Lösungsgrundlage für Vitamin D3 ist weniger toxisch für die Zellen als Ethanol (blaue Kurve) bei der höchsten eingesetzten Konzentration von Vitamin D3.
Vitamin D Toxizitätstest (alamarBlue®)
0
50
100
150
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5
Ethanol (reinst)
DMSO
co
log10 (Vitamin D [µM])
Via
bilitä
t [%
de
r K
on
tro
lle
]
Ergebnisse
Seite | 81
Es war deutlich zu erkennen, dass Vitamin D3 in DMSO (rote Kurve) gelöst in höheren
Konzentrationen geringer toxisch auf die Zellen wirkte als nach Lösung in Ethanol (blaue
Kurve). Eine Konzentration von 5 µM wurde von den Zellen sehr gut toleriert und ist auch
noch ausreichend hoch, um auf die osteogene Differenzierung Einfluss nehmen zu können.
5.6.2 Bestimmung nicht toxischer Dexamethason Konzentrationen
Im Gegensatz zu Vitamin D3 gab es bei Dexamethason keine Schwierigkeiten beim Ansetzen
der Stocklösung, es war vollständig in D-PBS löslich. Dennoch führten wir einen Toxizitätstest
durch, um sicher zu stellen, dass die in den Publikationen beschriebenen Dexamethason-
Konzentrationen nicht toxisch auf Ad-MSCs wirken.
Folgende Dexamethason-Konzentrationen wurden getestet:
0 nM (Kontrolle), 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM
Nach einer Inkubation von 24 Stunden wurde die Viabilität mittels alamarBlue® untersucht.
Abbildung 39: Viabilitätsbestimmung mittels alamarBlue® nach 24 h Inkubation mit Dexamethason N = 4, n = 6; Die Graphik zeigt einen konstanten Viabilitätsabfall um 11 % bis 800 nM Dexamethason.
Dexamethason Toxizitätstest (alamarBlue®)
0
20
40
60
80
100
120
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0log10(Dexamethason [nM])
Via
bili
tät
[% d
er K
on
tro
lle]
Ergebnisse
Seite | 82
In Abbildung 39 ist das prozentuale Überleben der Zellen bezogen auf die Kontrollgruppe bei
zunehmender Dexamethasonkonzentration aufgezeigt. Man konnte beobachten, dass bis zur
Höchstkonzentration von 800 nM die Viabilität um lediglich 11 % abnahm. Die in den
Publikationen verwendete Konzentration von 100 nM hat keinen signifikanten Einfluss auf
die Zellviabilität.
5.6.3 Vitamin D3 induziert die AP-Aktivität
Nachdem beide Zusätze einzeln auf ihre zellschädigende Wirkung getestet worden waren,
wurde ihr Einfluss auf die osteogene Differenzierung von Ad-MSCs näher untersucht.
Analog zum Basisdifferenzierungsmedium Test (siehe Kapitel 5.4) wurden wieder 4
Medienkonstellationen verwendet, die wie in Tabelle 17 beschrieben zusammengesetzt
waren.
Basisdifferenzierungsmedium ohne
Zusatz plus
Dexamethason plus
Vitamin D3
plus Dex. & Vitamin D3
Basisdifferenzierungsmedium X X X X
Dexamethason 100 nM
X
X
Vitamin D3 5 µM
X X
Tabelle 17: Vitamin D3- und Dexamethasonzugabe zum Basisdifferenzierungsmedium Verschiedene Konstellationen der Zugabe von Vitamin D3 und Dexamethason zum zuvor ermittelten Basisdifferenzierungsmedium
Die Ad-MSCs wurden in einer 48 Well Platte je Medium für 0, 1, 2, 4, 6 und 10 Tage
stimuliert und die AP-Aktivität gemessen (siehe Abbildung 40). Mediumwechsel fand alle vier
Tage statt.
Ergebnisse
Seite | 83
Abbildung 40: AP-Aktivitätsbestimmung nach Stimulation mit Vitamin D3 und Dexamethason
N = 3, n = 4 pro Tag und Medium; Die Zugabe von Vitamin D3 zum Basisdifferenzierungsmedium führt im Vergleich zu den anderen Medienkonstellationen ab dem 2. Tag zu einem signifikanten Anstieg der AP-Aktivität mit p < 0,05.
Am Tag 0, also bei den unstimulierten Zellen, war bei allen vier Medien eine vergleichbare
basale Enzymaktivität zu erkennen.
Mit Basisdifferenzierungsmedium (grün) und Basisdifferenzierungsmedium plus
Dexamethason (blau) stimulierte Zellen zeigten im Verlauf der zehn Tage einen geringen
Anstieg ihrer AP-Aktivität von durchschnittlich 15 nmol/h auf 36 nmol/h.
Bei Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3 (orange) hingegen war
keinerlei Zunahme der Enzymaktivität zu erkennen, was für ein Ausbleiben der osteogenen
Differenzierung sprechen kann.
Differenzierungsmediumtest (AP-Aktivität)
0 2 4 6 8 10
0
25
50
75
100
125
150
Zeit [d]
pN
P [
nm
ol/h
]
Differenzierungsmediumtest (AP-Aktivität)
0 2 4 6 8 10
0
25
50
75
100
125
150
Zeit [d]
pN
P [
µM
]
Basisdifferenzierungsmedium
Basisdifferenzierungsmediumplus Dexamethason
Basisdifferenzierungsmediumplus Vitamin D
Basisdifferenzierungsmediumplus Dexamethason & Vitamin D
Differenzierungsmediumtest (AP-Aktivität)
0 2 4 6 8 10
0
25
50
75
100
125
150
Zeit [d]
pN
P [
µM
]
3
3
Ergebnisse
Seite | 84
Zellen, die mit dem Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 (rot) beimpft wurden,
verzeichneten bereits nach zwei Tagen eine deutliche Zunahme der AP-Aktivität. Im Verlauf
der nächsten acht Tage erreichte die AP-Aktivität bei ca. 123 nmol/h ihr Maximum und eine
beginnende Plateaubildung war zu erkennen.
Diese Daten zeigen, dass ein Medium bestehend aus L-Ascorbinsäure-2-phosphat, HEPES,
-Glycerolphosphat, CaCl2 und Vitamin D3 in der Lage ist, die für Osteoblasten typische
AP-Aktivität bei Ad-MSCs signifikant zu erhöhen. Die Messung kann schon nach einer
Stimulationsdauer von sechs bis zehn Tagen durchgeführt werden, da sich die Messwerte
nach diesem relativ kurzen Zeitraum bereits im Bereich der erreichbaren Maximalwerte
bewegen.
Abschließend konnte mittels der AP-Färbung (siehe Kapitel 4.9.1.2) die gebildete alkalische
Phosphatase blau angefärbt werden (siehe Abbildung 41).
Abbildung 41: osteogen differenzierte Ad-MSC in AP-Färbung dargestellt (Vergrößerung: 20 X) Die Alkalische Phosphatase wird in der Zelle durch die AP-Färbung blau sichtbar.
5.6.4 Beste Induktion der Matrixmineralisierung durch kombinierten Einsatz von
Vitamin D3 und Dexamethason
Ein weiterer Anhaltspunkt für die Differenzierung in Richtung Osteoblasten ist der Nachweis
von mineralisierter Matrix.
Zur Ermittlung wann die Matrixmineralisierung einsetzt, wurden auf 48 Well Platten
Ad-MSCs ausplattiert. Die verwendeten Medien entsprechen den Medien-
zusammensetzungen aus Kapitel 5.6.3. Je 6 Wells einer Platte wurden mit den vier
Ergebnisse
Seite | 85
Differenzierungsmediumtest 8 und 15 Tage(Alizarin Rot)
8 15 8 15 8 15 8 15 8 150
500
1000
1500
Zeit [d]
Aliz
arin
rot
[µ
mol
]
Basisdifferenzierungsmedium
Basisdifferenzierungsmediumplus Dexamethason
Basisdifferenzierungsmediumplus Vitamin D
Basisdifferenzierungsmediumplus Dexamethason & Vitamin D
Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS
3
3
Medienkonstellationen und Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS für 8 bzw. 15 Tage stimuliert.
Anschließend wurde die Menge an mineralisierter Matrix mittels Alizarin Rot Färbung
ermittelt (siehe Abbildung 42).
Abbildung 42: Bestimmung der mineralisierten Matrix nach 8- und 15tägiger osteogener Stimulation N = 1, n = 6; Die Graphik zeigt, dass nach 8 Tagen die Menge an mineralisierter Matrix bei allen 5 Medien vergleichbar ist. Nach 15 Tagen Stimulationsdauer kann bei Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason (blau) und Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3 (orange) ein signifikanter Anstieg der gebildeten Matrix von p < 0,001 (***) und bei Basisdifferenzierungsmedium (grün) und Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 (rot) ein Anstieg von p < 0,0001 (****) im Vergleich zum Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS (grau) beobachtet werden.
Zellen, die nur acht Tage mit Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS bzw. den vier
Differenzierungsmedium behandelt wurden, zeigten sehr niedrige Alizarin Rot Werte.
Nach 15tägiger Stimulation jedoch waren die messbaren Alizarin Rot Werte bei allen vier
Differenzierungsmedien im Vergleich zur mit Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS beimpften
Kontrollgruppe um ein vielfaches höher. Die Mineralisierung war nach 15 Tagen schon so
weit fortgeschritten, dass nur geringe Unterschiede zwischen den einzelnen Medien messbar
waren. Abbildung 42 zeigt, dass mit Basisdifferenzierungsmedium und
Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 stimulierte Zellen, mehr mineralisierte Matrix
bilden konnten, als die mit Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason und
Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3 behandelten. Um
aussagekräftigere Ergebnisse unter Berücksichtigung der Spendervarianz zu erhalten, wurde
Differenzierungsmediumtest 8 und 15 Tage(Alizarin Rot)
8 15 8 15 8 15 8 15 8 150
500
1000
1500
Zeit [d]
Aliz
arin
ro
t [µ
mo
l] **** ****
*** ***
Ergebnisse
Seite | 86
der Versuch mit zusätzlichen vier Spendern (N = 4, n = 6) bei einer Stimulationsdauer von 12
Tagen wiederholt.
Die dabei gewonnen Daten zeigt Abbildung 43:
Abbildung 43: Bestimmung der gebildeten mineralisierten Matrix nach 12 Tagen osteogener Stimulation N = 4, n = 6; Im Vergleich zur mit Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS stimulierten Kontrollgruppe erreichen die Gruppen Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 und Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3 mit p < 0,001 (°°°) signifikant höhere Mineralisierungswerte. Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3 erzielt mit p < 0,1 (*) im Vergleich zum Basisdifferenzierungsmedium ohne Zusätze das beste Mineralisierungsergebnis.
Abbildung 43 zeigt deutlich, dass die mit Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS stimulierten
Zellen sich nur gering mit Alizarin Rot anfärben ließen.
Mit Basisdifferenzierungsmedium und Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason
behandelte Zellen wiesen einen annähernd gleich hohen dennoch nicht signifikanten Anstieg
der Matrixmineralisierung im Vergleich zur Kontrollgruppe auf.
Jedoch konnte mit Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 und
Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3 eine weitere Zunahme der
Alizarin Rot Werte erzielt werden. Die große Standardabweichung ist durch eine sehr
Differenzierungsmediumtest 12 Tage(Alizarin Rot)
0
500
1000
1500
Aliz
arin
Ro
t [µ
mo
l]
*°°°
°°°
Basisdifferenzierungsmediumohne
Zusätzeplus Dexa-methason
plus Vitamin D3
plus Dex. & Vitamin D3
Kontrolle
Basisdifferenzierungsmedium X X X XDexamethason 100 nM X XVitamin D3 5 µM X XAd-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS X
Ergebnisse
Seite | 87
ausgeprägte Spendervarianz zu erklären. Drei Spender wiesen Werte zwischen 90 und
220 µmol gebundenes Alizarin Rot auf, wohingegen diese beim vierten Spender bis 2000
µmol anstiegen.
5.7 BRE Reporterassay und Zugabe von BMP 2 und/oder BMP 7
BMP 2, 7, 9 spielen eine große Rolle bei der Entstehung von Knochen und Knorpel (Cheng,
Jiang et al. 2003, S. 1544). Allerdings waren lange Zeit nur BMP 2 und BMP 7 synthetisch
herstellbar, weswegen nur diese Einsatz im klinischen Alltag fanden. Wir haben uns deshalb
auf diese beiden Wachstumsfaktoren konzentriert.
5.7.1 Zugabe von BMP 2 und/oder BMP 7 verbessert die AP-Aktivität nicht
Für den Versuch wurden Ad-MSCs in eine 48-Well-Platte ausplattiert. Am nächsten Tag
wurden immer sechs Wells mit einem der vier verschiedenen Medien (siehe Tabelle 18) bzw.
mit Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 als Kontrollgruppe für acht Tage stimuliert.
Mediumwechsel fand nach vier Tagen statt.
Basisdifferenzierungsmedium plus
Vitamin D3 plus BMP 2 plus BMP 7
plus BMP 2 & BMP 7
Vitamin D3 X X X X
BMP 2 5 ng/ml
X
X
BMP 7 5 ng/ml
X X
Tabelle 18: Verschiedene Konstellationen der Zugabe von BMP 2 und BMP 7 zum zuvor ermittelten Basisdifferenzierungsmedium
Die Ergebnisse der AP-Aktivitätsmessung nach 8 Tagen sind in der nachfolgenden Abbildung
44 dargestellt:
Ergebnisse
Seite | 88
Abbildung 44: AP-Aktivtätsmessung nach 8tägiger Stimulation mit BMP 2 und/oder BMP 7
N = 9, n = 6; Nach einer Stimulationsdauer von 8 Tagen kann bei Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 und Basisdifferenzierungsmedium plus BMP 2 ein signifikanter Anstieg der AP-Aktivität von p < 0,01 (**) im Vergleich zur Kontrollgrupe beobachtet werden.
Die AP-Aktivitätsmessung nach acht Tagen (Abbildung 44) zeigt, wie aus den
Voruntersuchungen zu erwarten, beim Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 einen
signifikanten Anstieg. Beim Basisdifferenzierungsmedium plus BMP 2 wurden vergleichbare
AP-Aktivitäts Werte erzielt wie beim Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3.
Basisdifferenzierungsmedium plus BMP 7 und Basisdifferenzierungsmedium plus BMP 2 &
BMP 7 wiesen eine niedrigere jedoch nicht signifikant geringere AP-Aktivität auf.
5.7.2 Zugabe von BMP 2 und / oder BMP 7 verbessert die Matrixmineralisierung
nicht
Analog zum vorherigen Versuchsaufbau (siehe Kapitel 5.7.1) wurden die Zellen für 12 Tage
stimuliert und mittels Alizarin Rot Färbung die mineralisierte Matrix bestimmt.
Basisdifferenzierungsmedium plus
Vitamin D3plus BMP 2 plus BMP 7
plus BMP 2 & BMP 7
Kontrolle
Vitamin D3 X X X XBMP 2 5 ng/ml X XBMP 7 5 ng/ml X XAd-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS X
BMP-Test 8 Tage (AP-Aktivität)
0
50
100
150
200
** **
pN
P [
nm
ol/h
]
Ergebnisse
Seite | 89
Abbildung 45: Quantifizierung der gebildeten Matrix nach 12 tägiger Stimulation mit BMP 2 und/oder BMP 7 N = 5, n = 6; Die Messung der Alizarin Rot Werte nach Stimulation der Zellen mit BMP 2 und/oder BMP 7 zeigt keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Medien.
In Abbildung 45 ist zu sehen, dass mit Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3
stimulierte Zellen etwas mehr mineralisierte Matrix produziert haben als Zellen, die BMPs im
Medium zugesetzt hatten. Jedoch war auch hier kein signifikanter Unterschied zwischen
dem Basisdifferenzierungsmedium und den Medien mit BMPs zu erkennen.
5.7.3 BRE Reporterassay
Da unsere Versuche entgegen vieler Publikationen keine Verbesserung der osteogenen
Differenzierung durch BMPs zeigten, haben wir die Aktivierung des BMP-Signalweges
mithilfe eines Reporterassays (siehe Kapitel 4.6.5) bestimmt.
BMP-Test 12 Tage (Alizarin Rot)
0
200
400
600
800
1000
Aliz
arin
Ro
t [µ
mo
l]
Basisdifferenzierungsmedium plus
Vitamin D3plus BMP 2 plus BMP 7
plus BMP 2 & BMP 7
Kontrolle
Vitamin D3 X X X XBMP 2 5 ng/ml X XBMP 7 5 ng/ml X XAd-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS X
Ergebnisse
Seite | 90
Abbildung 46: Luciferase Aktivität bei unterschiedlichen BMP 2 Konzentrationen N = 4, n = 2; Die Abbildung zeigt die gebildete Luciferase Aktivität in RLU normiert auf den Proteingehalt. Die Zugabe von BMP 2 konnte das Smad1-Signalling nur für 50 ng/ml und 100 ng/ml eingesetztem BMP signifikant (p < 0,001, ***) im Vergleich zur Kontrolle induzieren. Geringere Konzentrationen führten sogar zu einer Abnahme des Smad1-Signallings mit signifikanten Werten (p < 0,05, *) für die Behandlung mit 5 ng/ml BMP 2.
Abbildung 47: Luciferase Aktivität bei unterschiedlichen BMP 7 Konzentrationen N = 4, n = 2; Die Abbildung zeigt die gebildete Luciferase Aktivität in RLU normiert auf den Proteingehalt. Die Zugabe von BMP 7 konnte das Smad1-Signalling nicht nachweisbar induzieren. Tendenziell gab es eher eine Abnahme des Smad1-Signallings mit signifikanten Werten (p < 0,05, *) für die Behandlung mit 50 ng/ml BMP 7.
Smad1-Reporter Assay(Ad5-BRE-Luc)
5 10 50 100 Kontrolle0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
*
*** ***
BMP 2 [ng/ml]
RLU
/µg
Pro
tein
Smad1-Reporter Assay(Ad5-BRE-Luc)
RLU
/μg
Pro
tein
BMP 2 [ng/ml]
Smad1-Reporter Assay(Ad5-BRE-Luc)
5 10 50 100 Kontrolle 0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
*
BMP 7 [ng/ml]
RLU
/µg P
rote
in
Smad1-Reporter Assay(Ad5-BRE-Luc)
RLU
/μg
Pro
tein
BMP 7 [ng/ml]
Ergebnisse
Seite | 91
Abbildung 48: Luciferase Aktivität bei unterschiedlichen BMP2 und BMP 7 Konzentrationen
N = 4, n = 2; Die Abbildung zeigt die gebildete Luciferase Aktivität in RLU normiert auf den Proteingehalt. Die Zugabe von BMP 2 und BMP 7 konnte das Smad1-Signalling nicht signifikant verbessern.
Alle drei Diagramme weisen ein vergleichbares Basissignalling (Basisdifferenzierungsmedium
plus Vitamin D3 ohne BMPs = Kontrolle) auf. Bei BMP 2 konnte nur mit sehr hohen Dosen
(50 und 100 ng/ml) das Signalling induziert werden. BMP 7 konnte selbst in sehr hohen
Dosen keine Signalinduktion erreichen. Tendenziell zeigte BMP 7 eher eine Verminderung
des Signals. Auch eine kombinatorische Gabe von BMP 2 und BMP 7 konnte das Signalling
nicht induzieren.
5.8 Ad-MSCs exprimieren osteoblastentypische Gene nach osteogener
Differenzierung
Zum Nachweis, dass Ad-MSCs nach der osteogenen Differenzierung auch wirklich
osteoblastentypische Gene exprimieren, wurden die Zellen mittels RT-PCR weiter
untersucht. Nach 12 Tagen osteogener Differenzierung in den jeweiligen
Differenzierungsmedien (Basisdifferenzierungsmedium, Basisdifferenzierungsmedium plus
Dexamethason, Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 und Basisdifferenzierungs-
medium plus Dexamethason & Vitamin D3) wurden die Expressionslevel folgender Gene
bestimmt (siehe Abbildung 49):
Smad1-Reporter Assay(Ad5-BRE-Luc)
5 10 Kontrolle0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
BMP 2 + 7 [ng/ml]
RLU
/µg P
rote
in
Smad1-Reporter Assay(Ad5-BRE-Luc)
RLU
/μg
Prot
ein
BMP 2 & 7 [ng/ml]
Ergebnisse
Seite | 92
Alkalische Phosphatase, BMP Rezeptor II, BMP 2, BMP 4, Bone Sialoprotein 2, Matrix gla
Protein, Osteocalcin, Osteopontin, Osteoprotegerin, Osteoblast Specific factor 2 und RANKL.
Die densitometrische Auswertung mit dem Bildbearbeitungsprogramm Image J ergab, dass
das Basisdifferenzierungsmedium ((1) siehe Abbildung 49) die Expression aller untersuchten
Gene induziert hat. Die Zugabe von Vitamin D3 zum Basisdifferenzierungsmedium (3)
verbesserte die Expressionslevel von BMPRII, MGP, OC, OP, OPG und RANKL weiter. Mit
Dexamethason versetzte Medien (2 und 4) verminderten die Expression aller untersuchten
osteoblastentypischer Gene.
Die densitometrische Auswertung (Abbildung 50) mehrerer Spender zeigte beispielsweise,
dass die Zugabe von Vitamin D3 zum Basisdifferenzierungsmedium die Expression von MGP
von dem 7,6 (1) auf das 13,7 fache (3) der Kontrolle verbessert hat, wohingegen in
dexamethasonhaltigen Medien nur eine 1,2 (2) bzw. 1,5 fache (4) Steigerung zu beobachten
war. Ähnliche Ergebnisse waren bei Osteopontin zu beobachten:
Basisdifferenzierungsmedium steigerte 14,2 fach, Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin
D3 19,9 fach das Genexpressionslevel, Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason
bzw. plus Dexamethason & Vitamin D3 nur 6,3 bzw. 5,3 fach.
Ergebnisse
Seite | 93
Abbildung 49: Nachweis osteoblastentypischer Gene in den differenzierten Ad-MSCs im Vergleich zu humanen Osteoblasten (invers dargestellt) Repräsentative Abbildung der RT-PCR für osteoblastentypische Gene in Ad-MSCs, MSCs, die mit den vier unterschiedlichen Medienkonstellationen stimuliert wurden (1 = Basisdifferenzierungsmedium, 2 = Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason, 3 = Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 und 4 = Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3). Als positive Kontrolle wurden humane Osteoblasten und als negative Wasser verwendet, rechts ist der pUC19-Marker zu sehen.
differenzierte Ad-MSCs
OSÜ H2O Marker1 2 3 4
AP
BMPR II
BMP 2
BMP 4
MGP
OC
OP
OPG
OSF 2
RANKL
GAPDH
BSP 2
Ergebnisse
Seite | 94
Densitometrische Auswertung der untersuchten Gene:
Abbildung 50: Densitometrische Auswertung aller untersuchten Gene N = 5, n = 2; 1 = Basisdifferenzierungsmedium, 2 = Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason, 3 = Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 und 4 = Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3. Die Abbildungen zeigen das Vielfache der Bandensignale im Vergleich zur Kontrolle (humane Osteoblasten)
Alkalische Phosphatase
1 2 3 4 Kontrolle0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
BMPRII
1 2 3 4 Kontrolle0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
BMP 2
1 2 3 4 Kontrolle0
1
2
3
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
BMP 4
1 2 3 4 Kontrolle0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
BSP2
1 2 3 4 Kontrolle0
10
20
30
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
Matrix gla Protein
1 2 3 4 Kontrolle0
5
10
15
20
25
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
Osteocalcin
1 2 3 4 Kontrolle0
2
4
6
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
Osteopontin
1 2 3 4 Kontrolle0
10
20
30
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
Osteoprotegerin
1 2 3 4 Kontrolle0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
OSF 2
1 2 3 4 Kontrolle0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
RANKL
1 2 3 4 Kontrolle0
5
10
15
20
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
*
Diskussion
Seite | 95
6 Diskussion
In dieser Arbeit wurden mesenchymale Stammzellen aus humanem Bauchdecken- oder
Hüftfett isoliert, verschiedene Supplemente zur Herstellung und Optimierung eines
osteogenen Differenzierungsmediums getestet, um abschließend die ausdifferenzierten
Stammzellen mit primären humanen Osteoblasten auf ihren osteoblastentypischen
Phänotyp hin zu vergleichen.
Chondrogene und adipogene Differenzierung mit industriell erzeugten Medien
Das „Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular
Therapy“ schlägt zur Definition von humanen mesenchymalen Stammzellen folgende
Mindestkriterien vor (Dominici, Le Blanc et al. 2006, S. 315):
1. MSCs müssen CD73, CD90 und CD105 Oberflächenmarker exprimieren und
dürfen CD11b, CD 14, CD19, CD34, CD45, oder CD79alpha und HLA-DR nicht
exprimieren.
2. MSCs müssen in der Zellkultur unter Standardbedingungen plastikadhärent sein.
3. MSCs müssen die Fähigkeit besitzen in vitro in Chondrozyten, Adipozyten und
Osteozyten zu differenzieren.
Wir untersuchten die isolierten Zellen mittels FACS Analyse und RT-PCR auf die Präsenz von
bestimmten Oberflächenmarkern. Die von uns isolierten Zellen waren in Passage drei CD13,
CD29, CD44, CD90, CD105 und CD166 positiv (Seeliger, Culmes et al. 2012, S. 124).
CD13 (Aminopeptidase N) wird in großer Anzahl auf Stammzellen und leukämischen Blasten
exprimiert (Bauvois and Dauzonne 2006, S. 88; Plesa, Chelghoum et al. 2008, S. 572).
Zusätzlich kann CD13 wichtige biologische Prozesse wie Zellwachstum, -invasion und
Angiogenese beeinflussen (Pasqualini, Koivunen et al. 2000, S. 722; Bhagwat, Lahdenranta et
al. 2001, S. 652; Bauvois and Dauzonne 2006, S. 88). CD29 (Integrin β1) spielt eine wichtige
Rolle bei der Adhäsion und Migration der MSCs (Ode, Kopf et al. 2011, S. 26). CD 44 ist der
Rezeptor für Hyaluronsäure, Osteopontin, Kollagen und Matrix-Metalloproteasen und ist
somit in die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen involviert (Naor, Sionov et al. 1997, S.
241). CD90 (Thy-1) wird allgemein als positiver Marker für MSCs verwendet, nimmt aber
auch wie CD29 an Adhäsions- und Migrationsvorgängen teil (Mason, Yarwood et al. 1997, S.
Diskussion
Seite | 96
1233-1234; Kasten, Beyen et al. 2008, S. 47). CD105 (Endoglin) ist ein TGF-β Corezeptor und
ist an der TGF-β/BMP Signalkaskade beteiligt (Fonsatti, Sigalotti et al. 2003, S. 427). CD166
(activated leukocyte cell adhesion molecule = ALCAM) ist ein häufig aufgeführter Marker für
mesenchymale Stammzellen (Calloni, Cordero et al. 2013, S. 1456). CD166 ist zudem auf
Zellen nachweisbar, die in dynamische Wachstumsprozesse und/oder Migrationsvorgänge,
wie z.B. die Entstehung neuronaler Verschaltungen oder die Immunantwort involviert sind
(Swart 2002, S. 313). Zusätzlich wird CD166 auf Tumorstammzellen des Colon- (Dalerba,
Dylla et al. 2007, S. 10158), Prostatacarcinoms und malignen Melanoms exprimiert
(Jezierska, Matysiak et al. 2006, S. 263).
CD14, CD31, CD34, CD45 und CD147 Oberflächenmarker, die auf eine Verunreinigung mit
Monozyten, Makrophagen und anderen Zellen hinweisen (Bobis, Jarocha et al. 2006, S. 216;
Chamberlain, Fox et al. 2007, S. 2739), waren ab Passage drei nicht mehr nachweisbar,
weshalb für die Versuche ausschließlich Zellen aus Passage drei oder vier verwendet wurden
(Seeliger, Culmes et al. 2012, S. 124).
Bei der Untersuchung der anderen Kriterien ergab sich, dass Ad-MSCs nach 12-24 h auf
Plastik adhärierten und sich problemlos in zwei (Chondrozyten und Adipozyten) der drei
geforderten Zellarten differenzieren ließen (siehe Abbildung 31 und Abbildung 32). Die
Differenzierung in Zellen der osteogenen Linie schließt sich in den nachfolgenden Versuchen
an.
Ad-MSCs exprimieren osteoblastentypische Oberflächenrezeptoren
Wir konnten zeigen, dass Ad-MSCs Alk 1, 2, 3, 5, 6, TGF-β Rezeptor II, BMP Rezeptor II, IGF
Rezeptor I u II, Retinoid X Rezeptor β und Vitamin D Rezeptor exprimieren. Basierend auf
diesen Ergebnissen sollten die Ad-MSCs in der Lage sein BMPs, Vitamin D3 und IGF
aufzunehmen.
- TGF- Rezeptoren sind transmembranöse Seronin/Threonin Kinasen. Bis heute sind
sieben Typ I Rezeptoren und fünf Typ II Rezeptoren (TGF-βRII, ActR-II, ActR-IIB,
BMPRII, AMHR-II) bekannt (Inman, Nicolas et al. 2002, S. 65). Die Typ I Rezeptoren
werden auch „Activin-receptor-like kinases“ genannt, kurz Alk 1-7. Für die
Signaltransduktion werden jeweils ein Typ I- und ein Typ II Rezeptor benötigt
Diskussion
Seite | 97
(Massague 1998, S. 753). Nach Ligandenbindung an den Typ II Rezeptor, verbinden
sich beide Rezeptoren miteinander. Abhängig von dem TGF- Liganden bilden
unterschiedliche Typ I und II Rezeptoren einen Komplex, somit ist eine spezifische
Signalübertragung des Liganden gewährleistet. Aufgabe der über 35 Mitglieder der
TGF- Familie ist die Entstehung und Stoffwechselregulation verschiedener Gewebe,
wobei deren größtes Vorkommen im menschlichen Körper im Knochengewebe zu
finden ist (Massague 1998, S. 753-754). Die Gruppe um Cheng hat das osteogene
Differenzierungspotential 13 verschiedener BMPs auf murine embryonale
Fibroblasten und C2C12-Zellen untersucht. Dabei verbesserten besonders BMP 2,
BMP 9 und in geringerem Maße auch BMP 7 die osteogene Differenzierung der Zellen
(Cheng, Jiang et al. 2003, S. 1544). Wir konnten zeigen, dass Alk 1, 2, 3, 5, 6, TGF-β
Rezeptor II und BMP Rezeptor II in den Ad-MSCs exprimiert wird. Vorarbeiten
unserer Arbeitsgruppe ergaben, dass die kontinuierliche Exposition von TGF-β die
Reifung von primären Osteoblasten verhindert (Ehnert, Baur et al. 2010, S. 1).
Deshalb haben wir in unseren Versuchen auf die Stimulation mit TGF-β verzichtet. Da
bisher nur BMP 2 und BMP 7 klinische Anwendung fanden haben wir uns auf diese
beiden konzentriert.
Insulin like growth factor Rezeptoren Typ I und II sind an Zellwachstums-,
Differenzierungs- und Regulationsprozessen beteiligt. Sie weisen eine hohe Affinität
zu IGF-I und II auf, jedoch eine signifikant erniedrigte gegenüber dem Insulin (Bentov
Y. 2008). Versuche mit einer lokal (in Form beschichteter Implantate) applizierten
Kombination aus IGF I und TGF-β1 ergaben einen stimulierenden Effekt auf die
Frakturheilung (Schmidmaier, Lucke et al. 2006, S. 61), was einen Hinweis auf die
Mitbeteiligung dieses Substrats am Knochenstoffwechsel sein kann. Ergebnisse einer
anderen Arbeitsgruppe ergeben, dass IGF-I Knock out Mäuse eine höhere
Knochendichte aufweisen als deren Wildtypgattung. Dieses Ergebnis wird dadurch
erklärt, dass IGF-I die Osteoklastogenese durch die Expression von RANKL und RANK
unterstützt und regelt (Wang, Nishida et al. 2006, S. 1350). In einer anderen
Publikation wird beschrieben, dass IGF-I seinen Einfluss auf das skelettale System
nicht primär über die Fraktion der Osteoprogenitorzellen, sondern auf reifere Zellen
der osteoblastären Linie ausübt (Walsh, Jefferiss et al. 2003, S. 80). Parallel laufende
Diskussion
Seite | 98
Arbeiten in unserem Labor haben sich mit dem Effekt von Insulin (strukturell
verwandt mit IGF) auf primäre humane Osteoblasten befasst. In diesen Arbeiten wies
unsere Arbeitsgruppe nach, dass eine kontinuierliche Stimulation mit Insulin die
Expression und Aktivierung von TGF-β induzierte und dadurch die
Osteoblastenfunktion inhibierte (Freude, Braun et al. 2012, S. 1257). Aufgrund dieser
kontroversen Aussagen bezüglich der Wirkung von IGF auf die osteogene
Differenzierung, fiel der Entschluss auf dessen Einsatz im Optimierungsprotokoll zu
verzichten.
Der Vitamin D Rezeptor gehört zur Familie der Steroidrezeptoren und agiert, wie
auch andere Mitglieder aus dieser Gruppe, nach Aktivierung durch seinen Liganden
als Transkriptionsfaktor (Dusso, Brown et al. 2005, S. 8). Zusätzlich vermittelt Vitamin
D3 seine Wirkung über den in der Zellmembran gebundenen Rezeptor Protein
Disulfidisomerase A3 (PDIA3). Im Verlauf der osteogenen Differenzierung von
humanen MSCs wird die Expression des Vitamin D Rezeptors gesteigert wobei das
Expressionslevel von PDIA3 konstant bleibt (Olivares-Navarrete, Sutha et al. 2012, S.
1726). Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass in der Frühphase der Differenzierung
die Vitamin D3 Aufnahme zum Großteil über PDIA3 erfolgt und im Verlauf des
Differenzierungsprozesses immer mehr vom Vitamin D Rezeptor übernommen wird.
Publikationen zeigen, dass Dexamethason durch Cholecalciferol (Vitamin D3) in der
osteogenen Differenzierung von humanen Stromazellen aus Fettgewebe (Zhou, Liu et
al. 2006, S. 1278; Zhou, Liu et al. 2012, S. 160) und von embryonalen Stammzellen
(zur Nieden, Kempka et al. 2003, S. 18) ersetzt werden kann. Aufgrund dieser ersten
Hinweise wurde dem Vitamin D3 in den Optimierungsversuchen eine besondere Rolle
beigemessen.
Der Retinoid X Rezeptor β ist ein nukleärer Rezeptor für 9-cis Retinoinsäure und ist
ein obligater Partner des Vitamin D Rezeptors bei der Vermittlung der Wirkung des
Cholecalciferols (Heyman, Mangelsdorf et al. 1992, S. 397; Sutton and MacDonald
2003, S. 778). Außerdem proklamieren Zhang et al. einen synergistischen Effekt
zwischen dem Retinoid Signalling und der Induktion der osteogenen Differenzierung
von mesenchymalen Progenitorzellen durch BMP 9 (Zhang, Deng et al. 2010, S. 1).
Die Gruppe um Chaudhry verwendete anstatt Dexamethason Retinoinsäure und
Diskussion
Seite | 99
konnten dadurch die Mineralisierung von embryonalen Stammzellen im 3D-Scaffold
induzieren (Chaudhry, Yao et al. 2004, S. 205). Die Arbeitsgruppe um Shibuya zeigte
jedoch, dass die Zugabe von Retinoinsäure die osteogene Differenzierung von
periodontalen Zellen der Sharpey Fasern inhibierte (Shibuya, Nemoto et al. 2005, S.
432). Aufgrund der gegensätzlichen Ergebnisse wurde Retinoinsäure nicht in den
Versuchen verwendet.
Vier Zusätze im osteogenen Basisdifferenzierungsmedium
In den nächsten Versuchen wurde der Suche nach einem kostengünstigen Medium, das die
Zellen möglichst wenigen unterschiedlichen Substanzen aussetzt und dennoch hohes
Differenzierungspotential aufweist, nachgegangen. Diese Punkte sind ein wichtiger Aspekt,
um das Tissue Engineering für die Industrie interessant und lukrativ, für Kliniken und
Krankenkassen finanzierbar und für den Patienten sicher zu gestalten.
Calciumchloridsalz diente im Medium als Calciumquelle, L-Ascorbinsäure-2-phosphat und -
Glycerolphosphat als Phosphatlieferanten; interessanterweise induziert bereits die alleinige
Zugabe von L-Ascorbinsäure-2-phosphat in MSCs aus Nabelschnurblut die osteogene
Differenzierung (Mekala, Baadhe et al. 2013, S. 156). Ascorbinsäure spielt eine Schlüsselrolle
als Cofaktor bei der posttranslationalen Modifikation der Kollagenmoleküle (Geesin,
Hendricks et al. 1991, S. 6). Entscheidend war bei unseren Versuchen die Konzentration von
Ascorbinsäure-2-phosphat. Bei Konzentrationen unter 200 µM blieb die Induktion der AP-
Aktivität aus. Ähnliche Ergebnisse erhielt die Arbeitsgruppe um Kyllönen und Haimi, die
zeigten dass bei der osteogenen Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen
aus Fettgewebe die runx2 (wichtiger Transkriptionsfaktor, der an Osteoblasten-
differenzierung und Skelettentwicklung beteiligt ist) Expression mit höheren
L-Ascorbinsäure-2-phosphat Konzentrationen stieg (Kyllonen, Haimi et al. 2013, S. 1). HEPES
dient zur Pufferung des Mediumansatzes.
Die Messung der AP-Aktivität (Abbildung 34) ergab, dass nur die Zugabe aller 4
Mediensupplemente einen signifikanten Anstieg der Enzymaktivität bewirkte. Basierend auf
diesem Ergebnis wurde für die Versuche folgendes Basisdifferenzierungsmedium verwendet:
L-Ascorbinsäure-2-phosphat (c = 200 µM), -Glycerolphosphat (c = 10 mM), HEPES
(c = 25 mM) und CaCl2 (c= 1,5 mM) gelöst in Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS.
Diskussion
Seite | 100
2,5 % FCS im Medium verspricht die besten Differenzierungserfolge
Eine auf den ersten Blick eher zweitrangige Inhaltsangabe in vielen Rezepturen ist die
Verwendung von 10 % FCS in Kultur- und 5 % FCS in Differenzierungsmedien. Die bisherige
Annahme, dass eine FCS-Reduktion lediglich den Wachstumsstimulus reduziert und dadurch
die anderen Mediensupplemente stärker ihre Differenzierungswirkung entfalten können,
sollte erneut überprüft werden. In Abbildung 36 bestätigt sich mittels alamarBlue®, dass bei
10 % FCS die optimalen Wachstumsbedingungen für die Zellen bestanden. Die besten
Ergebnisse für die Matrixmineralisierung (siehe Abbildung 37) konnten mit 0 % FCS erzielt
werden, während die höchste AP-Aktivität (siehe Abbildung 35) bei 5 % FCS gemessen
wurde. Um beiden Kriterien gerecht zu werden, wurde für das Differenzierungsmedium eine
FCS-Konzentration von 2,5 % festgelegt (in Anlehnung an: Ehnert, Häuser et al. 2011, S. 4).
Vitamin D3 verbessert die osteogenen Differenzierungseigenschaften des Basismediums,
Dexamethason hingegen nicht
In der Mehrzahl der osteogenen Differenzierungsprotokolle kommt hauptsächlich
Dexamethason und vereinzelt auch Vitamin D3 zum Einsatz (Beresford, Joyner et al. 1994, S.
941). Beide üben einen maßgeblichen Einfluss auf den Knochenstoffwechsel aus und sollen
den Differenzierungsprozess zeitlich und qualitativ optimieren.
Nach Ermittlung der Toxizitätsgrenzen für beide Substanzen wurde deren Einfluss auf die AP-
Aktivität und Matrixmineralisierung untersucht. Dabei bewirkte die Zugabe von Vitamin D3
zum Basisdifferenzierungsmedium einen signifikanten Anstieg der AP-Aktivität.
Vergleichbare Ergebnisse lieferte die Alizarin Rot Färbung, bei der der Zusatz von Vitamin D3
die Bildung mineralisierter Matrix signifikant induzierte. Dies wird durch Beobachtungen am
Patienten unterstützt, so findet Vitamin D3 zum Beispiel bei Therapie und Prophylaxe von
Osteoporose sowie bei der Rachitisbehandlung seine Verwendung. Vitamin D3 gehört zur
Gruppe der Steroide und arbeitet nach seiner Aktivierung mittels UV-Licht zum 1,25
Dihydroxycholecalciferol (1,25(OH)2D3) auf zwei Ebenen im Körper. Auf Genebene bindet es
an den Vitamin D Rezeptor und kann so regulatorisch auf die Gentranskription Einfluss
nehmen. Als nicht genomisches Wirkprinzip wird eine Sofortreaktion unter anderem auch in
Osteoblasten beschrieben, bei der 1,25(OH)2D3 über eine Aktivierung der Phospholipase C
und damit des Inositoltriphosphat/Diacylglycerol-Weges einen Anstieg der intrazellulären
Diskussion
Seite | 101
Calciumkonzentrationen induziert (Lieberherr, Garabedian et al. 1979, S. 47; Fritsch, Grosse
et al. 1985, S.639-644).
Die Leber produziert Calcidiol, die Vorstufe des metabolisch aktiven Calcitriols (Nair 2010, S.
491-492). Studien belegen, dass bei Patienten mit chronischer Lebererkrankung der Vitamin
D3 Stoffwechsel verändert ist und der Vitamin D3 Serumspiegel sinkt (Arteh, Narra et al.
2010, S. 2624). Ebenso weisen Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz vermehrt eine
Hypovitaminose auf (Mawer, Taylor et al. 1973, S. 626). In beiden Patientengruppen findet
man ein erhöhtes Osteoporoserisiko, was zeigt, dass Vitamin D3 eine maßgebliche Rolle im
Knochenstoffwechsel spielt.
Die Zugabe von Dexamethason zum Basisdifferenzierungsmedium verbesserte die AP-
Aktivität nicht, dies beschreibt auch die Arbeitsgruppe um Khanna-Jain bei der osteogenen
Differenzierung humaner Stammzellen aus Zahnpulpa (Khanna-Jain, Mannerstrom et al.
2012, S. 1). Eine kürzlich veröffentlichte Arbeit an Ad-MSCs zeigt, dass hohe Dexamethason
Konzentrationen (100 nM) die Zellproliferation und Expression von Kollagen Typ I
supprimieren, wohingegen eine geringe Dexamethason Konzentration (5 nM) in
Kombination mit einer hohen L-Ascorbinsäure-2-phosphat Konzentration (250 μM) die
osteogene Differenzierung begünstigen (Kyllonen, Haimi et al. 2013, S. 11). Die
Matrixmineralisierung nahm durch Dexamethason im Vergleich zum
Basisdifferenzierungsmedium nur wenig zu. Buttery und seine Mitarbeiter zeigten, dass die
Zugabe von Dexamethason mit L-Ascorbinsäure-2-phosphat und β-Glycerolphosphat ab Tag
14 und später, jedoch nicht davor, die Matrixmineralisierung von embryonalen Stammzellen
induzieren konnte (Buttery, Bourne et al. 2001, S. 89). Interessanterweise steigerte
Dexamethason in Kombination mit Vitamin D3 die Matrixmineralisierung signifikant obwohl
die AP-Aktivität in dieser Kombination nicht induziert wurde. Dexamethason ist ein
Kortikosteroid, das in der Medizin zur Therapie zahlreicher Indikationen eingesetzt wird.
Jedoch weist es auch eine lange Liste von unerwünschten Nebenwirkungen auf. Im Bezug auf
Knochen finden vor allem das osteoporosefördernde Potential, das bei hohen Dosen auch
schon nach kurzer Behandlungsdauer nachgewiesen werden kann, und das Risiko
aseptischer Knochennekrosen im Kopfbereich von Humerus und Femur Beachtung (Kaiser
2002, S. 137-138). Allerdings wird in vielen Protokollen zur Differenzierung von primären
Osteoblasten Dexamethason in physiologischen Konzentrationen zugefügt. Auch in den von
uns isolierten primären humanen Osteoblasten hat Dexamethason bessere
Diskussion
Seite | 102
Differenzierungserfolge erzielt als dessen Ersatz durch Vitamin D3. So konnten wir zeigen,
dass bei Ad-MSCs, Knochenmarkstammzellen und Osteoblasten desselben Spenders ein
vergleichbares Differenzierungsergebnis mit unterschiedlichen Medien erreicht werden
konnte (Ehnert, Häuser et al. 2011, S. 6). Dies wird bestätigt durch die Arbeit von Atmani et
al., die gezeigt haben, dass Calcitriol 1,25(OH)2D3 die osteogene Differenzierung von
Knochenmarkstammzellen vermindert, wohingegen Dexamethason diese fördert (Atmani,
Chappard et al. 2003, S. 364). Die osteogene Differenzierung von Ad-MSCs hingegen wurde
durch Vitamin D3 induziert und durch Dexamethason vermindert. Die bereits oben erwähnte
Gruppe um Khanna-Jain berichtet, dass bei der Stimulation humaner Stammzellen aus
Zahnpulpa mit Vitamin D3 signifikant höhere Expressionslevel von Osteopontin und
Osteocalcin erzielt werden konnten als bei der Stimulation mit Dexamethason (Khanna-Jain,
Mannerstrom et al. 2012, S. 6-8).
Zugabe von BMP 2 und/ oder BMP 7 verbessert die osteogene Differenzierung nicht
In Publikationen wird der osteoinduktive Effekt von BMP 2, BMP 7 und BMP 9 proklamiert
(Cheng, Jiang et al. 2003, S. 1544; Donati, Di Bella et al. 2008, S. 65; Azad, Breitbart et al.
2009, S. 267). Die lokale Applikation von Wachstumsfaktoren zur Verbesserung der
Knochenheilung durch verschiedene Trägersysteme und direkte Injektionen wird seit vielen
Jahren untersucht. So konnte zum Beispiel eine verbesserte Heilung bei Zustand nach
Fraktur oder Osteotomie durch BMP 2 freisetzende Kollagenschwämme im Tiermodell
beobachtet werden (Welch, Jones et al. 1998, S. 1483; Bouxsein, Turek et al. 2001, S. 1219).
TGF-β1 zeigte eine starke chemotaktische Wirkung auf humane Osteoblasten. Die
Verabreichung dieses Zytokins im Hundemodell verstärkte die mechanische
Implantatfixation und das Knochenwachstum; interessanterweise war der Effekt bei
niedrigen TGF-β1-Konzentrationen (0,3 µg) ausgeprägter als bei dessen höher dosiertem
Einsatz (3,0 µg), jedoch in beiden Gruppen signifikant mehr im Vergleich zur Kontrollgruppe
(Lind 1998, S. 4).
Da nur BMP 2 und BMP 7 für den klinischen Einsatz zugelassen sind, haben wir deren Effekt
auf die osteogene Differenzierung der Ad-MSCs untersucht. Entgegen der gängigen
Meinung, dass BMPs die Osteogenese fördern, konnten wir weder durch BMP 2 oder BMP 7
noch die Kombination aus beiden die AP-Aktivität und Bildung mineralisierter Matrix
Diskussion
Seite | 103
verbessern. BMP 7 zeigte tendenziell sogar eine Verminderung der angestrebten osteogenen
Effekte.
Dabei ist zu unterscheiden, dass in vielen Publikationen (Helm, Alden et al. 2000, S. 191;
Cheng, Jiang et al. 2003, S. 1544) die BMPs häufig durch Überexpression in den Zellen selbst
ihre Wirkung entfalten konnten, in unserem Versuchsansatz jedoch auf rekombinante BMPs
zurückgegriffen wurde.
Obwohl Ad-MSCs die für das BMP Signalling benötigten Rezeptoren exprimieren konnten wir
keinen osteoinduktiven Effekt von BMP 2 und BMP 7 nachweisen. Deshalb untersuchten wir
die Aktivierung des Signalweges. Dabei zeigte sich, dass BMP 2 nur in sehr hohen Dosen das
Signalling aktivierte, wohingegen BMP 7 das Signalling tendenziell verminderte. Die
ausbleibende Signalaktivierung könnte den zuvor beobachteten fehlenden osteoinduktiven
Effekt erklären. Weiter muss untersucht werden, ob im Medium Faktoren enthalten sind, die
die BMP Wirkung vermindern oder sogar inhibieren, wie z.B. BMP 3 (Gamer, Nove et al.
2005, S. 156) , Noggin (Rosen 2006, S. 19) oder hohe Konzentrationen von TGF-β1 (Ehnert,
Baur et al. 2010, S. 1). BMP 2 könnte in sehr hohen Dosen einen positiven Effekt auf die
osteogene Differenzierung haben, jedoch ist dies mit sehr hohen Kosten verbunden. Da ein
Hauptziel der Arbeit darin bestand, ein Medium für den Routineeinsatz zu entwickeln, wurde
aus Kosten Nutzen Überlegungen auf die Zugabe von Wachstumsfaktoren verzichtet.
Weitere Aspekte sprechen für den Verzicht auf Wachstumsfaktoren:
- Untersuchungen im Tiermodell zeigten, dass die hochdosierte systemische Gabe von
Wachstumsfaktoren ernsthafte Nebeneffekte wie Gewebsläsionen in Leber,
Knochen, Niere, Herz, Pankreas und Magen (Terrell, Working et al. 1993, S. 43) mit
sich bringen kann.
- Die Verabreichung von IGF I führt bei Kindern mit fehlendem Wachstumsrezeptor zu
Hypoglykämien und einem vorübergehend erhöhten Kaliumspiegel (Wilton 1992, S.
137).
Die Ergebnisse nach Wachstumsfaktorengabe bei der Primärversorgung von Frakturen sind
immer vor dem Hintergrund zu betrachten, dass die Konsolidierung der Fraktur auch durch
den natürlichen Heilungsprozess des Patienten eingetreten sein kann. So zeigten
Schmidmaier et al., dass die lokale Applikation von Wachstumsfaktoren den Prozess der
Frakturheilung anfänglich verbesserte, jedoch nach 84 Tagen vergleichbare Ergebnisse in der
Diskussion
Seite | 104
Gruppe ohne Wachstumsfaktorengabe nachweisbar waren (Schmidmaier, Wildemann et al.
2004, S. 514).
Ad-MSCs exprimieren osteoblastentypische Gene nach osteogener Differenzierung
Ähnlich der AP-Aktivität und Matrixmineralisierung hatten die vier Differenzierungsmedien
einen starken Einfluss auf die Expression osteoblastentypischer Gene. Das
Basisdifferenzierungsmedium konnte die Expressionslevel aller untersuchten Gene (AP,
BMPRII, BMP 2, BMP 4, BSP 2, MGP, OC, OP, OPG, OSF 2, RANKL) verbessern. Durch die
Zugabe von Vitamin D3 konnte der osteoinduktive Effekt auf diese Gene weiter gesteigert
werden. Der RANK Ligand (RANKL) bindet an den Osteoklastenrezeptor RANK (NF κB) und ist
der wichtigste stimulierende Faktor für die Bildung reifer Osteoklasten, was einen Verlust
der Knochenmatrix zur Folge hätte. Allerdings hat Vitamin D3 auch die Expression von OPG
gesteigert, welches RANKL bindet und somit dessen osteoklastische Wirkung inhibiert
(Haima 2013, S. 4). Dieser Effekt wurde auch in Stromazellen beobachtet. Nach Stimulation
mit TGF-β1 wurde die Expression von OPG und weiteren Faktoren, die die Osteoklastogenese
inhibieren, gesteigert (Thirunavukkarasu, Miles et al. 2001, S. 36241). Im Gegensatz dazu
zeigten primäre humane Osteoblasten nach TGF-β1-Stimulation eine signifikant höhere
Sekretion von RANKL und eine gleichzeitige Abnahme der OPG-Bildung (Ehnert, Baur et al.
2010, S. 1). Die Expression des durch Vitamin D3 induzierbaren Matrix gla Proteins (Cancela,
Hsieh et al. 1990, S. 15040) konnte mit dem Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3
weiter gesteigert werden. Ebenso zeigt Wallin, dass in HTM Zellen MGP inhibitorisch auf die
BMP 2 induzierte AP-Aktivität und Mineralisierung wirkt (Xue, Wallin et al. 2006, S. 997).
Dies könnte eine weitere Erklärung für den ausbleibenden osteogenen Effekt des BMP 2 in
unseren Versuchen sein.
Die BMP 4 Expression wurde durch die Zugabe von Dexamethason stark reduziert.
Basisdifferenzierungsmedium und Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 hingegen
induzierten die Bildung des BMP 4, das unter anderem eine wichtige Rolle im
endochondralen Ossifikationsprozess spielt. Interessanterweise zeigte sich, dass
Dexamethason auch hier die Expressionslevel osteoblastentypischer Gene verminderte. Dies
war ein weiterer Grund für das Weglassen von Dexamethason in unserem Ad-MSC
Differenzierungsmedium.
Diskussion
Seite | 105
Die Wahl der Stammzellquelle ist Gegenstand vieler Publikationen. Die bereits oben
erwähnten Kriterien, die Dominici et al. von einer Stammzellgattung fordern (Dominici, Le
Blanc et al. 2006, S. 315), konnten von Ad-MSCs erfüllt werden. Jedoch gibt es Berichte, dass
deren osteogenes Differenzierungspotential im Vergleich zu B-MSCs wesentlich geringer ist
(Im, Shin et al. 2005, S. 845; Vishnubalaji, Al-Nbaheen et al. 2012, S. 419). Nachteil dieser
Studien ist, dass diese nie mit Zellen eines Spenders durchgeführt wurden, sodass eine
Spendervarianz aufgrund verschiedener Faktoren wie Geschlecht, Alter, Erkrankungen oder
Medikamenteneinnahme nicht ausgeschlossen werden kann (Ehnert, Häuser et al. 2011, S.
7). Deshalb untersuchten wir Ad-MSCs und B-MSCs von einem Spender und verglichen die
Ergebnisse für Zellproliferation, osteogene Differenzierung und Expression
osteoblastentypischer Gene mit spendereigenen Osteoblasten. Dabei zeigte sich, dass Ad-
MSCs durchschnittlich doppelt so schnell proliferierten wie korrespondierende B-MSC. Die
osteogene Differenzierung setzte in den B-MSCs geringfügig früher ein, jedoch zeigten beide
Gruppen nach einer Differenzierungsdauer von 21 Tagen vergleichbare Ergebnisse. Bei der
abschließenden Bestimmung von osteoblastentypischen Genen wie BSP 2, BMP 2, BMP 4,
OC und OP erzielten sowohl Ad-MSCs als auch B-MSCs gleichermaßen hohe Expressionslevel
wie die differenzierten primären Osteoblasten (Ehnert, Häuser et al. 2011, S. 5-7).
Ein Pool von 100.000 Knochenmarkzellen beinhaltet eine Stammzelle (Fraser, Wulur et al.
2006, S. 150; Polak and Bishop 2006, S. 357) bzw. aus einem Milliliter Knochenmark können
1 x 102 bis 1 x 103 Stammzellen gewonnen werden (Coleman 2006, S. 117). Eine
Stammzellpopulation aus dem Knochenmark ist ein heterogener Mix aus unterschiedlichen
Subpopulationen: endotheliale Progenitorzellen sowie hämatopoetische und mesenchymale
Stammzellen (Herzog, Chai et al. 2003, S. 3483). Fettgewebe hat prozentual den höchsten
Anteil an adulten Stammzellen von allen Geweben im Körper und so können aus 1 g
Fettgewebe ca. 5 x 103 Zellen isoliert werden (Coleman 2006, S. 117). Somit kann aus Ad-
MSCs innerhalb eines kurzen Zeitraums eine große Zellzahl, die z.B. bei der Transplantation
von Zellen in einen großen Knochendefekt nötig sind, gewonnen werden. Die stetige
Replikation bringt das Risiko einer ungewollten genetischen Veränderung mit sich. Da jedoch
wie oben erwähnt im Gegensatz zu B-MSCs die Ad-MSCs von Anfang an in großen Mengen
zur Verfügung stehen, kann mit nur wenigen Replikationszyklen eine große Menge an Ad-
MSCs gezüchtet werden.
Diskussion
Seite | 106
Unsere Ergebnisse zeigen somit, dass Ad-MSCs durch die Anpassung der unterschiedlichen
Differenzierungssupplemente vergleichbare Ergebnisse wie primäre humane Osteoblasten
erzielen können. Da die Gewinnung von Fettgewebe risikoärmer ist als die Gewinnung eines
Knochenmarkaspirats, daraus die Ausbeute an Fettgewebsstammzellen wesentlich höher ist
als an Knochenmarkstammzellen und die osteogenen Differenzierungsergebnisse beider
Zellarten vergleichbar sind, sind Ad-MSCs eine ideale alternative Zellquelle für das Tissue
Engineering (Ehnert, Häuser et al. 2011, S. 7-8).
Zusammenfassung und Ausblick
Seite | 107
7 Zusammenfassung und Ausblick
In dieser Arbeit wurde die osteogene Differenzierungsfähigkeit von Fettgewebsstammzellen
untersucht. Die Zellen wurden aus Hüft- oder Bauchdeckenfett isoliert und mit
verschiedenen Supplementen zur osteogenen Differenzierung angeregt. Der
Differenzierungserfolg wurde durch Ermittlung von AP-Aktivität und Matrixmineralisierung
überprüft. Besonders zu erwähnen ist, dass der Austausch von Dexamethason durch
Vitamin D3 die osteogene Differenzierung signifikant steigerte. Die Zugabe der
Wachstumsfaktoren BMP 2 und BMP 7 erbrachte dabei keine signifikante Verbesserung. Die
abschließende RT-PCR zeigte, dass mit dem optimierten Differenzierungsmedium die
Expression osteoblastentypischer Gene vergleichbar zu primären humanen Osteoblasten
war. Deshalb sind wir der Meinung, dass Ad-MSCs eine alternative Stammzellquelle für den
klinischen Einsatz darstellen.
Folgende Aspekte werden derzeit oder in Zukunft noch näher untersucht:
Momentan wird der Einfluss des Spenderalters auf die osteogene Differenzierung der Ad-
MSCs untersucht, wobei es erste Hinweise gibt, dass die osteogene Differenzierungsfähigkeit
mit dem Alter abnimmt. Dies wird auch durch Girolamo et al. bestätigt, die sowohl im 2D-
Modell als auch bei der Kultivierung im Scaffold eine signifikante Verringerung des
osteogenen Potentials mit zunehmendem Alter beobachten. Der Ertrag an Ad-MSCs älterer
Spender ist jedoch signifikant höher als der aus jungem Spendermaterial (de Girolamo, Lopa
et al. 2009, S. 793). Im Gegensatz dazu steht, dass B-MSCs von Spendern über 65 Jahren, die
höchsten AP-Aktivitätswerte erzielen. Beim Vergleich der Expressionslevel von osteogenen
Markergenen von B-MSCs aus Spendern jünger als 50 Jahre, zwischen 50 und 65 Jahre und
älter als 65 Jahre wurden keine signifikanten Unterschiede detektiert (Fickert, Schroter-
Bobsin et al. 2011, S. 224). Die Grenze von 50 Jahren für junge Spender ist dabei jedoch
kritisch zu betrachten. Für die Differenzierung von Ad-MSCs in Adipozyten und Myozyten
spielt das Spenderalter keine Rolle (Roura, Farre et al. 2006, S. 555). Zugrundeliegende
Mechanismen, wie z.B. Stoffwechselprozesse sind noch nicht geklärt. Um den Einfluss des
Alters auf das Differenzierungspotential näher zu untersuchen müssen die altersbedingten
Veränderungen der Stoffwechselprozesse in den Zellen näher betrachtet werden.
Wir beschränkten uns auf die Verwendung von Fettgewebe aus der Hüft- und
Bauchdeckenregion. Seit vielen Jahren ist bekannt, dass Frauen dazu tendieren im Gesäß-
Zusammenfassung und Ausblick
Seite | 108
und Oberschenkelbereich Fettgewebe anzulegen, wohingegen Männer eher in der
Bauchregion vor allem aber intraabdominell. Ebenso konnte gezeigt werden, dass besonders
das intraabdominelle Fettgewebe ein erhöhtes Risiko für kardiovaskuläre oder metabolische
Krankheiten wie die koronare Herzkrankheit oder den Diabetes mellitus darstellt (Kissebah
1996, S. 25). Weiter unterscheidet man braunes und weißes Fett. Braunes Fettgewebe findet
man vor allem beim Säugling, durch Oxidation der Fettsäuren kann Wärme gewonnen
werden. Weißes Fettgewebe hingegen erfüllt seine Funktion als Speicher-, Isolier- und
Baufett. Diese verschiedenen Aspekte zeigen, dass die Untersuchung weiterer
Spenderregionen noch viele neue Erkenntnisse über mesenchymale Stammzellen aus
Fettgewebe bringen wird.
Informationen zu den Primern
Seite | 109
8 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Mikroskopischer Aufbau eines Röhrenknochens..........................................12
Abbildung 2: Die mesenchymale Stammzelle ...................................................................16
Abbildung 3: β-Glycerolphosphatdinatrium Salzhydrat.....................................................18
Abbildung 4: L-Ascorbinsäure-2-phosphatsesquimagnesium Salzhydrat ...........................18
Abbildung 5: HEPES ..........................................................................................................19
Abbildung 6: Calciumchloriddihydrat................................................................................19
Abbildung 7: Cholecalciferol .............................................................................................20
Abbildung 8: Dexamethason–Cyclodextrin-Komplex ........................................................20
Abbildung 9: Schematische Darstellung des BMP- und TGF-β Signallings ..........................22
Abbildung 10: orthotope Ossifikation bei BMP 2, 6, 7 und 9 ...............................................23
Abbildung 11: Zellen nach SRB-Färbung .............................................................................32
Abbildung 12: Spektraluntersuchung der SRB-Lösung ........................................................33
Abbildung 13: Schematische Darstellung einer Neubauer Zählkammer ..............................34
Abbildung 14: Vergrößerte Darstellung des eingravierten Zählnetzes auf einer Neubauer
Zählkammer ................................................................................................35
Abbildung 15: Smad 1/5/8 Luciferase Reporter Assay ........................................................40
Abbildung 16: Beispiel einer Standardkurve der BSA-Lösung ..............................................44
Abbildung 17: (a) Phasentrennung nach dem ersten Zentrifugationsschritt
(b) gelartiges Pellet enthält RNA ..................................................................47
Abbildung 18: Beispiel einer Gelelektrophorese mit intakter RNA (invers dargestellt) ........48
Abbildung 19: Beispielbild einer Gelelektrophorese (invers dargestellt) .............................55
Abbildung 20: Schema zum Pipettieren der AP-Aktivität Standardkurve ............................57
Abbildung 21: Beispiel einer Standardkurve für die AP-Aktivität.........................................58
Abbildung 22: Spektraluntersuchung der AP-Substrat-Lösung ............................................59
Abbildung 23: osteogen differenzierte Fettstammzelle in AP-Färbung dargestellt
(Vergrößerung: 20 X) ...................................................................................61
Abbildung 24: osteogen differenzierte Fettstammzelle in van Kossa Färbung dargestellt
(Vergrößerung: 10 X) ...................................................................................63
Abbildung 25: Beispiel einer Standardkurve für Alizarin Rot ...............................................65
Abbildung 26: Spektraluntersuchung der Alizarin Rot Färbelösung.....................................66
Informationen zu den Primern
Seite | 110
Abbildung 27: Alcianblau Kernechtrot (Vergrößerung: 10 X) ..............................................68
Abbildung 28: Ölrot O Färbung ...........................................................................................69
Abbildung 29: Bestimmung der Zellviabilität mittels alamarBlue® ......................................71
Abbildung 30: Bestimmung der Zelladhärenz mittels SRB-Färbung .....................................72
Abbildung 31: Kontrollgruppe und chondrogen stimulierte Fettgewebsstammzellen nach
Alzian Blau Kernechtrot Färbung .................................................................73
Abbildung 32: Kontrollgruppe und adipogen stimulierte Fettgewebsstammzellen nach Ölrot
O Färbung ....................................................................................................74
Abbildung 33: Bestimmung der Oberflächenrezeptoren auf Ad-MSCs und Osteoblasten ...75
Abbildung 34: Zugabe verschiedener Supplemente und Ermittlung der AP-Aktivität ..........77
Abbildung 35: AP-Aktivität bei verschiedenen FCS-Konzentrationen ..................................78
Abbildung 36: Zellviabilitätsmessung mittels alamarBlue® .................................................78
Abbildung 37: Matrixmineralisierung bei verschiedenen FCS-Konzentrationen ..................79
Abbildung 38: exemplarische Darstellung des Viabilitätsverlaufes eines Spenders .............80
Abbildung 39: Viabilitätsbestimmung mittels alamarBlue® nach 24 h Inkubation mit
Dexamethason ............................................................................................81
Abbildung 40: AP-Aktivitätsbestimmung nach Stimulation mit Vitamin D3 und
Dexamethason ............................................................................................83
Abbildung 41: osteogen differenzierte Ad-MSC in AP-Färbung dargestellt
(Vergrößerung: 20 X) ...................................................................................84
Abbildung 42: Bestimmung der mineralisierten Matrix nach 8- und 15tägiger osteogener
Stimulation ..................................................................................................85
Abbildung 43: Bestimmung der gebildeten mineralisierten Matrix nach 12 Tagen
osteogener Stimulation ...............................................................................86
Abbildung 44: AP-Aktivtätsmessung nach 8tägiger Stimulation mit BMP 2 und/oder BMP 7 .
....................................................................................................................88
Abbildung 45: Quantifizierung der gebildeten Matrix nach 12 tägiger Stimulation mit BMP 2
und/oder BMP 7 ..........................................................................................89
Abbildung 46: Luciferase Aktivität bei unterschiedlichen BMP 2 Konzentrationen .............90
Abbildung 47: Luciferase Aktivität bei unterschiedlichen BMP 7 Konzentrationen .............90
Abbildung 48: Luciferase Aktivität bei unterschiedlichen BMP2 und BMP 7 Konzentrationen
....................................................................................................................91
Informationen zu den Primern
Seite | 111
Abbildung 49: Nachweis osteoblastentypischer Gene in den differenzierten Ad-MSCs im
Vergleich zu humanen Osteoblasten (invers dargestellt)............................93
Abbildung 50: Densitometrische Auswertung aller untersuchten Gene ..............................94
9 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Übersicht über die verwendeten Materialien ..............................................25
Tabelle 2: Übersicht über die verwendeten Geräte ......................................................26
Tabelle 3: Arbeitsschritte der SRB-Färbung ..................................................................33
Tabelle 4: Mediensupplemente ...................................................................................38
Tabelle 5: Verwendete BMP-Konzentrationen .............................................................41
Tabelle 6: Pipettierschema der BSA-Konzentrationen zur Erstellung der Standardkurve .
....................................................................................................................42
Tabelle 7: PCR-Reagenzien und Volumina pro Reaktionsgefäß .....................................50
Tabelle 8: Zeit- und Temperatureinstellungen am Mastercycler ..................................50
Tabelle 9: Informationen über die verwendeten Primer ..............................................53
Tabelle 10: Arbeitsschritte der AP-Färbung ....................................................................61
Tabelle 11: Arbeitsschritte der van Kossa Färbung .........................................................63
Tabelle 12: Schema zum Pipettieren der Alizarin Rot Standardkurve .............................64
Tabelle 13: Arbeitsschritte der Alizarin Rot Färbung ......................................................66
Tabelle 14: Arbeitsschritte der Alcianblau Kernechtrot Färbung ....................................67
Tabelle 15: Arbeitsschritte der Ölrot O Färbung .............................................................69
Tabelle 16: Auflistung der im Versuch verwendeten Medienzusammensetzungen ........76
Tabelle 17: Vitamin D3- und Dexamethasonzugabe zum Basisdifferenzierungsmedium .82
Tabelle 18: Verschiedene Konstellationen der Zugabe von BMP 2 und BMP 7 zum zuvor
ermittelten Basisdifferenzierungsmedium ...................................................87
Informationen zu den Primern
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10 Informationen zu den Primern
10.1 Alk 1
>NM_001077401.1 Homo sapiens activin A receptor type II-like 1 (ACVRL1), transcript variant 2, mRNA
product length = 256 Forward primer 1 GCTCAGACACGACAACATCC 20 Template 896 .................... 915 Reverse primer 1 ATTGCGGCTCTTGAAGTCG 19 Template 1151 ................... 1133
>NM_000020.2 Homo sapiens activin A receptor type II-like 1 (ACVRL1), transcript variant 1, mRNA
product length = 256 Forward primer 1 GCTCAGACACGACAACATCC 20 Template 1033 .................... 1052 Reverse primer 1 ATTGCGGCTCTTGAAGTCG 19 Template 1288 ................... 1270
10.2 Alk 2
>NM_001616.3 Homo sapiens activin A receptor, type IIA (ACVR2A), mRNA
product length = 253 Forward primer 1 CTTGCATTGCTGACTTTGG 19 Template 1159 ................... 1177 Reverse primer 1 CCAATTTCCTCCTCAAATGG 20 Template 1411 .................... 1392
10.3 Alk 3
>NM_004329.2 Homo sapiens bone morphogenetic protein receptor, type IA (BMPR1A), mRNA
product length = 179 Forward primer 1 CACTGCCCCCTGTTGTCATAG 21 Template 958 ..................... 978 Reverse primer 1 ATCCTGTTCCAAATCACGATTGT 23 Template 1136 ....................... 1114
10.4 Alk 5
>NM_001130916.1 Homo sapiens transforming growth factor, beta receptor 1 (TGFBR1), transcript variant 2, mRNA
Informationen zu den Primern
Seite | 113
product length = 287 Forward primer 1 TGTTGGTACCCAAGGAAAGC 20 Template 805 .................... 824 Reverse primer 1 AACATCGTCGAGCAATTTCC 20 Template 1091 .................... 1072
>NM_004612.2 Homo sapiens transforming growth factor, beta receptor 1 (TGFBR1), transcript variant 1, mRNA
product length = 287 Forward primer 1 TGTTGGTACCCAAGGAAAGC 20 Template 1036 .................... 1055 Reverse primer 1 AACATCGTCGAGCAATTTCC 20 Template 1322 .................... 1303
10.5 Alk 6
>NM_001256794.1 Homo sapiens bone morphogenetic protein receptor, type IB (BMPR1B), transcript variant 4, mRNA
product length = 130 Forward primer 1 CTTTTGCGAAGTGCAGGAAAAT 22 Template 158 ...................... 179 Reverse primer 1 TGTTGACTGAGTCTTCTGGACAA 23 Template 287 ....................... 265
>NM_001256793.1 Homo sapiens bone morphogenetic protein receptor, type IB (BMPR1B), transcript variant 1, mRNA
product length = 130 Forward primer 1 CTTTTGCGAAGTGCAGGAAAAT 22 Template 115 ...................... 136 Reverse primer 1 TGTTGACTGAGTCTTCTGGACAA 23 Template 244 ....................... 222
>NM_001256792.1 Homo sapiens bone morphogenetic protein receptor, type IB (BMPR1B), transcript variant 3, mRNA
product length = 130 Forward primer 1 CTTTTGCGAAGTGCAGGAAAAT 22 Template 174 ...................... 195 Reverse primer 1 TGTTGACTGAGTCTTCTGGACAA 23 Template 303 ....................... 281
>NM_001203.2 Homo sapiens bone morphogenetic protein receptor, type IB (BMPR1B), transcript variant 2, mRNA
product length = 130
Informationen zu den Primern
Seite | 114
Forward primer 1 CTTTTGCGAAGTGCAGGAAAAT 22 Template 278 ...................... 299 Reverse primer 1 TGTTGACTGAGTCTTCTGGACAA 23 Template 407 ....................... 385
10.6 TGF-ß-RII
>NM_003242.5 Homo sapiens transforming growth factor, beta receptor II (70/80kDa) (TGFBR2), transcript variant 2, mRNA
product length = 258 Forward primer 1 ATGCTGCTTCTCCAAAGTGC 20 Template 726 .................... 745 Reverse primer 1 AGGTTGAACTCACGTTCTGC 20 Template 983 ............GC...... 964
>NM_001024847.2 Homo sapiens transforming growth factor, beta receptor II (70/80kDa) (TGFBR2), transcript variant 1, mRNA
product length = 258 Forward primer 1 ATGCTGCTTCTCCAAAGTGC 20 Template 801 .................... 820 Reverse primer 1 AGGTTGAACTCACGTTCTGC 20 Template 1058 ............GC...... 1039
10.7 BMPRII
>NM_001204.6 Homo sapiens bone morphogenetic protein receptor, type II (serine/threonine kinase) (BMPR2), mRNA
product length = 154 Forward primer 1 CCACCTCCTGACACAACACC 20 Template 1542 .................... 1561 Reverse primer 1 GACCTTGTTTACGGTCTCCTG 21 Template 1695 ..................... 1675
10.8 IGF1R
>NM_000875.3 Homo sapiens insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R), mRNA
product length = 241 Forward primer 1 TCGACATCCGCAACGACTATC 21 Template 160 ..................... 180 Reverse primer 1 AGGGCGTAGTTGTAGAAGAGTTT 23 Template 400 ....................... 378
Informationen zu den Primern
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10.9 IGF2R
>NM_000876.2 Homo sapiens insulin-like growth factor 2 receptor (IGF2R), mRNA
product length = 146 Forward primer 1 GTGGAAGTGTGGATATTGTCCAG 23 Template 354 ....................... 376 Reverse primer 1 ACAGCTCACTGTTGTGTTGAA 21 Template 499 ..................... 479
10.10 RetinoidXR ß
>NM_021976.3 Homo sapiens retinoid X receptor, beta (RXRB), mRNA
product length = 236 Forward primer 1 TGGGCTCTCCCTTTCCAGT 19 Template 565 ................... 583 Reverse primer 1 GATTGCACATAGCCGTTTGCC 21 Template 800 ..................... 780
10.11 GAPDH
>NM_001256799.1 Homo sapiens glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), transcript variant 2, mRNA
product length = 420 Forward primer 1 GTCAGTGGTGGACCTGACCT 20 Template 918 .................... 937 Reverse primer 1 AGGGGTCTACATGGCAACTG 20 Template 1337 .................... 1318
>NM_002046.4 Homo sapiens glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), transcript variant 1, mRNA
product length = 420 Forward primer 1 GTCAGTGGTGGACCTGACCT 20 Template 894 .................... 913 Reverse primer 1 AGGGGTCTACATGGCAACTG 20 Template 1313 .................... 1294
10.12 BMP 4
>NM_130851.2 Homo sapiens bone morphogenetic protein 4 (BMP4), transcript variant 3, mRNA
product length = 130 Forward primer 1 TGGTCTTGAGTATCCTGAGCG 21 Template 570 ..................... 590
Informationen zu den Primern
Seite | 116
Reverse primer 1 GCTGAGGTTAAAGAGGAAACGA 22 Template 699 ...................... 678
>NM_130850.2 Homo sapiens bone morphogenetic protein 4 (BMP4), transcript variant 2, mRNA
product length = 130 Forward primer 1 TGGTCTTGAGTATCCTGAGCG 21 Template 516 ..................... 536 Reverse primer 1 GCTGAGGTTAAAGAGGAAACGA 22 Template 645 ...................... 624
>NM_001202.3 Homo sapiens bone morphogenetic protein 4 (BMP4), transcript variant 1, mRNA
product length = 130 Forward primer 1 TGGTCTTGAGTATCCTGAGCG 21 Template 725 ..................... 745 Reverse primer 1 GCTGAGGTTAAAGAGGAAACGA 22 Template 854 ...................... 833
10.13 BSP 2
>NM_004967.3 Homo sapiens integrin-binding sialoprotein (IBSP), mRNA
product length = 202 Forward primer 1 TGACTCATCCGAAGAAAATGGAG 23 Template 290 ....................... 312 Reverse primer 1 CTGGATTGCAGCTAACCCTGT 21 Template 491 ..................... 471
10.14 MGP
>NM_001190839.1 Homo sapiens matrix Gla protein (MGP), transcript variant 1, mRNA
product length = 102 Forward primer 1 AGATGGAGAGCTAAAGTCCAAGA 23 Template 348 ....................... 370 Reverse primer 1 GTAGCGTTCGCAAAGTCTGTA 21 Template 449 ..................... 429
>NM_000900.3 Homo sapiens matrix Gla protein (MGP), transcript variant 2, mRNA
product length = 102 Forward primer 1 AGATGGAGAGCTAAAGTCCAAGA 23 Template 273 ....................... 295 Reverse primer 1 GTAGCGTTCGCAAAGTCTGTA 21 Template 374 ..................... 354
Informationen zu den Primern
Seite | 117
10.15 OSF 2
>NM_006475.2 Homo sapiens periostin, osteoblast specific factor (POSTN), transcript variant 1, mRNA
product length = 140 Forward primer 1 TAAGTTTGTTCGTGGTAGCACC 22 Template 2077 ...................... 2098 Reverse primer 1 GTGTGGGTCCTTCAGTTTTGATA 23 Template 2216 ....................... 2194
10.16 Alkalische Phosphatase
>NM_000478.4 Homo sapiens alkaline phosphatase, liver/bone/kidney (ALPL), transcript variant 1, mRNA
product length = 476 Forward primer 1 ACGTGGCTAAGAATGTCATC 20 Template 403 .................... 422 Reverse primer 1 CTGGTAGGCGATGTCCTTA 19 Template 878 ................... 860
>NM_001177520.1 Homo sapiens alkaline phosphatase, liver/bone/kidney (ALPL), transcript variant 3, mRNA
product length = 360 Forward primer 1 ACGTGGCTAAGAATGTCATC 20 Template 238 .................... 257 Reverse primer 1 CTGGTAGGCGATGTCCTTA 19 Template 597 ................... 579
>NM_001127501.2 Homo sapiens alkaline phosphatase, liver/bone/kidney (ALPL), transcript variant 2, mRNA
product length = 476 Forward primer 1 ACGTGGCTAAGAATGTCATC 20 Template 238 .................... 257 Reverse primer 1 CTGGTAGGCGATGTCCTTA 19 Template 713 ................... 695
10.17 Osteoprotegerin
>NM_002546.3 Homo sapiens tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11b (TNFRSF11B), mRNA
product length = 313 Forward primer 1 CCGGAAACAGTGAATCAACTC 21 Template 880 ..................... 900
Informationen zu den Primern
Seite | 118
Reverse primer 1 AGGTTAGCATGTCCAATGTG 20 Template 1192 .................... 1173
10.18 BMP 2
>NM_001200.2 Homo sapiens bone morphogenetic protein 2 (BMP2), mRNA
product length = 150 Forward primer 1 CCCCCTACATGCTAGACCTGT 21 Template 1012 ..................... 1032 Reverse primer 1 CACTCGTTTCTGGTAGTTCTTCC 23 Template 1161 ....................... 1139
10.19 Osteopontin
>NM_001251830.1 Homo sapiens secreted phosphoprotein 1 (SPP1), transcript variant 5, mRNA
product length = 257 Forward primer 1 CTCCATTGACTCGAACGACTC 21 Template 657 ..................... 677 Reverse primer 1 CGTCTGTAGCATCAGGGTACTG 22 Template 913 ...................... 892
>NM_001251829.1 Homo sapiens secreted phosphoprotein 1 (SPP1), transcript variant 4, mRNA
product length = 257 Forward primer 1 CTCCATTGACTCGAACGACTC 21 Template 345 ..................... 365 Reverse primer 1 CGTCTGTAGCATCAGGGTACTG 22 Template 601 ...................... 580
>NM_001040060.1 Homo sapiens secreted phosphoprotein 1 (SPP1), transcript variant 3, mRNA
product length = 257 Forward primer 1 CTCCATTGACTCGAACGACTC 21 Template 387 ..................... 407 Reverse primer 1 CGTCTGTAGCATCAGGGTACTG 22 Template 643 ...................... 622
>NM_001040058.1 Homo sapiens secreted phosphoprotein 1 (SPP1), transcript variant 1, mRNA
product length = 257 Forward primer 1 CTCCATTGACTCGAACGACTC 21 Template 468 ..................... 488 Reverse primer 1 CGTCTGTAGCATCAGGGTACTG 22
Informationen zu den Primern
Seite | 119
Template 724 ...................... 703 >NM_000582.2 Homo sapiens secreted phosphoprotein 1 (SPP1), transcript variant 2, mRNA
product length = 257 Forward primer 1 CTCCATTGACTCGAACGACTC 21 Template 426 ..................... 446 Reverse primer 1 CGTCTGTAGCATCAGGGTACTG 22 Template 682 ...................... 661
10.20 Osteocalcin
>NM_199173.4 Homo sapiens bone gamma-carboxyglutamate (gla) protein (BGLAP), mRNA
product length = 138 Forward primer 1 CACTCCTCGCCCTATTGGC 19 Template 86 ................... 104 Reverse primer 1 GCCTGGGTCTCTTCACTACCT 21 Template 223 ..................... 203
10.21 Vitamin D
>NM_001017536.1 Homo sapiens vitamin D (1,25- dihydroxyvitamin D3) receptor (VDR), transcript variant 3, mRNA
product length = 158 Forward primer 1 GACATCGGCATGATGAAGGAG 21 Template 807 ..................... 827 Reverse primer 1 GCGTCCAGCAGTATGGCAA 19 Template 964 ................... 946
>NM_001017535.1 Homo sapiens vitamin D (1,25- dihydroxyvitamin D3) receptor (VDR), transcript variant 2, mRNA
product length = 158 Forward primer 1 GACATCGGCATGATGAAGGAG 21 Template 538 ..................... 558 Reverse primer 1 GCGTCCAGCAGTATGGCAA 19 Template 695 ................... 677
>NM_000376.2 Homo sapiens vitamin D (1,25- dihydroxyvitamin D3) receptor (VDR), transcript variant 1, mRNA
product length = 158 Forward primer 1 GACATCGGCATGATGAAGGAG 21 Template 416 ..................... 436
Informationen zu den Primern
Seite | 120
Reverse primer 1 GCGTCCAGCAGTATGGCAA 19 Template 573 ................... 555
10.22 Osteoprotegerin
>NM_002546.3 Homo sapiens tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11b (TNFRSF11B), mRNA
product length = 313 Forward primer 1 CCGGAAACAGTGAATCAACTC 21 Template 880 ..................... 900 Reverse primer 1 AGGTTAGCATGTCCAATGTG 20 Template 1192 .................... 1173
10.23 RANKL
>NM_033012.3 Homo sapiens tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 11 (TNFSF11), transcript variant 2, mRNA
product length = 245 Forward primer 1 TCCCAAGTTCTCATACCCTGA 21 Template 1056 ..................... 1076 Reverse primer 1 CATCCAGGAAATACATAACACTCC 24 Template 1300 ........................ 1277
>NM_003701.3 Homo sapiens tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 11 (TNFSF11), transcript variant 1, mRNA
product length = 245 Forward primer 1 TCCCAAGTTCTCATACCCTGA 21 Template 895 ..................... 915 Reverse primer 1 CATCCAGGAAATACATAACACTCC 24 Template 1139 ........................ 1116
Literaturverzeichnis
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11 Literaturverzeichnis
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Danksagung
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12 Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. rer. nat. Andreas K. Nüssler bedanken,
dass ich die Arbeit in der von ihm geleiteten Abteilung durchführen durfte. Mir wurden alle
benötigten Geräte, Materialen und Literatur zur Verfügung gestellt sowie stets eine
hochqualifizierte Unterstützung in der Planung und Durchführung entgegengebracht.
Ich möchte ebenfalls Frau Dr. sc. hum. Sabrina Ehnert für eine praktische und
wissenschaftliche Betreuung danken, die weit über das normale Maß hinaus ging.
Weiterer Dank geht an Herrn Prof. Dr. rer. nat. Steven Dooley für die Bereitstellung der
adenoviralen Reporterkonstrukte sowie der Arbeitsräume.
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