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Theoretische und experimentelle Untersuchungen zur
Inhibition des Enzyms Aldose Reduktase
Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
dem
Fachbereich Pharmazie
der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von
Oliver Krämer
aus Siegen
Marburg/Lahn 2003
Vom Fachbereich Pharmazie der Philipps-Universität Marburg
als Dissertation angenommen am: 28.05.03
Erstgutachter: Prof. Dr. G. Klebe
Zweitgutachter: Prof. Dr. M. Schlitzer
Tag der mündlichen Prüfung: 28.05.03
Die dieser Arbeit zugrundeliegenden Untersuchungen wurden auf Anregung von Herrn Prof.
Dr. Gerhard Klebe in der Zeit von September 1999 bis Januar 2003 am Institut für
Pharmazeutische Chemie des Fachbereiches Pharmazie der Philipps-Universität Marburg
durchgeführt.
Danksagung
• Prof. Dr. Gerhard Klebe danke ich für die interessante Themenstellung, die gute
Betreuung und die gewährte Freiheit bei der Bearbeitung des Themas.
• Dr. Christoph Sotriffer danke ich für die exzellente Einführung in das Gebiet der MD-
Simulationen, seine stete Hilfsbereitschaft, die vielen hilfreichen Diskussionen und das
sichere Geleit durch die Bergwelt der Dolomiten.
• Hans-Dieter Gerber danke ich für die Synthese der Verbindungen und seine stets
aufmunternden Worte.
• Dr. Alberto D. Podjarny danke ich für viele hilfreiche Diskussionen und die sehr gute
Zusammenarbeit.
• Alexandra Cousido und Isabelle Hazemann danke ich für die Expression und
Aufreinigung der für die mikrokalorimetrischen Messungen benötigten Proteinmengen.
• André Mitschler danke ich für die Einführung in die Geheimnisse der
Proteinkristallisation sowie für die Messung des HD04-Datensatzes.
• Dr. Andreas Heine und Prof. Dr. Milton Stubbs danke ich für die Hilfe bei allen Fragen
der Röntgenkristallographie.
• Dr. John Ladbury danke ich für die Ermöglichung eines Aufenthaltes in seinem Labor am
University College London und die hilfreichen Diskussionen. Dr. Ronan O’Brien danke
ich für die exzellente fachliche Betreuung während dieser Zeit.
• Ich danke allen Literaturarbeitern/innen die an der Entstehung dieser Arbeit beteiligt
waren.
• Ich danke allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe für die angenehme Arbeitsatmosphäre.
• Meinen Eltern sei an dieser Stelle für die Ermöglichung meines Studiums und für ihre
stete Fürsorge gedankt.
Darin besteht das Wesen der Wissenschaft. Zuerst denkt man
an etwas, das wahr sein könnte. Dann sieht man nach, ob es der
Fall ist und im allgemeinen ist es nicht der Fall.
Bertrand Russell (1872-1970)
Das Schönste, was wir entdecken können, ist das
Geheimnisvolle.
Albert Einstein (1879-1955)
Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht:
Aufsätze
• Oliver Krämer, Isabelle Hazemann, Alberto D. Podjarny, Gerhard Klebe, Ultra-High
Resolution Drug Design III: Virtual Screening for Inhibitors of Human Aldose Reductase, Proteins:
Structure, Function and Genetics, akzeptiert.
• Christoph A. Sotriffer, Oliver Krämer, Gerhard Klebe, Ultra-high resolution drug design IV: Probing flexibility and "induced-fit" phenomena in aldose reductase by comparative crystal structure
analysis and molecular dynamics simulations, Proteins: Structure, Function and Genetics,
eingereicht.
Tagungsbeiträge
• Oliver Krämer, Isabelle Hazemann, Alberto D. Podjarny, Gerhard Klebe, Thermodynamic
Characterization of Ligand Binding to the Enzyme Aldose Reductase, Poster, European Conference
on Current Trends in Microcalorimetry, Dublin (Irland), August 2002.
• Oliver Krämer, Virtual Screening of Novel Aldose Reductase Inhibitors, Vortrag, 16. Darmstädter
Molecular-Modelling-Workshop, Darmstadt, Mai 2002.
Abkürzungsverzeichnis
ACD Available Chemicals Directory
AR Aldose Reduktase
ARI Aldose Reduktase-Inhibitor
DFT Dichtefunktionaltheorie
FEP Free Energy Perturbation
hAR humane Aldose Reduktase
HEPES 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure
HTS High-Throughput-Screening
ITC Isothermale Titrations Kalorimetrie
k.A. keine Angabe(n)
MM Molekularmechanik
MD Molekulardynamik
NADP(H) β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat
NCI National Cancer Institute
NPT constant Number of particles, Pressure and Temperature
QM Quantenmechanik
rms root mean square
rmsd root mean square deviation
SBDD Structure-based Drug Design
SDH Sorbitol Dehydrogenase
TRIS N-Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
vdW van der Waals
VS Virtual Screening
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 3
1.1 Rationales Wirkstoffdesign 3
1.2 Rezeptorflexibilität 3
1.3 Aufgabenstellung 3
2 Diabetes mellitus 3
2.1 Spätfolgen des Diabetes mellitus 3
2.2 Sorbitol-Stoffwechselweg 3
3 Stand der Kenntnisse 3
3.1 Aldose Reduktase 3
3.2 Kristallstrukturen 3
3.3 Inhibitoren der Aldose Reduktase 3 3.3.1 Zyklische Imide 3 3.3.2 Carbonsäuren 3
3.4 Untersuchungen zum Mechanismus 3
3.5 Struktur basierendes Wirkstoffdesign 3
4 Ergebnisse und Diskussion 3
4.1 Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 3 4.1.1 Introduction 3 4.1.2 Materials and Methods 3 4.1.3 Results and Discussion 3 4.1.4 Conclusions 3
4.2 Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 3 4.2.1 Introduction 3 4.2.2 Data Analysis, Methods and Results 3 4.2.3 Discussion 3 4.2.4 Conclusions 3
4.3 Datenbanksuche unter Berücksichtigung multipler Bindungsmodi 3 4.3.1 Ligand basierender Ansatz 3 4.3.2 Durchführung der Datenbanksuche 3 4.3.3 Diskussion 3
4.4 Optimierung des Inhibitors RJC03373 3
4.5 Kristallstruktur der hAR im Komplex mit dem Inhibitor HD04 3
4.6 Thermodynamische Messungen 3 4.6.1 Bestimmung der Bindungskonstanten 3 4.6.2 Änderung der Protonierungszustände bei der Bindung 3 4.6.3 Oxidationszustand des Kofaktors 3 4.6.4 Diskussion 3
5 Zusammenfassung und Ausblick 3
6 Material und Methoden 3
6.1 Chemikalien und Enzym 3
6.2 Enzymassay 3
6.3 Isothermale Titrationskalorimetrie 3 6.3.1 Beschreibung des Gerätes 3 6.3.2 Energetische Betrachtung des Bindungsvorganges 3 6.3.3 Bestimmbare Größen 3 6.3.4 Durchführung der Messungen 3
6.4 Methoden des computergestützten Wirkstoff-Designs 3 6.4.1 Berechnung von günstigen Wechselwirkungsfeldern in der Bindetasche 3 6.4.2 Generierung von Datenbanken für das virtuelle Screening 3 6.4.3 UNITY-Pharmakophor-Generierung 3 6.4.4 Proteinüberlagerung 3 6.4.5 Molekülüberlagerung und Ähnlichkeitsvergleich 3 6.4.6 Docking-Verfahren 3 6.4.7 Hierarchische Datenbanksuchen 3
7 Literaturverzeichnis 3
Einleitung Rationales Wirkstoffdesign 9
1 Einleitung
1.1 Rationales Wirkstoffdesign
Die Entschlüsselung des menschlichen Genoms (Lander et al. 2001; Venter 2003; Venter et al.
2001; Waterston et al. 2002; Waterston et al. 2003) stellt den Beginn eines neuen Zeitalters für
die Arzneimittelforschung dar. Durch das Humane Genom Projekt konnten die Sequenzen
von ca. 30.000 Genen entschlüsselt werden. Obwohl die genaue Anzahl der sich darunter
befindenden Zielmoleküle (Targets) noch nicht bekannt ist, wird sie wesentlich höher liegen als
die heute ca. 500 Zielmoleküle, an denen die im Markt befindlichen Arzneistoffe ihre Wirkung
entfalten (Drews 2000a; Drews 2000b). Damit ist klar, dass in den kommenden Jahren die
Identifizierung und Validierung von geeigneten neuen Targets eine wesentliche
Herausforderung für die Pharmazeutische Forschung sein wird (Swindells et al. 2002).
Ist dies geleistet, kann die Suche nach einer Leitstruktur für Inhibitoren dieses Zielmoleküls
beginnen. Eine derzeit häufig angewendete Strategie ist die in vitro-Testung großer
Molekülbibliotheken auf Aktivität (High-Throughput Screening, HTS) (Inglese 2002; Smith 2002).
In der Verbindung mit kombinatorischer Chemie (Oliver et al. 1999) werden
Substanzbibliotheken synthetisiert und mit geeigneten Assays auf ihre Wirksamkeit getestet
(Carell et al. 1995). Durch automatisierte Verfahren ist es möglich, in kurzer Zeit eine sehr
große Anzahl an Verbindungen experimentell zu überprüfen. Bereits in diesem Jahr wird es
möglich sein, standardmäßig eine Million Verbindungen pro Target in wenigen Tagen zu testen
(Bajorath 2002). Die Trefferquoten dieses Ansatzes sind jedoch ernüchternd und liegen häufig
unter einem Promille der Anzahl eingesetzter Substanzen (Lahana 1999; Sills 1998).
Eine alternative Strategie ist das Struktur basierende Wirkstoff-Design, bei dem ausgehend
von der dreidimensionalen (3D) Struktur des molekularen Rezeptors, am besten im Komplex
mit bereits bekannten Liganden, Inhibitoren rational entworfen oder selektiert werden. Nach
der experimentellen Testung auf Aktivität und der strukturellen Untersuchung der potentiellen
Inhibitoren, fließen dabei gewonnene Erkenntnisse als neue Information zurück in den
Design-Zyklus (Abbildung 1) (Klebe 2000).
Einleitung Rationales Wirkstoffdesign 10
Abbildung 1. Prinzip des Struktur basierenden Wirkstoffdesigns.
Eine große Hilfe beim Entwurf neuer Inhibitoren (de novo-Design) oder der Optimierung
bereits bekannter Inhibitoren ist die Identifizierung und Visualisierung von bevorzugten
Wechselwirkungsbereichen (hot spots) innerhalb der Bindetasche mit geeigneten
Computermethoden (Böhm 1992; Gohlke et al. 2000b; Goodford 1985; Miranker et al. 1995;
Verdonk et al. 1999; Verdonk et al. 2001). Diese Informationen können alternativ genutzt
werden, um Kriterien für das virtuelle Durchmustern (virtual screening) großer Datenbanken
abzuleiten. Die in den Datenbanken gespeicherten kleinen Moleküle werden einer Reihe von
hierarchischen Filterschritten unterworfen. In einem abschließenden bewertenden Schritt
werden die verbleibenden Moleküle häufig durch so genannte Docking-Programme in die
Proteinbindetasche eingepasst (Good 2001; Sotriffer et al. 2003; Walters et al. 1998). Gängige
Docking-Programme betrachten die Bindetasche als rigide, wohingegen der Ligand flexibel
behandelt wird (Ewing et al. 2001; Jones et al. 1997; Rarey et al. 1996a). Durch zunehmend
schnellere Computer ist es mittlerweile bis zu einem gewissen Grad möglich, Proteinflexibilität
während des Dockings zu berücksichtigen (s. Kapitel 1.2).
Entscheidend für den Erfolg des virtuellen Screenings ist eine zuverlässige Vorhersage der
Affinität eines „Screening-Kandidaten“ zu seinem Rezeptor (scoring) (Gohlke et al. 2002a).
Vergleichende Studien haben gezeigt, dass die vorhandenen Bewertungsfunktionen für
unterschiedliche Proteine unterschiedlich gute Ergebnisse liefern (Bissantz et al. 2000; Stahl et
al. 2001). Auch die Güte der Vorhersage der Docking-Programme ist vom jeweiligen Protein
abhängig. Deshalb muss für jeden Rezeptor eine günstige Kombination von Docking-
Programm und Bewertungsfunktion gefunden werden. Die Verwendung mehrerer
Bewertungsfunktionen kann sich als vorteilhaft erweisen, insbesondere wenn die Vorhersagen
der verschiedenen Funktionen in Einklang stehen (consensus-scoring).
Einleitung Rationales Wirkstoffdesign 11
Die durch virtuelles Screening aufgefallenen Verbindungen werden entweder kommerziell
erworben oder synthetisiert und anschließend in einem Bioassay auf ihre Affinität überprüft.
Im letzten Schritt wird im Idealfall die vorhergesagte Bindungsgeometrie
röntgenkristallographisch oder NMR-spektroskopisch validiert, um den Design-Zyklus zu
schließen. Die gewonnenen Erkenntnisse können in einen neuen Zyklus einfließen und so die
weitere Optimierung der Inhibitoren leiten.
Nach der kompletten Sequenzierung des humanen Genoms sowie der Genome weiterer
Organismen wurden zahlreiche Structural Genomics Initiativen gegründet. Diese zielen darauf
ab, im großen Maßstab durch automatisierte Prozesse Gene zu klonieren, zu transformieren,
zu exprimieren und die erhaltenen Proteine anschließend zu reinigen, um so durch
Hochdurchsatz-NMR-Spektroskopie oder -Röntgenkristallographie neue Proteinstrukturen zu
bestimmen (Mittl et al. 2001). Es ist davon auszugehen, dass die Zahl der öffentlich
zugänglichen 3D-Protein-Strukturen von zur Zeit über 20.000 (PDB, Stand: März 2003)
weiter exponentiell ansteigen wird (Berman et al. 2002; Bernstein et al. 1977; Westbrook et al.
2003).
In den letzten Jahren sind einige Erfolge mit dem Struktur basierenden Design von
Wirkstoffen erzielt worden (Lyne 2002). So konnten z.B. subnanomolare Inhibitoren der
Carboanhydrase mit einem virtuellen Screening gefunden werden (Grüneberg et al. 2002). Die
mit virtuellem Screening erreichbaren Trefferquoten scheinen im Allgemeinen höher zu sein
als beim Hochdurchsatz-Screening, wie zwei kürzlich veröffentlichte Studien (Doman et al.
2002; Paiva et al. 2001) belegen. Nachdem HTS und virtuelles Screening lange als
komplementäre Ansätze betrachtet wurden, rückt mittlerweile immer mehr die kombinierte
Anwendung dieser Methoden in den Vordergrund, um dabei bestehende Synergien zu nutzen
(Bajorath 2002; Böhm et al. 2000; Good et al. 2000). Durch das nachträgliche Docking von
Treffern aus einem HTS nach Angiogenin-Inhibitoren konnte die Hitrate des HTS um mehr
als das Sechsfache gesteigert werden (Jenkins et al. 2003). Insbesondere befanden sich unter
den von HTS und VS im Konsens positiv bewerteten Verbindungen nur sehr wenige falsch
positiv bewertete Verbindungen. Möglich ist auch, vor der tatsächlichen Synthese und
experimentellen Testung, den chemischen Suchraum durch das Durchmustern virtueller
Bibliotheken, die auf Struktur basierenden oder kombinatorischen Prinzipien beruhen,
einzuschränken. Umgekehrt können durch das HTS großer Datensätze Informationen über
Struktur-Wirkungsbeziehungen von Liganden gesammelt werden. Die Auswertung dieser
Datensätze kann dann mit Methoden des Computer unterstützten Wirkstoff-Designs erfolgen.
Einleitung Rationales Wirkstoffdesign 12
Das Ziel ist, durch die Nutzung der Synergie-Effekte in Zukunft schneller und
kostengünstiger neue Arzneistoffe entwickeln zu können.
Einleitung Rezeptorflexibilität 13
1.2 Rezeptorflexibilität
Wie bereits erwähnt, ist aufgrund der begrenzten Rechenkapazitäten die Berücksichtigung
einer einzelnen fixierten Proteinstruktur der Standard beim Einpassen des Liganden in die
Bindetasche. Eine solche einzelne Konformation kann aber nur im Fall eines sehr rigiden
Systems eine adäquate Darstellung des Proteins sein. Diese Repräsentation entspricht der
Vorstellung, die dem von Erwin Fischer postulierten „Schlüssel-Schloss-Prinzip“ zugrunde
liegt: An das in einer wohldefinierten Konformation vorliegende Protein bindet der Ligand in
optimaler Konformation und räumlicher Orientierung, um komplementäre Wechselwirkungen
mit dem Protein einzugehen. Realistischer ist die Vorstellung, dass die meisten Proteine
komplizierte Energie-Hyperflächen besitzen, auf denen viele konformativ und energetisch
unterschiedliche Zustände auftreten können. Die Faltung eines Proteins kann man sich als
einen Vorgang vorstellen, bei dem das Protein aus einer Vielzahl ungünstiger Zustände über
multiple Pfade in den gefalteten Zustand übergeht. Obwohl es (bei einem rigiden Protein) so
aussehen mag, als ob es nur einen gefalteten Zustand (nur ein Minimum) gäbe, zeigt sich bei
genauerer Betrachtung, dass dieser gefaltete Zustand aus mehreren strukturell ähnlichen und
energetisch nahezu entarteten Konformationen des Proteins besteht, die ein Ensemble bilden
(Abbildung 2). Eine einzelne Proteinstruktur ist kaum in der Lage dieses Ensemble korrekt zu
beschreiben, auch wenn eine Kristallstruktur das zeitliche Mittel mehrerer Konformationen
wiedergibt.
Einleitung Rezeptorflexibilität 14
Konformationsraum
Pot
entie
lle E
nerg
ie
Konformationsraum
Pot
entie
lle E
nerg
ie
Abbildung 2. Energiehyperfläche eines realen Proteins. Der günstigste Zustand besteht aus einem
Ensemble strukturell ähnlicher und energetisch nahezu entarteter Konformationen. Entnommen
aus (Sotriffer in press).
Die Form der Energie-Hyperfläche wird durch eine Reihe umgebungsabhängiger Variablen
(Ionenstärke, pH, Temperatur, etc.) bestimmt. Auch durch die Einführung eines Liganden
wird das System beeinflusst. Man spricht in diesem Zusammenhang von einer induzierten
Anpassung (induced-fit) des Proteins (Koshland Jr. 1958). In den letzten Jahren wurde die
Theorie zum Auftreten verschiedener Proteinkonformationen bei der Bindung
unterschiedlicher Liganden durch die Arbeiten von Freire et al. (Freire 1998) und Ma et al.
(Ma et al. 1999) erweitert und an neue Erkenntnisse angepasst. Das Protein wird nicht mehr
als fixierter Zustand betrachtet, der durch Einführung des Liganden deformiert wird.
Stattdessen geht man davon aus, dass das Protein per se in der Lage ist, sämtliche
beobachtbaren Konformationen einzunehmen – einige entsprechend dem nativen (gefalteten)
Zustand, andere entsprechend dem komplexierten Zustand nach induzierter Anpassung. Der
Ligand selektiert dann lediglich die für seine Bindung günstigste Proteinkonformation und
stabilisiert diese. Ist die Bindung des Liganden an den Zustand nach induzierter Anpassung
bevorzugt, dann verschiebt sich die mittlere Struktur des Proteins zu diesem Zustand.
Das Auftreten von multiplen Bindungsmodi eines Liganden wird verständlich, da es mehr als
eine „angepasste“ Proteinkonformation mit ähnlich günstiger Energie für diesen Liganden
geben kann. Zur korrekten Abschätzung der Bindungsaffinität eines solchen Liganden
müssten sämtliche populierten Zustände betrachtet werden.
Einleitung Rezeptorflexibilität 15
Welche Faktoren bestimmen die Bindungsaffinität eines Liganden? Wie generell bei solchen
Gleichgewichtsprozessen müssen die Energien der Reaktanden vor und nach der Bindung
verglichen werden (s. Abbildung 23, Seite 3). Im Gleichgewicht tragen unter
Standardbedingungen enthalpische und entropische Anteile zur freien Bindungsenergie bei
(Gleichung 1).
Gleichung 1 ∆Gobind = ∆Ho - T∆So
Die für die Änderung der Proteinkonformation beim Übergang von der freien zur
gebundenen Konformation benötigte freie Energie ∆Goconf muss bei der Berechnung der
Bindungsenergie ∆Gobind berücksichtigt werden (Gleichung 2). ∆Go
rigide ist die freie
Bindungsenergie unter der Annahme, dass die freie und die gebundene Konformation des
Proteins identisch sind.
Gleichung 2 ∆Gobind = ∆Go
rigide + ∆Goconf
Wie groß ist die für die Konformationsänderung benötigte Energie? Diese Frage ist von
essentieller Bedeutung für das Wirkstoffdesign bei flexiblen Proteinen. Ist die für die
Konformationsänderung benötigte Energie vernachlässigbar, dann wird die intrinsische
Bindungsenergie ∆Gorigide des Liganden zum bestimmenden Faktor. Der Ligand wird dann
tatsächlich die für seine Bindung günstigste Proteinkonformation selektieren. Stellt ∆Goconf
jedoch einen bedeutenden Beitrag dar, dann sind bei einem flexiblen Protein zwei Extremfälle
denkbar, die beide zu einer günstigen Bindungsenergie führen: (1) ein Ligand mit mäßiger
intrinsischer Affinität (∆Gorigide < 0) bindet bevorzugt an eine energetisch sehr günstige
Konformation des Proteins; (2) ein Ligand mit hoher intrinsischer Affinität (∆Gorigide << 0)
bindet an eine weniger günstige (und damit weniger populierte) Konformation des Proteins.
Den günstigsten Fall, der folglich zu einer sehr großen Bindungsenergie führen sollte, stellt
natürlich die Bindung eines Liganden mit hoher intrinsischer Affinität an eine günstige
Proteinkonformation dar.
Einleitung Rezeptorflexibilität 16
Abbildung 3. Ein Protein existiert in Lösung in einer Reihe von verschiedenen Konformationen (a)-
(f) mit unterschiedlichen Energien. Die beiden energetisch günstigsten Zustände (b) und (d) sind im
ungebundenen Zustand am häufigsten populiert. Ein Ligand (dargestellt in grün) mit einer hohen
intrinsischen Affinität (∆Gorigide << 0) bindet bevorzugt an die Proteinkonformation (a), da die
entsprechend der Energiedifferenz zwischen den Zuständen (a) und (d) für die Konformations-
änderung benötigte Energie (∆Goconf > 0) überkompensiert wird. Dadurch wird die Population der
Proteinkonformationen im Vergleich zum ungebundenen Zustand verschoben (induced-fit). Ein
Ligand mit mäßiger intrinsischer Affinität (dargestellt in blau) bindet bevorzugt an die schon im
ungebundenen Zustand am häufigsten populierte Konformation. Entnommen aus (Carlson 2002a).
Im Laufe der Jahre sind eine Reihe von Methoden entwickelt worden, um die
Rezeptorflexibilität im Rahmen des Molecular Modeling zu berücksichtigen. Einen sehr guten
Überblick geben die Artikel von Halperin et al. (Halperin et al. 2002) und Carlson (Carlson
2002a; Carlson 2002b; Carlson et al. 2000). Die verschiedenen Ansätze lassen sich grob nach
dem Maß der berücksichtigten Flexibilität klassifizieren. Die Ansätze reichen von der
Berücksichtigung verschiedener Seitenketten-Konformationen hin bis zu der Simulation der
Bewegung von ganzen Schleifen oder Domänen. Im Bereich des Struktur basierenden
Wirkstoffdesigns haben sich vermehrt Methoden durchgesetzt, die multiple Proteinstrukturen
verwenden, um die Flexibilität des Rezeptors zu beschreiben. Dieses Konzept nutzt auch das
in dieser Arbeit verwendete Programm FLEXE (Claussen et al. 2001). Entweder aus
experimentellen Daten (Kristallstrukturen, NMR) entnommene oder Computer generierte
Proteinkonformationen werden zu einer Rezeptorbeschreibung vereint, wobei die im
Ensemble vertretenen Alternativen zu neuen Proteinkonformationen kombiniert werden.
Einleitung Aufgabenstellung 17
1.3 Aufgabenstellung
Thema der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der Inhibition des Enzyms Aldose
Reduktase (AR), das im Zusammenhang mit der Entstehung von Spätfolgen des Diabetes
mellitus (s. Kap. 2.1) steht. Aufgrund intensiver Bemühungen auch von Seiten der
Pharmaindustrie sind im Laufe der Jahre bereits eine Reihe von Inhibitoren der Aldose
Reduktase identifiziert worden (s. Kapitel 3.3). Die strukturellen und mechanistischen
Kenntnisse zur Bindung von ARIs werden in Kapitel 3.2 und 3.4 vorgestellt. Die bisher
publizierten Arbeiten zu dem Struktur basierenden Design von ARIs werden in Kapitel 3.5
zusammengefasst.
Eine Besonderheit der Aldose Reduktase liegt in der ausgeprägten Anpassungsfähigkeit ihrer
Bindetasche bei der Ligandbindung. Das Ausmaß dieser Rezeptorflexibilität wurde durch den
ausführlichen Vergleich bekannter Kristallstrukturen und mit Hilfe von
molekulardynamischen Simulationen untersucht (Kapitel 4.1).
Wesentliches Ziel der vorliegenden Arbeit war die Suche nach neuen Inhibitoren der Aldose
Reduktase. Das virtuelle Screening wurde dabei zunächst auf eine rigide Proteinstruktur
beschränkt (Kapitel 4.2). Anschließend wurde untersucht, inwieweit neue Ansätze in der Lage
sind, die Flexibilität des Rezeptors bei der virtuellen Suche zu berücksichtigen (Kapitel 4.3). In
beiden Datenbanksuchen konnten neue Inhibitoren der Aldose Reduktase im mikromolaren
Bereich identifiziert werden.
Ein bereits bekannter Inhibitor wurde hinsichtlich seiner Affinität optimiert (Kapitel 4.4). Die
Struktur des so erhaltenen Inhibitors im Komplex mit humaner Aldose Reduktase konnte
aufgeklärt werden und dient als Grundlage für eine Design-Strategie zur weiteren Optimierung
des Inhibitors (Kapitel 4.5).
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die mikrokalorimetrische Untersuchung der
Ligandbindung (Kapitel 4.6). Anhand der gesammelten thermodynamischen Daten konnten
Rückschlüsse auf den Enzym- bzw. Ligandenbindungs-Mechanismus gezogen werden.
Diabetes mellitus 18
2 Diabetes mellitus
Diabetes mellitus ist eine chronische Stoffwechselerkrankung, bei der es durch unzureichende
Produktion des Hormons Insulin in den Langerhansschen Inseln (B-Zellen) der
Bauchspeicheldrüse oder durch mangelnde Insulinwirksamkeit zu einer Störung des
Kohlenhydrat-, aber auch des Fett- und Eiweißstoffwechsels kommt.
Die Häufigkeit des Diabetes mellitus hat in den Industrieländern in den letzten Jahrzehnten in
einem solchen Maß zugenommen, dass mittlerweile von einer Epidemie gesprochen werden
kann (Zimmet et al. 2001). Diabetes mellitus stellt eine der größten gesundheitlichen
Gefährdungen des 21. Jahrhunderts dar. Es wird erwartet, dass die weltweite Anzahl der
Patienten mit Diabetes mellitus von zur Zeit etwa 150 Millionen auf 220 Millionen im Jahr
2010 und auf etwa 300 Millionen im Jahr 2024 steigen wird (Amos et al. 1997; King et al.
1998). Die Zunahme steht in Zusammenhang mit der gestiegenen Lebenserwartung und den
veränderten Ernährungsgewohnheiten. Bei der Entstehung ist im Allgemeinen das
Zusammenwirken einer entsprechenden Erbanlage mit äußeren (exogenen) Einflüssen
(Infekte, Stress, hormonelle Einflüsse, Überernährung) Voraussetzung.
Der Diabetes mellitus wird von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) in zwei
Krankheitsformen unterteilt:
1. Typ-I-Diabetes
Insulinabhängiger Diabetes (IDDM, engl. insulin-dependent diabetes mellitus). An diesem juvenilen Typ, verursacht durch (absoluten) Insulinmangel, leiden 20 % der Diabetes mellitus-Patienten.
2. Typ-II-Diabetes
Insulinunabhängiger Diabetes (NIDDM, engl. non-insulin-dependent diabetes mellitus). An diesem adulten Diabetes, verursacht durch verminderte Insulinwirkung (relativer Insulinmangel), leiden 80 % der Diabetes mellitus-Patienten.
Gerade bei Jugendlichen ist in den kommenden Jahren eine Zunahme der Typ II
Erkrankungen zu erwarten.
Der Entstehung von Typ I liegt eine Schädigung der B-Zellen durch eine entzündliche
Reaktion des Inselgewebes (Insulitis) zugrunde, die zum absoluten Insulinmangel führt. Diese
Schädigung beruht auf einer Disposition des Immunsystems, bei der es zur Bildung von
Diabetes mellitus 19
Antikörpern gegen die B-Zellen kommt (Autoagression). Dabei können Virusinfektionen
auslösend sein.
Eine häufig beobachtete Vorstufe des manifestierten Typ-II-Diabetes, die durch das
gemeinsame Auftreten von Hyperinsulinismus, Hypertonie, Hyperlipoproteinämie und
Adipositas („tödliches Quartett“) charakterisiert ist, wird als metabolisches Syndrom oder
auch Syndrom X bezeichnet. Typ II weist anfangs vor allem bei Überernährung eine
Erhöhung des Blutzuckerspiegels bei zunächst hohem Insulinspiegel (Hyperinsulinämie)
durch gesteigerte Sekretion des Hormons auf. Bei überschießender Insulinabsonderung
nehmen die Insulinrezeptoren an der Zelloberfläche ab. Dieses führt, wie die durch
Überernährung verursachte Fettsucht (Adipositas), zu einer mangelnden Insulinwirkung auf
den Blutzucker (relativer Insulinmangel), die Erhöhung des Blutzuckerspiegels wird weiter
verstärkt. Die Entdeckung des Proteins Resistin, das von Fettzellen gebildet wird, erklärt
möglicherweise den Zusammenhang zwischen Adipositas und dem Auftreten der Insulin-
Resistenz (Steppan et al. 2001). Folge des weiter erhöhten Blutzuckerspiegels ist eine erneut
gesteigerte Insulinsekretion. Bei erblicher Veranlagung kommt es schließlich zu einer
Überforderung der B-Zellen und zum Diabetes mellitus mit absolutem Insulinmangel
(Sekundärversagen).
Die Behandlung wird bei Typ II durch Diät und orale Antidiabetika durchgeführt. Bei Typ I
und Typ II mit Sekundärversagen wird mit Insulin behandelt.
Die Auswirkungen des Diabetes mellitus können in kurzfristige und langfristige
Komplikationen unterteilt werden. Die langfristigen Komplikationen (Spätfolgen) werden in
Kap. 2.1 diskutiert.
Die biochemischen Auswirkungen des Diabetes mellitus sind im wesentlichen auf die
verminderte Insulinwirkung zurückzuführen. Bei absolutem oder relativem Insulinmangel ist
im Rahmen des Kohlenhydratstoffwechsels der Glukosetransport in die Gewebe gestört,
daraus resultiert ein Anstieg der Zuckerkonzentration im Blut (Hyperglykämie). Zugleich
kommt es zu einer Ausschüttung von Hormonen, die antagonistisch zum Insulin wirken und
somit zu vermehrter Glukosebildung führen (Gluconeogenese). Übersteigt die Glukose-
Konzentration einen bestimmten Schwellenwert, dann lässt sich Glukose im Harn nachweisen
(Glucosurie). Da Zucker nur in gelöster Form ausgeschieden werden kann, geht mit dem
Harn eine große Menge von Flüssigkeit und Mineralien verloren. Im Extremfall kann es zu
Austrocknungserscheinungen des Körpers kommen (Exsikkose). Blutzuckererhöhung und
Diabetes mellitus 20
vermehrte Flüssigkeitsausscheidung (Polyurie) verursachen verstärkten Durst (Polydipsie). Die
Verluste an Flüssigkeit, Salzen und Zucker rufen auch Kreislauf- und Muskelschwäche,
Gewichtsverlust und allgemeinen Leistungsabfall hervor. Obwohl viel Zucker im Blut kreist,
kann wegen Insulinmangel kein Zucker mehr in die Zellen eintreten. Muskeltätigkeit
begünstigt unabhängig von Insulin den Eintritt von Glukose in die Zellen, Fettgewebe
hingegen erfordert die Einwirkung von Insulin, woraus sich der größere Insulinbedarf bei
Fettleibigkeit erklärt.
Insulinmangel bewirkt auch eine Störung des Fettstoffwechsels. Es kommt zu einem
mangelhaften Abbau langkettiger Fettsäuren und damit zur überhöhten Entstehung
(Ketogenese) von Ketonen, die im Körper nicht weiter zerlegt werden können. Es kommt zur
Ketoacidose. Extreme Stoffwechselentgleisungen münden in das ketoacidotische diabetische
Koma.
2.1 Spätfolgen des Diabetes mellitus
Durch die Behandlung mit Insulin lässt sich der Blutzuckerspiegel bei Diabetikern einstellen,
wodurch sich deren Lebenserwartung und -qualität entscheidend verbessert. Dennoch erreicht
man durch die exogene Zufuhr von Insulin nicht die gleich präzise Regulation des
Blutglukosespiegels, wie es die Bauchspeicheldrüse leistet. Infolgedessen treten häufig trotz
gut überwachter Insulintherapie Spitzen im Blutzuckerspiegel auf, die eng mit der Entstehung
von Spätkomplikationen (diabetisches Spätsyndrom) verknüpft sind. Dazu gehören:
• Makroangiopathien: koronare Herzerkrankungen, Arteriosklerose (periphere arterielle
Verschlusskrankheiten)
• Mikroangiopathien: diabetische Retinopathie (nichtentzündliche. Netzhauterkrankung),
diabetische Nephropathie bzw. diabetische Glomerulosklerose (Schädigung der
glomerulären Kapillaren der Niere)
• Diabetische Neuropathie (Befall des peripheren, autonomen und zentralen
Nervensystems)
• Diabetische Enzephalopathie (nichtentzündliche Erkrankung des Gehirns)
• Diabetischer Katarakt (grauer Star)
Diese diabetischen Folgeerkrankungen vermindern die Lebensqualität und verkürzen die
Lebenserwartung der betroffenen Patienten. Das diabetische Spätsyndrom führt in
Diabetes mellitus Sorbitol-Stoffwechselweg 21
Deutschland zu gravierenden Folgen: ca. 17000 Beinamputationen pro Jahr, 2000
Neuerblindungen und etwa 20000 Dialysepatienten sind Diabetiker. Die mittlere
Lebenserwartung des Diabetikers, die im statistischen Mittel etwa 1/3 unter dem allgemeinen
Durchschnitt liegt, hängt entscheidend von den Spätschäden der Krankheit ab, da das
diabetische Koma heute nur noch bei etwa 1 % der Sterbefälle Todesursache ist.
Als wichtigste Ursache für die Entstehung der diabetischen Folgeerkrankungen wird die
Hyperglykämie angesehen. Es gibt mehrere Erklärungsansätze, die eine Verknüpfung
zwischen der Hyperglykämie und der Entstehung von Spätkomplikationen herstellen
(Brownlee 2001):
• Die Hyperglykämie bewirkt eine unspezifische Glykosylierung verschiedenster Proteine.
Dies führt zu Aktivitätsverlusten. Die nicht enzymatisch katalysierte Reaktion langlebiger
Proteine (Albumin, Kollagen, etc.) führt zur Bildung sog. AGEs (engl. advanced glycosylated
end products).
• Hyperglykämie führt zu verstärkter enzymatischer Umwandlung von Glukose zu Sorbitol.
Diese geschieht im Rahmen des Sorbitol-Stoffwechselweges, dessen erster Schritt von
Aldose Reduktase katalysiert wird (s. nächstes Kapitel).
• Hyperglykämie führt zu einer Aktivierung der Protein Kinase C.
• Hyperglykämie führt zu einem erhöhten Fluss durch den Hexosamin-Stoffwechselweg.
2.2 Sorbitol-Stoffwechselweg
Die unzureichende Insulinregulierung kann kurzfristig zu stark erhöhten Blutzuckerspiegeln
führen. Dadurch steigt die Glukosekonzentration in Zellen, deren Glukoseaufnahme
insulinunabhängig ist, auf unphysiologisch hohe Werte an. Unter diesen Bedingungen erreicht
der normalerweise beschrittene glykolytische Abbau, der mit der Hexokinasereaktion beginnt,
eine Sättigung und überschüssige Glukose tritt in den Sorbitol-Stoffwechselweg (in der
englischsprachigen Literatur meist als polyol pathway bezeichnet) ein. Dieser Pfad (s. Abbildung
4), auf dem Glukose in Fruktose umgewandelt wird, verläuft über die beiden Enzyme Aldose
Reduktase (AR) und Sorbitol Dehydrogenase (SDH) (Petrash et al. 1994). Diese Enzyme
katalysieren den Abbau von Glukose über Sorbitol als Zwischenprodukt zu Fruktose, wobei
der erste Schritt mit der Oxidation von NADPH zu NADP+, der zweite mit der Reduktion
von NAD+ zu NADH verknüpft ist.
Diabetes mellitus Sorbitol-Stoffwechselweg 22
OHH
CH
HOH
OHH
OHH
CH2
O
OH
O
CH2
HOH
OHH
OHH
CH2
OH
OH
OHH
CH2
HOH
OHH
OHH
CH2
OH
OH
Aldose Reduktase
NADPH, H+ NADP+
Sorbitol Dehydrogenase
NAD+ NADH
D-Glukose D-Sorbitol D-Fruktose
Abbildung 4. Reaktionen des Sorbitol-Stoffwechselweges. Glukose, Sorbitol und Fruktose sind in
der Fischer-Projektion dargestellt.
Eine erhöhte Glukosekonzentration führt zu einem vermehrten Fluss durch den Sorbitol-
Stoffwechselweg und damit zur verstärkten Bildung des stark polaren Abbauproduktes
Sorbitol. Dieses lässt sich nur schwer durch die Zellmembran transportieren und reichert sich
somit in den Zellen an, auch weil seine weitere Umsetzung zu Fruktose wesentlich langsamer
erfolgt als seine Neubildung. Akkumuliertes Sorbitol bedingt eine Wasseraufnahme in die
Zellen und damit einen erhöhten osmotischen Druck. Lange ging man davon aus, dass dies
die molekulare Ursache der klinisch beobachteteten diabetischen Spätschäden sei. Mittlerweile
weiß man, dass auch unter diabetischen Bedingungen keine intrazellulären Sorbitol-
Konzentrationen auftreten, die eine solche Annahme rechtfertigen. Heute nimmt man an, dass
der vermehrte Verbrauch von NADPH unter diabetischen Bedingungen dazu führt, dass
Enzyme (wie z.B. Glutathion-Reduktase), die für den Abbau von oxidativem Stress
verantwortlich sind, nicht mehr effizient arbeiten können (s. Abbildung 5). Die Enstehung
reaktiver Sauerstoff-Spezies (Superoxide) gilt dabei als Verknüpfungspunkt der verschiedenen
Mechanismen zur Entstehung von diabetischen Spätkomplikationen (Brownlee 2001).
Diabetes mellitus Sorbitol-Stoffwechselweg 23
Abbildung 5. Neben Glukose reduziert Aldose Reductase toxische Aldehyde, die aus reaktiven
Sauerstoff-Spezies (ROS) entstehen, zu inaktiven Alkoholen. Als Kofaktor dient NADPH. In Zellen
mit erhöhter AR-Aktivität wird die Konzentration von reduziertem Glutathion verringert, was zu
einem erhöhten oxidativen Stress führt. Entnommen aus (Brownlee 2001).
Schon früh wurde erkannt, dass über eine Regulation der Enzymaktivität der Aldose
Reduktase der schädigende Einfluss durch die vermehrte Entstehung von Sorbitol reduziert
werden kann. Daher wird Verbindungen, die die Funktion von Aldose Reduktase hemmen
können, ein Potential zur Prävention der Spätfolgen von Diabetes mellitus zugewiesen (Yabe-
Nishimura 1998). Sie stellen somit einen Therapieansatz dar, der unabhängig von der
insulinbeeinflussten Kontrolle des Blutzuckerspiegels ist.
Stand der Kenntnisse Aldose Reduktase 24
3 Stand der Kenntnisse
3.1 Aldose Reduktase
Das Enzym Aldose Reduktase (EC 1.1.1.21, AKR1B1, ALR2 oder AR) wurde zuerst 1960
von Hers beschrieben und ist seitdem sehr gut charakterisiert worden. Aldose Reduktase ist
ein cytoplasmisches, monomeres Enzym mit einem Molekulargewicht von ~35.900 D. Es ist
Mitglied der Aldo-Keto-Reduktase Familie und besitzt ein Triose-Phosphat-Isomerase
Strukturmotiv. Das Enzym verwendet bevorzugt NADPH als Hydrid-Donor zur Katalyse der
vorwärtsgerichteten Reaktion, bei der ein Aldehyd-Substrat zu dem entsprechenden Alkohol
reduziert wird. Aldose Reduktase vermag eine breite Palette von aromatischen und
aliphatischen Aldehyden einschließlich Glukose und Galaktose als Substrat umzusetzen. Das
natürliche Substrat der Aldose Reduktase ist bis heute unbekannt. Die breite
Substratpromiskuität der Aldose Reduktase hängt vermutlich mit der Anpassungsfähigkeit des
Enzyms (induced-fit) an verschiedene Substrate und Liganden (s. nächstes Kapitel) zusammen.
Das strukturelle und mechanistische Verständnis der Funktion und Inhibition der Aldose
Reduktase wurde durch die Aufklärung der Kristallstruktur im Jahre 1992 deutlich
vorangebracht. Es gelang zunächst die Struktur des Apoenzyms (aus Linsen des
Schweineauges) in Abwesenheit des Kofaktors NADPH in seiner „offenen“ Form zu
kristallisieren (Rondeau et al. 1992). Im gleichen Jahr wurde die Struktur des humanen
Holoenzyms mit gebundenem Kofaktor bekannt (Wilson et al. 1992).
Das Enzym besitzt eine α/β-TIM-barrel Faltung (s. Abbildung 6). Acht α-Helices (farbige
Bänder) umschließen einen Kern von acht parallel angeordneten β-Faltblättern (farbige
Pfeile). Der durch Pfeile symbolisierte Verlauf der β-Faltblätter zeigt vom N- zum C-
Terminus. Das aktive Zentrum befindet sich am C-Terminus und ist von drei Schleifen
begrenzt. Der Kofaktor NADPH bindet nahe dem C-Terminus, wobei der Nicotinamid-Teil
im Zentrum der fassartigen Struktur zu liegen kommt. Er begrenzt auf der einen Seite das
aktive Zentrum. Es schließt sich eine elliptische Bindetasche aus 7 aromatischen, 4 unpolaren
und 3 polaren Aminosäureresten an.
Stand der Kenntnisse Aldose Reduktase 25
Abbildung 6. TIM-barrel Struktur der Aldose Reduktase. Acht α-Helices (farbige Bänder) umgeben
einen Kern von β-Faltblättern (farbige Pfeile). Schleifen sind in Form von farbigen Kabeln
dargestellt. Der Kofaktor NADPH ist mit seiner Solvens-zugänglichen Oberfläche abgebildet. Diese
ist entsprechend der Atomtypen im Molekül koloriert.
Tabelle 1. Vorkommen der Aldose Reduktase in verschiedenen menschlichen Gewebearten
(Angaben entnommem aus (Oates 2002)).
Gewebeart Konzentration [µg/mg]
Inneres Nierenmark 29
Ichiasnerv 5
Linse 3
Hoden 2
Herz 2
Augen-Hornhaut 1
Leber, Nierenrinde, Magen,
Milz, Lunge, Darm 0,8-0,4
Stand der Kenntnisse Aldose Reduktase 26
Bei der Suche nach der physiologischen Aufgabe der Aldose Reduktase hilft die Betrachtung
der Verteilung von Aldose Reduktase auf verschiedene Gewebe (Tabelle 1) nur bedingt weiter.
Auffällig ist die hohe Konzentration der Aldose Reduktase im inneren Nierenmark. Hier trägt
die Aldose Reduktase durch Produktion von intrazellulärem Sorbitol zum Ausgleich von lokal
erhöhten osmotischen Drücken im Interstitium bei. Da die SDH in diesem Gewebe nur in
geringem Maße vorkommt, handelt es sich nicht um eine gemeinsame physiologische
Funktion der AR und der SDH als Sorbitol-Stoffwechsel-Enzyme.
Die natürliche Funktion des Sorbitol-Stoffwechselweges ist bis heute nicht abschließend
geklärt. Vermutet wird eine Funktion bei der „Feinabstimmung“ der cytosolischen
Osmolarität, um kleinere osmotische Veränderungen in der Zellumgebung auszugleichen.
Auch eine fundamentale Rolle als Schalter, der Glukose bei hohen Konzentrationen einer
anderen Verwendung als der Glycolyse zuführt, wird diskutiert. Eine besondere Rolle spielt
der Sorbitol-Stoffwechselweg in den Samenblasen. Da die Biosynthese der beiden Enzyme AR
und SDH dort unter der Kontrolle von Testosteron steht, erlaubt die Bestimmung der
Fruktosekonzentration in der Spermaflüssigkeit Rückschlüsse auf die Testosteronproduktion
der Hoden (Löffler et al. 2003).
Weitere mögliche Funktionen der Aldose Reduktase selbst sind der Steroid-Metabolismus und
die Entgiftung reaktiver Aldehyde oder deren glutathionilierter Derivate. Die Zuordnung
bleibt allerdings zweifelhaft, da die breite Substratspezifität der Aldose Reduktase mit der von
verwandten Enzymen, wie der Aldehyd Reduktase oder der Aldehyd Dehydrogenase,
überlappt.
Stand der Kenntnisse Kristallstrukturen 27
3.2 Kristallstrukturen
Vor kurzem konnte die Struktur der hAR im Komplex mit dem Inhibitor IDD594 aufgeklärt
werden. Für diesen Komplex konnten Kristalle erhalten werden, die bis zu Beugungswinkeln,
die einer Auflösung von 0,66 Å entsprechen, gestreut haben. Das ist die höchste Auflösung,
die bislang für einen Protein-Ligand-Komplex dieser Größe erreicht werden konnte. Diese
außergewöhnlich gute Auflösung gibt neue Einblicke in die Bindetasche des Enzyms. Da die
meisten Wasserstoffatome der Aminosäuren im aktiven Zentrum der Elektronendichte
zugeordnet werden konnten, war es möglich, exakte Informationen über den
Protonierungszustand des Inhibitors und des Proteins zu erhalten (Abbildung 7).
O
O
O
F
NS
F
Br
H
O
HN
N
H
O
H
N H
N+
-
hydrophobe TascheLeu300
Thr113
Trp111
His110
Tyr48
NADP+
IDD594
Abbildung 7. Schematische Darstellung des Bindungsmodus von IDD594 an hAR. Aus
Platzgründen ist nur ein Teil des Kofaktors NADP+ dargestellt.
Danach bindet der Inhibitor mit seiner deprotonierten Carboxylatgruppe in einer Weise an das
Protein, wie man sich den Bindungsmodus der zu reduzierenden Carbonylgruppe des
Substrats im katalytischen Zentrum vorstellt. Einer der Carboxylat-Sauerstoffe bildet mit
Tyr48 und Nε2 des neutralen His110 jeweils eine Wasserstoffbrücke, wobei der Carboxylat-
Kohlenstoff in Nachbarschaft zu C4 des Nicotinamids zu liegen kommt. Der andere
Carboxylat-Sauerstoff bildet eine Wasserstoffbrücke mit Nε1 von Trp111. Des Weiteren
Stand der Kenntnisse Kristallstrukturen 28
befindet sich dieser Sauerstoff in Wasserstoffbrücken-Distanz zum Stickstoff des IDD594,
was auf eine intramolekulare Wasserstoffbrücken-Bindung hinweist. Die drei für die Katalyse
wichtigen Reste Tyr48, His110 und Trp111 (Urzhumtsev et al. 1997; Wilson et al. 1993) bilden
zusammen mit NADP+ die polare „Anionen-Bindetasche“.
Der unpolare Teil des Inhibitors besetzt einen hydrophoben Teil der Bindetasche, der für die
Spezifität des Inhibitors maßgebend ist, wobei der 4-Brom-2-fluor-benzyl-Rest zwischen
Trp111 und Leu300 platziert wird.
Mittlerweile sind eine ganze Reihe von Strukturen der Aldose Reduktase im Komplex mit
verschiedenen Liganden bekannt (s. Tabelle 2). Neben Strukturbestimmungen am Apo- und
Holoenzym sind Komplexe der Aldose Reduktase mit Citrat, Cacodylat, Glukose-6-phosphat
in der PDB hinterlegt. Aus der Reihe der Inhibitoren von Carbonsäure-Typ konnten neben
IDD594 auch die Strukturen mit Tolrestat, Zopolrestat, Zenarestat, Alrestatin und IDD384
aufgeklärt werden. Aus der Reihe der Spirohydantoine wurden die Strukturen mit Sorbinil und
Fidarestat bestimmt. Diese Inhibitoren binden mit ihrer basischen Gruppe in den Bereich, der
bei den Inhibitoren vom Carbonsäure-Typ durch die Carboxylat-Gruppe besetzt wird.
Während die IDD594-Struktur gezeigt hat, dass Hemmstoffe vom Carbonsäuretyp
deprotoniert binden, ist für die Hydantoine der Protonierungs-/Tautomerie-Zustand in der
Enzymtasche nicht endgültig geklärt.
Die verschiedenen Komplexstrukturen verweisen auf konformative Änderungen in der
Bindetasche des Enzyms (induced-fit). Während alle Inhibitoren mit ihrem polaren Molekülteil
das aktive Zentrum (die Anionen-Bindetasche) belegen, führt die Bindung spezifischer
Inhibitoren zur Öffnung und geometrischen Adaption der Bindetasche auf den unpolaren Teil
der Inhibitoren. Sie binden mit ihrem unpolaren Molekülteil in eine im Holoenzym nicht
ausgebildete Spezifitätstasche, die durch Trp111, Thr113, Phe122, Ala299 und Leu300
abgegrenzt wird. Die essentielle Bedeutung von Trp111 und Thr113 für die Ligand-Bindung
wurde durch Mutagenese- und Modeling-Studien belegt. Da die Aminosäuren der
Spezifitätstasche nicht konserviert sind zwischen Aldose und Aldehyd Reduktase, sind sie ein
Schlüssel zur Entwicklung von Inhibitoren mit verminderten Nebenwirkungen. Überlagert
man die Komplexstrukturen, so wird deutlich, dass z.B. Sorbinil einen deutlich anderen
Bereich der Bindetasche belegt als Tolrestat oder IDD594 (s. Abbildung 8). Allerdings treten
auch für die beiden letzteren Inhibitoren Unterschiede im Bindungsmodus des unpolaren
aromatischen Molekülteils auf (s. Abbildung 9). Ein ausführlicher Vergleich der verschiedenen
Kristallstrukturen findet sich in Kapitel 4.1.
Stand der Kenntnisse Kristallstrukturen 29
Tabelle 2. Vergleich der Bindetaschen verschiedener AR-Kristallstrukturen mit dem IDD594-
Komplex als Referenz. Alle Messungen wurden nach der Überlagerung (least-squares fit) der Cα-
Atome der Aminosäuren in der Bindetasche auf die Referenzstruktur durchgeführt. Die fünfte
Spalte gibt die Anzahl der Mutationen innerhalb der Bindetasche bezogen auf das humane Enzym
an. Die sechste Spalte zeigt die rms-Abweichungen der Cα-Positionen der Aminosäuren in der
Bindetasche. In der siebten Spalte ist die Anzahl der Cα-Atome angegeben, deren Position um
mehr als ≥0.9 Å von der Referenz abweicht, während die darauffolgende Spalte die Anzahl der um
mehr als ≥1.0 Å verschobenen Seitenketten-Schwerpunkte enthält. Die Anzahl der
Überschneidungen zwischen den Atomen des Referenzliganden und den Atomen der überlagerten
Bindetaschen findet sich in der letzten Spalte. Als Überschneidung gilt ein Abstand, der kleiner als
die Summe der vdW-Radien ist.
PDB-
Code Aufl. Quelle Ligand
Anzahl
Mutat.
rmsd
[Å] Cα
Seiten-
ketten
Überschnei-
dungen
1ads 1.6 human* - (holo) - 0.7 3 4 9
1ef3 2.8 human * Fidarestat - 0.7 1 4 8
1el3 1.7 human * IDD384 - 0.6 1 3 8
1mar 1.8 human * Zopolrestat - 0.4 - *** ***
1iei 2.5 human * Zenarestat - 0.7 1 4 3
2acq 1.8 human * Glukose-6-P - 0.7 3 4 10
2acr 1.8 human * Cacodylat - 0.7 3 4 9
2acs 1.8 human * Citrat - 0.7 3 4 9
1dla 3.0 Schwein - (apo) 1 3.3 19 * *
1ah4 2.0 Schwein - (holo) 1 0.6 2 4 10
1ah0 2.3 Schwein Sorbinil 1 0.7 2 4 12
1ah3 2.3 Schwein Tolrestat 1 0.7 7 7 11
1eko 2.2 Schwein IDD384 1 0.7 4 5 11
1abn# 2.4 C298S** - (holo) 3 0.6 1 *** ***
2acu 1.8 Y48H** Citrat 1 0.7 3 4 10
1az1 1.8 C298A/
W219Y** Alrestatin
2 0.7 4 5 8
1az2 2.9 C298S/
W219Y** Citrat
2 0.7 3 4 8
* rekombinant, ** Mutanten, *** Nur Cα-Positionen in der PDB abgelegt, # Pro218 und
Trp219 fehlen in der Sequenz.
Stand der Kenntnisse Kristallstrukturen 30
Abbildung 8. Obere Reihe: Kristallstrukturen der Komplexe der Aldose Reduktase mit Sorbinil
(links, grün) und Tolrestat (rechts, cyan). Die Oberflächen wurden um den Komplex mit Sorbinil
(links, beige) und Tolrestat (rechts, blau) berechnet. Untere Reihe: Nach Überlagerung der beiden
Strukturen sind die Inhibitoren in der Bindetasche des Proteins mit der jeweils anderen
Konformation dargestellt. Die Bindetaschen in der Nachbarschaft um die Hydantoin- bzw.
Carboxylat-Gruppe nehmen weitgehend identische Form an, dagegen besitzen sie im Bereich der
hydrophoben Seitenketten, bedingt durch die induzierte Anpassung, völlig verschiedene
Passformen. Der größere Rest im Tolrestat stößt eine zusätzliche (Spezifitäts-)Tasche auf (oben
rechts), die im Falle von Sorbinil nicht in Erscheinung tritt.
Stand der Kenntnisse Kristallstrukturen 31
Abbildung 9. Obere Reihe: Kristallstrukturen der Komplexe der Aldose Reduktase mit Tolrestat
(links, cyan) und IDD594 (rechts, gelb). Die Oberflächen wurden um den Komplex mit Tolrestat
(links, blau) und IDD594 (rechts, gelb) berechnet. Untere Reihe: Nach Überlagerung der beiden
Strukturen sind die Inhibitoren in der Bindetasche des Proteins mit der jeweils anderen
Konformation dargestellt. Die Bindetaschen in der Nachbarschaft um die Carboxylat-Gruppen
besitzen weitgehend identische Form, dagegen ergeben sich für die Taschen im Bereich der
hydrophoben Seitenketten (Spezifitätstasche), bedingt durch die induzierte Anpassung, deutlich
unterschiedliche Passformen. Im Vergleich zum Tolrestat ist die Tasche um die 4-Brom-2-fluor-
benzyl-Gruppe des IDD594 tiefer, dafür fehlt eine Ausbuchtung, die durch die CF3-Gruppe am
Tolrestat bedingt wird.
Stand der Kenntnisse Inhibitoren der Aldose Reduktase 32
3.3 Inhibitoren der Aldose Reduktase
Mittlerweile ist eine ganze Reihe strukturell diverser Aldose Reduktase Inhibitoren (ARIs)
bekannt (Miyamoto 2002). Tabelle 3 gibt einen Überblick. Diese Verbindungen können in
zwei Substanzklassen unterteilt werden: (1) Zum einen die große Gruppe von
Hemmstoffen, denen allen eine Carbonsäure-Gruppe gemeinsam ist, (2) zum anderen
die Gruppe der zyklischen Imide, meist vertreten durch Spirohydantoine oder verwandte
Ringsysteme. Darüber hinaus sind noch Flavonoide wie das Quercetin-Derivat (15) und
Phenylsulfonylnitromethan-Derivate (16) als Hemmstoffe der Aldose Reduktase
bekannt.
3.3.1 Zyklische Imide
Seit der Entdeckung von Sorbinil (8) durch Pfizer im Jahre 1978 wurden weitere Inhibitoren
mit einer Spirohydantoin-Gruppe oder einem ähnlichem Gerüst entwickelt. Die Aktivität von
Sorbinil ist fast ausschließlich auf das C4-S-Enantiomer zurückzuführen, wie Struktur-
Wirkungsbeziehungen und eine theoretische Studie mit AS-3201 (9) zeigen konnten (Kurono
et al. 2001). Die Anwendung von Sorbinil scheiterte an hypersensiblen Reaktionen, verursacht
durch ein toxisches Zwischenprodukt, das beim Metabolismus von Sorbinil entsteht. Weitere
Vertreter dieser Strukturklasse befinden sich aber noch in klinischen Studien: Fidarestat (10)
befindet sich in Phase III (Japan) bzw. Phase II (USA), Minalrestat (11) befindet sich ebenfalls
in Phase III (USA).
Nicht nur Spirohydantoine sondern auch einfache Imide und deren Bioisostere inhibieren
Aldose Reduktase. Ein Beispiel für solche Bioisostere sind 2,4-Thiazolidindione (Glitazone)
wie z.B. Risarestat (12). Diese Verbindungen inhibieren nicht nur Aldose Reduktase, sondern
besitzen auch eine antihyperglykämische Wirkung, da sie auf PPAR γ (peroxisome proliferator-
activated receptor γ) wirken und die Empfindlichkeit gegenüber Insulin steigern (Oliver et al.
2001; Willson et al. 2001). Sie befinden sich als „Insulin-Sensitizer“ auch auf dem deutschen
Markt (Pioglitazon, Actos; Rosiglitazon, Avandia).
3.3.2 Carbonsäuren
Einige Aldehyd-Substrate (z.B. Glykoaldehyd) zeigen einen hemmenden Effekt auf Aldose
Reduktase. Durch Ersatz der Aldehyd-Funktion mit einer Carbonsäure-Gruppe gelangte man
zu potenten Inhibitoren, da diese Verbindungen nicht mehr von Aldose Reduktase reduziert
werden können. Als eine der ersten Verbindungen mit hemmender Wirkung war
Stand der Kenntnisse Inhibitoren der Aldose Reduktase 33
Tetramethylenglutarsäure (1) aufgefallen. Das schlechte Membran-Penetrationsverhalten
dieser Verbindung führte zur Entwicklung von Alrestatin (2). Obwohl seit 20 Jahren eine
Reihe von Verbindungen in klinischen Studien an Diabetes-Patienten getestet wurden, fehlt
bei den meisten Verbindungen immer noch der Beweis einer ausreichenden Wirksamkeit.
Tolrestat (3), untersucht seit 1989, wurde aufgrund fehlender in vivo-Wirkstärke 1996
zurückgezogen. Zu den später entwickelten Inhibitoren, die klinischen Studien unterzogen
wurden, gehören Ponalrestat (4), Zopolrestat (5) und Zenarestat (6). Zopolrestat wurde 1999
von klinischen Studien zur Behandlung von Neuropathien zurückgezogen, wird allerdings
immer noch zur Behandlung von Cardiomyopathien und Nephropathien getestet. Zenarestat
wurde 2001 aus Phase III der klinischen Studien aufgrund nicht akzeptabler toxischer
Nebenwirkungen zurückgezogen. Zur Zeit ist nur Epalrestat (7), das von Ono entwickelt und
1992 auf den japanischen Markt gebracht wurde, erhältlich. Epalrestat (7) leitet sich von
einem 2-Thioxo-4-thiazolidinon- oder Rhodanin-Gerüst ab.
Toxische Nebenwirkungen sind vermutlich auf Wechselwirkungen mit anderen Enzymen
zurückzuführen. Um dies zu vermeiden, bedarf es einer gesteigerten Spezifität der Inhibitoren.
Als Maß für die Spezifität von ARIs hat sich der Vergleich der Inhibitor-Affinitäten zu Aldose
Reduktase (ALR2) und zu dem verwandten Enzym Aldehyd Reduktase (ALR1), das ebenfalls
zur Familie der Aldo-Keto-Reduktasen gehört und 60% Sequenzidentität aufweist, etabliert.
Ebenfalls kritisch für den Erfolg eines Inhibitors ist sein pharmakokinetisches Verhalten.
Während Carbonsäuren und zyklische Imide vergleichbare in vitro Aktivitäten aufweisen,
zeigen Letztere in der Regel eine höhere in vivo Aktivität. Carbonsäuren liegen aufgrund ihrer
niedrigen pKA-Werte bei physiologischem pH deprotoniert vor, wodurch die Aufnahme über
biologische Membranen erschwert wird. Der stark hydrophobe Charakter der AR-
Spezifitätstasche spiegelt sich in den meist aus mehreren Aromaten aufgebauten
Grundgerüsten der bekannten Inhibitoren wider. Dies führt zumeist zu einer schlechteren
Wasserlöslichkeit, ein weiterer wichtiger Parameter, der für optimale ADME-Eigenschaften
der Inhibitoren angepasst werden muss. Vom Institute for Diabetes Discovery (IDD) stammen
Phenoxyessigsäure-Derivate wie IDD594. Diese Verbindungen zeigen neben einer
verbesserten Löslichkeit eine hohe Selektivität für Aldose Reduktase gegenüber Aldehyd
Reduktase. Ebenfalls von diesem Institut entwickelt wurde IDD384. Dieser Inhibitor
gehört zu den Benzoylaminophenylsulfonylglycinen, die als Bioisostere der bereits
erwähnten Phenylsulfonylnitromethane angesehen werden können.
Nachdem in den letzten Jahren einige Komplexstrukturen röntgenkristallographisch bestimmt
werden konnten (s. Kapitel 3.2), wurden vermehrt Methoden des Struktur basierenden
Stand der Kenntnisse Inhibitoren der Aldose Reduktase 34
Wirkstoffdesigns zur Identifizierung und Entwicklung weiterer Inhibitoren eingesetzt (s.
Kapitel 3.5).
Tabelle 3. Eine Auswahl bekannter Aldose Reduktase Inhibitoren. In den ersten Spalten sind der
Name der Verbindung und die Strukturformel angegeben. Die dritte Spalte listet die für die
jeweilige Verbindung bestimmten IC50-Werte auf, die vierte Spalte verweist auf die entsprechende
Literatur. Die letzte Spalte enthält (falls vorhanden) den PDB-Code der zugehörigen Kristallstruktur.
Nr. Trivialname Strukturformel IC50 [µM] PDB Literatur
1 -
OOH
OHO
- - (Kinoshita 1974)
2 Alrestatin O ON
COOH
15 1az1 (Dvornik et al.
1973)
3 Tolrestat
N SHOOC
CF3
O
0,03–0,1 1ah3 (Sestanj et al.
1984)
4 Ponalrestat
(ICI 128,436) NN
O
HOOC
F
Br
0,007-0,11 - (Stribling et al.
1985)
5 Zopolrestat
CF3
N
S
NN
O
HOOC
0,003-0,04 1mar (Mylari et al.
1991)
6 Zenarestat N
N
O
HOOC
ClOBr
F
0,04-0,06 1iei (Tanaka et al.
1993)
7 Epalrestat
(ONO-2235) SN
O
S
COOH
0,01-15 - (Terashima et al.
1984)
Stand der Kenntnisse Inhibitoren der Aldose Reduktase 35
8 Sorbinil NH
NH
O
O
O
F
0,15-3,5 1ah0 (Sarges et al.
1986)
9 AS-3201
NH
N
O
O
O
NO
F
Br
0,15 - (Negoro et al.
1998)
10 Fidarestat
(SNK860)
NH
NH
O
O
O
F
CONH2
0,009-0,02 1ef3 (Mizuno et al.
1992)
11 Minalrestat
NH
NH
N
O
O
F
O F
BrO
k.A. - (Malamas et al.
1994)
12 Risarestat
(CT112) S
NHO
OO
O
k.A. - (Sohda et al.
1982)
13 IDD594 FO
OH
O
NH
SF
Br
0,03 - (Van Zandt et
al. 1999)
14 IDD384 O
NH
SNH
OO
O
OHk.A.
1eko,
1el3
(Kompella et al.
1999)
15 - O
OHO
OH
2,5 - (Costantino et
al. 1999)
16 - OS
NH
SOO
N+
O
O
O
k.A: - k.A.
Stand der Kenntnisse Untersuchungen zum Mechanismus 36
3.4 Untersuchungen zum Mechanismus
Wie bereits erwähnt, katalysiert Aldose Reduktase die Reduktion einer Vielzahl von Aldehyd-
Substraten zu den entsprechenden Alkoholen. In der Reduktionsreaktion wird ein Hydridion
vom C4-Atom des Nicotinamid-Rings des Kofaktors NADPH auf den Carbonylkohlenstoff
des Substrataldehyds übertragen. Um die Reduktion zum Alkohol abzuschließen, muss
weiterhin ein Proton von einer der Aminosäuren im aktiven Zentrum auf das Substrat
übertragen werden. Die Frage, welche Aminosäure dabei als Protonendonor fungiert und in
welcher Reihenfolge Hydrid und Proton übertragen werden, wurde lange kontrovers
diskutiert.
Zur Klärung dieser Frage wurden neben kristallographischen Untersuchungen eine Reihe von
Mutanten hergestellt. Tabelle 4 gibt einen Überblick über diese Mutationsstudien und fasst die
Ergebnisse qualitativ zusammen. Kristallstrukturen mit der C298S- und der Y48H-Mutante,
sowie mit der C298A/W219Y-Doppelmutante, konnten aufgeklärt werden (s. Tabelle 2) und
zeigen, dass die Strukturen im Vergleich zum Wildtyp, über das gesamte Enzym betrachtet,
nahezu unverändert sind. Dies wird bestätigt durch Untersuchungen an anderen Mutanten
mittels Zirkular-Dichroismus (Bohren et al. 1994; Carper et al. 1995).
Seit der Bestimmung der 3-dimensionalen Struktur der Aldose Reduktase wurden einige
Molecular Modeling Studien durchgeführt, die Einblick in den Bindungsmodus der
Inhibitoren und deren Inhibitionsmechanismus geben. Eine Studie von Itzstein et al. (De
Winter et al. 1995) hat gezeigt, dass Tyr48, His110 und Trp111 Wasserstoffbrücken mit den
Substraten D-Xylose, L-Xylose und D-Lyxose ausbilden. Eine gute Korrelation zwischen
berechneten Enthalpien und experimentell bestimmten log(Km)- oder log(kcat/Km)- Werten
konnte nur erhalten werden, indem das Nε2-Atom des His110 protoniert und das Nδ1-Atom
dieses Histidins deprotoniert angenommen wurde. AMBER und DELPHI wurden zur
Berechnung von Bindungsenthalpien und Solvatationsenergien verwendet. Die
Substratbindung wurde auch von Kador et al. (Lee et al. 1998b) mit Hilfe einer Kombination
aus Quantenmechanik (QM) und Molekularmechanik (MM) untersucht. Dabei wurde
festgestellt, dass die Reduktion von D-Glyceraldehyd zu Glycerol bevorzugt mit His110 und
nicht mit Tyr48 als Protonendonor abläuft. Allerdings steht diese Aussage nicht im Einklang
mit einer Computer-Simulation, die von Warshel et al. (Varnai et al. 2000) durchgeführt
wurde. Diese Studie kommt zu der Schlussfolgerung, dass Tyr48 als Protondonor fungiert,
Stand der Kenntnisse Untersuchungen zum Mechanismus 37
während die neutrale His110-Seitengruppe wichtig für die Substratbindung während der
Katalyse ist.
In Bezug auf die Reduktion von Aldehyd-Substraten sind Inhibitoren vom Carbonsäure-Typ
nicht-kompetitiv, wie für den Inhibitor Alrestatin gezeigt werden konnte (Ehrig et al. 1994).
Obwohl dieser Befund nicht zwangsläufig die Bindung der Inhibitoren in das aktive Zentrum
des Enzyms ausschließt, führte er zu einer Diskussion über die Existenz einer zweiten,
separaten Bindestelle (Kador et al. 1995). Allerdings zeigen alle Kristallstrukturen (s. Kapitel
3.2), dass die ARIs vom Carbonsäure- und Hydantoin-Typ im aktiven Zentrum binden. Eine
separate Bindestelle konnte nie kristallographisch belegt werden. Zudem sind Carbonsäure-
Inhibitoren kompetitiv in Bezug auf die rückwärtsgerichtete Reaktion (Griffin et al. 1986;
Harrison et al. 1994; Liu et al. 1992), d.h. die Oxidation von Alkoholen zu dem
entsprechenden Aldehyd, die ebenfalls von Aldose Reduktase katalysiert wird. Um dieses
Verhalten zu erklären, wurde vorgeschlagen, dass geladene Inhibitoren (wie z.B. Carboxylate)
zwar genau wie die Substrate in das aktive Zentrum binden, allerdings erst nachdem der
katalytische Zyklus durchlaufen wurde (Ehrig, Bohren et al. 1994; Urzhumtsev, Tete-Favier et
al. 1997). D.h. sie binden bevorzugt an den AR⋅NADP+-Komplex, während Substrate an die
reduzierte AR⋅NADPH-Form binden. Dies konnte durch die in dieser Arbeit durchgeführten
ITC-Studien belegt werden (s. Kapitel 4.6.3). Diese Diskriminierung zwischen NADP+ und
NADPH ist konsistent mit der Annahme, dass His110 neutral vorliegt. Andererseits schlugen
Lee et al. (Lee et al. 1998a) vor, dass der negativ geladene Inhibitor ein positiv geladenes
His110 bevorzugen könnte, wodurch eine weitere Salzbrücke ausgebildet werden könnte. Wie
die hochaufgelöste IDD594-Struktur nahelegt, binden Hemmstoffe vom Carbonsäuretyp
deprotoniert und bilden Wasserstoffbrücken-Bindungen zu einem neutralen His110, Tyr48
und Trp111 aus. Die wesentliche elektrostatische Wechselwirkung findet also zwischen
Inhibitor und NADP+ statt. Dazu passt die Beobachtung, dass Alrestatin auch nach Mutation
von His110 zu einem neutralen Alanin immer noch an das Enzym bindet (Ehrig, Bohren et al.
1994). Die gleiche Studie hat gezeigt, dass Alrestatin nach Mutation von Tyr48 zu His nicht
mehr binden kann. Die Wasserstoffbrücke über den Sauerstoff des Tyr48 ist demnach im
Gegensatz zur Wasserstoffbrücke über Nε1 des His110 unverzichtbar für die Ligandbindung.
Wie die IDD594-Kristallstruktur zeigt, wird die Tyr48 OH-Gruppe durch das positiv geladene
Lys77 polarisiert, wodurch die Wasserstoffbrücke zusätzlich verstärkt wird. Mutation von
Lys77 zu einem ungeladenen Methionin führt zu einem starken Aktivitätsverlust des Enzyms
(Bohren, Grimshaw et al. 1994; Tarle et al. 1993).
Stand der Kenntnisse Untersuchungen zum Mechanismus 38
Tabelle 4. Übersicht der literaturbekannten Mutationsstudien mit qualitativer Zusammenfassung
der beobachteten Effekte. Literatur: (1) (Bohren et al. 1991), (2) (Tarle, Borhani et al. 1993), (3)
(Bohren, Grimshaw et al. 1994), (4) (Ehrig, Bohren et al. 1994), (5) (Carper, Hohmann et al. 1995),
(6) (Kubiseki et al. 1995) (7) (Singh et al. 2000) (8) (Petrash et al. 1992), (9) (El-Kabbani et al.
1999).
Mutation Enzym Literatur beobachteter Effekt
human 4 Verlust der Inhibition bei Alrestatin und Sorbinil
(keine Bindung). Bindung von Zopolrestat und
Zenarestat weniger stark abgeschwächt. Bindung
von Citrat (IC50=60mM) wird nicht beeinflusst.
Trp20Ala
human 7 Inhibition (durch Zopolrestat und Zenarestat)
stark abgeschwächt
Trp20Tyr human 7 Inhibition (durch Zopolrestat und Zenarestat)
kaum abgeschwächt
Asp43Asn human 2 KM und kcat kaum verändert
(DL-Glyceraldehyd, pH 7)
human 2 Enzym inaktiv
human 3 Enzym inaktiv
human 4 Enzym inaktiv
Tyr48Phe
Ratten-Linse 5 Enzym inaktiv
human 3 Spezifitätskonstante um Faktor 105 reduziert
(DL-Glyceraldehyd, pH 7)
Tyr48His
human 4 Verlust der Inhibition durch Alrestatin (keine
Bindung)
Tyr48Ser human 3 Spezifitätskonstante um Faktor 105 reduziert
(DL-Glyceraldehyd, pH 7)
human 2 spezifische Aktivität um Faktor ~103 reduziert Lys77Met
human 3 Enzym inaktiv
His110Asp human 2 KM steigt, kcat kaum verändert
(DL-Glyceraldehyd, pH 7)
His110Gln human 3 Spezifitätskonstante sinkt
(DL-Glyceraldehyd, pH 7)
Stand der Kenntnisse Untersuchungen zum Mechanismus 39
His110Gln Ratten-Linse 5 KM steigt um Faktor 200, kcat kaum verändert
(DL-Glyceraldehyd).
Verminderte Inhibition (Sorbinil, Tolrestat, u.a.)
human 3 Spezifitätskonstante sinkt
(DL-Glyceraldehyd, pH 7)
His110Ala
human 4 leicht abgeschwächte Alrestatin-Bindung
Trp111Ala human 7 Inhibition (durch Zopolrestat und Zenarestat)
stark abgeschwächt
Trp111Tyr human 7 Inhibition (durch Zopolrestat und Zenarestat)
kaum abgeschwächt
His187Gln Ratten-Linse 5 kein Einfluss auf Aktivität und Inhibition
His200Gln Ratten-Linse 5 kein Einfluss auf Aktivität und Inhibition
Tyr209Phe human 4 kein Einfluss auf die Alrestatin-Bindung
Pro216Ser human 9 Schwächung der Kofaktor-Bindung
Trp219Ala human 4 leicht abgeschwächte Alrestatin-Bindung
Lys262Met human 1 Aktivität unverändert
Arg268Met human 6 Aktivität unverändert
Cys298Ala human 4 kein Einfluss auf die Alrestatin-Bindung
Ratten-Linse 5 kein Einfluss auf die Inhibition (Sorbinil,
Tolrestat, u.a.)
Cys298Ser
human 8 Sorbinil bindet schwächer (Ki 10fach erhöht),
kein Einfluss auf Tolrestat-Bindung
Die erste quantenchemische Untersuchung des katalytischen Mechanismus, die die neuen
Erkenntnisse aus der hochaufgelösten IDD594-Struktur berücksichtigt, stammt von Cachau et
al. (Cachau et al. 2000). Die Autoren verwenden insbesondere die exakte Information über die
Orientierung und den Protonierungszustand des His111. Sie führen MD-Simulationen und
DFT-Rechnungen mit verschiedenen Modellen für Zwischenstufen der Substrat-Reduktion
durch, um mögliche Reaktionspfade einzugrenzen. Sie kommen zu der Schlussfolgerung, dass
weder His110 noch Tyr48 allein als Protondonor fungieren. Vielmehr ist die Übertragung des
Protons ein gemeinsamer Effekt der drei Aminosäuren Lys77, Tyr48 und His110. Das
geladene Lys77 polarisiert die Tyr48 OH-Gruppe. Diese überträgt dann ihr Proton auf
His110. Das nunmehr positiv geladene His110 schließlich überträgt ein Proton auf das
Stand der Kenntnisse Untersuchungen zum Mechanismus 40
Substrat. Tyr48 ist somit die Quelle der Protonen, während His110 als Protonenüberträger
fungiert.
Für die durch Aldose Reduktase katalysierte Aldehyd-Reduktion wird folgender Mechanismus
postuliert (Abbildung 10).
N
N
HI
δ-δ+
Asp43
_O
O
NADPH
Substrat
Lys77
Tyr48
N +H
H
H
OH
N
N
H
O
H
NH
H
II
δ+
δ-
δ-
δ+
OO_
Asp43NADPH
Substrat
Lys77
Tyr48His110+
NH
H
N
NH
H
O
H
NH
H
OH
N
NH
H
OH
HOH
N+
His110 Tyr48
Substrat
NADP+
Asp43
_O
O
III
Lys77
NH
H
N+
NADP+
IDD 594
_O
O
N
N
HO
H
N+H
H
H
His110 Tyr48
Lys77
IDD 594
OO_
Asp43
Abbildung 10. Postulierter Mechanismus der Aldose Reduktase katalysierten Reduktion von
Aldehyden zu den entsprechenden Alkoholen (entnommen aus (Cachau, Howard et al. 2000)). I) In
dem nativen AR·NADPH-Komplex bildet His110 (schwarz) eine Wasserstoffbrückenbindung mit
Tyr48 aus und ermöglicht somit dem Proton zwischen Lys77 und dem einfach protonierten
(neutralen) His110 zu wandern. II) Nach Diffusion des Substrates in das aktive Zentrum findet der
Hydrid-Transfer statt, wodurch ein reaktives Alkoholat gebildet wird. Dieses Alkoholat stabilisiert
das zweifach protonierte (positiv geladene) Histidin, welches auf die in der Kristallstruktur
beobachtete Position verschoben wird. Abschließend findet der Proton-Transfer statt. III) Nach
Abschluss der Reaktion ist die positive Ladung von Lys77 auf NADP+ übergegangen. IDD594) Die
beobachtete Struktur mit der geladenen Carboxylat-Gruppe des Inhibitors ahmt die
Wechselwirkung zwischen His110 und dem Alkoholat nach.
His110
Stand der Kenntnisse Struktur basierendes Wirkstoffdesign 41
3.5 Struktur basierendes Wirkstoffdesign
Costantino et al. (Costantino et al. 1996) berichten über Molecular Modeling und MD
Untersuchungen eines Pyridazinonessigsäure Inhibitors (IC50 = 6,4 µM), die auf spezifische
Wechselwirkungen des Inhibitors mit Aldose Reduktase hindeuten.
Eine MD Simulation von Aldose Reduktase im Komplex mit dem Inhibitor Tolrestat wurde
von Rastelli et al. (Rastelli et al. 1998a) durchgeführt. Eines der resultierenden Modelle des
Komplexes stimmte gut mit der experimentell beobachteten Kristallstruktur überein.
Basierend auf den Aktivitäten einiger bekannter Aldose Reduktase Inhibitoren und deren
Bindungsmoden, die in einer Docking-Studie vorhergesagt wurden, haben Kador et al. (Lee,
Chen et al. 1998a) ein Pharmakophor-Modell für Aldose Reduktase abgeleitet.
Zwei Gruppen haben FEP Studien mit AMBER durchgeführt. Rastelli et al. (Rastelli et al.
1998b) untersuchten eine Serie von methoxylierten Analoga des bereits zuvor untersuchten
Pyridazinon-essigsäure Inhibitors, um eine Erklärung für die beobachteten Unterschiede der
Affinitäten der betrachteten Inhibitoren zu finden. Die durch Punkt-Mutationen von
Aminosäuren des aktiven Zentrums verursachten Effekte wurden von Singh et al. (Singh,
Malamas et al. 2000) bewertet, um ein Modell für den Bindungsmodus des Inhibitors
Zopolrestat zu erhalten. Dieses Modell wurde anschließend zur Vorhersage der
Bindungsmoden anderer ARIs verwendet.
Basierend auf der bereits zuvor erwähnten Modeling Studie haben Rastelli et al. (Rastelli et al.
1997) ein neues Derivat mit einer 100fach gesteigerten Affinität entwickelt. Diese Verbindung
ist allerdings die simple Vereinigung des trizyklischen Pyridazinon-Gerüstes mit dem
Benzothiazol-Ring des Zopolrestat.
Von Wilson et al. (Wilson et al. 1997) stammt eine der ersten Studien, bei der ARIs durch eine
3D-Datenbanksuche entdeckt wurden. Unter den 30 Verbindungen, die von DOCK am besten
bewertet wurden, konnten einige aromatische Aldoxime mit Inhibitionskonstanten im
mikromolaren Bereich identifiziert werden, die allerdings den bereits bekannten
Benzaldoximen in Struktur und Affinität sehr ähnlich waren.
Ein erfolgreiches Beispiel für die Entdeckung neuartiger ARIs mit Hilfe einer
Datenbanksuche wurde von Iwata et al. (Iwata et al. 2001) veröffentlicht. Dabei konnten
sieben ARIs im mikromolaren Bereich mit einer Trefferquote von 20% identifiziert werden.
Dazu wurde das Programm ADAM&EVE verwendet, um Verbindungen aus der ACD-
Datenbank in die AR-Bindetasche, die der Komplexstruktur mit Glukose-6-Phosphat (PDB
code 2acq) entnommen wurde, einzupassen.
Stand der Kenntnisse Struktur basierendes Wirkstoffdesign 42
Rastelli et al. (Rastelli et al. 2002b) berichten von einer Datenbanksuche bei der neben den
bekannten Hemmstoffklassen auch Inhibitoren aus anderen chemischen Klassen, darunter
Sulfonsäuren, Sulfonamide und Verbindungen mit einer Carbonyl- oder Nitro-Gruppe,
gefunden wurden. Die Autoren verwendeten das Programm DOCK, um Moleküle aus der
NCI Datenbank in eine Bindetasche einzupassen, die einem zuvor Energie minimierten
Modell der Aldose Reduktase entnommen wurde. Ähnlich wie bei Iwata et al. wurde eine
Trefferquote von ~20% erreicht, ohne dass dem Docking andere Selektionsschritte zum
Filtern möglicher Kandidatenmoleküle vorgeschaltet wurden.
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 43
4 Ergebnisse und Diskussion
Teile dieser Arbeit wurden bereits zur Veröffentlichung eingereicht. Im folgenden werden die
erzielten Arbeitsergebnisse daher in einigen Kapiteln durch den englischen Originaltext der
Veröffentlichung beschrieben. Die erhaltenen Ergebnisse werden zunächst im jeweiligen
Kapitel diskutiert. Kapitel 5 fasst die Ergebnisse noch einmal zusammen und gibt einen
Ausblick.
4.1 Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen1
4.1.1 Introduction
Aldose Reductase (EC 1.1.1.21.) is an NADPH-dependent enzyme that catalyzes the
reduction of various aromatic and aliphatic aldehydes (primarily aldoses) to the corresponding
alcohols (Oates 2002; Yabe-Nishimura 1998). Physiologically, its role in the polyol pathway is
of prime importance, where aldose reductase is responsible for the reduction of glucose to
sorbitol. The processing of glucose through the polyol pathway is activated at elevated levels
of glucose, a common situation in patients suffering from diabetes mellitus. Since sorbitol
does not easily cross cell membranes and is only slowly converted to fructose via sorbitol
dehydrogenase, it accumulates in cells with insulin-independent glucose uptake, leading to an
increase in osmotic pressure and eventual cell damages. Furthermore, enhanced processing of
glucose through the polyol pathway results in depletion of the NADPH reservoir which
causes increased oxidative stress. A variety of diabetic complications has been attributed to
these biochemical phenomena caused by glucose processing through the polyol pathway.
Accordingly, aldose reductase has found considerable attention as a target for therapeutic
intervention to prevent disabling complications of diabetes, resulting in the development of a
large variety of inhibitors (Miyamoto 2002). So far, however, none of these has proven to be
clinically useful, except for the compound epalrestat currently marketed in Japan. This
underlines the need for continuing efforts to develop new aldose reductase inhibitors.
1 Das folgende Kapitel wurde zur Veröffentlichung eingereicht: Christoph A. Sotriffer, Oliver
Krämer, Gerhard Klebe, Ultra-high resolution drug design IV: Probing flexibility and
"induced-fit" phenomena in aldose reductase by comparative crystal structure analysis and
molecular dynamics simulations, Proteins: Structure, Function and Genetics.
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 44
One of the strategies to identify new ligands and to develop novel inhibitors is given by
structure-based design (Klebe 2000). In this approach, the three-dimensional structure of the
target enzyme is the key-component in the ligand-design and optimization process, which
proceeds by iterative application of computational and experimental techniques. In the case of
aldose reductase, a few studies following this strategy have already been pursued (Iwata,
Arisawa et al. 2001; Krämer et al. akzeptiert; Rastelli, Ferrari et al. 2002b). They are, however,
commonly hampered by the fact that aldose reductase shows pronounced induced-fit effects,
resulting in different binding-site conformations for different inhibitors. As a consequence,
predictions of binding modes, docking, and virtual screening are significantly complicated and
often faced with unexpected results upon experimental validation.
To support future structure-based design efforts, a more comprehensive knowledge about
accessible binding-site conformations seems mandatory, as it represents a prerequisite for the
application of some emerging new strategies for the consideration of multiple conformations
in the drug design process (Carlson 2002a; Carlson and McCammon 2000; Halperin, Ma et al.
2002). Information of this kind can - at least in part - be obtained by a careful comparison of
available crystal structures. Here, such an analysis has been carried out with the aid of
RELIBASE+ as a powerful data mining tool (Bergner et al. 2001; Gunther et al. 2003; Hendlich
1998; Hendlich et al. 2003). With respect to binding-site flexibility, the results are, however,
necessarily limited as long as no complete coverage of all representative conformations is
reached by the available experimental structures.
Accordingly, to further probe the binding site flexibility of aldose reductase, extensive
molecular dynamics (MD) simulations have been carried out and are reported here. MD
simulations have already been applied to aldose reductase by other research groups addressing
a variety of different aspects (Costantino, Rastelli et al. 1996; Lee et al. 2003; Rastelli and
Costantino 1998a; Rastelli, Ferrari et al. 2002b). Here, the main purpose is to conduct
thorough conformational sampling under the most realistic simulation conditions, i.e. applying
full explicit solvation, periodic boundary conditions, long-range electrostatics, no structural
restraints, and multi-nanosecond sampling times. Fueled by dramatic increases in computing
power and algorithmic improvements, MD simulations can nowadays be conducted under
these conditions and have as such proven to be a valuable tool for studying protein dynamics
(Karplus 2002; McCammon et al. 2002). The simulation studies presented here are based on
the crystal structure of aldose reductase in complex with IDD594, one of the most potent
inhibitors known to date (Van Zandt, Sibley et al. 1999). This structure has been solved to a
resolution of 0.66 Å (Howard et al. submitted), providing unprecedented quality and detail,
including information about hydrogen atom positions and thus protonation states. Using such
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 45
an ultra-high resolution structure as starting point comes as a significant advantage for MD
simulations, not only because of the higher structural quality, but also because fewer
assumptions must be made upon setup of the system for the simulation (e.g., histidine
protonation states).
4.1.2 Materials and Methods
Comparisons of binding sites in aldose reductase crystal structures were carried out with
RELIBASE+ (Bergner, Gunther et al. 2001; Gunther, Bergner et al. 2003; Hendlich 1998;
Hendlich, Bergner et al. 2003). The IDD594 complex structure (i.e., the starting point of the
MD simulations) was incorporated into an in-house version of the RELIBASE+ database for
comparison with publicly available aldose reductase structures. Using the IDD594 complex as
reference, all structures with a sequence identity of ≥85% and a resolution of at least 2.5 Å
were retrieved from the database. For two of the 14 structures obtained this way only the Cα
coordinates are deposited in the PDB, thus leaving 12 structures for complete comparison (cf.
Table 1). Eight of these structures are from human aldose reductase (with two mutants: the
Cys298Ala/Trp219Tyr double mutant 1az1, and the Tyr48His mutant 2acu), the other four
(1ah0, 1ah3, 1ah4, 1eko) are from the porcine enzyme. The overall sequence identity between
human and porcine aldose reductase is 86.3%; close to the binding region the differences in
sequence are limited to the substitutions of Phe121 by Pro and of Leu301 by Met in the
porcine protein. Superposition of all 12 structures with the IDD594 complex structure was
carried out using only residues of the binding site which are within 6 Å of the ligand in the
reference structure. Details on the comparative measurements are given in the legend to Table
1.
All MD simulations described herein are based on the ultra-high resolution crystal structure of
human aldose reductase complexed with the cofactor NADP+ and the inhibitor IDD594 (cf.
Figure 1). Three different simulations were setup. In a first simulation, the native complexed
state with both cofactor and inhibitor present was used as starting point ("native" simulation,
serving as reference and denoted as "lig_300K"). The second simulation was started from the
same structure, but the inhibitor was removed ("perturbed" simulation, denoted as
"no_lig_300K"). The third simulation, finally, used the same inhibitor-devoid starting point as
the second, but was carried out at a higher temperature ("perturbed high-temperature"
simulation, denoted as "no_lig_350K"). Besides these differences, the setup and simulation
protocol was identical in all three cases.
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 46
NH
S
O F
F
Br
O
O
Figure 1. a) The cofactor (NADP+; displayed as surface model color-coded by atom type) and the
ligand (IDD594; displayed as surface model colored in yellow) are deeply buried within the compact
globular fold of aldose reductase. b) Structural formula of ligand IDD594. The crystal structure of
the complex shows that the compound binds with a deprotonated carboxylate to aldose reductase.
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 47
All preparing steps and simulations were carried out with the AMBER 6.0 suite of programs
(Case et al. 1999), using the Cornell et al. force field (Cornell et al. 1995) in the variant of the
parm99 parameter set (Wang et al. 2000). Missing force field parameters for the ligand
IDD594 were derived from experimental data and by comparison with existing parameters.
The same applies to the cofactor NADP+, where parameters generously provided by Giulio
Rastelli (University of Modena, Italy) were available for comparison. Atomic charges for both
ligands were calculated by fitting to the HF/6-31G* electrostatic potential using the
conformation observed in the crystal structure. The corresponding ab initio calculations were
performed with GAUSSIAN98 (Frisch et al. 1998), the restrained electrostatic potential fit with
the RESP program (Bayly et al. 1993; Cornell et al. 1993). Hydrogen atoms were used as
assigned by the crystallographers, whereby, due to the high resolution, 54% of all possible
hydrogen atoms in the protein were experimentally observed (77% of the hydrogens in the
binding site). The simulated protein system thus consisted of 316 amino acids or 5071 atoms,
plus the cofactor with 73 atoms and the ligand with 35 atoms.
In all three cases, the starting structure (i.e, the inhibitor complex in the native simulation and
the corresponding structure without inhibitor in the perturbed simulations) was subjected to a
short initial energy minimization in vacuo using 20 steps of steepest descent followed by 180
steps conjugate gradient minimization. After addition of counterions to ensure neutrality, the
systems were solvated in a box of TIP3P water molecules (Jorgensen et al. 1983), which
resulted in box sizes of ~81 Å × 66 Å × 77 Å and a total of ~9100 water molecules.
Subsequently, 20 steps steepest descent and 180 steps conjugate gradient minimization were
applied to water molecules and counterions of the solvated system. The MD simulation was
then started by heating the solvent to 300K over a period of 20 ps and cooling to 100 K over
a period of 5 ps, keeping the protein (and ligands) fixed. After this, the entire system was
gradually brought to 300 K (350 K in case of the high-temperature perturbed simulation) over
a period of 25 ps. The simulation was then carried on under NPT and periodic boundary
conditions for 3050 ps.
The temperature was kept constant by coupling to a heat bath through the Berendsen
algorithm (Berendsen et al. 1984). Pressure was adjusted by isotropic position scaling using a
Berendsen-like algorithm. Covalent bonds to hydrogens atoms were constrained by the
SHAKE algorithm (Ryckaert et al. 1977) and a time step of 2 fs was used. A cutoff of 9 Å was
applied to the van der Waals interactions, while the electrostatics were treated by the Particle
Mesh Ewald method (Darden et al. 1993). The simulation was carried out with the SANDER
MD module of AMBER 6.0.
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 48
For analysis, energy data were saved every 10 time steps, solute coordinates every 0.5 ps and
solvent coordinates every 2 ps. All results presented below refer to the 3.0 ns trajectories
which exclude the first 100 ps required for temperature adjustment and equilibration (an
equilibrated state with respect to the total potential energy in the system was reached by all
three simulations within approximately 100 ps). Analyses were carried out primarily with
programs of the AMBER 7.0 release (Case et al. 2002), while VMD (Humphrey et al. 1996) and
PYMOL (DeLano 2002) were used for various visualization purposes.
4.1.3 Results and Discussion
Comparative binding-site analysis of aldose reductase crystal structures. Although it is
already known that ligand complexation can lead to significant conformational changes in the
binding site of aldose reductase (Urzhumtsev, Tete-Favier et al. 1997), the crystal structures
available to date do not yet appear to represent all conformations that might potentially be
adopted upon ligand binding, considering that structure determination of complexes with new
inhibitors can still result in surprising binding modes. In part, this applies also to the complex
with IDD594: as the following comparison with publicly available crystal structures will show,
none of the other structures is fully compatible with the binding mode observed for the
IDD594 ligand.
As mentioned in Materials and Methods, 12 aldose reductase structures are available for
comparison. Superimposing their binding sites with the IDD594 complex using RELIBASE+
leads to Cα-rmsd values of 0.6 to 0.7 Å (Table 1) (for details about superposition and rmsd
calculation in RELIBASE+ cf. (Hendlich, Bergner et al. 2003)). However, despite this good
overall fit of the binding regions, the ligand (IDD594) would clash with each of the
superimposed binding sites (a clash being a distance shorter than the sum of the van der Waals
radii of the corresponding atoms). As shown in column 8 of Table 1, with exception of the
zenarestat-bound structure (1iei) at least 8 clashes are observed in all cases. Most frequently
these overlaps or short contacts are observed with Leu 300, while the residues Trp20, His110,
Trp111, Thr113, and Phe122 are involved to a minor extent. In case of 1iei, only a few short
contacts arise with Trp111 and Phe122, and none with Leu300. With respect to the IDD594
binding mode, this structure would, therefore, be the most "compatible". Nevertheless, as
discussed further below, a series of other structural differences is observed in the 1iei binding
site compared to the IDD594 complex structure.
Table 1. Comparison of the binding sites of aldose reductase crystal structures with the IDD594 complex (the starting structure of the MD simulations) as
reference. Measurements were carried out after least-squares superposition of the binding site residues onto the reference structure. The PDB code of the
structure is given in column 1, mutations of binding-site residues are reported in column 2, the name of the bound ligand is shown in the third column. Column 4
reports the Cα-rmsd of the binding site residues. In column 5, the number of Cα-atoms moved by ≥0.9 Å with respect to the reference is given, whereas column 6
reports the number of side-chain centers shifted by ≥1.0 Å . Column 7 lists the number of side-chain torsions differing by at least 10°. The number of clashes of
the reference ligand with the superimposed binding site is given in column 8. Finally, the last column shows the percentage of volume overlap of the reference
ligand with the ligand of the superimposed complex.
PDB mutations ligand rmsd [Å] ∆ Cα ∆ side chain ∆ torsion clashes ligand overlap
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) 1ads - - 0.7 3 4 9 9 n.a.
1ah0 1 sorbinil 0.7 2 4 14 12 63%
1ah3 1 tolrestat 0.7 7 7 16 11 65%
1ah4 1 - 0.6 2 4 16 10 n.a.
1az1 2 alrestatin 0.7 4 5 10 8 30%
1eko 1 IDD384 0.7 4 5 22 11 53%
1el3 - IDD384 0.6 1 3 9 8 56%
1iei - zenarestat 0.7 1 4 30 3 100%
2acq - glucose-6-P 0.7 3 4 10 10 43%
2acr - cacodylate 0.7 3 4 8 9 14%
2acs - citrate 0.7 3 4 9 9 42%
2acu 1 citrate 0.7 3 4 13 10 41%
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 50
As displayed in Table 1, all structures show some backbone (Cα-atom) and side-chain
movements with respect to the IDD594 complex structure, but the extent to which these
differences occur varies. From one (1el3, 1iei) to seven (1ah3) residues have their Cα-atom
displaced by at least 0.9 Å, and between three (1el3) and seven (1ah3) side-chain centers move
by 1.0 Å or more. Differences in side-chain torsion angles of more than 10° are abundant as
well (it has to be noted, that 10° is often the accuracy limit of protein crystal structure
determinations); in some cases, though, the net effect of these differences on the orientation
of the corresponding side chain is compensated by changes of opposite direction in
immediately adjacent torsions.
Residues involved in these variations are noted in Table 2, Table 3, and Table 4. Backbone
shifts are most commonly observed for Ala299 and Leu300, but also for Val130 (the latter is
already quite distant from the immediate binding site, with all but one contacts to IDD594
being larger than 7 Å; in addition, the only variation of Val130 within the data set is observed
in the IDD594 complex, where the backbone is shifted and the χ1-angle is changed by ~120°
such that one methyl group points into a different direction; in the remainder, Val130 is thus
not further discussed). The Phe122 and Trp219 Cα-positions are also subject to frequent
variations, though generally in a distance range of only 0.5 to 0.8 Å. Occasional Cα-shifts are
also observed for Phe121, Pro218, and Val297.
As far as the side chains are concerned (Table 3), the largest center-to-center distances with
respect to the superimposed reference are shown by Leu300. Equally frequent, but smaller are
the differences observed for Tyr309. Also Val297 and Cys303 are often shifted to other
conformations, whereas differences of Phe115, Phe122, and Ala299 are less frequent. Center-
to-center distances, however, are not sufficient to characterize conformational differences, and
thus Table 4 shows the torsional variations occurring in four frequently varying side chains.
Leu300, but also Cys298 exhibit an impressive variability in their side chain torsion angles.
The torsions of Phe122 and Cys303, instead, seem essentially to be confined to 2 or 3 distinct
states.
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 51
Table 2. Movements of Cα-atoms in the binding site of various aldose reductase crystal structures,
measured with respect to the superimposed reference structure (IDD594 complex). Only values
≥0.9 Å are explicitly reported.
PDB Phe121 Phe122 Val130 Pro218 Trp219 Val297 Ala299 Leu300
1ads 1.1 0.9 2.3
1ah0 1.0 1.9
1ah3 0.9 1.1 1.1 0.9 0.9 1.4 1.1
1ah4 0.9 1.8
1az1 1.2 1.9 1.1 2.1
1eko 1.1 1.0 1.0 1.7
1el3 2.1
1iei 1.2
2acq 1.2 0.9 2.2
2acr 1.2 1.0 2.2
2acs 1.2 0.9 2.2
2acu 1.1 0.9 2.3
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 52
Table 3. Movements of side-chain centers in the binding site of various aldose reductase crystal
structures, measured with respect to the superimposed reference structure (IDD594 complex).
Only values ≥1.0 Å are explicitly reported.
PDB Phe115 Phe122 Val130 Val297 Ala299 Leu300 Cys303 Tyr309
1ads 1.6 4.3 1.0 1.2
1ah0 1.8 1.2 3.8 1.1
1ah3 2.1 2.0 1.3 1.2 3.1 1.4 1.0
1ah4 1.7 1.0 3.7 1.2
1az1 1.2 1.5 4.1 1.2 1.4
1eko 1.0 1.9 1.7 3.4 1.3
1el3 1.1 4.0 1.2
1iei 2.3 1.6 1.2 1.6
2acq 1.7 4.2 1.0 1.3
2acr 1.6 4.3 1.1 1.2
2acs 1.6 4.3 1.1 1.2
2acu 1.7 4.4 1.0 1.3
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 53
Table 4. Side-chain torsion angles of Phe122, Cys298, Leu300, and Cys303 in different aldose
reductase crystal structures. Only values differing by at least 10° from the reference (IDD594
complex, line 1) are given in the table. Differences of more than 20° are highlighted in bold.
PDB Phe122 χ1 Phe122 χ2 Cys298 χ1 Leu300 χ1 Leu300 χ2 Cys303 χ1
IDD594 169.4 87.4 87.6 61.2 60.0 166.7
1ads 167.2 109.9 -135.8
1ah0 179.4 -171.7 75.1 81.4 -174.8
1ah3 -175.6 -77.6 172.5 154.6 -30.8 73.3
1ah4 155.9 75.9 72.3 -174.6
1az1 129.3 107.5 -130.0
1eko -79.6 102.2 87.0 71.7
1el3 -88.9 170.3 114.3 -133.5 -174.2
1iei 139.3 72.1 158.0
2acq 169.6 106.1 -140.6
2acr 177.6 108.2 -137.1
2acs 142.5 106.9 -135.8
2acu 77.1 178.0 82.0 76.9
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 54
OHNH
N
OH
N
OO
N
O N
SH
O
N
N
NHN
+
NH2
O
SH
OH
NH
NH
NH
Val297
Thr113
Trp111
His110 Tyr48
NADP+
Trp20
Val47Trp79
Phe122
Phe115
Tyr309Trp219
Cys303
anion-bindingpocketspecificity
Leu300
Ala299
Cys298
Figure 2. Schematic drawing of the aldose reductase binding pocket. The color-code refers to the
degree of flexibility as derived from the MD simulations and the comparative X-ray structure
analysis, with red for the most flexible regions and blue for the least mobile area.
Taken together, these comparisons provide a view of the binding site as composed half of an
invariant part and half of a flexible part (Figure 2). The part which is superimposable very well
for all structures and where differences are only rarely seen, is mainly formed by the pocket
with the catalytic residues (anion-binding pocket) and its surrounding. This means that the arc
going from Trp20 over Tyr48, Val47, and His110 to Trp79 is very well conserved; this
includes also the entire cofactor (NADP+) which is almost perfectly superimposable in all
cases. Also the adjacent Trp111, which forms an important π-stacking-border of the binding
site, belongs still to the fairly invariant section, and minor shifts of this side chain are only
observed in some of the crystal structures.
In contrast, in the other half of the binding site, frequent and recurring changes are found.
Most affected is the segment from Val297 to Leu300 and the neighbouring regions occupied
by Trp219 on the one hand and Cys303 and Tyr309 on the other. To a minor extent,
significant variability is also shown by the area formed by Thr113, Phe121, and Phe122. By all
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 55
accounts, Leu300 is the most variable residue which essentially determines the appearance of
the binding pocket and the accessible binding modes (cf. below). This is reflected also by the
Cα-movements and the center-of-side-chain movements: for both parameters, the largest and
most frequent differences are observed for Leu300 (cf. Table 2). It is, in fact, primarily the
Leu300 neighborhood which mediates potential induced-fits, whereas the cofactor
neighborhood with the catalytic residues provides a stable region for tight anchoring of
essential functional groups.
Visual analysis of the superimposed binding sites reveals that the available crystal structures
represent essentially four distinct binding site conformations (cf. Figure 3): besides the
"IDD594"-conformation, this is the holo-conformation, the "tolrestat"-conformation, and the
"zenarestat"-conformation. Most frequently is the holo-conformation as represented by the
structure 1ads found in the set of analyzed crystal structures. A total of ten crystal structures
can be assigned to this group (1ads, 1ah0, 1ah4, 1az1, 1eko, 1el3, 2acq, 2acr, 2acs, 2acu).
Compared to the IDD594-conformation, this holo-conformation is characterized by an
entirely different orientation of Leu300: the backbone is shifted by more than 2 Å towards the
specificity pocket and the side chain is pointing into the pocket, towards Trp111. The
backbone shift obviously also affects the immediately adjacent residues; this is of relevance
primarily for Ala299, which delineates the binding pocket, whereas residue 301 (Leu in the
human enzyme, but Met in porcine aldose reductase) is not really part of the binding site. The
backbone is actually not only shifted, but also adopting a completely different conformation:
compared to the IDD594 structure, both the Ala299 carbonyl and the Leu300 NH are
pointing into opposite directions. Spatially neighboring residues are affected by these
"changes": on the C-terminal side, Cys303 and especially Tyr309 are pushed away from the
binding site (their position in the IDD594 structure would not be compatible with the holo-
conformation of the Ala299 and Leu300 backbone); on the N-terminal side, the Cys298 side
chain is pointing into another direction (χ1-difference of 80°), and Trp219 is slightly shifted in
position.
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 56
Phe122
Phe115
Tyr48
Trp20
NADP+
His110
Trp111Thr113
Trp219
Cys298
Tyr309
Leu300
Ala299Cys298
NADP+
Figure 3. Comparison of five different binding site conformations from crystal structures. For clarity,
the binding site representation is split into a top and a bottom part. The "IDD594"-conformation is
shown in gray, the holo-conformation from 1ads in green, the holo-conformation from 1ah4 in
yellow, the "tolrestat"-conformation (1ah3) in cyan, and the "zenarestat"-conformation (1iei) in pink.
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 57
A subgroup with minor differences to this standard holo-conformation is formed by 1ah0,
1ah4, and 1eko, which - in contrast to the other structures - are from porcine aldose reductase.
Here, besides the differences mentioned above, a moderate shift of Phe122 is observed, which
could be a consequence of the Phe121Pro mutation in the porcine protein. In addition,
however, the Leu300 side chain adopts a different conformation, characterized by an almost
180°-flip of the χ2-angle. The conformation of the side chain is thus more similar to IDD594,
but since the backbone differences still apply, the Leu300 side chain occupies the binding
pocket also in the porcine structures, showing extensive volume overlap with the Leu300
orientation in the human holo-structures. Further differences in this subgroup with respect to
the human holo-conformation are (very) small shifts of the Val297, Cys298, and Cys303 side
chains.
The holo-conformation is also maintained in complexes with various ligands: sorbinil (1ah0),
alrestatin (1az1), IDD384 (1eko, 1el3), as well as glucose-6-phosphate (2acq), cacodylate
(2acr), and citrate (2acs) all bind to this conformation and do not induce significant alterations.
Due to the position of Leu300, the specificity pocket between Leu300, Trp111, and Thr113 is
not accessible, and all these ligands bind only in the "upper" part of the pocket which is closer
to the catalytic site. Spatial overlap of the ligands with the IDD594 inhibitor is thus only
observed with respect to its (5-fluoro-2-thiocarbamoyl-phenoxy)-acetic acid moiety. Given the
smaller size of the pocket in this holo-conformation, larger ligands even have part of their
structure rather exposed and not in tight contact with the protein; this is the case for IDD384
and alrestatin. In the crystal structure of the latter complex, two copies of the ligand are
observed to bind, stacking onto each other and thus, apparently, compensating some of the
lacking protein contacts.
A very different binding-site conformation is given by the tolrestat complex (1ah3). Here, the
Leu300 side chain is also pointing into the pocket, but not so much towards Trp111, rather
somewhat "lower", on top of the Ala299 backbone. This enables tolrestat to adopt a binding
mode contacting Thr113, but with the aromatic ring plane situated above the Leu300 side
chain (between Leu300 and Phe122) and perpendicular to the Trp111 plane, not parallel as in
the IDD594 or the zenarestat complex! If superimposed onto the IDD594 complex structure,
the carboxylate side chains of both ligands in the anion-binding pocket overlap very well;
besides that, however, tolrestat would clash with Leu300, but also with Phe122 and Cys303.
Accordingly, also the side chains of Phe122, Cys303, and Tyr309 are all shifted to open up a
wider space. The backbone conformation of Ala299 and Leu300 is similar to the one observed
in the holo-structures (e.g., 1ah4), but shifted a bit outwards from the pocket, such that the
volume overlap with the IDD594 complex structure is somewhat increased.
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 58
A further distinct variant of binding-site conformations is given by the zenarestat complex 1iei
(since this structure has been solved at the comparatively low resolution of 2.5 Å, it can not be
exlcuded that some of the differences might also be attributed to the limited accuracy of this
structure determination). Although the binding modes of zenarestat and IDD594 are fairly
similar (a short contact of zenarestat with the superimposed IDD594 protein structure would
arise only with the Cys298 side chain; for short contacts of IDD594 with the 1iei structure cf.
above), there are many differences in the binding-site conformations of these two complexes.
Four side chains centers (Phe115, Val 297, Ala 299, and Tyr 309) are moved by more than 1 Å
and 30 side-chain torsion angles differ by more than 10°. The Cys298 side chain is in the same
conformation as in the holo-structures, but the backbone carbonyl is pointing upwards instead
of down towards the protein interior (the only example where this backbone conformation is
observed). Consequently, also the following polar backbone groups are "switched" in their
orientation, and the backbone as a whole is somewhat shifted. The Leu300 carbonyl is then
again oriented the same way as in the IDD594 structure, though a shift is still present. The
Leu300 side chain adopts a different χ2-conformation, such that only one methyl group (the
one directed towards the binding pocket) overlaps in the two structures, whereas the others
point in opposite directions. Around Thr113, the following differences are observed: despite a
very similar ligand moiety binding here (Br-subsituted aromatic ring), Thr113 itself is shifted
and the side chain is in a different conformation, such that the oxygen is pointing
"downwards" and adopting the position where the methyl group resides in the IDD594
structure. The Phe115 phenyl ring is shifted upwards, but kept in the same plane. Finally, also
the side chains of the two other phenylalanines, Phe121 and Phe122, are found in slightly
different positions.
Taken together, the available crystal structures suggest that induced-fit phenomena in aldose
reductase are mainly mediated by Leu300, the side chain of which is responsible for opening
or closing hydrophobic subpockets in the binding site. In addition, the Cys298-Leu300
backbone plays an important role by alternatively exposing hydrogen bond donor or acceptor
functionalities towards the binding site. Additional adaptations are mediated by Cys303,
Tyr309, Thr113, as well as by the aromatic rings of Phe115 and Phe122.
Molecular dynamics simulations. What do MD simulations reveal about dynamics and
conformational flexibility of the aldose reductase structure in general and its binding site in
particular? To probe binding site flexibility in a more comprehensive way, three different
simulations were setup based on the IDD594 complex structure: the aldose reductase
structure with ligand at standard temperature (simulation "lig_300K"), without ligand at
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 59
standard temperature (simulation "no_lig_300K"), and without ligand at elevated temperature
(simulation "no_lig_350K"), as described in more detail in the Methods section. The cofactor
was included in all three cases.
Figure 4. Comparison of the Cα-rms deviations for all three trajectories.
Generally speaking, all three simulations show a comparatively high stability of the overall
fold. The trajectory average of the Cα-atom rms deviation from the X-ray structure used as
starting point is only 1.04 ± 0.11 Å for simulation lig_300K, of equal size (1.04 ± 0.10 Å) for
the uncomplexed simulation at standard temperature, and somewhat higher - but still at a
surprisingly low level - for the high-temperature simulation (1.20 ± 0.10 Å) (cf. Figure 4). This
is a clear reflection of the fact that aldose reductase is an enzyme with a compact globular fold.
Remarkably, this stability is not only observed in the reference simulation, but also in the
other two simulations - perturbed by removing the ligand from the binding site - which
already indicates that structural changes upon ligand binding should rather be of local nature
and not lead to large-scale shifts affecting the entire fold. If measured over all atoms instead of
only the Cα-trace, the trajectory-averaged rmsd values are 1.47 ± 0.10 Å for lig_300K, 1.54 ±
0.11 Å for no_lig_300K, and 1.71 ± 0.12 Å for no_lig_350K, reflecting the obviously more
pronounced adaptations when side chains are being considered as well. Still, the absolute
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 60
values remain moderate, as do the standard deviations of the averages, indicating rather
attenuated overall fluctuations. The relative magnitudes of the rmsd values are in agreement
with the expected larger deviations for the uncomplexed simulations, especially when
conducted at higher temperature.
These differences become even more pronounced when the rmsd analysis is restricted to the
binding site residues (as defined in the Methods section). In the simulation with the ligand, the
all-atom rmsd for the binding site is 1.11 ± 0.20 Å (Cα-rmsd 0.90 ± 0.15 Å), whereas values of
1.58 ± 0.25 Å (Cα: 1.12 ± 0.19 Å) and 1.85 ± 0.20 Å (Cα: 1.41 ± 0.18 Å) are measured for
simulation no_lig_300K and no_lig_350K, respectively. Clearly, some structural changes must
have occurred in the binding site upon ligand removal which do not occur when the ligand is
present. Furthermore, as indicated by the larger standard deviations, the fluctuations and thus
the degree of mobility of the binding site residues seem to be significantly higher than for the
overall structure.
Being the area of highest interest in the context of structure-based drug design and with
respect to issues of flexibility, in the remainder the focus will be exclusively on the binding-site
region. As a reference for the following discussions, the simulation with the ligand (lig_300K)
will be analyzed in detail first.
MD simulations of the complexed state. In the complex, the ligand is tightly bound within
the deep pocket and is well kept in its position during the simulation as indicated by a rmsd of
1.15 ± 0.28 Å measured for the ligand atoms based on the binding-site all-atom fit mentioned
above. Nevertheless, it retains a considerable degree of residual mobility which is likely to
indicate a favorable entropic contribution to the binding free energy. This mobility is most
evident in the fluctuations of the p-bromo-o-fluorophenyl ring sandwiched between the
Leu300 and Trp111 side chains, as well as in the torsional motions around the two ether
bonds and the bond leading off the p-bromo-o-fluorophenyl ring. The other torsions of the
ligand show smaller fluctuations. The interaction of the two carboxylate oxygens with the
residues of the catalytic center Tyr48, His110, and Trp111 is extremely well conserved. The six
average distances of the two oxygens to the donor hydrogens of these three residues show
standard deviations of 0.12 - 0.24 Å and thus rather moderate fluctuations. Interestingly, four
of the six distances are even shortened compared to the starting value, indicating a very
favorable interaction motif. Conformationally the least fluctuating part is formed by the
thioamide group and the immediately adjacent bonds. The standard deviations for these
torsions are all below 13.5°. The thioamide itself retains its planarity, and the N-C.sp3 torsion
shows an average in excellent agreement with the starting value (96.6° versus 102.1°), whereas
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 61
the torsion of the C.sp2-C.sp2 single bond connecting the thioamide with the aromatic ring is
shifted to a slightly higher value (i.e., -7.2° instead of -42.2°). This is probably related to the
fact that the intramolecular hydrogen bond between the thioamide hydrogen and the ether
oxygen is shortened in the early phase of the simulation (from 2.3 to 1.9 Å), but is then stably
maintained along the entire trajectory (standard deviation < 0.1 Å). This intramolecular
hydrogen bond has been attributed an important role for the high affinity of IDD594 and
related ligands, as it preorganizes the free ligand in a conformation suitable for binding (Van
Zandt, Sibley et al. 1999). The simulation underlines the importance of this internal
interaction.
Despite the overall compactness of the fold and the presence of the ligand, significant
conformational variations are observed in simulation lig_300K for parts of the binding site.
Distance measurements across and along the binding site reveal that one half maintains a very
stable conformation during the simulation, whereas residues of the other half are more
flexible. The most stable part is formed by the residues Trp20, Tyr48, Trp79, His110, and
Trp111, including also Thr113. As reflected by the values in Table 5, the mutual distances
between these residues show very low fluctuations and averages which remain close to the
starting values. Also NADP+, the cofactor, is part of this stable subpocket, called the anion-
binding pocket, and shows only very restricted mobility throughout the simulation.
In contrast, much larger fluctuations are observed for the other half of the binding pocket, the
specificity pocket, including especially Leu 300, Trp 219, and Phe122, but also Cys298 and
Cys303, as listed in Table 5 and graphically displayed in Figure 5.
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 62
Figure 5. Characteristic binding-site distances measured to Trp111 in the simulation of the complex
(lig_300K). Cf. Table 5 for further details.
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 63
The most flexible behavior is shown by Leu300. This is clearly reflected by the distance to
Trp111 across the binding pocket (measured between atom CG of Leu300 and the geometric
center of the Trp indole ring). Trp111 itself maintains its position very well. This distance to
Leu300, however, oscillates between a minimum of 7.5 Å and a maximum of 12.1 Å. With an
average of 9.2 ± 0.72 Å, the distance is widened by 1.1 Å compared to the starting value of 8.1
Å in the crystal structure. A histogram analysis shows, though, that in 7.3 % of the 6000
trajectory conformations this distance is 8.2 Å or less (≤ 8.6 Å in 20.6 %). Thus, the starting
distance is still adopted quite frequently, but the high mobility of this residue allows a wide
range of distances to be sampled, and if transitions occur they preferably lead to distances
beyond 9 Å. The distances of Leu300 to its neighboring residues Trp219 and Cys303 show
averages very close to the starting values, but very large fluctuations either (Trp219: 7.3 ± 1.3
Å, starting value 7.7 Å; Cys 303: 4.6 ± 0.7 Å, starting value 4.4 Å). The Trp219 distance
fluctuations are especially high since Trp219 itself exhibits a high degree of flexibility, but its
motion is not tightly coupled to Leu300. On the other hand, the Cys303 side chain shows
occasional transition into an alternative conformation (with χ1 changing from ∼180° to 60-
80°), leading to a correspondingly higher distance for the period during which this
conformation is maintained (∼500 ps). Conversely, the distance to the conformationally fairly
well conserved Thr113 is lowered when the Cys303 side chain adopts this conformation. Yet
the trajectory average of the χ1-torsion is in perfect agreement with the starting value in the
crystal structure (167.1° ± 26.7° versus 166.7°). The situation is somewhat different with
respect to the other cysteine in the binding site, Cys298. Here, during equilibration a transition
occurs from the starting value of 87.6° towards values around 170° (trajectory average of
170.5° ± 11.1°). Interestingly, a conformational disorder over two states was
crystallographically observed for this residue. An interesting behavior is also observed for the
side chain of Phe122. While the χ2-torsion remains at the starting value throughout the
simulation, two different conformations are adopted by the χ1-torsion (cf. Figure 6): ∼75° on
the one hand and ∼170° on the other, the latter being reminiscent of the 169.4° starting value.
The two conformations are populated in a ratio of roughly 40:60.
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 64
Figure 6. Trajectory snapshot of simulation lig_300K (green) compared to the crystal structure. The
snapshot shows the alternative binding site conformation C1 sampled by the trajectory besides the
main crystallographically observed conformation (cf. the 2D-rmsd and cluster analysis reported in
the text). The main differences are in the Leu300 region, including Ala299 and Cys298 on the right,
and Cys298 and Tyr309 on the left, as well as in the Phe122 conformation. The anion-binding
pocket surrounding Tyr48, instead, shows no variation. For reasons of clarity, the ligand has been
omitted from the representation.
Leu300
Phe122
Tyr48
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 65
Table 5. Binding site distances, measured in the three simulations and compared with starting
values of the crystal structure. All values are given in Å. For His, Phe, Trp, and Tyr residues the
geometric center of the corresponding ring system was used in the distance measurements, unless
otherwise noted; for NADP+, the nicotinamide ring was used for the same purpose. In all other
cases, the atom to which the distance was measured is explicitly given. The lines of the two table
sections are sorted by residue number.
start lig_300K no_lig_300K no_lig_350K
binding site area of low flexibility
Trp20 - NADP+ 5.69 6.02±0.31 5.91±0.56 5.58±0.51
Trp20 - Trp79 10.98 10.19±0.40 10.25±0.45 10.43±0.57
Trp20 - His110 8.79 8.68±0.25 8.32±0.53 8.06±0.48
Trp20 - Trp111 9.96 10.04±0.30 10.49±0.71 10.32±0.68
Tyr48OH - His110NE2 3.72 3.95±0.24 4.21±0.36 4.43±0.52
His110 - Trp111 5.81 5.89±0.24 6.23±0.45 6.23±0.57
Trp111 - Thr113OG1 6.05 5.63±0.36 5.28±0.42 5.17±0.49
binding site area of high flexibility
Trp20 - Trp219 7.16 7.19±0.48 7.18±0.83 10.75±1.22
Trp79 - Phe122 5.47 6.28±1.07 6.13±0.96 6.33±0.96
Trp111 - Phe122 8.45 9.91±0.64 9.41±0.68 9.81±0.82
Trp111 - Trp219 10.78 11.52±1.03 12.96±0.88 14.88±0.88
Trp111 - Cys298SG 5.53 6.19±0.52 8.19±1.34 8.03±1.33
Trp111 - Leu300CG 8.15 9.24±0.72 5.01±0.53 4.89±0.59
Trp111 - Cys303SG 7.77 8.13±0.55 7.56±0.63 7.52±1.09
Thr113OG1 - Cys303SG 5.70 6.18±0.63 4.95±0.86 4.98±0.93
Phe115 - Ala299CA 12.19 12.46±0.57 12.38±0.47 12.36±0.57
Trp219 - Leu300CG 7.76 7.27±1.35 11.33±1.37 12.96±1.04
Leu300CG - Cys303SG 4.37 4.56±0.67 4.24±0.51 4.84±0.76
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 66
Mobility in this area is not restricted to the side chain level, but includes sections of the
backbone as well. In fact, Leu300 is part of a highly mobile backbone stretch in the binding
pocket, leading from Val297 to Leu300. Especially ψAla299 and ϕLeu300 show large fluctuations
and oscillate between two states ("state 1" and "state 2") that differ by about 100 – 120°
(Ala299: ψ1 30 – 40°, ψ2 150 – 160°; Leu300: ϕ1 -50 – -70°, ϕ2 -150 – -160°). The oscillations
of these torsions are such that they compensate each other with respect to the conformational
net effect on the preceeding and subsequent backbone section. Obviously, however, the
orientation of the Ala299 carbonyl and the Leu300 amide changes depending on the adopted
torsions: while state 2 largely corresponds to the conformation observed in the crystal
structure, state 1 represents an alternative conformation where the Ala299 carbonyl is pointing
away from the binding site while the Leu300 amide is oriented towards the binding pocket (cf.
Figure 6). Generally, the backbone mobility is also of interest in the context of the high
variability observed for the Leu300 side chain and its key role in binding site adaptations.
Since Leu300 is the largest side chain of this backbone section and is furthermore exposed
towards the binding pocket, the effect of backbone mobility on the binding-site shape is
enhanced by this residue.
Taken together, the simulation of the complexed state (lig_300K) provides a view of the
binding site as being composed half of a rigid section and half of a flexible part. The rigid
section is formed by the anion-binding pocket and its surroundings, whereas flexibility is
mediated by a mobile backbone stretch (Val297-Leu300), with the Leu300 side chain as main
"amplifier" and neighboring side chains as "modulators". Two major distinct states of the
binding site can be discerned in the trajectory: one which bears high resemblance to the
crystallographically observed conformation and a second which is characterized by an "out-
swing" of the Leu300 side chain, a χ1-flip of Phe122 and a shift of the Cys303 and Tyr309 side
chains, in the majority of the cases combined with torsion state 1 of the Ala299 - Leu300
backbone, as described above (cf. Figure 6).
More quantitatively, this observation is confirmed by a mutual comparison of the trajectory
snapshots of the binding site in terms of 2D-rmsd plots and hierarchical cluster analysis. 150
snapshots were used for this purpose, taken at regular intervals of 20 ps over the entire 3 ns
trajectory (a comparative analysis using 600 snapshots with 5 ps intervals did not reveal further
insights and was computationally less feasible). It is immediately apparent from Figure 7 that
two main conformational families or substates can be distinguished and that transitions occur
between them. The one observed first in the sampled trajectory will be called "conformation
1" or C1 (lower left part of the plot in Figure 7), while the other will be called "conformation
2" or C2. Essentially, C2 corresponds to the conformation observed in the crystal structure
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 67
used as starting point, while C1 is characterized by a jointly adopted alternative conformation
of the most flexible residues, as mentioned in the preceeding paragraph and shown in Figure
6. C2 is the more populated state (~60%), while C1 is observed less frequently (~40%).
Interestingly, after the initial 100 ps of thermalization and equilibration, the sampling phase of
the simulation starts with C1, which means that during the equilibration phase a transition
must have occurred. A clear-cut second transition is observed after 1130 ps, apparent as a
sharp borderline between light and dark squares in the lower left third of the plot. In this
transition area, the rmsd jumps from ~0.7 Å (conformations of the same family) to up to 1.7
Å (conformations of different families). The conformational family C2 is then maintained for
about 1800 ps, before a new transition to C1 occurs. Light-gray crosspeaks indicate that it is
indeed a C1-like state which is being revisited in the last 200 ps.
A perfectly complementary picture emerges from hierarchical cluster analysis (HCA) based on
the mutual rms deviations of the same 150 binding site conformations. As can be seen in
Figure 8, the 150 snapshots clearly separate into two main clusters (level 1), populated at a
ratio of 40:60 and corresponding to C1 and C2, respectively. C2 further separates into three
subclusters (level 2), whereas C1 is composed of two subclusters. In the latter case, the larger
subcluster is mainly composed of snapshots from the first-1-ns block of C1, but also a few
snapshots from the last-200-ps block; the smaller subcluster, instead, shows a higher
proportion of frames from the last-200-ps block.
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 68
Figure 7. 2D-rmsd plots, based on a superposition of all binding site atoms using snapshots taken
every 20 ps (a total of 150 conformations). Left: simulation lig_300K; middle: simulation
no_lig_300K; right: simulation no_lig_350K. In each diagram, the 150 consecutive snapshots are
plotted from left to right and from bottom to top. Each square in the plot holds the mutual rmsd
between the two snapshots, which is represented with a relative gray-scale code: white
corresponds to 0 Å rmsd, black to the maximum rmsd observed within the given plot. The
maximum deviations are 2.03 Å for lig_300K (left), 2.49 Å for no_lig_300K (middle), and 2.81 Å for
no_lig_350K (right).
Figure 8. Hierarchical cluster analysis based on the mutual rms deviations of the same 150 binding
site conformations as in Figure 7. Left: simulation lig_300K; middle: simulation no_lig_300K; right:
simulation no_lig_350K.
Level 1
Level 2
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 69
MD simulations of the uncomplexed state. Without the IDD594 ligand in the binding
pocket, a significantly different result is obtained when subjecting the aldose reductase
structure to MD simulations. Already at the standard temperature of 300 K, a more diverse set
of binding-site conformations is sampled. This is immediately evident from the 2D-rmsd plot
and the “Hierachical Cluster Analysis” (HCA) diagram for simulation no_lig_300K, both
prepared identically as for simulation lig_300K above (cf. Figure 7 and Figure 8). Depending
on where the threshold is set, four to five major conformational clusters can be discerned. The
maximum deviation among any of the 11175 snapshot pairs is 2.49 Å (2.03 Å in case of
simulation lig_300K). At elevated temperature (350 K) the sampled conformations are of even
higher diversity. For simulation no_lig_350K the maximum deviation among the snapshots is
2.81 Å and about six main clusters are revealed by the 2D-rmsd and HCA graphs. Frequent
transitions between these conformational states occur during the simulation, indicative of the
high thermal energy available to the system.
An instructive composite picture and a comparative overview of the conformational space
sampled in all three simulations together (i.e., lig_300K, no_lig_300K, and no_lig_350K) is
obtained by generating a 2D-rmsd and HCA diagram for the combined 3 × 150 = 450
snapshots, as shown in Figure 9. The maximum deviation observed for any of these 101025
pairs is 3.37 Å. The 2D-rmsd plot provides clear evidence for the fact that the simulation of
the complex (lig_300K) has a fairly distinct character compared to the uncomplexed
simulations. On the one hand, less conformational states are visited during the simulation
(only two, essentially; cf. the bottom left part of the plot). On the other hand, these
conformations clearly differ from those sampled by the uncomplexed simulations (cf. the dark
areas in the bottom third or left third of the plot). This applies especially to the less populated
of these two states (C1), which, as shown above, is the one less similar to the IDD594 crystal
structure. The more populated, "crystallographic" state C2, instead, bears a slightly better
resemblance to some of the uncomplexed conformations, primarily those from the early
stages of simulation no_lig_300K.
Based on the composite HCA diagram, it appears most reasonable to distinguish 8-10 major
clusters. For the following discussion, the threshold is set at a level of 9 clusters (cf. Figure 9
and Table 6). Cluster 1 and 2 consist entirely of lig_300K conformations and essentially
correspond to C1 and C2, respectively, as described above. Some conformations of simulation
lig_300K, however, do also occur in cluster 3 (C3) in which the majority of the conformations
comes from simulation no_lig_300K. This is reasonable, since in the first third of the
uncomplexed simulation at standard temperature binding-site conformations more similar to
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 70
the crystallographic state are still observed, as mentioned above. Significant differences
between C2 and C3 are mostly confined to shifts in Leu300, Trp219, and Phe122.
Table 6. Cluster composition based on the hierarchical cluster analysis comprising all three
simulations (450 snapshots) as shown in Figure 9.
Cluster number of members from simulation
1 53 lig_300K
2 79 lig_300K
3 18
23
lig_300K
no_lig_300K
4 66
4
no_lig_300K
no_lig_350K
5 49
2
no_lig_300K
no_lig_350K
6 12
14
no_lig_300K
no_lig_350K
7 12 no_lig_350K
8 83 no_lig_350K
9 35 no_lig_350K
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 71
Figure 9. Combined 2D-rmsd plot (top) and hierarchical cluster analysis (bottom) for all three
simulations, using the same conformations as in Figures 7 and 8. This results in 450 different
conformations in the analysis. In the 2D-rmsd plot, the order of the conformations from left to right
and bottom to top is as follows: first the lig_300K conformations, then the no_lig_300K
conformations, and finally the no_lig_350K conformations. The maximum rmsd between any of
these conformations is 3.37 Å. The red line in the cluster diagram corresponds to the threshold set
for the discussion of the major conformational families (cf. Table 6).
1 2 3 4 5
6
9 8 7
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 72
The remaining six clusters are exclusively formed by conformations of the uncomplexed
simulations (cf. Table 6): two are dominated by no_lig_300K conformations, one consists of an
almost equal number of conformations from both simulations, and the remaining three are
formed by no_lig_350K conformations only. This distribution and composition of clusters is
again a reflection of the fact that conformational sampling is significantly more diverse in case
of the uncomplexed simulations and - not unexpectedly - further increases at higher
temperature.
A comparison of members from each cluster provides insight into the conformational states
sampled during the simulations. Most important is the fact that in the uncomplexed
simulations, Leu300 generally adopts a position much closer to Trp111 than in the IDD594
complex structure and thus closes the specificity pocket. This is also apparent from the
distance measurements reported in Table 5. Again, since Trp111 itself shows only minor
swings of its aromatic side chain, most of the differences observed in the distances in
comparison to the complexed state can be attributed to the other residue to which the
measurement refers to. The most drastic changes are observed with respect to Leu300,
Cys298, and Trp219, indicating that Leu300 moves into the binding pocket, whereas Trp219
shifts further out and Cys298 preferably adopts a conformation where the side chain points
away from Trp111.
The closing of the specificity pocket by Leu300 is most persistently observed in the
no_lig_300K simulation, while at higher temperature (no_lig_350K) conformations also occur in
which the Leu300 side chain is found again in a bound-state-like orientation, with the
specificity pocket partially opened (this applies to subclusters of cluster 8). It is remarkable
that this open conformation is revisited at intermediate stages of the high-temperature
simulation although closed conformations appear clearly preferred when no ligand is present.
This has important implications, as further discussed below.
The "closed state" of Leu300 seems not so much determined by the side chain torsions of this
residue, but rather by its backbone orientation. The effect of altered backbone conformations
on the binding pocket, however, is largely amplified by the Leu side chain. The Leu300
backbone orientation, in turn, depends to a good extent on the Ala299 and Cys298 backbone
conformation. Considerable flexibility is actually mediated by this backbone segment. In
cluster 5, for example, conformations are even observed in which the hydrogen bonding
pattern exposed to the binding site is switched, such that the Ala299 carbonyl and the Ala299
amide are addressable by hydrogen bonding partners of a ligand whereas the Cys298 carbonyl
is not (cf. Figure 10).
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 73
Cluster 3
Cluster 5
Cluster 9
Figure 10. Comparison of MD-generated conformations from three different clusters with the
IDD594 crystal structure, showing the residues Leu300, Ala299, Cys298, as well as Tyr309 and
Cys303. The X-ray structure is shown in grey, conformations obtained from no_lig_300K in blue
(cluster 3 and 5) and the conformation obtained from no_lig_350K in yellow. Figures on the left and
on the right show the identical conformation from two different views.
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 74
The comparative analysis of the different clusters also clearly reveals that the Cys303 and
Tyr309 position is tightly coupled with the Leu300 orientation. Whenever the Leu300 side
chain adopts a position pointing into the specificity pocket, both Tyr309 and Cys303 are
slightly pushed outwards since their position in the IDD594-complexed state would not be
compatible with the new Leu300 orientation (cf. Figure 10).
Considerable variability is furthermore observed for Trp219. This, however, is not caused by
this residue’s side chain torsions, but rather by the dramatic backbone mobility of the loop
segment between Pro215 and Pro225. Despite the high conformational flexibility of the
segment, the effect on the binding site geometry is moderate because only the Trp219 side
chain is exposed towards the pocket. In addition, the relative movement of Trp219 does not
appear to be correlated with other changes in the binding site.
A further potentially important motion for the shape of the binding site are the oscillations of
the Phe122 side chain governed by the χ1 angle, onto which occasional minor shifts
originating at the backbone are superimposed. The two states of χ1 are distributed around 80-
90° on the one hand and 170-180° on the other. This oscillation, however, has also been
observed in the complex simulation. In contrast, 180°-flips of the χ2 angle (viz., phenyl ring
plane) are observed only in the uncomplexed simulations, but not for the complex.
Despite of all these variations, the anion-binding pocket with its surroundings (i.e., NADP+,
Trp20, Val47, Tyr48, Trp79, His110) keeps its position very well and shows an essentially
identical conformation in all the clusters. This is remarkable since in the uncomplexed state a
stabilizing ligand group (carboxylate) bridging Tyr48 and His110 via hydrogen bonds is absent.
The stability in the uncomplexed state might at least in part be attributed to the presence of a
water molecule, which forms hydrogen bonds to Tyr48 and His110 and thus "replaces" the
ligand carboxylate. Such a water molecule is observed in both uncomplexed simulations,
no_lig_300K and no_lig_350K. In both cases, the water molecule is very stably maintained in
this position and exchanged only twice during the 3 ns simulation time. The dual nature of the
binding site composed of a fairly flexible specificity pocket and a comparatively rigid half
(formed by the anion-binding site) is thus apparent also in the simulations of the uncomplexed
state.
An interesting question is whether conformations sampled in the uncomplexed simulations
bear any resemblance to other aldose reductase crystal structures. Limiting the discussion to
the three main distinct experimental structures identified above (i.e., 1ads, 1ah3, and 1iei),
rmsd measurements of the binding-site residues reveal that this seems actually to be the case.
For simulation no_lig_300K the trajectory average rmsd with respect to the uncomplexed
crystal structure 1ads is 1.34 (± 0.17) Å and thus significantly lower than the value measured
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 75
with respect to the IDD594 crystal structure corresponding to 1.55 (± 0.25) Å. The minimum
rmsd with respect to the ligand-free structure (1ads) observed during the trajectory is 0.90 Å,
indicating high similarity to this experimental structure of the unbound state. Even in
comparison to the tolrestat-bound structure (1ah3), a conformation with a minimum rmsd of
0.99 Å is sampled, but the average rmsd of 1.58 (± 0.24) Å is higher than the corresponding
value for the uncomplexed structure (1ads), which is not unexpected. The least similarity,
finally, is observed with respect to the zenarestat-bound structure (1iei): here, the minimum
rmsd is 1.17 Å and the trajectory average 1.79 (± 0.22) Å. As far as simulation no_lig_350K is
concerned, generally somewhat higher values but analogous trends in the rmsd measurements
with respect to IDD594, 1ads, 1ah3, and 1iei are observed.
The rmsd measurements, however, are not to be overinterpreted and should be
complemented by qualitative visual inspection and comparison of torsion angles. The
important factors determining the size and form of the binding pocket are, in fact, primarily
the conformation of the Cys298-Leu300 backbone and the orientation of the Leu300 side
chain and differences or similarities in these residues might be masked in the rmsd
measurement by other, less important residues with minor effects on the binding site. From
visual inspection it turns out, however, that relevant conformations comparable to other
experimentally observed conformations are indeed being sampled (e.g., compare Figure 3 and
Figure 10). Furthermore, a comparison of the crystal-structure torsion angles listed in Table 4
(side chains of Phe122, Cys298, Leu300, Cys303) with torsion-angle distributions sampled by
the two trajectories of the uncomplexed state shows that the distributions cover nearly the
entire range of the experimentally observed values. The main exception is Leu300, where the
values between -130.0° and -140.6° as well as the value in the tolrestat-bound state (1ah3) of -
30.8° is not sampled. As far as the Val297 - Leu300 backbone ϕ- and ψ-angles are concerned,
most of the experimental variation is seen in the simulations as well. Taken together, the
degree of sampling obtained here using a single X-ray starting structure subjected to different
simulations of 3 ns length appears reasonably adequate for the degree of binding-site flexibility
anticipated for aldose reductase.
Binding-site flexibility and induced-fit of aldose reductase. The comparative X-ray
structure analysis combined with extensive MD simulations provides a fairly consistent picture
of flexibility effects and dynamic characteristics of the aldose reductase binding site. First of
all, flexibility is clearly mediated by a limited set of residues: most of the mobility is
transmitted by only about a third of the 15 binding-site residues. The key role is played by
Leu300 and the backbone stretch from Val297 to Leu300. The effects of positional and
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 76
conformational variations of this backbone segment are amplified by the Leu300 side chain:
backbone motions which per se would have only minor effects on the shape of the binding site,
lead to significant alterations in its appearance because of modified Leu300 movements.
Besides that, this side chain itself exhibits considerable mobility and affects the positions of
spatially neighbouring binding site residues, primarily Cys303 and Tyr309 whose positions are
correlated with the Leu300 orientation. Among the other residues in the binding pocket,
Phe122 and Trp219 show the most significant degree of flexibility; both are located in spatial
proximity to the pivotal Leu300. All other binding-site residues are significantly more stable in
position and conformation. This applies especially to the catalytic site around the cofactor,
Tyr48 and His110. The high stability of this region in the uncomplexed state is fostered by a
water molecule which is firmly embedded into a hydrogen-bonding network.
Both the comparative X-ray structure analysis and the MD simulations provide clear evidence
for a dual character of the aldose reductase binding site: an area of high structural stability
surrounding the catalytic site and a region of high mobility surrounding the Leu300 residue.
Based on a thermodynamic stability analysis, such a dual nature of binding sites has recently
been proposed as a general and functionally important characteristic of proteins (Luque et al.
2000). Aldose reductase appears to perfectly fit this view, in particular also the observation
that catalytic residues are usually located in regions with very high structural stability.
In light of these findings, it is worthwhile to discuss what is generally considered as induced-fit
binding of inhibitors to aldose reductase. In the absence of a ligand, the holo-conformation as
represented by the uncomplexed structure 1ads seems clearly preferred: different crystal
structures of the holo state show only minor differences, and in the MD simulations of the
uncomplexed state, holo-like conformations are predominant (even though a complexed
conformation was used as starting point!). The conformation seen in the uncomplexed state of
the enzyme is frequently also observed in crystal structures with bound ligands; currently, the
majority of the aldose reductase structures in the PDB adopts this conformation. Accordingly,
this conformation also represents a binding-competent state, and induced-fit is not a necessary
condition for ligand binding to aldose reductase. The occurrence of induced-fit does of course
also depend on the size and nature of the ligand.
With certain more extended ligands, such as IDD594, zenarestat, or tolrestat, however, a
variable specificity pocket is opened. Most likely this opening requires energy and thus
contributes unfavorably to the binding free energy. The rare occurrence of protein
conformational states suitable for binding of IDD594 or tolrestat in the simulations of the
uncomplexed state corroborates this assumption. Thus, in the absence of a ligand, the
Leu300-closed state of the specificity pocket is clearly preferred. Nevertheless the overall
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 77
energetic cost of the conformational change in the binding site is likely to be moderate
because on the one hand the area where it occurs has low structural stability, while on the
other hand significant mobility is maintained in the ligand-bound state. Furthermore, any
unfavorable contribution to ligand binding is likely to be largely overcompensated by the gain
in free energy resulting from desolvation effects and the deep burial of the ligand moiety in
the specificity pocket and the specific interactions formed therein (e.g., the stacking with
Trp111).
Although the resulting adaptation of the binding site to certain aldose reductase inhibitors is
generally referred to with the term induced-fit, it might be more appropriate to think of it as a
process of preferential selection of conformations and corresponding shifts of conformational
equilibria (Freire 1998; Ma, Kumar et al. 1999). Accordingly, states with an appropriately
opened specificity pocket, which in the absence of a ligand are very weakly populated, are
preferentially selected by the corresponding ligand because of a local stabilization due to the
presence of parts oft the ligand. In total, this results in a net gain in free energy compared to
other protein conformations in the ensemble. As a result, the conformational equilibrium is
shifted towards the binding-competent conformations with open pocket, and the
corresponding conformational state becomes predominant and experimentally observable.
Based on this view of selection of intrinsic protein conformations, it appears actually
reasonable for structure-based drug design techniques to address issues of flexibility and
induced-fit analyzing a set of (pregenerated) protein conformations.
Relevance and implications for drug design. Given the aforementioned flexibility effects
upon binding of certain ligands, aldose reductase is clearly a complicated target for structure-
based design. As a consequence, standard drug design methods based on a single immobilized
binding site may yield comparatively low success rates in predicting near-native binding modes
because the selected binding pocket is of relevance only for a certain fraction of the virtually
screened ligands. As long as complete flexibility of the protein structure cannot be handled in
a truly simultaneous or adaptive manner, the currently favored strategy is to use a limited set
of different protein conformations and to consider them as possible alternatives in various
ways (e.g., (Claussen, Buning et al. 2001)). This set of structures may be either of experimental
origin or come from MD simulations. In both cases the question arises whether the selected
structures are a) relevant and b) sufficient.
For aldose reductase as a target for future application of such design techniques, the present
study suggests some answers to these questions. Clearly, with respect to the data of
experimental origin, there is no doubt that the available crystal structures represent relevant
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 78
conformations. Nevertheless, the level of detail and the quality of the structural data is not the
same for all available structures. While the ultra-high resolution structure of the IDD594
complex represents a nearly ideal case in terms of quality and detail, it is well known that with
structures solved at much lower resolution (~2.5 Å) caution is sometimes warranted. The
probably more important question, however, is, whether the available structures are sufficient
to cover the spectrum of potentially binding-competent conformations. In the case of aldose
reductase, the answer is clearly no: the presently known, experimentally confirmed structures
represent only four major conformations and there is no reason to believe that no further
variations are possible. This assumption is supported by the results of the performed MD
simulations.
MD simulations are a tool to alleviate this situation through conformational sampling. In the
present study, running multiple simulations with varying starting conditions on a nanosecond
timescale led to a respectable number of different conformational substates, covering a much
larger spectrum of accessible binding site conformations than detectable in presently available
crystal structures. In addition, apart from the major conformational states identified via 2D-
rmsd and hierarchical cluster analysis, many "intermediate" states are generated. For a first
instance of virtual screening based on multiple protein conformations, both the number and
the variation of the generated conformations appears fully sufficient. Nevertheless it is also
clear that truly complete sampling can hardly be achieved for systems of the size of aldose
reductase. Running additional simulations starting from other experimental conformations is
the most straightforward way to address this problem, and first steps into this direction have
already been undertaken in the context of the present project.
The final question then is, whether the MD generated conformations are not only sufficiently
diverse, but also relevant. Apart from the fact that a well-proven, state-of-the-art simulation
method and force field has been applied, a variety of observations indicates that the relevance
seems to be given also in the present case. First of all, the rms deviations remain within
reasonable boundaries during the simulation. In particular, the overall structure is very stably
maintained, in agreement with the expectations for this kind of fold. With respect to the
binding site, it is fully compatible with experimental data that different degrees of mobility are
observed, e.g. a relatively rigid catalytic site and a highly flexible Leu300 region. Comparing
the three different trajectories, it is furthermore reasonable that the experimental binding site
conformation dominates in the simulation of the complex, whereas, upon removal of the
ligand, conformations are sampled that resemble much more the uncomplexed state. Most
valuable in the context of sampling for applications of structure-based design is the less
obvious and less expected observation that even in the absence of a ligand, conformations can
Vergleichende Kristallstruktur-Analyse und MD-Simulationen 79
occur which resemble already known complexed conformations. Such characteristics are most
useful if MD simulations are to be applied for conformational sampling of putative binding-
site conformations for virtual screening.
4.1.4 Conclusions
Comparative crystal structure analysis and MD simulations based on a new ultra-high
resolution crystal structure have been used to probe the binding-site flexibility of aldose
reductase. A dual nature of the binding pocket is revealed, characterized by a very stable
region surrounding the catalytic site and a highly mobile area around Leu300. This residue
itself plays the dominant role in the binding-site adaptations. The conformational substates
generated by the simulations are both compatible with and complementary to the
conformations observed in currently available crystal structures and should thus prove useful
in virtual screening applications. Qualitatively, the results support a view of binding-site
adaptations as resulting from preferential selection of binding-competent conformations from
the ensemble. The energetic penalty of such adaptations on the overall binding free energy is
likely to be small. Further MD studies, virtual screening based on MD-generated
conformations, as well as isothermal titration calorimetry and site-directed mutagenesis
experiments are currently undertaken to quantify the contributions and to further improve the
understanding of the effects of binding-site flexibility on inhibitor design, thermodynamics of
ligand binding, and specificity.
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 80
4.2 Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus2
4.2.1 Introduction
A major goal of any drug development project is the discovery of new prospective leads that
are appropriate in shape and chemical constitution (“lead-like”) to be subsequently optimized
towards highly active and selective inhibitors of the biochemical pathway under consideration.
In parallel, pharmacological studies have to show that modulations along this pathway result
in a valid therapeutic principle. Proteomics will provide increasing information about such
new pathways and structural genomics will elucidate the 3D structure of the proteins that
could possibly serve as targets for therapeutic intervention (James 1997; Kenyon et al. 2002;
Page et al. 1999). Are we prepared to find efficiently in short time putative leads for these new
targets? One well-established technology is experimental high-throughput screening; however,
it has been shown to be rather cost-intensive and of frustratingly low hit rate (Jenkins, Kao et
al. 2003; Rishton 1997). As a rather recent complement virtual screening has been introduced
(Klebe 2000; Lyne 2002; Schneider et al. 2002; Walters, Stahl et al. 1998). This typical
knowledge-driven approach starts with the 3D structure of the target protein, which is
exploited to discover new leads by computer searches in large compound libraries. A
prerequisite for the success of this method is a detailed understanding of the structural
properties of the target protein and the criteria that determine its binding to a ligand.
Additionally, its crystal structure in complex with several distinct ligands should help to define
the range of possible binding modes. Furthermore, information from structure/activity
relationships determined for a series of ligands support a better prediction of the expected
binding affinities. The latter entity is of utmost importance since it serves as the ultimate
selection criterion for the actual testing of computer-retrieved candidates.
Inhibition of aldose reductase provides a therapeutic mean for the treatment of diabetes.
Although administration of insulin can prolong the life of patients, it does not prevent the
progression of chronic diabetes resulting in late-onset, debilitating complications that occur in
many tissues and affect various sensory organs, such as the nerve system, circulation, and renal
excretion. These complications cause retinopathy, cataract, microangiopathy, and neuropathy,
2 Das folgende Kapitel wurde zur Veröffentlichung eingereicht und akzeptiert: Oliver Krämer,
Isabelle Hazemann, Alberto D. Podjarny, Gerhard Klebe, Ultra-High Resolution Drug Design
III: Virtual Screening for Inhibitors of Human Aldose Reductase, Proteins: Structure, Function
and Genetics
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 81
finally progressing to loss of vision, sensory perception, limb function, and premature death.
The development of these complications is linked to an excess level of free glucose in the
corresponding tissues leading to an enhanced flux of glucose through the polyol pathway.
Aldose reductase (AR), together with sorbitol dehydrogenase (SDH), operates along this
pathway. Thus, inhibition of aldose reductase provides a possible strategy to prevent the
complications of chronic diabetes (Yabe-Nishimura 1998). Accordingly, considerable research
effort has resulted in the detailed structural characterization of aldose reductase (Borhani et al.
1992; Calderone et al. 2000; El-Kabbani et al. 1998; Rondeau, Tete-Favier et al. 1992;
Urzhumtsev, Tete-Favier et al. 1997; Wilson, Bohren et al. 1992; Wilson et al. 1995; Wilson,
Tarle et al. 1993) and in the discovery of a large number of structurally distinct AR inhibitors
(Costantino, Rastelli et al. 1999; Costantino, Rastelli et al. 1996; Da Settimo et al. 2001;
Donkor et al. 1999; Fresneau et al. 1998; Hanefeld et al. 1995; Inoue et al. 1999; Mylari,
Larson et al. 1991; Oka et al. 2000; Sarges and Peterson 1986). Even if a remarkable number
of different classes are known, apparently none of these compounds exhibits yet a property
profile with sufficient efficacy in clinical trials.
The crystal structures of AR complexes with the inhibitors Tolrestat, Zopolrestat, and Sorbinil
show different conformations of the residues in the binding site. While the spirohydantoine-
type inhibitor Sorbinil binds to a protein structure conformationally similar to the holo
enzyme, the two aromatic acids Tolrestat and Zopolrestat open up distinct new pockets at the
protein-binding site. A statistical overview of the data in the PDB has shown that ligand
binding frequently induces pronounced structural changes in the geometry of the
umcomplexed protein. However, within a series of related ligands binding to the same binding
site the protein often exhibits only minor induced-fit adaptations. Obviously, the properties of
AR clearly deviate from such a straight-forward, easily predictable behavior. As a
consequence, the question, general in computational drug design, can be put forward on how
to handle this type of receptor flexibility. More recently, clearly stimulated by detailed
crystallographic studies of the pig-lens and subsequently of the human enzyme, several
structure-activity relationship studies have been reported (Costantino et al. 2001; Lee, Chen et
al. 1998a; Lee et al. 1994; Rastelli et al. 2000; Rastelli and Costantino 1998a; Rastelli et al.
2002a; Rastelli, Costantino et al. 1998b; Rastelli, Vianello et al. 1997; Singh, Malamas et al.
2000). Iwata et al. (Iwata, Arisawa et al. 2001) and Rastelli et al. (Rastelli, Ferrari et al. 2002b)
have performed database screenings based on one single conformer of the protein structure.
They were able to find AR inhibitors in the micromolar range. While such a strategy is fast and
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 82
efficient, it only concentrates on one possible conformer of the binding pocket of AR. It thus
ignores other varieties in agreement with the observed binding pocket flexibility.
In this paper, we present a virtual screening based on the ultra-high resolution crystal structure
of the inhibitor IDD594 in complex with hAR. Although this approach also clearly limits to
one predefined binding pocket, we decided to focus on this structure for the following
reasons: (1) IDD594, analog to Zopolrestat, shows high affinity towards AR, (2) similar to the
complex structure of Zopolrestat in hAR, whose coordinates are not fully deposited in the
PDB, an alternative specificity pocket is occupied by IDD594, (3) the ultra-high resolution
gives us exact information about the protonation state of both, the inhibitor and the protein,
(4) obviously AR experiences strong binding affinity for this active-site variant suggesting this
binding pocket as being optimal for inhibitor design.
In our virtual screening we applied a protocol of consecutive hierarchical filters (Scheme 1).
These filters were selected to discover compounds that would fit the binding pocket of
IDD594. The initial database comprised about 260,000 test candidates. In the first selection
step, putative ligands were chosen that exhibit a functional group to anchor the anion-binding
pocket. Subsequently, a pharmacophore model based on the binding geometry of IDD594
and extrapolated from mapping the binding pocket in terms of putative “hot spots” of
binding was applied as consecutive filter. In a final filtering step, the remaining candidate
molecules were flexibly docked into the binding pocket of IDD594 and ranked according to
their predicted DRUGSCORE affinities. After clustering the best scored compounds were
subjected to visual inspection. As a proof-of-concept, the most prospective hits from this
inspection were acquired and tested for inhibitory activity.
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 83
Scheme 1
206 compoundscluster analysis &visual inspection
1.261 compounds
FlexXflexible docking & verification
~12.500 compounds
3D-Querymatch pharmacophore
~260.000 compounds
2D-Queryanchor groups, MW, rot. bonds
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 84
4.2.2 Data Analysis, Methods and Results
4.2.2.1 Binding Site of the Target Protein
Aldose reductase (AR, EC 1.1.1.21), a member of the aldo-keto reductase superfamily, is a
monomeric enzyme that catalyzes the reduction of aldo sugars and a variety of aldehydes to
their corresponding alcohols. AR adopts a (β/α)8 TIM-barrel fold with the catalytic site
located in the barrel center at the bottom of a deep hydrophobic cleft. The enzyme is
NADPH dependent and the nicotinamide moiety of the cofactor is largely buried at the
bottom of the barrel where it closes up the catalytic center.
Recently, the crystal structure of human Aldose Reductase in complex with the potent
inhibitor IDD594 has been determined. (Howard, Sanishvili et al. submitted) In this complex
the electron density could be refined using data to a resolution of 0.66 Å, which is the highest
resolution yet achieved for a ligand-protein complex of this size. The extraordinary resolution
provides new important information with respect to the inhibitor binding site. Most of the
protons in the active site can be assigned to the electron density, giving us exact information
about the protonation state of the inhibitor and the protein (Figure 11).
O
O
O
F
NS
F
Br
O
HN
N
H
O
H
N H
N+
-
hydrophobic pocketLeu300
Thr113
Trp111
His110
Tyr48
NADP+
IDD594
Figure 11. Sketch of the binding mode of IDD594.
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 85
The carboxylate group of IDD594 is deprotonated and binds close to the nicotinamide carbon
C4 of NADP+. Besides this electrostatic interaction, it accepts three hydrogen bonds from the
residues Tyr48, His110, and Trp111. They all play an important role in substrate binding along
the catalytic pathway. Together with the positively charged nicotinamide ring of the cofactor
in its oxidized state, these residues form a pronounced positively charged binding site, the so-
called anion-binding pocket.
Similar to other inhibitors, such as Zopolrestat, IDD594 opens up a deep hydrophobic
specificity pocket, where its 4-bromo-2-fluoro-benzyl portion is accommodated. This aromatic
part of the inhibitor is stacked between Trp111 and Leu300. A special feature not indicated in
any of the other previously determined AR structures is the surprisingly short distance of 2.98
Å between the bromine substituent of IDD594 and the oxygen Oγ in the side chain of
Thr113. Multipolar refinements (B. Guillot, personal communication) have indicated a mutual
polarisation between both atoms, giving evidence for some type of polar interaction.
4.2.2.2 Virtual Screening
In the following sections, we will describe the different techniques applied to perform the
strategy outlined in the Introduction and the results obtained. All structural handling was
performed using SYBYL (2001a) running on a Silicon Graphics O2 (R5000) workstation.
Parallel docking was done with FLEXX (Rarey, Kramer et al. 1996a; Rarey et al. 1996b)
running on a cluster of Linux PCs.
4.2.2.2.1 Preliminary Filtering for Anion-Binding Pocket Anchor Groups
IDD594 binds with its deprotonated carboxylate to the anion-binding pocket. Accordingly, all
candidate molecules were requested to possess one of the terminal functional groups listed in
Table 7. These groups have been described in literature as bioisosteres of the carboxylic acid
function (Wermuth 1996). Based on this connectivity, we preselected the ACD database
(2000) composed of 259,747 entries using UNITY (2001b). In this step, we also applied the
criteria defined by Lipinski et al. (Lipinski et al. 1997), additionally we removed all compounds
with a molecular weight larger than 350 D and containing more than eight rotatable bonds.
This resulted in a reduction of the original dataset to 12,545 entries.
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 86
Table 7. Functional groups selected as potential anion-binding pocket anchor groups and their
corresponding SLN codes.
Anchor SLN-code
OH
O
C(=O)OH
N
O
OHH
C(=O)NH(OH)
NNN N
H N[1]HN=NN=C@1<v=1>
POH
OH
O
P(=O)(OH)OH
SO
OH
O
S(=O)(=O)OH
4.2.2.2.2 3D Pharmacophore Query with UNITY
Subsequent to this 2D connectivity search, we performed a 3D search with UNITY based on a
predefined pharmacophore hypothesis. This hypothesis was directly extracted from the
requirements imposed by the binding site. To highlight those areas of the binding site where a
putative ligand can favorably interact with the protein, we applied SuperStar (Verdonk, Cole et
al. 2001) and DRUGSCORE (Gohlke et al. 2000a; Gohlke, Hendlich et al. 2000b) as alternative
methods.
SuperStar calculates preferred interaction sites in proteins by mapping scatter plots or
associated propensity maps derived from composite crystal-field environments observed in
the crystal packing of small organic molecules onto active site exposed residues. Accordingly,
the SuperStar maps show experimentally observed spatial distributions of contacting groups
around one particular central functional group. SuperStar provides the option to switch
between the CSD and the PDB as origin of the structural information database (Boer et al.
2001). In this paper, only the CSD-based SuperStar maps have been used.
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 87
Figure 12. Mapping the “hot spots” of binding in the active site of human AR. To facilitate
orientation, the binding geometry of inhibitor IDD594, as determined by crystallography, is also
shown. (a) and (b) highlight favorable areas (contour level set to 5% above the global minimum in
DRUGSCORE and to a propensity level of 8 in SuperStar) for a hydrogen-bond acceptor group in a
putative ligand (red): (a) SuperStar maps using carbonyl oxygen as probe, (b) DRUGSCORE maps
using O.2 as probe. (c) to (f) highlight favorable areas for interactions with a hydrophobic group in a
putative ligand: SuperStar maps with (c) methyl group (white) and (e) aromatic CH (magenta) as
probe, DRUGSCORE maps with (d) C.3 (white) and (f) C.ar (magenta) as probes.
a b
c d
e f
Tyr48
His110
Thr113
Leu300
Trp111
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 88
DRUGSCORE is based on a knowledge-based approach. Statistical potentials are derived using
the “inverse Boltzmann principle”. The ligand-protein interface is analysed in terms of
occurance frequencies by which a particular ligand atom type is found in contact with a
protein atom type. As knowledge base for the analyses, the body of determined protein-ligand
complexes is used. To analyze the binding properties of a binding pocket, a regularly spaced
grid is imbedded. Subsequently, for different ligand atom types interaction energies are
computed by systematically placing these probe atoms to the various grid intersections. As
functional form to determine the interactions with the surrounding protein residues the
knowledge-based pair potentials of DRUGSCORE have been used. In a final step the obtained
grid values are contoured according to a predefined level above the detected global energy
minimum.
Using SuperStar, the pocket of hAR was systematically analyzed to detect favorable interaction
sites with the following functional groups: C=O (H-bond acceptor), a methyl group, and an
aromatic CH group to describe hydrophobic interactions. Using DRUGSCORE, the following
probes were applied: O.2 type oxygen (SYBYL atom type notation) as H-bond acceptor, C.3
and C.ar for hydrophobic contacts.
In Figure 12, the binding mode of IDD594 is shown together with the contour maps for an
H-bond acceptor (Figure 12a+b). For both methods, the acceptor property is indicated as a
strong contour in the region of the anion-binding pocket, where H-bonds are formed with
Tyr48, His110, and Trp111. In addition, an interaction with a ligand acceptor atom is
predicted next to Thr113. IDD594 places a bromine atom into this region.
In the case of hydrophobic interactions (Figure 12c-f), both methods predict favorable ligand
binding regions in an area next to Trp111, Thr113, Phe122, and the loop around Leu300, the
so-called specificity pocket, which is occupied by the 4-bromo-2-fluoro-benzyl portion of
IDD594. This area seems to be especially favorable for aromatic interactions. Additionally,
both methods indicate a favorable hydrophobic region close to the carboxylate of the
inhibitor.
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 89
Figure 13. Translation of ‘hot spots’ indicated in the various maps in Figure 2 into a UNITY
pharmacophore hypothesis. To facilitate orientation, the binding geometry of inhibitor IDD594 is
also shown. The positions of the pseudocenters correspond to the centers of the “hot spots”.
Spheres of adjustable size (gray) were assigned to the pseudocenters: (1) acceptor atom (O sp2, N
sp2), tolerance 0.7Å, (2) donor atom (selection see text, O in OH group, N in NH group), tolerance
0.7Å, (3) bridging atom requested for the anchor group (carbon atom in carbonic acid, hydroxamic
acid, or tetrazole; phosphorous atom in phosphonate, sulphur atom in sulphonate), tolerance 0.7Å,
(4) hydrophobic atom (not H), tolerance 1.0Å, (5) atom as member of a hydrophobic moiety,
tolerance 1.5Å, (6) atom as member of a 5- or 6-membered aromatic ring, tolerance 0.7Å.
Keeping the experimentally determined protonation state of the inhibitor IDD594 in mind, is
important to correctly translate the indicated hot spots for H-bonding properties into a
pharmacophore pattern appropriate for the planned database searches. IDD594 binds with its
deprotonated carboxylate group into the anion-binding pocket, while carboxylic acids are
stored as neutral (protonated) compounds in our precompiled database. Since we can assume
that also the carboxylic acid isosteres become deprotonated upon hAR binding, we have to
2
31
4
56
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 90
artificially define a H-bond donor site for our pharmacophore query replacing the H-bond
acceptor ‘hot spots’ in the anion-binding pocket. This procedure assures that candidate
molecules will be retrieved in correct protonation states from the precompiled database with
protonated compounds.
Translation of the indicated ‘hot spots’ for hydrophobic interactions is straightforward for
both areas, the specificity and the anion-binding pocket. Generic pharmacophore sites were
assigned to the geometric centers of the contoured ‘hot spots’. No clear cut ‘hot spot’ is
indicated in the region bridging the anion-binding pocket and the specificity pocket.
The accordingly defined pharmacophore model has been submitted to UNITY. It comprises
six pseudocenters of deviating spherical tolerances (Figure 13), each assigned to a specific
property. Three pseudocenters were used to define the position and orientation of the putative
anchor groups. Markush atoms were assigned to these centers: (1) an acceptor atom close to
Tyr48 and His110 (sp2 oxygen atom or sp2 nitrogen atom), (2) the artificially assigned donor
atom close to Trp111 (oxygen atom of an OH group or nitrogen atom of a NH group), (3) a
bridging atom to further define the anchor group (carbon atom in carboxylic acid, hydroxamic
acid, or tetrazole; phosphorous atom in phosphonate, sulphur atom in sulphonate).
One sphere (5) was assigned to describe the region favorable for hydrophobic interactions
inside the specificity pocket, a second sphere (4) was placed close to the anion-binding pocket.
An additional sphere (6) was located adjacent to sphere (5) demanding for a five- or six-
membered aromatic ring to be placed in the specificity pocket.
Based on this query, a residual set of 1261 compounds was retrieved. Among these hits, nearly
97% of the considered molecules contained a terminal carboxylic acid group. None of the
hydroxamic acids or tetrazoles were retrieved.
4.2.2.2.3 Final Docking with FLEXX
In a final step, the remaining 1261 hits from the UNITY search were docked into the binding
pocket of hAR (taking the coordinates from the complex structure with IDD594 as reference)
using FLEXX. Prior to docking, all groups anchoring to the anion-binding pocket were
deprotonated using a shell script. Docking solutions were ranked by their predicted binding
affinity using DRUGSCORE. Only the best scored binding mode of each compound was
further considered in the following steps.
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 91
In a validation step it was assessed, whether this best scored FLEXX docking solution suggests
the compound to be accommodated in a way that the previously defined pharmacophore has
been satisfied. In this step, a reduced UNITY pharmacophore, consisting of the three
previously described pseudocenters (1), (2), and (5) only (Figure 13), has been considered. This
assessment further reduced the dataset to 206 compounds. Among them were five
sulphonates. None of the retrieved phosphonates was suggested to bind in agreement with the
pharmacophore.
The impact of the molecular weight on compound selection has been mentioned in previous
studies (Muegge et al. 1999; Pegg et al. 2001). A significant dependency of DRUGSCORE on the
molecular weight has been observed in our lab (Silber 2002). With increasing size of the
candidate molecules DRUGSCORE adds an increasing number of contributions of the pair
potentials. This fact can easily exaggerate the affinity estimate of docking solutions of larger
candidate molecules. Pan et al. proposed a normalization strategy based on the total number
of heavy atoms to obtain a less biased ranking of molecules of deviating size in a relative
comparison (Pan et al. 2002). We decided to use the molecular weight and the number of
rotatable bonds as descriptors to scale the relative scoring of retrieved compounds. The score
finally used for ranking was calculated by dividing the squared DRUGSCORE contribution by
the product of the molecular weight times the number of rotatable bonds (equation 1):
equation 1 ( )
( ) ( )bonds rot. No.MWDrugScoreScore
2
∗=
A first visual inspection of the proposed binding modes generated by FLEXX revealed that
many carboxylic acids with similar topology were found among the best scored hits. To
concentrate on the best scored compounds (the top two thirds) we selected carboxylic acids
with a score better than the overall top score times 0.33 and clustered the remaining 120
compounds with respect to their UNITY 2D fingerprints. Using the Jarvis-Patrick clustering
scheme, as implemented in SYBYL, 40 clusters were produced. The best scored compound
from each such cluster was subjected to further visual inspection. In this visual inspection we
critically assessed the suggested binding conformation, the mutual surface complementarity of
ligand and protein and the possible presence of unfilled space along the protein-ligand
interface.
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 92
Finally, a subset of 9 carboxylic acids was selected for acquisition and subsequent biological
testing.
4.2.2.3 Biological Testing
4.2.2.3.1 Overproduction and purification of recombinant hAR
The ORF of the hAR gene (Accession GenBankTM
/EMBL Data Bank Number J05017) was
amplified by PCR from its cDNA and cloned into the T7 RNA polymerase-based vector
pET15b (Novagen). Expression of the (his)6-hAR in the E. coli strain BL21(DE3) (Novagen)
is induced by IPTG (Euromedex) during a 3 hours culturing at 37°C. The pellets from a 4
liters culture were disrupted by sonication and centrifuged. The supernatant was applied on a
TALON metal affinity column (Clontech). After thrombin cleavage of the hexahistidine
extension, the detagged protein was loaded on a DEAE Sephadex A-50 column (Pharmacia)
and eluted with a NaCl gradient.
4.2.2.3.2 Photometric determination of inhibitory activity
Human AR was purified as described above. The in vitro inhibitory activity of the candidate
molecules was determined by recording the decrease in the oxidation ratio of NADPH. The
absorbance at 340nm was monitored at 25°C with a BMG plate reader. The assay was
performed at 25°C in a 250µL reaction mixture of 100mM sodium phosphate buffer (pH 6.2)
which contained 0.14mM NADPH, 26.5mM D-xylose as substrate, and 0.28µM human AR
enzyme. The test compounds were assayed for their inhibition of AR at concentrations from
0.8mM to 20nM. GraFit software (1989-1999) was used to obtain the IC50 values (Table 8).
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 93
Table 8. Scoring values, predicted and experimentally determined IC50 values for the 9 compounds
discovered by virtual screening and selected for testing with hAR.
no. label
(database)
MW no. rot.
bonds
DrugScore
(∗10-3)
score# IC50
(pred.)*
[µM]
IC50
[µM]
1 BTB02809
(Maybridge) 277.24 5 -420 127 5.6 2.4±0.5
2 JFD00882
(Maybridge) 271.20 4 -412 156 11.7 4.1±1.0
3 3H-395S
(Bionet) 224.25 5 -424 160 20.4 13.0±3.9
4 2D-111
(Bionet) 233.26 4 -402 173 24.5 15.5±4.5
5 4E-334S
(Bionet) 314.26 4 -427 145 13.5 16.7±3.4
6 DP01177
(Maybridge) 247.23 5 -439 156 9.5 64.3±11.3
7 MWP00297
(Maybridge) 295.33 4 -537 244 0.2 >500
8 PD00723
(Maybridge) 273.44 5 -435 138 3.7 >500
9 11F-915
(Bionet) 280.32 3 -498 295 0.6 >500
# Score computed according to equation 1. * IC50 values have been calculated based on the
DRUGSCORE values using the scaling coefficient, which has been determined as average over
scaling factors obtained for data sets of serine proteases, metallo proteases, endothiapepsines,
and two mixed data sets (Gohlke et al. 2002b).
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 94
a) IDD594
O2N
N
ON
O
OH
NN
OS OH
O
OO2N
b) BTB02809, IC50= 2.4 ± 0.5 µM c) JFD00882, IC50= 4.1 ± 1.0 µM
Figure 14. Suggested binding mode of the two hits BTB02809 (b) and JFD00882 (c), as obtained
by docking into the binding pocket of IDD594 (a) using FLEXX and the scoring with DRUGSCORE.
The shape of the binding pocket is represented by the solvent accessible surface (green), parts
clipped off for clarity.
Tyr48
His110
Thr113
Leu300
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 95
4.2.3 Discussion
In this paper, we present a strategy for the computer screening of large compound libraries to
obtain a limited set of prospective hAR inhibitors. Our approach successfully retrieved a set of
prospective hits of which 9 were tested by enzyme kinetics. All of these compounds exhibited
a carboxylic acid as anion-binding pocket anchor. This reflects the results of our initial search,
when at an early stage the 3D pharmacophore hypothesis limited already 97% of the retrieved
compounds to carboxylic acids. The finally performed assay showed that 6 out of 9 tested
compounds exhibited activity with IC50 values in the micromolar range.
In a recent review on virtual screening, Schneider and Böhm (Schneider and Böhm 2002)
mentioned that “all docking programs and scoring functions have a tendency to generate a
significant number of false positives” and that “different scoring functions work better for
different protein-ligand complexes”. In the present virtual screening study a hit rate of 66% is
achieved considering only inhibitors with IC50 < 100 µM. Therefore, DRUGSCORE seems to be
an appropriate scoring function for the discovery of aldose reductase inhibitors. This is further
exemplified by the fact that the IC50 values of all active compounds are predicted correctly
within one logarithmic unit (Table 8 and Figure 15).
3
4
5
6
7
3 4 5 6 7
pIC50 exp.
pIC
50 d
rugs
core
Figure 15. Plot of experimental and DRUGSCORE predicted IC50 values taken from Table 8.
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 96
O2N
N
ON
O
OH
N
NO
S OH
O
OO2N
NH
S
OOH
O
N
N S OH
O
N N
S
N
OH
OF
F
F
N
ON
O
OHO
OHOO
S
CH3
OOH
NH
ON
O
OH
S
N
Figure 16. Chemical formulae of potential ARIs discovered by virtual screening.
1
5
9
3
7 8
6
4
2
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 97
In the first successful example of the discovery of novel potent inhibitors of AR following a
database search, Iwata et al. (Iwata, Arisawa et al. 2001) could identify 7 ARIs in the
micromolar range with a hit rate of 20%. They used the program ADAM&EVE to dock
compounds from the ACD into the binding pocket of AR extracted from the complex
structure with Glucose-6-phosphate (PDB code 2acq). In their database screening, Rastelli et
al. (Rastelli, Ferrari et al. 2002b) were able to discover inhibitors from other chemical classes
including sulfonic acids, nitro derivatives, sulfonamides and carbonyl derivatives. They used
the program DOCK to place molecules from the NCI database into a previously energy
minimized structural model of AR. Similarly to Iwata et al., they did not apply additional filter
steps and achieved a hit rate of ~20%. The higher hit rate achieved in our study compared to
the previous studies can be attributed to the more restrictive search criteria applied. Trade-off
for this rather satisfying hit rate is the sole retrieval of carboxylic acids as AR inhibitors.
However, applying a very similar strategy, we could succeed with even higher hit rates for
carbonic anhydrase (Grüneberg, Stubbs et al. 2002) and tRNA-guanine-transglycosylase
(Brenk et al. 2003; Meyer et al. 2002).
Nevertheless, it has to be mentioned that also a few false positives appeared in our retrieval.
Our approach is not entirely capable to discriminate true hits from non-binders (compounds 7
- 9). Can we collect some evidence to explain these findings? Obviously, the non-binders are
less flexible than the true hits (Figure 16), e.g. in compound 7 and 9 the carboxylate group is
directly connected to an adjacent phenyl ring, whereas in IDD594 there is a oxymethylene
spacer between the carboxylate group and the aromatic ring. Our pharmacophore hypothesis
comprises two main anchoring points for inhibitors in the hAR active site. One is the anion-
binding pocket where the carboxylate group binds, the second coincides with an area in the
hydrophobic specificity pocket where aromatic ring systems are stacked between Trp111 and
Leu300. The lack of affinity of 7 and 9 might be attributed to the conformationally restricted
bridge between the carboxylate group and the terminal aromatic moiety not allowing for
optimal placement of both anchoring groups. In the case of compound 8 an unbalanced H-
bond inventory might be responsible for the non-detectable binding affinity. The NH and
C=O of the amide group and the pyridine nitrogen are likely to be involved in hydrogen
bonding in aqueous solution prior to complex formation. However, in the suggested binding
mode all functional groups become desolvated and do not find an appropriate H-bonding
partner at the binding site to compensate for this loss in the overall H-bonding inventory.
The aim of the study was to identify lead compounds which are able to bind to hAR with a
binding mode similar to that of IDD594. As a subsequent step, the suggested binding modes
Datenbanksuche basierend auf IDD594-Bindungsmodus 98
have to be confirmed by crystallography. However, first trials to co-crystallize the discovered
hits with human AR have not been successful yet.
Can we expect the database compounds to have similar inhibitory activity as IDD594? We
discovered inhibitors in the micromolar range, the best inhibitors possessing IC50 values of
2.5µM and 4.0µM. Accordingly, they are much weaker binders compared to IDD594. This in
not surprising, since our filter steps were set such to select lead-like compounds, which, due to
their reduced size, can only form a reduced number of contacts to the target protein and thus
exhibit weaker activity (Oprea et al. 2001).
As mentioned before, there is evidence for an interaction between the Br atom of IDD594
and the oxygen of Thr113. This interaction has been identified as a key feature for the specific
inhibition of hAR by IDD594 (Howard, Sanishvili et al. submitted). The generated docking
solutions suggest that the two micromolar inhibitors BTB02809 and JFD00882 place a nitro
group next to Thr113 in an orientation rather similar to the Br atom (Figure 14). This
indicates a possible interaction between these nitro groups and Thr113. Further testing has to
show whether the new inhibitors are specific hAR inhibitors.
4.2.4 Conclusions
The present study is the first successful example of a virtual screening of inhibitors for hAR
based on the crystal structure determined with a potent and specific AR inhibitor. Applying a
number of consecutive hierachical filters, the ACD database was screened using the
conformation of AR adopted in the complex with IDD594. This search resulted in the
discovery of 6 inhibitors with IC50 values in the micromolar range. Considering the rather
small number of 9 compounds selected for testing a hit rate of 66% of active compounds
demonstrates the high success rate of our approach.
Datenbanksuche unter Berücksichtigung multipler Bindungsmodi 99
4.3 Datenbanksuche unter Berücksichtigung multipler Bindungsmodi
Wie in Kapitel 1.1 beschrieben, dient als Startpunkt für eine virtuelle Datenbanksuche die 3D-
Struktur des Ziel-Proteins, da das Verständnis der strukturellen Eigenschaften des Ziel-
Proteins eine wesentliche Voraussetzung für den Erfolg dieses Ansatzes ist. Bei der Mehrheit
der bislang publizierten Arbeiten wurde dieser Ansatz bei Proteinen mit rigiden Bindetaschen,
deren Form sich bei der Ligandbindung nicht verändert, angewendet. Da die Bindetasche der
Aldose Reduktase eine ausgeprägte Flexibilität zeigt (Kapitel 3.2), weicht sie deutlich von
einem solchen, einfach vorzusagenden Verhalten ab.
Nachdem die in Kapitel 4.2 beschriebene Datenbanksuche auf eine der experimentell
beobachteten Proteinkonformationen der Aldose Reduktase beschränkt worden war, soll nun
untersucht werden, inwieweit es möglich ist, die Flexibilität des Rezeptors bei der virtuellen
Suche nach neuen Inhibitoren der Aldose Reduktase zu berücksichtigen. Im Laufe der letzten
Jahre sind erste Methoden entwickelt worden, um die Rezeptorflexibilität im Rahmen des
Molecular Modeling zu berücksichtigen (Carlson 2002a; Carlson 2002b; Carlson and
McCammon 2000; Halperin, Ma et al. 2002), wobei die verschiedenen Ansätze von der
Berücksichtigung verschiedener Seitenketten-Konformationen hin bis zu der Simulation der
Bewegung von ganzen Domänen reichen. Da zu Beginn dieser Arbeit keine dieser Rezeptor
basierenden Methoden zur Verfügung stand, wurde ein Ligand basierender Ansatz gewählt.
4.3.1 Ligand basierender Ansatz
Gemäß dem von Erwin Fischer postulierten „Schlüssel-Schloss-Prinzip“ ist ein Ligand ein
Abbild des Rezeptors, an den er bindet. Nach der in Kapitel 1.2 vorgestellten Theorie zum
Auftreten unterschiedlicher Proteinkonformationen bei der Bindung verschiedener Liganden
(induced-fit), selektiert jeder Ligand die für seine Bindung günstigste Proteinkonformation.
Dementsprechend sollte es möglich sein, durch die Vereinigung mehrerer Liganden, deren
verschiedene Bindungsmodi bekannt sind, zu einem Abbild der entsprechenden
Proteinkonformationen zu kommen. Die Auswahl der Liganden sollte so erfolgen, dass die
Vielzahl möglicher Proteinkonformationen und damit die Flexibilität des Rezeptors
ausreichend repräsentiert werden.
Die Komplexstrukturen der Aldose Reduktase mit Sorbinil, Tolrestat und Zopolrestat zeigen
abweichende Konformationen der Aminosäuren in der Bindetasche (vgl. Kap. 3.2 und 4.1).
Während der Inhibitor vom Spirohydantoin-Typ Sorbinil an das im Vergleich zum Holo-
Enzym nahezu unveränderte Protein bindet, besetzen die beiden Carbonsäuren Tolrestat und
Zopolrestat hydrophobe Spezifitätstaschen, die im Holo-Enzym nicht ausgebildet sind.
Datenbanksuche unter Berücksichtigung multipler Bindungsmodi 100
Allerdings treten auch für die beiden letzteren Inhibitoren Unterschiede im Bindungsmodus
der aromatischen Baugruppen auf.
Für die im Anschluss beschriebene Suche nach neuen Inhibitoren der Aldose Reduktase
wurden die Inhibitoren Sorbinil, Tolrestat und Zopolrestat unter Beibehaltung aller Atome zu
einer Referenzstruktur vereinigt. Im Rahmen der Datenbanksuche wurden dann die
Kandidatenmoleküle aus der Datenbank paarweise mit dem Programm SEAL (Klebe et al.
1994) auf diese Referenz überlagert. Das Konzept ist in Abbildung 11 dargestellt.
Datenbank
Überlagerung
Abbildung 11. Konzept der Ligand basierenden Datenbanksuche.
Das Programm SEAL verwendet Gauss-Funktionen zur Repräsentation der
physikochemischen Eigenschaften der zu überlagernden Moleküle. Eine Vereinigung unter
Beibehaltung aller Atome entspricht in dieser mathematischen Darstellung einer logischen
Oder-Verknüpfung der physikochemischen Eigenschaften. Bereiche, in denen alle vereinigten
Moleküle gleiche physikochemische Eigenschaften zeigen, werden hervorgehoben. Die
Verwendung der vereinigten Inhibitoren Sorbinil, Tolrestat und Zopolrestat als Referenz für
die SEAL-Überlagerung impliziert demnach die Erstellung eines Pharmakophors.
Vor der Verwendung im Rahmen der Datenbanksuche (s. nächster Abschnitt), wurde
zunächst getestet, ob der Ansatz in der Lage ist, experimentell beobachtete Bindungsmodi zu
reproduzieren. Dazu wurde ein Testdatensatz aus Verbindungen, deren Komplexstrukturen
mit Aldose Reduktase bekannt sind, zusammengestellt (s. Tabelle 5).
Datenbanksuche unter Berücksichtigung multipler Bindungsmodi 101
Tabelle 5. Verbindungen des Testdatensatzes. Angegeben sind der Name der Verbindung, die
Strukturformel und der PDB-Code der entsprechenden Kristallstruktur.
Name Strukturformel PDB
Sorbinil NH
NH
O
O
O
F
1ah0
Tolrestat
N SHOOC
CF3
O
1ah3
IDD594 FO
OH
O
NH
SF
Br
Unveröf-
fentlicht
IDD384 O
NH
SNH
OO
O
OH
1el3
Fidarestat NH
NH
O
O
O
F
CONH2
1ef3
Zenarestat N
N
O
HOOC
ClOBr
F
1iei
Zopolrestat
CF3
N
S
NN
O
HOOC
1mar
Jede Verbindung des Testdatensatzes wurde paarweise auf die Referenzstruktur überlagert.
Die rms-Abweichungen zwischen den von SEAL berechneten Lösungen und dem
kristallographisch bestimmten Bindungmodus wurden berechnet. In Tabelle 6 sind die Werte
für die (anhand des Ähnlichkeitsmaßes) als am besten bewertete Lösung und die Lösung mit
der kleinsten rms-Abweichung angegeben.
Datenbanksuche unter Berücksichtigung multipler Bindungsmodi 102
Tabelle 6. Berechnete rms-Abweichungen (in Å) zwischen den kristallographisch bestimmten
Konformationen und den mit SEAL erhaltenen Lösungen. Sowohl die rms-Abweichung für die
Lösung auf Rang eins (höchstes Ähnlichkeitsmaß) als auch für die beste Lösung (mit der kleinsten
Abweichung) sind angegeben. Die Verbindungen des Testdatensatzes wurden auf die vereinigten
Inhibitoren Sorbinil, Tolrestat und IDD594 überlagert.
Rang 1 Beste Lösung Inhibitor
rmsd [Å] rmsd [Å] Rang
Sorbinil 0,94 0,94 1
Tolrestat 0,50 0,50 1
IDD594 1,49 1,49 1
IDD384 8,92 8,09 6
Fidarestat 1,62 0,75 3
Zenarestat 1,61 0,59 2
Zopolrestat 0,94 0,84 2
Es zeigt sich, dass SEAL für alle Inhibitoren, mit Ausnahme des Inhibitors IDD384, bereits auf
Rang eins eine Lösung findet, die um weniger als 2 Å von dem experimentellen
Bindungsmodus abweicht. Zudem findet sich die Lösung mit der geringsten rms-Abweichung
in drei von sieben Fällen auf Rang eins.
Bei dem Inhibitor IDD384 werden die Grenzen des Ansatzes deutlich. Der experimentelle
Bindungsmodus von IDD384 kann nicht reproduziert werden. Der Grund dafür ist, dass kein
Stellvertreter für diesen Bindungsmodus in der vereinigten Referenzstruktur enthalten ist.
Ohne dass dieser von den anderen drei Liganden völlig abweichende Bindungsmodus in der
vereinigten Referenzstruktur aufgenommen wird, kann der SEAL-Überlagerungsansatz keine
sinnvolle Lösung liefern. Dies ist in Abbildung 12 veranschaulicht. Die Betrachtung der von
SEAL am besten bewerteten Überlagerung von IDD384 mit der Referenz zeigt, wie wichtig es
ist, folgende Kriterien zu überprüfen:
• Korrekte Orientierung der terminalen funktionellen Gruppe in der Anionen-Bindetasche,
um Ausbildung der essentiellen Wasserstoffbrückenbindungen (zu Tyr48, His110 und
Trp111) zu ermöglichen.
• Vermeidung ungünstiger (intramolekularer) Torsionswinkel.
Wie bei IDD384 leicht zu erkennen ist, kommt es zur Einstellung ungünstiger Torsionswinkel,
wenn das zu überlagernde Molekül eine größere räumliche Ausdehnung hat als die Referenz.
Datenbanksuche unter Berücksichtigung multipler Bindungsmodi 103
Um solche Schwierigkeiten einzudämmen, wurde bei der folgenden Datenbanksuche das
maximal zulässige Molekulargewicht der Datenbankverbindungen begrenzt.
Abbildung 12. Links: SEAL-Überlagerung des Inhibitors IDD384 (gefärbt nach Atomtypen) auf die
zur Referenz vereinigten Inhibitoren Sorbinil, Tolrestat und Zopolrestat (grün). Gezeigt ist die am
besten (höchstes Ähnlichkeitsmaß) bewertete Konformation. Rechts: Kristallographisch bestimmter
Bindungmodus des Inhibitors IDD384 (gefärbt nach Atomtypen). Zum Vergeich ist auch die
Referenz (grün) gezeigt.
4.3.2 Durchführung der Datenbanksuche
Alle bekannten AR-Inhibitoren besitzen eine polare funktionelle Gruppe, die in der Lage ist,
in die Anionen-Bindetasche, die von Tyr48, His110, Trp111 und dem Kofaktor NADP+
ausgebildet wird, zu binden. Dementsprechend wurde von den Kandidatenmolekülen
verlangt, eine der folgenden terminalen funktionellen Gruppe aufzuweisen: Carbonsäure,
Säureamid oder Hydantoin. Mit UNITY wurde anhand dieses Konnektivitäts-Kriteriums die
Maybridge Datenbank mit etwa 60.000 Molekülen durchsucht. Zusätzlich wurden mit dem
SYBYL-Modul SELECTOR alle Verbindungen mit einem Molekulargewicht > 350 D und mehr
als vier drehbaren Bindungen entfernt.
Mit den etwa 2700 Verbindungen, die diese Anforderungen erfüllten, wurde im Anschluss
eine flexible 3D-Suche mit UNITY durchgeführt. Aufgrund der konformativen Flexibilität der
AR-Bindetasche wurde eine Pharmakophor-Hypothese aus der Überlagerung der Inhibitoren
Sorbinil, Tolrestat und Zopolrestat abgeleitet. Die verwendete UNITY-Suchanfrage ist in
Abbildung 13 dargestellt. Die alternative Besetzung der verschiedenen Spezifitätstaschen,
wurde durch Verwendung der partial match-Option in UNITY berücksichtigt. Dabei wird die
Besetzung nur einer der beiden hydrophoben Sphären 5 und 6 des UNITY-Pharmakophors
Datenbanksuche unter Berücksichtigung multipler Bindungsmodi 104
verlangt. Um des Weiteren Überschneidungen mit dem Protein zu vermeiden, wurden eine
Reihe verbotener Bereiche (excluded volumes) definiert, die die Solvens-zugängliche Oberfläche
der Aldose Reduktase im Bereich der rigiden Anionen-Bindetasche nachahmen.
Abbildung 13. Ligand basierende Pharmakophor-Hypothese. Die überlagerten Inhibitoren Sorbinil,
Tolrestat und Zopolrestat sowie einige Aminosäuren des Proteins sind zur Verdeutlichung
dargestellt. Sphären variabler Größe, entsprechend der Suchtoleranz, wurden den verschiedenen
Pseudozentren zugewiesen. Donorgruppen (1, NH oder OH, Toleranz 0,7 Å) sind blau eingefärbt,
Akzeptorgruppen (2, C=O, Toleranz 0,7 Å) rot. Hydrophobe Gruppen (4-6, Toleranz 1,5 Å) sind
gelb markiert, wobei die Sphären 5 und 6 alternativ zu besetzen sind. Innerhalb der Sphäre 3
(Toleranz 1,0 Å) wird ein Nicht-Wasserstoff-Atom verlangt (C, N, P, O oder S).
In der Folge wurden die verbliebenen 150 Verbindungen paarweise mit SEAL flexibel auf die
zur Referenz vereinten Inhibitoren Sorbinil, Tolrestat und Zopolrestat überlagert. Die
vorgeschlagenen Lösungen wurden anhand des Ähnlichkeitsmaßes in eine Reihenfolge
gebracht. Für die jeweils am besten bewertete Lösung wurde überprüft, ob die jeweilige
terminale funktionelle Gruppe im Einklang mit dem zuvor definierten Pharmakophor in der
Anionen-Bindetasche platziert wurde (nur die Sphären 1 und 2 wurden verwendet). Abbildung
14 gibt einen Überblick über den Ablauf der Datenbanksuche.
Tyr48
His110
Trp111
1
2
3
4
5
6
Datenbanksuche unter Berücksichtigung multipler Bindungsmodi 105
75 Verbindungen
VisuelleInspektion
150 Verbindungen
SEAL-Überlagerung +Pharmakophor-Vergleich
2.700 Verbindungen
3D-Suche:Unity-Pharmakophor
~60.000 Verbindungen
2D-Suche: Kopfgruppen, MW,Anzahl drehbarer Bindungen
Abbildung 14. Schematische Darstellung des Ablaufs der virtuellen Datenbanksuche.
Nach visueller Inspektion der verbliebenen 75 Verbindungen wurden schließlich vier
Verbindungen käuflich erworben und auf ihre Affinität überprüft. Tabelle 7 zeigt die
getesteten Verbindungen und die entsprechenden IC50-Werte.
Datenbanksuche unter Berücksichtigung multipler Bindungsmodi 106
Tabelle 7. Strukturformeln und experimentell bestimmte IC50-Werte der vier Verbindungen, die bei
der Datenbanksuche entdeckt wurden.
Bezeichnung Strukturformel IC50 [µM]
RJC00316 S
N2
4
OOO
18,0 ± 2,5
SEW00809 N
OHO
OCF3
44,6 ± 5,8
DFP00359 N
OHO
OO
88,3 ± 8,5
SPB02727 S
N
OHO
F
F
~ 200
Datenbanksuche unter Berücksichtigung multipler Bindungsmodi 107
4.3.3 Diskussion
Die hier präsentierte Strategie zur Suche in virtuellen Datenbanken basiert auf der
Überlagerung bekannter Inhibitoren der Aldose Reduktase. In einem der Filterschritte wurde
die Vereinigung dieser Inhibitoren als Referenz für die paarweise Überlagerung der
Datenbankverbindungen mit dem Programm SEAL verwendet. Mit diesem Konzept konnten
vier potentielle Inhibitoren identifiziert werden, die in einem Enzymassay auf ihre biologische
Aktivität überprüft wurden. Bei allen ausgewählten Verbindungen handelt es sich um
Carbonsäuren. Kein Carbonsäureamid oder Hydantoin konnte in der Maybridge Datenbank
gefunden werden, das in der Lage war, die UNITY Pharmakophor-Hypothese zu erfüllen. Bei
dem Enzymassay wurde für drei der vier getesteten Verbindungen ein IC50-Wert im
zweistelligen mikromolaren Bereich bestimmt.
Als aktivste Verbindung stellte sich (4-Oxo-2-phenyl-3,4-dihydro-2H-benzo[b][1,4]thiazepin-
5-yl)-essigsäure (RJC00316) mit einem IC50-Wert von 18 ± 2 µM heraus. Diese Verbindung
weist an dem Kohlenstoff C2 ein stereogenes Zentrum auf. Bei der getesteten Substanzprobe
handelte es sich um das Racemat. Es ist fraglich, ob eines der beiden Enantiomere bevorzugt
an Aldose Reduktase bindet. Falls eine Selektion durch das Enzym stattfindet, könnte die
Kokristallisation der humanen Aldose Reduktase mit dem Racemat eine Antwort auf diese
Frage geben. Erste Kristallisationsversuche laufen zur Zeit. Des Weiteren wird versucht, die
beiden Enantiomere durch Umsetzung mit einem chiralen Auxiliar und fraktionierende
Kristallisation zu trennen.
Ein Schwachpunkt des vorgestellten Konzepts zur virtuellen Datenbanksuche liegt sicherlich
in der aufwendigen visuellen Inspektion und der schwierigen Beurteilung der von SEAL
vorgeschlagenen Konformationen. Während der Suche wird die Form des Rezeptors nur über
die Definition von verbotenen Bereichen ansatzweise berücksichtigt, Informationen über
gerichtete Wechselwirkungen zwischen Ligand und Rezeptor fehlen. Dennoch konnte mit
RJC00316 ein Inhibitor identifiziert werden, dessen Affinität nur unwesentlich geringer ist als
die der besten Verbindungen aus der in Kapitel 4.2 präsentierten Datenbanksuche. Hinzu
kommt, dass der Inhibitor RJC00316, dessen Struktur formale Ähnlichkeit zu anderen
psychopharmakologisch wirksamen Benzothiazepinen aufweist, bei der in Kapitel 4.2
beschriebenen Datenbanksuche nicht gefunden werden konnte, da die dort verwendete
Pharmakophor-Hypothese auf die Besetzung der IDD594-Spezifitätstasche ausgerichtet war.
Interessant ist auch, dass mit dem hier beschriebenen Ansatz aktive Verbindungen gefunden
werden konnten, bei denen die Säurefunktion direkt an einem Carbozyklus sitzt oder nur
Datenbanksuche unter Berücksichtigung multipler Bindungsmodi 108
durch eine Methylengruppe von diesem getrennt ist. Bei der Suche nach Inhibitoren für die
IDD594-Bindetasche waren solche Verbindungen als inaktiv aufgefallen. Eine verminderte
konformative Flexibilität in diesem Bereich der Moleküle scheint bei den hier getesteten
Verbindungen keine negativen Auswirkungen auf die Affinität zu haben. Dies liegt vermutlich
an dem Fehlen von Gruppen, die tief in eine der Spezifitätstaschen binden. Mit der hier
präsentierten Strategie war aufgrund der aufwendigen visuellen Inspektion nur die Suche in
der recht kleinen Maybridge Datenbank praktisch durchführbar. Darin mag das Fehlen von
noch affineren Verbindungen, ebenso wie die ausschließliche Identifikation von Carbonsäuren
als potentielle Inhibitoren, begründet sein.
Das von dem Programm SEAL berechnete Ähnlichkeitsmaß der überlagerten
Datenbankverbindungen zu der Referenzstruktur (den vereinten bekannten Inhibitoren) bietet
eine nur indirekte Grundlage für die Bewertung der Datenbankverbindungen. Somit fehlt in
dem beschriebenen Ansatz bislang ein Filterschritt, der eine direkte Abschätzung der
Bindungsaffinität (scoring) der Datenbankverbindungen erlaubt.
Quantitative Modelle von Struktur-Wirkungsbeziehungen (QSAR) bekannter Inhibitoren
bieten prinzipiell die Möglichkeit zur Vorhersage der Affinität neuer Verbindungen.
Grundlage für ein 3D-QSAR-Modell ist die Überlagerung der Inhibitoren. Mit dem hier
beschriebenen Ansatz wurde ein Trainingsdatensatz von 39 AR-Inhibitoren überlagert.
Anschließend wurde mit dem CoMSIA-Ansatz ein QSAR-Modell erstellt (Krämer et al. 2001).
Dieses Modell sollte in der Folge zur Beurteilung der Kandidatenmoleküle aus der
beschriebenen Datenbanksuche verwendet werden. Dabei zeigte sich allerdings, dass das
QSAR-Modell nicht in der Lage ist, die experimentell bestimmten Affinitäten der getesteten
Datenbankverbindungen vorherzusagen. Bei Verbindungen, die denen des Trainings-
datensatzes sehr unähnlich sind, versagt das Modell.
Ein weiterer Rezeptor basierender Filterschritt wäre wünschenswert, da (1) die Auswahl durch
visuelle Inspektion sehr aufwendig ist und (2) bei anderen Arbeiten gute Erfahrungen mit der
Kombination von Ligand basierenden und Rezeptor basierenden Filterschritten gemacht
wurden (Grüneberg et al.). Im Bereich des Struktur basierenden Wirkstoffdesigns sind in
letzter Zeit vermehrt Methoden entwickelt worden, die multiple Proteinstrukturen verwenden,
um die Flexibilität des Rezeptors zu beschreiben. Dieses Konzept nutzt auch das Programm
FLEXE (Claussen, Buning et al. 2001). Es vereint Proteinkonformationen, die entweder aus
experimentellen Daten (Kristallstrukturen, NMR) entnommen oder mit dem Computer
generiert werden, zu einer Rezeptorbeschreibung. Dabei werden die im Ensemble vertretenen
Alternativen zu neuen Proteinkonformationen kombiniert.
Datenbanksuche unter Berücksichtigung multipler Bindungsmodi 109
Um FlexE zu testen, wurde erneut der zuvor beschriebene Testdatensatz verwendet. Das
Ensemble bestand aus den Komplexstrukturen der Aldose Reduktase mit den Inhibitoren
Sorbinil (1ah0), Tolrestat (1ah3) und IDD594. Die Verbindungen des Testdatensatzes wurden
sowohl in die vereinte Rezeptorbeschreibung, als auch in die einzelnen Proteinstrukturen des
Ensembles eingepasst (crossdocking). Zur Bewertung wurde die modifizierte Böhm-Funktion
verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 und Tabelle 9 zusammengefasst.
Es zeigt sich, dass FLEXE in der derzeitigen Version nicht in der Lage ist, die experimentellen
Kristallstrukturen mit rms-Abweichungen < 2Å zu reproduzieren. Nur für die Inhibitoren
Sorbinil und Fidarestat gelingt dies auf Platz eins. Zieht man auch hintere Ränge in Betracht,
was im Rahmen einer Suche in großen Datenbanken aber kaum möglich ist, dann gelingt dies
immerhin in vier von sieben Fällen. Dennoch sind die Ergebnisse des hier durchgeführten
crossdockings wesentlich schlechter, als die von H. Claussen (Claussen, Buning et al. 2001)
publizierten Ergebnisse. Dort wurde allerdings anstatt der IDD594-Kristallstruktur ein Modell
der Kristallstruktur mit dem Inhibitor Zopolrestat verwendet. Dies mag ein Hinweis darauf
sein, dass die Auswahl der Kristallstrukturen für das Ensemble ein kritischer Punkt für den
Erfolg dieses Ansatzes ist. Aufgrund dieser Schwierigkeiten scheint die Verwendung von
FLEXE auf dem derzeitigen Entwicklungsstand für eine virtuelle Datenbanksuche wenig
aussichtsreich. Anzumerken bleibt allerdings, dass das verwendete Ensemble auf lediglich drei
Proteinstrukturen begrenzt war. Möglicherweise können bessere Ergebnisse bei Verwendung
eines größeren Ensembles, angereichert mit weiteren Proteinkonformationen (z.B. aus den
MD-Simulationen), erreicht werden. Auch die Verwendung einer anderen Scoring-Funktion
könnte zu einer Verbesserung der Ergebnisse führen.
Datenbanksuche unter Berücksichtigung multipler Bindungsmodi 110
Tabelle 8. rms-Abweichungen (in Å) zwischen den kristallographisch bestimmten Konformationen
und den mit FLEXX erhaltenen Lösungen auf Platz eins (höchste Bewertung). Die Verbindungen
des Testdatensatzes wurden sowohl in die United Receptor Description (Ensemble), als auch in
die einzelnen Proteinstrukturen des Ensembles (1ah0, 1ah3, hAR⋅IDD594) eingepasst.
Inhibitor Ensemble 1ah0 1ah3 hAR⋅IDD594
Sorbinil 1,75 7,50* 2,06 1,68
Tolrestat 6,81 7,06 1,91 3,18
IDD594 7,27 6,61 4,67 1,08
IDD384 7,99 6,23 5,68 3,08
Fidarestat 1,94 8,48 11,16 1,93
Zenarestat 7,28 7,37 5,17 0,84
Zopolrestat 9,74 8,34 7,72 0,90
* Bei Verwendung einer manuellen Basisfragment-Platzierung anhand der Referenzstruktur wird
eine rms-Abweichung von 1,05 Å erhalten.
Tabelle 9. Geringste rms-Abweichungen (in Å) zwischen den kristallographisch bestimmten
Konformationen und den mit FLEXX erhaltenen Lösungen. Die Platzierung der jeweiligen Docking-
Lösung ist in Klammern angegeben. Die Verbindungen des Testdatensatzes wurden sowohl in die
United Receptor Description (Ensemble), als auch in die einzelnen Proteinstrukturen des
Ensembles (1ah0, 1ah3, hAR⋅IDD594) eingepasst.
Inhibitor Ensemble 1ah0 1ah3 hAR⋅IDD594
Sorbinil 1,18 (6) 6,35 (23)* 1,22 (2) 1,51 (2)
Tolrestat 4,43 (9) 4,31 (17) 0,48 (2) 2,83 (14)
IDD594 4,54 (180) 4,56 (224) 2,79 (156) 1,08 (1)
IDD384 1,82 (171) 4,04 (419) 3,23 (172) 2,02 (140)
Fidarestat 1,94 (1) 5,97 (301) 5,07 (15) 1,82 (8)
Zenarestat 2,11 (232) 5,48 (426) 3,65 (248) 0,78 (14)
Zopolrestat 6,68 (63) 6,79 (130) 6,40 (113) 0,90 (1)
• Bei Verwendung einer manuellen Basisfragment-Platzierung anhand der Referenzstruktur wird
auf Platz eins eine rms-Abweichung von 1.05 Å erhalten.
Optimierung des Inhibitors RJC03373 111
4.4 Optimierung des Inhibitors RJC03373
Bei der im vorherigen Kapitel beschriebenen Datenbanksuche hat sich die Verifizierung der
mit dem Programm SEAL (Klebe, Mietzner et al. 1994) vorhergesagten Konformation als
wichtiger Filterschritt herausgestellt. Dabei wurde überprüft, ob die vorhergesagte
Konformation im Einklang mit der Pharmakophorhypothese steht. Nur Verbindungen, die
dieses Kriterium erfüllten, wurden dann einer visuellen Inspektion unterzogen. Dabei fiel auf,
dass der aus einer vorangegangenen Diplomarbeit (Krämer 1999) bekannte schwache
Inhibitor RJC03373 (IC50 = 0,1 mM) dieses Filterkriterium nicht erfüllen konnte.
Abbildung 15. SEAL-Überlagerung des Inhibitors RJC03373 (links) auf die zu einer Referenz
vereinigten Inhibitoren Sorbinil, Tolrestat und Zopolrestat (rechts). Gezeigt ist die am besten
(höchstes Ähnlichkeitsmaß) bewertete Konformation.
Bei der Betrachtung der am besten bewerteten (höchstes Ähnlichkeitsmaß) Konformation
erkennt man, dass die Carboxylat-Gruppe des Inhibitors nicht optimal auf die Referenz
platziert wird. Da die Orientierung dieser Gruppe in der Anionen-Bindetasche kritisch ist
(siehe Kapitel 4.2.3), wurde vermutet, dass eine Veränderung der relativen Stellung der
Carboxylat-Gruppe zum Benzimidazol-2-ylmethyl-Substituenten und die Einführung eines
spacers zwischen Benzolring und Carboxylat-Gruppe eine Verbesserung der Affinität bewirken
könnten.
Optimierung des Inhibitors RJC03373 112
Zur Synthese3 der entsprechenden Derivate wurde die Phillips-Reaktion (Phillips 1928;
Preston 1974) angewendet (s. Schema 1). Die eingesetzten Carboxymethyl-benzoesäuren, –
phenole und -phenylessigsäuren waren bis auf 3-Carboxymethyl-benzoesäure kommerziell
erhältlich. 3-Carboxymethyl-benzoesäure war in einer 4-stufigen Synthesefolge (Richter et al.
1974) ausgehend von 3-Cyano-benzaldehyd zugänglich.
Durch eine Phenolether-Kupplung und anschließende alkalische Ester-Spaltung konnten die
Derivate HD04 und HD05 ausgehend von den mittels der Phillips-Reaktion erhaltenen (1H-
Benzimidazol-2-ylmethyl)-phenolen synthetisiert werden (s. Schema 2).
NH2
NH2
HOOC R NH
NH
R
Cl
5N HCl150-170°C / 3h(Autoklav)
-2H2O+
+
R = COOH, CH2COOH, OH
Schema 1. Phillips-Reaktion.
NH
NH
Cl
N
NH
NH
NH
Cl
+ + ICH2COOCH3
2 KOC(CH3)3
tert. BuOH20°C
HD04: R1=H, R2=OHHD05: R1=OH, R2=H
R1
R2
R3
R4
HD04: R3=H, R4=OCH2COOCH3HD05: R3=OCH2COOCH3, R4=H
+
R5
R6
HD04: R5=H, R6=OCH2COOHHD05: R5=OCH2COOH, R6=H
1) KOH 5%
2) HCl 5N
Schema 2. Phenolether-Kupplung und anschließende alkalische Ester-Spaltung.
3 Die Synthese der nachfolgend beschriebenen Derivate wurde von H.D. Gerber (Universität Marburg) durchgeführt.
Optimierung des Inhibitors RJC03373 113
Tabelle 10. Inhibitor RJC03373 und Derivate mit IC50 Werten.
Code Name (IUPAC) Strukturformel IC50 [µM]
RJC03373 2-(1H-Benzimidazol-2-
ylmethyl)-benzoesäure N
N
OO
100 ± 16
HD01 3-(1H-Benzimidazol-2-
ylmethyl)-benzoesäure N
NO
O
3200 ± 400
HD02 [2-(1H-Benzimidazol-2-
ylmethyl)-phenyl]-essigsäure N
N
O
O
1100 ± 200
HD03 [3-(1H-Benzimidazol-2-
ylmethyl)-phenyl]-essigsäure N
N
OO
42,3 ± 10,8
HD05 [2-(1H-Benzimidazol-2-
ylmethyl)-phenoxy]-essigsäure N
NO
O
O
43,0 ± 9,0
HD04 [3-(1H-Benzimidazol-2-
ylmethyl)-phenoxy]-essigsäureN
NO
O
O
3,4 ± 0,6
Optimierung des Inhibitors RJC03373 114
In Tabelle 10 sind die Strukturformeln der synthetisierten Derivate und die experimentell
ermittelten IC50 Werte (siehe Kapitel 6.1) angegeben. Während der Wechsel von der ortho- in
die meta-Position zunächst zu einem drastischen Aktivitätsverlust führte (HD01), zeigte die
Einführung einer Methylen- bzw. einer Oxymethylen-Gruppe als spacer den gewünschten
Effekt. Bei den Derivaten mit einer solchen Gruppe stellte sich tatsächlich jeweils die meta-
substituierte Verbindung (HD03, HD04) als die aktivere im Vergleich zur entsprechenden
ortho-substituierten Verbindung (HD02, HD05) heraus. Die Verbindung mit der höchsten
Affinität ist [3-(1H-Benzimidazol-2-ylmethyl)-phenoxy]-essigsäure. Mit einem IC50 Wert von
3,4 ± 0,6 µM ist sie etwa um einen Faktor 30 affiner als die Ausgangsverbindung RJC03373.
Eine Erklärung der beobachteten Trends anhand der Modeling-Ergebnisse ist nicht möglich.
Überlagert man die Derivate mit SEAL auf die Referenz, dann wird in allen Fällen eine
Konformation vorgeschlagen, die die Pharmakophor-Hypothese erfüllt. Auch die vergebenen
Ähnlichkeitsmaße erlauben keine Differenzierung.
Ein besseres Verständnis wurde erst durch die Bestimmung der Kristallstruktur des Derivates
HD04 im Komplex mit humaner Aldose Reduktase ermöglicht (s. nächstes Kapitel).
Kristallstruktur der hAR im Komplex mit dem Inhibitor HD04 115
4.5 Kristallstruktur der hAR im Komplex mit dem Inhibitor HD04
Humane Aldose Reduktase wurde aus E.coli exprimiert und bei 4 °C (nach dem seeding bei
24 °C) aus Ammoniumcitrat-Puffer (120 mM, 20% PEG 6000, pH 5,0) zusammen mit
NADP+ und dem Inhibitor HD04 kokristallisiert. Der Datensatz wurde bei –196 °C an der
Synchrotron Lichtquelle Schweiz (SLS) des Paul Scherrer Instituts (Villigen, Schweiz)
gesammelt. Reflexe konnten bis zu Beugungswinkeln, die einer Auflösung von 1,30 Å
entsprechen, beobachtet werden. Die Daten wurden mit HKL2000 (Otwinowski et al. 1997)
prozessiert und skaliert4. Die Struktur von hAR im Komplex mit dem Inhibitor IDD384
(PDB-Code 1el3) wurde als Startstruktur für die Verfeinerung verwendet. Bei der ersten
Verfeinerung mit dem CNS-Paket (Brünger et al. 1998) wurden eine rigid-body und eine
simulated-annealing Minimierung durchgeführt. Sowohl der Inhibitor als auch ein Citrat-Molekül
waren eindeutig in der Fo-Fc-Elektronendichte zu sehen und konnten problemlos eingepasst
werden (vgl. Abbildung 16).
Abbildung 16. Blick in die Bindetasche der hAR im Komplex mit dem Inhibitor HD04. Der Inhibitor
ist zusammen mit der 2Fo-Fc Elektronendichte dargestellt. Ebenfalls innerhalb dieser
Elektronendichte dargestellt sind das benachbarte Citrat-Molekül und mehrere Wassermoleküle.
His110
Trp111
Leu300
Tyr48
Citrat
HD04
Wat1
Wat2
Kristallstruktur der hAR im Komplex mit dem Inhibitor HD04 116
Die Verfeinerung der Daten wurde anschließend mit SHELXL-97 (Sheldrick et al. 1997)
fortgesetzt5. Hierbei wurden mindestens 10 Zyklen von conjugate gradient Minimierung pro
Verfeinerung durchgeführt mit Einschränkungen (restraints) für die Bindungslängen, -winkel
und B-Werte. Für den Kofaktor und Liganden wurden die Einschränkungen (restraints)
zunächst aus den PDB-Koordinaten erzeugt um anschließend weitere notwendige
Bedingungen zur Erzwingung planarer Geometrien hinzuzufügen. Bei der gegebenen
Auflösung war es möglich, die Atome mit anisotropen B-Werten zu verfeinern, was durch die
Abnahme von Rfree gerechtfertigt erschien. Während der letzten Verfeinerungen wurden
Wasserstoffatome in idealen Positionen nach einem Reitermodell (riding model) verfeinert, ohne
dass dafür zusätzliche Parameter verwendet wurden. Tabelle 11 fasst die statistischen
Ergebnisse der Datensammlung und Verfeinerung zusammen.
Tabelle 11. Statistische Ergebnisse der Datensammlung und Verfeinerung des Komplexes
hAR⋅HD04. # Werte in Klammern beziehen sich auf den höchsten Auflösungsbereich. * Rsym = [ ΣhΣi
Ii(h) - <I(h)> / ΣhΣi Ii(h) ] x 100, wobei I die gemessene Intensität und <I> die durchschnittliche
Intensität für multiple Messungen ist. ** Rcryst = Σhkl Fo-Fc / Σhkl Fo *** Der Rfree-Faktor wurde
analog zu Rsym aus einer zufälligen Auswahl von Reflexen aus 10% der Daten berechnet. ****
Berechnet mit PROCHECK (Laskowski et al. 1993).
Auflösung (Å) 25-1,30
Raumgruppe P21
Zellkonstanten (Å, ° for β) a = 49,2; b = 66,6;
c = 47,1; β = 92,4
Höchster Auflösungsbereich (Å) 1,35 – 1,30
Zahl der gemessenen Reflexe 181872
Zahl der unabhängigen Reflexe 69006
Vollständigkeit der Daten (%) 93,3 [63,7]#
Mittleres I/σi 21,7 [3,4]
Rsym (%)* 4,5 [21,3]
Zahl verfeinerter Proteinatome (Aminosäuren) 2545 (316)
Zahl verfeinerter Kofaktor-Atome 48
4 Diese Arbeiten wurden von I. Hazeman, A. Mitschler und B. Chevrier am IGBMC in Straßburg durchgeführt. 5 Diese Verfeinerungszyklen wurden von Dr. A. Heine durchgeführt.
Kristallstruktur der hAR im Komplex mit dem Inhibitor HD04 117
Zahl verfeinerter Inhibitor-Atome 21
Zahl verfeinerter Citrat-Atome 13
Zahl verfeinerter Wassermoleküle 490
Auflösungsbereich der Verfeinerung (Å) 10-1,35
Rcryst (F0 > 4σ F0; F0)** 11,6; 12,2
Rfree (F0 > 4σ F0; F0)*** 16,8; 17,4
rms Abweichungen
Bindungslängen (Å) 0,012
Bindungswinkel (°) 2,4
Durchschnittliche B-Faktor (Å2) 15,1
Hauptkette (Å2) 12,8
Seitenketten (Å2) 17,5
Kofaktor (Å2) 8,5
Inhibitor (Å2) 13,3
Citrat (Å2) 18,4
Wassermoleküle (Å2) 33,0
Ramachandran Plot****
Sehr günstig (%) 91,3
Erlaubt (%) 8,7
Noch erlaubt (%) 0,0
Verboten (%) 0,0
Der Komplex kristallisiert in einer monoklinen Kristallform mit ähnlichen Zellkonstanten wie
der Komplex mit dem Inhibitor IDD384 (PDB-Code 1el3). Auch die räumliche Anordnung
der Aminosäuren ist in beiden Komplexen sehr ähnlich (rms-Abweichung der Cα-Positionen:
0,35 Å). Die atomare Anordnung im HD04-Komplex unterscheidet sich zudem nur
unwesentlich von der Anordnung, die im humanen Holo-Enzym (PDB-Code 1ads)
beobachtet wurde (rms-Abweichung der Cα-Positionen: 0,56 Å). Der Inhibitor bindet an das
nahezu unveränderte Holo-Enzym und besetzt nicht, wie ursprünglich vermutet, eine
IDD594- oder Zopolrestat-ähnliche Spezifitätstasche. Während die Position des
Phenoxyessigsäure-Restes im aktivem Zentrum exakt der bei IDD594 beobachteten
Anordnung entspricht, nimmt der Benzimidazol-Rest eine Position ein, die insofern dem
Bindungsmodus des IDD384 ähnelt, als dass er außerhalb des aktiven Zentrums in einem
Lösungsmittel-zugänglichen Bereich platziert wird (s. Abbildung 17).
Kristallstruktur der hAR im Komplex mit dem Inhibitor HD04 118
Abbildung 17. Ausschnitt aus den Komplexstrukturen von hAR mit den Inhibitoren HD04
(eingefärbt nach Atomtyp), IDD384 (links, in grün) und IDD594 (rechts, in orange).
Die Carboxylat-Gruppe des Inhibitors bildet ein Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen
zu den Aminosäuren des katalytischen Zentrums (der Anionen-Bindetasche) der Aldose
Reduktase aus. Eines der beiden Sauerstoffatome geht Wasserstoffbrückenbindungen mit
Tyr48 Oη (2,8 Å) und mit His110 Nε2 (2,7 Å) ein, während sich das zweite Sauerstoffatom in
Wasserstoffbrückenbindungsdistanz zu Trp111 Nε1 (3,0 Å) befindet.
Erstmals in dieser Struktur nachgewiesen ist die Beteiligung eines Citrat-Moleküls an der
Bindung des Inhibitors (s. Abbildung 18). Das Citrat-Molekül verbrückt die Wechselwirkung
des Inhibitors mit der Schleifenregion um Leu300. Zwei der drei Carboxylat-Gruppen und die
Hydroxyl-Gruppe des Citrats gehen gerichtete Wechselwirkungen mit dem Rückgrat dieser
Schleife ein. Kurze Kontakte bestehen zwischen dem Sauerstoff der Hydroxylgruppe und dem
Stickstoff von Leu301 (2,8 Å), zwischen einem Sauerstoff der ersten Carboxylat-Gruppe und
dem Stickstoff von Leu300 (3,0 Å), sowie zwischen einem Sauerstoff der zweiten Carboxylat-
Gruppe und dem Stickstoff von Ser302 (3,0 Å). Der andere Sauerstoff der zweiten
Carboxylat-Gruppe bildet eine Wasserstoffbrücke zu einem Stickstoff des Benzimidazol-
Ringsystems (2,7 Å) aus und verbrückt so den Inhibitor mit dem Protein.
Ebenfalls an der Bindung des Inhibitors beteiligt ist ein Wassermolekül (Wat1), das in der
Nähe des aktiven Zentrums zwischen Inhibitor und Citrat platziert ist. Dieses Wassermolekül
geht eine Wasserstoffbrückenbindung zu dem zweiten Sauerstoff der ersten Carboxylat-
Gruppe des Citrats ein (2,6 Å). Da es auch in kurzer Distanz zu einem Carboxylat-Sauerstoff
Citrat
HD04
IDD384
HD04
Citrat
IDD594
Kristallstruktur der hAR im Komplex mit dem Inhibitor HD04 119
des Inhibitors steht (2,8 Å), verbrückt es die Wechselwirkung zwischen dem Inhibitor und
dem Citrat.
Abbildung 18. Der Inhibitor ist über ein Citrat-Molekül mit der Schleifenregion um Leu300 verbrückt.
Ein Wassermolekül, das als Wasserstoffbrücken-Donor oder –Akzeptor fungieren kann, sitzt in der
Bindetasche und vermittelt die Wechselwirkung zwischen der Carboxylat-Gruppe des Inhibitors
und dem Citrat-Molekül. Distanzen zwischen den Atomen sind in Å angegeben.
Die Beteiligung des Citrat-Moleküls an der Bindung des Inhibitors HD04 verweist auf die
Möglichkeit, die beiden Moleküle zu einem neuen potenteren Inhibitor zu verknüpfen.
Theoretisch ergibt sich dabei die Bindungsenergie der verknüpften Verbindung aus der
Summe der Bindungsenergien der beiden Fragmente (zuzüglich eines Beitrags durch die
Verknüpfung) (Jencks 1981). So kann die Affinität des neuen Inhibitors auf ein Vielfaches der
Affinitäten der ursprünglichen Fragmente gesteigert werden. Dieser Ansatz wurde von Fesik
et al. (Hajduk et al. 1997) unter der Bezeichnung „SAR by NMR“ bekannt gemacht: Die
Methode identifiziert mittels NMR-Spektroskopie kleine Fragmente aus Substanzbibliotheken,
die an den vorgegebenen Rezeptor binden. Anschließend werden diese unter Erhalt ihrer
experimentell beobachteten, gebundenen Konformation verknüpft. Mit diesem Ansatz konnte
ein Molekül, das sehr fest (Kd=19 nM) an das FK506-Bindeprotein (FKBP) bindet, aus zwei
nur schwach bindenden (Kd=2µM und 100µM) Fragmenten abgeleitet werden (Shuker et al.
1996).
HD04
Citrat
Wat1
Leu300
Leu301
Ser302
3,0
2,8
3,0
2,7
2,8
2,6
Kristallstruktur der hAR im Komplex mit dem Inhibitor HD04 120
Das gleiche Konzept wird auch von Computerprogrammen zum de novo-Design von
Inhibitoren verwendet (Schneider and Böhm 2002). Die Fragmente werden anhand
potentieller Interaktionspunkte in der Tasche der Rezeptors platziert und anschließend zu
neuen Molekülen kombiniert (s. Abbildung 19). Bei diesem sogenannten „kombinatorischen
Docking“ werden nur solche Molekül-Bausteine (Synthone) als Fragmente verwendet, von
denen bekannt ist, dass sie die gewünschte chemische Verknüpfungsreaktion mit hoher
Wahrscheinlichkeit eingehen werden.
Abbildung 19. Strategie zum Struktur basierenden Molekülaufbau aus Fragmenten. Die Fragmente
werden in der Bindetasche platziert und anschließend verknüpft. Entnommen aus (Schneider and
Böhm 2002).
Da hier der Inhibitor HD04 als ein Fragment vorgegeben ist, muss zunächst überlegt werden,
auf welchem Syntheseweg die Verknüpfung mit anderen Fragmenten möglich ist. Dann
können Fragmente gesucht werden, die (1) die für die Verknüpfungsreaktion notwendigen
funktionellen Gruppen aufweisen und (2) aufgrund ihrer sonstigen funktionellen Gruppen
und konformativen Eigenschaften mit hoher Wahrscheinlichkeit in der Lage sind, die gleichen
Wechselwirkungen mit dem Protein einzugehen, die die Analyse der HD04-Kristallstruktur für
das Citrat-Molekül ergeben hat. Eine Möglichkeit zur Verknüpfung mit Fragmenten, die eine
gute Abgangsgruppe (z.B. Halogene oder Tosylat-Gruppen) besitzen, könnte die nucleophile
Substitution der Abgangsgruppe nach Deprotonierung der Benzimidazol-Gruppe des HD04
mit einer Base sein (s. Schema 3).
Kristallstruktur der hAR im Komplex mit dem Inhibitor HD04 121
N
NH O
O
OH
N
N OO
OHR
+ RCH2X+ Base
-HX
X= Hal, OTos
Schema 3. Ansatz zur Verknüpfung von HD04 mit Fragmenten, die eine gute Abgangsgruppe
besitzen.
Abbildung 20. Unity-Suchanfrage für die Suche nach Fragmenten zur Verknüpfung mit dem
Inhibitor HD04. Der Inhibitor HD04, Citrat und einige Aminosäuren des Proteins sind zur
Verdeutlichung dargestellt. Akzeptorgruppen sind rot eingefärbt, die dazugehörigen Donorgruppen
auf Proteinseite sind blau eingefärbt. Die ambivalente Donor-Akzeptor-Gruppe ist violett markiert.
Innerhalb der grau dargestellten Sphäre wird die Platzierung des Kohlenstoffatoms, das die
Abgangsgruppe tragen soll, verlangt.
Abbildung 20 zeigt eine mögliche Suchfrage mit dem Programm UNITY, bei der die
wichtigsten Wechselwirkungen des Citrat-Moleküls mit den Aminosäuren Leu300-Ser302 bzw.
mit dem Wassermolekül, das die Wechselwirkung zur Carboxylat-Gruppe des HD04
vermittelt, berücksichtigt wurden.
HD04
Citrat
Wat1
Leu300
Leu301
Ser302
Kristallstruktur der hAR im Komplex mit dem Inhibitor HD04 122
Die Suche nach geeigneten Fragmenten in virtuellen Datenbanken wird zur Zeit durchgeführt.
Die Zukunft wird zeigen, ob es tatsächlich gelingt, diese mit dem Inhibitor HD04 zu
verknüpfen und ob dies zu einer Steigerung der Affinität führt.
Thermodynamische Messungen 123
4.6 Thermodynamische Messungen
Um die Bindung innerhalb einer Reihe von AR-Inhibitoren thermodynamisch zu
charakterisieren, wurden ITC-Messungen mit humaner Aldose Reduktase und NADP+ als
Kofaktor durchgeführt. Kinetische Untersuchungen der Reduktion von DL-Glyceraldehyd
durch Aldose Reduktase aus Schweinemuskeln bei pH 7,0 haben zu der Schlussfolgerung
geführt, dass der Reaktion ein geordneter Mechanismus zugrundeliegt. Demnach bindet
zunächst der Kofaktor NADP(H) an das Apo-Enzym, was zu einer Konformationsänderung
des Proteins führt. Erst dann bindet das Substrat (Kubiseski et al. 1992). Da hier die Bindung
der Inhibitoren an das Holo-Enzym studiert werden soll, wurde der Kofaktor im 10fachen
Überschuss (bezogen auf hAR), bei gleicher Konzentration in der Messzelle und in der
Spritze, eingesetzt. Die gleiche Konzentration in Messzelle wie Spritze ist erforderlich, um
Wärmetönungen aufgrund von Mischungseffekten zu minimieren. Alle Messungen wurden bei
25°C und pH 8,0 durchgeführt. Die Konzentration des jeweiligen Puffers lag in allen Fällen
bei 10 mM. Untersucht wurde auch die Abhängigkeit der thermodynamischen Daten vom
verwendeten Puffersystem und dem Oxidationszustand des Kofaktors.
4.6.1 Bestimmung der Bindungskonstanten
Für die Inhibitoren Sorbinil, HD04, IDD370, Tolrestat, IDD594 und IDD393 (Formeln s.
Seite 3) konnten die Bindungskonstanten K für die Wechselwirkung mit humaner Aldose
Reduktase thermodynamisch bestimmt werden. In Tabelle 12 sind die Werte für die beiden
verwendeten Puffersysteme TRIS und HEPES (jeweils 10 mM) aufgelistet. Die Messungen
wurden bei pH 8,0 durchgeführt. Es wird ein Bereich von 0,4⋅106 M-1 bis 1,7⋅108 M-1 für die
Bindungskonstanten abgedeckt.
In Tabelle 13 sind die pKD-Werte aufgeführt, die den negativen dekadischen Logarithmus der
Dissoziationskonstanten KD darstellen. Diese verhält sich reziprok zur gemessenen
Bindungskonstanten K. Verwendet wurde die gemittelte Bindungskonstante aus den
Messungen mit TRIS- und HEPES-Puffer. Dem sind die kinetisch bestimmten
Inhibitionskonstanten IC50 bzw. Ki-Werte gegenübergestellt. Tabelle 13 und Abbildung 21
zeigen, dass die thermodynamisch gemessenen Werte gut mit den kinetisch bestimmten
Größen übereinstimmen.
Thermodynamische Messungen 124
Tabelle 12. Bindungskonstanten K für verschiedene Inhibitoren gegenüber humaner Aldose
Reduktase. Die Werte wurden für zwei verschiedene Puffersysteme ermittelt. *: Nicht bestimmt.
Bindungskonstanten K (106 M-1) Substanz
TRIS HEPES
Sorbinil 21,5±3,2 14,1±2,6
HD04 0,5±0,1 0,4±0,0
Tolrestat 10,8±4,2 30,3±8,5
IDD594 77,0±32,7 70,6±14,3
IDD393 173±53 *
IDD370 4,3±1,4 *
Tabelle 13. Vergleich der kinetisch gemessenen Inhibitionskonstanten IC50 bzw. Ki (pKi) und der
thermodynamisch gemessenen Dissoziationskonstanten KD (pKD) (Kapitel 6.8).
kinetisch thermodynamisch Substanz
IC50 (nM) Ki (nM) pKi KD (nM) pKD
Sorbinil 585 127 6,9 56,2 7,3
HD04 3400 3400 5,5 2390 5,6
Tolrestat 35 35 7,5 48,7 7,3
IDD594 30 30 7,5 13,6 7,9
IDD393 6 6 8,2 5,8 8,2
IDD370 590 590 6,2 230 6,6
Thermodynamische Messungen 125
Korrelation pKd / pKi
5
6
7
8
9
5 6 7 8 9
pKi
pKd
Abbildung 21. Korrelation zwischen thermodynamisch gemessenen Dissoziationskonstanten pKD
und kinetisch bestimmten pKi-Werten. Die gestrichelten Linien deuten die Abweichung einer
Größenordnung an.
Beim Vergleich der Dissoziationskonstanten pKD, die durch thermodynamische Messungen
bestimmt wurden, mit den kinetisch gemessenen Inhibitionskonstanten pKi fällt auf, dass sich
die Werte um weniger als 0,5 logarithmische Einheiten unterscheiden. Diese gute
Übereinstimmung steht im Einklang mit dem in der Literatur beschriebenen (Ehrig, Bohren et
al. 1994) Vorliegen einer nicht-kompetitiven Inhibition im Falle der Carbonsäure-Inhibitoren,
da dann gilt Ki = IC50 (Copeland 1996). Für Sorbinil wurde das Vorliegen einer
unkompetitiven Hemmung beschrieben (Kato et al. 1991). In diesem Fall lässt sich Ki nach
Gleichung 3 (Copeland 1996) aus dem gemessenen IC50-Wert berechnen. In dem
zugrundeliegenden Enzymassay (s. Kapitel 6.2) wurde D-Xylose mit einer Konzentration von
26,6 mM verwendet, der entsprechende Km-Wert von 7,4 mM wurde aus der Literatur
(Bohren, Grimshaw et al. 1994) entnommen.
Gleichung 3 Ki = IC50 / (1 + [S]/Km)
Thermodynamische Messungen 126
4.6.2 Änderung der Protonierungszustände bei der Bindung
Für die oben genannten Verbindungen wurden die kompletten thermodynamischen Parameter
für die Bindung an humane Aldose Reduktase bestimmt. Die gesamte Wärmetönung ∆Hges
und die Bindungskonstante K wurden direkt aus der beobachteten Bindungsisothermen
bestimmt (siehe Kapitel 6.3.3). Die Freie Enthalpie ∆G leitet sich aus der Bindungskonstanten
K nach Gleichung 19 ab. Der entropische Anteil ergibt sich dann aus der Differenz von Freier
Enthalpie ∆G und beobachteter Wärmetönung ∆Hges. Zur Bestimmung sich überlagernder
Prozesse wurden die thermodynamischen Parameter der Inhibitoren in TRIS-Puffer (Tabelle
14) und HEPES-Puffer (Tabelle 15) ermittelt.
Die ∆G-Werte fallen in einen relativ engen Bereich zwischen –47,0 und –31,8 kJ/mol,
während bei den gemessenen enthalpischen Wärmetönungen ∆Hges der Messbereich erheblich
größer ist (–72,7 bis –13,3 kJ/mol). Dies wirkt sich dementsprechend auf den Betrag des
entropischen Terms aus. Diese Werte liegen im Bereich von –26,6 bis +9,3 kJ/mol.
Thermodynamische Messungen 127
Substanz K (106 M-1) ∆G (kJ mol-1) ∆Hges (kJ mol-1) ∆G-∆Hges (kJ mol-1)
Sorbinil 21,5±3,2 -41,9±0,4 -47,7±0,3 5,8±0,5
HD04 0,5±0,1 -32,4±0,5 -22,6±0,8 -9,8±0,9
Tolrestat 10,8±4,2 -40,2±1,0 -13,6±0,2 -26,6±1,0
IDD594 77,0±32,7 -45,0±1,1 -38,6±0,5 -6,4±1,2
IDD393 173±53 -47,0±0,8 -56,3±0,4 9,3±0,9
IDD370 4,3±1,4 -37,9±0,8 -13,3±0,2 -24,6±0,8
Tabelle 14. Thermodynamische Parameter ∆Hges, ∆G und ∆G-∆Hges und K für verschiedene hAR
Inhibitoren. Die Messungen wurden in TRIS-Puffer durchgeführt. Die Wärmetönung ∆Hges und die
Bindungskonstante K wurden direkt aus der gemessenen Bindungsisothermen bestimmt.
Substanz K (106 M-1) ∆G (kJ mol-1) ∆Hges (kJ mol-1) ∆G-∆Hges (kJ mol-1)
Sorbinil 14,1±2,6 -40,8±0,5 -37,0±0,5 -3,9±0,7
HD04 0,4±0,0 -31,8±0,0 -37,8±1,0 6,0±1,0
Tolrestat 30,3±8,5 -42,7±0,7 -27,1±0,4 -15,6±0,8
IDD594 70,6±14,3 -44,8±0,5 -50,0±0,4 5,2±0,6
IDD393 * * -72,7± *
Tabelle 15. Thermodynamische Parameter ∆Hges, ∆G und ∆G-∆Hges und K für verschiedene hAR
Inhibitoren. Die Messungen wurden in HEPES-Puffer durchgeführt. Die Wärmetönung ∆Hges und
die Bindungskonstante K wurden direkt aus der gemessenen Bindungsisothermen abgeleitet. *:
Nicht bestimmt.
Thermodynamische Messungen 128
4.6.2.1 Pufferbeiträge
Um die intrinsische Bindungsenthalpie ∆Hbind zu bestimmen, wurden die ITC-Experimente
bei pH 8,0 und 25°C in zwei verschiedenen Puffern (TRIS und HEPES) mit unterschiedlichen
Ionisierungsenthalpien ∆Hion durchgeführt. Die jeweiligen Messpuffer enthielten 10mM
Puffersubstanz. In Tabelle 16 sind die verwendeten Puffersubstanzen mit ihren
entsprechenden Ionisierungsenthalpien ∆Hion aufgeführt.
Tabelle 16. Übersicht über die verwendeten Ionisierungsenthalpien bei 25°C. Die Werte beziehen
sich auf die Deprotonierung der Puffersubstanz. Werte entnommen aus (Fukada et al. 1998).
Puffersubstanz Ionisierungsenthalpie ∆Hion (kJ/mol)
HEPES 21,07
TRIS 48,07
Werden gleichzeitig mit der Bindungsreaktion Protonen vom untersuchten System
aufgenommen oder abgegeben, müssen der enthalpische Beitrag des Puffers bzw. die
enthalpischen Beiträge der ionisierbaren Protein- bzw. Ligandengruppen, auf die diese
Protonierungsreaktionen zurückzuführen sind, von der gemessenen Gesamtenthalpie ∆Hges
abgezogen werden, um die intrinsische Bindungsenthalpie ∆Hbind zu erhalten. Nach Abzug der
Ionisierungsenthalpie des Puffers erhält man die korrigierte Enthalpie ∆Hx. Anschließend
muss noch um die Wärmetönung korrigiert werden, die für die Protonierung/Deprotonierung
der entsprechenden funktionellen Gruppe des Liganden oder Proteins auftritt. Erst nach
Berücksichtigung des enthalpischen Beitrags dieser ionisierbaren Gruppe ergibt sich die
intrinsische Enthalpie ∆Hbind (siehe nächstes Kapitel).
Alle untersuchten Verbindungen zeigen eine Abhängigkeit der Enthalpie von der verwendeten
Puffersubstanz (s. Tabelle 17). Die Art der Abhängigkeit ist bei allen Inhibitoren mit einer
Carboxylat-Gruppe gleich, die größeren Enthalpien wurden in HEPES-Puffer gemessen. Im
Gegensatz dazu wurde für Sorbinil in TRIS-Puffer die größere Enthalpie gemessen.
Thermodynamische Messungen 129
Tabelle 17. Gemessene Enthalpien ∆Hges für verschiedene Inhibitoren in TRIS- und HEPES-Puffer
bei 25°C.
Enthalpie ∆Hges (kJ/mol) Substanz
TRIS HEPES
Sorbinil -47,7±0,3 -37,0±0,5
HD04 -22,6±0,8 -37,8±1,0
Tolrestat -13,6±0,2 -27,1±0,4
IDD594 -38,6±0,5 -50,0±0,4
IDD393 -56,3±0,4 -72,7±0,5
IDD370 -13,3±0,2 *
Nach Auftragung der gemessenen Wärmetönung ∆Hges gegen die Ionisierungsenthalpie ∆Hion
des Puffers können die Anzahl der vom Puffer auf das Protein-Ligand-System übertragenen
Protonen (Größe n) und die Enthalpie ∆Hx der Reaktion, die die um ∆Hion korrigierte
Reaktionsenthalpie ∆Hges darstellt, bestimmt werden. Die Größe n ergibt sich nach Gleichung
23 aus der Steigung der verbindenden Geraden und ∆Hx als Achsenabschnitt auf der Ordinate
∆Hges.
-100
-80
-60
-40
-20
0
0 10 20 30 40 50 60
∆Hion
∆Hge
s
Abbildung 22. Auftragung der gemessenen Enthalpie ∆Hges gegen die Ionisierungsenthalpie ∆Hion.
Die Anzahl n der vom Puffer übertragenen Protonen ergibt sich aus der Steigung der Geraden und
Thermodynamische Messungen 130
die korrigierte Enthalpie ∆Hx aus dem Achsenabschnitt auf der Ordinate ∆Hges. ο Sorbinil, ♦ HD04,
■ Tolrestat, ▲ IDD594, ● IDD393.
Es zeigt sich durch Auswertung der Abbildung 22, dass bei der Reaktion von Sorbinil mit
hAR im Mittel 0,4 Protonen vom Puffer aufgenommen werden, die wiederum bei der Bildung
des Komplexes vom Enzym-Ligand-System abgegeben werden. Bei der Komplexbildung aller
übrigen Inhibitoren vom Carbonsäuretyp werden im Mittel 0,4 bis 0,6 Protonen während des
Bindungsschritts vom Enzym-Ligand-System aufgenommen.
Tabelle 18. Korrektur (∆Hx=∆Hges-n∆Hion) der gemessenen Wärmetönungen ∆Hges um die
Ionisierungsenthalpien ∆Hion , die vom verwendeten Puffer herrühren. Die Werte sind der
Auftragung in Abbildung 22 entnommen. Positive n-Werte deuten auf eine Protonenaufnahme des
Enzym-Ligand-Systems hin.
Substanz n ∆Hx (kJ mol-1)
Sorbinil -0,4 -28,6
HD04 0,6 -49,7
Tolrestat 0,5 -37,7
IDD594 0,4 -58,8
IDD393 0,6 -85,5
4.6.2.2 Ionisierung von funktionellen Gruppen
Die Korrektur der gemessenen Wärmetönung ∆Hges um die Ionisierungsenthalpie ∆Hion des
Puffers ergibt die Enthalpie ∆Hx (Abbildung 22 und Tabelle 18). Als weiterer Korrekturterm
muss noch die Ionisierungsenthalpie der funktionellen Gruppe des Liganden bzw. des
Proteins, die während der eigentlichen Bindungsreaktion protoniert bzw. deprotoniert wird,
berücksichtigt werden. Um welche Gruppe(n) es sich dabei handelt, hängt also vom
postulierten Bindungsmechanismus der Liganden ab (s. Kapitel 4.6.3). Für den Inhibitor
IDD594 ist aus der hochaufgelösten Röntgenstrukturanalyse bekannt, dass er in
deprotonierter Form bindet. Es ist anzunehmen, dass dies auch für die übrigen Inhibitoren
vom Carbonsäuretyp gilt. Aufgrund ihrer niedrigen pKA-Werte (IDD594: pKA ≈ 2,90) werden
diese Inhibitoren bereits vor der Bindung an Aldose Reduktase als Carboxylate in Lösung
vorliegen, d.h. ihr Protonierungszustand ändert sich bei der Bindung nicht. Welche
funktionelle Gruppe des Proteins protoniert wird ist Gegenstand der Diskussion (Kapitel
Thermodynamische Messungen 131
4.6.4). Der pKA-Wert von Sorbinil liegt nach einer Berechnung mit der ACD Solaris Software
bei 8,67 ± 0,20. Damit ergibt sich nach der Henderson-Hasselbalch-Gleichung, dass in einem
wässrigen Puffersystem bei pH 8,0 etwa 80% des Sorbinils protoniert vorliegen. Unter der
Annahme, dass Sorbinil deprotoniert an Aldose Reduktase bindet, muss die gemessene
Enthalpie ∆Hges zusätzlich zur Korrektur der Ionisierungsenthalpie ∆Hion des Puffers aufgrund
der teilweisen Deprotonierung (n = -0,8) um einen Teil der Ionisierungsenthalpie ∆Hi für
Sorbinil korrigiert werden (s. Tabelle 19). Die Ionisierungsenthalpie von Hydantoin als
Modellverbindung für Sorbinil wurde gemessen (siehe Kapitel 6.3.4.4). Die Verwendung einer
Modellverbindung war aufgrund der zu geringen Löslichkeit von Sorbinil notwendig. Die
Ionisierungsenthalpie ∆Hi bezieht sich auf die Deprotonierung der funktionellen Gruppe.
Gleichung 4 ixbind HnHH ∆⋅+∆=∆
Tabelle 19. Korrektur (nach Gleichung 4) der Enthalpie ∆Hx um die für die Modellverbindung
gemessene Ionisierungsenthalpie ∆Hi, die von der ionisierbaren funktionellen Gruppe des
Liganden herrührt.
Ligand ∆Hx
(kJ mol-1) n
∆Hi
(kJ mol-1)
∆Hbind
(kJ mol-1)
Sorbinil -28,6 -0,8 27,0 -50,2
Thermodynamische Messungen 132
4.6.2.3 Thermodynamische Daten nach Berücksichtigung der Korrekturterme
Unter der Voraussetzung, dass keine weiteren Prozesse, die Wärme freisetzen oder
absorbieren, der eigentlichen Bindungsreaktion überlagert sind, ist die so erhaltene intrinsische
Bindungsenthalpie ∆Hbind die Netto-Reaktionsenthalpie des Assoziationsschrittes zwischen
Ligand und Protein bei 25 °C. Alle bisher noch nicht berücksichtigten Effekte (z.B.
Protonierung des Proteins) können als identisch für alle untersuchten Liganden betrachtet
werden (vgl. Kapitel 4.6.4.3). Daher kann ein relativer Vergleich der thermodynamischen
Parameter erfolgen.
Ausgehend von dieser Enthalpie ∆Hbind kann der entropische Beitrag -T∆S nach Gleichung 19
berechnet werden. Als Bindungskonstante K bzw. Freie Enthalpie ∆G wurden die aus beiden
Puffern bestimmten Mittelwerte verwendet.
Tabelle 20. Thermodynamische Parameter ∆Hbind, ∆G, -T∆S und K der untersuchten Liganden für
die Bindung an humane Aldose Reduktase. Die Bindungskonstanten K sind Mittelwerte aus den
Messungen in TRIS- und HEPES-Puffer. Bei IDD393 wurde K nur in TRIS-Puffer bestimmt, da die
Messung in HEPES aufgrund der Steilheit der Bindungsisotherme nicht auswertbar war. Nach
Gleichung 2.18 ergibt sich die Freie Enthalpie ∆G, während der entropische Term -T∆S die
Differenz aus der Freien Enthalpie ∆G und der Enthalpie ∆Hbind beschreibt. Die Enthalpien ∆Hbind
sind die um die Ionisierungsenthalpien korrigierten Enthalpien.
Substanz K (106 M-1) ∆G (kJ mol-1) ∆Hbind (kJ mol-1) -T∆S (kJ mol-1)
Sorbinil 17,8 -41,4 -50,2 8,8
HD04 0,4 -32,1 -49,7 17,6
Tolrestat 20,5 -41,7 -37,7 -4,0
IDD594 73,8 -44,9 -58,8 13,9
IDD393 173 -47,0 -85,5 38,5
Thermodynamische Messungen 133
4.6.3 Oxidationszustand des Kofaktors
Um die in anderen Arbeiten beobachtete Abhängigkeit der Inhibitor-Bindung vom
Oxidationszustand des Kofaktors zu untersuchen, wurden ITC-Experimente mit dem
Kofaktor sowohl in der reduzierten (NADPH) als auch in der oxidierten Form (NADP+)
durchgeführt. Der Kofaktor wurde im Überschuss eingesetzt, da die Bindung der Inhibitoren
an das Holo-Enzym studiert werden sollte. Tabelle 21 zeigt die mit den Inhibitoren Sorbinil
und IDD594 erhaltenen Werte.
Tabelle 21. Kalorimetrisch bestimmte Bindungskonstanten und freie Enthalpien für die Bindung der
Inhibitoren Sorbinil und IDD594 an die Holo-Enzyme hAR⋅NADP+ bzw. hAR⋅NADPH. Die
Messungen wurden in TRIS-Puffer bei pH 8,0 durchgeführt.
NADP+ NADPH Substanz
K (106 M-1) ∆G (kJ mol-1) K (106 M-1) ∆G (kJ mol-1)
Sorbinil 21,5±3,2 -41,9±0,4 1,3±0,0 -34,9±0,0
IDD594 77,0±32,7 -45,0±1,1 7,5±0,4 -39,2±0,1
Bei beiden Inhibitoren ist die Bindung an den NADP+-Komplex bevorzugt. Die
Bindungskonstante K liegt für beide Inhibitoren bei der Bindung an hAR⋅NADP+ um eine
Größenordnung höher als bei der Bindung an hAR⋅NADPH.
Für den Inhibitor IDD594 wurden die Messungen mit NADP+ bzw. NADPH in HEPES-
Puffer wiederholt, um Änderungen des Protonierungszustandes bei der Bindung des
Inhibitors zu untersuchen (s. Tabelle 22). Während bei den Messungen mit NADP+ eine
mittlere Aufnahme von 0,4 Protonen bei der Komplexbildung zu beobachten ist, zeigen die
Messungen mit NADPH keine Abhängigkeit der Enthalpie vom verwendeten Puffersystem,
d.h. bei der Bindung von IDD594 an das hAR⋅NADPH Holo-Enzym werden keine Protonen
zwischen dem Puffer und dem Enzym-Ligand-Komplex ausgetauscht.
Thermodynamische Messungen 134
Tabelle 22. Bindungskonstanten und freie Enthalpien für die Bindung des Inhibitors IDD594 an die
Holo-Enzyme hAR⋅NADP+ bzw. hAR⋅NADPH. Die Messungen wurden in TRIS- bzw. HEPES-
Puffer bei pH 8,0 durchgeführt. Die Enthalpie ∆Hbind ist um die Ionisierungsenthalpien korrigiert
(∆Hbind=∆Hges-n∆Hion). Ein positiver n-Wert verweist auf eine Protonenaufnahme des Enzym-
Ligand-Systems bei der Bildung des Komplexes.
Kofaktor K
(106 M-1)
∆G
(kJ mol-1)
∆Hbind
(kJ mol-1) n
-T∆S
(kJ mol-1)
NADP+ 73,8 -44,9 -58,8 0,4 13,9
NADPH 7,2 -39,2 -61,3 0,0 22,1
Thermodynamische Messungen 135
4.6.4 Diskussion
4.6.4.1 Enthalpische und entropische Beiträge zur Bindungsenergie
Wie bereits einleitend erwähnt, sind bei der Beschreibung der Energetik einer
Bindungsreaktion immer zwei Zustände in Betracht zu ziehen und relativ miteinander zu
vergleichen: den Zustand vor der Bindung und den Zustand nach der Bindung.
Ligand
H-Brücken
Enzym Komplex
„freiesWasser“
hydrophoberKontakt
H-Brücken
Rotation
loseassoziiertes
Wasser
Vib.
Translation
Abbildung 23. Schematische Darstellung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen. Vor der Bindung
ist der Ligand frei beweglich und entfaltet seine Flexibilität. Ligand und Enzym sind solvatisiert,
wobei einige Wassermoleküle über Wasserstoffbrücken (gestrichelte Linien) verknüpft, andere lose
assoziiert sind. Bei der Bindung (rechts) gehen Rotations- und Translationsfreiheitsgrade verloren.
Die Erniedrigung der Entropie ist dabei ungünstig für die Bindung. Die Bindung des Liganden führt
zu neuen Wasserstoffbrücken und hydrophoben Kontakten. Wasser wird dabei freigesetzt.
Zusätzlich entstehen niederfrequente Schwingungsmoden, die auf die neu gebildeten
nichtkovalenten Wechselwirkungen zurückzuführen sind. Nach (Andrews et al. 1984).
Das größte Problem, genaue Werte für die Bindungsenergien von biophysikalischen
Assoziationsreaktionen vorherzusagen, liegt darin, dass diese Bindungsenergien aus
Energiedifferenzen zwischen Molekülen in Lösung, die mit freien Wassermolekülen
wechselwirken, und gebundenen Molekülen, die im Komplex miteinander wechselwirken,
entstehen.
Wasserstoffbrücken. Schon vor der eigentlichen Bindungsreaktion sind die polaren Gruppen
des Proteins und des Liganden durch Wasserstoffbrücken mit den Wassermolekülen in ihrer
Umgebung abgesättigt. Durch Bindung des Liganden an das Protein gehen diese
Wechselwirkungen zwar verloren, aber es werden auch neue intermolekulare polare Kontakte
gebildet. Eine aufgrund der Komplexbildung neu ausgebildete Wasserstoffbrücke wird nur
Thermodynamische Messungen 136
dann konstruktiv zur Bindung beitragen, wenn die Desolvatisierungsenthalpie der polaren
Gruppe durch die Enthalpie der neu gebildeten intermolekularen Wasserstoffbrücken
überkompensiert wird. Demgegenüber kann sich eine polare Gruppe, die vor der
Bindungsreaktion vollständig solvatisiert war, als enthalpisch ungünstig für die
Bindungsreaktion erweisen, wenn sich im Komplex kein geeigneter Wechselwirkungspartner
findet, der die Desolvatisierungsenergie kompensieren kann.
Entropie. Aufgrund der Assoziation zweier Moleküle kann erwartet werden, dass ein System
Änderungen bezüglich der translatorischen, rotatorischen und internen Freiheitsgrade
durchläuft. Zum Beispiel kann während der Bindung ein definierter Teil des Proteins seine
Konformation verändern und „fester“ gefaltet werden, was mit einem Übergang zu höher
frequenten Schwingungsmodi einhergeht, die durch ihre geringere energetische Anregung und
damit ihre geringere Population weniger zur Entropie des Systems beitragen. Die Reduzierung
interner Freiheitsgrade ist ein entropisch ungünstiger Beitrag zur Freien Bindungsenthalpie
∆G. Die Entropie nimmt ab, entsprechend einer negativen Entropieänderung.
Andererseits kann eine Region des Biomoleküls nach der eigentlichen Bindungsreaktion auch
flexibler sein. Das wiederum führt zu einem positiven ∆S-Wert und begünstigt deshalb
entropisch die Bindungsreaktion.
Wasser. Wassermoleküle organisieren sich in einer geordneten Struktur an der hydrophoben
Oberfläche von Biomolekülen. Es wird angenommen, dass diese geordneten Wassermoleküle
untereinander stärkere Wasserstoffbrücken ausbilden, als sie in hochgradig ungeordneten
Wasserstrukturen gefunden werden. Das heißt, dass bei der Assoziation zweier Moleküle
dieses Freisetzen von Wassermolekülen zur Freien Enthalpie des gesamten Prozesses beiträgt,
weil das Wasserstoffbrückennetzwerk neu geordnet wird. Da die Freisetzung von
Wassermolekülen in diesem Falle zwingend für die Reaktion ist, muss beachtet werden, dass
ein Teil der gemessenen Enthalpie von der Freisetzung des Wassers herrührt.
Da zwangsläufig Oberflächenanteile bei einer Bindung vergraben werden, wird sich die
Verteilung von an der Oberfläche gebundenen Wassermolekülen und freien Wassermolekülen
verändern. Bei den meisten Bindungsreaktionen ist es diese Änderung der
Solvenswechselwirkungen, die den entropischen Term dominiert. Wenn Wasser während der
eigentlichen Bindung freigesetzt wird, das vorher mit hydrophoben Oberflächen
wechselwirkte, kann außerdem eine günstige Entropieänderung für diese Reaktion beobachtet
werden. Dieses gilt vor allem auch für solche Wassermoleküle, die vor der Ligandenbindung
die Bindetasche des Proteins ausfüllen.
Thermodynamische Messungen 137
4.6.4.2 Faktorisierung der enthalpischen und entropischen Bindungsbeiträge der
untersuchten AR-Inhibitoren
Wie sind die beobachteten enthalpischen und entropischen Beiträge im Rahmen dieser
theoretischen Überlegungen zu interpretieren? Zur besseren Übersicht stellt Abbildung 24 die
in Tabelle 20 aufgeführten thermodynamischen Größen in Form eines Balkendiagrammes dar.
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
kJ/m
ol
SorbinilHD04TolrestatIDD594IDD393
Abbildung 24. Balkendiagramm zur Gegenüberstellung der thermodynamischen Größen ∆Hbind, ∆G
und -T∆S der untersuchten Liganden für die Bindung an humane Aldose Reduktase.
Zunächst einmal ist anzumerken, dass es sich bei den thermodynamischen Daten nicht um
Absolutwerte handelt! Wie Überlegungen zum Bindungsmechanismus ergeben (s. Kapitel
4.6.4.3), verändert sich bei der Ligandbindung der Protonierungszustand des Proteins. Die in
Tabelle 20 aufgeführten Enthalpien sind bisher nicht um diesen unbekannten Beitrag
korrigiert worden. Es erscheint allerdings plausibel, dass das Protein bei den Messungen mit
NADP+ für alle Inhibitoren die gleichen Protonierungszustände vor bzw. nach der Bindung
des jeweiligen Inhibitors einnimmt. Der unbekannte Beitrag wäre demnach für alle Messungen
mit NADP+ gleich. Da dieser Beitrag als vermutlich exotherme Wärmetönung in allen ∆Hbind-
Werten (noch) enthalten ist, wird sich eine veränderte Faktorisierung der ∆G-Werte in
enthalpische und entropische Anteile ergeben (vgl. Abbildung 25). Dennoch können die
∆G ∆Hbind -T∆S
Thermodynamische Messungen 138
enthalpischen und entropischen Beiträge zur freien Enthalpie der Inhibitoren im Rahmen
dieser Überlegungen relativ zueinander interpretiert werden.
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
kJ/m
ol
SorbinilHD04TolrestatIDD594IDD393
Abbildung 25. Die Korrektur um einen bislang unbekannten Beitrag aufgrund einer Änderung des
Protonierungszustandes des Proteins verschiebt die Basislinie.
Die Enthalpiewerte streuen innerhalb der Serie um 47.8 kJ/mol, die Entropiebeiträge (–T∆S)
um 42.5 kJ/mol. Sorbinil ist das einzige Hydantoin in der Reihe der untersuchten Inhibitoren.
Verglichen mit den IDD-Inhibitoren bindet es schwächer enthalpisch, seine Bindung ist aber
mit einem stärker negativen ∆H verknüpft als die Bindung von Tolrestat. Sorbinil geht eine
Reihe von Wasserstoffbrückenbindungen und elektrostatische Wechselwirkungen im aktivem
Zentrum ein, die zu dem enthalpischen Bindungsbeitrag Anlass geben könnten (s. Abbildung
26). Es sei aber daran erinnert, dass eine korrekte Faktorisierung in Absolutwerte nur möglich
ist, wenn die mittlere Aufnahme von 0,5 Protonen durch das Protein geklärt und korrigiert ist.
Wie in Kapitel 4.6.4.3 diskutiert wird, ist die Protonierung von Lys77 wahrscheinlich, bei den
gegebenen pH Bedingungen und pKA-Werten sollten im molaren Mittel 0,5 Protonen
übertragen werden. Dieser Schritt kann als exotherme Reaktion mit ca –22,5 kJ/mol
(Ionisierungsenergie von Lys = -45 kJ/mol (Chaplin 2002), multipliziert mit dem Faktor 0,5)
angenommen werden. Vergleicht man die entropischen Bindungsanteile relativ zueinander,
fällt Sorbinil in einen mittleren Bereich. Es ist vergleichbar mit HD04 und IDD594. Deutlich
abweichend sind Tolrestat (größter entropisch begünstigender Beitrag) auf der einen Seite und
IDD393 (größter die Bindungsenergie reduzierender entropischer Beitrag). Sorbinil ist das
starrste Molekül der Serie und sollte von daher kaum Torsionswinkel-Freiheitsgrade bei der
∆Hbind -T∆S
Korrektur um bislang unbekannten Beitrag verschiebt die Basislinie
Thermodynamische Messungen 139
Bindung an AR verlieren. Dennoch gewinnt Sorbinil gegenüber den größeren Inhibitoren
vom Carbonsäure-Typ durch den entropischen Beitrag nicht soviel, wie zu erwarten war. Dies
mag zum einen daran liegen, dass IDD594, IDD393 und Tolrestat bei ihrer Bindung durch die
Besetzung von Spezifitätstaschen eine Reihe von Wassermolekülen verdrängen. Wie oben
dargestellt, führt dies zu einem günstigen entropischen Beitrag, da freie Wassermoleküle im
Solvens (bulk water) nicht so geordnet sind, wie in der Nähe einer hydrophoben Oberfläche.
Ein weiterer Aspekt könnte die nach der Bindung verbleibende Beweglichkeit der Inhibitoren
in der Bindetasche sein. Das deprotonierte Sorbinil bindet sehr fixiert in das aktive Zentrum:
Neben drei Wasserstoffbrückenbindungen zu Tyr48, His110 und Trp111 ist eine
elektrostatische Wechselwirkung der zweiten, partiell negativ geladenen C=O-Gruppe mit
NADP+ wahrscheinlich. Für die Inhibitoren vom Carbonsäure-Typ hingegen zeigt die
IDD384-Komplexstruktur, dass eine alternative Orientierung der COO—Gruppe möglich ist.
Abbildung 26 stellt die kristallographisch beobachteten Orientierungen im aktivem Zentrum
gegenüber. Da IDD384 bei pH 5,0 kokristallisiert wurde (PDB-Code 1el3) und einen pKA von
4,6 hat, nahm man zunächst an, der Grund für die alternative Orientierung könne die teilweise
Protonierung der Carboxylat-Gruppe sein (Calderone, Chevrier et al. 2000). IDD594 jedoch
bindet beim gleichen pH deprotoniert, wie später die hochaufgelöste Struktur zeigen konnte.
Heute erscheint die bei IDD384 zu beobachtende Wechselwirkung mit NADP+ als plausiblere
Erklärung. In der Summe ihrer Wechselwirkungen ähneln die beiden Orientierungen der
COO--Gruppe den Wechselwirkungen des Sorbinils (PDB-Code 1ah0) mit den Aminosäuren
des Proteins im aktiven Zentrum. Vermutlich liegt ein Gleichgewicht zwischen beiden
Orientierungen vor, was zu einer höheren Beweglichkeit und damit zu einem günstigeren
entropischen Beitrag führt. Neueste kristallographische Erkenntnisse bestätigen diese
Vermutung. Die Kristallstruktur der hAR mit dem Inhibitor IDD552 zeigt zwei alternative
Konformationen der Carboxylat-Gruppe des Inhibitors in der Anionen-Bindetasche, die im
wesentlichen den beiden Orientierungen in den Kristallstrukturen mit IDD594 und IDD384
entsprechen (persönliche Mitteilung F. Ruiz).
Thermodynamische Messungen 140
N H
N
N
H
OH
NN
O
O
H
N+
NH2
O
δ−
δ−
δ−
2.86
2.83
3.002.81
3.26
N H
N
N
H
OH N
+
NH2
O
O
Oδ−
δ−
2.74
2.66
3.06
N H
N
N
H
OH N
+
NH2
O
OO
δ−
δ−
2.802.72
2.693.37
Abbildung 26. Schematische Darstellung der Interaktionen zwischen den Inhibitoren Sorbinil,
IDD594 und IDD384 und den Aminosäuren Tyr48, His110 und Trp111 bzw. dem Kofaktor NADP+
im Bereich des aktiven Zentrums (Anionen-Bindetasche). Der Vergleich der Kristallstrukturen mit
IDD594 und IDD384 offenbart zwei unterschiedliche Orientierungen der Carboxylat-Gruppe im
aktiven Zentrum. In der Summe ihrer Wechselwirkungen ähneln die beiden Orientierungen den
Wechselwirkungen des Sorbinils mit den Aminosäuren des Proteins. Distanzen gemessen
zwischen Heteroatomen.
Sorbinil
IDD594
IDD384
Trp111
His110
Tyr48
NADP+
Thermodynamische Messungen 141
Die beiden vom Institute for Diabetes Discovery entwickelten Inhibitoren IDD594 und IDD393
zeichnen sich durch einen fast identischen Bindungsmodus aus. Bei den thermodynamischen
Daten zeigt sich allerdings, dass IDD393 einen deutlich günstigeren enthalpischen Beitrag zur
Bindung (-85,5 kJ/mol) aufweist als IDD594 (-58,8 kJ/mol), was allerdings durch einen
ungünstigeren entropischen Beitrag (IDD393: +38,5 kJ/mol gegen IDD594: +13,9 kJ/mol)
zum großen Teil wieder kompensiert wird. Vergleicht man die chemische Struktur von
IDD594 mit der von IDD393, dann fällt als wesentlicher Unterschied der Ersatz der Halogen-
Substituenten in ortho- und para-Position durch eine Nitro-Gruppe in meta-Stellung des
Benzyl-Restes, der in die hydrophobe Spezifitätstasche des Enzyms bindet, auf. In der
Kristallstruktur mit IDD393 (bislang unveröffentlicht) konnte eine Wasserstoffbrücken-
Bindung zwischen der Nitro-Gruppe des Inhibitors und der NH Gruppe von Leu300
beobachtet werden (persönliche Mitteilung von F. Ruiz). Diese gerichtete Wechselwirkung
trägt zu einer günstigeren Enthalpie bei. Andererseits kann eine solche gerichtete
Wechselwirkung auch zur Verringerung der Beweglichkeit des Inhibitors IDD393 im
Vergleich zu IDD594 in der Bindetasche führen, was den ungünstigeren entropischen Beitrag
für IDD393 erklären könnte.
Im Vergleich zu den übrigen Inhibitoren des Datensatzes besitzt Tolrestat einen relativ
geringen enthalpischen Beitrag (-37,7 kJ/mol), dafür aber den günstigsten entropischen
Beitrag (-4,0 kJ/mol) zur Freien Enthalpie. Bei der Betrachtung der Kristallstrukturen (vgl.
auch Kapitel 3.2 und 4.1) gibt es einige auffällige Unterschiede: (1) Die Konformation der
Schleife Val297-Cys303 bleibt im Vergleich zur Holo-Struktur bei Ausbildung der Tolrestat-
Spezifitätstasche erhalten, während die Konformation des Protein-Rückgrates in diesem
Bereich zur Bindung der IDD-Verbindungen geändert wird. (2) Die Tolrestat-
Spezifitätstasche ist weniger vergraben als die von den IDD-Verbindungen besetzte
Spezifitätstasche, was eine geringere Änderung der Solvens-zugänglichen Oberfläche bei der
Bindung mit sich bringt. (3) Die Bindung von Tolrestat scheint zu einer Erhöhung der
Unordnung im Bereich der Schleife Val297-Cys303 zu führen, wie ein Vergleich der mittleren
B-Faktoren (s. Tabelle 23) zeigt.
Thermodynamische Messungen 142
Tabelle 23. Mittlere B-Faktoren in Å2. Berechnet jeweils für die Schleife Val297-Cys303 und für das
gesamte Protein.
Schleife Val297-Cys303 Gesamtes Protein Struktur
Rückgrat Seitenketten Rückgrat Seitenketten
1ah0 34,9 44,5 34,0 36,8
1ah3 47,6 56,7 37,6 40,8
1ah4 38,4 48,5 38,0 41,5
Vergleicht man aber die für die Schleife Val297-Cys303 berechneten mit den für das gesamte
Protein berechneten mittleren B-Faktoren, dann fällt auf, dass einzig bei der Tolrestat-Struktur
(1ah3) eine deutliche Erhöhung der mittleren B-Faktoren zu beobachten ist. Zwar zeigen auch
die Holo-Strukur (1ah4) und die Sorbinil-Struktur (1ah0) eine Erhöhung der mittleren B-
Faktoren der Seitenketten-Atome im Bereich der Schleife Val297-Cys303, allerdings nicht in
dem Ausmaß wie bei der Tolrestat-Struktur. Dies erklärt möglicherweise den günstigen
entropischen Beitrag zur Bindungsenergie des Tolrestat.
Der Inhibitor HD04 zeigt mit –49,7 kJ/mol einen enthalpischen Beitrag zur Bindungsenergie,
der günstiger ist, als der für Tolrestat gemessene Wert. Allerdings wird das durch einen
ungünstigen entropischen Beitrag soweit kompensiert, dass HD04 die geringste freie
Enthalpie des vermessenen Satzes von Inhibitoren aufweist. Die Struktur von HD04 im
Komplex mit hAr konnte durch Kokristallisation aus Ammonium-Citrat Puffer aufgeklärt
werden (s. Kapitel 4.5). Da aber die ITC-Experimente ohne Citrat durchgeführt wurden, ist
keine Interpretation in struktureller Hinsicht möglich. Der Bindungsmodus von HD04 ohne
Citrat ist unbekannt.
Thermodynamische Messungen 143
4.6.4.3 Mechanismus der Liganden-Bindungsreaktion
Es ist bekannt, dass Inhibitoren vom Carbonsäure-Typ, wie für den Inhibitor Alrestatin
gezeigt werden konnte, in Bezug auf die durch Aldose Reduktase katalysierte Reduktion von
Aldehyd-Substraten nicht-kompetitiv sind. Andererseits sind sie aber kompetitive Inhibitoren
der ebenfalls durch Aldose Reduktase katalysierten Oxidation von Alkoholen zu den
entsprechenden Aldehyden (rückwärtsgerichtete Reaktion). Um dieses Verhalten zu erklären,
wurde vorgeschlagen, dass geladene Inhibitoren (z.B. Carboxylate) zwar wie Substrate in das
aktive Zentrum binden, allerdings erst nachdem der katalytische Zyklus durchlaufen wurde
(Ehrig, Bohren et al. 1994). Demnach müssen sie bevorzugt an den AR⋅NADP+-Komplex
binden, während Substrate bevorzugt an die reduzierte AR⋅NADPH-Form binden. Auch für
den Inhibitor Sorbinil zeigen kinetische Daten, dass er sowohl an AR⋅NADPH als auch an
AR⋅NADP+ bindet, wobei aber nur die Bindung an letzteren Komplex zu einer signifikanten
Verringerung der Umsatzrate führt (Bohren et al. 2000).
Diese Schlussfolgerung wird durch die im Rahmen dieser Arbeit gesammelten
thermodynamischen Daten untermauert. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl Inhibitoren
vom Carbonsäure-Typ (IDD594) als auch vom Hydantoin-Typ (Sorbinil) deutlich stärker an
den hAR⋅NADP+-Komplex als an den hAR⋅NADPH-Komplex binden (s. Tabelle 21). Die
Bindungskonstante K ist für beide Inhibitoren bei der Bindung an den hAR⋅NADP+-
Komplex um eine Größenordnung erhöht.
Interessant im Hinblick auf den Mechanismus der Liganden-Bindung sind auch die
beobachteten Änderungen der Protonierungszustände bei der Bindung. Die Anzahl der vom
Protein-Ligand-Komplex bei der Bindung aufgenommenen bzw. abgegebenen Protonen
wurde für Inhibitoren von Carbonsäure- und Hydantoin-Typ, sowie für die oxidierte und
reduzierte Form des Kofaktors bestimmt. Tabelle 24 fasst die Ergebnisse zusammen.
Thermodynamische Messungen 144
Tabelle 24. Experimentell beobachtete Änderungen der Protonierungszustände bei der Bindung
von ARIs aus verschiedenen Klassen an hAR. Die Anzahl der vom ternären Protein-Ligand-
Kofaktor-Komplex mit der Puffer bei der Bindung ausgetauschten Protonen wurde mit der
oxidierten und der reduzierten Form des Kofaktors bestimmt. Positive Werte stehen für eine
Protonenaufnahme, negative Werte für eine Protonenabgabe. Nach Abzug der Anzahl der mit dem
Inhibitor ausgetauschten Protonen ergibt sich die durch eine Änderung des
Protonierungszustandes der hAR zu erklärende Differenz.
Inhibitor-Klasse Carbonsäure Hydantoin
Oxidationszustand des Kofaktors NADP+ NADPH NADP+
Wahrscheinlicher Protonierungs-
zustand des Inhibitors in Lösung bei
pH 8,0
deprotoniert deprotoniert ca. 80%
protoniert
Protonierungszustand des Inhibitors
im Komplex deprotoniert deprotoniert deprotoniert
Anzahl mit dem Protein-Ligand-
Komplex ausgetauschter Protonen 0,5 0,0 -0,4
Anzahl mit dem Inhibitor
ausgetauschter Protonen 0,0 0,0 -0,82
Differenz 0,5 0,0 0,42
Betrachten wir zunächst die Bindung eines Inhibitors vom Carbonsäuretyp an AR⋅NADP+.
Aus den ITC-Experimenten geht hervor, dass bei der Bindung im Mittel 0,5 Protonen von
dem Protein-Inhibitor-NADP+-Komplex aufgenommen werden. Aufgrund der
hochaufgelösten IDD594-Komplexstruktur ist bekannt, dass IDD594 deprotoniert bindet.
His110 und Tyr48 liegen nach der Bindung neutral vor. Lys77 ist protoniert und polarisiert die
Tyr48 OH-Gruppe. Asp43 ist deprotoniert und geht elektrostatische Wechselwirkungen
(Salzbrücken) mit NADP+ und Lys77 ein. Aufgrund ihrer generell niedrigen pKA-Werte (2-5)
ist davon auszugehen, dass Inhibitoren vom Carbonsäure-Typ bereits in wässriger Lösung
deprotoniert vorliegen. Damit bleibt die Aufnahme von 0,5 Protonen durch Veränderungen
im Protonierungszustand der Aminosäuren der Aldose Reduktase zu erklären. Wie liegt der
Protein-Kofaktor-Komplex vor der Inhibitorbindung vor? Die räumliche Nähe des
Thermodynamische Messungen 145
Nicotinamid-Ringes von NADP+ und Lys77 spricht dafür, dass die Basizität von Lys77
herabgesetzt sein könnte (s. Abbildung 27).
OO OOOOOO
OHH
OHH
OHH
OH
HO H
H
NH3 +OO Me Me
NH3 + NH3 + NH3 +
NH3 + Me MeOO
NH3 +
OHH
OHH
OHH
OH
HO H
H
pKa ↑ pKa ↓ pKa ↑
pKa ↓ pKa ↓pKa ↑
Abbildung 27. Schematische Darstellung der Effekte, die Nachbargruppen auf die Verschiebung
von pKA-Werten einer Carbonsäure oder Aminogruppierung ausüben können. Modifiziert nach
(Dullweber 2000).
Demnach würde Lys77 neutral (deprotoniert) vorliegen und könnte eine H-Brückenbindung
zu Asp43 eingehen, das seinerseits eine Salzbrücke zu NADP+ ausbildet. Entscheidend für die
Protonenaufnahme ist vermutlich eine pKA-Verschiebung des Lys77. Da der Inhibitor mit
seiner Carboxylat-Gruppe eine elektrostatische Wechselwirkung mit NADP+ eingeht, wird der
Einfluss des Kofaktors auf Lys77 verringert. Als Folge dessen steigt die Basizität des Lys77.
Eine Verschiebung des pKA-Wertes von Lys77 auf ~8 würde die Aufnahme eines halben
Protons im Mittel erklären (Abbildung 28). Die direkte Protonen-Übertragung durch den
Puffer ist denkbar, da das Protein auf seiner „Rückseite“ einen Wasserkanal ausbildet, der bei
Asp43 endet (Cachau, Howard et al. 2000).
Thermodynamische Messungen 146
OH
N+ O
NH2
N
N
H
NH
H
O
O
OH
N+ O
NH2
N
N
H
N+
H
HH
O
O
O
O
- -
-
Abbildung 28. Vermutete Protonierungszustände in der AR-Bindetasche vor und nach Bindung
eines Inhibitors vom Carbonsäure-Typ an AR⋅NADP+.
Ein alternativer Erklärungsansatz für die beobachtete Protonenaufnahme könnte eine pKA-
Verschiebung des His110 durch die Nähe der negativ geladenen Carboxylat-Gruppe des
Inhibitors sein. Allerdings zeigt die hochaufgelöste Kristallstruktur eindeutig, das His110
neutral vorliegt. Denkbar wäre höchstens, dass das Proton zwar von His110 aufgenommen
wird, dann aber in Umkehrung des postulierten katalytischen Mechanismus weiter auf Lys77
übertragen wird.
Kommen wir nun zur Bindung eine Inhibitors vom Carbonsäuretyp an AR⋅NADPH. In
diesem Fall stehen keine Informationen über den Protonierungszustand des ternären
Komplexes aus einer hochaufgelösten Kristallstruktur zur Verfügung. Da der Kofaktor in
seiner ungeladenen, reduzierten Form vorliegt, ist nicht davon auszugehen, dass es zu einer
starken pKA-Verschiebung des Lys77 kommt, so dass dieser Rest auch ohne gebundenen
Inhibitor protoniert vorliegen wird. Stabilisiert wird diese Ladung durch eine mögliche
Salzbrücke zum deprotonierten Asp43. Wie bereits erwähnt, ändert sich der
Protonierungszustand des Inhibitors bei der Bindung nicht. Unsere Experimente belegen, dass
sich auch der Protonierungszustand des Proteins nicht ändert, wodurch es insgesamt zu
keinem Protonenaustausch zwischen der wässrigen Pufferlösung und dem Protein-Inhibitor-
Komplex kommt (Abbildung 29).
His110
Tyr48
NADP+
Lys77
Asp43
Inhib. Lys77
50% protoniert
± Inhibitor
± 0,5 H+
Thermodynamische Messungen 147
OH
NO
NH2
N
N
H
O
O
OH
NO
NH2
N
N
H
N+
H
HH
O
O
O
O
N+
H
HH
- -
-
Abbildung 29. Vermutete Protonierungszustände in der AR-Bindetasche vor und nach Bindung
eines Inhibitors vom Carbonsäure-Typ an AR⋅NADPH.
Bei der Bindung von Sorbinil an AR⋅NADP+ werden im Mittel 0,4 Protonen von dem
Protein-Inhibitor-Komplex abgegeben. Der pKA-Wert von Sorbinil liegt bei 8,67 ± 0,20. Nach
der Henderson-Hasselbalch-Gleichung ergibt sich demnach, dass in einem wässrigen
Puffersystem bei pH 8,0 etwa 80% des Sorbinils protoniert vorliegen. Unter der Annahme,
dass Sorbinil deprotoniert an Aldose Reduktase bindet, werden vom Inhibitor im Mittel 0,8
Protonen bei der Bildung des Komplexes freigesetzt. Diese Annahme wird durch den Befund
gestützt, dass Sorbinil genau wie IDD594 bevorzugt an hAR⋅NADP+ bindet. Gehen wir
davon aus, dass ansonsten die gleichen Protonierungszustände vorliegen wie bei der Bindung
einer Carbonsäure an AR⋅NADP+, dann ergibt sich unter Berücksichtigung der pKA-
Verschiebung des Lys77 eine Aufnahme von 0,5 Protonen bei der Komplexbildung durch das
Protein. In guter Übereinstimmung mit dem Experiment verbleibt als Nettoeffekt eine
mittlere Abgabe von ca. 0,3 Protonen (Abbildung 30).
His110
Tyr48
NADPH Asp43
Inhib. Lys77
50% protoniert
± Inhibitor Lys77
50% protoniert
Thermodynamische Messungen 148
OH
N+ O
NH2
N
N
H
NH
H
O
O
OH
N+ O
NH2
N
N
H
N+
H
HH
O
O
NH
NO
O
- -
Abbildung 30. Vermutete Protonierungszustände in der AR-Bindetasche vor und nach Bindung
eines Inhibitors vom Hydantoin-Typ an AR⋅NADP+.
Es muss angemerkt werden, dass die thermodynamischen Messungen mit großen Fehlern und
damit die hier vorgestellte Interpretation mit einer großen Unsicherheit behaftet ist. Aufgrund
des notwendigen Aufwands, der zur Bereitstellung ausreichender Mengen an Proteinmaterial
getrieben werden musste, konnten einige Messungen nicht hinreichend oft wiederholt werden,
um einen verlässlichen statistischen Mittelwert und Fehler zu bestimmen. Der Mangel an
Proteinmaterial führte auch dazu, dass eine möglichst geringe Menge pro Messung verwendet
wurde. Da dabei nahe an der Detektionsgrenze des Kalorimeters gearbeitet wurde, sinkt
unweigerlich die Zuverlässigkeit der Messungen.
Alle hier vorgestellten Überlegungen müssen daher zum gegenwärtigen Zeitpunkt als erste
Hinweise auf den Bindungsmechanismus gewertet werden. Die in sich schlüssige
Interpretierbarkeit aller bisher gesammelten Daten im Rahmen der präsentierten
Modellvorstellung und die gute Übereinstimmung mit anderen experimentellen Befunden
stimmen zuversichtlich, dass das vorgeschlagene Modell durch zukünftige Messungen
bestätigt und weiter untermauert werden kann. So wird es z.B. interessant sein zu sehen, ob
sich eine veränderte Bilanz für die Änderung der Protonierungszustände ergibt, wenn die
Messungen bei einem anderen pH durchgeführt werden. Werden diese Veränderungen im
Rahmen der hier vorgestellten Modellvorstellung für den Mechanismus der Liganden-Bindung
erklärbar sein, oder werden sie eine Anpassung des Modells erfordern? Darüber hinaus
werden weitere Messungen mit anderen Inhibitoren notwendig sein, um eine vollständiges
Bild der Liganden-Bindung zu erhalten.
His110
Tyr48
NADP+
Lys77
Asp43
Inhib.
Lys77
50% protoniert
± Inhibitor
± 0,5 H+
Zusammenfassung und Ausblick 149
5 Zusammenfassung und Ausblick
Thema der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Inhibition des Enzyms Aldose
Reduktase. Eine Besonderheit dieses Enzyms liegt in der ausgeprägten Anpassungsfähigkeit
der Bindetasche bei der Ligandbindung. Das Ausmaß dieser Rezeptorflexibilität wurde durch
den ausführlichen Vergleich bekannter Kristallstrukturen und mit Hilfe von
molekulardynamischen Simulationen untersucht (Kapitel 4.1). Beim Vergleich der bekannten
Kristallstrukturen zeigte sich, dass bislang nur vier unterschiedliche „Hauptkonformationen“
kristallographisch beobachtet wurden. Als Startstruktur für die MD-Simulationen wurde die
Geometrie der Kristallstruktur der humanen Aldose Reduktase im Komplex mit dem
Inhibitor IDD594 verwendet. Bei zwei der drei Simulationen wurde der Ligand zuvor aus der
Startstruktur entfernt. Durch die verschiedenen MD-Simulationen war es möglich, eine
Vielzahl weiterer Konformationen zu generieren, die „Zwischenzustände“ der bereits
bekannten Konformationen darstellen. Bei der Analyse der MD-Trajektorien wurde des
weiteren der duale Charakter der AR-Bindetasche deutlich. Die Bindetasche kann in zwei
Subtaschen unterteilt werden: Das rigide katalytische Zentrum (die Anionen-Bindetasche) und
die hochflexible Region um Leu300, die wesentlich an der Ausbildung der hydrophoben
Spezifitätstasche beteiligt ist. Interessant ist auch die Tatsache, dass während der MD-
Simulationen, bei denen der Ligand aus der Startstruktur entfernt worden war,
Konformationen auftraten, die anderen mit weiteren Inhibitoren kristallographisch
beobachteten Konformationen sehr ähnlich sind. Dies zeigt, wie wertvoll MD-Simulationen
zur Generierung eines Ensembles relevanter Proteinkonformationen sein können, gerade bei
Ziel-Proteinen für die kaum Kristallstrukturen zur Verfügung stehen.
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Suche nach neuen Inhibitoren der Aldose Reduktase.
Das virtuelle Screening wurde dabei zunächst auf die in der hochaufgelösten IDD594-
Komplexstruktur beobachtete Proteinkonformation beschränkt. In diesem Ansatz wurde also
die Flexibilität des Rezeptors vernachlässigt. Die Vorteile der IDD594-Komplexstruktur liegen
(a) in der hohen Auflösung, die exakte Informationen über den Protonierungszustand von
Protein und Ligand liefert, und (b) in dem Vorliegen einer hydrophoben Spezifitätstasche,
deren Besetzung zu einer hohen Affinität und Spezifität der Liganden gegenüber eng
verwandten Enzymen (wie z.B. der Aldehyd Reduktase) führt. Die Bindetasche wurde einer
Hot Spot-Analyse unterzogen, um aus den dabei identifizierten bevorzugten
Wechselwirkungsbereichen eine Pharmakophor-Hypothese abzuleiten, die für eine 3D-
Zusammenfassung und Ausblick 150
Datenbanksuche verwendet wurde. Abschließend wurden die Kandidatenmoleküle flexibel in
die Bindetasche eingepasst und einer visuellen Inspektion unterzogen.
Ebenfalls untersucht wurde, inwieweit es ein Ligand basierender Ansatz erlaubt, die
Flexibilität des Rezeptors bei der virtuellen Datenbanksuche zu berücksichtigen (Kapitel 4.3).
Die Idee war, bekannte Inhibitoren der Aldose Reduktase als Abbild der entsprechenden
Proteinkonformationen zu verwenden. Die hier berücksichtigten Inhibitoren sind
Stellvertreter für drei der vier zuvor erwähnten „Hauptkonformationen“ der Aldose
Reduktase. Aus der Überlagerung der Inhibitoren wurde eine Pharmakophor-Hypothese
abgeleitet und für die Datenbanksuche verwendet. Anschließend wurden die Inhibitoren
vereinigt und als Referenz für die paarweise Überlagerung der Kandidatenmoleküle
verwendet.
Aus beiden Datenbanksuchen konnten neue Inhibitoren der Aldose Reduktase mit Affinitäten
im mikromolaren Bereich identifiziert werden. Das Ziel der durchgeführten virtuellen
Datenbanksuchen war, Leitstruktur-ähnliche Verbindungen zu finden, deren Affinität in
weiteren Design-Zyklen optimiert werden kann. Ein Beispiel dafür ist die Derivatisierung
eines bereits bekannten Inhibitors (Kapitel 4.4). Das beste Derivat zeigt eine 30fach höhere
Affinität als die Ausgangsverbindung. Die Struktur dieses Inhibitors im Komplex mit humaner
Aldose Reduktase konnte aufgeklärt werden. Dabei wurde ein neuer Bindungsmodus
beobachtet, bei dem ein Citrat-Molekül die Wechselwirkung des Inhibitors mit dem Protein
verbrückt. Die Analyse dieser Wechselwirkungen kann in der Zukunft als Grundlage für eine
neue Design-Strategie zur weiteren Verbesserung der Affinität dienen (Kapitel 4.5). Dies
unterstreicht die Bedeutung des Zusammenwirkens von Computermethoden und
Röntgenkristallographie bei der Entwicklung neuer Inhibitoren. Am Ende einer solchen
Entwicklung könnten möglicherweise Inhibitoren mit einer vergleichbaren Affinität zu bereits
bekannten Inhibitoren stehen.
Alle Verbindungen, die als Inhibitoren der Aldose Reduktase identifiziert werden konnten,
sind Carbonsäuren. AR-Inhibitoren mit einer anderen terminalen funktionellen Gruppe
konnten nicht gefunden werden. Allerdings wurden bislang nur Datenbanken mit einer sehr
begrenzten Anzahl von Verbindungen durchsucht. Möglicherweise lassen sich weitere
Inhibitoren in deutlich umfangreicheren Datenbanken finden. Die Suche in großen
Datenbanken scheint zur Zeit nur mit dem auf eine, als rigide betrachtete,
Proteinkonformation beschränkten Ansatz möglich. Die zur endgültigen Auswahl der
Zusammenfassung und Ausblick 151
Testverbindungen notwendige visuelle Inspektion ist bei dem zuvor beschriebenen Ligand
basierenden Ansatz, der implizit die Rezeptorflexibilität berücksichtigt, zu aufwendig, um die
Anwendung dieser Suchstrategie auf größere Datenbanken zu erlauben.
Abhilfe könnte ein zusätzlicher Rezeptor basierender Filterschritt schaffen, der eine
Abschätzung der Affinität (scoring) ermöglicht und es somit erlaubt, die Kandidatenmoleküle
in eine Reihenfolge zu bringen (ranking). Bei einer zuverlässigen Abschätzung der Affinität
kann die visuelle Inspektion dann auf die begrenzte Anzahl der am besten bewerteten
Verbindungen beschränkt werden. Das Programm FLEXE erlaubt das Einpassen von
Liganden in ein Ensemble von Proteinstrukturen und könnte in einem weiteren Filterschritt
verwendet werden. Ein Testdatensatz aus AR-Inhibitoren mit bekannten Bindungsmodi
wurde verwendet, um das Programm FLEXE zu testen. Dabei hat sich gezeigt, dass die
experimentellen Bindungsmodi nicht zuverlässig mit FLEXE reproduziert werden konnten.
Anzumerken ist, dass das verwendete Ensemble auf lediglich drei Proteinstrukturen begrenzt
war. Möglicherweise können bessere Ergebnisse bei Verwendung eines größeren Ensembles,
angereichert mit weiteren Proteinkonformationen (z.B. aus den MD-Simulationen), erreicht
werden. Die Vergrößerung des Ensembles hat allerdings Grenzen, da sie zu einer Erhöhung
der Rechenzeiten führt. Ebenfalls zu testen ist, ob das ranking der generierten Docking-
Lösungen durch eine Anpassung der verwendeten Bewertungs-Funktion verbessert werden
kann. Um eine korrekte Abschätzung der Bindungsenergie zu ermöglichen, muss jedoch das
Programm zunächst überhaupt in der Lage sein, Lösungen zu generieren, die dem
experimentell beobachteten Bindungsmodus nahe kommen, da das Scoring von der
zugrundeliegenden Proteinkonformation abhängt (Marelius et al. 2001).
Eine Alternative zum Docking in multiple Proteinkonformationen mit FLEXE könnte die
Verwendung des Programms AUTODOCK sein. Dabei werden gemittelte, energiegewichtete
Gitter zur Beschreibung multipler Proteinkonformationen eingesetzt (Österberg et al. 2002).
AUTODOCK lässt sich auch mit DRUGSCORE Potenzial-Feldern verwenden (Sotriffer et al.
2002).
Ein weiteres prinzipielles Problem beim Docking in Ensemble von Proteinstrukturen liegt
darin, dass bislang keine Bewertungs-Funktion einen Beitrag zur freien Bindungsenergie
aufgrund einer Konformationsänderung des Proteins erfassen kann. Die Frage, wie groß ein
solcher Beitrag ist, kann möglichweise in der Zukunft durch temperaturabhängige
Zusammenfassung und Ausblick 152
mikrokalorimetrische Untersuchungen der Ligandbindung erreicht werden. Allerdings nur,
falls der entsprechende enthalpische Beitrag groß genug ist, um eine Detektion zu erlauben.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden ITC-Messsungen bei pH 8,0 und bei 25°C mit einer Reihe
von AR-Inhibitoren durchgeführt, um ein thermodynamisches Profil der Bindung des
jeweiligen Inhibitors zu erhalten (Kapitel 4.6). Nach der Berücksichtigung von
Korrekturtermen für die Ionisierung des Puffers und funktioneller Gruppen des Liganden,
war eine strukturbezogene Interpretation der erhaltenen thermodynamischen Daten möglich.
Anhand der in Abhängigkeit von dem Oxidationszustand des Kofaktors beobachteten
Protonierungsänderungen bei der Ligandbindung konnten Rückschlüsse auf den Ligand-
Bindungsmechanismus gezogen werden. Eine Hypothese über den Protonierungszustand des
Proteins vor und nach der Bindung der verschiedenen Liganden wurde abgeleitet. Diese
erlaubt die Betrachtung der beobachteten Effekte in einem einheitlichen Bild und steht im
Einklang mit anderen experimentellen Befunden. Die Untersuchung weiterer Inhibitoren bei
einem anderen pH-Wert wird nötig sein, um das Bild der Liganden-Bindung abzurunden.
Welche anderen Ansätze gibt es für die zukünftige Suche nach Inhibitoren der Aldose
Reduktase mit neuen funktionellen Gruppen, die die Anionen-Bindetasche besetzen? Eine
Möglichkeit könnte in der gezielten Suche nach 2,4-Thiazolidindionen (Glitazonen)
bestehen. Verbindungen aus dieser Substanzklasse inhibieren nicht nur Aldose
Reduktase, sondern besitzen auch eine antihyperglykämische Wirkung, da sie auf PPAR
γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ) wirken und die Empfindlichkeit gegenüber
Insulin steigern (s. Kap. 3.3.1). Die Entwicklung von Glitazonen, die unter Erhalt der
Wirkung auf PPAR γ auch Aldose Reduktase inhibieren, könnte den Zugang zu einer
neuen Klasse von oral wirksamen Antidiabetika eröffnen, die (1) den Blutzuckerspiegel
senken und (2) der Entstehung von Spätfolgen vorbeugen.
Ein weiterer Ansatzpunkt ist der duale Charakter der AR-Bindetasche, die neben der sehr
rigiden Anionen-Bindetasche eine sehr flexible Region aufweist, die die Ausbildung der
verschiedenen hydrophoben Spezifitätstaschen ermöglicht. Grundlage einer zukünftigen
Design-Strategie könnte die getrennte Suche und Optimierung von Fragmenten für die
Anionen-Bindetasche und die hydrophobe Spezifitätstasche sein, um diese anschließend zu
einem potenten Inhibitor zu verknüpfen. Der Vergleich der in dieser Arbeit getesteten
Verbindungen macht deutlich, dass eine ausreichende Flexibilität in dem verknüpfenden Teil
(linker) der so entwickelten Inhibitoren essentiell für eine günstige Bindungsenergie ist, da nur
dann eine optimale Platzierung der Fragmente in der jeweiligen Subtasche möglich sein wird.
Chemikalien und Enzym 153
6 Material und Methoden
6.1 Chemikalien und Enzym
Enzym. Aldose-Reduktase wurde uns vom IGMBC (Illkirch, Frankreich) zur Verfügung
gestellt. Nach Überexpression der mit einem Hexahistidin-Rest versehenen (his)6-hAR im E.
coli Stamm BL21(DE3) (Novagen) bei 37°C (bis OD600nm=0,6) und Aufbrechen der Zellen
mittels Ultraschallbehandlung, erfolgt die Aufreinigung in zwei säulenchromatographischen
Schritten. Zunächst über eine Metall-Affinitäts-Säule (TALON, SuperflowTM, Clontech) und
anschließend nach Abspaltung des Hexahistidin-Restes mittels Thrombin über eine
Anionenaustauscher-Säule (DEAE Sephadex A-50, Pharmacia). Im letzten Schritt erfolgt der
Austausch des zur Elution verwendeten Puffers gegen den bei den ITC-Messungen
verwendeten Puffer und Einengung bis zu einer Proteinkonzentration von 5 mg/ml.
Inhibitoren. Die zu testenden Verbindungen aus den Datenbanksuchen wurden von dem in
der Datenbank angegebenen Hersteller bezogen. Sorbinil und Tolrestat waren über das
IGBMC zugänglich. Vom Institute for Diabetes Discovery wurden IDD370, IDD393 und IDD594
zur Verfügung gestellt.
Sonstige Chemikalien. Soweit es nicht explizit erwähnt wird, wurden die Reagenzien in der
Qualität „pro analysi“ (p.a.) oder höherer Qualität bezogen. Der Kofaktor β-Nicotinamid-
adenin-dinucleotid-phosphat wurde in reduzierter Form (NADPH, analytical grade, 98%) und
in oxidierter Form (NADP+, analytical grade, >97%) als Natrium-Salz von SERVA
(Heidelberg) bezogen. D-Xylose (>99%) wurde bei Sigma-Aldrich (Steinheim) erworben.
Hydantoin (purum, ~97%) wurde von Fluka (Buchs) geliefert.
Wasser. Das verwendete Wasser wurde nach Entionisierung über einen Ionenaustauscher mit
einer Reinstwasseranlage (PurelabTM Plus, ELGA ESF Deutschland GmbH) aufbereitet.
Enzymassay 154
6.2 Enzymassay
Der in dieser Arbeit verwendete in vitro Enzymassay zur Bestimmung von IC50-Werten beruht
auf der Reduktaseaktivität der humanen Aldose Reduktase. Das Aldehyd-Substrat (z.B. D-
Xylose) wird durch die hAR zum entsprechenden Alkohol reduziert. Dabei wird ein Hydrid
vom C4-Atom des Nicotinamid-Teils des Kofaktors NADPH auf das Substrat übertragen.
Der Kofaktor geht in seine oxidierte Form NADP+ über. Die damit einhergehende Abnahme
der Absorption bei 340nm kann mit einem UV-Spektrometer photometrisch verfolgt werden.
In Abhängigkeit von der Konzentration des Inhibitors verläuft die Umsetzung des Subtrates
zeitlich verzögert ab, daraus resultiert eine entsprechend verlangsamte zeitabhängige Abnahme
der Absorption durch NADPH.
Als IC50 ist die Inhibitorkonzentration definiert, bei der das Enzym eine um 50% verminderte
Aktivität zeigt. Zur Bestimmung dieses Wertes werden sogenannte „Dosis-Aktivitäts-
Diagramme“ (dose-response-curves) ausgewertet, bei denen auf der y-Achse die relative Änderung
der Enzymaktivität im Vergleich zur nichtinhibierten Reaktion und auf der x-Achse die
logarithmierte Inhibitorkonzentration aufgetragen ist (Copeland 1996). Gleichung 5 beschreibt
die relative Änderung der Enzymaktivität in Abhängigkeit von der Inhibitorkonzentration.
Gleichung 5
Als Maß für die Enzymaktivität wird die Geschwindigkeit der von dem Enzym katalysierten
Reaktion verwendet, die proportional zur Steigung der Absorptionsänderung bei der
jeweiligen Inhibitorkonzentration ist. Die Enzym- und Substratkonzentration ist bei allen
Messungen gleich.
Zur Durchführung der Messung wurde für jeden Inhibitor eine Verdünnungsreihe angesetzt.
Eine Stammlösung (in der Regel 1mM) des Inhibitors in einem Gemisch aus Phosphat-Puffer
(100mM, pH 6,2) und bis zu 30 Vol% DMSO oder Ethanol wurde hergestellt und
anschließend mit dem Phosphat-Puffer schrittweise jeweils um den Faktor 10 verdünnt.
Der Assay wurde bei 25°C in einer hochtransparenten Mikrotiterplatte mit 96
Reaktionsgefäßen (Greiner GmbH, Deutschland) durchgeführt. Die Absorption bei 340 nm
wurde mit einem Plattenreader (iEMS Reader MF, Labsystems Oy, Finland) detektiert. Die
Enzymassay 155
Reaktionsmischungen in den Reaktionsgefäßen hatten ein Volumen von 250 µL und
bestanden aus Phosphat-Puffer (100 mM, pH 6,2) in dem NADPH (0,14 mM), D-Xylose
(26,5 mM) und humane Aldose Reduktase (0,28 µM) gelöst waren. Die zu testenden
Verbindungen wurden bei Konzentrationen von 0,8 mM bis 20 nM auf Inhibition getestet.
Um die Mischungen anzusetzen, wurden nacheinander folgende Lösungen (s. Tabelle 25) nach
dem dargestellten Schema (s. Abbildung 31) pipettiert.
Tabelle 25. Zusammensetzung der Reaktionsmischungen für den Enzymassay.
Reihenfolge Substanz Konzentration Volumen
1 Phosphat-Puffer pH 6,2 100 mM s. Schema
2 Inhibitor in Phosphat-Puffer s. Schema s. Schema
3 D-Xylose in Wasser (bidest.) 50 mg/ml 20 µL
4 NADPH in Wasser (bidest.) 3 mg/ml 10 µL
5 Aldose Reduktase in TRIS-Puffer
(10 mM, pH 8,0)
0,125 mg/ml 20 µL
1 2 3 4 Verdünnung
A 200 µl 150 µl 100 µl 50 µl StammlösungB 200 µl 150 µl 100 µl 50 µl 1:10C 200 µl 150 µl 100 µl 50 µl 1:100D 200 µl 150 µl 100 µl 50 µl 1:1.000E 200 µl 150 µl 100 µl 50 µl 1:10.000F MAX
Puffervolumen0 µl 50 µl 100 µl 150 µl 200 µL
MAX = Maximale Anfangsgeschwindigkeit ohne Inhibition
Abbildung 31. Schema zum Pipettieren der Lösungen. Jede Zelle steht für ein Reaktionsgefäß der
Mikrotiterplatte. In jeder Zeile wird die angegebene Verdünnung der Inhibitor-Stammlösung
verwendet. Das dabei eingesetzte Volumen ist von Spalte zu Spalte verschieden und in den Zellen
angegeben. Die Farben symbolisieren mit welchem Puffervolumen aufgefüllt wird.
Enzymassay 156
[Inhibitor]10-8 10-7 10-6 10-5 10-4
rel.
Aktiv
ität
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Abbildung 32. Dosis-Aktivitäts-Diagramm zur Bestimmung des IC50-Wertes von Sorbinil.
Die Validierung des Assays erfolgte mit dem Inhibitor Sorbinil (s. Abbildung 32). Der IC50-
Wert von 0,65 ± 0,15 µM fällt in den gleichen Bereich wie die in der Literatur angegebenen
Werte (3,5 - 0,15 µM) (Kato, Nakayama et al. 1991; Poulsom 1987a; Poulsom 1987b; Sarges
and Peterson 1986), die allerdings z.T. mit anderen Substraten oder dem Enzym aus Rind oder
Ratte gemessen wurden.
Zur Auswertung der Dosis-Aktivitäts-Diagramme mittels nichtlinearer Regression wurde das
Programm GRAFIT (LEATHERBARROW 1989-1999) verwendet. Der IC50-Wert ergibt sich aus
dem Wendepunkt der an die experimentellen Werte angepassten, sigmoidalen Kurve. Die
Fehlergrenzen wurden anhand der nichtlinearen Regression ebenfalls mit GRAFIT bestimmt.
Um eine ausreichende Änderung der Absorption während der Reaktionszeit zu erreichen,
wird zur Aktivitätsbestimmung eine relativ hohe Enzymkonzentration benötigt. Dies
wiederum hat zur Folge, dass die freie Inhibitorkonzentration (Menge des frei in Lösung
vorliegenden Inhibitors) geringer ist als die ursprünglich eingesetzte Konzentration. Ein Teil
des Inhibitors ist nach dem Massenwirkungsgesetz mit der Gleichgewichtskonstante Ki an das
Enzym gebunden und liegt somit nicht mehr in Lösung als freier Inhibitor vor. Dieser Effekt
macht sich allerdings erst bei Inhibitorkonzentrationen im nanomolaren Bereich bemerkbar
und konnte daher meist vernachlässigt werden.
Isothermale Titrationskalorimetrie 157
6.3 Isothermale Titrationskalorimetrie
6.3.1 Beschreibung des Gerätes
Alle Messungen wurden mit dem MCS-ITC Kalorimeter der Firma MicroCal Inc.
durchgeführt. Dieses Kalorimeter besitzt zwei Zellen, hergestellt aus einer chemisch
resistenten Legierung, die jeweils ein Volumen von etwa 1,4 ml haben. Beide Zellen sind von
einem adiabatischen Schutzschild umgeben, um Wärmeaustausch zwischen den Zellen und
der Umgebung zu verhindern.
Eine der beiden Zellen dient als Referenzzelle. Sie ist bei Messungen in wässrigen Systemen
mit destilliertem entgastem Wasser befüllt. In der zweiten Zelle, der Messzelle, findet die zu
untersuchende Reaktion statt. Sie besitzt einen nach oben offenen Zugang zum Einführen der
verwendeten Spezialspritze. Deren lange, frei drehbare Kanüle geht an ihrem Ende in ein
kleines Rührblatt über. Dieses wird über einen Motor mit konstanter Geschwindigkeit gedreht
und sorgt so für die Durchmischung der Lösung.
Sowohl die Zellen als auch der adiabatische Mantel besitzen voneinander unabhängige
Thermometer und Heizelemente, welche die Temperaturdifferenzen sowohl zwischen den
beiden Zellen selbst als auch zwischen Mantel und Zellen messen und konstant halten. Der
Temperaturregelkreis zwischen den Zellen und dem sie umgebenden Schild verhindert einen
Wärmeaustausch zwischen Zelle und Schild, indem es eventuell entstehende
Temperaturdifferenzen kompensiert. Zur Konstanthaltung der Temperaturdifferenz zwischen
den Zellen selbst wird während der Messung der Referenzzelle ein konstanter Heizstrom von
etwa einem Milliwatt zugeführt. Die hierdurch auftretende Temperaturdifferenz zwischen
Mess- und Referenzzelle aktiviert das Heizelement der Messzelle, welches versucht durch
Wärmeabgabe in die Messzelle die während der Reaktion entstandene Temperaturdifferenz
wieder auf Null zu bringen. Dieser eingesetzte Heizstrom, angegeben in µcal/s, dient als
Messsignal der ITC und wird mittels eines PCs als Funktion der Zeit aufgezeichnet.
Je nach Art der in der Messzelle stattfindenden Reaktion erhält man unterschiedliche Signale.
Findet nach dem Einspritzen eine exotherme Reaktion statt, so erwärmt sich die Messzelle
stärker als die Referenzzelle und die Heizleistung der Messzellenheizung wird gedrosselt, um
die Temperaturen anzugleichen. Man erhält ein negatives Signal. Handelt es sich jedoch um
eine endotherme Reaktion, so muss der Heizstrom der Messzelle verstärkt werden. Es
resultiert ein positives Signal.
Messungen mit diesem Gerät sind nur bei Reaktionstemperaturen oberhalb der
Raumtemperatur zuverlässig möglich, da der Temperaturausgleich ausschließlich über
Heizelemente erfolgt. Für Reaktionstemperaturen unterhalb der Raumtemperatur ist eine
Isothermale Titrationskalorimetrie 158
Kühlung des Gerätes mittels eines Wasserbades unter Benutzung der eingebauten
Kühlspiralen erforderlich und möglich. Um bei den Experimenten eine ausreichende
Temperaturdifferenz zwischen Reaktions- und Raumtemperatur herzustellen, ist der
Messraum mittels einer Klimaanlage auf 18°C temperiert.
Das Detektionslimit des Gerätes liegt bei ca. 0,5 µcal, was einer Temperaturänderung in der
Messzelle von etwa 10-6 K entspricht. Eine Messung kann dann als ausreichend aufgelöst
betrachtet werden, wenn die gemessene Peakhöhe mindestens 0,1 µcal/s beträgt. Die
schnellste Reaktionszeit, ohne dass eine Überkompensation auftritt, liegt bei 6 bis 7 Sekunden.
∆T2
∆T1
Adiabatischer Schutz
Zugang fürSpritze
CFB
FbHtr
RefHtr
Abbildung 2.17. Schematische Darstellung des isothermen Titrationskalorimeters mit Messzelle
(links) und Referenzzelle (rechts), die durch das Heizelement RefHtr („reference heater“) geheizt
wird. ∆T1 aktiviert das Heizelement CFB („cell feedback“), während ∆T2 das Heizelement FbHtr
(„feedback heater“) aktiviert.
6.3.2 Energetische Betrachtung des Bindungsvorganges
Die reversible Bindung eines Liganden an ein Protein zu einem Protein-Ligand-Komplex wird
im thermodynamischen Gleichgewicht durch das Massenwirkungsgesetz beschrieben.
Gleichung 6 [ ][ ][ ]LPPLK =
Dabei sind die Ausdrücke [P]tot und [L]tot wie folgt definiert:
Isothermale Titrationskalorimetrie 159
Gleichung 7 [ ] [ ] [ ]PLLL tot +=
Gleichung 8 [ ] [ ] [ ] [ ] [ ][ ]LKPLPLPPLP tot ⋅
+=+=
Aus diesen Gleichungen erkennt man, dass sich die Gesamtkonzentration des Liganden in der
Messzelle aus der Summe der Konzentrationen des freien und des gebundenen Liganden
zusammensetzt. Analog dazu setzt sich die Gesamtkonzentration an Protein aus der
ungebundenen und der komplexierten Menge zusammen. Zusätzlich ist in Gleichung 8 die
Konzentration des freien Proteins durch den Term, der sich nach Umstellung des
Massenwirkungsgesetzes ergibt, ersetzt. Anschließend wird Gleichung 7 nach [L] aufgelöst
und in Gleichung 8 eingesetzt. Durch weitere mathematische Operationen erhält man
folgende quadratische Gleichung:
Gleichung 9 [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] 012 =+
−−−+ tottottottot LP
KLPPLPL
Die positive Wurzel dieser Gleichung lautet:
Gleichung 10 [ ]2
42 abbPL −−−=
mit
Gleichung 11 [ ] [ ]K
LPb tottot1
−−−=
und
Gleichung 12 [ ] [ ]tottot LPa =
Im nächsten Schritt wird die Konzentration des Protein-Ligand-Komplexes [PL] nach der
Gesamtkonzentration des Liganden [L]tot abgeleitet. Nach Umstellung der erhaltenen
Gleichung ergibt sich:
Isothermale Titrationskalorimetrie 160
Gleichung 13 [ ][ ] ( ) ( )22 112
2211
21
rrXX
Xr
LdPLd
rr
r
tot ++−−
−+
−+=
mit
Gleichung 14 [ ]totPKr 1=
und
Gleichung 15 [ ][ ]tot
totr PLX =
Ziel der mathematischen Umformungen ist es, einen Zusammenhang zwischen der
freigesetzten bzw. absorbierten Wärmemenge Q und den Konzentrationen in der Messzelle zu
finden. Q hängt von folgenden Faktoren ab:
a) Zellvolumen V
b) molare Bindungsenthalpie ∆H
c) Stöchiometrie
d) Menge des eingespritzten Liganden
e) Konzentrationen in der Messzelle
Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass mit der Abnahme an unkomplexiertem Protein die
freigesetzte Wärmemenge verringert wird, ergibt sich die nachfolgende Gleichung. Dabei ist
die Abnahme der Anzahl unbesetzter Bindetaschen antiproportional zur
Konzentrationsänderung des Protein-Ligand-Komplexes d[PL].
Gleichung 16 [ ] VHPLddQ ⋅∆⋅=
Der Term d[PL] fasst dabei die Faktoren c), d) und e) zusammen, von denen die
Wärmemenge Q abhängig ist.
Isothermale Titrationskalorimetrie 161
Die Gleichung zeigt, dass die Änderung der Konzentration von [PL] der Änderung von Q
proportional ist. Dies bedeutet, dass je größer die Änderung von [PL] ist, desto größer ist die
umgesetzte Wärmemenge und umgekehrt.
Die Änderung der Konzentration von [PL] wurde bereits in Gleichung 13 beschrieben. Durch
Substitution in Gleichung 16 erhält man:
Gleichung 17 [ ] ( ) ( )
++−−
−+
−+∆=⋅
22 11222
11
211
rrXX
Xr
HLddQ
Vrr
r
tot
Diese Beziehung beschreibt die Bindungsreaktion zwischen einem Protein und einem
Liganden im Verhältnis 1:1 und ist ein Ausdruck für die umgesetzte Wärmemenge.
Bei einer starken Bindung zwischen Protein und Ligand, d.h. hohen K-Werten, werden bei
jeder Zugabe die Ligandmoleküle sofort quantitativ gebunden. Die freigesetzte Wärmemenge
bleibt gleich, da sie bei überschüssiger Enzymkonzentration nur von der Anzahl an
eingespritzten Ligandmolekülen abhängt. Dieser Vorgang wiederholt sich bis zur kompletten
Sättigung des Enzyms. Überschreitet man den Äquivalenzpunkt, so wird, da keine Bindungen
mehr geknüpft werden, auch keine Wärme mehr freigesetzt. Der dennoch beobachtete
Wärmeumsatz muss demnach auf andere Phänomene, wie z.B. Verdünnungseffekte
zurückzuführen sein. Bei hohen K-Werten hat die Titrationskurve die Form einer
Stufenfunktion, deren Höhe ∆H entspricht.
Bei kleineren Werten für K nimmt die freigesetzte Wärmemenge ab, sobald man sich dem
Sättigunspunkt der Titration nähert. Dies kommt dadurch zustande, dass nicht mehr alle
Ligandmoleküle quantitativ gebunden werden. Beim Übergang zu kleineren Werten für K geht
also die Bindungskurve aufgrund der eben beschriebenen Phänomene in eine sigmoidale
Form über. Bei zu kleinen K-Werten erhält man fast eine Horizontale. Aus solch flachen
Kurven lassen sich keine Informationen über K mehr entnehmen.
Simulierte Bindungskurven bezüglich der Gleichung 17 sind in Abbildung 33 dargestellt. Für
die Interpretation dieser Kurven wird ein zusätzlicher Parameter c eingeführt, der reziprok
zum Wert r aus Gleichung 14 ist.
Gleichung 18 [ ]totPKr
c ==1
Isothermale Titrationskalorimetrie 162
Bei einer sehr starken Bindung (c = ∞) des Liganden L an das Protein P werden alle Moleküle
des Liganden sofort gebunden, bis die Sättigung des Proteins eintritt, d.h. bis alle katalytischen
Zentren besetzt sind. Als Bindungskurve ergibt sich dann eine Stufenfunktion mit der Höhe
∆H.
∆H
0.01
1
5
40 500
∞
1 20[L]tot/[P]tot
0.5
Abbildung 33. Simulierte Bindungsisotherme nach Gleichung 17 für verschiedene Parameter c = K
[P]tot. Die Werte für c sind in der Abbildung dargestellt.
Für relativ starke Ligandenbindungen mit c = 10 - 500 geht diese Stufenfunktion in eine
sigmoidale Kurve über, deren Verlauf stark von dem Parameter c abhängt. Schwache
Ligandenbindungen ergeben fast horizontale Bindungskurven (c < 5), die nur wenig
Informationen über die Bindungskonstante K enthalten. Der c-Wert und die
Bindungskonstante K sind direkt proportional zueinander. Große c-Werte sprechen daher für
eine hohe Bindungskonstante, kleine c-Werte für eine niedrige.
Aus diesen Überlegungen ergibt sich zwangsläufig, dass bei großen Bindungskonstanten nur
geringe Proteinkonzentrationen eingesetzt werden können, wenn man den oben genannten
Bereich geeigneter c-Werte nicht verlassen möchte. Der Einsatz einer geringeren
Proteinkonzentration führt aber im Gegenzug zu einer Verringerung der insgesamt
freigesetzten Wärmemenge. Daher ist es unter Umständen möglich, dass bei einer solchen
Messanordnung das Detektionslimit des Messgerätes unterschritten wird und dadurch eine
Messung unmöglich wird.
Isothermale Titrationskalorimetrie 163
6.3.3 Bestimmbare Größen
Die Messgrößen, die aus einer einzigen ITC-Messung erhalten werden können, sollen im
folgenden Abschnitt kurz erläutert werden. Um diese Daten mittels einer anderen Methode zu
bestimmen, sind mehrere Messungen unter unterschiedlichen Bedingungen erforderlich.
Das Messsignal der ITC ist, wie oben beschrieben, der Heizstrom zum Erwärmen der
Messzelle, angegeben in µcal/s, aufgetragen gegen die Zeit. Es resultiert eine Kurve wie in
Abbildung 34 (oben).
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0 10 20 30 40 50 60 70
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5-6
-4
-2
0
Molares Verhältnis
Zeit (min)
µcal
/sec
kcal
/mol
pro
Inje
ktio
n
Abbildung 34. Ergebnis einer ITC-Messung. Die obere Hälfte zeigt die Rohdaten einer typischen
ITC Messung. Jeder Peak steht für eine Injektion. Nach der vollständigen Sättigung des Proteins
zeigen die letzten Peaks nur die Wärmetönung, die durch die Verdünnung des Liganden in der
Zelle entsteht. Die Messpunkte in der unteren Hälfte der Abbildung sind jeweils das Integral der
obigen Peaks. Die durchgezogene Kurve repräsentiert das Ergebnis der Kurvenanpassung nach
der Methode der kleinsten Fehlerquadrate.
Isothermale Titrationskalorimetrie 164
Anschließend wird mittels eines Computers das Integral der einzelnen Peaks zwischen
Basislinie und Kurvenverlauf gebildet. Dieses wird dann gegen das molare Verhältnis von
Ligand zu Protein aufgetragen, wie in Abbildung 34 (unten) dargestellt.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
-5
-4
-3
-2
-1
0
Molares Verhältnis
kcal
/mol
pro
Inje
ktio
n
Stöchiometrie
∆G
∆H
Abbildung 35. Auswertung einer ITC Messung. Die Messpunkte in der Abbildung entsprechen
jeweils dem Integral der Messsignale. Die durchgezogene Kurve repräsentiert das Ergebnis der
Kurvenanpassung nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate. Der Achsenabschnitt auf der
Ordinate repräsentiert die Bindungsenthalpie ∆H, aus dem Kurvenverlauf lässt sich die Freie
Bindungsenthalpie ∆G und somit auch die Bindungskonstante K bestimmen.
Den sigmoidalen Kurvenverlauf erhält man mittels einer mathematischen Fit-Funktion
(Gleichung 17), mit deren Hilfe die Kurve an die erhaltenen Messpunkte angepasst wird. Die
Berechnung der Kurve erfolgt vollautomatisch mit Hilfe eines PCs und einer entsprechenden
Software. Aus dem Kurvenverlauf berechnet der PC den Wert der Bindungskonstante K, die
Stöchiometrie der Reaktion und die Enthalpie ∆H. Die freie Enthalpie ∆G und die Entropie
∆S können anschließend daraus abgeleitet werden.
Isothermale Titrationskalorimetrie 165
6.3.3.1 Enthalpie
Der Betrag der Enthalpie der untersuchten Bindungsreaktion lässt sich, wie in Abbildung 35
zu sehen, direkt aus dem Kurvenschnittpunkt mit der y-Achse ablesen. Dabei ist jedoch zu
beachten, dass die durch ITC-Messungen bestimmte Enthalpie die gesamte Wärmetönung des
kompletten Reaktionssystems darstellt. Sie enthält sowohl den Wärmeaustausch zwischen den
reagierenden Molekülen, als auch die durch überlagerte Prozesse umgesetzte Wärmemenge.
Dies können zum Beispiel konformative Änderungen, Ionisierung von polaren Gruppen und
Wechselwirkungen mit den anderen Pufferkomponenten sein. Um die Enthalpie der reinen
Bindungsreaktion zu bestimmen, müssen diese Wärmemengen zuvor abgezogen werden.
6.3.3.2 Bindungskonstante
Bei der ITC handelt es sich um eine Methode für thermodynamische Messungen. Solche
Messungen machen keinerlei Aussagen über die Kinetik einer Reaktion, sondern liefern
lediglich Daten über energetische Änderungen der Reaktionspartner. Registriert wird also
lediglich die Aufnahme bzw. Abgabe von Wärme. Um zu auswertbaren Ergebnissen zu
kommen, ist es notwendig, dass bei Konzentrationen gearbeitet wird, bei denen ausreichende
Mengen an Ligand, freiem Protein und Komplex vorhanden sind. Die verwendeten
Konzentrationen müssen oberhalb der Dissoziationskonstanten des Komplexes liegen. Nur
dann kann die resultierende sigmoidale Kurve ausgewertet werden. Zu hohe Konzentrationen
resultieren in einem zu hohen c-Wert mit den weiter oben beschriebenen Folgen. Zu niedrige
Konzentrationen entsprechen einem zu niedrigen c-Wert, was auch zu einem nicht
auswertbaren Kurvenverlauf bezüglich der Bindungskonstanten führt.
6.3.3.3 Freie Enthalpie und Entropie
Da die Messung isotherm erfolgt, lässt sich unter Standardbedingungen nach der Bestimmung
der Reaktionsenthalpie und der Bindungskonstanten auch die Änderung der freien Enthalpie
und in der Folge die Entropieänderung mit Gleichung 19 berechnen:
Gleichung 19 STHKTRG ∆⋅−∆=⋅⋅−=∆ ln
Auch hier ist zu beachten, dass sich die gemessene Entropieänderung aus den Beiträgen des
gesamten Systems zusammensetzt.
Isothermale Titrationskalorimetrie 166
6.3.3.4 Stöchiometrie der Reaktion
Aus einer mittels einer ITC-Titration erhaltenen sigmoidalen Kurve lässt sich die
Stöchiometrie der beobachteten Reaktion direkt ablesen. Voraussetzung hierfür ist, dass mit
Konzentrationen oberhalb der Dissoziationskonstanten gearbeitet wird. Nur in diesem Fall ist
der zur Bestimmung des Äquivalenzpunktes benötigte Sprung in der Titrationskurve deutlich
zu sehen.
6.3.4 Durchführung der Messungen
Damit die entstehende Reaktionswärme nicht von anderen wesentlich stärkeren Effekten wie
Verdünnungswärme oder anderen Mischungseffekten überlagert wird, müssen Enzym und
Ligand in Pufferlösungen gelöst werden, die sich bezüglich pH-Wert, Zusammensetzung und
Konzentration nicht unterscheiden. Vor dem Befüllen von Zelle und Spritze müssen beide
Lösungen erst durch das Anlegen eines Unterdrucks entgast werden, um die Wärmekapazität
der Messzelle nicht zu verfälschen. Anschließend muss beim Befüllen darauf geachtet werden,
keine Luftblasen in Zelle oder Spritze zu bekommen. Nach dem Starten der Messung dauert
es ca. 10 Minuten bis das Gerät die Lösungen in der Zelle vollständig thermostatisiert hat. Die
eigentliche Messung besteht aus 10 bis 20 Einspritzungen eines Aliquots von 10 - 20 µl
Volumen. Die Wartezeit zwischen zwei Einspritzungen hängt im Wesentlichen davon ab, wie
lange das System braucht, um nach einem Messpeak wieder eine stabile Basislinie herzustellen,
d.h. die Temperaturdifferenz zwischen Mess- und Referenzzelle auszugleichen. In der Regel
liegt dieser Zeitraum zwischen zwei und fünf Minuten. Das verwendete Volumen einer
Einspritzung hängt von einigen unterschiedlichen Faktoren ab, wie z.B. Inhibitor- und
Proteinkonzentration, Größe der Spritze, erwarteter Wärmetönung und Bindungskonstante K.
Die Konzentration des Liganden in der Messzelle am Ende der Messung sollte etwa doppelt
so groß sein wie die eingesetzte Proteinkonzentration. Bei einer solchen Wahl der
Konzentrationen kommen die letzten Signale, die ja beträchtlich hinter dem Äquivalenzpunkt
liegen nur noch aufgrund von Verdünnungswärme des Liganden oder unspezifischen
Bindungsvorgängen zustande, da das Protein zu diesem Zeitpunkt bereits vollständig gesättigt
ist. Diese daraus resultierende Wärme muss daher von der eigentlichen Bindungsisothermen
subtrahiert werden.
Isothermale Titrationskalorimetrie 167
6.3.4.1 Inhibitordatensatz
NH
NH
O
O
O
F
Sorbinil
NH
NOOH
O
HD04
N SHOOC
CF3
O
Tolrestat
SN
O O
OOH
O2N
IDD370
ClO
OH
O
NH
OO2N
IDD393
FO
OH
O
NH
SF
Br
IDD594
6.3.4.2 Kalibrierung
Das Kalorimeter wurde halbjährlich kalibriert. Die Kalibrierung erfolgt mittels einer Reihe
elektrischer Standardimpulse. Die beiden Zellen sind dabei mit Wasser zu füllen. Aus dem
Verhältnis von gemessener Wärmemenge zu theoretisch zu erwartender Wärmemenge wird
über alle Wärmeimpulse ein Mittelwert gebildet, der zur Anpassung der
Kalibrierungskonstanten dient. Dabei wird die neue Kalibrierungskonstante const´ gemäß
Gleichung 20 durch Multiplikation der alten Konstante const mit diesem durchschnittlichen
Verhältnis von erwarteter zu gemessener Wärmemenge erhalten.
Gleichung 20 const´ = const ⋅ [ Σ(Werwartet / Wgemessen ) / Anzahl Impulse ]
Dies ist allerdings nur notwendig, falls die gemessenen Wärmemengen um mehr als 1% von
den erwarteten Wärmemengen abweichen, was nie der Fall war.
6.3.4.3 Allgemeine Messvorschrift
Alle Messungen wurden bei 25 °C durchgeführt. Dazu wurde der Thermostat des
Kalorimeters ebenfalls auf 25 °C eingestellt. Alle Messungen wurden bei pH 8,0 in 10 mM
TRIS- oder HEPES-Puffer durchgeführt, der keine weiteren Zusätze (insbesondere keine
Salze) enthielt.
Isothermale Titrationskalorimetrie 168
Zur Katalyse der Reduktion von Aldehyden benötigt Aldose Reduktase den Kofaktor
NADPH, es handelt sich also um ein ternäres System. Da nur die bei der Bindung des
Liganden an das Holo-Enzym (den Protein-Kofaktor-Komplex) auftretende Wärmetönung
gemessen werden sollte, wurde das Enzym mit dem Kofaktor präinkubiert. Der Kofaktor
NADP+ bzw. NADPH wurde in 10fachem Überschuss (bezogen auf das Enzym) zusammen
mit dem Enzym in der Messzelle vorgelegt. Die Lösung wurde unter Rühren entgast und dann
blasenfrei mit einer Hamiltonspritze in die Messzelle eingefüllt, die vorher mit Wasser
vorgespült worden war.
Der zu messende Ligand wurde in demselben Puffer wie das Protein gelöst. Diese Lösung
enthielt den Kofaktor in der gleichen Konzentration wie in der Messzelle. Die Konzentration
des Liganden in der Spritze war in der Regel zehnmal so groß wie die Konzentration des
Proteins in der Messzelle. Die Lösung wurde ebenfalls unter Rühren entgast. Die
Spezialspritze für die kalorimetrische Messung wurde blasenfrei mit der Lösung des Liganden
aufgezogen. Bei allen Messungen wurde eine 250 µl Spritze verwendet. Die
Injektionsvolumina lagen zwischen 10 und 15 µl in Abhängigkeit von der Größe der
gemessenen Wärmetönung. Als Injektionszeit wurde jeweils die Hälfte des von der MicroCal
Observer Software vorgegebenen Wertes gewählt. Es wurden 15 – 20 Injektionen
durchgeführt. Die Wartezeit zwischen zwei Injektionen betrug in der Regel 400 Sekunden und
die Rührgeschwindigkeit 400 Umdrehungen pro Minute. Die Wartezeit vor der ersten
Injektion (initial delay) lag bei 180 Sekunden. Die Referenz-Heizleistung (reference offset) konnte
bei allen Messungen auf 10 % gesetzt werden.
Tabelle 26. Typische Zusammensetzung der Lösungen in der Messzelle und in der Spezialspritze.
(Konzentration der Stammlösung )
Messzelle Spritze
1800 µl hAR-Stammlösung (28 µM) 1800 µl Ligand-Stammlösung (280 µM)
200 µl Kofaktor-Stammlösung (2,5 mM) 200 µl Kofaktor-Stammlösung (2,5 mM)
Zur Auswertung der Messdaten wurde die mitgelieferte Software Microcal Origin Version 5.0
und spezielle Auswertungsskripte verwendet. Die Anpassung der Bindungsisothermen an die
Messpunkte erfolgte nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate (least squares fit). Für die
Stöchiometrie der Bindungsreaktion wurde häufig ein Wert n < 1 erhalten. Da dieser Wert
theoretisch bei eins liegen muss, wurde dies auf eine Verringerung der Konzentration des
Isothermale Titrationskalorimetrie 169
aktiven Proteins zurückgeführt. Es war offensichtlich, dass das Protein „altert“, da die
Abweichung von dem theoretischen Wert im Laufe der Zeit zunahm. Um nur die
Konzentration des aktiven Proteins zu berücksichtigen, wurde die Proteinkonzentration bei
der Auswertung so angepasst, dass ein stöchiometrischer Faktor n ≈ 1 erhalten wurde.
Aus der Anpassung der Bindungsisothermen an die Messpunkte ergibt sich der Fehler mit
dem jede einzelne Messung versehen ist. Zur Bestimmung eines statischen Fehlers wurden die
Messungen bis zu viermal wiederholt. Allerdings konnten aufgrund des Mangels an
Proteinmaterial nicht alle Messungen hinreichend oft wiederholt werden, um einen
verlässlichen statistischen Mittelwert und Fehler zu bestimmen.
Die Verdünnungswärme des Inhibitors wurde durch Injektion der Inhibitorlösung (ohne
Kofaktor) in die Messzelle, in der die Pufferlösung (ohne Protein) vorgelegt war, ermittelt.
Analog wurde die Verdünnungswärme des Proteins durch Injektion der Pufferlösung in die
Messzelle, in der das Protein (im gleichen Puffer gelöst) vorgelegt war, gemessen. Die
Wärmemenge, die durch die Verdünnung des Inhibitors oder des Proteins entsteht, lag
aufgrund der geringen Konzentrationen in der Regel unterhalb des Detektionslimits. Daher
brauchte keine Korrektur bezüglich der Verdünnungswärmen zu erfolgen.
6.3.4.4 Ionisierungsreaktionen
Kalorimetrische Untersuchungen von biologischen Systemen werden in gepufferten Lösungen
durchgeführt, um den pH-Wert konstant zu halten. Werden gleichzeitig mit der eigentlichen
Bindungsreaktion Protonen vom beobachteten System aufgenommen oder abgegeben, so ist
die Enthalpie, die auf diese Protonierungsreaktion zurückzuführen ist, ein Teil der gemessenen
Gesamtenthalpie. Die Reaktion der Protonierung läuft folglich simultan zur
Assoziationsreaktion zwischen Ligand und Protein ab.
Als Beispiel wird eine Reaktion zwischen einem Protein P und dem Liganden L betrachtet:
Gleichung 21 P + L + n H+ PL(nH+) ; ∆Hbind
Das Protein P bildet mit dem Liganden L den Komplex PL. Falls sich der Protonierungs-
zustand bei dieser Assoziationsreaktion ändert, können vom System entweder n Protonen
aufgenommen (n > 0) oder n Protonen abgegeben (n <0) werden. Der Wert ∆Hbind beschreibt
Isothermale Titrationskalorimetrie 170
die intrinsische Bindungsenthalpie unter der Annahme, dass die ionisierbare funktionelle
Gruppe von P bzw. L keine von Null verschiedene Ionisierungsenthalpie aufweist.
Wenn diese Reaktion in einer gepufferten Lösung stattfindet, so werden von der
Puffersubstanz BH+ Protonen aufgenommen oder abgegeben.
Gleichung 22 BH+ B + H+ ; ∆Hion
Das heißt also, dass die Protonen, die vom System aufgenommen werden, von der
Puffersubstanz abgegeben werden und umgekehrt.
Wenn man die intrinsische Bindungsenthalpie ∆Hbind der Protein-Liganden-Bindung und die
Enthalpie ∆Hion, die mit der Protonenaufnahme oder –abgabe des Puffers zusammenhängt,
betrachtet, so ist die kalorimetrisch gemessene Wärmetönung ∆Hges die Summe dieser beiden
Enthalpien.
Gleichung 23 ionbindges HnHH ∆+∆=∆
Das bedeutet, dass für die richtige Bestimmung der intrinsischen Bindungsenthalpie ∆Hbind der
Beitrag des Puffers von der gemessenen Wärmetönung ∆Hges abgezogen werden muss.
Um aber den richtigen Beitrag des Puffers für die Bestimmung der intrinsischen Enthalpie
∆Hbind zu ermitteln, muss man die betreffende Ionisierungenthalpie ∆Hion des Puffers und die
Anzahl n der übertragenen Protonen kennen.
In dieser Arbeit wurden die kalorimetrischen Messungen des hAR-Ligand-Systems bei
konstantem pH-Wert und kontanter Temperatur in zwei verschiedenen Puffern wiederholt,
die sich in ihren Ionisierungsenthalpien signifikant unterscheiden. HEPES hat mit 21,07
kJ/mol eine viel kleinere Ionisierungsenthalpie als TRIS mit 48,07 kJ/mol (Fukada and
Takahashi 1998). Ansonsten war die Zusammensetzung völlig identisch, um vergleichbare
Ergebnisse zu erhalten. Durch Auftragen der gemessenen Wärmetönungen ∆Hges gegen die
jeweiligen Ionisierungsenthalpien ∆Hion der Puffersubstanzen wurde der Achsenabschnitt auf
der ∆Hges-Achse und somit die intrinsische Enthalpie ∆Hbind des betrachteten Systems
bestimmt. Aus der Steigung der Geraden wurde der Parameter n bestimmt, der für die Anzahl
der übertragenen Protonen steht.
Isothermale Titrationskalorimetrie 171
∆Hion
∆Hges
∆Hbind
Abbildung 36. Gemessene Enthalpie ∆Hges aufgetragen gegen die jeweilige Ionisierungsenthalpie
∆Hion. Die Steigung der angepassten Geraden ergibt die Anzahl n der übertragenen Protonen. Der
Abschnitt auf der ∆Hges-Achse bestimmt die intrinsische Bindungsenthalpie ∆Hbind .
Besitzt die ionisierbare funktionelle Gruppe des Liganden bzw. des Proteins eine von Null
verschiedene Ionisierungsenthalpie, muss zusätzlich noch ein Korrekturterm für die
Ionisierungsenthalpie dieser Gruppe berücksichtigt werden. Für die Korrektur der
gemessenen Enthalpie um dem Wärmebeitrag, der durch die Deprotonierung der Hydantoin-
Gruppe des Sorbinil entstand, wurde die Ionisierungsenthalpie von Hydantoin bestimmt.
Dazu wurde eine 50 mM Hydantoin-Lösung auf pH 9,16 eingestellt, entsprechend dem pKA-
Wert der Verbindung (Edward et al. 1957; Zief et al. 1937). Die Lösung wurde entgast und in
der Messzelle des ITC-Gerätes vorgelegt. Anschließend wurden mit der 100 µl Spritze 10
Aliquote je 10 µl Volumen einer 1 mM Salzsäure injiziert. Aus den bei 25 °C gemessenen
Enthalpien je Injektion bildete man den Mittelwert. Zur Bestimmung der
Verdünnungsenthalpie injizierte man die 1 mM Salzsäure nach dem gleichen Protokoll in eine
mit Wasser gefüllte Zelle. Die gemessene Ionisierungenthalpie wurde danach um den Betrag
der Verdünnungsenthalpie korrigiert.
Methoden des computergestützten Wirkstoff-Designs 172
6.4 Methoden des computergestützten Wirkstoff-Designs
Für die Molecular Modeling Arbeiten wurden die Programmpakete SYBYL 6.7 und 6.8 (2001a)
sowie MOLOC 01/05/08 (Gerber 2001) verwendet. Als Workstation diente eine Silicon
Graphics O2 (R5000).
6.4.1 Berechnung von günstigen Wechselwirkungsfeldern in der Bindetasche
Günstige Wechselwirkungsfelder (Hot Spots) in der Bindetasche wurden mit den Programmen
SUPERSTAR (BOER, KROON ET AL. 2001; VERDONK, COLE ET AL. 1999; VERDONK, COLE ET
AL. 2001) und DRUGSCORE (Gohlke, Hendlich et al. 2000a; Gohlke, Hendlich et al. 2000b)
berechnet. Beide Ansätze haben gemeinsam, dass zunächst ein dreidimensionales Gitter in die
Protein-Bindetasche platziert wird. An jedem Gitterpunkt werden dann die Wechselwirkungen
einer bestimmten Sonde zu den umgebenden Proteinatomen berechnet.
6.4.1.1 Berechnungen mit SuperStar
SUPERSTAR basiert auf Informationen über nicht bindende Wechselwirkungen, die aus einer
statistischen Analyse von Packungsmustern in Kristallstrukturen von kleinen Molekülen
abgeleitet wurden (Verdonk, Cole et al. 1999). Als Datenbasis dient die ISOSTAR-Datenbank
(Bruno et al. 1997). In dieser Datenbank sind Informationen über Wechselwirkungen als
Streuungs-Diagramme (scatterplots) gespeichert. Diese scatterplots zeigen die Verteilung einer
bestimmten Kontaktgruppe, die als Sonde fungiert, um ein zentrales Strukturfragment.
SUPERSTAR zerlegt ein Templatmolekül (z.B. eine Bindetasche) in eine Reihe von solchen
Strukturfragmenten, für die eine ausreichende Anzahl von Einträgen in der IsoStar-Datenbank
vorhanden sind. Die zu den Fragmenten gehörenden scatterplots werden auf die
entsprechenden Teile des Templats überlagert und in eine Wahrscheinlichkeitsdichte
konvertiert. Diese kann auf verschiedenen Wahrscheinlichkeitsniveaus konturiert werden. Ein
Wahrscheinlichkeitsniveau von 2,0 bedeutet, dass die Kontakte auf einem bestimmten
Gitterpunkt mit einer zweimal höheren Wahrscheinlichkeit auftreten, als dies bei einer
zufälligen Verteilung zu erwarten wäre.
Als Repräsentant für einen Wasserstoffbrücken-Akzeptor wurde die neutrale Carbonyl-
Sauerstoff-Sonde gewählt. Hydrophobe Wechselwirkungen wurden mit der aromatischen
Kohlenstoff-Sonde sowie mit der Methyl-Kohlenstoff-Sonde charakterisiert. Die
Berechnungen wurden mit den Standardeinstellungen durchgeführt. Als Templatmolekül
Methoden des computergestützten Wirkstoff-Designs 173
wurde die Kristallstruktur der humanen Aldose Reduktase im Komplex mit dem Inhibitor
IDD594 verwendet. Zur graphischen Auswertung wurden die Hot Spots so konturiert, dass
relativ scharf lokalisierte Felder erhalten wurden.
6.4.1.2 Berechnungen mit DRUGSCORE
DRUGSCORE basiert auf Daten, die aus Kristallstrukturen von Ligand-Protein-Komplexen
abgeleitet wurden (Gohlke, Hendlich et al. 2000a; Gohlke, Hendlich et al. 2000b). Als
Datenbasis diente die RELIBASE-Datenbank (Hendlich 1998; Hendlich, Bergner et al. 2003).
Die Häufigkeit des Auftretens bestimmter Protein-Ligand-Kontakte wurde dabei in Bezug auf
einen Referenzzustand in Pseudo-Potenziale konvertiert. Die Auflösung von Protein-
Kristallstrukturen ist in der Regel zu gering, um Wasserstoffatome zuordnen zu können.
Deshalb wurden bei der Ableitung der DRUGSCORE-Potenziale Wasserstoffatome im
Gegensatz zu SUPERSTAR nicht explizit berücksichtigt. Die Potenziale können sowohl zum
Bewerten von Ligand-Protein-Wechselwirkungen (als Scoring-Funktion), als auch zur
Vorhersage von ausgezeichneten Wechselwirkungsbereichen in der Bindetasche verwendet
werden. Bei der Berechnung von Hot Spots wird der niedrigste Potenzial-Wert, der auf einem
Gitterpunkt berechnet wird (das globale Optimum), von DRUGSCORE auf 100 gesetzt. Ein
Niveau von 80 bedeutet, dass der Bereich Funktionswerte von bis zu 20% über dem globalen
Optimum für den betrachteten Atomtyp umschließt. Als Repräsentant für einen
Wasserstoffbrücken-Akzeptor wurde die O.2-Sonde gewählt. Hydrophobe Wechselwirkungen
wurden mit der C.ar- sowie mit der C.3-Sonde charakterisiert. Die Berechnungen wurden mit
den Standard-Einstellungen durchgeführt. Verwendet wurde die Kristallstruktur der humanen
Aldose Reduktase im Komplex mit dem Inhibitor IDD594. Zur graphischen Auswertung
wurden die Hot Spots so konturiert, dass relativ scharf lokalisierte Felder erhalten wurden.
6.4.2 Generierung von Datenbanken für das virtuelle Screening
In den verwendeten Datenbanken sind die Moleküle zumeist als 2D-Strukturen gespeichert.
Mit CORINA (Sadowski 1997) wurden daraus 3D-Strukturen generiert. Dabei wurden fehlende
Wasserstoffatome (z. B. von Carboxylatgruppen) ergänzt und kleine Fragmente, die nicht
kovalent mit einem zweiten Molekül verbunden waren (z. B. Gegenionen), entfernt.
Anschließend wurden aus den so generierten 3D-Strukturen mit Hilfe des UNITY-Befehls
dbimport UNITY-Datenbanken erzeugt (2001b). Mit dem Befehl dbmkscreen wurden
Macro-Fingerprints generiert, um spätere Suchen zu beschleunigen.
Methoden des computergestützten Wirkstoff-Designs 174
Folgende Datenbanken wurden verwendet:
• Available Chemicals Directory ACD (Version 2000.1), http://www.mdli.com
• Maybridge (Version 6/2000), http://www.maybridge.com
6.4.3 UNITY-Pharmakophor-Generierung
Pharmakophor-Modelle wurden mit UNITY (2001B) aufgebaut. Die geforderten
Wechselwirkungseigenschaften (Wasserstoffbrücken-Donor bzw. -Akzeptor, hydrophobe
Gruppe) wurden durch Pseudozentren im Raum beschrieben. Die Positionierung dieser
Pseudozentren erfolgte entweder anhand von günstigen Wechselwirkungsfeldern (Hot Spots)
oder durch Vergleich der physikochemischen Eigenschaften überlagerter AR-Inhibitoren.
Suchtoleranzen wurden durch Sphären um diese Punkte festgelegt, wobei der Radius der
maximalen Abweichung entsprach. Bei der in Kapitel 4.2 beschriebenen Datenbanksuche
wurden die Radien der Suchtoleranzen auf Ligand-Seite den zu Grunde liegenden Hot Spots
angepasst.
Bei der in Kapitel 4.3 beschrieben Datenbanksuche wurde die Form der Bindetasche durch
die Festlegung von verbotenen Bereichen (excluded volumes) in den Pharmakophor einbezogen.
Die Radien der verbotenen Bereiche auf Proteinseite wurden so eingestellt, dass Liganden in
einem Testdatensatz, bestehend aus bereits bekannten AR-Inhibitoren der
Pharmakophorhypothese genügten.
6.4.4 Proteinüberlagerung
Die Kristallstruktur der humanen Aldose Reduktase im Komplex mit dem Inhibitor IDD594
wurde in eine interne Version der RELIBASE+ Datenbank aufgenommen und diente als
Referenz für die Überlagerung der restlichen in PDB abgelegten Proteinstrukturen der Aldose
Reduktase. Die Sequenzidentität zwischen humaner und AR aus Schweinelinsen liegt bei
86,3%. Daher wurden alle Strukturen mit einer Sequenzidentität ≥85% gesucht. Die
Strukturen wurden mit RELIBASE+ auf die Referenz überlagert und im mol2-Format
exportiert. Bei Hendlich et al. finden sich weitere Angaben zum verwendeten Algorithmus. Da
in den exportierten Dateien Informationen über Bindungen fehlten, wurden die Original-
PDB-Koordinaten mit dem SYBYL-Kommando fit (nur die Cα Atome wurden verwendet) auf
die von RELIBASE+ generierten Koordinaten gelegt.
Methoden des computergestützten Wirkstoff-Designs 175
6.4.5 Molekülüberlagerung und Ähnlichkeitsvergleich
Für die Überlagerung kleiner Moleküle wurde das ursprünglich von Kearsley und Smith
entwickelte, später von Klebe et al. modifizierte Programm SEAL (Steric and Electrostatic
ALignment) verwendet (Klebe, Mietzner et al. 1994). Das Programm überlagert Moleküle
anhand ihrer physikochemischen Eigenschaften. Diese werden über van-der-Waals-Radien,
Partialladungen, atombasierende Hydrophobizitäten (Viswanadhan et al. 1989) und
Wasserstoffbrücken-Eigenschaften ausgedrückt. Das Ähnlichkeitsmaß zweier rigider Moleküle
bei der Überlagerung wird durch eine Bewertungsfunktion ermittelt, die formal dem von
Carbó definierten Ähnlichkeitsmaß entspricht. Der räumliche Verlauf der Eigenschaften bei
der Berechnung der Bewertungsfunktion wird über Gauss-Funktionen dargestellt. Die
Überlagerung erfolgt dadurch, dass die Bewertungsfunktion durch Translation und Rotation
eines Moleküls maximiert wird.
Die Prozedur align kombiniert SEAL mit dem Programm MIMUMBA, das eine wissensbasierte
Konformationsanalyse der Moleküle ermöglicht. Dies erlaubt die flexible Überlagerung der
Verbindungen aus dem Testdatensatz bzw. aus der Datenbanksuche auf eine rigide
Referenzstruktur. Eine genaue Beschreibung des Algorithmus findet sich bei (Krämer 1999).
Als Referenzstruktur wurden die mit dem SYBYL-Befehl merge (unter Beibehaltung aller
Atome) vereinigten Inhibitoren Sorbinil, Tolrestat und Zopolrestat verwendet. Die
Bindungsgeometrien der drei Inhibitoren wurden den mit RELIBASE+ überlagerten
Komplexstrukturen entnommen (PDB-Codes 1ah0, 1ah0, 1mar).
Partialladungen wurden für alle Verbindungen nach der Methode von Gasteiger und Marsili
berechnet.
Jede Verbindung des Testdatensatzes bzw. aus der Datenbanksuche wurde einzeln auf die
Referenz überlagert, wobei für jede Verbindung 50 Konformationen mit MIMUMBA generiert
wurden und bis zu zehn Überlagerungs-Lösungen berechnet wurden.
Methoden des computergestützten Wirkstoff-Designs 176
6.4.6 Docking-Verfahren
Als Docking-Programm wurde FLEXX (Rarey, Kramer et al. 1996a) (Version 1.10.0) benutzt.
Der Docking-Algorithmus von FLEXX beruht auf einer Strategie zum schrittweisen Aufbau
des Liganden in der Bindetasche. Diese Strategie besteht im wesentlichen aus drei Phasen:
1. Auswahl eines Basisfragmentes. Ein Teil des Liganden wird als Basisfragment
ausgewählt.
2. Basisfragment-Platzierung. Das Basisfragment wird unabhängig vom Rest des Liganden
in der Bindetasche platziert.
3. Aufbau des Protein-Ligand-Komplexes. Ausgehend von den verschiedenen
Plazierungen des Basisfragmentes wird der Ligand schrittweise durch Anfügen der
verbleibenden Fragmente des Liganden in der Bindetasche aufgebaut.
Um die Verbindungen (aus der Datenbanksuche) für das Docking vorzubereiten, wurden
zunächst die Protonierungszustände mit einem Shell-Skript angepasst. Carbonsäure- und
isostere Gruppen wurden deprotoniert. Formalladungen wurden von FLEXX zugewiesen.
Als Referenz wurde die hochaufgelöste Komplexstruktur der humanen Aldose Reduktase mit
dem Inhibitor IDD594 (noch kein PDB-Eintrag) verwendet. FLEXX verwendet
Templatstrukturen für die verschiedenen Aminosäuren, Histidin110 wurde das seinem
tautomeren Zustand entsprechende Templat zugewiesen. Der Diederwinkel der Tyr48 OH-
Gruppe wurde der Kristallstruktur entsprechend angepasst. Der Kofaktor NADP+ wurde als
hetero file eingebunden.
Während der Komplexbildungsphase wurde die modifizierte Böhm-Funktion zur Bewertung
der Platzierungen benutzt. Die Docking-Lösungen wurden anschließend mit der in FLEXX
implementierten Version von DRUGSCORE nachbewertet. Anschließend wurden die Lösungen
mit einem PERL-Script gefiltert, um die Lösung mit der besten Bewertung zu finden. Mit
UNITY wurde überprüft, ob diese Lösung gleichzeitig der Pharmakophorhypothese entspricht.
Nur diese Verbindungen wurden im weiteren Vorgehen berücksichtigt.
6.4.6.1 FLEXE
Die FLEXX-Version 1.11.2 beeinhaltet FLEXE (Claussen, Buning et al. 2001) als zusätzliches
Modul zum Docking von Liganden in ein Ensemble von Proteinstrukturen. FLEXE vereinigt
Methoden des computergestützten Wirkstoff-Designs 177
ähnliche Teile der Proteinstrukturen, während Teile, die unterschiedliche Konformationen
zeigen, als Alternativen behandelt werden.
Das Ensemble wurde durch die Komplexstrukturen der Aldose Reduktase mit den
Inhibitoren Sorbinil (PDB-Code 1ah0), Tolrestat (PDB-Code 1ah3) und IDD594 (noch kein
PDB-Eintrag) definiert. Die Strukturen waren zuvor mit RELIBASE+ überlagert worden.
6.4.7 Hierarchische Datenbanksuchen
Die in Kapitel 4.2 und 4.3 beschriebenen virtuellen Screening-Läufe wurden nach einem
hierarchischen Protokoll durchgeführt, wobei die einzelnen Schritte in ihrer Komplexität und
damit in der benötigten Rechenintensität zunahmen. Die genaue Abfolge der Filterschritte ist
in den jeweiligen Kapiteln angegeben.
Um das zulässige Molekulargewicht und die Anzahl drehbarer Bindungen einzuschränken,
wurde das SYBYL-Modul SELECTOR verwendet (Funktion: compound filtering). 2D-Topologie-
Suchen und flexible 3D-Suchen wurden mit UNITY (2001b) durchgeführt. Für die flexible 3D-
Suche wird die sog. directed tweak-Methode angewendet (Hurst 1994). In diesem Schritt wurden
die generierten Pharmakophorhypothesen verwendet. Gemäß den Standardeinstellungen von
UNITY wurde die Erfüllung der rule-of-five (Lipinski, Lombardo et al. 1997) überprüft, obwohl
das primäre Ziel die Suche nach neuen Leitstrukturkandidaten war, die in der Regel kleiner
sind als Arzneistoffe (Hann et al. 2001; Oprea, Davis et al. 2001) und dementsprechend auch
weniger Donor- bzw. Akzeptorgruppen besitzen.
Als ein weiterer (bewertender) Filterschritt folgte entweder das Einpassen der
Kandidatenmoleküle in die Bindetasche der Aldose Reduktase mit FLEXX oder die
Überlagerung der Verbindungen auf eine Referenz aus bereits bekannten Inhibitoren mit
SEAL.
Am Ende der Datenbanksuche stand jeweils die visuelle Inspektion die verbliebenen
Kandidatenmoleküle. Darauf wurde auf folgende Kriterien geachtet:
• Übereinstimmung mit dem als essentiell angenommenen Wasserstoffbrücken-Netzwerk
• Komplementarität von Ligand- und Proteinoberfläche
• Fehlen von ungünstigen oder repulsiven Wechselwirkungen
• Besetzung einer Spezifitätstasche
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Lebenslauf
Oliver Krämer
Geburtstag: 6. November 1972
Geburtsort: Hüttental jetzt Siegen
1983 – 1992 Evangelisches Gymnasium in Siegen-Weidenau
Juni 1992 Allgemeine Hochschulreife
1992 – 1993 Zivildienst in der Behindertenwerkstatt der Arbeiterwohlfahrt e.V.,
Siegen-Deuz
1993 Immatrikulation im Studiengang Diplom-Chemie an der Universität-
GH Siegen
November 1995 Diplom-Vorprüfung
1995 – 1999 Haupt-Studiengang Diplom-Chemie an der Philipps-Universität
Marburg
1996 Forschungspraktikum bei der Bayer AG, Leverkusen
1997 Forschungspraktikum bei der BASF AG, Ludwigshafen
August 1998 Diplom-Prüfung
1998 – 1999 Anfertigung der Diplomarbeit „Rationales Wirkstoff-Design am
Beispiel der Aldose Reduktase“ unter Anleitung von Herrn Prof. Dr.
Gerhard Klebe am Institut für Pharmazeutische Chemie der Philipps-
Universität Marburg
Juli 1999 Verleihung des akademischen Grades „Diplom-Chemiker“
1999 – 2003 Anfertigung der vorliegenden Dissertation unter Anleitung von Herrn
Prof. Dr. Gerhard Klebe am Institut für Pharmazeutische Chemie der
Philipps-Universität Marburg
1999 – 2003 Wissenschaftlicher Mitarbeiter am selbigen Institut; Betreuung des
Studentenpraktikums „Qualitative Analyse anorganischer Stoffe“ (1.
Semester Pharmazie)
Erklärung
Ich versichere, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig ohne unerlaubte Hilfe angefertigt
und mich dabei keiner anderen als der von mir ausdrücklich bezeichneten Quellen bedient
habe.
Die Dissertation wurde in der jetzigen oder einer ähnlichen Form noch bei keiner anderen
Hochschule eingereicht und hat noch keinen sonstigen Prüfungszwecken gedient.
Marburg, im April 2003
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