untersuchung der tiefen biosphäre - pmbio.icbm.de · 3 vl mikrobiologie der erdkruste ss 2004 bert...
Post on 06-Aug-2019
214 Views
Preview:
TRANSCRIPT
1
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Untersuchung der tiefen Biosphäre
Mikrobiologische und molekularbiologische Methoden
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Wie werden Bakterien eigentlich gezählt?
Parkes, R.J., B.A. Cragg and P. Wellsbury, 2000
2
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Autofluoreszenz von Chlorophyll a
Anfärbung mit Fluoreszenz-Farbstoffen: DAPI, Acridinorange, SYBR Green
Färbung von Wattsediment mit SYBR Green
Ph
oto
: B
. K
öp
ke
Pho
tos:
H.
Cyp
ionk
a
Eisensulfidflocke im Phasenkontrast
fluoreszierende Zellen
Kombination ausPhasenkontrast und
Fluoreszenz
Mikroskopie:
FlowcytometerDNA-Menge (2-4*106 Basenpaare pro Bakteriengenom)ATP * 250 BioC (in g)
Andere Methoden:
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
MPN-Verfahren (Most Probable Number)Verdünnungsreihe in 3-5 Parallelen, Berechnung nach Formel (Tabelle)
auf Platten, Flüssigkultur
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6Verdünnung
9 mlMedium
1 ml plattieren
159 17 2 0 zu viele Kolonien
159 x 103 = 1,59 x 105
Kolonien x Verdünnung = Zellzahl
verändert nach Brock, 1997
A
H
G
F
E
D
C
1
B
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Kontrolle
Parallele 1
Parallele 2
Parallele 3
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
Lebendzellzahl (< 1%):
3
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Möglichkeiten zur Analyse von Bakteriengemeinschaften
Kultivierung Molekularbiologie
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Nachteil:
Weiterführende Untersuchungen oft nicht möglich
Viele Bakterien lassen sich nicht so einfach kultivieren
Enorm zeitintensiv
Vorteil:
Untersuchungen z.B. zur Physiologie, Gen-Regulation
oder Produktion von Metaboliten möglich
Umgehung von Kultivierungsschritten
Erfassung von bisher nicht kultivierten Organismen
Molekularbiologische Protokolle:
Kultivierungsabhängige Techniken:
4
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Proteobacteria
Syner
gist
es
Aci
doba
cter
ium
Nit
rosp
ira
Archaea 0,10
Fusobacteria
Spirochetes
Thermus/Deinococcus
CytophagalesGreen sulfur
FibrobacterLow G+C gram positive
Cyanobacteria
Flexistip
es
Planctomycetes
Verrucom
icrobia
Chlam
ydia
ActinobacteriaGreen non-sulfur
TM7
OP
8Te
rmite
gro
up I
OP11
WS6
TM6
Marine group A
OS-K
OP3
OP10WS1
OP5
OP9
Dictyglomus
Coprothermobacter
Thermotogales
Thermodesu
lfobacte
rium
Aquificales
Hugenholtz et al. 1997
Ca. 1/3 der Bakterienphyla
bestehen aus bisher nicht
kultivierten Bakterien!!!
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Kultivierung Anreicherung
Ilsolierung
Identifizierung
5
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Warum möchte man überhaupt Bakterien aus der Umwelt kultivieren?
• Biotechnologisch bzw. pharmazeutisch nutzbares Potenzial
(Produktion von Antibiotika oder Abbau von Kohlenwasserstoffen)
• In aquatischen Systemen werden 90% aller Stoffumsetzungen
durch Mikroorganismen bewirkt
• Bakterien dominieren die Biosphäre und und katalysieren
essenzielle Teile von biogeochemischen Kreisläufen
⇒ Beschreibung physiologischer Eigenschaften enorm wichtig für
das Verständnis von globalen ökologischen Prozessen
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Kultivierungstechniken
•• Koch‘sches Plattengussverfahren
• Ausstrichverfahren (mit Drigalski-Spatel)
• Membranfiltration
• Dreizehn-Strich-Methode
Festmedien
(Zugabe von Agar)
• Anreicherung (als „Batch“-Kultur)
•• Kontinuierliche Kultur
• MPN (Most Probable Number)-Methode
oder „dilution to extinction“
Flüssigmedien
6
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Cypionka, 2003
Dreizehn-Strich-Methode
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
• Zusammensetzung des Mediums
• Temperatur
• pH-Wert
• O2 -Konzentration
• Salzkonzentration
• Licht
Was muss man bei der Kultivierungvon Bakterien beachten?
7
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
„Dilution to extinction“ ⇒ Kultivierung abundanter aber langsamer wachsender
Bakterien
K-Strategen ⇒ langsam wachsende Arten, angepasst an geringe
Substratkonzentrationen
r-Strategen ⇒ schnellwüchsige Arten, hohe Wachstumsraten nur bei hohen
Substratkonzentrationen
Mikroorganismen, die an niedrige Substratkonzentrationen angepasst sind bezeichnet
man als oligotroph oder oligocarbophil.
Mikroorganismen, die hohe Substratkonzentration benötigen, bezeichnet man als
copiotroph.
Wen kann ich anreichern?
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Habitat Kultivierungseffizienz
Meerwasser 0.001 - 0.1 %
Mesotropher See 0.1 - 1 %
Belebtschlamm 1 - 15 %
Boden 0.3 %
Kultivierungseffizienz von Bakterien aus der Umwelt
Amann et al. 1995
Kultivierungseffizienz (%):
MPN-Zahl x 100
Gesamtzellzahlder Ursprungsprobe
(%) =
8
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Potenzielle Gründe für den geringen Kultivierungserfolg
Manche Bakterien gehen in einen sogenannten „viable but non
culturable“ –Zustand über, wenn sie unter Stress geraten (z.B.
geringe Temperatur, geringe Nährstoffkonzentrationen)
VBNC
ZellschädenZellmembranen, Proteine oder DNA können durch chemische oder
physikalische Einflüsse beschädigt werden
Alter Das Altern ist ein Prozess, der beginnt, wenn das Wachstum endet.
Es kommt zu einem Verlust des Replikationspotenzials
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Was sind VBNC-Zellen?
„viable but non culturable“
Lebend + metabolisch aktiv aber nicht „kultivierbar“ bzw. teilungsfähig
Übergang in den VBNC-Zustand führt zu morphologischen Änderungen sowie zu
Veränderungen wichtiger Biopolymere (Proteine, Membran-lipide, Nukleinsäuren)
Welche Bedeutung haben VBNC-Zellen?
VBNC-Zellen können „wiederbelebt“ werden
Der Cholera-Erreger Vibrio cholerae geht durch osmotischen und Nährstoff-Stress in den
VBNC-Zustand über.... z.B. wenn die Zellen ins Meerwasser geraten sind
⇒ Überdauerung im Meerwasser, Kontaminationsquelle da Zellen
irgendwann wiederbelebt werden können und dann infektiös sind!
9
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Kultivierung unter verschiedenen Inkubationsbedingungen
25°C
15°C 4°C
21 % O2 20°C
21%
O2
3% O
2
0% O
2
Bruns et al. 2003
Mögilichkeit: Kultivierung in
Gradienten, da nur ein Bruchteil der
zu kultivierenden Bakterien
geeignete Bedingungen vorfindet!
Temperatur
Sauerstoff
Sub
stra
t
Kultivierungsmaschine?
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Molekularbiologie
10
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
V2
V1
V3
V5
V6V7
V8
V9
5’
3’
Yve
s V
ande
Pee
r(1
996)
, mod
ifiz
iert
hoch variabel
absolut konserviert
E. coli, aber nicht in > 75% aller Bakterien
Die prokaryontische 16S rRNA
In einzelnen Bereichen der rRNA
geht die „molekulare Uhr“
unterschiedlich schnell.
Mutationen in konservierten
Regionen sind entwicklungs-
geschichtlich früher entstanden, als
Änderungen in variablen Regionen.
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Kary B. Mullis, 1983
Prinzip der Polymerase Chain Reaction
Denaturierung- Schmelzen der DNA
Annealing- Primeranlagerung
Elongation- Kettenverlängerung
DNA-Doppelstrang 5´
5´
3´
3´
5´
5´
3´
3´
5´
5´
3´
3´
5´
5´
3´
3´
5´
5´
3´
3´
5´ 3´
5´3´
94 °C
50-65 °C
72 °C
n ×
- eine „ molekularbiologische Pinzette“
11
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Vereinzelung von Sequenzen aus der Umweltdurch Klonierung
Ligation von PCR-Produkten an überhängende Ts
Klonierung von PCR-Produkten in eine „multiple cloning site“
Selektion von Plasmid tragenden Zellen durch Antibiotika-Resistenz
Blue/white-Screening von Zellen mit Insert tragenden Plasmiden
Reamplifikation der Inserts durch flankierende Primer
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Analyse einer Klonbank
Amplifikation der 16S rDNA
TA-cloning
blue-white screening
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12
G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12
H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12
Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft
Sequenz Analyseeinzelner Klone
12
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Doppelstrang
Einzelstränge
Teilweise geschmolzen
PCR-Produkt
Den
atur
iere
nder
Gra
dien
t
Ele
ktro
ph
ore
se
+
-
DGGE (engl.: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)Trennung in denaturierenden Gelen
anhand des Schmelzverhaltens der PCR-Produkte, chemischer Gradient
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Den
atur
iere
nder
Gra
dien
t
Schematischer Verlauf einer DGGE
BakterienReinkulturen
BakterienGemeinschaften
Ele
ktro
phor
ese
+
-
13
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Clusteranalyse
Bildanalyse
Digitalisierung
Umwelt-Probe
Extraktion
PCR
16S rDNA der Bakteriengemeinschaft
NukleinsäurenDNA
DGGE
Fingerprints der Bakterien-
gemeinschaft
Sequenzierung
16S rDNA/rRNASequenzen
PhylogenetischeZuordnung
„Fingerprinting“ von Bakteriengemeinschaften
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Beispiele zur Untersuchung von Bakteriengemeinschaften der tiefen Biosphäre
14
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
The deep biosphere and the subseafloor ocean New evidence suggests that vast microbial populations may live within a broad range of temperatures and pressures, where sediment and rock appear to provide life-sustaining resources. Microbes that characterize these extreme environments are now broadly considered a potential source of new bio-materials and are the basis of ideas for new biotechnical applications, such as water treatment and microbially enhanced oil recovery...
IODP will probe this environment globally, providing the first comprehensive characterization of this ocean below the seafloor.
The international ocean drilling program (IODP) will focus on three broad scientific themes:
Environmental change, processes and effects
Solid earth cycles and geodynamics
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
15
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Meteor Ausfahrt 51/3 (11.11.2001 – 10.12.2001)
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Beprobung von tieferen Sedimentschichten mit dem Schwerelot
16
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Top Bottom
Schwerelot-Kern mit Sapropelen S1, S3, S4 und S5 (85 cm)
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
0 1 2 3 4 5 6 7
Depth
(cm
)
0
100200
300
400
Total cell count (107 cm3)0 1 2
S1
S3
S4
S5
Station 567-1
/ /
/ / /
/
ATP-Konzentrationen (ll) und Zellzahlen (¡¡) an der Sedimentoberfläche, in Sapropelen und Corg-armen Zwischenschichten
Erste Ergebnisse zur Abundanz und Aktivität
17
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Kultivierungseffizienz
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
International Continental Scientific Drilling Program
18
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Mallik 2002 Gas Hydrate Research Well Program
The project focused on geophysical and geological studies, and extended production testing. On this website you can get information about the drillhole advance and the works of scientists from various fields. So have a look at the scientific data and the drilling region, north of Canada, beyond the Artic Circle.
This is the homepage of the Mallik 2002 Drilling Program, an international research project on Gas Hydrate Production in the Northwest Territories of Canada.
http://www.icdp-online.de/sites/mallik/index/index.html
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
19
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Detaillierter Nachweis von thermophilen sulfatreduzierenden Prokaryonten (SRP) in einer Erdöllagerstätte mit angeschlossenem Betrieb
Bearbeitung der Projekte:
Katja Ziegelmüller
Zeynep Yeðin
Dr. Michael Böttcher
Dr. Bert Engelen
Maren Fröhlich
Dipl.-Biol. Andrea Schlingloff
Dr. Andrea Sass
Dr. Bert Engelen
Oliver Roß
Gerke Kunz
Dr. Bert Engelen
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
ÖL
Gas
Slopgrube
Fördersonden
Lagerstätte
Molch
Feldleitungen
Einpressleitung+ Coupon
Tank
Führung des Lagerstättenwassers bei der Erdölförderung
20
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Wie unterscheidet sich die mikrobielle Zusammensetzung in
Fördersonden und Leitungssystemen?
- Gesamtzellzahlbestimmung der Standortproben
- molekularbiologischer Nachweis von (hyper)thermophilen
sulfatreduzierenden Bakterien und Archaeen
Ist Wachstum bei in situ-Temperaturen möglich?
- Anreicherung bei 55°C und bei 90°C
Fragestellung des Auftraggebers:
Wird H2S in Lagerstätte oder im Betrieb produziert?
Behindern die H2S-Gehalte die geplante Einrichtung eines Erdgasspeichers?
Untersuchungen folgender Fragenkomplexe:
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
DGGE-Gel A: Originalproben Juli 2003
Std
E 2
2
E 2
9
E 2
7
Kö
2
FL
E
FL
Kö
T2
Cou
p
EL
E 2
5
EL
H2
H2
Slo
p
Std
-3
-8a
-15a
-24
-1
-12a
-9
-21
-7
-10a
-18e
-23a
-2a
-13
-16a
-17a
-19a
-22a
-4
-18b
-20a
-25a-26a
-5
-6
-11
-14a
A26a Thermacetogenium phaeum 99%
A1 Flavobacterium sp. 99%A2a Chryseobacterium meningosepticum 99%A3 Flexibacter tractuosus 88% A4 Cytophaga fermentans 93%
A5 Bacillus sp. MK 03 97%
A10a R. solanacearum / Ps. syzygii 96%
A6 Bacillus methanolicus 89%
A7 Thiomicrospira sp. 97%A8a Delftia acidovorans 98%A9 Uncultured vent bacterium 88%
A11 Bacillus sp. MK03 95%A12a Gluconacetobacter sp. (alpha proteob.) 96%A13 Pseudomonas saccharophila 95%A14a Bacillus sp. MK03 95%
A15a Caulobacter sp. 95%A16a Pelobacter venetianus 90%A17a Desulfotomaculum geothermicum 88%A18a Desulfotom. geotherm. 91% / A18e Aminomonas sp. 88%A19a Thermosipho sp. 99%A20a Dethiosulfovibrio acidaminovorans 92%A21 Polyangium vitellinum 93%A22a Dethiosulfovibrio acidaminovorans 94%A23a Uncultured Acidobacteriales 89%
A25a Thermosipho ferriphilus 85%A24 Thermotoga sp. 98%
-2c -2b-2d
-8b -8c -8d-10b
-12b -12c -12d -12e -12f -12g
-15b -15c-16b -16c-16d -16e -16f
-17b -17c -17d -17e
-18c -18d-18a-19b-20b
-22b
-25b-23c -23b
-25c
-22c
-26a
rote Schrift: Sulfat-, Thiosulfat- und Schwefelreduzierer
Sonden Leitungssysteme
21
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
55° Anreicherungen
E 2
7
FL
E
T 2
Cou
p
EL
E 2
5
EL
H2
H2
Slo
p
Std
-6
-1
-12a
-2a
-11a
-10a-9a-9b
-7
-5a
B1 Petrotoga sp. 98%
B2a Petrotoga olearia 97%
B5a Thermosipho sp. 98%B6 Microbacteriaceae sp. 98%B7 Thermosipho geolei 97%
B9a Anaerobaculum thermoterrenum 87%B10a Thermosipho sp. 97% B11a Desulfacinum sp. 96%B12a Thermotoga sp. 98%
90° Anreicherungen
E 2
9
FL
E
T2
EL
E 2
5
H2
Slo
p
Std
-8a
-3a
-13
-4
B3a Burkholderia sp. 99%
B4 Marinilactibacillus psychrotolerans 93%
B8a Microbacteriaceae 92%
B13 Thermotoga maritima 96%
-2b -2b -2c -2d
-5b -5c -5d
-8a
-8b -8c
-10b -10c -10d -10e-10f
-11b -11c -11d -11e
-9c
-3b
DGGE-Gel B: Kultivierungsansätze 2003
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Zusammenfassung der Ergebnisse
Gesamtzellzahl: etwa 106 Zellen/ml (wie 2002)
Anreicherung: 7 von 11 bei 55°C und 5 von 11 bei 90°C
Nachweis von: (hyper)thermophilen H2S-Produzenten und erdöltypischen Begleitorganismen
Allgemein: größerer Anteil von H2S-Produzenten in Leitungssystemen
Vergleich mit einer früheren Untersuchung:
dynamisches System in Lagerstätte und Betrieb
à schwankende H2S-Gehalte durch unterschiedliche mikrobielle Zusammensetzung
22
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
• Kultivierung von Bakterien aus der Umwelt:
⇒ Erklärung bedeutender ökologischer Prozesse
⇒ unentdecktes Potenzial (z.B. Antibiotika-Produktion)
• Mögliche Gründe für die sog. „Great Plate Count Anomaly“ (< 1%)
⇒ Substratschock, VBNC, Sauerstoffradikale
⇒ Mangelnde Kommunikation
• Die Kombination von molekularbiologischen und klassischen mikrobiologischen
Methoden hilft bei der Aufdeckung ökologischer Fragestellungen.
Was haben wir gelernt?
top related