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Diplomarbeit vorgelegt von
Wei Lü
aus
Jiangsu, China
angefertigt im Institut für Mikrobiologie und Genetik
Abteilung Molekulare Strukturbiologie an der Biologischen Fakultät der Georg-August-Universität zu Göttingen
2007
Referent: Prof. Dr. Oliver Einsle Korreferent: Prof. Dr. Ralf Ficner Abgabedatum der Diplomarbeit: 13.04.2007 Letzter mündlicher Prüfungstermin: 14.07.2006
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Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG .................................................................................................... 4
1.1 Biologische Membran .................................................................................. 4 1.1.1 Aufbau biologischer Membranen............................................................. 4 1.1.2 Funktionen biologischer Membranen ...................................................... 7
1.2 Membranproteine ......................................................................................... 7 1.2.1 Klassifizierung ......................................................................................... 8 1.2.2 Funktionen von Membranproteinen......................................................... 9
1.3 Detergenzien .............................................................................................. 10 1.3.1 Klassifizierung ....................................................................................... 11 1.3.2 Wichtige Parameter von Detergenzien................................................... 12 1.3.3 Solubilisierung von Membranproteinen mit Detergenzien.................... 13 1.3.4 Delipidierung ......................................................................................... 15 1.3.5 Detergenz-Membranprotein-Interaktion und Kristallisation.................. 15
1.4 Stickstoffkreislauf ...................................................................................... 17
1.5 Bedeutung von Nitrat und Nitrit ................................................................ 19
1.6 Das Nitratreduktasesystem in E. coli ......................................................... 20
1.7 Das Nitritreduktasesystem in E. coli .......................................................... 21
1.8 Transport von Nitrat und Nitrit in E. coli................................................... 22
1.9 Daten von NirC aus E. coli ........................................................................ 24
1.10 Aufgabenstellung und Zielsetzung............................................................. 25
2 MATERIAL UND METHODEN ................................................................... 26
2.1 Primer-Design ............................................................................................ 26
2.2 PCR-Amplifikation .................................................................................... 26
2.3 Klonierung und Transformation................................................................. 28
2.4 Überexpression in E. coli ........................................................................... 31
2.5 Reinigung von NirC ................................................................................... 31 2.5.1 Zellernte ................................................................................................. 32 2.5.2 Zellaufschluss......................................................................................... 32 2.5.3 Isolierung der Membranen ..................................................................... 33 2.5.4 Solubilisierung mit Detergenz ............................................................... 33 2.5.5 His-Tag Affinitätschromatographie ....................................................... 34 2.5.6 Größenausschlußchromatographie......................................................... 34 2.5.7 Austausch von Detergenz....................................................................... 35
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2.6 Analytische Methoden ............................................................................... 36 2.6.1 Agarosegelelektrophoresen .................................................................... 36 2.6.2 Gelextraktion.......................................................................................... 37 2.6.3 SDS-PAGE............................................................................................. 37 2.6.4 Western Blot .......................................................................................... 39 2.6.5 Dünnschichtchromatographie (DC) ....................................................... 39 2.6.6 Lipidextraktion....................................................................................... 40 2.6.7 Saure Methylierung................................................................................ 41 2.6.8 Gaschromatographie .............................................................................. 42 2.6.9 GC/ MS .................................................................................................. 42 2.6.10 Aggregationstest................................................................................. 43
2.7 Kristallisation von gereinigtem NirC......................................................... 44 2.7.1 Vorgefertigte und kommerziell erhältliche Screens............................... 45 2.7.2 Feinscreen, Additive Screen und Detergent Screen............................... 46 2.7.3 Microseeding.......................................................................................... 46 2.7.4 Kryobedingungen................................................................................... 47 2.7.5 Kristall Annealing .................................................................................. 47 2.7.6 Kristall Dehydrierung ............................................................................ 48 2.7.7 Röntgenbeugungsexperimente ............................................................... 48
2.8 ITC (engl. Isothermal Titration Calorimetry) ............................................ 49
3 ERGEBNISSE .................................................................................................. 50
3.1 PCR-Amplifikation .................................................................................... 50
3.2 Klonierung und Transformation................................................................. 51
3.3 Überexpression in E. coli C43 ................................................................... 53
3.4 Wachstumskurven...................................................................................... 54
3.5 Reinigung von NirC ................................................................................... 55 3.5.1 Zellernte, Aufschluss und Isolierung de Membranen ............................ 55 3.5.2 Solubilisierung mit Detergenz ............................................................... 56 3.5.3 Affinitätschromatographie ..................................................................... 56 3.5.4 Größenausschlußchromatographie......................................................... 59 3.5.5 Bestimmung der Proteinkonzentration................................................... 60
3.6 Quantitative Bestimmung der Zusammensetzung von Detergenzien und Lipiden im Protein-Detergenz-Komplex (PDK).................................................... 61
3.6.1 Bestimmung des Detergenz-Protein-Verhältnisses im PDK.................. 61 3.6.2 Bestimmung der Lipidzusammensetzung im PDK................................ 63
3.7 Aggregationstest......................................................................................... 64
3.8 Austausch von Detergenz........................................................................... 65
3.9 Kristallisation von NirC ............................................................................. 69
3.10 Röntgenbeugungsexperimente ................................................................... 71
3.11 ITC (engl. Isothermal Titration Calorimetry) ............................................ 72
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4 DISKUSSION ................................................................................................... 74
4.1 Solubilisierung und Aufreinigungen von NirC.......................................... 74
4.2 Bestimmung der Detergenz-/Phospholipidzusammensetzung im PDK..... 77
4.3 Kristallisation ............................................................................................. 78
4.4 ITC ............................................................................................................. 80
5 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................. 82
6 LITERATURVERZEICHNIS........................................................................ 83
7 ANHANG.......................................................................................................... 92
7.1 Abkürzungsverzeichnis .............................................................................. 92
7.2 Basensequenz von NirC ............................................................................. 94
7.3 Aminosäuresequenz von NirC ................................................................... 94
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1 EINLEITUNG
1.1 Biologische Membran
Alle Lebewesen, sowohl Pro- als auch Eukaryonten, besitzen eine Plasmamembran (Abb.
1.1). Sie trennt das Zytoplasma von der Umgebung ab und hält somit die Zellen von
Gleichgewicht fern, was die Voraussetzung für das Leben ist. Mit einem Wort, die
biologische Membran ist die Grundlage der Entwicklung komplexen biologischen Systems.
1.1.1 Aufbau biologischer Membranen
Biologische Membranen unterscheiden sich je nach ihren Funktionen in ihrer chemischen
Zusammensetzung, ihrer Morphologie und ihren enzymatischen Funktionen sehr stark
voneinander. Jedoch sind sie nach einem gemeinsamen Prinzip aufgebaut:
Lipiddoppelschichten bilden die Permeabilitätsschranke und enthalten Membranproteine,
Abb. 1.1 Biologische Membran. Links: Plasmamembran im Elektronenmikroskop. Rechts: schematische Darstellung einer Plasmamembran (aus dem Internet).
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die entweder als Transportsystem, bestehend aus Pumpen und Kanälen, wirken, oder
enzymatische Funktionen übernehmen. Zusätzlich sind noch andere Moleküle wie z.B.
Cholesterin vorhanden, die bestimmte biologische Funktionen haben. Biologische
Membranen sind asymmetrisch, d.h. die verschiedenen Phospho- und Glycolipide sind
stark ungleich verteilt. In der äußeren Schicht überwiegen Phosphatidylcholin,
Sphingomyelin, Cholesterin und Glycolipide. In der inneren Schicht überwiegen
Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol und Phosphatidylethanolamin (Biochemie Stryer,
5. Auflage).
Membranen weisen eine hoch dynamische Struktur auf. Das Flüssigmosaikmodell (Singer
und Nicolson, 1972) beschreibt die biologische Membran folgendermaßen: Membranen
sind zweidimensionale Lösungen gerichteter Lipide und globulärer Proteine. In anderen
Worten, die Lipidkomponente bewegt sich ständig, sowohl durch laterale Diffusion
(spontan, schnell) als auch durch transversale Diffusion (mit Hilfe von Flippase, langsam).
Membranproteine können ebenfalls lateral in der Lipidmatrix diffundieren.
Die Lipidzusammensetzungen einiger Tiere- bzw. Bakterienzellmembranen werden in
Tabelle 1.1 dargestellt.
Tabelle 1.1 Lipidzusammensetzung einiger Tier- bzw. Bakterienzellmembranen. PC: Phosphatidylcholin; PE: Phosphatidylethanolamin; PG: Phosphatidylglycerin; PS: Phosphatidylserin; CL: Cardiolipin; SM: Sphingomyelin.
Lipidzusammensetzung
Membran PC PE PG PI PS CL SM Cholesterin Gangliosid
Myelin (Mensch) 10% 20% - - 8,5% - 8,5% 27% 26%
Erythrozyt (Mensch) 25% 22% - - 10% - 18% 25% -
Mitochondrium 40% 39% - 2% - 17% - in Spuren -
E. coli - 74% 19% - - 3% - - -
Zur den biologisch wichtigsten Eigenschaften der Lipide gehört ihr amphiphiles Verhalten.
Diese Eigenschaft ist im Wesentlichen auf ihren besonderen Aufbau zurückzuführen: alle
Lipide haben einen hydrophilen Kopf, der am häufigsten aus Glycerin oder Sphingosin
besteht, und einen hydrophoben Schwanz aus Fettsäuren. Ein schematischer Aufbau
verschiedener Lipide wird in Abb. 1.2 dargestellt.
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Tabelle 1.2 Einige natürlich vorkommende Fettsäuren (Biochemie Stryer, 5. Auflage).
Anzahl der C-Atome
Anzahl der Doppelbindungen
Trivialname systematischer Name
12 0 Laurat n-Dodecanat
14 0 Myristat n-Tetradecanat
16 0 Palmitat n-Hexandecanat
18 0 Stearat n-Octadecanat
20 0 Arachinat n-Eicosanat
22 0 Behenat n-Docosanat
24 0 Lignocerat n-Tetracosanat
16 1 Palmitoleat cis-Δ9-Hexadecenat
18 1 Oleat cis-Δ9-Octadecenat
18 2 Linoleat cis,cis-Δ9-Δ12-Octadecadienat
18 3 Linolenat all-cis-Δ9,Δ12,Δ15-Octadecatrienat
20 4 Arachidonat all-cis-Δ5,Δ8,Δ11,Δ14-Eicosatetraenat
Abb. 1.2 Schematischer Aufbau verschiedener Lipide (http://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/overheads-2/ch11_lipid-struct.jpg).
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Fettsäuren in biologischen Systemen besitzen gewöhnlich eine gerade Anzahl von
Kohlenstoffatomen, typischerweise zwischen 14 und 24 (Tabelle 1.2). Dabei kommen
Fettsäuren mit 16 und 18 C-Atome am häufigsten vor. Die Alkylkette kann gesättigt sein
oder eine bzw. mehrere Doppelbindungen enthalten, die meistens eine cis-Konfiguration
haben.
1.1.2 Funktionen biologischer Membranen
Die Lipidkomponenten bilden eine Permeabilitätsbarriere, so dass Membranen für Ionen
und die meisten polaren Moleküle sehr gering durchlässig sind. Ausnahme sind einige
unpolare kleine Moleküle wie z.B. Sauerstoff bzw. Wasser (zwar polar, aber klein, hohe
Konzentration und keine komplette Ladung). Damit wird die Zelle von der Umgebung
getrennt. Dies ist die wichtigste Funktion biologischer Membranen. Die zweite wichtige
Funktion ist die Energiespeicherung, da Fettsäuren hochkonzentrierte Energiespeicher sind.
Weitere Funktionen der Membran werden hauptsächlich mittels Membranproteinen erfüllt,
wie z.B. Transport, Signalübertragung, enzymatische Funktionen. Sie werden im nächsten
Abschnitt (1.2) genauer erläutert.
1.2 Membranproteine
Ein Membranprotein ist ein in die Lipidschicht einer Biomembran eingelagertes oder
dieser aufgelagertes Protein. Gemäß der Analyse von genomischen Sequenzen sind 30 %
der gesamten Proteine bei E. coli Membranproteine.
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1.2.1 Klassifizierung
Membranprotein werden in zwei große Klassen unterteilt: Intergrale Membranproteine und
membranständige Proteine.
Als intergrale Membranproteine werden die Proteine bezeichnet, die die
Lipiddoppelschicht einer Membran durchspannen. Sie werden wiederum in zwei Gruppen
unterschieden. Die erste sind aus α-Helices bestehende Transmembranproteine, zu denen
sowohl die sogenannten „singlepass“ Transmembranproteine (engl. bitopic membrane
proteins) gehören, die die Membran nur einmal durchqueren, wie z.B. T-Zell-Rezeptoren,
als auch die „multipass“ Transmembranproteine (entl. polytopic membrane proteins) wie
z.B. Membrantransporter und Ionenkanäle. Die zweite sind Transmembranproteine, die aus
β-Faltblättern aufgebaut sind. Solche Proteine sind nur in der äußeren Membran Gram-
negativer Bakterien, der Zellwand Gram-positiver Bakterien und äußeren Membran von
Mitochondrien vorhanden und haben eine zylinderförmige Transmembran-β-
Faltblattstruktur, wie z.B. LamB, eine Maltoseporin (Van Gelder et al., 2002).
Als membranständige Proteine (engl. monotopic membrane proteins) werden Proteine
bezeichnet, die zwar in der Membran verankert sind, diese jedoch nicht durchqueren. In
der Abb. 1.3 werden einige verschiedene membranständige Proteine schematisch
dargestellt.
Abb. 1.3 Intergrale Membranproteine. 1: singlepass Transmembranprotein mit einer Transmembranhelix. 2: multipass Transmembranprotein mit mehreren Transmembranhelices. 3: Transmembranprotein aus β-Faltblättern (http://en.wikipedia.org/wiki/Transmembrane_proteins).
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1.2.2 Funktionen von Membranproteinen
Fast alle Membranfunktionen werden
von Membranproteinen vermittelt. Sie
fungieren vor allem als
Membrantransporter bzw. Ionenkanäle,
die bestimmte Moleküle bzw. Ionen
durch die Membran transportieren. Ein
Beispiel ist LacY (Abb. 1.4), ein
Laktosetransporter in E. coli, der zur
MFS (engl. Major Facilitator
Superfamiliy) gehört. Die zweite
wichtige Funktion von
Membranproteinen ist die
Signaltransduktion. In den Membranen
Abb. 1.3 Verschiedene membranständige Proteine. 1: Das Protein wird in der Membran mittels einer α-Helix verankert, die parallel zur Membranebene ist. 2: Das Protein wird in der Membran mittels eines hydrophoben Loops verankert. 3: Das Protein bindet an der Membran mittels kovalenten Wechselwirkungen mit den Lipiden. 4: Das Protein bindet an der Membran durch elektrostatische Wechselwirkungen mit den Lipiden (http://en.wikipedia.org/wiki/Peripheral_membrane_protein).
Abb. 1.4 LacY aus E. coli, ein Laktosetransporter. Die schwarzen Kugeln stellen das Substrathomolge TDG (ß-D-galactopyranosyl-1-thio-ß-D-galactopyranoside) dar (Abramson et al., 2003).
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befinden sich viele Signalrezeptoren, die bestimmte Signalmoleküle wie z.B. Hormone
oder Neurotransmitter spezifisch erkennen und das Signal weiter übertragen. Zum Beispiel
die 7TM-Rezeptoren (die Rezeptoren mit sieben Transmembranhelices) sind für Geruch,
Geschmack, Sehen und viele anderen biologische Funktionen verantwortlich.
1.3 Detergenzien Um mit Membranproteinen arbeiten zu können, d.h. sie zu reinigen, zu kristallisieren und
um enzymatische Tests durchführen zu können, ist es notwendig, sie in Lösung zu bringen.
Bei einigen Proteinen, die über elektrostatische Wechselwirkungen an die Membran
gebunden sind, gelingt dies einfach durch Erhöhung der Salzkonzentration. Der Großteil
der Transmembranproteine erfordert jedoch die Zugabe von Detergenzien, da ihre
Transmembranhelices stark mit der Lipiddoppelschicht hydrophob wechselwirken (Wiener
2004; Caffrey 2003; Garavito et al., 2001).
Detergenzien sind amphiphile Moleküle ähnlich den Lipiden, die einen hydrophoben und
einen hydrophilen Anteil besitzen (Abb. 1.5.A). Deshalb bilden sie wie Lipide in wässriger
Lösung spontan Mizellenstrukturen (Abb. 1.5.B).
HydrophoberSchwanz
HydrophileKopf
A. B.
Abb. 1.5 Detergenz. A: schematische Darstellung eines Detergenzmoleküls. B: schematische Darstellung einer Detergenzmizelle.
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1.3.1 Klassifizierung
Je nach der Ladung werden Detergenzien in drei Gruppen eingeteilt: ionische Detergenzien,
nichtionische Detergenzien und zwitterionische Detergenzien (Abb. 1.6, Seddon et al.,
2004).
A. B.
C.
Ionische Detergenzien besitzen eine Kopfgruppe mit einer Nettoladung, die entweder
anionisch oder kationisch sein kann,wie z.B. SDS (engl. sodium dodecylsulfate). Solche
Detergenzien können Membranproteine sehr effektiv solubilisieren, sehr häufig tritt jedoch
dabei eine gleichzeitige (teilweise) Denatuierung auf.
Nichtionische Detergenzien enthalten eine ungeladene hydrophile Kopfgruppe, die
meistens entweder eine Zuckergruppe oder Polyoxyethylen ist. Sie sind meistens milder als
ionische Detergenzien, deshalb können sie viele Membranproteine solubilisieren, ohne
deren Proteinstruktur zu verändern. Das heißt, Membranproteine können mit Hilfe solcher
Detergenzien in biologisch aktiver Form aufgereinigt werden. Als eine Ausnahme sind
nichtionische Detergenzien mit kurzen hydrophoben Ketten (C7-10) wie z.B. OG (engl. n-
octyl-β-D-glucopyranoside), die oft zur Deaktivierung von Membranproteinen führen
Abb. 1.6 Einige typische Detergenzien. A: Ionisch; B: Nichtionisch; C: Zwitterionisch.
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(Seddon et al., 2004). DDM (engl. n-dodecyl-β-D-maltoside) ist ein häufig benutztes
nichtionische Detergenz.
Zwitterionische Detergenzien kombinieren die Eigenschaften ionischer und nichtionischer
Detergenzien, da sie zwar Ladungen enthalten, ihre Nettoladung jedoch Null ist. Sie
wirken im Allgemeinen deaktivierender als ionische Detergenzien, jedoch schwächer als
ionische. Normalerweise werden sie bei strukturellen Studien eingesetzt. Zum Beispiel
wurde LDAO (engl. n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide) bei der Kristallisation von
Ammoniumtransporter Amt-1 (Andrade et al., 2005) verwendet.
1.3.2 Wichtige Parameter von Detergenzien
Der wichtigste Parameter von Detergenz ist die CMC (engl. critical micelle concentration).
Sie beschreibt die minimale Konzentration an Detergenz, bei der Mizellen gebildet werden.
Die CMC steigt mit der Länge der Alkylgruppe und umgekehrt. Doppelbindungen und
Verzweigungen der Alkylgruppe bewirken eine Abnahme der CMC. Je länger die
Alkylkette ist und je weniger Doppelbindungen und Verzweigungen vorhanden sind, desto
stärker ist die Wechselwirkung zwischen den Detergenzmolekülen. Außerdem hängt die
CMC noch von vielen äußeren Faktoren ab, wie z.B. pH-Wert, Ionenstärke, Temperatur
und Vorhandensein von Proteinen, Lipiden bzw. anderen Detergenzien (Seddon et al.,
2004).
Der zweite wichtige Parameter, CMT (engl. critical micelle temperature) beschreibt die
Veränderung der Eigenschaften eines Detergenz mit der Temperatur. Bei niedriger
Temperatur liegen Detergenzien hauptsächlich in kristalliner Form vor, die mit gelösten
Detergenzmonomeren im Gleichgewicht steht. Steigt die Temperatur, werden immer mehr
Detergenzmoleküle gelöst, bis die CMC erreicht wird. Die Temperatur an diesem Punkt
wird als CMT bezeichnet. Ist die Temperatur höher als die CMT, wird die detergenzhaltige
Lösung mit Steigung der Temperatur immer trüber, bis die sogenannte Phasenseparation
auftritt: die detergenzreiche Phase und die wässrige Phase. Die Temperatur an diesem
Punkt wird als „cloud point“ bezeichnet (Seddon et al., 2004).
Der letzte wichtige Parameter von Detergenzien ist die Aggregationszahl, die die mittlere
Anzahl an Detergenzmonomeren in einer einzigen Mizelle beschreibt.
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In Tabelle 1.3 werden die in dieser Arbeit verwendeten Detergenzien zusammengefasst.
Tabelle 1.3 Die in dieser Arbeit verwendeten Detergenzien. N: Nichtionische Detergenz; Z: Zwitterionische Detergenz. D9M: n-Nonyl-ß-D-Maltopyranosid; D10M: n-Decyl-ß-D-Maltopyranosid; D11M: n-Undecyl-ß-D-Maltopyranosid; DDM: n-Dodecyl-ß-D-Maltopyranosid; DDPO: Dimethyl-Decylphosphin Oxid; LDAO: n-Dodecyl-N,N-Dimethylamin-N-Oxid (Daten von Anatrace).
1.3.3 Solubilisierung von Membranproteinen mit Detergenzien
Die Fähigkeit von Detergenzien, Membranprotein aus der Lipiddoppelschicht zu
extrahieren, beruht im Wesentlichen auf ihrer Fähigkeit, Lipide zu solubilisieren.
Begleitend zur Entfernung (Solubilisierung) von Lipiden durch Detergenzien werden die
hydrophoben Teile von Membranproteinen ebenfalls durch Detergenzien umschlossen. In
diesem Stadium werden Membranproteine als gelöste (solubilisierte) Form betrachtet (le
Maire et al., 2000). Der Solubilisierungsprozess wird in der Abb. 1.7 dargestellt.
Detergenz Typ MW CMC (w/v) (in Wasser)
Aggregationszahl (in Wasser)
Struktur
D9M N 468,5 0,28 % 55
D10M N 482,6 0,0869 % 69
D11M N 496,6 0,0292 % 71
DDM N 510,6 0,0087 % 78-92
DDPO N 218,3 0,1 % 31
LDAO Z 229,4 0,0344 % 76
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In der ersten Phase liegen Detergetien als Nichtmizellen-Form vor. Einige davon dringen
in die Lipiddoppelschicht ein. Mit Erhöhung der Konzentration an Detergenz werden
immer mehr Lipide durch Detergenzmoleküle ausgetauscht und die Membran wird
dadurch destabilisiert. Dies führt endlich zur Fragmentierung der Membrandoppelschicht.
Ist die Konzentration an Detergenz höher als die CSC (engl. critical solubilization
concentration), werden die großen, wasserunlöslichen Lipiddoppelschichtfragmente zur
sehr kleinen Membranfragmenten abgebaut. Schließlich sind nur gemischte Mizellen
Abb. 1.7 Schematische Darstellung des Solubilisierungsprozesses als eine Funktion der Konzentration an freien Detergenzien. In der Phase a: Detergenzien dringen in die Lipiddoppelschicht ein, aber Lipide überwiegen noch. In der Phase b: oberhalb der Konzentration Csat dringen immer mehr Detergenzmoleküle in die Lipiddoppelschicht ein. Dies führt zur Destabilisierung der Membran und anschließend werden große Membranfragmente, die mit Detergenzien am Rand abgeschlossen werden, gebildet. In der Phase c: oberhalb der CSC (engl. critical solubilization concentration) werden die großen Membranfragmente zur sehr kleinen Membranstücke umgesetzt, die wasserlöslich sind. In der Phase d sind nur gemischte Mizellen (Detergenz-Lipid und Detergenz-Lipid-Protein) vorhanden. Die Membranproteine sind vollständig solubilisiert. (Kragh-Hansen et al., 1993)
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(Detergenz-Lipid und Detergenz-Lipid-Protein) vorhanden und die Membranproteine sind
vollständig solubilisiert.
1.3.4 Delipidierung
Begleitend zur Solubilisierung werden Membranproteine delipidiert. Aber inwiefern sie
delipidiert werden, muss kontrolliert werden.
Einerseits bewirkt eine vollständige Delipidierung häufig die Deaktivierung des Proteins,
da Lipide oft eine wichtige Rolle bei der Interaktion zwischen Proteinuntereinheiten
spielen, die die Voraussetzung für die Funktionen einiger Enzyme wie z.B. Cytrochrom b6f
Komplex sind. Lipide sind auch entscheidend für die richtige Konformation einiger
Membranproteine (le Maire et al., 2000; Esmann et al., 1979; Esmann et al., 1984; Breyton
et al., 1997; Palsdottir et al., 2004).
Andererseits werden die Membranproteine, die erfolgreich kristallisiert werden, meistens
komplett oder fast komplett delipidiert. Als Ausnahme benötigen manche
Membranproteine Lipide für die Kristallisation oder eine bessere Beugungsqualität (Guan
et al., 2005; Deisenhofer et al., 1985; Palsdottir et al., 2004).
Der Delipidierungsgrad wird durch mehrere Faktoren beeinflusst wie z.B. den Typ und die
Menge des verwendeten Detergenz.
1.3.5 Detergenz-Membranprotein-Interaktion und Kristallisation
Drei Bindungsmodelle von Detergenz und Membranprotein werden vorgeschlagen (le
Maire et al., 2000). Das erste ist die mizellenartige Bindung (Abb. 1.8.A), bei der
Membranprotein im Inneren der Mizelle beachtet wird. Das zweite ist die Monoschicht-
Bindung (Abb. 1.8.B), bei der weniger Detergenzmoleküle benötigt werden, da sie den
hydrophoben Teil des Membranproteins als eine Monoschicht umgeben. Dieses Modell
lässt sich noch diskutieren, da die hydrophoben Anteile der Detergenzmoleküle, die am
Ende des Transmembranbereichs des Proteins liegen, der hydrophilen wässrigen
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Umgebung ausgesetzt wären. Dieses Problem wird in dem dritten Modell, der
modifizierten Monoschicht-Bindung (Abb. 1.8.C), korrigiert. Dabei werden nur die
Detergenzmoleküle im mittleren Bereich als Monoschicht angeordnet und die
Detergenzmoleküle an den beiden Enden sind mehr oder weniger parallel zu der
Proteinoberfläche.
Da die Membranproteine mit Detergenzmolekülen umhüllt werden, spielt die
Wechselwirkung zwischen Detergenzmolekülen eine entscheidende Rolle bei der
Kristallisation. Selbst ein winziger chemischer Unterschied im Detergenz kann ein
komplett anderes Kristallisationsverhalten verursachen (Ostermeier et al., 1997).
Allgemein gesagt, die Auswahl von Detergenz ist ein kritische Faktor bei der Arbeit mit
Membranproteinen, der nur durch Versuch und Irrtum bestimmt werden kann.
Abb. 1.8 Bindungsmodelle von Detergenz zum Membranprotein. A: Detergenzmoleküle und Protein werden als eine gemischte Mizelle gepackt. B: Die Detergenzmoleküle bedecken den hydrophoben Bereich des Proteins als Monoschicht. C: Nur die Detergenzmoleküle im mittleren Anteil werden als Monoschicht angeordnet, während die Moleküle an den beiden Enden parallel zur Proteinoberfläche liegen (le Maire et al., 2000).
A. mizellenartig B. Monoschicht C. modifizierte Monoschicht
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1.4 Stickstoffkreislauf
Stickstoff ist, neben Sauerstoff, Kohlenstoff und Wasserstoff, eines der vier wichtigsten
Elemente in Leberwesen und gleichzeitig das häufigste Element in der Atmosphäre. Die
Bindung innerhalb des Stickstoffmoleküls ist chemisch sehr stabil und besitzt eine
Dissoziationsenergie von 940 kJ/Mol N2 im Vergleich zu 493 kJ/Mol O2 der O2-
Doppelbindung. Daher ist nur eine relativ kleine Anzahl von Mikroorganismen in der Lage,
Stickstoff direkt zu verwerten. Andererseits besitzt Stickstoff sechs verschiedene
Oxidationsstufen, die eine Energiegewinnung bzw. Elektronenlieferung ermöglichen.
Zusätzlich ist Distickstoff die einzige N-Quelle für Aminosäuren, Nukleinsäuren und
zahlreiche andere Verbindungen, die für Organismen essentiell sind. Die in der Natur
vorhandenen Umsetzungen verschiedener Oxidationsstufe von Stickstoff werden im
Stickstoffkreislauf zusammengefasst (Abb. 1.9).
Abb. 1.9 Der Stickstoffkreislauf. Der Kreislauf wird in fünf Bereiche (1-5) gegliedert (Einsle et al. 2004).
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Der Stickstoffkreislauf wird in einzelne Bereiche gegliedert: Stickstofffixierung,
Nitrifikation, Denitrifikation, Nitratammonifikation und Anammox (anaerobe
Ammoniumoxidation).
Stickstofffixierung: Aufgrund der chemischen Stabilität sind nur einige spezielle
Prokaryoten in der Lage, Stickstoff zu reduzieren. Diese Bakterien können in zwei Klassen
eingeteilt werden: freilebende stickstofffixierende Bakterien wie z.B. Cyanobakterien und
symbiotische stickstofffixierende Bakterien wie z.B. Rhizobium. Der Fixierungsprozess
wird durch die Nitrogenase unter Verbrauch von ATP katalysiert. Die Nitrogenase besteht
aus zwei Untereinheiten, eine mit einem 4Fe-4S-Cluster und Bindungsstellen für
Mg2+/ATP (Fe-Protein), die andere mit einem α2ß2-Tetramer aus zwei P-Clustern und zwei
M-Clustern. Die Fixierung findet am M-Cluster statt, der in drei Varianten auftritt: Fe/Mo-
Cluster, Fe/V-Cluster und Fe/Fe-Cluster (Einsle et al., 2002; Tsai et al., 1995; Rees et al.,
2000). Neben der mikrobiologischen Fixierung kann Stickstoff auch durch das Haber-
Bosch-Verfahren industriell reduziert werden.
Nitrifikation: Bei der Nitrifikation werden Ammoniak bzw. Nitrit als Elektronendonoren
verwendet, die schrittweise zu Nitrat oxidiert werden. Ammoniak (oder Ammonium) wird,
zuerst katalysiert durch die Ammonium-Monooxygenase, zu Hydroxylamin umgesetzt, das
anschließend durch die Hydoxylamin-Oxidoreduktase zu Nitrit oxidiert wird. Schließlich
wird Nitrit mit Hilfe der Nitritoxidase zu Nitrat oxidiert. Nitrosomonas (ein
Ammoniakoxidierer) und Nitrobacter (ein Nitritoxidierer) sind typische nitrifizierende
Bakterien (King 1966).
Denitrifikation: Im Gegensatz zur Nitrifikation wird als Denitrifikation die schrittweise
Umwandlung von Nitrat zu Stickstoff bezeichnet. Dieser Vorgang ist der Hauptweg, auf
dem gasförmiger Stickstoff biologisch gebildet wird. Ein alternativer Weg hierfür ist
Anammox. Im ersten Schritt wird Nitrat durch die Nitrat-Reduktase in Nitrit umgesetzt,
das wiederum mit Hilfe der Nitrit-Reduktase zu Stickstoffmonoxid reduziert wird.
Distickstoffoxid (Lachgas) entsteht dann durch Reduktion von NO durch die
Stickstoffmonoxid-Reduktase. Schließlich wird es unter der Wirkung der Distickstoffoxid-
Reduktase zu freiem Stickstoff umgesetzt. Denitrifizierende Bakterien wie z.B.
Pseudomonas können bei diesem Prozess Energie gewinnen. Daher wird Denitrifikation
auch als Nitratatmung bezeichnet (Ferguson 1994).
Nitratammonifikation: Die Nitratammonifikation ist eine Variante der Nitratatmung. Nitrat
wirkt dabei auch als Elektronenakzeptor und wird zu Nitrit reduziert, ohne dass Stickstoff
gebildet wird. Die assimilatorische Reduktion von Nitrit zu Ammonium liefert keine
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19
nutzbare Energie für Bakterien, vielmehr handelt es sich um einen Gärungsprozess, bei
dem Nitrit als exogener Elektronenakzeptor fungiert. Die Organismen ziehen aus der
Nitritreduktion letztlich doch einen Vorteil, indem sie während der Vergärung einen Teil
der Reduktionsäquivalente wieder gewinnen. Viele fakultativ anaerobe Bakterien
vermögen diesen Prozess durchzuführen, ein Beilspiel hierfür ist Enterobacter aerogenes
(Ward 1996).
Anammox: Anammox ist die Abkürzung für die anaerobe Ammoniakoxidation, ein
Prozess mit großer Bedeutung für die Abwasserreinigung, da die beiden
umweltschädigenden chemischen Verbindungen Nitrit und Ammoniak unter anaeroben
Bedingungen zu Stickstoff umgewandelt werden. Bakterien wie. z.B. Brocadia
anammoxidans sind für diese Prozesse verantwortlich. Das Schlüsselenzym der Reaktion
ist Hydroxylaminoxidoreduktase (Jetten et al., 1998).
1.5 Bedeutung von Nitrat und Nitrit
Es ist sehr eindeutig, dass Nitrat und Nitrit eine zentrale Bedeutung im Stickstoffkreislauf
haben. Sie spielen sowohl beim assimilatorischen als auch bei dem dissimilatorischen
Stickstoffmetabolismus eine wichtige Rolle. Beim dissimilatorischen Stoffwechsel
(Denitrifikation) dient Nitrat (Nitrit) als Elektronenakzeptor und Energie wird gewonnen.
Beim assimilatorischen Stoffwechsel (Nitratammonifikation) wirkt Nitrat (Nitrit) ebenfalls
als Elektronenakzeptor und obwohl dabei keine Energiegewinnung ermöglicht wird, ist das
Endprodukt Ammoniak eine bedeutende Stickstoffquelle für die Aminosäure- und
Nukleinsäurebiosynthese.
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20
1.6 Das Nitratreduktasesystem in E. coli
Unter verschiedenen Wachstumbedingungen exprimiert E. coli drei unterschiedliche
Nitratreduktasen (Abb. 1.12).
Die erste ist die Nitratreduktase A (NRA, Abb. 10), die durch das Operon narGHJI codiert
wird. Dieses wird durch den Transkriptionsfactor FNR während anaeroben Wachstums
induziert und ermöglicht so die Verwendung von Nitrat als alternativem
Elektronenakzeptor. Die Synthese der Nitratreduktase A wird zusätzlich stark durch hohe
Konzentration von Nitrat induziert. Die zweite Reduktase ist die Nitratreduktase Z (NRZ),
codiert durch das Operon narZYWV. Sie wird unter verschiedenen Stressbedingungen wie
z.B. Nahrungsmangel oder bei saurem pH-Wert exprimiert und ermöglicht den
Abb. 1.10 Struktur der Nitratreduktase A (NRA) aus E. coli. a: Die Struktur vom NarGHI-Komplex mit zwei gebundenen Phospholipiden. b: Redoxkofaktoren von NarGHI mit der gleichen Orientierung wie in a. (Bertero et al., 2003)
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21
Mikroorganismen, mit Nitrat zu überleben. Die dritte Reduktase ist die periplasmatische
Nap, die durch das Operon napFDAGHBC codiert wird und nur während anaeroben
Wachstums exprimiert wird. Die Synthese von Nap wird durch eine niedrige
Konzentration an Nitrat optimal und durch Nitrit schwach induziert. Aufgrund ihrer hohen
Affinität zur Nitrat ist Nap bei niedriger Konzentration an Nitrat physiologisch wichtiger
als die NRA. Im Gegensatz zu den Nitratreduktase A und Z, die membrangebunden sind
und an der Cytoplasmaseite liegen, ist Nap im Periplasma lokalisiert (Jia et al., 2004;
Clegg et al., 2002).
1.7 Das Nitritreduktasesystem in E. coli
Die Reduktion von Nitrat führt zur Produktion großer Mengen Nitrit, welches sehr toxisch
für Mikroorganismen ist. Daher muss Nitrit entweder ausgestoßen oder zu unschädlichen
Produkten reduziert werden. Zu disem Zweck exprimiert E. coli zwei Nitritreduktasen
(Abb. 1.12): die cytoplasmatische NADH-abhängige Nitritreduktase Nir und die
periplasmatische formiat-abhängige Nitrit Reduktase Nrf, die das Nitrat zu Ammoniak
reduzieren.
Abb. 1.11 Struktur von Cytochrom c Nitrit Reduktase aus Wolinella succinogenes. A: Die Dimerstruktur von NrfA. B: Die Anordnung der fünf Hämgruppen. (Einsle et al. 2000)
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22
Nir wird durch das Operon nirBDECcysG codiert, wobei nirB und nirD für die beiden
Untereinheiten des Enzyms codieren. Das Gen cysG wird für die Synthese einer als
Sirohäm bezeichnete Häm-Gruppe, die als Bindungsstelle für Nitrit in der Nitritreduktase
fungiert, benötigt. In Übereinstimmung mit ihrer Funktion in der Nitritreduktion bei
anaerobem Wachstum auf Nirtit, wird der nirB Promoter koordiniert mit dem narG
Promoter reguliert. Nir ist in der Lage, unter Verwendung von NADH als Elektronendonor,
das Nitrit sofort nach der Entstehung zu Ammoniak zu reduzieren. Bei diesem Prozess
wird keine Energie konserviert.
Nrf, die durch das Operon nrfABCDEFG (Abb. 1.11) codiert wird, ist ebenfalls in der Lage,
das Nitrit im Periplasma zu Ammoniak zu reduzieren. NrfA und NrfB sind beides
Pentahäm c-Typ Cytochrome, während NrfC ein nicht-Häm Fe-S Protein und NrfD eine
membrangebundene Chinoldehydrogenase sind. Die anderen drei Proteine NrfE, NrfF und
NrfG sind für die Reduktaseaktivität notwendig. Bei der Reduktion werden Elektronen von
NrfD über NrfC und NrfB auf NrfA und schließlich zum Nitrit übertragen. Energie wird in
diesem Prozess durch Elektronentransport mittels einer membrangebundenen
Elektronentransportkette konserviert (Clegg et al., 2002; Jia et al., 2004; Wang et al., 2000).
1.8 Transport von Nitrat und Nitrit in E. coli
Da sich zwei der drei Nitratreduktasen (NRA und NRZ) im Cytoplasma befinden, kann
Nitrat nur reduziert werden, wenn es durch die Cytoplasmamembran in die Zelle
transportiert wird. Die Cytoplasmamembran ist aber im Inneren relativ zur Außenseite
negativ geladen, während Nitrat bei physiologischem pH-Wert (ca. 7.4) vollständig
deprotoniert ist. Es muss daher ein spezieller Mechanismus vorhanden sein, der das negativ
geladene Ion gegen die Membranbarriere transportieren kann. Während anaeroben
Nitratwachstums werden Nitritionen im Cytoplasma akkumuliert, die toxisch auf die Zelle
wirken. Sie müssen entweder nach außen transportiert oder zu Ammoniak reduziert werden.
E. coli exprimiert drei Membrantransporter, NarK, NarU und NirC (Abb. 1.12), die die
oben genannten Probleme lösen.
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23
NapA
NapB
NapG
NapC
NapH NapFNarI/V
NarG/Z
NarH/Y
NrfA
NrfB
NirBNirD
NarK / NarU NirC
NrfC NrfD
NO3-
NO2-
NO2-
NH4+
NO2-
NH4+
NO2-
NO3- H+
NO3-
NO2-
Periplasm
Cytoplasm
Membrane AmtB
NarK ist ein Membranprotein mit 12 Transmembranhelices und spielt eine Rolle bei das
Aufnahme von Nitrat und Nitrit bzw. der Extrusion von Nitrit (Clegg et al., 2002; Jia et al.,
2004).
NarU ist homolog zu NarK und weist eine 75 %ige Identität in der Aminosäuresequenz auf.
Die physiologische Funktion ist ebenfalls ähnlich zu NarK, Jedoch ist die Expression von
NarK sowohl in der exponentiellen als auch stationären Phase deutlich stärker als bei NarU
(Jia et al., 2004; Clegg et al., 2006).
NirC wird als ein Nitrit/Proton Symporter vorgeschlagen (Clegg. et al., 2002) und ist in der
Lage, Nitrit aus dem Periplasma in die Zelle zu transportieren. Desweiteren wird über eine
mögliche Interaktion zwischen NirC und der cytoplasmatischen Nitritreduktase Nir
diskutiert, da die Geschwindigkeit der Aufnahme bzw. Reduktion von Nitrit in dem E. coli
Stamm, in dem nur NirC exprimiert wird (NarK-NarU-NirC+), sehr ähnlich ist (Clegg et al.,
2002; Jia et al., 2004).
Abb. 1.12 Nitrat-/ Nitritreduktasesystem und Nitrat-/ Nitrittransporter System in E. coli. Es werden drei Nitratreduktasen exprimiert: zwei membrangebundene Nitratreduktasen (NarA und NarZ) und eine periplasmatische Nitratreduktase (Nap). Zwei Nitritreduktasen werden ebenfalls von E. coli synthetisiert: die cytoplasmatische Nitritreduktase Nir und die periplasmatische Nitritreduktase Nrf. Das Nitrat-/ Nitrittransportsystem von E. coli besteht aus drei Membranproteinen: NarK, NarU und NirC. NarK und NarU fungieren hautsächlich als Nitrat/ Nitrit-Antiporter und NirC ist ein Nitrit/Protonen-Symporter. AmtB ist ein Ammoniumtransporter.
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24
1.9 Daten von NirC aus E. coli
Anders als NarK und NarU, die zur MFS gehört, ist NirC ein Mitglied der FNT-Familie
(Formiat/Nitrat-Transporter). NirC wird durch das dritte Gen des nir Operons codiert und
ist ein integrales Membranprotein mit 6 Transmembranhelices, bestehend aus 268
Aminosäuren und mit einer theoretischen Größe von 28562,52 Da (ExPASy).
Abb. 1.13 Organisation des Operons nirBDEC (aus NCBI).
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25
1.10 Aufgabenstellung und Zielsetzung
Ziel dieser Arbeit war vor allem Expression und Aufreinigung des Nitrittransporters NirC
aus E. coli. Das gereinigte NirC sollte kristallisiert werden. Die Kristalle sollten zur
Aufklärung der Struktur über Röntgenbeugungsexperimente genutzt werden. Für
biochemische Charakterisierung sollten ITC-Experiment durchgeführt werden und somit
die Bindungsparameter (ΔH, ΔG, ΔS und n) von NirC mit Ihrem Substrat Nitrit ermittelt
werden.
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26
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Primer-Design
Um die Sequenz von NirC durch PCR (Polymerasekettenreaktion) amplifizieren zu können,
wurden Primer erstellt (MWG-Biotech, Ebersberg). Die Primer wurden für den Vektor
pET-21a(+) (Merck Biosciences, Nottingham, UK) erstellt und enthielten Schnittstellen für
das 5’-Restriktionsenzym NdeI und das 3’-Restriktionsenzym XhoI bzw. EcoRI, wodurch
die Nutzung des His-Tags im Vektors pET-21a(+) möglich wurde (Lichty et al., 2005).
nirC_NdeI
5'- CAT ATG TTT ACA GAC ACT ATT AAT AAG TGT GCG GCT AAC GC -
3'
nirC_XhoI
5’- T CTC GAG ACC GGC AGC CGT TTC AGT TTG ATT -3’
nirC_EcoRI
5’- T GAA TTC CC GGC AGC CGT TTC AGT TTG ATT -3’
2.2 PCR-Amplifikation
Die Polymerasekettenreaktion (Mullis et al., 1986) zur exponentiellen Amplifikation des
linearen nirC-Fragments wurde mit oben beschriebenen Primern durchgeführt (Tab. 2.1
und 2.2). Die Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese überprüft. In dieser Arbeit
Abb. 2.1 Primer für die Amplifikation von nirC.
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
27
wurde der Thermocycler Whatman BIOMETRA Tpersonal zur PCR-Amplifikation
verwendet.
Tabelle 2.1 PCR-Reaktionsansatz.
Vol.
5' - Primer (100 µmol) 1 µl
3' - Primer (100 µmol) 1 µl
5X Phusion Puffer (New England BioLabs) 2 µl
Phusion DNA Polymerase (New England BioLabs) 2 units/μl 0,5 µl
dNTPs (10 mM) 1 µl
DMSO (100 %) 0,5 µl
H2O 4 µl
Tabelle 2.2 Thermocycleprogramm
Temp. (°C) Dauer (sek.)
98 180
60 120
72 180
98 30
59 30 2x
72 40
98 30
56 30 25x
72 40
72 600
8 Pause
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28
2.3 Klonierung und Transformation
Die Reinigung des PCR-Produkts erfolgte durch das QIAquick PCR Purification-Kit
(Qiagen, Hilden) gemäß dem vorgegebenen Standardprotokoll.
Die blunt-end PCR Produkte wurden zuerst in dem Vektor pPCR-Script Amp SK(+)
(Stratagene, La Jolla, USA) ligiert, weil die direkte Ligation des Inserts im pET-21a(+)
nicht funktioniert hat. Der Ansatz nach folgendem Protokoll wurde für 1 h bei
Raumtemperatur inkubiert und die Hitzeinaktivierung der T4 DNA Ligase erfolgte danach
durch zehnminütige Inkubation der Ansätze bei 65°C.
Tabelle 2.3 Ligationsansatz von PCR-Produkt mit dem pPCR-Script Amp SK(+) cloning Vektor.
Vol.
pPCR-Script Amp SK(+) cloning Vektor 1 μl
PCR-Script 10X Reaktionspuffer 1 μl
10 mM rATP 0,5 μl
geschnittenes Insert 4 μl
SrfI Restriktionsenzym 1 μl
T4 Ligase 1 μl
Wasser 1,5 μl
Das ligierte Plasmid pPCR-Script Amp SK(+)::nirC wurde in E. coli XL10(gold)
transformiert und auf XGal-IPTG-LB-Agarplatten ausgestrichen. Daraufhin erfolgte die
Selektion auf erfolgreich transformierte Zellen durch Zugabe der Antibiotika Kanamycin
(Kan) und Ampicillin (Amp) in das Agarplattenmedium, da Zellen, die mit dem
Plasmidkonstrukt erfolgreich transformiert wurden, einer positiven Selektion durch eine
genomcodierte Kan-, sowie plasmidcodierte Amp-Resistenz unterlagen. Darüber hinaus
wurden die Zellen durch eine Weiss-Blau-Färbe-Methode selektiert: Der Vektor pPCR-
Script Amp SK(+) codiert β-Galactosidase und in der Methode wird X-Gal (5-bromo-4-
chloro-3-indolyl-β-Dgalactopyronoside) als Substrat genutzt. Durch den gleichen
Mechanismus kann X-Gal wie auch Lactose durch die β-Galactosidase zu zwei Molekülen
gespalten werden, eines dieser Spaltprodukte wird durch Sauerstoff zu 5,5’-Dibrom-4,4’-
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
29
Dichlorindigo (blau) oxidiert. Deshalb können nur Zellen, die mit dem Plasmidkonstrukt
erfolgreich transformiert wurden, sich nicht färben, da das die ß-Galactosidase codierende
Gen durch das Insert kaputt gemacht wird.
Die positiven Kolonien wurden aufgenommen und in LB-Medium (5 ml) über Nacht bei
30 °C und unter ständigem Schütteln inkubiert.
Standard-Transformationsprotokoll
- 1µl Plasmidlösung zu 100 µl kompetenten Zellen des gewünschten Typs
- 30 min auf Eis inkubieren
- 10 min bei 37°C inkubieren (Hitzeschock)
- 10 min auf Eis inkubieren
- 200 µl LB-Medium zufügen
- 60 min bei 37°C und 300 rpm (Resistenzbildung)
- Plattierung bzw. Flüssigkultur
Der korrekte Einbau des nirC-Fragments wurde durch Agarosegelelektrophorese auf
gereinigte Plasmide überprüft, wobei zur Plasmidreinigung das Machery–Nagel Kit
NucleoSpinPlasmid verwendet wurde.
Das positive Plasmid pPCR-Script Amp SK(+)::nirC und der Vektor pET-21a(+) wurden
mit den Restriktionsenzymen NdeI/ XhoI bzw. NdeI/ EcoRI für zwei Stunden bei 37°C
verdaut. Die Hitzeinaktivierung der Enzyme erfolgte danach durch zehnminütige
Inkubation der Ansätze bei 65°C.
Tabelle 2.4 Restriktionsverdausansätze von Amp SK(+)::nirC und Vektor pET-21a(+).
Insert Vol. Vektor Vol.
NdeI 1 μl NdeI 1 μl
XhoI od. EcoRI 1 μl XhoI od. EcoRI 1 μl
Buffer O 1,5 μl Buffer O 1 μl
pPCR-Script Amp SK(+)::nirC 11,5 μl pET-21a(+) 7 μl
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30
Um die Religierung des geschnittenen Vektors zu vermeiden, wurden die 5’-Enden des
linearisierten pET-21a(+) durch Calf Intestine Alkaline Phosphatase (CIAP)
dephosphoryliert. Der linearisierte Vektor wurde mit CIAP für 30 min bei 37 °C inkubiert.
Die Reaktion wurde durch fünfzehnminütige Inkubation bei 85 °C gestoppt.
Tabelle 2.5 Dephosphorylierungsansatz des geschnittenen Vektor pET-21a(+).
Vol.
Plasmid 10 μl
10X Reaktionspuffer 2 μl
Calf Intestine Alkaline Phosphatase 0,5 μl
Wasser 7,5 μl
Die dadurch entstandene nirC Fragmente und der dephosphorylierte pET-21a(+) wurden
auf Aagarosegel aufgetragen und anschließend durch Gel-Extraktion aufgereinigt. Danach
wurden sie zusammen ligiert. Die Ansätze wurden über Nacht bei Raumtemperatur
inkubiert.
Tabelle 2.6 Ligationsansatz.
Vol.
T4 Ligase Puffer 1 μl
T4 Ligase 1 μl
Vektor pET-21a(+) 2 μl
Insert nirC 6 μl
Die Ligationsprodukte wurden in E. coli XL10(gold) transformiert und dann auf LB-
Agarplatten ausgestrichen. Die Selektion erfolgte durch Zugabe der Antibiotika Ampicillin
in das Agarplatten bzw. die Flüssigkulturen. Die Flüssigkulturen (5 ml) vereinzelter Zellen
wurden über Nacht bei 30 °C inkubiert.
Nach der Aufreinigung wurde das Plasmid durch ein Agarosegel überprüft. Anschließend
wurde eine DNA-Sequenzierung zur Überprüfung der Basensequenz des
Plasmidkonstrukts eingesetzt.
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31
2.4 Überexpression in E. coli
Um die Überproduktion einer großen Menge NirC zu erreichen, wurde pET21a-(+):nirC in
E. coli C43(DE3) transformiert. E. coli C43(DE3) ist eine Doppelmutante von E. coli
BL21(DE3). Die beiden Mutationspositionen sind noch unbekannt, aber sie beeinflussen
entweder die Aktivität oder die Menge der T7 RNA Polymerase. Beide Effekte verhindern
die Abkopplung von Transkription und Translation (Miroux and Walker, 1996; Terp 2006;
Arechaga 2000; Dumon-Seignovert et al., 2004).
Der 200 µl Transformationsansatz wurde in 100 ml LB-Medium gegeben und bei 30 °C
und ständigem Schütteln über Nacht inkubiert. Zur Gewinnung großer Proteinmengen
wurde Autoinduktionsmedium verwendet: 400 ml Autoinduktionsmedium wurde
zusammen mit 10 ml Vorkultur in einem 2 L Kolben für 22 – 24 Stunden bei 18 °C und
ständigem Schütteln inkubiert (Studier 2005; Eshaghi et al., 2005; Wang et al., 2002).
2.5 Reinigung von NirC
Ein effektiver Ansatz zur Reinigung eines Proteins besteht in der Nutzung von spezifischen
Polypeptidfusionen, die dem eigentlichen Proteinfragment weitere Aminosäuren
hinzufügen und so ein zur Reinigung verwendbares chemisches Charakteristikum zur
Verfügung stellen. Diese Affinitäts-Marker werden am Anfang (N-terminal) oder am Ende
(C-terminal) an das Proteinfragment angefügt.
Für die Reinigung von NirC wurde ein C-terminales 6-His-Tag-Fusionspeptid gewählt, so
dass NirC mit zwei Chromatographieverfahren aufgereinigt wurde:
Affinitätschromotographie und Gelfiltration.
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
32
Überexpression in E. coli C43
Zellernte
Zellaufschluss
Isolierung der Membranen
Solubilisierung mit Detergenz
Affinitätschromatographie
Gelfiltration
(Detergenzaustausch)
2.5.1 Zellernte
Die Zellen wurden durch Zentrifugation (4.000 g, 15 min, 4°C, Avanti J-20XP Series
High-Performance Centrifuge (Beckman Coulter, Harbor Boulevard, USA)) in 1l-Bechern
sedimentiert. Das Zellpellet wurde dann in steril filtriertem Aufschlusspuffer (50 mM
HEPES pH 8.0, 500 mM NaCl, 10 % Glycerol) resuspendiert: 1g Pellet ~ 2 ml Puffer.
2.5.2 Zellaufschluss
Zur Isolierung der Membranfraktion wurden die Zellen mittels Microfluidizer
(Microfluidics European Headquarters, Lampertheim) aufgeschlossen. Bei dieser Methode
ermöglichen grossen Scherkräfte, die beim Aufeinandertreffen zweier Flüssigkeitsstrahlen
Abb. 2.2 Methodenschema. Aufreinigung von NirC.
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
33
unter hohem Druck auftreten, einen effizienten Aufschluss der Zellen. Die Zelllyse mittels
Microfluidizer wurde bei einem Druck von ca. 80 psi durchgeführt und 5-7mal wiederholt.
2.5.3 Isolierung der Membranen
Um unlösliche Zelltrümmer aus dem Zellaufschluss zu entfernen, wurde die Suspension
bei einer Geschwindigkeit von 20.000 g zentrifugiert (30 min, 4 °C, Avanti J-30I High-
Performance Centrifuge (Beckman Coulter Harbor Boulevard, USA)) und das Pellet
verworfen. Der Überstand wurde noch einmal durch eine Ultrazentrifugation (100.000 g, 3
Stunden, 4 °C, Avanti J-30I High-Performance Centrifuge (Beckman Coulter Harbor
Boulevard, USA)) zentrifugiert, so dass die unlösliche Membranfraktion sedimentierte.
Nach Entfernung des Überstands wurde das Pellet (Membran) gewogen und anschließend
mit Aufschlusspuffer resuspendiert: 1g Membran ~ 10 ml Puffer.
2.5.4 Solubilisierung mit Detergenz
Um die Membranproteine zu reinigen sowie weiter verarbeiten zu können, müssen sie
zuerst „in Lösung“ gebracht werden. Dies wird durch Zugabe von Detergenz erreicht.
Detergenzien sind chemische Verbindungen, die ein polares Ende und ein unpolares Ende
besitzen. Sie können Membranprotein aus Membranen herauslösen und einen so genannten
Detergenz-Protein-Komplex bilden. Dieser ist wasserlöslich. Es gibt zwei wichtige
Parameter für Detergenzien: CMC (kritische mizelläre Konzentration) und die
Aggregationsnummer. Als kritische mizelläre Konzentration bezeichnet man die
Grenzkonzentration, bei der Detergenzien Mizellen bilden. Die Aggregationsnummer ist
die mittlere Anzahl an Detergenzmolekülen in einer Mizelle.
NirC wurde mit LDAO (n-Dodecyl-N,N-dimethylamin-N-Oxide) solubilisiert: 10 ml 10 %
LDAO-Lösung (in dem selben Puffer wie die Membranen) wurde tropfenweise unter
ständigem Rühren zu der Membransuspension (40 ml) titriert. Die Lösung wurde dann
weiter für weitere 30 Minuten gerührt. Die unlöslichen Fette und Lipide wurden durch eine
Zentrifugation (100.000 g, 45 Minuten, 4°C) sedimentiert. Der Überstand, der Detergenz-
Protein-Komplexe enthielt, wurde zur weiteren Aufreinigung benutzt.
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
34
2.5.5 His-Tag Affinitätschromatographie
Da NirC zusammen mit 6 C-terminalen Histidinen exprimiert wurde und die Imidazolringe
von Histidin Nickelionen chelatieren, wurde NirC durch Affinitätschromatographie mit
einer His-Trap Säule als erstem Reinigungsschritt aufgereinigt. Der Säulenlauf selbst
wurde mit Hilfe eines Äktaprime-Chromatographiesystems (GE Healthcare, München)
kotrolliert. Die Verlaufsdiagramme der Reinigung wurden mit dem Programm PrimeView
erstellt. Die verwendeten Puffer wurden entgast und sterilfiltriert. Die HisTrap Säule
wurde zuerst mit 5 Volumina ddH2O gewaschen. Eine Äquilibrierung erfolgte mit
mehreren Volumina Puffer A (50 mM HEPES pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, 0,1
% LDAO). Anschließend wurde die Proteinfraktion über einen 50 ml Superloop auf die
Säule geladen. Um die Spezifität der His-Tag-Bindung zu gewährleisten, wurden 30 mM
Imidazol vor Ladung zu der Proteinfraktion zugegeben. Verunreinigungen wurden durch
schrittweises Erhöhen der Konzentration an Imidazol (bis zu 150 mM) im Puffersystem
entfernt. Danach wurde NirC durch einen Konzentrationsgradienten von Imidazol (150
mM zu 300 mM über 40 ml) eluiert. Die Proteinfraktionen wurden mittels SDS-PAGE auf
ihre Zusammensetzung analysiert. Die Fraktionen mit NirC wurden gesammelt. Zur
weiteren Verwendung für die Gelfiltration wurde die Proteinlösung mittels einer
Ultrazentrifugationsmembran mit einer Ausschlussgröße von 50 kDa und Zentrifugation
(3000 g, 4 °C) auf ein Volumen von ca. 1 ml ankonzentriert.
2.5.6 Größenausschlußchromatographie
Das Protein NirC war nach der His-Tag-Reinigung schon sehr sauber. Um die
verschiedenen Polymerformen zu trennen, wurden sie auf eine Gelfiltrationssäule
aufgetragen. Das Prinzip der Gelfiltrationschromatographie ist die Separation von
Molekülen unterschiedlicher molekularer Größe. Abhängig von der Porengröße wird
Molekülen bis zu einem bestimmten Stokes-Radius das Eindringen in den Innenraum
spezieller Gelkugeln erlaubt. Die Häufigkeit eines solchen Ereignisses ist umgekehrt
proportional zur molaren Größe der über die Säule gepumpten Teilchen. Deshalb besitzen
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
35
Proteine höherer molekularer Größe eine geringere Retentionszeit als Proteine niedrigerer
Größe. Damit können die Proteine nach ihren Größen getrennt werden.
Zur Reinigung von NirC wurde eine Superdex 200 Gelfiltrationssäule verwendet. Die
Säule wurde mit drei Säulenvolumen Wasser und anschließend mit drei Säulenvolumen
Aufreinigungspuffer (50 mM HEPES pH 8, 200 mM NaCl, 10 % Glycerol, und
entsprechende Detergenz) äquilibriert. 1 ml ankonzentrierte Proteinprobe wurde auf die
Säule bei einer Flussrate von 1 ml/min aufgetragen. Der Durchlauf der Säule wurde
fraktioniert und durch SDS-PAGE analysiert. Fraktionen, die NirC enthielten, wurden
mittels einer Ultrazentrifugationsmembran mit einer Ausschlussgröße von 50 kDa und
Zentrifugation (3000 g, 4 °C) ankonzentriert. Die Proteinkonzentration wurde mit dem
colorimetrischen BCA-Test bestimmt.
2.5.7 Austausch von Detergenz
Das mit einem Detergenz aufreinigte Protein wurde erneut auf eine 1 ml HisTrap FF Säule
geladen. Anschließend wurde die Säule mit ca. 30 ml Puffer, welcher das zweite Detergenz
enthielt, gewaschen. Am Ende wurde das Protein mit Elutionspuffer eluiert.
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
36
2.6 Analytische Methoden
2.6.1 Agarosegelelektrophoresen
Die Agarosegelelektrophorese ist eine Methode, um Nukleinsäure-Fragemente (RNA oder
DNA) nach ihrer Größe zu trennen und diese durch Vergleich mit Markern bekannter
Größe (GeneRuler DNA Ladder Mix, Fermentas, St. Leon-Rot) zu bestimmen. Lange
Fäden aus Agarosepolymeren werden zu einem Gel vernetzt. Je höher die Agarose
konzentriert ist, desto kleiner sind die Poren, die sich in dem Gel befinden. Die
Gelelektrophorese funktioniert wie ein Sieb für Moleküle. Ein elektrisches Feld wird
verwendet, um die negativ geladenen Nukleinsäure-Moleküle durch die Gelmatrix zu
ziehen, wobei die kleineren Fragmente sich schneller durch das Gel bewegen können und
somit eine Auftrennung der Stränge nach ihrer Größe ermöglicht wird.
Zur Fertigung des Gels wurde TAE-Puffer (Tris-Acetat-EDTA) mit 1 % Agarose (w/v)
versetzt, aufgekocht und polymerisiert. Die DNA-Proben wurden zusammen mit
Ladepuffer in die Gelmatrix aufgetragen. Das Auftrennen wurde mit einer Spannung von
60 V in TAE-Puffer erreicht. Nach dem Lauf wurde das Gel für 15 min in Ethidiumbromid
(5 mg/ml in Wasser) unter ständigem Schütteln inkubiert. Da sich Ethidiumbromid in die
DNA einlagert und im UV-Licht fluoreszieren kann, sind die DNA-Moleküle unter einer
UV-Lampe (Gel Doc EQ System, BIORAD, Müchen) sichtbar.
Tabelle 2.7 Zusammensetzung von TAE-Puffer.
TAE-Puffer Vol.
Tris 40 mM
Borsäure 20 mM
EDTA 1 mM
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37
Tabelle 2.8 Zusammensetzung von Fermentas 6x Ladepuffer für Agarosegelelektrophores.
Fermentas 6x Ladepuffer Vol.
Tris-HCl (pH 7,6) 10 mM
Bromphenolblau 0,03 %
Xylen cyanol FF 0,03 %
Glycerol 60 %
EDTA 60 mM
Tabelle 2.9 Probe für Auftragung.
Probe für Gelauftrag Vol.
Probe 3 µl
Fermentas 6x Ladepuffer 1 µl
ddH2O 2 µl
2.6.2 Gelextraktion
Gelextraktion ist eine sehr effiziente Methode zur Reinigung von DNA-Fragmenten und
Plasmid-DNA aus Agarosegelen. Nach dem Agarosegelektrophorese wurden die DNA-
Banden aus dem Gel unter UV-Licht ausgeschnitten. Dann wurde die DNA nach dem
Protokoll des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen, Hilden) aufgereinigt.
2.6.3 SDS-PAGE
SDS-PAGE (Abkürzung für engl. Sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel
electrophoresis) ist eine analytische Methode zur Trennung von Polypeptiden im
elektrischen Feld. Als Trennmedium dient ein Gel auf Polyacrylamidbasis. Zusätzlich
kommt SDS zum Einsatz. Dieses anionische Detergenz überdeckt die Eigenladung von
Proteinen, so dass die Proteine eine konstante Ladungsverteilung aufweisen. Außerdem
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
38
kann SDS die Sekundär- und Tertiärstrukturen von Proteinen (teilweise) aufbrechen.
Damit erfolgt die Auftrennung im elektrischen Feld nur anhand der Molekülgröße.
Zur Bestimmung der Reinheit des NirC wurden die Proteinproben zusammen mit nicht
reduzierendem Ladepuffer (Fermentas) auf das Gel (Trenngel: 12,5 % Bis-acrylamid;
Sammelgel: 5 % Bis-acrylamid) aufgetragen. Die SDS-PAGE wurde mit Stromstärken von
20 mA durchgeführt. Als Größenstandard wurde der „Protein Molecular Weight
Marker“ von Fermentas verwendet.
Tabelle 2.10 Zusammensetzung von Trenngel und Sammelgel für SDS-PAGE.
Trenngel 1x [ml] 12,50 % Sammelgel 1x [ml] 5 %
Bis-acrylamid 30% 3 Bis-acrylamid 30% 0,5
1,88 M Tris/HCl, pH 8.8 1,8 1,88 M Tris/HCl, pH 8,8 0,6
0,5% SDS 1,8 0,5 % SDS 0,6
ddH2O 2,4 ddH2O 1,3
TEMED [µl] 8 TEMED [µl] 3
10% APS [µl] 45 10 % APS [µl] 15
Nach dem Lauf wurden die Gele mit ca. 50 ml Coomassie-Lösung gefärbt. Dafür wurden
die Gele 30-60 min in der Färbelösung inkubiert, bis die Markerbanden zu erkennen waren.
Dann wurden die Gele mit 10 % Ethanol entfärbt.
Tabelle 2.11 Coomassie Färbung.
Coomassie-Lösung (50 ml)
Ethanol 10 %
Essigsäure 5 %
1 % (w/v) Coomassie Brillant Blue G 40 µl
1 % (w/v) Coomassie Brillant Blue R 160 µl
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
39
2.6.4 Western Blot
Ein Western Blot bezeichnet den Transfer von Proteinen auf eine Trägermembran, welche
anschließend über unterschiedliche Reaktionen nachgewiesen werden können. Vor dem
eigentlichen Western Blot wird ein Proteingemisch mit Hilfe einer SDS-PAGE aufgetrennt.
Dann werden die Proteine vom Polyacrylamid-Gel durch ein senkrecht zum Gel angelegtes
elektrisches Feld eluiert und auf eine Membran transferiert. An der Membranoberfläche
bleiben die Proteine aufgrund hydrophober Wechselwirkungen haften. Dann können die
Proteine über eine Immunodetektion visualisiert werden. Dabei bindet ein
antigenspezifischer Primär-Antikörper an Epitope des gesuchten Proteins. An den primären
Antikörper bindet wiederum ein sekundärer Antikörper, über welchen die Detektion erfolgt.
In dieser Arbeit wurden Anti-PentaHis Antikörper als primärer, AP-gekoppelte Anti-Maus-
Antikörper als sekundärer Antikörper benutzt. Der Nachweis erfolgt dabei durch eine
Färbreaktion mit dem artifiziellen Substrat BCIP und NBT, die durch AP katalysiert wird.
Der Ablauf wurde nach dem Protokoll von QIAexpress durchgeführt.
2.6.5 Dünnschichtchromatographie (DC)
Um das Detergenz und Phospholipid in NirC quantitativ zu bestimmen, wurde eine
Dünnschichtchromatographie durchgeführt. Dieses Trennsystem besteht aus zwei Phasen:
einer stationären und einer mobilen Phase. Als stationäre Phase wird die Kieselgelschicht
an der Glasoberfläche bezeichnet. Die mobile Phase ist ein Lösungsmittel mit definierter
Zusammensetzung. Auf der Startlinie der DC-Platte wird das zu untersuchende Gemisch
aufgetragen. Dann wird die DC-Platte senkrecht in eine mit Laufmittel (mobile Phase) für
mindesten 30 Minuten äquilibrierte DC-Kammer gestellt, in die die DC-Platte zu einem
geringen Teil eintaucht. Das ganze System wird dann verschlossen. Das Laufmittel saugt
sich nun über Kapillarkräfte in die stationäre Phase nach oben. Sobald die Flüssigkeit die
Probe erreicht, werden seine Komponenten gelöst. Die Moleküle in der Probe sind nun den
Anziehungskräften der stationären Phase einerseits und den Anziehungskräften der
mobilen Phase andererseits ausgesetzt. Je nach Kräfteverhältnis wandern die Moleküle
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
40
unterschiedlich weit nach oben. So werden sie aufgetrennt. Da das Kieselgel selbst polar
(Si-O Bindung) ist, laufen polarere Moleküle aufgrund der Dipol-Dipol-Kräfte weniger
weit. Für die mobile Phase gilt allgemein: Je polarer das Laufmittel ist, desto weiter
wandern polare Substanzen, und umgekehrt (Peterson et al., 2006).
Nach der Trennung wurden die DC-Platten für ca. 8 Sekunden in eine CuSO4 Lösung
eingetaucht und bei 110 °C getrocknet. Anschließend wurden die Platten bei 170 °C
gebacken und die Detergenzien oder Phospholipide wurden verascht, so dass sie sichtbar
wurden. Die Flächen der Banden wurden mit der Software „Aida Image
Analyzer“ bestimmt. Eine Eichgrade wurde mit verschiedenen Detergenzien bekannter
Menge erstellt. Dann wurde das Detergenz in der Proteinprobe durch Vergleich zur
Eichgrade quantifiziert.
Das Laufmittel für die Quantifizierung des Detergenz bestand aus Chloroform/ Methanol /
Ammonium Hydroxid (63 / 35 / 5)
Für die Bestimmung des Phospholipids wurde: Chloroform/ Methanol / Essigsäure (65 / 25
/ 8) als Laufmittel verwendet.
2.6.6 Lipidextraktion
Für die (quantitative) Bestimmung von Phospholipiden im NirC wurde das Lipid aus dem
Protein nach dem Protokoll von Bligh und Dyer (1959) extrahiert. Zur Extraktion wurde
die Proteinprobe mit 0,8 ml Wasser, 2 ml Methanol und 1 ml Chloroform in einem 8 ml
Glasgefäß (Kimble) gemischt. Die Mischung wurde kräftig gevortext und anschließend
wurden 1 ml Chloroform und 1 ml Wasser dazugegeben. Nach weiterem kräftigem
Vortexen wurden die Mischung für 10 Minuten bei 1500 rpm und 4 °C zentrifugiert. Die
untere Phase (Chloroform mit Lipid) wurde in ein sauberes 8 ml Glasgefäß (Kimble)
transferiert und unter Stickstoffbegasung eingedampft. Der Rückstand (Lipid) wurde für
die weitere Verwendung in Chloroform (DC oder saure Methylierung) gelöst.
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
41
2.6.7 Saure Methylierung
Für die Quantifizierung der Fettsäuren wurden die Phospholipide zuerst nach Protokoll
(Miquel und Browse 1992) transmethyliert. Die extrahierten Phospholipide wurden in
kleinen Pyrex-Gläschen mit 1 ml FAME-Lösung und 0,4 μg internem Standard (Tri-
Heptadecanoat) gemischt. Die Gläschen wurden mit Argon überschichtet, um eine
mögliche Oxidation durch Sauerstoff zu vermeiden. Das Reaktionsgemisch wurde für 60
Minuten bei 80 °C inkubiert. Anschließend wurden 200 μl gesättigte NaCl-Lösung und 2
ml n-Hexan zugegeben. Nach kräftigem Vortexen wurde die Mischung für 10 Minuten bei
1500 rpm zentrifugiert. Die obere Phase (n-Hexan mit Fettsäure) wurde in neues Pyrex-
Gläschen transferiert und unter einem Stickstoffstrom eingedampft. Die untere Phase
wurde noch einmal mit 2 ml n-Hexan nach oben genanntem Prozess extrahiert. Die obere
Phase wurde dann in das mit Stickstoff begaste Gläschen gegeben. Der Rückstand wurde
in 2 ml n-Hexan aufgenommen. Zur Entfernung der sauren Reste wurden 2 ml tridest.
Wasser hinzugefügt. Nach 10 minütiger Zentrifugation bei 1500 rpm wurde die obere
Phase durch eine mit Watte und Natriumsulfat befüllte Pasteur-Pipette (Abb. 2.3) laufen
gelassen. Anschließend wurde die restliche Probe durch die Pipette gedrückt. Nach
Eindampfen unter einem Stickstoffstrom wurde der Rückstand (Fettsäure) in 10 μl
Acetonitril resuspendiert, gevortext und kurz zentrifugiert. Danach wurde die Lösung in
Gaschromatographie-Gläschen mit Einsatz abgefüllt, der entweder zur GC-Analyse
verwendet oder bei – 20 °C aufbewahrt wurden.
FAME-Lösung - 2,5 % H2SO4 - 2 % Dimethoxipropan - in Methanol lösen
Abb. 2.3 Pasteurpipette mit Na2SO4 und Watte.
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
42
2.6.8 Gaschromatographie
Die Gaschromatographie (GC) ist eine sehr empfindliche Methode zur Analyse von
Stoffgemischen, bei der als mobile Phase ein Inertgas mit guten Strömungseigenschaften,
meist Stickstoff, Helium oder Wasserstoff verwendet wird. Dieses Trägergas wird durch
eine Säule geleitet. Die Säule wird mit einem bestimmten Material ausgekleidet, der
stationären Phase. Das Messprinzip beruht auf zwei Prinzipien. Das erste bezieht sich auf
die unterschiedlichen Siedepunkte der Einzelsubstanzen in dem Gemisch. Das zweite ist
die spezielle Wechselwirkung des zu analysierenden Stoffes mit der stationären Phase. Die
Stärke der Wechselwirkung zwischen den Probenkomponenten und der stationären Phase
wird sowohl von deren Struktur als auch von deren funktionellen Gruppen bestimmt
(Eiceman 2000).
2.6.9 GC/ MS
Durch Vergleich der Retentionszeit bei der GC mit dem Standard konnten bereits die
Fettsäuren in der Probe (quantitativ) identifiziert werden. Um das Ergebnis zu bestätigen,
wurde eine sogenannte GC/MS-Kopplung durchgeführt, das heißt eine Kombination von
Gaschromatographie und Massenspektrometrie.
Die Massenspektrometrie ist ein Verfahren zum Messen des Masse-Ladung Verhältnisses
(m/q) von Teilchen. Bei bekannter Ladung q kann die Masse m der Teilchen ermittelt
werden. Die zu untersuchende Probe wird in das MS eingebracht, verdampft und ionisiert.
Abb. 2.4 Schematische Darstellung eines GC. 1:
Trägergas 2: Injektion 3: Säule im GC-Ofen 4:
Detektor 5: Signalaufzeichung
(http://de.wikipedia.org/wiki/Gaschromatographie).
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
43
Als bewegte geladene Teilchen lassen sich die Ionen in einem Analysator nach ihrem
Masse-Ladungs-Verhältnis auftrennen und anschließend detektieren. Dies ermöglicht
Aussagen über das Vorhandensein und die Menge der Teilchen. Der Aufbau eines MS lässt
sich somit in vier Hauptkomponenten gliedern: Probenaufnahmesystem, Ionisierung,
Massentrennung und Detektion (Watson et al., 1965).
2.6.10 Aggregationstest
Um zu bestimmen, welche Detergenzien geeignet sind für NirC, wurde ein
Aggregationstest durchgeführt. Das Prinzip beruht darauf, dass aggregierte Proteine das
Licht bei einer Wellenlänge von 320 nm absorbieren. Sinkt die Absorption, bedeutet das,
dass ein neues Detergenz die Proteine besser solubilisieren kann, und umgekehrt (Wiener
2004). Die mit DDM gereinigte Proteinprobe, wurde mit verschiedenem Detergenz bis zu
einem Volumen von 300 μl gemischt, wobei die Konzentration an Protein 1 mg/ml betrug
und die Konzentration an dem neuen Detergenz das 10 Fache seines CMC ausmachte. Die
Absorbtion der Mischung bei 320 nm wurde mit einem Zeitabstand von 20 Sekunden für
30 Minuten gemessen.
Abb. 2.5 Schematischer Aufbau eines GC/MS-Systems.
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44
2.7 Kristallisation von gereinigtem NirC
Um die dreidimensionale Struktur von NirC durch Röntgenbeugungsexperimente zu lösen,
muss NirC zuerst kristallisiert werden. Im kristallinen Zustand sind die atomaren Bausteine
(Atome, Ionen, Moleküle) in dreidimensional periodischer Weise angeordnet. Die
Kristallisation wird sowohl thermodynamisch als auch kinetisch reguliert.
Thermodynamik: Eine chemische Reaktion kann ohne Energiezufuhr ablaufen, wenn
dadurch die freie Energie G des Systems abnimmt. Die Änderung der freien Energie ΔG
bei der Keimbildung setzt sich aus zwei Termen zusammen. Ein Term spiegelt die
Grenzflächenenergie des Keims wider, der kugelförmig zur umgebenden Lösung
angenommen wird. Er ist proportional zur Oberfläche (r2) des Keims und stets positiv. Der
zweite Term ist immer negativ und proportional zur Stoffmenge (Volumen, r3), die in die
kristalline Phase übergeht. Verfolgt man ΔG als Funktion des Keimradius r, so überwiegt
bei kleinem r der Oberflächenterm, d.h. bei der Bildung eines kleinen Keims wird die freie
Energie des Systems erhöht, und es muß Arbeit - die Keimbildungsarbeit - geleistet werden.
Die Funktion durchläuft ein Maximum bei r*, dem kritischen Keimradius. Erst wenn ein
Keim unter Aufwendung der Keimbildungsarbeit ΔG* diese kritische Größe erreicht hat,
wird durch sein weiteres Wachstum die freie Energie des Systems wieder verringert, der
Keim ist stabil und wird weiter wachsen. Zur Keimbildung muß das thermodynamische
Gleichgewicht überschritten werden. Eine Potentialdifferenz muß als Triebkraft aufgebaut
werden, um Energie für die Formierung der Phasengrenzfläche zu gewinnen.
Kinetik: In den meisten Fällen, selbst wenn es thermodynamisch günstig ist, kristallisiert
das Protein nicht, da die Kristallisation zusätzlich kinetisch kontrolliert wird. Eine zu
schnelle Aggregation der Proteine führt nicht zu geordneten Kristalle, sondern zu
ungeordnetem Proteinpräzipitat. Ist der Prozess zu langsam, dann ist die Kristallisation
zwar theoretisch realisierbar, der Kristall entsteht jedoch praktisch nicht oder erst nach
einem Zeitraum von Monaten oder Jahren.
Allgemein gesagt, sind es viele Faktoren, wie z. B. Temperatur, pH-Wert, Art und
Konzentration von Fällungsmittel, Ionstärke, Additive usw., die die Kristallisation von
Protein beeinflussen können.
In dieser Arbeit wurde Dampfdiffusion zur Kristallzüchtung eingesetzt. Bei diesem
Verfahren wird versucht, die Keimbildungszone durch Äquilibrieren eines Tropfens gegen
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45
ein größeres Volumen (Reservoir) zu erreichen. Der Tropfen ist ein Gemisch von
Reservoir- und konzentrierter Proteinlösung in einem Verhältnis von in der Regel 1:1. Das
Reservoir enthält das Fällungsmittel. Die Triebkraft für die Äquilibrierung stammt aus dem
Konzentrationsgradienten zwischen Reservoir und Tropfen und wird über die Dampfphase
ausgeglichen. Die geeignete Kristallisationsbedingung wird durch eine große Zahl von
Screens gesucht.
2.7.1 Vorgefertigte und kommerziell erhältliche Screens
Die Kristallisationsansätze wurden nach der „sitting drop“-Methode angefertigt. Die
Screens wurden in „Cryschem Plate“- (Hampton Research, Aliso Viejo, USA)
Kristallplatten auf Eis mit jeweils 1µl Protein (10 mg/ml) zu 1µl Reservoirlösung (400 µl)
pipettiert und mit Crystal Clear Sealing Tape (Hampton Research) verschlossen. Die
Platten wurden dann bei 4 °C gelagert.
Tabelle 2.12 Liste eingesetzter Kristallisierungsscreens
Name Bedingungen Quelle
Crystal Screen I 48 Hampton Research
Crystal Screen II 48 Hampton Research
MemStart Screen 48 Hampton Research
MemSys Screen 48 Hampton Research
Natrix Screen 48 Hampton Research
PEG/Ion Screen 48 Hampton Research
Structure Screen 48 Hampton Research
Footprint Screen I 24 Stura
Footprint Screen II 24 Stura
Footprint Screen III 24 Stura
JB Membrane Protein Screen I 24 Jena Bioscience
JB Membrane Protein Screen II 24 Jena Bioscience
JB Membrane Protein Screen III 24 Jena Bioscience
Sigma Membrane protein Screen 50 Sigma
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46
2.7.2 Feinscreen, Additive Screen und Detergent Screen
Die Kristalle wurden in drei initialen Bedingungen gefunden.
1). 0,1 M Natriumcitrat pH 3,5, 0,1 M Li2SO4, 30 % PEG 400)
2). 0,2 M Imidazolmalat pH 5,5, 33 % PEG 600
3). 0,05 M Cacodylat/HAc pH 6,5, 0,12 M Natriumbenzoat
Eine Serie von Feinscreens wurde pipettiert, um die pH-Werte, Ionstärke,
Proteinkonzentration, Präzipitantkonzentration und die Tropengröße zu variieren. Die sich
daraufhin anschließende Verfeinerung der Kristallformen wurde durch die Nutzung des
Additive Screen I-IV, Detergent Screen I-III (Hampton Research) und Detergent Screen 1-
2 (Sigma) versucht.
2.7.3 Microseeding
Um größere Kristalle mit besserer Streuungsqualität zu bekommen, wurde Mikroseeding
durchgeführt. Dafür wurden gut gewachsene Kristalle mit einem Plastikhomogenisierer
zerstört und anschließend in Stabilisierungslösung (Reservoir mit 20 % mehr Präzipitant)
resuspendiert. Die Mikrokristalle wurden dann durch eine Verdünnungsreihe von 10 bis
106 verdünnt und bei 4 °C gelagert. Screens mit denselben Bedingungen, in denen die
Kristalle gewachsen waren, wurden mit niedrigeren Präzipitantkonzentrationen pipettiert
und für ca. 2 Stunden äquilibriert. Dann wurden jeweils 0,3 μl Keime aus verschiedenen
Verdünnungsstufen dazu gegeben. Die Platten wurden anschließend bei 4 °C gelagert
(Bergfors 2003; Saridakis et al., 2000).
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47
2.7.4 Kryobedingungen
Bei der klassischen Methode wird der Kristall mit etwas Reservoirlösung in eine Kapillare
aufgenommen. Anschließend wird der Kristall “trocken“ gelegt, d.h. die den Kristall
umgebende Lösung wird mit Kapillaren und Filterpapier entfernt. Danach wird die
Kapillare luftdicht mit Wachs verschlossen, so dass der Kristall nicht austrocknen kann.
Um die Strahlenschäden durch Röntgenstrahlung zu verringern, werden Kryotechniken
angewendet, da die Kühlung die Immobilisierung von OH-Radikal bewirkt, welches durch
Röntgenstrahlung aus dem Wasser erzeugt wird und schädlich für das Proteinkristall ist.
Dafür muss eine geeignete Kryobedingung herausgefunden werden. Normalerweise
werden höhere Konzentrationen an Präzipitanz oder ein zusätzliches Kryoprotektant
verwendet. In dieser Arbeit wurde dieselbe Lösung aus dem Reservoir, jedoch mit 35 %
PEG 400, als Kryobedingung benutzt.
2.7.5 Kristall Annealing
Die Kryotechnik kann die Kristalle vor Ausbildung von Eis schützen, bringt aber auch
Probleme mit: Sie führt manchmal Gitterunordnung ein, die wieder zur erhöhter Mosaizität
und reduzierter Beugungsauflösung führt.
Kristall Annealing ist eine einfache Methode, die machmal die Streuungsqualität nach
Kryobehandlung verbessern kann. Denn das ungeordnete Gitter kann möglich dadurch
wieder geordnet werden.
In dieser Arbeit wurde dieser Prozess folgendermaßen durchgeführt: Die Kristalle wurden
aufgenommen, sofort in flüssigen Stickstoff eingefroren und anschließend unter dem
kalten Stickstoffstrom von Diffraktormeter platziert. Dann wurde der kalte Strom für ca. 2
Sekunden dreimal mit einem Zeitabstand von 6 Sekunden blokiert. Nun waren die Kristalle
bereit für das Röntgenbeugungsexperiment (Harp et al., 1998; Heras et al., 2005; Newman
2005).
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
48
2.7.6 Kristall Dehydrierung
Proteinkristalle enthalten typischerweis mehr als 50 % Wasser (Masse) und es ist bekannt,
dass die Reduzierung des Wassergehalts zu enger gepackten und besser geordneten Kristall
führen kann (Salunke et al., 1985; Frey, 1994). Kristalldehydrierung ist ein sehr wertvolles
Verfahren für diese Absicht. In dieser Arbeit wurde der Kristalle enthaltende
Kristallisationsansatz gegen Reservoirs, die jeweils 5 % mehr Präzipitanz als die
vorherigen enthielten, über Nacht äquilibriert. Dieser Prozess wurde 5- bis 6-mal
wiederholt (Heras et al., 2005; Newman 2005).
2.7.7 Röntgenbeugungsexperimente
Das Ziel von Röntgenbeugungsexperimenten an Proteinkristallen ist der Erhalt einer
Elektronendichteverteilung in der dreidimensionalen Einheitszelle des Kristalls. Grundlage
aller Röntgenbeugungsexperimente an einem Kristall ist das Gesetz von Bragg.
λθ ⋅=⋅ nd )sin(2 1)
(λ = Wellenlänge, d = Abstand der Ebenenschar im Kristall, θ = halber Winkel zwischen eintretendem und austretendem Strahl)
Die Datensammlung erfolgte ausschließlich nach dem Prinzip der Rotationsmethode bei
Verwendung monochromatischer Röntgenstrahlung. Dabei wird der Kristall um eine
Achse senkrecht zum einfallenden Röntgenstrahl um den Winkel φ gedreht. Die Reflexe
der durch die Drehbewegung in Reflexion gebrachten Netzebenen werden von einem
Flächendetektor aufgenommen, der Intensität und Lage des Reflexes registriert. Um einen
vollständigen, redundanten Datensatz zu erhalten, muss der Kristall um einen seiner
Symmetrie entsprechenden Betrag gedreht werden.
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
49
2.8 ITC (engl. Isothermal Titration Calorimetry)
ITC ist eine biophysikalische Technik, welche die Bindungsaffinität (Ka), Änderung der
Enthalpie (ΔH) und Bindungsstöchiometrie (n) der Interaktion zwischen zwei oder mehr
Molekülen messen kann. Der Gibbs’sche freie Energie (ΔG) und die Änderung der
Entropie (ΔS) können weiterhin nach Gleichung 2) ermittelt werden (Perozzo et al., 2004;
Leavitt et al., 2001; Velazque-Campoy et al., 2006).
ΔG = -RTlnKa = ΔH-TΔS 2)
R: Gaskonstante, T: absolute Temperatur
Bei ITC-Experiment wird ein Ligand mittels einer Spitze in die Zelle, welche die
Makromoleküllösung enthält, bei konstanter Temperatur pipettiert. Die freigesetzte oder
absorbierte Wärme wird gegen eine Referenzzelle angemessen. Die Daten werden dann
mit Hilfe der Software Origin analysiert (Tellinghuisen 2005).
In dieser Arbeit wird ein VP-IPC Gerät von MicroCal (Northampton, USA) verwendet.
Der Aufbau des Geräts ist in Abb. 2.6 schematisch dargestellt.
Abb. 2.6 Schematische Darstellung eines ITC-Geräts. A: Allgemeiner Aufbau eines ITC-Geräts. B: Referenzzelle und Probenzelle (MicroCal).
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50
3 ERGEBNISSE
3.1 PCR-Amplifikation
Die Produkte der Polymerasekettenreaktion zur Amplifikation des nirC-Fragments wurden
mittels Agarosegelelektrophorese auf ihre Länge überprüft.
M 1 2 3 4
~ 830 bp900 bp
800 bp
In der ersten Bahn wurde ein DNA-Marker mit einem Größenbereich von 100 bp bis
10000 bp aufgetragen. In den Bahnen 1 und 2 wurden jeweils die PCR-Produkte von nirC
mit den Schnittstellen NdeI/EcoRI aufgetragen (1: genomische DNA von E. coli K12 als
Matrize, 2: E. coli XL10 Gold Zellen als Matrize). In den Bahnen 3 und 4 wurden jeweils
die PCR-Produkte nirC mit den Schnittstellen NdeI/XhoI aufgetragen (3: genomische
DNA von E. coli K12 als Matrize, 4: E. coli XL10 Gold Zellen als Matrize).
Die PCR-Produkte der vier Ansätze liefen alle bei einer Größe von ca. 830 bp, was der
Größe des nirC-Fragments entspricht. Die Amplifikation war somit erfolgreich.
Abb. 3.1 PCR-Amplifikation des nirC-Fragments. Die Banden in Bahn 1 und 2 sind nirC mit den Schnittstellen NdeI/EcoRI, die Banden in Bahn 3 und 4 sind nirC mit den Schnittstellen NdeI/XhoI. Als Matrize: genomische DNA von E. coli K12 (ungerade Zahl), E. coli XL10 Gold Zelle (gerade Zahl). M: GeneRuler DNA Ladder Mix.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
51
3.2 Klonierung und Transformation
Die PCR-Produkte wurden zuerst in den Vektor pPCR-Script Amp SK(+) ligiert und dann
über einen Weiss-Blau-Färbetest selektiert. Um zu überprüfen, ob die Ligation richtig
funktioniert hat, wurden die Plasmide einiger positiver Kolonien aufgereinigt und mit den
Restriktionsenzympaaren NdeI/ EcoRI oder NdeI/ XhoI verdaut. Anschließend wurden die
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M
3000 bp
1000 bp
750 bp
ungeschnittenen und geschnittenen Plasmide jeweils mit einem Agarosegel analysiert. Der
Vektor pPCR-Script Amp SK(+) selbst hat eine Größe von ca. 3000 bp. Die Abbildung 3.2
zeigt, dass die Proben 3, 5-8 und 10-12 positiv waren, da sie nach dem Restriktionsverdau
zwei Banden mit einer Größe von ca. 3000 bp (pPCR-Script Amp SK(+)) bzw. 830 bp
(nirC-Fragment) hatten. Im Gegensatz dazu waren die Proben 1, 2, 4 und 9 negativ, da hier
die Banden vor dem Restriktionsverdau bei ca. 2000 bp und nach dem Restriktionsverdau
bei ca. 3000 bp liefen. Das bedeutet, dass die vier Proben den Vektor pPCR-Script Amp
SK(+) ohne nirC-Fragment enthielten. Da die Plasmide vor dem Verdau ringförmig waren,
konnten sie im Gel weiter wandern.
Abb. 3.2 Das ligierte Plasmid pPCR-Script Amp SK(+)::nirC nach Restriktionsverdau. 1-6: Plasmid mit Schnittstelle NdeI/EcoRI; 7-12: Plasmid mit Schnittstelle NdeI/XhoI. M: GeneRuler 1kb DNA Ladder.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
52
Die durch Agarosegelextraktion aufgereinigten nirC-Fragemente wurden in den zuvor mit
den Restriktionsenzympaaren NdeI/EcoRI bzw. NdeI/XhoI geschnittenen Vektor pET-
21a(+) ligiert und in E. coli XL10 Gold transformiert. Um die Klonierung zu überprüfen,
wurden die gereinigten Plasmide mit den entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut und
mittels Agarosegelelektrophorese analysiert. Es zeigte sich, dass alle 24 Proben, die jeweils
aus verschiedenen Bakterienkolonien aufgereinigt wurden, zwei Banden aufweisen, von
denen die eine, entsprechend der Größe des linearisierten pET-21a(+)-Vektors, bei ca.
5500 bp und die andere, mit Ausnahme der Probe 24, bei einer Größe von ca. 830 bp lief.
Dies entspricht genau der Größe von nirC. Die nirC-Fragmente der Proben 1-23 wurden
somit erfolgreich in den pET-21a(+) Vektor kloniert.
Die Sequenzierung der Plasmidinsertionsbereiche offenbarte, dass das nirC-Fragement in
vollständiger Weise und korrekter Anordnung (Leseraster) in den Vektor integriert wurde,
daher wurde es in den weiteren Experimenten für die Expression von NirC verwendet.
Abb. 3.3 Das ligierte Plasmid pET-21a(+)::nirC nach Restriktionsverdau mit NdeI/EcoRI (1-12) bzw. NdeI/XhoI (13-24). 1-12: Plasmid mit Schnittstelle NdeI/EcoRI, 13-24: Plasmid mit Schnittstelle NdeI/XhoI. M: GeneRuler DNA Ladder Mix.
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53
3.3 Überexpression in E. coli C43
Um eine starke Überproduktion von NirC und ein gleichzeitig gutes Wachstum der E. coli
C43 Zellen mit dem pET-21a(+)::nirC Konstrukt in dem normalen LB-Medium zu
gewährleisten, wurde ein Induktionstest mit verschiedenen IPTG-Konzentrationen
durchgeführt. Der Expressionslevel wurde mittels 10 % SDS-PAGE und anschließend mit
einem Western Blot analysiert.
E4 E3 E2 E1 M X1 X2 X3 X4
Trimer
Dimer
Monomer
45 kDa
35 kDa
18.4 kDa
Als Größenstandard wurde der Protein Molecular Weight Marker (Fermentas) verwendet.
In die Geltaschen E1 und X1 wurden Zellen der uninduzierten Kulturen aufgetragen. In
Bahn E2-4 und X2-4 wurden Zellkulturen aufgetragen, die bei einer optischen Dichte von
0.8 (600 nm Wellenlänge) mit jeweils 0,1 mM, 0,5 mM und 1 mM IPTG induziert wurden
(E steht für NirC mit Konstrukt NdeI/EcoRI, X steht für NirC mit Konstrukt NdeI/XhoI.).
Während in Bahn E1 und X1 kein Protein detektiert wurde, zeigen die anderen 6 Ansätze
zeigten eine sehr starke Induktion. Bei diesen Ansätzen wurden 3 Banden sichtbar, die
jeweils bei einer Höhe von ca. 15 kDa, 30 kDa und 45 kDa (schwach erkennbar) liefen.
Nach der Molekulargrößenvorhersage des ExPASy-Webservice (http://www.expasy.org/,
Gasteiger et al.) hat NirC eine Größe von 28,562 kDa. Berücksichtigt man, dass
Membranproteine eine sehr stark hydrophobe Wechselwirkung im Inneren besitzen, ist es
unwahrscheinlich, dass sie durch SDS vollständig entfaltet werden können. Deshalb laufen
Abb. 3.4 Western Blot der acht Proben des IPTG-Induktionstest von E. coli C43 Zellen, die mit dem pET-21a(+)::nirC Konstrukt transformiert wurden. In Ansatz E1 und X1 wurde keine Induktion durchgeführt und dient somit als Kontrollansatz. Ansätze E2-E4 und X2-X4 wurde jeweils mit 0.1 mM, 0.5 mM und 1 mM IPTG bei oD600 = 0.8 induziert. Als Standard wurde der Protein Molecular Weight Marker (Fermentas) verwendet. Das Monomer, Dimer und Trimer wurden jeweils bei einer Höhe von 15 kDa, 30 kDa und 45 kDa beobachtet.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
54
Membranproteine in einem SDS-Gel normalerweise tiefer als ihre reale Größe, da die
Protein Marker lösliche Proteine enthalten. Daher sollte die Banden bei 15 kDa dem
Monomer von NirC, die Banden bei 30 kDa dem Dimer und die Banden bei 45 kDa dem
Trimer entsprechen.
Die Überexpression von NirC durch Induktion mit IPTG behinderte das Wachstum der E.
coli C43 Zellen, dieser Effekt war umso stärker, je höher die Konzentration an IPTG war.
Die Messwerte für die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm 4 Stunden nach
der Induktion waren jeweils 2,9, 2,7, 2,3, 2,3 für E1-4 und 2,8, 2,7, 2,6, 2,2 für X1-4. Um
das Gleichgewicht zwischen einer starken Überproduktion von NirC und einem starken
Wachstum von E. coli C43 zu gewährleisten, wurden 0,5 mM IPTG zur Induktion in dieser
Arbeit verwendet.
3.4 Wachstumskurven
Um den optimalen Zeitpunkt für die Expression von NirC und das Wachstum der Zelle
herauszufinden, wurde das Wachstum in LB-Medium und Autoinduktionsmedium (ZYM
5052, Studier 2005) verfolgt.
Die Wachstumskurve von E. coli C43 mit dem pET-21a(+)::nirC Konstrukt in LB-
Medium wurde bei 30 °C erstellt. Die Kultur wurde durch Zugabe von 0,5 mM IPTG bei
oD600 = 0,6 induziert. Ungefähr zwei Stunden nach der Induktion erreichten die Zellen
kurz vor der stationären Phase eine oD600 von ca. 1,5. welches der optimale Zeitpunkt für
die Zellernte war.
Die Wachstumskurve von E. coli C43 mit dem pET-21a(+) Konstrukt in
Autoinduktionsmedium ZYM 5052 wurde bei 18 °C erstellt. Der beste Zeitpunkt für die
Zellernte war nach etwa 24 h bei einer oD600 von ca. 11 erreicht, da das Wachstum
anschließend in die die stationäre Phase überging.
Das Vergleich beider Wachstumskurven zeigt, dass das Autoinduktionsmedium deutlich
effektiver als normales LB-Medium ist, da bei geringerem Verbrauch an Rohstoffen mehr
Biomasse produziert wird. Deswegen wurde Autoinduktionsmedium ZYM 5052 für die
weitere Überexpression von NirC in dieser Arbeit verwendet.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
55
3.5 Reinigung von NirC
3.5.1 Zellernte, Aufschluss und Isolierung de Membranen
Bei Zellernte und Aufschluss wurden die Bakterienkulturen, wie unter 2.5.1 und 2.5.2
angegeben, behandelt. Die Ausbeute von E. coli C 43 Zellen mit dem pET-21a(+)
Konstrukt war normalerweise ca. 20 g pro Liter Autoinduktionsmedium. Nach zwei
Zentrifugationen (2.5.3) wurden ca. 0,17 g Membranen pro Gramm Zelle geerntet.
Abb. 3.5.B Wachstumskurve von E. coli C43 mit pET-21a(+)::nirC Konstrukt bei 18°C in Autoinduktionsmedium ZYM 5052. Die beste Inkubationszeit ist ca. 24 Stunden mit einer oD600 von ca. 11.
Abb. 3.5.A Wachstumskurve von E. coli C43 mit pET-21a(+)::nirC Konstrukt bei 30°C in LB-Medium. Die Kultur wurde durch Zugabe von 0.5 mM IPTG bei oD600 = 0.6 induziert. Ungefähr zwei Stunden nach der Induktion erreichten die Zellen kurz vor der stationären Phase eine oD600 von ca. 1.5.
Wachstumskurve (E. coli C43 mit NirC in ZYM 5052 @18 °C)
0
2
4
6
8
10
12
14
0 10 20 30 40 50
time (h)
oD60
0
Wachstumskurve (E. coli C43 mit NirC in LB-Amp@ 30 °C)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 5 10 15 20 25 30
time (h)
oD60
0
Zugabe von 0.5 mM IPTG
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
56
3.5.2 Solubilisierung mit Detergenz
Die Membranen wurden in Aufschlusspuffer resuspendiert. Die Suspension war trüb, da
Membranen schwer wasserlöslich sind. Nach der Solubilisierung mit 2 % LDAO (2.5.4)
wurde die Lösung klar. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt (100.000 x g, 4 °C) gab
es nur eine kleine Menge von weißem Pellet, welches darauf hindeutert, dass die meisten
Membranproteine bereits solubilisiert wurden und das weiße Pellet aus wasserunlöslichen
Lipiden besteht.
3.5.3 Affinitätschromatographie
Der Überstand der Zentrifugation wurde über eine 5 ml HisTrap FF Säule gereinigt (2.5.5).
In der Abb. 3.7.A (aufgereinigt mit LDAO) ist ein typischer Säulenlauf gezeigt. Der
Überstand enthielt 20 mM Imidazol, um die unspezifischen Bindungen durch die
Verunreinigungen an der Säule zu verhindern. Da das der erste Aufreinigungsversuch war,
wurden fünf aufeinanderfolgende Waschschritte mit einer Konzentration an Imidazol von
30 mM, 50 mM, 100 mM, 110 mM und 125 mM durchgeführt, um den Waschprozess für
weitere Aufreinigungsexperimente in dieser Arbeit zu optimieren. Anschließend wurde die
Säule mit einem linearen Gradienten von 25-100 % Elutionspuffer eluiert, dabei wurde ein
scharfer Peak beobachtet.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
57
0
500
1000
1500
2000
mAu
0 50 100 150 200 250 300 min
Method Run 17.11.2006, 11:13:11, Method : , Result : C:\...\prime\Manual Injection Valve Load Flow 1.5 ml/min Flow 1.0 ml/min Manual Set, Concentration 6 %B Manual Set, Concentration 18 %B Error: 69 ERROR Stop grad. set HOLD or PAUSE
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 65687
30 mMImidazol
50 mMImidazol
100 mMImidazol
110 mMImidazol
125 mMImidazol
500 mMImidazol
20 mMImidazol
Die gesammelten Fraktionen der Affinitätschromatographie wurden durch SDS-PAGE
analysiert (Abb. 3.7.B).
Das SDS-Gel zeigte, dass sämtliches NirC an der Säule gebunden hatte, da in den
Durchfluss-Ansätzen 1-5 kein NirC beobachtet wurde. Desweiteren konnten durch die fünf
Waschschritte fast alle Verunreinigungen ausgewaschen werden. Die Elutionsfraktionen
waren bereits relativ sauber. Jedoch wurden vier verschiedene Polymerformen in dem Gel
sichtbar: Monomer (ca. 24 kDa), Dimer (ca. 45 kDa), Trimer (ca. 70 kDa) und Tetramer
(ca. 100 kDa). Dies bedeutet aber nicht unbedingt, dass die Proteine tatsächlich vier
Polymerformen hatten, denn NirC ist ein Membranprotein und wird durch Detergenz
eingeschlossen. Die Transmembranhelices besitzen untereinander sehr starke hydrophobe
Abb. 3.7.A: Chromatogramm der Affinitätschromatographie von NirC mittels einer 5 ml HisTrap FF Säule. Die Proteinlösung wurde mit 20 mM Imidazol auf die Säule geladen, um unspezifische Bindungen zu vermeiden (Siehe Pfeil). Anschließend folgten fünf Waschschritte mit Imidazolkonzentration von 30 mM, 50 mM, 100 mM, 110 mM und 125 mM. Schließlich wurde NirC mit einem linearen Gradienten von 25-100% Elutionspuffer eluiert (100% Elutionspuffer entsprach 500 mM Imidazol), ein großer scharfer Peak ist zu erkennen.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
58
Wechselwirkungen, daher ist es für SDS-Moleküle schwierig, sich in die Detergenz-
Protein-Komplexe einzulagern und die quartären Strukturen vollständig zu zerstören. Diese
Vermutung wurde durch die Ankonzentrierung von NirC unterstützt: Die Fraktionen, die
NirC enthielten, wurden mittels einer Ultrazentrifugationsmembran mit einer
Ausschlussgröße von 50 kDa und Zentrifugation (3000 x g, 4 °C) ankonzentriert. Wenn
NirC wirklich vier verschiedene Polymerformen gebildet hätte, sollten im Durchfluss des
Konzentrators ebenfalls Proteine vorhanden sein, da die Größe von Monomer kleiner als
50 kDa wäre. Dies wurde jedoch nicht beobachtet, daher kann angenommen werden, dass
NirC als Tetramer vorliegt.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Monomer
Tetramer
Trimer
Dimer
116
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
kDa
Auffällig in diesem Gel ist, dass die Proteine im Vergleich zu Abb. 3.4 kürzer gelaufen
sind, was auf den unterschiedlichen Anteil an Acrylaimd im SDS-Gel zurückzuführen ist.
Um eine bessere Auftrennung zu erreichen, enthielten alle SDS-Gel in dieser Arbeit 12,5
% Acrylamid,.
NirC wurde auch mittels D10M erfolgreich aufgereinigt.
Abb. 3.7.B: SDS-PAGE (12,5% Acrylamid) zur Kontrolle der Affinitätschromatographie (HisTrap). M: Protein Molecular Weight Marker von Fermentas. 1-5: Durchfluss (Fraktionen 1-5 in der Abb. 3.7.A). 6-9: Waschfraktionen (entsprachen jeweils den Waschschritten 30 mM, 50 mM, 100 mM, 125 mM Imidazol). 10-18: Elutionsfraktionen. Vier Banden für NirC wurden in Ansätze 10-18 deutlich beobachtet. Sie entsprachen jeweils Monomer (ca. 24 kDa), Dimer (ca. 45 kDa), Trimer (ca. 70 kDa) und Tetramer (ca. 100 kDa).
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
59
3.5.4 Größenausschlußchromatographie
Das konzentrierte Protein wurde auf eine HiLoad 16/60 Superdex 200 geladen, da NirC
wahrscheinlich Tetramere bildet. In der Abb. 3.8 ist das Chromatogramm von NirC/D10M
gezeigt. Der Aufreinigungspuffer bestand aus: 50 mM HEPES pH 8, 200 mM NaCl, 10 %
Glycerol und 0,2 % D10M. Drei Peaks, die jeweils einer Größe von 1400 kDa, 460 kDa
und 200 kDa entsprachen, waren zu beobachten. Die gesammelten Fraktionen wurden
mittels SDS-PAGE analysiert. Die Abb. 3.8.B zeigt, dass alle drei Peaks nur NirC
enthielten. Dies bedeutete, dass die ersten beiden Peaks Aggregationen von NirC sein
sollten. Deswegen wurden nur die Fraktionen im dritten Peak gesammelt und bis ca. 1 ml
konzentriert.
Manual Run 3:10_UV Manual Run 3:10_Conc Manual Run 3:10_Fractions
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
mAu
0 50 100 150 min1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41
Abb. 3.8.A Chromatogramm der Gelfiltrationschromatographie von NirC/D10M mittels einer HiLoad 16/60 Superdex 200 Säule. Drei Peaks waren zu erkennen, die jeweils eine Größe von 1400 kDa, 460 kDa und 200 kDa nach Reihenfolge entsprachen. Die ersten beiden Peaks sollten Aggregation von NirC sein. Der dritte Peak entspricht ungefähr der Größe von Tetramer mit Detergenz.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
60
3.5.5 Bestimmung der Proteinkonzentration
Die Konzentration des aufgereinigten NirC wurde mit einem BCA-Test und zusätzlich mit
der Ehresmann-Methode bestimmt (Ehresmann et al., 1973).
In Abb. 3.9 ist eine Eichgerade BSA-Standards dargestellt. Anhand dieser wurde die
Konzentration von NirC mit 50,8 ± 0,4 mg/ml (1,45 ml) gerechnet. Dies entspricht einer
Ausbeute von 2,7 mg NirC/ 1 g Zellen.
Die Ehresman-Methode lieferte ein ähnliches Ergebnis wie der BCA-Test.
BCA Protein Assay
y = 273.25x - 6.6458
0
50
100
150
200
250
300
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Absorbtion (562 nm)
Con
cent
ratio
n ( μ
g/m
l)
Abb. 3.9 Eichgrade von BSA zur Bestimmung der Konzentration von NirC.
Abb. 3.8.B SDS-PAGE (12,5% Acrylamid) der Gelfiltration. M: Protein Molecular Weight Marker von Fermentas. 1-2: Peak 1; 3-5: Peak 2; 6-11: Peak 3. Vier Banden für NirC wurden in den Ansätzen 10-18 deutlich beobachtet. Sie entsprachen jeweils Monomer (ca. 24 kDa), Dimer (ca. 45 kDa), Trimer (ca. 70 kDa) und Tetramer (ca. 100 kDa).
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
61
3.6 Quantitative Bestimmung der Zusammensetzung von Detergenzien und Lipiden im Protein-Detergenz-Komplex (PDK)
3.6.1 Bestimmung des Detergenz-Protein-Verhältnisses im PDK
Die Konzentration an Detergenz in der Proteinlösung spielt eine wichtige Rolle sowohl bei
der Solubilisierung (Stabilität und Solubilität des PDK) als auch bei der Kristallisation
(Wechselwirkung zwischen PDK) von Membranproteinen. Daher wurde die
Detergenzkonzentration nach Ankonzentrierung mittels Dünnschichtchromatographie
quantifiziert. Gleichzeitig wurde das Detergenz-Protein-Verhältnis inm PDK berechnet
(Eriks et al., 2003; daCosta et al., 2002).
In Abb. 3.10 sind die unterschiedlichen Laufhöhen verschiedener Detergenzien in einer
DC-Platte gezeigt.
Eine Eichgerade wurde mit einer Serie bekannter LDAO-Mengen erstellt (Abb. 3.11),
deren Daten die gemittelten Werte von drei unabhängigen Versuchen entsprechen. Nur vier
Banden (0,01-0,15 mg) wurden für die Eichgerade eingesetzt, da die Kurve in diesem
Bereich linear war und die Menge an LDAO in der Proteinprobe ebenfalls in diesem
Bereich lag. Die Menge an Detergenz in der Proteinprobe sowie in dem Durchfluss wurde
Abb. 3.10 Charakteristische Laufhöhe einiger Detergenzien. NirC/LDAO und NirC/D10M entsprechen NirC, das jeweils mit LDAO bzw. D10M aufgereinigt wurde. Das Laufmittel: Chloroform/ Methanol/ Ammonium Hydroxid (63/ 35/ 5).
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
62
durch Vergleich mit der Eichgerade bestimmt. Die Konzentration von LDAO im
Durchfluss war 0,12 %±0,02 %, d.h. LDAO wurde während der Ankonzentrierung von
NirC nicht ankonzentriert. Daher konnte das Detergenz-Protein-Verhältnis in dem PDK
berechnet werden: (58,4±0,6)-LDAO Moleküle binden an ein NirC.
Abb. 3.11 Quantitative Bestimmung des Detergenz-Protein-Verhältnisses in dem PDK mittels DC. A: Die Banden von LDAO mit verschiedenen Mengen. Die ersten zwei Banden waren zu schwach und nicht quantifizierbar. B: Das mittels einer Ultrazentrifugationsmembran mit einer Ausschlussgröße von 50 kDa und Zentrifugation (3000 x g, 4 °C) ankonzentrierte NirC/LDAO wurde in drei verschiedenen Verdünnungen auf die Platte aufgetragen. Der Durchfluss war die untere Flüssigkeit bei Ankonzentrierung. C: Eichgerade für 0,01 – 0,15 mg. Die Intensität jeder Band im A wurde als die Funktion von der Menge an LDAO gezeichnet. Nur vier Banden wurden genommen, da die Kurve in diesem Bereich linear war.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
63
3.6.2 Bestimmung der Lipidzusammensetzung im PDK
Der Lipidgehalt im PDK kann ebenfalls wichtig für die Kristallisation von
Membranproteinen sein, da die Lipide sich auch an der Interaktion zwischen den PDK-
Molekülen beteiligen. Da bereits bekannt ist, dass Gelfiltrationschromatographie eine
Delipidierung verursachen kann, wurde die Lipidzusammensetzung im PDK quantitativ
bestimmt.
Eine qualitative Untersuchung wurde zuerst mittels DC durchgeführt und die extrahierten
Lipide wurden anhand der Laufhöhe im Vergleich zu dem Standard identifiziert (Abb.
3.12). Die Ergebnisse zeigten, dass PE, PG und CL die Hauptphospholipide in der
Membran von E. coli waren, die NirC überexprimierten. Desweiteren deuten die
Ergebnisse an, dass in NirC/LDAO noch PE vorhanden war. Zudem kann das
Vorhandensein von PG nicht ausgeschlossen werden, da es möglicherweise von der
starken Bande von LDAOH+ verdeckt wurde.
Abb. 3.12 Qualitative Analyse der Lipide in NirC/LDAO vor und nach der Gelfiltration. PC: Phosphatidylcholin; PI: Phosphatidylinositol; PE: Phosphatidylethanolamin; PG: Phosphatidylglycerol; PA: Phosphatidyl Acid; CL: Cardiolipin; Mem 1 und 2: jeweils 2 und 4 μl Extrakt der Membranfraktion aus E. coli C43, die NirC exprimieren; HisTrap: NirC/LDAO vor Gelfiltration; Gelfiltration: NirC/LDAO nach Gelfiltration; Puffer: Puffer der Proteinlösung. 1: PE; 2: PG; 3: CL; 4: LDAOH+; 5: LDAO. Das Laufmittel: Chloroform/ Methanol/ Essigsäure (65/ 25/ 8).
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
64
Die Fettsäurezusammensetzung der Phospholipide in NirC/LDAO ohne vorhertige
Gelfiltration wurde mittels GC/MS quantitativ bestimmt (Tabelle 3.1). Es waren sechs
unterschiedliche Fettsäuren vorhanden, von denen Ölsäure (18:1, 9Z) und Palmitinsäure
(16:0) die häufigsten waren. Insgesamt kamen auf ein mg NirC/LDAO ca. 1,39 μg
Fettsäure, die 1 Mol Fettsäure pro 6,8 Mol NirC/LDAO entspricht. Da ein Mol
Phospholipide zwei Mol Fettsäuren enthalten, beträgt das Verhältnis von Phospholipid zu
NirC/LDAO im PDK ca. 1: 13,6.
Tabelle 3.1 Die Fettsäurezusammensetzung von Phospholipiden in NirC/LDAO ohne Gelfiltration.
Fettsäure μg/mg
NirC/LDAO Anteil MW
μMol/mg NirC/LDAO
Myristinsäure, 14:0 0,0416 3,00 % 228 0,000182456
Palmitinsäure, 16:0 0,278264857 20,04 % 256 0,001086972
Palmitoleinsäure, 16:1 (9Z) 0,160355556 11,55 % 254 0,000631321
Heptadecenoinsäure,17:1 (10Z) 0,135111111 9,73 % 268 0,000504146
Stearinsäure, 18:0 0,04186546 3,01 % 284 0,000147414
Oleinsäure, 18:1 (9Z) 0,731377778 52,67 % 282 0,002593538
Σ(Fettsäure) 1,388574761 0,005145847
Phospholipid/NirC (Mol/Mol) 1 / 13,6
3.7 Aggregationstest
Um die Relevanz von Detergenz auf die Kristallisation von Membranproteinen zu
berücksichtigen, müssen einige Detergenzien ausgewählt und getestet werden. Das
Ergebnis ist in Abb. 3.13 dargestellt. Das mit DDM (0,01 %) gereinigte NirC wurde für
dieses Experiment ausgewählt, da es nicht so stabil war: die Proteine fielen einige Tage
nach Aufreinigung teilweise aus. Dieses Experiment ergab, dass die Absorptionen bei 320
nm von OGP, Fos-Cholin-iso9 und der Verdünnung mit der Zeit stiegen und die
Absorptionen der anderen fünf Detergenzien sanken. Dies bedeutet, dass OGP und Fos-
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
65
Cholin-iso9 auf keinen Fall mit NirC kompatibel sind. Im Gegensatz dazu sind LDAO,
DDPO, D10M und D11M mögliche geeignete Detergenzien für NirC.
OGPVerdünnung
Fos Cholin iso 9
Fos Cholin 12LDAODDPO
D11MD10M
3.8 Austausch von Detergenz
Es wurden insgesamt fünf Detergenzaustausche durchgeführt: LDAO→DDPO
LDAO→D10M, D10M→D9M, D10M→D11M, D10M→DDM.
In der Abb. 3.14.A ist das Chromatogarmm des Austausches (LDAO→DDPO) dargestellt.
Der Elutionspuffer besteht aus: 50 mM HEPES pH 8,0, 500 mM NaCl, 10 % Glycerol und
Abb. 3.13 Aggregationstest. Die mit DDM (0,01%) gereinigten Proteinproben, wurden mit verschiedenen Detergenzien (bis zu 300 μl) gemischt, in der die Konzentration an Protein 1 mg/ml betrug und die Konzentration des neuen Detergenz das 10 fach seines CMC ausmachte. Die Absorption bei 320 nm wurde mit einem Zeitabstand von 20 Sekunden für 30 Minuten gemessen. Verdünnung: Die Proteinprobe wurde mit Puffer ohne Detergenz 10 fach verdünnt.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
66
0,2 % DDPO. Die Fraktionen in dem Durchflusspeak und Elutionspeak wurden mit Hilfe
eines SDS-Gel analysiert (Abb. 3.14.B). In der Durchflussfraktion war noch NirC zu
erkennen, was auf die limitierte Säulenkapazität zurückgeführt werden kann. Das eluierte
Protein war relativ sauber und wurde mittels einer Ultrazentrifugationsmembran mit einer
Ausschlussgröße von 50 kDa und Zentrifugation (3000 x g, 4 °C) für weitere
Kristallisationsversuche ankonzentriert.
Manual Run 6:10_UV Manual Run 6:10_Conc Manual Run 6:10_Fractions
0
200
400
600
800
1000
mAu
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 min1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Durchfluss
NirC_DDPO
Abb. 3.14.A Chromatogramm des Detergenzaustausches (LDAO→DDPO) mittels Affinitätschromatographie. Das mit LDAO gereinigte NirC wurde auf eine 1 ml HisTrap FF Säule geladen. Die Säule wurde mit etwa 35 ml DDPO-haltigen Puffer gewaschen und anschließend über einen linearen Gradienten von 0-100% Elutionspuffer eluiert (100% Elutionspuffer entsprach 500 mM Imidazol). Dabei war ein scharfer Peak zu erkennen.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
67
M 1 2 3 4 5
25 kDa
45 kDa
In der Abb. 3.15.A ist das Chromatogramm des Austausches (D10M→D9M) gezeigt.
Manual Run 9:1_UV Manual Run 9:1_Conc Manual Run 9:1_Fractions
0
50
100
150
mAu
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 min
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Durchfluss
NirC_D9M
100 mMImidazol
120 mMImidazol
Abb. 3.15.A Chromatogramm des Detergenzaustausches (D10M→D9M) mittels Affinitätschromatographie. Das mit D10M gereinigte NirC wurde auf einer 1 ml HisTrap FF Säule geladen. Die Säule wurde mit etwa 20 ml D9M-haltigem Puffer gewaschen, und NirC anschließend mit einem linearen Gradienten von 24-100% Elutionspuffer eluiert (100% Elutionspuffer entsprach 500 mM Imidazol). Dabei war ein scharfer Peak zu erkennen.
Abb. 3.14.B SDS-PAGE des Detergenzaustausches (LDAO→DDPO). M: Protein Molecular Weight Marker von Fermentas. 1: Durchflussfraktion, 2-5: Elutionsfraktionen.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
68
Der Elutionspuffer besteht aus: 50 mM HEPES pH 8,0, 500 mM NaCl, 10 % Glycerol, 0,6
% D9M. Die Analyse der Fraktionen mittels eines SDS-Gels zeigte, dass das eluierte
Protein ebenfalls sauber war (Abb. 3.15.B). Daher wurde es mit Hilfe einer
Ultrazentrifugationsmembran mit einer Ausschlussgröße von 30 kDa auf ca. 10 mg/ml
ankonzentriert.
M 1 2 3 4 5 6
45 kDa
25 kDa
Die Austausche von D10M→D11M und D10M→DDM wurden ebenfalls durchgeführt
(Daten hier nicht gezeigt), wobei der Austausch noch über DC zu verifizieren ist.
Abb. 3.15.B SDS-PAGE des Detergenzaustausches (LDAO→DDPO). M: Protein Molecular Weight Marker von Fermentas. 1: Durchflussfraktion, 2-6: Elutionsfraktionen.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
69
3.9 Kristallisation von NirC
Die Kristallisationsversuche fanden unter den in 2.7 angegebenen Bedingungen statt.
Kristalle von NirC/LDAO wurden zuerst einige Tage nach Pipettierung in einigen initialen
Bedingungen gefunden.
a). b). c).
Sie waren jedoch entweder zu klein (Abb. 3.16.b und c) oder nicht regelmäßig (Abb.
3.16.a). Durch zur Optimierung des pH-Werts, der Konzentration an Präzipitant und der
Ionenstärke konnten größere (Abb. 3.17.b) bzw. plattenförmige Kristalle (Abb. 3.17.a)
gefunden werden.
a). b).
Die plattenförmigen Kristalle konnten durch Mikroseeding hinsichtlich ihres
dreidimensionalen Wachstums verbessert werden, jedoch waren sie für
Röntgenbeugungsexperimente immer noch zu klein bzw. nicht regelmäßig angeordnet.
Abb. 3.16 Kristalle von NirC/LDAO in drei initialen Bedingungen. a): 0,2 M Imidazolmalat pH 5,5, 33% PEG 600, 4°C; b): 0,1 M MES pH 6,5, 2,4 M Diammoniumsulfat, 20 °C; c) 0,1 M Natriumcitrat pH 3,5, 0,1 M Lithiumsulfat, 30% PEG 400. 4 °C. Proteinkonzentration: 10 mg/ml.
Abb. 3.17 Kristalle von NirC_LDAO in Finescreens. a): 0,1 M Natriumcitrat pH 4,5, 0,12 M Lithiumsulfat, 28% PEG 400; b): 0,2 M Imidazolmalat pH 5,5, 35% PEG 600. Proteinkonzentration: 10 mg/ml, 4 °C.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
70
Daher wurden weitere Additive und Detergenzien ausprobiert. Um die kinetischen
Eigenschaften der Kristallisation zu ändern, wurde das Reservoir mit Paraffinöl
überschichtet. Die besten Kristalle konnten nach Zugabe von vier Additiven (Additive 1:
10 % Pluronic F68, Additive 2: 4 mM Zwittergent 3-14, Additive 3: 1,1 mM C12E8,
Additive 4: 60 mM NaNO2) und 100 μl Paraffinöl im Reservoir beobachtet werden (Abb.
3.18).
Für das mit anderen Detergenzien gereinigte NirC wurden die oben genannten
Kristallisationsbedingungen wiederholt. Mit Ausnahme von NirC/DDPO konnten überall
Kristalle gefunden werden. Es wurde ebenfalls Finescreens, Mikroseeding, Additive
Screens und Detergent Screens durchgeführt, die bisher besten Kristalle sind in Abb. 3.19
dargestellt. Die Kristalle von NirC_D10M waren zwar dreidimensional und groß, jedoch
war ihre Oberfläche unregelmäßig, was darauf hindeutet, dass die Proteinmoleküle
innerhalb des Kristalls nicht perfekt angeordnet waren.
Die bisher besten Bedingungen sind in Tabelle 3.2 zusammengefasst:
Tabelle 3.2 Kristallisationsbedingungen.
Protein Detergenz Puffer Präzipitant Salz Additive 1 Additive 2 Bemerkung
NirC LDAO 0,1 M NaCitrat, pH 4,5
28 % PEG 400 0,12 M Li2SO4
10 % Pluronic F68
1.1 mM C12E8
100 μl Paraffinöl
in Reservoir
NirC DDM 0,1 M NaCitrat, pH 4,9
36 % PEG 400 0,12 M Li2SO4
NirC D11M 0,1 M NaCitrat, pH 4,4
33 % PEG 400 0,12 M Li2SO4
NirC D10M 0,1 M NaCitrat, pH 4,3
35 % PEG 400 0,12 M Li2SO4
15 % 1,2,3-Heptantriol
NirC D9M 0,1 M NaCitrat, pH 3,9
40 % PEG 400 0,12 M Li2SO4
Abb. 3.18 Kristall von NirC_LDAO. Die Bedingungen im Reservoir: 0,1 M Natriumcitrat pH 4,5, 0,12 M Lithiumsulfat, 28% PEG 400, Additive 1: 10% Pluronic F68, Additive 2: 4 mM Zwittergent 3-14, Additive 3: 1,1 mM C12E8, Additive 4: 60 mM NaNO2. 100 μl Paraffin wurde als Zusatz in Reservoir verwendet, um die Kristallisationsgeschwindigkeit zu verringern. Proteinkonzentration: 10 mg/ml, 4 °C.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
71
a). b). c).
d). e). f).
3.10 Röntgenbeugungsexperimente
Ungefähr fünfzig Kristalle von NirC_LDAO bzw. NirC_D10M wurden getestet. Sie
streuten jedoch entweder nicht oder nur sehr schlecht, daher wurden drei
Kristallmanipulationen probiert: „crystal annealing“, Kristalldehydration und „cross-link“.
Sie erbrachten aber keine Verbesserung, so dass bis jetzt die Auflösungsgrenze bei ca. 8 Å
(NirC_D10M) liegt.
Abb. 3.19 Kristalle von NirC_D10M (a, b, c), NirC_D11M (d), NirC_DDM (e), NirC_D9M (f). Kristallisationsbedingungen: a): 0,1 M Natriumcitrat pH 4,3, 0,12 M Lithiumsulfat, 35% PEG 400, Additive: FOS-Choline-12; b): 0,1 M Natriumcitrat pH 4,3, 0,12 M Lithiumsulfat, 34% PEG 400, nach Mikroseeding; c): 0,05 M HEPES, pH 8,0, 25% PEG 4000, 10% MPD; d): 0,1 M Natriumcitrat, pH 4,4, 0,12 M Lithiumsulfat, 33% PEG 400; e): 0,1 M Natriumcitrat, pH 4,9, 0,12 M Lithiumsulfat, 36% PEG 400;f): 0,1 M Natriumcitrat pH 3,9, 0,12 M Lithiumsulfat 40% PEG 400. Proteinkonzentration: 10 mg/ml, 4 °C.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
72
3.11 ITC (engl. Isothermal Titration Calorimetry)
Das ITC-Experiment wurde bei 20 °C bei unterschiedlichen pH Werten (pH 3, 5, 6, 8)
sowie Protein- und Ligandenkonzentration durchgeführt. Als Protein wurden NirC/LDAO
und NirC/D10M getestet und als Liganden Natriumnitrit, Natriumnitrat und
Natriumformiat getestet (Tabelle 3.3). Eine Bindung zwischen Protein und Ligand war
jedoch bei allen Versuchen nicht zu beobachten. In der Abb. 3.20 ist ein Beispiel gezeigt.
Die Puffer bestand aus 20 mM MES pH 6, 300 mM NaCl, 10 % Glycerol und 0,1 %
LDAO. Die Konzentration an Protein (NirC_LDAO) und Ligand (NaNO2) betrug jeweils
0,116 mM bzw. 30 mM. Nach Berücksichtigung des Einflusses einer Puffer-Puffer-
Titration konnte keine sigmoidale Kurve detektiert werden. Die lineare Messkurve war
wahrscheinlich eine Folge der Proteinverdünnungsenthalpie.
Tabelle 3.3 Die getesteten Bedingungen für ITC.
Versuch Detergenz pH CProtein (mM) Ligand CLigand (mM)
1 LDAO 8 0,005 Nitrit 0,15
2 LDAO 8 0,05 Nitrit 1,25
3 LDAO 8 0,05 Nitrit 2,5
4 LDAO 6 0,037 Nitrit 1,5
5 LDAO 6 0,116 Nitrit 30
6 LDAO 5 0,108 Nitrit 5
7 LDAO 3 0,13 Nitrit 10
8 LDAO 8 0,125 Nitrat 10
9 LDAO 8 0,125 Formiate 3,75
10 D10M 8 0,063 Nitrit 5
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73
Abb. 3.20 ITC-Experiment. Protein: NirC_LDAO (0,116 mM), Ligand: NaNO2 (30 mM), Puffer: 20 mM MES pH 6, 300 mM NaCl, 10% Glycerol und 0,1% LDAO. Der Versuch wurde bei 20 °C durchgeführt. Es konnte keine Bindung beobachtet werden. Die lineare Messkurve spiegelt wahrscheinlich die exothermische Proteinverdünnungsenthalpie wider.
DDIISSKKUUSSSSIIOONN
74
4 DISKUSSION
4.1 Solubilisierung und Aufreinigungen von NirC
NirC war zu Anfang mit DDM solubilisiert und aufgereinigt worden. Aber die
Solubilisierungseffizienz von DDM war nicht hoch und das Protein NirC/DDM war
ebenfalls nicht sehr stabil, da es einige Tage nach der Reinigung teilweise präzipitierte.
Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass DDM ein nichtionisches Detergenz und
daher relativ milder ist.
Anhand der Ergebnisse der Aggregationstests wurde LDAO für die weiter führenden
Experimente gewählt. LDAO ist zwitterionisch und stärker als DDM. Das Detergenz
funktionierte sowohl bei der Solubilisierung als auch bei der Aufreinigung des NirC sehr
effizient. Die Ausbeute war sehr hoch (2,7 mg NirC/ 1 g Zellen) und die Proteine waren
nach HisTrap Reinigung schon sehr sauber. Außerdem waren NirC/LDAO für lange Zeit
stabil.
Daraus ergibt sich jedoch ein Problem: LDAO ist ein zwitterionisches Detergenz und hat
daher eine hohe Affinität zum Membranprotein, was zur starken Delipidierung führen kann
(le Maire et al., 2000). Anhand des Ergebnisses der Phospholipidanalyse (3.6.2) beträgt das
Phospholipid-Protein-Verhältnis in dem Protein-Detergenz-Komplex ca. 1:13,6 (Mol:Mol).
Dieser Wert ist im Vergleich zu dem des Glycerol-3-Phosphat-Tranporters (41,1:1 nach
Affinitätschromatographie), welcher mit DDM aufgereinigt wurde, sehr niedrig.
Die Effekte der Membranprotein-Lipid-Interaktion sind unterschiedlich. Sie sind
möglicherweise notwendig für die Stabilität des Membranproteins. Sie können als
Chaperonin bei der Insertion und Faltung funktionieren. Sie können sich ebenfalls direkt
am molekularen Funktionsmechanismus beteiligen, wie etwa der enzymatischen Aktivität
oder dem Transportprozess (Palsdottir et al., 2004).
Die Wechselwirkungen zwischen Membranprotein und Lipid beruhen auf zwei Ursachen.
Die erste, auch die stärkste und häufigste ist die Wechselwirkung der negativ geladenen
Kopfgruppe des Lipids mit der positiv geladenen Seitenkette von Aminosäuren an der
Proteinoberfläche. Als zweites kann die hydrophobe Lipidseitenkette fest in einer Furche
DDIISSKKUUSSSSIIOONN
75
der Proteinoberfläche binden und dort durch die van-der-Waals-Kräfte stabilisiert werden
(Palsdottir et al., 2004).
Es ist bekannt, dass eine zu starke Delipidierung zur Inaktivierung des Proteins führen
kann, wie z.B. beim Cytochrom-bc1-Komplex (Schagger et al., 1990) und der Na+,K+-
ATPase (Esmann et al., 1984). Außerdem benötigen einige Membranproteinkristalle die
Phospholipide für bessere Beugungsqualität wie z.B. im Fall der Ca2+-ATPase (Toyoshima
et al., 2000) und des Lichtsammelkomplexes in Pflanzen (Nussberger et al., 1993). Daher
kann die starke Delipidierung des NirC/LDAO in dieser Arbeit möglichweise für die
schlechte Beugungsqualität des Kristalls und die nicht erfolgreichen ITC-Experimente
verantwortlich sein.
Einige Maßnahmen können getroffen werden, um eine starke Delipidierung zu vermeiden.
Zuerst können mildere Detergenzien anstelle von LDAO zur Solubilisierung verwendet
werden. Nichtionische Detergenzien sind generell von allen drei Typen am mildesten. Es
wurde jedoch gezeigt, dass DDM für NirC nicht geeignet ist und kein anderes
nichtionisches Detergenz in unserem Labor in großer Menge vorliegt. Deshalb könnte eine
Detergenzmischung aus z.B. LDAO und DDM eingesetzt werden. Damit wird
möglicherweise ein Optimum von Solubilisierung und minimaler Delipidierung erreicht
(Esmann, 1983).
Zweitens kann man versuchen, möglichst wenig Detergenzien bei der Solubilisierung zu
benutzen. In der Abb. 4.1 wird der Solubilisierungsprozess biologischer Membran mit
Protein dargestellt. Die Detergenzien werden schrittweise zu einer Membransuspension
hinzugefügt. Nach jedem Schritt wird die Suspension bei 100,000 x g zentrifugiert. Die
Masse des Sediments und die Konzentration an Protein und Lipid im Überstand wird
gemessen und somit der Solubilisierungsgrad von Protein und Lipid bestimmt. Dieser
Prozess kann in drei Phasen eingeteilt werden. In der Phase I findet noch keine
Solubilisierung des Proteins statt, so dass bei einer Zentrifugation bei 100,000 x g für 1 h
die Membranen nahezu vollständig sedimentiert würden. Diese Phase entspricht ebenfalls
der Phase a in der Abb. 1.7: Die Detergenzmoleküle dringen zunehmend in die
Lipiddoppelschicht ein, aber die Lipide überwiegen noch. In der Phase II werden die
Membranproteine und Lipide kontinuierlich mit dem Detergenz solubilisiert. Der in dieser
Phase entstehende Protein-Detergent-Komplex enthält noch relativ viele Lipide. In der
Phase III werden sowohl die Lipide als auch die Membranproteine vollständig solubilisiert
und die vorher noch im PDK vorhandenen Lipide werden schrittweise durch Detergenz
ersetzt. Am Ende werden die Proteine fast ausschließlich von Detergenzien umhüllt.
DDIISSKKUUSSSSIIOONN
76
Anhand des Diagramms sollen die Proteine kurz vor dem Übergangsbereich von Phase II
zur Phase III solubilisiert werden. Damit können die Membranproteine effizient gelöst
werden, ohne dass sie gleichzeitig zu stark delipidiert werden (Kragh-Hansen et al., 1998).
Als dritte Möglichkeit können die Phopholipide auch bei der Aufreinigung des Proteins
eingesetzt werden (Causes et al., 1997). Dafür muss zuerst analysiert werden, welche
Phospholipide in den Membranen vorhanden sind. So können bestimmte Phospholipide
gezielt zugesetzt werden. Anhand der Ergebnisse aus Abschnitt 3.6.2, liegen drei
verschiedene Phospholipide in der Membran von E. coli C43 vor, bei denen NirC
überexprimiert wird: Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylglycerin (PG) und
Cardiolipin (CL).
Abb. 4.1 Ein schematischer Solubilisierungsprozess. Die Phase I ist charakteristisch durch eine nahezu vollständige Sedimentierung von Membranen nach einer Zentrifugation bei 100,000 x g für 1 h. In der Phase II werden Membranproteine und Lipide kontinuierlich solubilisiert. Der in dieser Phase entstehende Protein-Detergent-Komplex enthält noch relativ viele Lipide. In der Phase III werden sowohl Lipide als auch Membranproteine vollständig solubilisiert und die vorher noch im PDK vorhandenen Lipide werden schrittweise durch Detergenz ersetzt. Am Ende werden die Proteine fast ausschließlich von Detergenzien umhüllt (Kragh-Hansen et al., 1998).
DDIISSKKUUSSSSIIOONN
77
Ein anderes Problem während der Aufreinigung des Proteins war die Größe von NirC. Die
theoretische molekulare Größe von NirC ist 28.562 kDa. Deshalb wurde am Anfang eine
Superdex 75 Säule, die für die Trennung von Proteinen mit einer molekularen Größe von
3-70 kDa effizient ist, für die Größenausschlusschromatographie verwendet. Hier fand sich
NirC aber immer im Ausschlussvolumen. Dies kann darauf zurückführen sein, dass die am
Protein gebundenen Detergenzmoleküle sowie die möglichen Multimerformen des Proteins
vernachlässigt wurden. Aufgrund der Tatsache, dass NirC im SDS-Gel in vier Banden
(Monomer, Dimer, Trimer, Tetramer) auftrat und alle Proteine nach der Zertrifugation
mittels einer Zentrifugationsmembran mit einer Ausschlussgröße von 50 kDa
aufkonzentriert werden konnten, wird vermutet, dass NirC als Tetramer vorliegt. Diese
Vermutung wurde durch eine Gelfiltration mit einer Superdex 200 Säule bestätigt, welche
Proteine mit einer Größe von 10-600 kDa effektiv trennen kann.
4.2 Bestimmung der Detergenz-/Phospholipidzusammensetzung im PDK
Die qualitative und quantitative Analyse der Zusammensetzung von Detergenz und
Phospholipid im Protein-Detergenz-Komplex liefert wichtige Informationen über
Delipidierung. Wegen des Zeitlimits wurde jedoch die Analyse nur auf das mit LDAO
aufgereinigte NirC eingegangen. Weitere Experimente sollen mit Protein ausgeführt
werden, das mit anderem Detergenz aufgereinigt worden ist. Ein Vergleich des
Lipidgehalts von Protein vor und nach der Gelfiltration sollte ebenfalls durchgeführt
werden. Damit könnte die Delipidierungsfähigkeit der Gelfiltration bzw. verschiedener
Detergenzien verglichen werden (Lemieux et al., 2003).
DDIISSKKUUSSSSIIOONN
78
4.3 Kristallisation
Die Kristallisation ist eine der entscheidenden und auch schwierigsten Schritte in der
Ermittlung einer dreidimensionalen Proteinstruktur. Bei Membranproteinen tritt ein
Kristall normalerweise in der Nähe der LLPS (engl. liquid-liquid phase separation) auf, bei
der sich die wässrige Phase und die Detergenzphase voneinander trennen. Die LLPS wird
wiederum durch mehrere Faktoren beeinflusst, wobei der Typ des Detergenz, die
Präzipitanzkonzentration, die Temperatur und eventuell ein zusätzliches Amphiphil zu den
wichtigsten gezählt werden (Tanaka et al., 2003; Rosenow et al., 2000; Yu et al., 2000).
Detergenz vermittelt die Interaktion im Protein-Detergenz-Komplex (Abb. 4.2). In dieser
Arbeit wurden insgesamt 6 verschiedene Detergenzien getestet, D9M, D10M, D11M,
DDPO und LDAO. D9M, D10M, D11M sind nichtionische Detergenzien und haben alle
einen Maltopyranosid-Kopf, aber unterschiedlich lange Alkylketten. DDPO ist ein
nichtionisches Phosphinoxid und LDAO ist ein zwitterionisches Aminoxid (Tabelle 1.3).
Es wurde Kristalle bei allen Dergentien außer DDPO gefunden. Die besten
Kristallisationsbedingungen sowie die Gestalt des Kristalls waren jedoch leicht
unterschiedlich, was den Einfluss des Detergenz bei der Kristallisation widerspiegelt. Bis
jetzt sind die Kristalle aus NirC/LDAO am besten gewachsen. Sie sind vergleichsweise
groß und dreidimensional und haben typisch eine oktaedrische Gestalt (Abb. 3.18). Leider
streuten sie sehr schlecht (≥ 18 Å). Bei NirC/D10M wurden auch viele große
dreidimensionale Kristalle produziert. Sie waren hexagonal und relativ dünn. Ihre
Oberflächen waren unregelmäßig (Abb. 3.19), was vermutlich darauf hindeutet, dass die
Proteinmoleküle im Kristall nicht perfekt angeordnet waren. Solche Kristalle streuten
maximal bis ca. 8 Å. Einige Kristallmanipulationen, wie z.B. „crystal annealing“,
Kristalldehydration und „cross-link“ wurden durchgeführt. Sie erbrachten jedoch keine
Verbesserung. Vor kurzem wurden Kristalle bei NirC/D9M, NirC/D11M und NirC/DDM
(Abb. 3.19) beobachtet. Sie hatten die gleiche Gestalt wie Kristalle aus dem NirC/D10M,
aber waren dicker und ihre Oberflächen waren ebenfalls glatter im Vergleich zu
NirC/D10M. Sie sind aber noch zu klein für Beugungsexperimente.
DDIISSKKUUSSSSIIOONN
79
Es wurde beobachtet, dass das Präzipitanz PEG 400 bei der Löslichkeit des Proteins
NirC/LDAO eine interessante Rolle spielt. Das Auftreten von Präzipitat nimmt deutlich zu,
wenn die Konzentration an PEG 400 höher als 32 % ist, da PEG 400 die Löslichkeit des
Proteins verringern kann. Ist Jedoch die Konzentration niedriger als 28 %, fällt das Protein
wieder aus, was schwieriger zu erklären ist. Vielleicht kann die OH-Gruppe der PEG-
Moleküle den Protein-Detergenz-Komplex mittels polarer Wechselwirkungen stabilisieren,
so dass eine bestimmte Konzentration an PEG benötigt wird. Dieses Phänomen wurde
jedoch bei der Kristallisation von NirC mit D9M, D10M, D11M oder DDM nicht
beobachtet. Diese Proteinsolubilisate sind generell stabiler als NirC/LDAO bei höherer
Präzipitanzkonzentration (34 % - 40 % PEG 400).
Für die Verbesserung des Kristalls sollen vor allem andere Detergenzien oder
Detergenzmischungen getestet werden. Eine Mischung von Detergenzien mit
unterschiedlicher Kettenlänge hat den Vorteil, dass sie die reale Lipidumgebung innerhalb
der Membrandoppelschicht besser simulieren kann (Esmann 1983). Als nächstes soll das
Protein ohne eine starke Delipidierung ausprobiert werden. Der für die
Affinitätschromatographie eingesetzte HisTag sollte ebenfalls nicht vernachlässigt werden.
Acht Aminosäuren (sechs Histidin und zwei Aminosäuren aus der Schnittstelle von XhoI)
werden am C-Terminus des NirC eingefügt, was möglicherweise die Proteine instabil
macht. Deshalb kann eine Schnittstelle für eine Protease vor dem HisTag eingebaut werden,
so dass der HisTag nach der Aufreinigung des Proteins entfernt werden kann. Die TEV-
Abb. 4.2 Die durch Detergenz vermittle Interaktion zwischen Membranproteinmoleküle innerhalb Kristalle. a): Typ I 3D Kristall; b): Typ II 3D Kristall (Ostermeier et al., 1997).
DDIISSKKUUSSSSIIOONN
80
Protease passt perfekt zu NirC, da ihre Erkennungssequenz Gly↓Gln-Phe-Tyr-Leu-Asn-
Glu ist und ein Glycin genau die letzte Aminosäure von NirC ist.
Die Beugungsqualität des Kristalls hängt darüberhinaus von der Kryobedingung ab. In
dieser Arbeit wurde dieselbe Lösung aus dem Reservoir, jedoch mit 35 % PEG 400 als
Kryobedingung, benutzt. Hirebei wurde häufig beobachtet, dass sich entweder die Kristalle
lösten oder die Oberflächen der Kristalle rauher wurden. Deshalb müssen bessere
Kryobedingungen gefunden werden.
4.4 ITC
Bei dem ITC-Experiment wurden insgesamt zehn verschiedene Bedingungen (Tabelle 3.3)
getestet. Aber keine richtige Bindung wurde beobachtet. Bei fast allen Fällen fand sich ein
linearer Verlauf (Abb. 3.20). Dies sollte vielmehr ein Ergebnis der Verdünnung des
Proteins bzw. Ligands sein. Da die Experimente in einem großen Bereich von
Bedingungen durchgeführt wurden, wird vermutet, dass die Bindung noch von anderen
Faktoren abhängt, als bisher getestet wurde.
Eine Möglichkeit ist, dass die Proteine in einer durch Detergenz inaktivierten Form
aufgereinigt wurden. Genau wie in Abschnitt 4.2 erläutet, führt eine zu starke
Delipidierung häufig zur Inaktivierung eines Membranproteins. Mit Blick auf die
Ergebnisse in Abschnitt 3.6.2 wurde NirC/LDAO wahrscheinlich durch Delipidierung
inaktiviert. D10M ist ein nichtionisches Detergenz und ist eigentlich milder als LDAO.
Aber das NirC/D10M wurde durch den Detergenzaustausch aus NirC/LDAO erhalten,
deshalb sollte es wahrscheinlich ähnlich stark delipidiert worden sein. Um diese
Deaktivierung zu vermeiden, könnte vor allem das weniger delipidierte Protein verwendet
werden. Als eine alternative Möglichkeit können andere Detergenzien als Zusätze benutzt
werden. C12E10 scheint hier eine gute Wahl zu sein, da es eine Mischung aus
Polyoxyethylen mit unterschiedlichen Oxyethylenkettenlängen ist. Deshalb sollte es die
essentiellen Phospholipide teilweise ersetzen. In einigen Fällen konnte die enzymatische
Aktivität dadurch fast vollständig wiederhergesetzt werden. Zum Beispiel wird bei der
durch C12E8 solubilisierten Na+,K+-ATPase irreversible inaktivierung beobachtet, wenn
das C12E8/Protein-Verhältnis (mg/mg) höher als vier ist. Wenn aber 1 mg/ml C12E10
DDIISSKKUUSSSSIIOONN
81
eingesetzt wird, bleibt die Aktivität bei ca. 90-95 %, selbst wenn die Konzentration an
Protein in der Lösung 0,35 mg/ml, C12E8 2 mg/ml beträgt (Esmann, 1983).
Da die vermutliche Funktion von NirC im Nitrittransport liegt, ist es möglich, dass es in
zwei Konformationen auftritt. Die erste Form sollte eine höhere Affinität zu Nitrit bzw.
HNO2, so dass Nitrit bzw. HNO2 an der periplasmatischen Seite der Cytoplasmamembran
binden kann. Die zweite Form sollte im Gegensatz dazu eine niedrigere Affinität zu Nitrit
bzw. HNO2 haben, so dass das Substrat auf der cytoplasmatischen Seite wieder ins
Medium freigesetzt werden kann. Daher kann NirC, wenn es in der zweiten Form
aufgereinigt wird, seine Substrate nicht binden. In diesem Fall ist die Inaktivierung vom
Detergenz unabhängig und kann deshalb nicht vermieden werden.
ZZUUSSAAMMMMEENNFFAASSSSUUNNGG
82
5 ZUSAMMENFASSUNG
Denitrifikation ist ein anaerober Prozess, bei dem Nitrat anstelle von Sauerstoff als
terminaler Elektronenakzeptor fungiert. Der Nitrit/ Protonen-Symporter NirC ist an diesem
Prozess beteiligt. Er ist ein Membranprotein mit sechs Transmembranhelices und gehört
zur FNT-Familie (Formiat/Nitrat-Transporter). Das durch NirC importierte Nitrit wird mit
Hilfe der cytoplasmatischen Nitritreduktase NirB zu Ammoniak reduziert, welches die
wichtigste Sticktsoffquelle für die Biosynthese von Aminosäuren und Nukleinsäuren
darstellt.
Um den Transportmechanismus aufzuklären, wurde in dieser Diplomarbeit das Gen nirC
aus E. coli mit PCR amplifiziert und dann in den Expressionsvektor pET-21a(+) kloniert.
NirC wurde in E. coli C43 überexpremiert und anschließend mit LDAO solubilisiert. Die
Aufreinigung erfolgte mittels Affinitätschromatographie und Gelfiltration. Mit dem reinen
NirC/LDAO wurden Detergenzaustausche (LDAO→DDPO, LDAO→D10M,
D10M→D9M, D10M→D11M, D10M→DDM) durchgeführt. Kristalle wurden überall bei
all diesen Protein-Detergenz-Komplexen mit Ausnahme von NirC/DDPO gefunden. Sie
beugten jedoch nicht ausreichend für die Strukturaufklärung.
Zur Charakterisierung der Bindungsaffinität (Ka), der Bindungsenthalpie (ΔH) und der
Bindungsstöchiometrie (n) von NirC mit seinem Liganden Nitrit wurden ITC-Experimente
durchgeführt. Eine Bindung von Ligand und Protein konnte nicht nachgewiesen werden,
da das Protein möglicherweise in einer inaktivierten Form aufgereinigt wurde.
Zusätzlich wurde die Zusammensetzung des Detergenz bzw. Phospholipids im Protein-
Detergenz-Komplex qualitativ und quantitativ bestimmt, was die Informationen für die
Verbesserung der Kristallisation bzw. der ITC-Experimente in der Zukunft liefert.
LLIITTEERRAATTUURRVVEERRZZEEIICCHHNNIISS
83
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AANNHHAANNGG
92
7 ANHANG
7.1 Abkürzungsverzeichnis
Å Angstrøm = 10-10 m (keine SI-Einheit)
ε molarer Extinktionskoeffizient
Amp Ampicillin
APS Ammoniumpersulfat
BCA 2,2'-Bichinolin-4,4'-dicarbonsäure Dikaliumsalz
bp Basenpaare (base pairs)
BCA Bicinchroninsäure
BSA Rinderserum-Albumin (bovine serum albumin)
C12E8 Polyoxyethylene(8)dodecyl ether
C12E10 Polyoxyethylene(10)dodecyl ether
CIAP calf intestine alkaline phosphatase
CL Cardiolipin
D9M n-Nonyl-ß-D-Maltopyranosid
D10M n-Decyl-ß-D-Maltopyranosid
D11M n-Undecyl-ß-D-Maltopyranosid
Da Dalton [g/mol]
DDM n-Dodecyl-ß-D-Maltopyranosid
DDPO Dimethyl-Decylphosphin
DC Dünnschichtchromatographie
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleinsäure
GC Gaschromatographie
HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
His-Tag Histidin Marker
AANNHHAANNGG
93
IPTG Iso-propylthiogalactosid
ITC Isothermal Titration Calorimetry
Kan Kanamycin
kDa KiloDalton, 1 kDa = 1000 g·mol-1
LB Luria Bertani
LDAO n-Dodecyl-N,N-Dimethylamin-N-Oxid
M mol/L
MS Massenspektrometrie
MW Molekulargewicht [g/mol]
OD Optische Dichte
PA Phosphatidyl Acid
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PC Phosphatidylcholin
PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
PDK Protein-Detergenz-Komplex
PE Phosphatidylethanolamin
PEG Polyethylenglykol
PG Phosphatidylglycerol
PI Phosphatidylinositol
SDS Natriumdodecylsulfat
TEMED N, N, N´, N´ Tetramethylethylendiamin
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
UV Ultraviolett
v/v Volumenprozent (volume per volume)
w/v Gewichtsprozent (weight per volume)
AANNHHAANNGG
94
7.2 Basensequenz von NirC
1 atgtttacag acactattaa taagtgtgcg gctaacgctg cgcgcattgc acgcctgtcg
61 gcaaataacc cgctcggctt ttgggtcagc tccgccatgg cgggcgcgta tgtgggtctt
121 gggatcatcc tgattttcac gctcggtaat ttgctcgatc catccgtacg ccctttggtg
181 atgggcgcga cctttggtat cgccttaacg ctggtgatta tcgccggttc tgaactgttc
241 accggacaca ccatgttcct cacctttggg gtaaaagcgg gcagcatcag ccacgggcaa
301 atgtgggcaa tcctgccgca aacctggctg ggtaacctgg tcggttccgt cttcgttgcc
361 atgctctata gctggggcgg cggtagcctg ctgccggtag ataccagcat cgttcactcc
421 gtcgcgctgg ctaaaaccac tgcaccggca atggtactct tcttcaaagg tgcattgtgt
481 aactggctgg tttgcctggc aatctggatg gcgctgcgca ctgaaggggc ggcgaaattt
541 atcgctatct ggtggtgtct gctggcattt atcgcgtccg gctacgagca ctctatcgct
601 aacatgacgc tgttcgcgct ctcctggttc ggcaaccaca gcgaagccta cacgctggcg
661 ggtattggtc ataacctgct gtgggtgacg ctgggtaata ctttatcagg tgccgtattc
721 atgggattgg gttattggta tgctacgccg aaagcgaatc gtccggttgc ggacaaattt
781 aatcaaactg aaacggctgc cggttaa
7.3 Aminosäuresequenz von NirC
1 mftdtinkca anaariarls annplgfwvs samagayvgl giiliftlgn lldpsvrplv
61 mgatfgialt lviiagself tghtmfltfg vkagsishgq mwailpqtwl gnlvgsvfva
121 mlyswgggsl lpvdtsivhs valakttapa mvlffkgalc nwlvclaiwm alrtegaakf
181 iaiwwcllaf iasgyehsia nmtlfalswf gnhseaytla gighnllwvt lgntlsgavf
241 mglgywyatp kanrpvadkf nqtetaag
DDAANNKKSSAAGGUUNNGG
95
Ich danke herzlich:
Herrn Prof. Dr. Oliver Einsle für eine hochspannende Aufgabenstellung und
seine engagierte und lehrreiche Betreuung.
Herrn Prof. Dr. Ralf Ficner für die Übernahme des Korreferates.
Herrn Daniel Heitmann für die hervorragende Betreung und Diskussion im
Verlauf der Diplomarbeit.
Frau Dr. Susana Andrade für die hilfreiche Unterstützung.
den Mitgliedern der M’n’M-Gruppe: Andreas, Anja, Haitham, Maren, Peer
und Sarah für die äußerst angenehme Arbeitsumgebung und viele
beantwortete Fragen sowie allen weiteren Mitgliedern der Abteilung
molekulare Strukturbiologie für Hilfestellungen.
meinen Eltern für ihre Liebe und finanzielle Unterstützung.
Juan für alles
96
UUnntteerrssuucchhuunnggeenn zzuurr FFuunnkkttiioonn ddeess NNiittrriitt--TTrraannssppoorrtteerrss NNiirrCC aauuss EEsscchheerriicchhiiaa ccoollii
Diplomarbeit vorgelegt von
Wei Lü
aus
Jiangsu, China
angefertigt im Institut für Mikrobiologie und Genetik
Abteilung Molekulare Strukturbiologie an der Biologischen Fakultät der Georg-August-Universität zu Göttingen
2007
Referent: Prof. Dr. Oliver Einsle Korreferent: Prof. Dr. Ralf Ficner Abgabedatum der Diplomarbeit: 13.04.2007 Letzter mündlicher Prüfungstermin: 14.07.2006
IINNHHAALLTTSSVVEERRZZEEIICCHHNNIISS
1
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG .................................................................................................... 4
1.1 Biologische Membran .................................................................................. 4 1.1.1 Aufbau biologischer Membranen............................................................. 4 1.1.2 Funktionen biologischer Membranen ...................................................... 7
1.2 Membranproteine ......................................................................................... 7 1.2.1 Klassifizierung ......................................................................................... 8 1.2.2 Funktionen von Membranproteinen......................................................... 9
1.3 Detergenzien .............................................................................................. 10 1.3.1 Klassifizierung ....................................................................................... 11 1.3.2 Wichtige Parameter von Detergenzien................................................... 12 1.3.3 Solubilisierung von Membranproteinen mit Detergenzien.................... 13 1.3.4 Delipidierung ......................................................................................... 15 1.3.5 Detergenz-Membranprotein-Interaktion und Kristallisation.................. 15
1.4 Stickstoffkreislauf ...................................................................................... 17
1.5 Bedeutung von Nitrat und Nitrit ................................................................ 19
1.6 Das Nitratreduktasesystem in E. coli ......................................................... 20
1.7 Das Nitritreduktasesystem in E. coli .......................................................... 21
1.8 Transport von Nitrat und Nitrit in E. coli................................................... 22
1.9 Daten von NirC aus E. coli ........................................................................ 24
1.10 Aufgabenstellung und Zielsetzung............................................................. 25
2 MATERIAL UND METHODEN ................................................................... 26
2.1 Primer-Design ............................................................................................ 26
2.2 PCR-Amplifikation .................................................................................... 26
2.3 Klonierung und Transformation................................................................. 28
2.4 Überexpression in E. coli ........................................................................... 31
2.5 Reinigung von NirC ................................................................................... 31 2.5.1 Zellernte ................................................................................................. 32 2.5.2 Zellaufschluss......................................................................................... 32 2.5.3 Isolierung der Membranen ..................................................................... 33 2.5.4 Solubilisierung mit Detergenz ............................................................... 33 2.5.5 His-Tag Affinitätschromatographie ....................................................... 34 2.5.6 Größenausschlußchromatographie......................................................... 34 2.5.7 Austausch von Detergenz....................................................................... 35
IINNHHAALLTTSSVVEERRZZEEIICCHHNNIISS
2
2.6 Analytische Methoden ............................................................................... 36 2.6.1 Agarosegelelektrophoresen .................................................................... 36 2.6.2 Gelextraktion.......................................................................................... 37 2.6.3 SDS-PAGE............................................................................................. 37 2.6.4 Western Blot .......................................................................................... 39 2.6.5 Dünnschichtchromatographie (DC) ....................................................... 39 2.6.6 Lipidextraktion....................................................................................... 40 2.6.7 Saure Methylierung................................................................................ 41 2.6.8 Gaschromatographie .............................................................................. 42 2.6.9 GC/ MS .................................................................................................. 42 2.6.10 Aggregationstest................................................................................. 43
2.7 Kristallisation von gereinigtem NirC......................................................... 44 2.7.1 Vorgefertigte und kommerziell erhältliche Screens............................... 45 2.7.2 Feinscreen, Additive Screen und Detergent Screen............................... 46 2.7.3 Microseeding.......................................................................................... 46 2.7.4 Kryobedingungen................................................................................... 47 2.7.5 Kristall Annealing .................................................................................. 47 2.7.6 Kristall Dehydrierung ............................................................................ 48 2.7.7 Röntgenbeugungsexperimente ............................................................... 48
2.8 ITC (engl. Isothermal Titration Calorimetry) ............................................ 49
3 ERGEBNISSE .................................................................................................. 50
3.1 PCR-Amplifikation .................................................................................... 50
3.2 Klonierung und Transformation................................................................. 51
3.3 Überexpression in E. coli C43 ................................................................... 53
3.4 Wachstumskurven...................................................................................... 54
3.5 Reinigung von NirC ................................................................................... 55 3.5.1 Zellernte, Aufschluss und Isolierung de Membranen ............................ 55 3.5.2 Solubilisierung mit Detergenz ............................................................... 56 3.5.3 Affinitätschromatographie ..................................................................... 56 3.5.4 Größenausschlußchromatographie......................................................... 59 3.5.5 Bestimmung der Proteinkonzentration................................................... 60
3.6 Quantitative Bestimmung der Zusammensetzung von Detergenzien und Lipiden im Protein-Detergenz-Komplex (PDK).................................................... 61
3.6.1 Bestimmung des Detergenz-Protein-Verhältnisses im PDK.................. 61 3.6.2 Bestimmung der Lipidzusammensetzung im PDK................................ 63
3.7 Aggregationstest......................................................................................... 64
3.8 Austausch von Detergenz........................................................................... 65
3.9 Kristallisation von NirC ............................................................................. 69
3.10 Röntgenbeugungsexperimente ................................................................... 71
3.11 ITC (engl. Isothermal Titration Calorimetry) ............................................ 72
IINNHHAALLTTSSVVEERRZZEEIICCHHNNIISS
3
4 DISKUSSION ................................................................................................... 74
4.1 Solubilisierung und Aufreinigungen von NirC.......................................... 74
4.2 Bestimmung der Detergenz-/Phospholipidzusammensetzung im PDK..... 77
4.3 Kristallisation ............................................................................................. 78
4.4 ITC ............................................................................................................. 80
5 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................. 82
6 LITERATURVERZEICHNIS........................................................................ 83
7 ANHANG.......................................................................................................... 92
7.1 Abkürzungsverzeichnis .............................................................................. 92
7.2 Basensequenz von NirC ............................................................................. 94
7.3 Aminosäuresequenz von NirC ................................................................... 94
EEIINNLLEEIITTUUNNGG
4
1 EINLEITUNG
1.1 Biologische Membran
Alle Lebewesen, sowohl Pro- als auch Eukaryonten, besitzen eine Plasmamembran (Abb.
1.1). Sie trennt das Zytoplasma von der Umgebung ab und hält somit die Zellen von
Gleichgewicht fern, was die Voraussetzung für das Leben ist. Mit einem Wort, die
biologische Membran ist die Grundlage der Entwicklung komplexen biologischen Systems.
1.1.1 Aufbau biologischer Membranen
Biologische Membranen unterscheiden sich je nach ihren Funktionen in ihrer chemischen
Zusammensetzung, ihrer Morphologie und ihren enzymatischen Funktionen sehr stark
voneinander. Jedoch sind sie nach einem gemeinsamen Prinzip aufgebaut:
Lipiddoppelschichten bilden die Permeabilitätsschranke und enthalten Membranproteine,
Abb. 1.1 Biologische Membran. Links: Plasmamembran im Elektronenmikroskop. Rechts: schematische Darstellung einer Plasmamembran (aus dem Internet).
EEIINNLLEEIITTUUNNGG
5
die entweder als Transportsystem, bestehend aus Pumpen und Kanälen, wirken, oder
enzymatische Funktionen übernehmen. Zusätzlich sind noch andere Moleküle wie z.B.
Cholesterin vorhanden, die bestimmte biologische Funktionen haben. Biologische
Membranen sind asymmetrisch, d.h. die verschiedenen Phospho- und Glycolipide sind
stark ungleich verteilt. In der äußeren Schicht überwiegen Phosphatidylcholin,
Sphingomyelin, Cholesterin und Glycolipide. In der inneren Schicht überwiegen
Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol und Phosphatidylethanolamin (Biochemie Stryer,
5. Auflage).
Membranen weisen eine hoch dynamische Struktur auf. Das Flüssigmosaikmodell (Singer
und Nicolson, 1972) beschreibt die biologische Membran folgendermaßen: Membranen
sind zweidimensionale Lösungen gerichteter Lipide und globulärer Proteine. In anderen
Worten, die Lipidkomponente bewegt sich ständig, sowohl durch laterale Diffusion
(spontan, schnell) als auch durch transversale Diffusion (mit Hilfe von Flippase, langsam).
Membranproteine können ebenfalls lateral in der Lipidmatrix diffundieren.
Die Lipidzusammensetzungen einiger Tiere- bzw. Bakterienzellmembranen werden in
Tabelle 1.1 dargestellt.
Tabelle 1.1 Lipidzusammensetzung einiger Tier- bzw. Bakterienzellmembranen. PC: Phosphatidylcholin; PE: Phosphatidylethanolamin; PG: Phosphatidylglycerin; PS: Phosphatidylserin; CL: Cardiolipin; SM: Sphingomyelin.
Lipidzusammensetzung
Membran PC PE PG PI PS CL SM Cholesterin Gangliosid
Myelin (Mensch) 10% 20% - - 8,5% - 8,5% 27% 26%
Erythrozyt (Mensch) 25% 22% - - 10% - 18% 25% -
Mitochondrium 40% 39% - 2% - 17% - in Spuren -
E. coli - 74% 19% - - 3% - - -
Zur den biologisch wichtigsten Eigenschaften der Lipide gehört ihr amphiphiles Verhalten.
Diese Eigenschaft ist im Wesentlichen auf ihren besonderen Aufbau zurückzuführen: alle
Lipide haben einen hydrophilen Kopf, der am häufigsten aus Glycerin oder Sphingosin
besteht, und einen hydrophoben Schwanz aus Fettsäuren. Ein schematischer Aufbau
verschiedener Lipide wird in Abb. 1.2 dargestellt.
EEIINNLLEEIITTUUNNGG
6
Tabelle 1.2 Einige natürlich vorkommende Fettsäuren (Biochemie Stryer, 5. Auflage).
Anzahl der C-Atome
Anzahl der Doppelbindungen
Trivialname systematischer Name
12 0 Laurat n-Dodecanat
14 0 Myristat n-Tetradecanat
16 0 Palmitat n-Hexandecanat
18 0 Stearat n-Octadecanat
20 0 Arachinat n-Eicosanat
22 0 Behenat n-Docosanat
24 0 Lignocerat n-Tetracosanat
16 1 Palmitoleat cis-Δ9-Hexadecenat
18 1 Oleat cis-Δ9-Octadecenat
18 2 Linoleat cis,cis-Δ9-Δ12-Octadecadienat
18 3 Linolenat all-cis-Δ9,Δ12,Δ15-Octadecatrienat
20 4 Arachidonat all-cis-Δ5,Δ8,Δ11,Δ14-Eicosatetraenat
Abb. 1.2 Schematischer Aufbau verschiedener Lipide (http://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/overheads-2/ch11_lipid-struct.jpg).
EEIINNLLEEIITTUUNNGG
7
Fettsäuren in biologischen Systemen besitzen gewöhnlich eine gerade Anzahl von
Kohlenstoffatomen, typischerweise zwischen 14 und 24 (Tabelle 1.2). Dabei kommen
Fettsäuren mit 16 und 18 C-Atome am häufigsten vor. Die Alkylkette kann gesättigt sein
oder eine bzw. mehrere Doppelbindungen enthalten, die meistens eine cis-Konfiguration
haben.
1.1.2 Funktionen biologischer Membranen
Die Lipidkomponenten bilden eine Permeabilitätsbarriere, so dass Membranen für Ionen
und die meisten polaren Moleküle sehr gering durchlässig sind. Ausnahme sind einige
unpolare kleine Moleküle wie z.B. Sauerstoff bzw. Wasser (zwar polar, aber klein, hohe
Konzentration und keine komplette Ladung). Damit wird die Zelle von der Umgebung
getrennt. Dies ist die wichtigste Funktion biologischer Membranen. Die zweite wichtige
Funktion ist die Energiespeicherung, da Fettsäuren hochkonzentrierte Energiespeicher sind.
Weitere Funktionen der Membran werden hauptsächlich mittels Membranproteinen erfüllt,
wie z.B. Transport, Signalübertragung, enzymatische Funktionen. Sie werden im nächsten
Abschnitt (1.2) genauer erläutert.
1.2 Membranproteine
Ein Membranprotein ist ein in die Lipidschicht einer Biomembran eingelagertes oder
dieser aufgelagertes Protein. Gemäß der Analyse von genomischen Sequenzen sind 30 %
der gesamten Proteine bei E. coli Membranproteine.
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1.2.1 Klassifizierung
Membranprotein werden in zwei große Klassen unterteilt: Intergrale Membranproteine und
membranständige Proteine.
Als intergrale Membranproteine werden die Proteine bezeichnet, die die
Lipiddoppelschicht einer Membran durchspannen. Sie werden wiederum in zwei Gruppen
unterschieden. Die erste sind aus α-Helices bestehende Transmembranproteine, zu denen
sowohl die sogenannten „singlepass“ Transmembranproteine (engl. bitopic membrane
proteins) gehören, die die Membran nur einmal durchqueren, wie z.B. T-Zell-Rezeptoren,
als auch die „multipass“ Transmembranproteine (entl. polytopic membrane proteins) wie
z.B. Membrantransporter und Ionenkanäle. Die zweite sind Transmembranproteine, die aus
β-Faltblättern aufgebaut sind. Solche Proteine sind nur in der äußeren Membran Gram-
negativer Bakterien, der Zellwand Gram-positiver Bakterien und äußeren Membran von
Mitochondrien vorhanden und haben eine zylinderförmige Transmembran-β-
Faltblattstruktur, wie z.B. LamB, eine Maltoseporin (Van Gelder et al., 2002).
Als membranständige Proteine (engl. monotopic membrane proteins) werden Proteine
bezeichnet, die zwar in der Membran verankert sind, diese jedoch nicht durchqueren. In
der Abb. 1.3 werden einige verschiedene membranständige Proteine schematisch
dargestellt.
Abb. 1.3 Intergrale Membranproteine. 1: singlepass Transmembranprotein mit einer Transmembranhelix. 2: multipass Transmembranprotein mit mehreren Transmembranhelices. 3: Transmembranprotein aus β-Faltblättern (http://en.wikipedia.org/wiki/Transmembrane_proteins).
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1.2.2 Funktionen von Membranproteinen
Fast alle Membranfunktionen werden
von Membranproteinen vermittelt. Sie
fungieren vor allem als
Membrantransporter bzw. Ionenkanäle,
die bestimmte Moleküle bzw. Ionen
durch die Membran transportieren. Ein
Beispiel ist LacY (Abb. 1.4), ein
Laktosetransporter in E. coli, der zur
MFS (engl. Major Facilitator
Superfamiliy) gehört. Die zweite
wichtige Funktion von
Membranproteinen ist die
Signaltransduktion. In den Membranen
Abb. 1.3 Verschiedene membranständige Proteine. 1: Das Protein wird in der Membran mittels einer α-Helix verankert, die parallel zur Membranebene ist. 2: Das Protein wird in der Membran mittels eines hydrophoben Loops verankert. 3: Das Protein bindet an der Membran mittels kovalenten Wechselwirkungen mit den Lipiden. 4: Das Protein bindet an der Membran durch elektrostatische Wechselwirkungen mit den Lipiden (http://en.wikipedia.org/wiki/Peripheral_membrane_protein).
Abb. 1.4 LacY aus E. coli, ein Laktosetransporter. Die schwarzen Kugeln stellen das Substrathomolge TDG (ß-D-galactopyranosyl-1-thio-ß-D-galactopyranoside) dar (Abramson et al., 2003).
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befinden sich viele Signalrezeptoren, die bestimmte Signalmoleküle wie z.B. Hormone
oder Neurotransmitter spezifisch erkennen und das Signal weiter übertragen. Zum Beispiel
die 7TM-Rezeptoren (die Rezeptoren mit sieben Transmembranhelices) sind für Geruch,
Geschmack, Sehen und viele anderen biologische Funktionen verantwortlich.
1.3 Detergenzien Um mit Membranproteinen arbeiten zu können, d.h. sie zu reinigen, zu kristallisieren und
um enzymatische Tests durchführen zu können, ist es notwendig, sie in Lösung zu bringen.
Bei einigen Proteinen, die über elektrostatische Wechselwirkungen an die Membran
gebunden sind, gelingt dies einfach durch Erhöhung der Salzkonzentration. Der Großteil
der Transmembranproteine erfordert jedoch die Zugabe von Detergenzien, da ihre
Transmembranhelices stark mit der Lipiddoppelschicht hydrophob wechselwirken (Wiener
2004; Caffrey 2003; Garavito et al., 2001).
Detergenzien sind amphiphile Moleküle ähnlich den Lipiden, die einen hydrophoben und
einen hydrophilen Anteil besitzen (Abb. 1.5.A). Deshalb bilden sie wie Lipide in wässriger
Lösung spontan Mizellenstrukturen (Abb. 1.5.B).
HydrophoberSchwanz
HydrophileKopf
A. B.
Abb. 1.5 Detergenz. A: schematische Darstellung eines Detergenzmoleküls. B: schematische Darstellung einer Detergenzmizelle.
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11
1.3.1 Klassifizierung
Je nach der Ladung werden Detergenzien in drei Gruppen eingeteilt: ionische Detergenzien,
nichtionische Detergenzien und zwitterionische Detergenzien (Abb. 1.6, Seddon et al.,
2004).
A. B.
C.
Ionische Detergenzien besitzen eine Kopfgruppe mit einer Nettoladung, die entweder
anionisch oder kationisch sein kann,wie z.B. SDS (engl. sodium dodecylsulfate). Solche
Detergenzien können Membranproteine sehr effektiv solubilisieren, sehr häufig tritt jedoch
dabei eine gleichzeitige (teilweise) Denatuierung auf.
Nichtionische Detergenzien enthalten eine ungeladene hydrophile Kopfgruppe, die
meistens entweder eine Zuckergruppe oder Polyoxyethylen ist. Sie sind meistens milder als
ionische Detergenzien, deshalb können sie viele Membranproteine solubilisieren, ohne
deren Proteinstruktur zu verändern. Das heißt, Membranproteine können mit Hilfe solcher
Detergenzien in biologisch aktiver Form aufgereinigt werden. Als eine Ausnahme sind
nichtionische Detergenzien mit kurzen hydrophoben Ketten (C7-10) wie z.B. OG (engl. n-
octyl-β-D-glucopyranoside), die oft zur Deaktivierung von Membranproteinen führen
Abb. 1.6 Einige typische Detergenzien. A: Ionisch; B: Nichtionisch; C: Zwitterionisch.
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12
(Seddon et al., 2004). DDM (engl. n-dodecyl-β-D-maltoside) ist ein häufig benutztes
nichtionische Detergenz.
Zwitterionische Detergenzien kombinieren die Eigenschaften ionischer und nichtionischer
Detergenzien, da sie zwar Ladungen enthalten, ihre Nettoladung jedoch Null ist. Sie
wirken im Allgemeinen deaktivierender als ionische Detergenzien, jedoch schwächer als
ionische. Normalerweise werden sie bei strukturellen Studien eingesetzt. Zum Beispiel
wurde LDAO (engl. n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide) bei der Kristallisation von
Ammoniumtransporter Amt-1 (Andrade et al., 2005) verwendet.
1.3.2 Wichtige Parameter von Detergenzien
Der wichtigste Parameter von Detergenz ist die CMC (engl. critical micelle concentration).
Sie beschreibt die minimale Konzentration an Detergenz, bei der Mizellen gebildet werden.
Die CMC steigt mit der Länge der Alkylgruppe und umgekehrt. Doppelbindungen und
Verzweigungen der Alkylgruppe bewirken eine Abnahme der CMC. Je länger die
Alkylkette ist und je weniger Doppelbindungen und Verzweigungen vorhanden sind, desto
stärker ist die Wechselwirkung zwischen den Detergenzmolekülen. Außerdem hängt die
CMC noch von vielen äußeren Faktoren ab, wie z.B. pH-Wert, Ionenstärke, Temperatur
und Vorhandensein von Proteinen, Lipiden bzw. anderen Detergenzien (Seddon et al.,
2004).
Der zweite wichtige Parameter, CMT (engl. critical micelle temperature) beschreibt die
Veränderung der Eigenschaften eines Detergenz mit der Temperatur. Bei niedriger
Temperatur liegen Detergenzien hauptsächlich in kristalliner Form vor, die mit gelösten
Detergenzmonomeren im Gleichgewicht steht. Steigt die Temperatur, werden immer mehr
Detergenzmoleküle gelöst, bis die CMC erreicht wird. Die Temperatur an diesem Punkt
wird als CMT bezeichnet. Ist die Temperatur höher als die CMT, wird die detergenzhaltige
Lösung mit Steigung der Temperatur immer trüber, bis die sogenannte Phasenseparation
auftritt: die detergenzreiche Phase und die wässrige Phase. Die Temperatur an diesem
Punkt wird als „cloud point“ bezeichnet (Seddon et al., 2004).
Der letzte wichtige Parameter von Detergenzien ist die Aggregationszahl, die die mittlere
Anzahl an Detergenzmonomeren in einer einzigen Mizelle beschreibt.
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In Tabelle 1.3 werden die in dieser Arbeit verwendeten Detergenzien zusammengefasst.
Tabelle 1.3 Die in dieser Arbeit verwendeten Detergenzien. N: Nichtionische Detergenz; Z: Zwitterionische Detergenz. D9M: n-Nonyl-ß-D-Maltopyranosid; D10M: n-Decyl-ß-D-Maltopyranosid; D11M: n-Undecyl-ß-D-Maltopyranosid; DDM: n-Dodecyl-ß-D-Maltopyranosid; DDPO: Dimethyl-Decylphosphin Oxid; LDAO: n-Dodecyl-N,N-Dimethylamin-N-Oxid (Daten von Anatrace).
1.3.3 Solubilisierung von Membranproteinen mit Detergenzien
Die Fähigkeit von Detergenzien, Membranprotein aus der Lipiddoppelschicht zu
extrahieren, beruht im Wesentlichen auf ihrer Fähigkeit, Lipide zu solubilisieren.
Begleitend zur Entfernung (Solubilisierung) von Lipiden durch Detergenzien werden die
hydrophoben Teile von Membranproteinen ebenfalls durch Detergenzien umschlossen. In
diesem Stadium werden Membranproteine als gelöste (solubilisierte) Form betrachtet (le
Maire et al., 2000). Der Solubilisierungsprozess wird in der Abb. 1.7 dargestellt.
Detergenz Typ MW CMC (w/v) (in Wasser)
Aggregationszahl (in Wasser)
Struktur
D9M N 468,5 0,28 % 55
D10M N 482,6 0,0869 % 69
D11M N 496,6 0,0292 % 71
DDM N 510,6 0,0087 % 78-92
DDPO N 218,3 0,1 % 31
LDAO Z 229,4 0,0344 % 76
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In der ersten Phase liegen Detergetien als Nichtmizellen-Form vor. Einige davon dringen
in die Lipiddoppelschicht ein. Mit Erhöhung der Konzentration an Detergenz werden
immer mehr Lipide durch Detergenzmoleküle ausgetauscht und die Membran wird
dadurch destabilisiert. Dies führt endlich zur Fragmentierung der Membrandoppelschicht.
Ist die Konzentration an Detergenz höher als die CSC (engl. critical solubilization
concentration), werden die großen, wasserunlöslichen Lipiddoppelschichtfragmente zur
sehr kleinen Membranfragmenten abgebaut. Schließlich sind nur gemischte Mizellen
Abb. 1.7 Schematische Darstellung des Solubilisierungsprozesses als eine Funktion der Konzentration an freien Detergenzien. In der Phase a: Detergenzien dringen in die Lipiddoppelschicht ein, aber Lipide überwiegen noch. In der Phase b: oberhalb der Konzentration Csat dringen immer mehr Detergenzmoleküle in die Lipiddoppelschicht ein. Dies führt zur Destabilisierung der Membran und anschließend werden große Membranfragmente, die mit Detergenzien am Rand abgeschlossen werden, gebildet. In der Phase c: oberhalb der CSC (engl. critical solubilization concentration) werden die großen Membranfragmente zur sehr kleinen Membranstücke umgesetzt, die wasserlöslich sind. In der Phase d sind nur gemischte Mizellen (Detergenz-Lipid und Detergenz-Lipid-Protein) vorhanden. Die Membranproteine sind vollständig solubilisiert. (Kragh-Hansen et al., 1993)
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(Detergenz-Lipid und Detergenz-Lipid-Protein) vorhanden und die Membranproteine sind
vollständig solubilisiert.
1.3.4 Delipidierung
Begleitend zur Solubilisierung werden Membranproteine delipidiert. Aber inwiefern sie
delipidiert werden, muss kontrolliert werden.
Einerseits bewirkt eine vollständige Delipidierung häufig die Deaktivierung des Proteins,
da Lipide oft eine wichtige Rolle bei der Interaktion zwischen Proteinuntereinheiten
spielen, die die Voraussetzung für die Funktionen einiger Enzyme wie z.B. Cytrochrom b6f
Komplex sind. Lipide sind auch entscheidend für die richtige Konformation einiger
Membranproteine (le Maire et al., 2000; Esmann et al., 1979; Esmann et al., 1984; Breyton
et al., 1997; Palsdottir et al., 2004).
Andererseits werden die Membranproteine, die erfolgreich kristallisiert werden, meistens
komplett oder fast komplett delipidiert. Als Ausnahme benötigen manche
Membranproteine Lipide für die Kristallisation oder eine bessere Beugungsqualität (Guan
et al., 2005; Deisenhofer et al., 1985; Palsdottir et al., 2004).
Der Delipidierungsgrad wird durch mehrere Faktoren beeinflusst wie z.B. den Typ und die
Menge des verwendeten Detergenz.
1.3.5 Detergenz-Membranprotein-Interaktion und Kristallisation
Drei Bindungsmodelle von Detergenz und Membranprotein werden vorgeschlagen (le
Maire et al., 2000). Das erste ist die mizellenartige Bindung (Abb. 1.8.A), bei der
Membranprotein im Inneren der Mizelle beachtet wird. Das zweite ist die Monoschicht-
Bindung (Abb. 1.8.B), bei der weniger Detergenzmoleküle benötigt werden, da sie den
hydrophoben Teil des Membranproteins als eine Monoschicht umgeben. Dieses Modell
lässt sich noch diskutieren, da die hydrophoben Anteile der Detergenzmoleküle, die am
Ende des Transmembranbereichs des Proteins liegen, der hydrophilen wässrigen
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Umgebung ausgesetzt wären. Dieses Problem wird in dem dritten Modell, der
modifizierten Monoschicht-Bindung (Abb. 1.8.C), korrigiert. Dabei werden nur die
Detergenzmoleküle im mittleren Bereich als Monoschicht angeordnet und die
Detergenzmoleküle an den beiden Enden sind mehr oder weniger parallel zu der
Proteinoberfläche.
Da die Membranproteine mit Detergenzmolekülen umhüllt werden, spielt die
Wechselwirkung zwischen Detergenzmolekülen eine entscheidende Rolle bei der
Kristallisation. Selbst ein winziger chemischer Unterschied im Detergenz kann ein
komplett anderes Kristallisationsverhalten verursachen (Ostermeier et al., 1997).
Allgemein gesagt, die Auswahl von Detergenz ist ein kritische Faktor bei der Arbeit mit
Membranproteinen, der nur durch Versuch und Irrtum bestimmt werden kann.
Abb. 1.8 Bindungsmodelle von Detergenz zum Membranprotein. A: Detergenzmoleküle und Protein werden als eine gemischte Mizelle gepackt. B: Die Detergenzmoleküle bedecken den hydrophoben Bereich des Proteins als Monoschicht. C: Nur die Detergenzmoleküle im mittleren Anteil werden als Monoschicht angeordnet, während die Moleküle an den beiden Enden parallel zur Proteinoberfläche liegen (le Maire et al., 2000).
A. mizellenartig B. Monoschicht C. modifizierte Monoschicht
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17
1.4 Stickstoffkreislauf
Stickstoff ist, neben Sauerstoff, Kohlenstoff und Wasserstoff, eines der vier wichtigsten
Elemente in Leberwesen und gleichzeitig das häufigste Element in der Atmosphäre. Die
Bindung innerhalb des Stickstoffmoleküls ist chemisch sehr stabil und besitzt eine
Dissoziationsenergie von 940 kJ/Mol N2 im Vergleich zu 493 kJ/Mol O2 der O2-
Doppelbindung. Daher ist nur eine relativ kleine Anzahl von Mikroorganismen in der Lage,
Stickstoff direkt zu verwerten. Andererseits besitzt Stickstoff sechs verschiedene
Oxidationsstufen, die eine Energiegewinnung bzw. Elektronenlieferung ermöglichen.
Zusätzlich ist Distickstoff die einzige N-Quelle für Aminosäuren, Nukleinsäuren und
zahlreiche andere Verbindungen, die für Organismen essentiell sind. Die in der Natur
vorhandenen Umsetzungen verschiedener Oxidationsstufe von Stickstoff werden im
Stickstoffkreislauf zusammengefasst (Abb. 1.9).
Abb. 1.9 Der Stickstoffkreislauf. Der Kreislauf wird in fünf Bereiche (1-5) gegliedert (Einsle et al. 2004).
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18
Der Stickstoffkreislauf wird in einzelne Bereiche gegliedert: Stickstofffixierung,
Nitrifikation, Denitrifikation, Nitratammonifikation und Anammox (anaerobe
Ammoniumoxidation).
Stickstofffixierung: Aufgrund der chemischen Stabilität sind nur einige spezielle
Prokaryoten in der Lage, Stickstoff zu reduzieren. Diese Bakterien können in zwei Klassen
eingeteilt werden: freilebende stickstofffixierende Bakterien wie z.B. Cyanobakterien und
symbiotische stickstofffixierende Bakterien wie z.B. Rhizobium. Der Fixierungsprozess
wird durch die Nitrogenase unter Verbrauch von ATP katalysiert. Die Nitrogenase besteht
aus zwei Untereinheiten, eine mit einem 4Fe-4S-Cluster und Bindungsstellen für
Mg2+/ATP (Fe-Protein), die andere mit einem α2ß2-Tetramer aus zwei P-Clustern und zwei
M-Clustern. Die Fixierung findet am M-Cluster statt, der in drei Varianten auftritt: Fe/Mo-
Cluster, Fe/V-Cluster und Fe/Fe-Cluster (Einsle et al., 2002; Tsai et al., 1995; Rees et al.,
2000). Neben der mikrobiologischen Fixierung kann Stickstoff auch durch das Haber-
Bosch-Verfahren industriell reduziert werden.
Nitrifikation: Bei der Nitrifikation werden Ammoniak bzw. Nitrit als Elektronendonoren
verwendet, die schrittweise zu Nitrat oxidiert werden. Ammoniak (oder Ammonium) wird,
zuerst katalysiert durch die Ammonium-Monooxygenase, zu Hydroxylamin umgesetzt, das
anschließend durch die Hydoxylamin-Oxidoreduktase zu Nitrit oxidiert wird. Schließlich
wird Nitrit mit Hilfe der Nitritoxidase zu Nitrat oxidiert. Nitrosomonas (ein
Ammoniakoxidierer) und Nitrobacter (ein Nitritoxidierer) sind typische nitrifizierende
Bakterien (King 1966).
Denitrifikation: Im Gegensatz zur Nitrifikation wird als Denitrifikation die schrittweise
Umwandlung von Nitrat zu Stickstoff bezeichnet. Dieser Vorgang ist der Hauptweg, auf
dem gasförmiger Stickstoff biologisch gebildet wird. Ein alternativer Weg hierfür ist
Anammox. Im ersten Schritt wird Nitrat durch die Nitrat-Reduktase in Nitrit umgesetzt,
das wiederum mit Hilfe der Nitrit-Reduktase zu Stickstoffmonoxid reduziert wird.
Distickstoffoxid (Lachgas) entsteht dann durch Reduktion von NO durch die
Stickstoffmonoxid-Reduktase. Schließlich wird es unter der Wirkung der Distickstoffoxid-
Reduktase zu freiem Stickstoff umgesetzt. Denitrifizierende Bakterien wie z.B.
Pseudomonas können bei diesem Prozess Energie gewinnen. Daher wird Denitrifikation
auch als Nitratatmung bezeichnet (Ferguson 1994).
Nitratammonifikation: Die Nitratammonifikation ist eine Variante der Nitratatmung. Nitrat
wirkt dabei auch als Elektronenakzeptor und wird zu Nitrit reduziert, ohne dass Stickstoff
gebildet wird. Die assimilatorische Reduktion von Nitrit zu Ammonium liefert keine
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19
nutzbare Energie für Bakterien, vielmehr handelt es sich um einen Gärungsprozess, bei
dem Nitrit als exogener Elektronenakzeptor fungiert. Die Organismen ziehen aus der
Nitritreduktion letztlich doch einen Vorteil, indem sie während der Vergärung einen Teil
der Reduktionsäquivalente wieder gewinnen. Viele fakultativ anaerobe Bakterien
vermögen diesen Prozess durchzuführen, ein Beilspiel hierfür ist Enterobacter aerogenes
(Ward 1996).
Anammox: Anammox ist die Abkürzung für die anaerobe Ammoniakoxidation, ein
Prozess mit großer Bedeutung für die Abwasserreinigung, da die beiden
umweltschädigenden chemischen Verbindungen Nitrit und Ammoniak unter anaeroben
Bedingungen zu Stickstoff umgewandelt werden. Bakterien wie. z.B. Brocadia
anammoxidans sind für diese Prozesse verantwortlich. Das Schlüsselenzym der Reaktion
ist Hydroxylaminoxidoreduktase (Jetten et al., 1998).
1.5 Bedeutung von Nitrat und Nitrit
Es ist sehr eindeutig, dass Nitrat und Nitrit eine zentrale Bedeutung im Stickstoffkreislauf
haben. Sie spielen sowohl beim assimilatorischen als auch bei dem dissimilatorischen
Stickstoffmetabolismus eine wichtige Rolle. Beim dissimilatorischen Stoffwechsel
(Denitrifikation) dient Nitrat (Nitrit) als Elektronenakzeptor und Energie wird gewonnen.
Beim assimilatorischen Stoffwechsel (Nitratammonifikation) wirkt Nitrat (Nitrit) ebenfalls
als Elektronenakzeptor und obwohl dabei keine Energiegewinnung ermöglicht wird, ist das
Endprodukt Ammoniak eine bedeutende Stickstoffquelle für die Aminosäure- und
Nukleinsäurebiosynthese.
EEIINNLLEEIITTUUNNGG
20
1.6 Das Nitratreduktasesystem in E. coli
Unter verschiedenen Wachstumbedingungen exprimiert E. coli drei unterschiedliche
Nitratreduktasen (Abb. 1.12).
Die erste ist die Nitratreduktase A (NRA, Abb. 10), die durch das Operon narGHJI codiert
wird. Dieses wird durch den Transkriptionsfactor FNR während anaeroben Wachstums
induziert und ermöglicht so die Verwendung von Nitrat als alternativem
Elektronenakzeptor. Die Synthese der Nitratreduktase A wird zusätzlich stark durch hohe
Konzentration von Nitrat induziert. Die zweite Reduktase ist die Nitratreduktase Z (NRZ),
codiert durch das Operon narZYWV. Sie wird unter verschiedenen Stressbedingungen wie
z.B. Nahrungsmangel oder bei saurem pH-Wert exprimiert und ermöglicht den
Abb. 1.10 Struktur der Nitratreduktase A (NRA) aus E. coli. a: Die Struktur vom NarGHI-Komplex mit zwei gebundenen Phospholipiden. b: Redoxkofaktoren von NarGHI mit der gleichen Orientierung wie in a. (Bertero et al., 2003)
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21
Mikroorganismen, mit Nitrat zu überleben. Die dritte Reduktase ist die periplasmatische
Nap, die durch das Operon napFDAGHBC codiert wird und nur während anaeroben
Wachstums exprimiert wird. Die Synthese von Nap wird durch eine niedrige
Konzentration an Nitrat optimal und durch Nitrit schwach induziert. Aufgrund ihrer hohen
Affinität zur Nitrat ist Nap bei niedriger Konzentration an Nitrat physiologisch wichtiger
als die NRA. Im Gegensatz zu den Nitratreduktase A und Z, die membrangebunden sind
und an der Cytoplasmaseite liegen, ist Nap im Periplasma lokalisiert (Jia et al., 2004;
Clegg et al., 2002).
1.7 Das Nitritreduktasesystem in E. coli
Die Reduktion von Nitrat führt zur Produktion großer Mengen Nitrit, welches sehr toxisch
für Mikroorganismen ist. Daher muss Nitrit entweder ausgestoßen oder zu unschädlichen
Produkten reduziert werden. Zu disem Zweck exprimiert E. coli zwei Nitritreduktasen
(Abb. 1.12): die cytoplasmatische NADH-abhängige Nitritreduktase Nir und die
periplasmatische formiat-abhängige Nitrit Reduktase Nrf, die das Nitrat zu Ammoniak
reduzieren.
Abb. 1.11 Struktur von Cytochrom c Nitrit Reduktase aus Wolinella succinogenes. A: Die Dimerstruktur von NrfA. B: Die Anordnung der fünf Hämgruppen. (Einsle et al. 2000)
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22
Nir wird durch das Operon nirBDECcysG codiert, wobei nirB und nirD für die beiden
Untereinheiten des Enzyms codieren. Das Gen cysG wird für die Synthese einer als
Sirohäm bezeichnete Häm-Gruppe, die als Bindungsstelle für Nitrit in der Nitritreduktase
fungiert, benötigt. In Übereinstimmung mit ihrer Funktion in der Nitritreduktion bei
anaerobem Wachstum auf Nirtit, wird der nirB Promoter koordiniert mit dem narG
Promoter reguliert. Nir ist in der Lage, unter Verwendung von NADH als Elektronendonor,
das Nitrit sofort nach der Entstehung zu Ammoniak zu reduzieren. Bei diesem Prozess
wird keine Energie konserviert.
Nrf, die durch das Operon nrfABCDEFG (Abb. 1.11) codiert wird, ist ebenfalls in der Lage,
das Nitrit im Periplasma zu Ammoniak zu reduzieren. NrfA und NrfB sind beides
Pentahäm c-Typ Cytochrome, während NrfC ein nicht-Häm Fe-S Protein und NrfD eine
membrangebundene Chinoldehydrogenase sind. Die anderen drei Proteine NrfE, NrfF und
NrfG sind für die Reduktaseaktivität notwendig. Bei der Reduktion werden Elektronen von
NrfD über NrfC und NrfB auf NrfA und schließlich zum Nitrit übertragen. Energie wird in
diesem Prozess durch Elektronentransport mittels einer membrangebundenen
Elektronentransportkette konserviert (Clegg et al., 2002; Jia et al., 2004; Wang et al., 2000).
1.8 Transport von Nitrat und Nitrit in E. coli
Da sich zwei der drei Nitratreduktasen (NRA und NRZ) im Cytoplasma befinden, kann
Nitrat nur reduziert werden, wenn es durch die Cytoplasmamembran in die Zelle
transportiert wird. Die Cytoplasmamembran ist aber im Inneren relativ zur Außenseite
negativ geladen, während Nitrat bei physiologischem pH-Wert (ca. 7.4) vollständig
deprotoniert ist. Es muss daher ein spezieller Mechanismus vorhanden sein, der das negativ
geladene Ion gegen die Membranbarriere transportieren kann. Während anaeroben
Nitratwachstums werden Nitritionen im Cytoplasma akkumuliert, die toxisch auf die Zelle
wirken. Sie müssen entweder nach außen transportiert oder zu Ammoniak reduziert werden.
E. coli exprimiert drei Membrantransporter, NarK, NarU und NirC (Abb. 1.12), die die
oben genannten Probleme lösen.
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23
NapA
NapB
NapG
NapC
NapH NapFNarI/V
NarG/Z
NarH/Y
NrfA
NrfB
NirBNirD
NarK / NarU NirC
NrfC NrfD
NO3-
NO2-
NO2-
NH4+
NO2-
NH4+
NO2-
NO3- H+
NO3-
NO2-
Periplasm
Cytoplasm
Membrane AmtB
NarK ist ein Membranprotein mit 12 Transmembranhelices und spielt eine Rolle bei das
Aufnahme von Nitrat und Nitrit bzw. der Extrusion von Nitrit (Clegg et al., 2002; Jia et al.,
2004).
NarU ist homolog zu NarK und weist eine 75 %ige Identität in der Aminosäuresequenz auf.
Die physiologische Funktion ist ebenfalls ähnlich zu NarK, Jedoch ist die Expression von
NarK sowohl in der exponentiellen als auch stationären Phase deutlich stärker als bei NarU
(Jia et al., 2004; Clegg et al., 2006).
NirC wird als ein Nitrit/Proton Symporter vorgeschlagen (Clegg. et al., 2002) und ist in der
Lage, Nitrit aus dem Periplasma in die Zelle zu transportieren. Desweiteren wird über eine
mögliche Interaktion zwischen NirC und der cytoplasmatischen Nitritreduktase Nir
diskutiert, da die Geschwindigkeit der Aufnahme bzw. Reduktion von Nitrit in dem E. coli
Stamm, in dem nur NirC exprimiert wird (NarK-NarU-NirC+), sehr ähnlich ist (Clegg et al.,
2002; Jia et al., 2004).
Abb. 1.12 Nitrat-/ Nitritreduktasesystem und Nitrat-/ Nitrittransporter System in E. coli. Es werden drei Nitratreduktasen exprimiert: zwei membrangebundene Nitratreduktasen (NarA und NarZ) und eine periplasmatische Nitratreduktase (Nap). Zwei Nitritreduktasen werden ebenfalls von E. coli synthetisiert: die cytoplasmatische Nitritreduktase Nir und die periplasmatische Nitritreduktase Nrf. Das Nitrat-/ Nitrittransportsystem von E. coli besteht aus drei Membranproteinen: NarK, NarU und NirC. NarK und NarU fungieren hautsächlich als Nitrat/ Nitrit-Antiporter und NirC ist ein Nitrit/Protonen-Symporter. AmtB ist ein Ammoniumtransporter.
EEIINNLLEEIITTUUNNGG
24
1.9 Daten von NirC aus E. coli
Anders als NarK und NarU, die zur MFS gehört, ist NirC ein Mitglied der FNT-Familie
(Formiat/Nitrat-Transporter). NirC wird durch das dritte Gen des nir Operons codiert und
ist ein integrales Membranprotein mit 6 Transmembranhelices, bestehend aus 268
Aminosäuren und mit einer theoretischen Größe von 28562,52 Da (ExPASy).
Abb. 1.13 Organisation des Operons nirBDEC (aus NCBI).
EEIINNLLEEIITTUUNNGG
25
1.10 Aufgabenstellung und Zielsetzung
Ziel dieser Arbeit war vor allem Expression und Aufreinigung des Nitrittransporters NirC
aus E. coli. Das gereinigte NirC sollte kristallisiert werden. Die Kristalle sollten zur
Aufklärung der Struktur über Röntgenbeugungsexperimente genutzt werden. Für
biochemische Charakterisierung sollten ITC-Experiment durchgeführt werden und somit
die Bindungsparameter (ΔH, ΔG, ΔS und n) von NirC mit Ihrem Substrat Nitrit ermittelt
werden.
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
26
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Primer-Design
Um die Sequenz von NirC durch PCR (Polymerasekettenreaktion) amplifizieren zu können,
wurden Primer erstellt (MWG-Biotech, Ebersberg). Die Primer wurden für den Vektor
pET-21a(+) (Merck Biosciences, Nottingham, UK) erstellt und enthielten Schnittstellen für
das 5’-Restriktionsenzym NdeI und das 3’-Restriktionsenzym XhoI bzw. EcoRI, wodurch
die Nutzung des His-Tags im Vektors pET-21a(+) möglich wurde (Lichty et al., 2005).
nirC_NdeI
5'- CAT ATG TTT ACA GAC ACT ATT AAT AAG TGT GCG GCT AAC GC -
3'
nirC_XhoI
5’- T CTC GAG ACC GGC AGC CGT TTC AGT TTG ATT -3’
nirC_EcoRI
5’- T GAA TTC CC GGC AGC CGT TTC AGT TTG ATT -3’
2.2 PCR-Amplifikation
Die Polymerasekettenreaktion (Mullis et al., 1986) zur exponentiellen Amplifikation des
linearen nirC-Fragments wurde mit oben beschriebenen Primern durchgeführt (Tab. 2.1
und 2.2). Die Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese überprüft. In dieser Arbeit
Abb. 2.1 Primer für die Amplifikation von nirC.
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
27
wurde der Thermocycler Whatman BIOMETRA Tpersonal zur PCR-Amplifikation
verwendet.
Tabelle 2.1 PCR-Reaktionsansatz.
Vol.
5' - Primer (100 µmol) 1 µl
3' - Primer (100 µmol) 1 µl
5X Phusion Puffer (New England BioLabs) 2 µl
Phusion DNA Polymerase (New England BioLabs) 2 units/μl 0,5 µl
dNTPs (10 mM) 1 µl
DMSO (100 %) 0,5 µl
H2O 4 µl
Tabelle 2.2 Thermocycleprogramm
Temp. (°C) Dauer (sek.)
98 180
60 120
72 180
98 30
59 30 2x
72 40
98 30
56 30 25x
72 40
72 600
8 Pause
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28
2.3 Klonierung und Transformation
Die Reinigung des PCR-Produkts erfolgte durch das QIAquick PCR Purification-Kit
(Qiagen, Hilden) gemäß dem vorgegebenen Standardprotokoll.
Die blunt-end PCR Produkte wurden zuerst in dem Vektor pPCR-Script Amp SK(+)
(Stratagene, La Jolla, USA) ligiert, weil die direkte Ligation des Inserts im pET-21a(+)
nicht funktioniert hat. Der Ansatz nach folgendem Protokoll wurde für 1 h bei
Raumtemperatur inkubiert und die Hitzeinaktivierung der T4 DNA Ligase erfolgte danach
durch zehnminütige Inkubation der Ansätze bei 65°C.
Tabelle 2.3 Ligationsansatz von PCR-Produkt mit dem pPCR-Script Amp SK(+) cloning Vektor.
Vol.
pPCR-Script Amp SK(+) cloning Vektor 1 μl
PCR-Script 10X Reaktionspuffer 1 μl
10 mM rATP 0,5 μl
geschnittenes Insert 4 μl
SrfI Restriktionsenzym 1 μl
T4 Ligase 1 μl
Wasser 1,5 μl
Das ligierte Plasmid pPCR-Script Amp SK(+)::nirC wurde in E. coli XL10(gold)
transformiert und auf XGal-IPTG-LB-Agarplatten ausgestrichen. Daraufhin erfolgte die
Selektion auf erfolgreich transformierte Zellen durch Zugabe der Antibiotika Kanamycin
(Kan) und Ampicillin (Amp) in das Agarplattenmedium, da Zellen, die mit dem
Plasmidkonstrukt erfolgreich transformiert wurden, einer positiven Selektion durch eine
genomcodierte Kan-, sowie plasmidcodierte Amp-Resistenz unterlagen. Darüber hinaus
wurden die Zellen durch eine Weiss-Blau-Färbe-Methode selektiert: Der Vektor pPCR-
Script Amp SK(+) codiert β-Galactosidase und in der Methode wird X-Gal (5-bromo-4-
chloro-3-indolyl-β-Dgalactopyronoside) als Substrat genutzt. Durch den gleichen
Mechanismus kann X-Gal wie auch Lactose durch die β-Galactosidase zu zwei Molekülen
gespalten werden, eines dieser Spaltprodukte wird durch Sauerstoff zu 5,5’-Dibrom-4,4’-
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29
Dichlorindigo (blau) oxidiert. Deshalb können nur Zellen, die mit dem Plasmidkonstrukt
erfolgreich transformiert wurden, sich nicht färben, da das die ß-Galactosidase codierende
Gen durch das Insert kaputt gemacht wird.
Die positiven Kolonien wurden aufgenommen und in LB-Medium (5 ml) über Nacht bei
30 °C und unter ständigem Schütteln inkubiert.
Standard-Transformationsprotokoll
- 1µl Plasmidlösung zu 100 µl kompetenten Zellen des gewünschten Typs
- 30 min auf Eis inkubieren
- 10 min bei 37°C inkubieren (Hitzeschock)
- 10 min auf Eis inkubieren
- 200 µl LB-Medium zufügen
- 60 min bei 37°C und 300 rpm (Resistenzbildung)
- Plattierung bzw. Flüssigkultur
Der korrekte Einbau des nirC-Fragments wurde durch Agarosegelelektrophorese auf
gereinigte Plasmide überprüft, wobei zur Plasmidreinigung das Machery–Nagel Kit
NucleoSpinPlasmid verwendet wurde.
Das positive Plasmid pPCR-Script Amp SK(+)::nirC und der Vektor pET-21a(+) wurden
mit den Restriktionsenzymen NdeI/ XhoI bzw. NdeI/ EcoRI für zwei Stunden bei 37°C
verdaut. Die Hitzeinaktivierung der Enzyme erfolgte danach durch zehnminütige
Inkubation der Ansätze bei 65°C.
Tabelle 2.4 Restriktionsverdausansätze von Amp SK(+)::nirC und Vektor pET-21a(+).
Insert Vol. Vektor Vol.
NdeI 1 μl NdeI 1 μl
XhoI od. EcoRI 1 μl XhoI od. EcoRI 1 μl
Buffer O 1,5 μl Buffer O 1 μl
pPCR-Script Amp SK(+)::nirC 11,5 μl pET-21a(+) 7 μl
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30
Um die Religierung des geschnittenen Vektors zu vermeiden, wurden die 5’-Enden des
linearisierten pET-21a(+) durch Calf Intestine Alkaline Phosphatase (CIAP)
dephosphoryliert. Der linearisierte Vektor wurde mit CIAP für 30 min bei 37 °C inkubiert.
Die Reaktion wurde durch fünfzehnminütige Inkubation bei 85 °C gestoppt.
Tabelle 2.5 Dephosphorylierungsansatz des geschnittenen Vektor pET-21a(+).
Vol.
Plasmid 10 μl
10X Reaktionspuffer 2 μl
Calf Intestine Alkaline Phosphatase 0,5 μl
Wasser 7,5 μl
Die dadurch entstandene nirC Fragmente und der dephosphorylierte pET-21a(+) wurden
auf Aagarosegel aufgetragen und anschließend durch Gel-Extraktion aufgereinigt. Danach
wurden sie zusammen ligiert. Die Ansätze wurden über Nacht bei Raumtemperatur
inkubiert.
Tabelle 2.6 Ligationsansatz.
Vol.
T4 Ligase Puffer 1 μl
T4 Ligase 1 μl
Vektor pET-21a(+) 2 μl
Insert nirC 6 μl
Die Ligationsprodukte wurden in E. coli XL10(gold) transformiert und dann auf LB-
Agarplatten ausgestrichen. Die Selektion erfolgte durch Zugabe der Antibiotika Ampicillin
in das Agarplatten bzw. die Flüssigkulturen. Die Flüssigkulturen (5 ml) vereinzelter Zellen
wurden über Nacht bei 30 °C inkubiert.
Nach der Aufreinigung wurde das Plasmid durch ein Agarosegel überprüft. Anschließend
wurde eine DNA-Sequenzierung zur Überprüfung der Basensequenz des
Plasmidkonstrukts eingesetzt.
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31
2.4 Überexpression in E. coli
Um die Überproduktion einer großen Menge NirC zu erreichen, wurde pET21a-(+):nirC in
E. coli C43(DE3) transformiert. E. coli C43(DE3) ist eine Doppelmutante von E. coli
BL21(DE3). Die beiden Mutationspositionen sind noch unbekannt, aber sie beeinflussen
entweder die Aktivität oder die Menge der T7 RNA Polymerase. Beide Effekte verhindern
die Abkopplung von Transkription und Translation (Miroux and Walker, 1996; Terp 2006;
Arechaga 2000; Dumon-Seignovert et al., 2004).
Der 200 µl Transformationsansatz wurde in 100 ml LB-Medium gegeben und bei 30 °C
und ständigem Schütteln über Nacht inkubiert. Zur Gewinnung großer Proteinmengen
wurde Autoinduktionsmedium verwendet: 400 ml Autoinduktionsmedium wurde
zusammen mit 10 ml Vorkultur in einem 2 L Kolben für 22 – 24 Stunden bei 18 °C und
ständigem Schütteln inkubiert (Studier 2005; Eshaghi et al., 2005; Wang et al., 2002).
2.5 Reinigung von NirC
Ein effektiver Ansatz zur Reinigung eines Proteins besteht in der Nutzung von spezifischen
Polypeptidfusionen, die dem eigentlichen Proteinfragment weitere Aminosäuren
hinzufügen und so ein zur Reinigung verwendbares chemisches Charakteristikum zur
Verfügung stellen. Diese Affinitäts-Marker werden am Anfang (N-terminal) oder am Ende
(C-terminal) an das Proteinfragment angefügt.
Für die Reinigung von NirC wurde ein C-terminales 6-His-Tag-Fusionspeptid gewählt, so
dass NirC mit zwei Chromatographieverfahren aufgereinigt wurde:
Affinitätschromotographie und Gelfiltration.
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32
Überexpression in E. coli C43
Zellernte
Zellaufschluss
Isolierung der Membranen
Solubilisierung mit Detergenz
Affinitätschromatographie
Gelfiltration
(Detergenzaustausch)
2.5.1 Zellernte
Die Zellen wurden durch Zentrifugation (4.000 g, 15 min, 4°C, Avanti J-20XP Series
High-Performance Centrifuge (Beckman Coulter, Harbor Boulevard, USA)) in 1l-Bechern
sedimentiert. Das Zellpellet wurde dann in steril filtriertem Aufschlusspuffer (50 mM
HEPES pH 8.0, 500 mM NaCl, 10 % Glycerol) resuspendiert: 1g Pellet ~ 2 ml Puffer.
2.5.2 Zellaufschluss
Zur Isolierung der Membranfraktion wurden die Zellen mittels Microfluidizer
(Microfluidics European Headquarters, Lampertheim) aufgeschlossen. Bei dieser Methode
ermöglichen grossen Scherkräfte, die beim Aufeinandertreffen zweier Flüssigkeitsstrahlen
Abb. 2.2 Methodenschema. Aufreinigung von NirC.
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
33
unter hohem Druck auftreten, einen effizienten Aufschluss der Zellen. Die Zelllyse mittels
Microfluidizer wurde bei einem Druck von ca. 80 psi durchgeführt und 5-7mal wiederholt.
2.5.3 Isolierung der Membranen
Um unlösliche Zelltrümmer aus dem Zellaufschluss zu entfernen, wurde die Suspension
bei einer Geschwindigkeit von 20.000 g zentrifugiert (30 min, 4 °C, Avanti J-30I High-
Performance Centrifuge (Beckman Coulter Harbor Boulevard, USA)) und das Pellet
verworfen. Der Überstand wurde noch einmal durch eine Ultrazentrifugation (100.000 g, 3
Stunden, 4 °C, Avanti J-30I High-Performance Centrifuge (Beckman Coulter Harbor
Boulevard, USA)) zentrifugiert, so dass die unlösliche Membranfraktion sedimentierte.
Nach Entfernung des Überstands wurde das Pellet (Membran) gewogen und anschließend
mit Aufschlusspuffer resuspendiert: 1g Membran ~ 10 ml Puffer.
2.5.4 Solubilisierung mit Detergenz
Um die Membranproteine zu reinigen sowie weiter verarbeiten zu können, müssen sie
zuerst „in Lösung“ gebracht werden. Dies wird durch Zugabe von Detergenz erreicht.
Detergenzien sind chemische Verbindungen, die ein polares Ende und ein unpolares Ende
besitzen. Sie können Membranprotein aus Membranen herauslösen und einen so genannten
Detergenz-Protein-Komplex bilden. Dieser ist wasserlöslich. Es gibt zwei wichtige
Parameter für Detergenzien: CMC (kritische mizelläre Konzentration) und die
Aggregationsnummer. Als kritische mizelläre Konzentration bezeichnet man die
Grenzkonzentration, bei der Detergenzien Mizellen bilden. Die Aggregationsnummer ist
die mittlere Anzahl an Detergenzmolekülen in einer Mizelle.
NirC wurde mit LDAO (n-Dodecyl-N,N-dimethylamin-N-Oxide) solubilisiert: 10 ml 10 %
LDAO-Lösung (in dem selben Puffer wie die Membranen) wurde tropfenweise unter
ständigem Rühren zu der Membransuspension (40 ml) titriert. Die Lösung wurde dann
weiter für weitere 30 Minuten gerührt. Die unlöslichen Fette und Lipide wurden durch eine
Zentrifugation (100.000 g, 45 Minuten, 4°C) sedimentiert. Der Überstand, der Detergenz-
Protein-Komplexe enthielt, wurde zur weiteren Aufreinigung benutzt.
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34
2.5.5 His-Tag Affinitätschromatographie
Da NirC zusammen mit 6 C-terminalen Histidinen exprimiert wurde und die Imidazolringe
von Histidin Nickelionen chelatieren, wurde NirC durch Affinitätschromatographie mit
einer His-Trap Säule als erstem Reinigungsschritt aufgereinigt. Der Säulenlauf selbst
wurde mit Hilfe eines Äktaprime-Chromatographiesystems (GE Healthcare, München)
kotrolliert. Die Verlaufsdiagramme der Reinigung wurden mit dem Programm PrimeView
erstellt. Die verwendeten Puffer wurden entgast und sterilfiltriert. Die HisTrap Säule
wurde zuerst mit 5 Volumina ddH2O gewaschen. Eine Äquilibrierung erfolgte mit
mehreren Volumina Puffer A (50 mM HEPES pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, 0,1
% LDAO). Anschließend wurde die Proteinfraktion über einen 50 ml Superloop auf die
Säule geladen. Um die Spezifität der His-Tag-Bindung zu gewährleisten, wurden 30 mM
Imidazol vor Ladung zu der Proteinfraktion zugegeben. Verunreinigungen wurden durch
schrittweises Erhöhen der Konzentration an Imidazol (bis zu 150 mM) im Puffersystem
entfernt. Danach wurde NirC durch einen Konzentrationsgradienten von Imidazol (150
mM zu 300 mM über 40 ml) eluiert. Die Proteinfraktionen wurden mittels SDS-PAGE auf
ihre Zusammensetzung analysiert. Die Fraktionen mit NirC wurden gesammelt. Zur
weiteren Verwendung für die Gelfiltration wurde die Proteinlösung mittels einer
Ultrazentrifugationsmembran mit einer Ausschlussgröße von 50 kDa und Zentrifugation
(3000 g, 4 °C) auf ein Volumen von ca. 1 ml ankonzentriert.
2.5.6 Größenausschlußchromatographie
Das Protein NirC war nach der His-Tag-Reinigung schon sehr sauber. Um die
verschiedenen Polymerformen zu trennen, wurden sie auf eine Gelfiltrationssäule
aufgetragen. Das Prinzip der Gelfiltrationschromatographie ist die Separation von
Molekülen unterschiedlicher molekularer Größe. Abhängig von der Porengröße wird
Molekülen bis zu einem bestimmten Stokes-Radius das Eindringen in den Innenraum
spezieller Gelkugeln erlaubt. Die Häufigkeit eines solchen Ereignisses ist umgekehrt
proportional zur molaren Größe der über die Säule gepumpten Teilchen. Deshalb besitzen
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
35
Proteine höherer molekularer Größe eine geringere Retentionszeit als Proteine niedrigerer
Größe. Damit können die Proteine nach ihren Größen getrennt werden.
Zur Reinigung von NirC wurde eine Superdex 200 Gelfiltrationssäule verwendet. Die
Säule wurde mit drei Säulenvolumen Wasser und anschließend mit drei Säulenvolumen
Aufreinigungspuffer (50 mM HEPES pH 8, 200 mM NaCl, 10 % Glycerol, und
entsprechende Detergenz) äquilibriert. 1 ml ankonzentrierte Proteinprobe wurde auf die
Säule bei einer Flussrate von 1 ml/min aufgetragen. Der Durchlauf der Säule wurde
fraktioniert und durch SDS-PAGE analysiert. Fraktionen, die NirC enthielten, wurden
mittels einer Ultrazentrifugationsmembran mit einer Ausschlussgröße von 50 kDa und
Zentrifugation (3000 g, 4 °C) ankonzentriert. Die Proteinkonzentration wurde mit dem
colorimetrischen BCA-Test bestimmt.
2.5.7 Austausch von Detergenz
Das mit einem Detergenz aufreinigte Protein wurde erneut auf eine 1 ml HisTrap FF Säule
geladen. Anschließend wurde die Säule mit ca. 30 ml Puffer, welcher das zweite Detergenz
enthielt, gewaschen. Am Ende wurde das Protein mit Elutionspuffer eluiert.
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36
2.6 Analytische Methoden
2.6.1 Agarosegelelektrophoresen
Die Agarosegelelektrophorese ist eine Methode, um Nukleinsäure-Fragemente (RNA oder
DNA) nach ihrer Größe zu trennen und diese durch Vergleich mit Markern bekannter
Größe (GeneRuler DNA Ladder Mix, Fermentas, St. Leon-Rot) zu bestimmen. Lange
Fäden aus Agarosepolymeren werden zu einem Gel vernetzt. Je höher die Agarose
konzentriert ist, desto kleiner sind die Poren, die sich in dem Gel befinden. Die
Gelelektrophorese funktioniert wie ein Sieb für Moleküle. Ein elektrisches Feld wird
verwendet, um die negativ geladenen Nukleinsäure-Moleküle durch die Gelmatrix zu
ziehen, wobei die kleineren Fragmente sich schneller durch das Gel bewegen können und
somit eine Auftrennung der Stränge nach ihrer Größe ermöglicht wird.
Zur Fertigung des Gels wurde TAE-Puffer (Tris-Acetat-EDTA) mit 1 % Agarose (w/v)
versetzt, aufgekocht und polymerisiert. Die DNA-Proben wurden zusammen mit
Ladepuffer in die Gelmatrix aufgetragen. Das Auftrennen wurde mit einer Spannung von
60 V in TAE-Puffer erreicht. Nach dem Lauf wurde das Gel für 15 min in Ethidiumbromid
(5 mg/ml in Wasser) unter ständigem Schütteln inkubiert. Da sich Ethidiumbromid in die
DNA einlagert und im UV-Licht fluoreszieren kann, sind die DNA-Moleküle unter einer
UV-Lampe (Gel Doc EQ System, BIORAD, Müchen) sichtbar.
Tabelle 2.7 Zusammensetzung von TAE-Puffer.
TAE-Puffer Vol.
Tris 40 mM
Borsäure 20 mM
EDTA 1 mM
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37
Tabelle 2.8 Zusammensetzung von Fermentas 6x Ladepuffer für Agarosegelelektrophores.
Fermentas 6x Ladepuffer Vol.
Tris-HCl (pH 7,6) 10 mM
Bromphenolblau 0,03 %
Xylen cyanol FF 0,03 %
Glycerol 60 %
EDTA 60 mM
Tabelle 2.9 Probe für Auftragung.
Probe für Gelauftrag Vol.
Probe 3 µl
Fermentas 6x Ladepuffer 1 µl
ddH2O 2 µl
2.6.2 Gelextraktion
Gelextraktion ist eine sehr effiziente Methode zur Reinigung von DNA-Fragmenten und
Plasmid-DNA aus Agarosegelen. Nach dem Agarosegelektrophorese wurden die DNA-
Banden aus dem Gel unter UV-Licht ausgeschnitten. Dann wurde die DNA nach dem
Protokoll des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen, Hilden) aufgereinigt.
2.6.3 SDS-PAGE
SDS-PAGE (Abkürzung für engl. Sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel
electrophoresis) ist eine analytische Methode zur Trennung von Polypeptiden im
elektrischen Feld. Als Trennmedium dient ein Gel auf Polyacrylamidbasis. Zusätzlich
kommt SDS zum Einsatz. Dieses anionische Detergenz überdeckt die Eigenladung von
Proteinen, so dass die Proteine eine konstante Ladungsverteilung aufweisen. Außerdem
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
38
kann SDS die Sekundär- und Tertiärstrukturen von Proteinen (teilweise) aufbrechen.
Damit erfolgt die Auftrennung im elektrischen Feld nur anhand der Molekülgröße.
Zur Bestimmung der Reinheit des NirC wurden die Proteinproben zusammen mit nicht
reduzierendem Ladepuffer (Fermentas) auf das Gel (Trenngel: 12,5 % Bis-acrylamid;
Sammelgel: 5 % Bis-acrylamid) aufgetragen. Die SDS-PAGE wurde mit Stromstärken von
20 mA durchgeführt. Als Größenstandard wurde der „Protein Molecular Weight
Marker“ von Fermentas verwendet.
Tabelle 2.10 Zusammensetzung von Trenngel und Sammelgel für SDS-PAGE.
Trenngel 1x [ml] 12,50 % Sammelgel 1x [ml] 5 %
Bis-acrylamid 30% 3 Bis-acrylamid 30% 0,5
1,88 M Tris/HCl, pH 8.8 1,8 1,88 M Tris/HCl, pH 8,8 0,6
0,5% SDS 1,8 0,5 % SDS 0,6
ddH2O 2,4 ddH2O 1,3
TEMED [µl] 8 TEMED [µl] 3
10% APS [µl] 45 10 % APS [µl] 15
Nach dem Lauf wurden die Gele mit ca. 50 ml Coomassie-Lösung gefärbt. Dafür wurden
die Gele 30-60 min in der Färbelösung inkubiert, bis die Markerbanden zu erkennen waren.
Dann wurden die Gele mit 10 % Ethanol entfärbt.
Tabelle 2.11 Coomassie Färbung.
Coomassie-Lösung (50 ml)
Ethanol 10 %
Essigsäure 5 %
1 % (w/v) Coomassie Brillant Blue G 40 µl
1 % (w/v) Coomassie Brillant Blue R 160 µl
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
39
2.6.4 Western Blot
Ein Western Blot bezeichnet den Transfer von Proteinen auf eine Trägermembran, welche
anschließend über unterschiedliche Reaktionen nachgewiesen werden können. Vor dem
eigentlichen Western Blot wird ein Proteingemisch mit Hilfe einer SDS-PAGE aufgetrennt.
Dann werden die Proteine vom Polyacrylamid-Gel durch ein senkrecht zum Gel angelegtes
elektrisches Feld eluiert und auf eine Membran transferiert. An der Membranoberfläche
bleiben die Proteine aufgrund hydrophober Wechselwirkungen haften. Dann können die
Proteine über eine Immunodetektion visualisiert werden. Dabei bindet ein
antigenspezifischer Primär-Antikörper an Epitope des gesuchten Proteins. An den primären
Antikörper bindet wiederum ein sekundärer Antikörper, über welchen die Detektion erfolgt.
In dieser Arbeit wurden Anti-PentaHis Antikörper als primärer, AP-gekoppelte Anti-Maus-
Antikörper als sekundärer Antikörper benutzt. Der Nachweis erfolgt dabei durch eine
Färbreaktion mit dem artifiziellen Substrat BCIP und NBT, die durch AP katalysiert wird.
Der Ablauf wurde nach dem Protokoll von QIAexpress durchgeführt.
2.6.5 Dünnschichtchromatographie (DC)
Um das Detergenz und Phospholipid in NirC quantitativ zu bestimmen, wurde eine
Dünnschichtchromatographie durchgeführt. Dieses Trennsystem besteht aus zwei Phasen:
einer stationären und einer mobilen Phase. Als stationäre Phase wird die Kieselgelschicht
an der Glasoberfläche bezeichnet. Die mobile Phase ist ein Lösungsmittel mit definierter
Zusammensetzung. Auf der Startlinie der DC-Platte wird das zu untersuchende Gemisch
aufgetragen. Dann wird die DC-Platte senkrecht in eine mit Laufmittel (mobile Phase) für
mindesten 30 Minuten äquilibrierte DC-Kammer gestellt, in die die DC-Platte zu einem
geringen Teil eintaucht. Das ganze System wird dann verschlossen. Das Laufmittel saugt
sich nun über Kapillarkräfte in die stationäre Phase nach oben. Sobald die Flüssigkeit die
Probe erreicht, werden seine Komponenten gelöst. Die Moleküle in der Probe sind nun den
Anziehungskräften der stationären Phase einerseits und den Anziehungskräften der
mobilen Phase andererseits ausgesetzt. Je nach Kräfteverhältnis wandern die Moleküle
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
40
unterschiedlich weit nach oben. So werden sie aufgetrennt. Da das Kieselgel selbst polar
(Si-O Bindung) ist, laufen polarere Moleküle aufgrund der Dipol-Dipol-Kräfte weniger
weit. Für die mobile Phase gilt allgemein: Je polarer das Laufmittel ist, desto weiter
wandern polare Substanzen, und umgekehrt (Peterson et al., 2006).
Nach der Trennung wurden die DC-Platten für ca. 8 Sekunden in eine CuSO4 Lösung
eingetaucht und bei 110 °C getrocknet. Anschließend wurden die Platten bei 170 °C
gebacken und die Detergenzien oder Phospholipide wurden verascht, so dass sie sichtbar
wurden. Die Flächen der Banden wurden mit der Software „Aida Image
Analyzer“ bestimmt. Eine Eichgrade wurde mit verschiedenen Detergenzien bekannter
Menge erstellt. Dann wurde das Detergenz in der Proteinprobe durch Vergleich zur
Eichgrade quantifiziert.
Das Laufmittel für die Quantifizierung des Detergenz bestand aus Chloroform/ Methanol /
Ammonium Hydroxid (63 / 35 / 5)
Für die Bestimmung des Phospholipids wurde: Chloroform/ Methanol / Essigsäure (65 / 25
/ 8) als Laufmittel verwendet.
2.6.6 Lipidextraktion
Für die (quantitative) Bestimmung von Phospholipiden im NirC wurde das Lipid aus dem
Protein nach dem Protokoll von Bligh und Dyer (1959) extrahiert. Zur Extraktion wurde
die Proteinprobe mit 0,8 ml Wasser, 2 ml Methanol und 1 ml Chloroform in einem 8 ml
Glasgefäß (Kimble) gemischt. Die Mischung wurde kräftig gevortext und anschließend
wurden 1 ml Chloroform und 1 ml Wasser dazugegeben. Nach weiterem kräftigem
Vortexen wurden die Mischung für 10 Minuten bei 1500 rpm und 4 °C zentrifugiert. Die
untere Phase (Chloroform mit Lipid) wurde in ein sauberes 8 ml Glasgefäß (Kimble)
transferiert und unter Stickstoffbegasung eingedampft. Der Rückstand (Lipid) wurde für
die weitere Verwendung in Chloroform (DC oder saure Methylierung) gelöst.
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
41
2.6.7 Saure Methylierung
Für die Quantifizierung der Fettsäuren wurden die Phospholipide zuerst nach Protokoll
(Miquel und Browse 1992) transmethyliert. Die extrahierten Phospholipide wurden in
kleinen Pyrex-Gläschen mit 1 ml FAME-Lösung und 0,4 μg internem Standard (Tri-
Heptadecanoat) gemischt. Die Gläschen wurden mit Argon überschichtet, um eine
mögliche Oxidation durch Sauerstoff zu vermeiden. Das Reaktionsgemisch wurde für 60
Minuten bei 80 °C inkubiert. Anschließend wurden 200 μl gesättigte NaCl-Lösung und 2
ml n-Hexan zugegeben. Nach kräftigem Vortexen wurde die Mischung für 10 Minuten bei
1500 rpm zentrifugiert. Die obere Phase (n-Hexan mit Fettsäure) wurde in neues Pyrex-
Gläschen transferiert und unter einem Stickstoffstrom eingedampft. Die untere Phase
wurde noch einmal mit 2 ml n-Hexan nach oben genanntem Prozess extrahiert. Die obere
Phase wurde dann in das mit Stickstoff begaste Gläschen gegeben. Der Rückstand wurde
in 2 ml n-Hexan aufgenommen. Zur Entfernung der sauren Reste wurden 2 ml tridest.
Wasser hinzugefügt. Nach 10 minütiger Zentrifugation bei 1500 rpm wurde die obere
Phase durch eine mit Watte und Natriumsulfat befüllte Pasteur-Pipette (Abb. 2.3) laufen
gelassen. Anschließend wurde die restliche Probe durch die Pipette gedrückt. Nach
Eindampfen unter einem Stickstoffstrom wurde der Rückstand (Fettsäure) in 10 μl
Acetonitril resuspendiert, gevortext und kurz zentrifugiert. Danach wurde die Lösung in
Gaschromatographie-Gläschen mit Einsatz abgefüllt, der entweder zur GC-Analyse
verwendet oder bei – 20 °C aufbewahrt wurden.
FAME-Lösung - 2,5 % H2SO4 - 2 % Dimethoxipropan - in Methanol lösen
Abb. 2.3 Pasteurpipette mit Na2SO4 und Watte.
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
42
2.6.8 Gaschromatographie
Die Gaschromatographie (GC) ist eine sehr empfindliche Methode zur Analyse von
Stoffgemischen, bei der als mobile Phase ein Inertgas mit guten Strömungseigenschaften,
meist Stickstoff, Helium oder Wasserstoff verwendet wird. Dieses Trägergas wird durch
eine Säule geleitet. Die Säule wird mit einem bestimmten Material ausgekleidet, der
stationären Phase. Das Messprinzip beruht auf zwei Prinzipien. Das erste bezieht sich auf
die unterschiedlichen Siedepunkte der Einzelsubstanzen in dem Gemisch. Das zweite ist
die spezielle Wechselwirkung des zu analysierenden Stoffes mit der stationären Phase. Die
Stärke der Wechselwirkung zwischen den Probenkomponenten und der stationären Phase
wird sowohl von deren Struktur als auch von deren funktionellen Gruppen bestimmt
(Eiceman 2000).
2.6.9 GC/ MS
Durch Vergleich der Retentionszeit bei der GC mit dem Standard konnten bereits die
Fettsäuren in der Probe (quantitativ) identifiziert werden. Um das Ergebnis zu bestätigen,
wurde eine sogenannte GC/MS-Kopplung durchgeführt, das heißt eine Kombination von
Gaschromatographie und Massenspektrometrie.
Die Massenspektrometrie ist ein Verfahren zum Messen des Masse-Ladung Verhältnisses
(m/q) von Teilchen. Bei bekannter Ladung q kann die Masse m der Teilchen ermittelt
werden. Die zu untersuchende Probe wird in das MS eingebracht, verdampft und ionisiert.
Abb. 2.4 Schematische Darstellung eines GC. 1:
Trägergas 2: Injektion 3: Säule im GC-Ofen 4:
Detektor 5: Signalaufzeichung
(http://de.wikipedia.org/wiki/Gaschromatographie).
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
43
Als bewegte geladene Teilchen lassen sich die Ionen in einem Analysator nach ihrem
Masse-Ladungs-Verhältnis auftrennen und anschließend detektieren. Dies ermöglicht
Aussagen über das Vorhandensein und die Menge der Teilchen. Der Aufbau eines MS lässt
sich somit in vier Hauptkomponenten gliedern: Probenaufnahmesystem, Ionisierung,
Massentrennung und Detektion (Watson et al., 1965).
2.6.10 Aggregationstest
Um zu bestimmen, welche Detergenzien geeignet sind für NirC, wurde ein
Aggregationstest durchgeführt. Das Prinzip beruht darauf, dass aggregierte Proteine das
Licht bei einer Wellenlänge von 320 nm absorbieren. Sinkt die Absorption, bedeutet das,
dass ein neues Detergenz die Proteine besser solubilisieren kann, und umgekehrt (Wiener
2004). Die mit DDM gereinigte Proteinprobe, wurde mit verschiedenem Detergenz bis zu
einem Volumen von 300 μl gemischt, wobei die Konzentration an Protein 1 mg/ml betrug
und die Konzentration an dem neuen Detergenz das 10 Fache seines CMC ausmachte. Die
Absorbtion der Mischung bei 320 nm wurde mit einem Zeitabstand von 20 Sekunden für
30 Minuten gemessen.
Abb. 2.5 Schematischer Aufbau eines GC/MS-Systems.
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
44
2.7 Kristallisation von gereinigtem NirC
Um die dreidimensionale Struktur von NirC durch Röntgenbeugungsexperimente zu lösen,
muss NirC zuerst kristallisiert werden. Im kristallinen Zustand sind die atomaren Bausteine
(Atome, Ionen, Moleküle) in dreidimensional periodischer Weise angeordnet. Die
Kristallisation wird sowohl thermodynamisch als auch kinetisch reguliert.
Thermodynamik: Eine chemische Reaktion kann ohne Energiezufuhr ablaufen, wenn
dadurch die freie Energie G des Systems abnimmt. Die Änderung der freien Energie ΔG
bei der Keimbildung setzt sich aus zwei Termen zusammen. Ein Term spiegelt die
Grenzflächenenergie des Keims wider, der kugelförmig zur umgebenden Lösung
angenommen wird. Er ist proportional zur Oberfläche (r2) des Keims und stets positiv. Der
zweite Term ist immer negativ und proportional zur Stoffmenge (Volumen, r3), die in die
kristalline Phase übergeht. Verfolgt man ΔG als Funktion des Keimradius r, so überwiegt
bei kleinem r der Oberflächenterm, d.h. bei der Bildung eines kleinen Keims wird die freie
Energie des Systems erhöht, und es muß Arbeit - die Keimbildungsarbeit - geleistet werden.
Die Funktion durchläuft ein Maximum bei r*, dem kritischen Keimradius. Erst wenn ein
Keim unter Aufwendung der Keimbildungsarbeit ΔG* diese kritische Größe erreicht hat,
wird durch sein weiteres Wachstum die freie Energie des Systems wieder verringert, der
Keim ist stabil und wird weiter wachsen. Zur Keimbildung muß das thermodynamische
Gleichgewicht überschritten werden. Eine Potentialdifferenz muß als Triebkraft aufgebaut
werden, um Energie für die Formierung der Phasengrenzfläche zu gewinnen.
Kinetik: In den meisten Fällen, selbst wenn es thermodynamisch günstig ist, kristallisiert
das Protein nicht, da die Kristallisation zusätzlich kinetisch kontrolliert wird. Eine zu
schnelle Aggregation der Proteine führt nicht zu geordneten Kristalle, sondern zu
ungeordnetem Proteinpräzipitat. Ist der Prozess zu langsam, dann ist die Kristallisation
zwar theoretisch realisierbar, der Kristall entsteht jedoch praktisch nicht oder erst nach
einem Zeitraum von Monaten oder Jahren.
Allgemein gesagt, sind es viele Faktoren, wie z. B. Temperatur, pH-Wert, Art und
Konzentration von Fällungsmittel, Ionstärke, Additive usw., die die Kristallisation von
Protein beeinflussen können.
In dieser Arbeit wurde Dampfdiffusion zur Kristallzüchtung eingesetzt. Bei diesem
Verfahren wird versucht, die Keimbildungszone durch Äquilibrieren eines Tropfens gegen
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45
ein größeres Volumen (Reservoir) zu erreichen. Der Tropfen ist ein Gemisch von
Reservoir- und konzentrierter Proteinlösung in einem Verhältnis von in der Regel 1:1. Das
Reservoir enthält das Fällungsmittel. Die Triebkraft für die Äquilibrierung stammt aus dem
Konzentrationsgradienten zwischen Reservoir und Tropfen und wird über die Dampfphase
ausgeglichen. Die geeignete Kristallisationsbedingung wird durch eine große Zahl von
Screens gesucht.
2.7.1 Vorgefertigte und kommerziell erhältliche Screens
Die Kristallisationsansätze wurden nach der „sitting drop“-Methode angefertigt. Die
Screens wurden in „Cryschem Plate“- (Hampton Research, Aliso Viejo, USA)
Kristallplatten auf Eis mit jeweils 1µl Protein (10 mg/ml) zu 1µl Reservoirlösung (400 µl)
pipettiert und mit Crystal Clear Sealing Tape (Hampton Research) verschlossen. Die
Platten wurden dann bei 4 °C gelagert.
Tabelle 2.12 Liste eingesetzter Kristallisierungsscreens
Name Bedingungen Quelle
Crystal Screen I 48 Hampton Research
Crystal Screen II 48 Hampton Research
MemStart Screen 48 Hampton Research
MemSys Screen 48 Hampton Research
Natrix Screen 48 Hampton Research
PEG/Ion Screen 48 Hampton Research
Structure Screen 48 Hampton Research
Footprint Screen I 24 Stura
Footprint Screen II 24 Stura
Footprint Screen III 24 Stura
JB Membrane Protein Screen I 24 Jena Bioscience
JB Membrane Protein Screen II 24 Jena Bioscience
JB Membrane Protein Screen III 24 Jena Bioscience
Sigma Membrane protein Screen 50 Sigma
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46
2.7.2 Feinscreen, Additive Screen und Detergent Screen
Die Kristalle wurden in drei initialen Bedingungen gefunden.
1). 0,1 M Natriumcitrat pH 3,5, 0,1 M Li2SO4, 30 % PEG 400)
2). 0,2 M Imidazolmalat pH 5,5, 33 % PEG 600
3). 0,05 M Cacodylat/HAc pH 6,5, 0,12 M Natriumbenzoat
Eine Serie von Feinscreens wurde pipettiert, um die pH-Werte, Ionstärke,
Proteinkonzentration, Präzipitantkonzentration und die Tropengröße zu variieren. Die sich
daraufhin anschließende Verfeinerung der Kristallformen wurde durch die Nutzung des
Additive Screen I-IV, Detergent Screen I-III (Hampton Research) und Detergent Screen 1-
2 (Sigma) versucht.
2.7.3 Microseeding
Um größere Kristalle mit besserer Streuungsqualität zu bekommen, wurde Mikroseeding
durchgeführt. Dafür wurden gut gewachsene Kristalle mit einem Plastikhomogenisierer
zerstört und anschließend in Stabilisierungslösung (Reservoir mit 20 % mehr Präzipitant)
resuspendiert. Die Mikrokristalle wurden dann durch eine Verdünnungsreihe von 10 bis
106 verdünnt und bei 4 °C gelagert. Screens mit denselben Bedingungen, in denen die
Kristalle gewachsen waren, wurden mit niedrigeren Präzipitantkonzentrationen pipettiert
und für ca. 2 Stunden äquilibriert. Dann wurden jeweils 0,3 μl Keime aus verschiedenen
Verdünnungsstufen dazu gegeben. Die Platten wurden anschließend bei 4 °C gelagert
(Bergfors 2003; Saridakis et al., 2000).
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47
2.7.4 Kryobedingungen
Bei der klassischen Methode wird der Kristall mit etwas Reservoirlösung in eine Kapillare
aufgenommen. Anschließend wird der Kristall “trocken“ gelegt, d.h. die den Kristall
umgebende Lösung wird mit Kapillaren und Filterpapier entfernt. Danach wird die
Kapillare luftdicht mit Wachs verschlossen, so dass der Kristall nicht austrocknen kann.
Um die Strahlenschäden durch Röntgenstrahlung zu verringern, werden Kryotechniken
angewendet, da die Kühlung die Immobilisierung von OH-Radikal bewirkt, welches durch
Röntgenstrahlung aus dem Wasser erzeugt wird und schädlich für das Proteinkristall ist.
Dafür muss eine geeignete Kryobedingung herausgefunden werden. Normalerweise
werden höhere Konzentrationen an Präzipitanz oder ein zusätzliches Kryoprotektant
verwendet. In dieser Arbeit wurde dieselbe Lösung aus dem Reservoir, jedoch mit 35 %
PEG 400, als Kryobedingung benutzt.
2.7.5 Kristall Annealing
Die Kryotechnik kann die Kristalle vor Ausbildung von Eis schützen, bringt aber auch
Probleme mit: Sie führt manchmal Gitterunordnung ein, die wieder zur erhöhter Mosaizität
und reduzierter Beugungsauflösung führt.
Kristall Annealing ist eine einfache Methode, die machmal die Streuungsqualität nach
Kryobehandlung verbessern kann. Denn das ungeordnete Gitter kann möglich dadurch
wieder geordnet werden.
In dieser Arbeit wurde dieser Prozess folgendermaßen durchgeführt: Die Kristalle wurden
aufgenommen, sofort in flüssigen Stickstoff eingefroren und anschließend unter dem
kalten Stickstoffstrom von Diffraktormeter platziert. Dann wurde der kalte Strom für ca. 2
Sekunden dreimal mit einem Zeitabstand von 6 Sekunden blokiert. Nun waren die Kristalle
bereit für das Röntgenbeugungsexperiment (Harp et al., 1998; Heras et al., 2005; Newman
2005).
MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN
48
2.7.6 Kristall Dehydrierung
Proteinkristalle enthalten typischerweis mehr als 50 % Wasser (Masse) und es ist bekannt,
dass die Reduzierung des Wassergehalts zu enger gepackten und besser geordneten Kristall
führen kann (Salunke et al., 1985; Frey, 1994). Kristalldehydrierung ist ein sehr wertvolles
Verfahren für diese Absicht. In dieser Arbeit wurde der Kristalle enthaltende
Kristallisationsansatz gegen Reservoirs, die jeweils 5 % mehr Präzipitanz als die
vorherigen enthielten, über Nacht äquilibriert. Dieser Prozess wurde 5- bis 6-mal
wiederholt (Heras et al., 2005; Newman 2005).
2.7.7 Röntgenbeugungsexperimente
Das Ziel von Röntgenbeugungsexperimenten an Proteinkristallen ist der Erhalt einer
Elektronendichteverteilung in der dreidimensionalen Einheitszelle des Kristalls. Grundlage
aller Röntgenbeugungsexperimente an einem Kristall ist das Gesetz von Bragg.
λθ ⋅=⋅ nd )sin(2 1)
(λ = Wellenlänge, d = Abstand der Ebenenschar im Kristall, θ = halber Winkel zwischen eintretendem und austretendem Strahl)
Die Datensammlung erfolgte ausschließlich nach dem Prinzip der Rotationsmethode bei
Verwendung monochromatischer Röntgenstrahlung. Dabei wird der Kristall um eine
Achse senkrecht zum einfallenden Röntgenstrahl um den Winkel φ gedreht. Die Reflexe
der durch die Drehbewegung in Reflexion gebrachten Netzebenen werden von einem
Flächendetektor aufgenommen, der Intensität und Lage des Reflexes registriert. Um einen
vollständigen, redundanten Datensatz zu erhalten, muss der Kristall um einen seiner
Symmetrie entsprechenden Betrag gedreht werden.
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49
2.8 ITC (engl. Isothermal Titration Calorimetry)
ITC ist eine biophysikalische Technik, welche die Bindungsaffinität (Ka), Änderung der
Enthalpie (ΔH) und Bindungsstöchiometrie (n) der Interaktion zwischen zwei oder mehr
Molekülen messen kann. Der Gibbs’sche freie Energie (ΔG) und die Änderung der
Entropie (ΔS) können weiterhin nach Gleichung 2) ermittelt werden (Perozzo et al., 2004;
Leavitt et al., 2001; Velazque-Campoy et al., 2006).
ΔG = -RTlnKa = ΔH-TΔS 2)
R: Gaskonstante, T: absolute Temperatur
Bei ITC-Experiment wird ein Ligand mittels einer Spitze in die Zelle, welche die
Makromoleküllösung enthält, bei konstanter Temperatur pipettiert. Die freigesetzte oder
absorbierte Wärme wird gegen eine Referenzzelle angemessen. Die Daten werden dann
mit Hilfe der Software Origin analysiert (Tellinghuisen 2005).
In dieser Arbeit wird ein VP-IPC Gerät von MicroCal (Northampton, USA) verwendet.
Der Aufbau des Geräts ist in Abb. 2.6 schematisch dargestellt.
Abb. 2.6 Schematische Darstellung eines ITC-Geräts. A: Allgemeiner Aufbau eines ITC-Geräts. B: Referenzzelle und Probenzelle (MicroCal).
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50
3 ERGEBNISSE
3.1 PCR-Amplifikation
Die Produkte der Polymerasekettenreaktion zur Amplifikation des nirC-Fragments wurden
mittels Agarosegelelektrophorese auf ihre Länge überprüft.
M 1 2 3 4
~ 830 bp900 bp
800 bp
In der ersten Bahn wurde ein DNA-Marker mit einem Größenbereich von 100 bp bis
10000 bp aufgetragen. In den Bahnen 1 und 2 wurden jeweils die PCR-Produkte von nirC
mit den Schnittstellen NdeI/EcoRI aufgetragen (1: genomische DNA von E. coli K12 als
Matrize, 2: E. coli XL10 Gold Zellen als Matrize). In den Bahnen 3 und 4 wurden jeweils
die PCR-Produkte nirC mit den Schnittstellen NdeI/XhoI aufgetragen (3: genomische
DNA von E. coli K12 als Matrize, 4: E. coli XL10 Gold Zellen als Matrize).
Die PCR-Produkte der vier Ansätze liefen alle bei einer Größe von ca. 830 bp, was der
Größe des nirC-Fragments entspricht. Die Amplifikation war somit erfolgreich.
Abb. 3.1 PCR-Amplifikation des nirC-Fragments. Die Banden in Bahn 1 und 2 sind nirC mit den Schnittstellen NdeI/EcoRI, die Banden in Bahn 3 und 4 sind nirC mit den Schnittstellen NdeI/XhoI. Als Matrize: genomische DNA von E. coli K12 (ungerade Zahl), E. coli XL10 Gold Zelle (gerade Zahl). M: GeneRuler DNA Ladder Mix.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
51
3.2 Klonierung und Transformation
Die PCR-Produkte wurden zuerst in den Vektor pPCR-Script Amp SK(+) ligiert und dann
über einen Weiss-Blau-Färbetest selektiert. Um zu überprüfen, ob die Ligation richtig
funktioniert hat, wurden die Plasmide einiger positiver Kolonien aufgereinigt und mit den
Restriktionsenzympaaren NdeI/ EcoRI oder NdeI/ XhoI verdaut. Anschließend wurden die
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M
3000 bp
1000 bp
750 bp
ungeschnittenen und geschnittenen Plasmide jeweils mit einem Agarosegel analysiert. Der
Vektor pPCR-Script Amp SK(+) selbst hat eine Größe von ca. 3000 bp. Die Abbildung 3.2
zeigt, dass die Proben 3, 5-8 und 10-12 positiv waren, da sie nach dem Restriktionsverdau
zwei Banden mit einer Größe von ca. 3000 bp (pPCR-Script Amp SK(+)) bzw. 830 bp
(nirC-Fragment) hatten. Im Gegensatz dazu waren die Proben 1, 2, 4 und 9 negativ, da hier
die Banden vor dem Restriktionsverdau bei ca. 2000 bp und nach dem Restriktionsverdau
bei ca. 3000 bp liefen. Das bedeutet, dass die vier Proben den Vektor pPCR-Script Amp
SK(+) ohne nirC-Fragment enthielten. Da die Plasmide vor dem Verdau ringförmig waren,
konnten sie im Gel weiter wandern.
Abb. 3.2 Das ligierte Plasmid pPCR-Script Amp SK(+)::nirC nach Restriktionsverdau. 1-6: Plasmid mit Schnittstelle NdeI/EcoRI; 7-12: Plasmid mit Schnittstelle NdeI/XhoI. M: GeneRuler 1kb DNA Ladder.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
52
Die durch Agarosegelextraktion aufgereinigten nirC-Fragemente wurden in den zuvor mit
den Restriktionsenzympaaren NdeI/EcoRI bzw. NdeI/XhoI geschnittenen Vektor pET-
21a(+) ligiert und in E. coli XL10 Gold transformiert. Um die Klonierung zu überprüfen,
wurden die gereinigten Plasmide mit den entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut und
mittels Agarosegelelektrophorese analysiert. Es zeigte sich, dass alle 24 Proben, die jeweils
aus verschiedenen Bakterienkolonien aufgereinigt wurden, zwei Banden aufweisen, von
denen die eine, entsprechend der Größe des linearisierten pET-21a(+)-Vektors, bei ca.
5500 bp und die andere, mit Ausnahme der Probe 24, bei einer Größe von ca. 830 bp lief.
Dies entspricht genau der Größe von nirC. Die nirC-Fragmente der Proben 1-23 wurden
somit erfolgreich in den pET-21a(+) Vektor kloniert.
Die Sequenzierung der Plasmidinsertionsbereiche offenbarte, dass das nirC-Fragement in
vollständiger Weise und korrekter Anordnung (Leseraster) in den Vektor integriert wurde,
daher wurde es in den weiteren Experimenten für die Expression von NirC verwendet.
Abb. 3.3 Das ligierte Plasmid pET-21a(+)::nirC nach Restriktionsverdau mit NdeI/EcoRI (1-12) bzw. NdeI/XhoI (13-24). 1-12: Plasmid mit Schnittstelle NdeI/EcoRI, 13-24: Plasmid mit Schnittstelle NdeI/XhoI. M: GeneRuler DNA Ladder Mix.
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53
3.3 Überexpression in E. coli C43
Um eine starke Überproduktion von NirC und ein gleichzeitig gutes Wachstum der E. coli
C43 Zellen mit dem pET-21a(+)::nirC Konstrukt in dem normalen LB-Medium zu
gewährleisten, wurde ein Induktionstest mit verschiedenen IPTG-Konzentrationen
durchgeführt. Der Expressionslevel wurde mittels 10 % SDS-PAGE und anschließend mit
einem Western Blot analysiert.
E4 E3 E2 E1 M X1 X2 X3 X4
Trimer
Dimer
Monomer
45 kDa
35 kDa
18.4 kDa
Als Größenstandard wurde der Protein Molecular Weight Marker (Fermentas) verwendet.
In die Geltaschen E1 und X1 wurden Zellen der uninduzierten Kulturen aufgetragen. In
Bahn E2-4 und X2-4 wurden Zellkulturen aufgetragen, die bei einer optischen Dichte von
0.8 (600 nm Wellenlänge) mit jeweils 0,1 mM, 0,5 mM und 1 mM IPTG induziert wurden
(E steht für NirC mit Konstrukt NdeI/EcoRI, X steht für NirC mit Konstrukt NdeI/XhoI.).
Während in Bahn E1 und X1 kein Protein detektiert wurde, zeigen die anderen 6 Ansätze
zeigten eine sehr starke Induktion. Bei diesen Ansätzen wurden 3 Banden sichtbar, die
jeweils bei einer Höhe von ca. 15 kDa, 30 kDa und 45 kDa (schwach erkennbar) liefen.
Nach der Molekulargrößenvorhersage des ExPASy-Webservice (http://www.expasy.org/,
Gasteiger et al.) hat NirC eine Größe von 28,562 kDa. Berücksichtigt man, dass
Membranproteine eine sehr stark hydrophobe Wechselwirkung im Inneren besitzen, ist es
unwahrscheinlich, dass sie durch SDS vollständig entfaltet werden können. Deshalb laufen
Abb. 3.4 Western Blot der acht Proben des IPTG-Induktionstest von E. coli C43 Zellen, die mit dem pET-21a(+)::nirC Konstrukt transformiert wurden. In Ansatz E1 und X1 wurde keine Induktion durchgeführt und dient somit als Kontrollansatz. Ansätze E2-E4 und X2-X4 wurde jeweils mit 0.1 mM, 0.5 mM und 1 mM IPTG bei oD600 = 0.8 induziert. Als Standard wurde der Protein Molecular Weight Marker (Fermentas) verwendet. Das Monomer, Dimer und Trimer wurden jeweils bei einer Höhe von 15 kDa, 30 kDa und 45 kDa beobachtet.
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54
Membranproteine in einem SDS-Gel normalerweise tiefer als ihre reale Größe, da die
Protein Marker lösliche Proteine enthalten. Daher sollte die Banden bei 15 kDa dem
Monomer von NirC, die Banden bei 30 kDa dem Dimer und die Banden bei 45 kDa dem
Trimer entsprechen.
Die Überexpression von NirC durch Induktion mit IPTG behinderte das Wachstum der E.
coli C43 Zellen, dieser Effekt war umso stärker, je höher die Konzentration an IPTG war.
Die Messwerte für die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm 4 Stunden nach
der Induktion waren jeweils 2,9, 2,7, 2,3, 2,3 für E1-4 und 2,8, 2,7, 2,6, 2,2 für X1-4. Um
das Gleichgewicht zwischen einer starken Überproduktion von NirC und einem starken
Wachstum von E. coli C43 zu gewährleisten, wurden 0,5 mM IPTG zur Induktion in dieser
Arbeit verwendet.
3.4 Wachstumskurven
Um den optimalen Zeitpunkt für die Expression von NirC und das Wachstum der Zelle
herauszufinden, wurde das Wachstum in LB-Medium und Autoinduktionsmedium (ZYM
5052, Studier 2005) verfolgt.
Die Wachstumskurve von E. coli C43 mit dem pET-21a(+)::nirC Konstrukt in LB-
Medium wurde bei 30 °C erstellt. Die Kultur wurde durch Zugabe von 0,5 mM IPTG bei
oD600 = 0,6 induziert. Ungefähr zwei Stunden nach der Induktion erreichten die Zellen
kurz vor der stationären Phase eine oD600 von ca. 1,5. welches der optimale Zeitpunkt für
die Zellernte war.
Die Wachstumskurve von E. coli C43 mit dem pET-21a(+) Konstrukt in
Autoinduktionsmedium ZYM 5052 wurde bei 18 °C erstellt. Der beste Zeitpunkt für die
Zellernte war nach etwa 24 h bei einer oD600 von ca. 11 erreicht, da das Wachstum
anschließend in die die stationäre Phase überging.
Das Vergleich beider Wachstumskurven zeigt, dass das Autoinduktionsmedium deutlich
effektiver als normales LB-Medium ist, da bei geringerem Verbrauch an Rohstoffen mehr
Biomasse produziert wird. Deswegen wurde Autoinduktionsmedium ZYM 5052 für die
weitere Überexpression von NirC in dieser Arbeit verwendet.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
55
3.5 Reinigung von NirC
3.5.1 Zellernte, Aufschluss und Isolierung de Membranen
Bei Zellernte und Aufschluss wurden die Bakterienkulturen, wie unter 2.5.1 und 2.5.2
angegeben, behandelt. Die Ausbeute von E. coli C 43 Zellen mit dem pET-21a(+)
Konstrukt war normalerweise ca. 20 g pro Liter Autoinduktionsmedium. Nach zwei
Zentrifugationen (2.5.3) wurden ca. 0,17 g Membranen pro Gramm Zelle geerntet.
Abb. 3.5.B Wachstumskurve von E. coli C43 mit pET-21a(+)::nirC Konstrukt bei 18°C in Autoinduktionsmedium ZYM 5052. Die beste Inkubationszeit ist ca. 24 Stunden mit einer oD600 von ca. 11.
Abb. 3.5.A Wachstumskurve von E. coli C43 mit pET-21a(+)::nirC Konstrukt bei 30°C in LB-Medium. Die Kultur wurde durch Zugabe von 0.5 mM IPTG bei oD600 = 0.6 induziert. Ungefähr zwei Stunden nach der Induktion erreichten die Zellen kurz vor der stationären Phase eine oD600 von ca. 1.5.
Wachstumskurve (E. coli C43 mit NirC in ZYM 5052 @18 °C)
0
2
4
6
8
10
12
14
0 10 20 30 40 50
time (h)
oD60
0
Wachstumskurve (E. coli C43 mit NirC in LB-Amp@ 30 °C)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 5 10 15 20 25 30
time (h)
oD60
0
Zugabe von 0.5 mM IPTG
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
56
3.5.2 Solubilisierung mit Detergenz
Die Membranen wurden in Aufschlusspuffer resuspendiert. Die Suspension war trüb, da
Membranen schwer wasserlöslich sind. Nach der Solubilisierung mit 2 % LDAO (2.5.4)
wurde die Lösung klar. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt (100.000 x g, 4 °C) gab
es nur eine kleine Menge von weißem Pellet, welches darauf hindeutert, dass die meisten
Membranproteine bereits solubilisiert wurden und das weiße Pellet aus wasserunlöslichen
Lipiden besteht.
3.5.3 Affinitätschromatographie
Der Überstand der Zentrifugation wurde über eine 5 ml HisTrap FF Säule gereinigt (2.5.5).
In der Abb. 3.7.A (aufgereinigt mit LDAO) ist ein typischer Säulenlauf gezeigt. Der
Überstand enthielt 20 mM Imidazol, um die unspezifischen Bindungen durch die
Verunreinigungen an der Säule zu verhindern. Da das der erste Aufreinigungsversuch war,
wurden fünf aufeinanderfolgende Waschschritte mit einer Konzentration an Imidazol von
30 mM, 50 mM, 100 mM, 110 mM und 125 mM durchgeführt, um den Waschprozess für
weitere Aufreinigungsexperimente in dieser Arbeit zu optimieren. Anschließend wurde die
Säule mit einem linearen Gradienten von 25-100 % Elutionspuffer eluiert, dabei wurde ein
scharfer Peak beobachtet.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
57
0
500
1000
1500
2000
mAu
0 50 100 150 200 250 300 min
Method Run 17.11.2006, 11:13:11, Method : , Result : C:\...\prime\Manual Injection Valve Load Flow 1.5 ml/min Flow 1.0 ml/min Manual Set, Concentration 6 %B Manual Set, Concentration 18 %B Error: 69 ERROR Stop grad. set HOLD or PAUSE
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 65687
30 mMImidazol
50 mMImidazol
100 mMImidazol
110 mMImidazol
125 mMImidazol
500 mMImidazol
20 mMImidazol
Die gesammelten Fraktionen der Affinitätschromatographie wurden durch SDS-PAGE
analysiert (Abb. 3.7.B).
Das SDS-Gel zeigte, dass sämtliches NirC an der Säule gebunden hatte, da in den
Durchfluss-Ansätzen 1-5 kein NirC beobachtet wurde. Desweiteren konnten durch die fünf
Waschschritte fast alle Verunreinigungen ausgewaschen werden. Die Elutionsfraktionen
waren bereits relativ sauber. Jedoch wurden vier verschiedene Polymerformen in dem Gel
sichtbar: Monomer (ca. 24 kDa), Dimer (ca. 45 kDa), Trimer (ca. 70 kDa) und Tetramer
(ca. 100 kDa). Dies bedeutet aber nicht unbedingt, dass die Proteine tatsächlich vier
Polymerformen hatten, denn NirC ist ein Membranprotein und wird durch Detergenz
eingeschlossen. Die Transmembranhelices besitzen untereinander sehr starke hydrophobe
Abb. 3.7.A: Chromatogramm der Affinitätschromatographie von NirC mittels einer 5 ml HisTrap FF Säule. Die Proteinlösung wurde mit 20 mM Imidazol auf die Säule geladen, um unspezifische Bindungen zu vermeiden (Siehe Pfeil). Anschließend folgten fünf Waschschritte mit Imidazolkonzentration von 30 mM, 50 mM, 100 mM, 110 mM und 125 mM. Schließlich wurde NirC mit einem linearen Gradienten von 25-100% Elutionspuffer eluiert (100% Elutionspuffer entsprach 500 mM Imidazol), ein großer scharfer Peak ist zu erkennen.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
58
Wechselwirkungen, daher ist es für SDS-Moleküle schwierig, sich in die Detergenz-
Protein-Komplexe einzulagern und die quartären Strukturen vollständig zu zerstören. Diese
Vermutung wurde durch die Ankonzentrierung von NirC unterstützt: Die Fraktionen, die
NirC enthielten, wurden mittels einer Ultrazentrifugationsmembran mit einer
Ausschlussgröße von 50 kDa und Zentrifugation (3000 x g, 4 °C) ankonzentriert. Wenn
NirC wirklich vier verschiedene Polymerformen gebildet hätte, sollten im Durchfluss des
Konzentrators ebenfalls Proteine vorhanden sein, da die Größe von Monomer kleiner als
50 kDa wäre. Dies wurde jedoch nicht beobachtet, daher kann angenommen werden, dass
NirC als Tetramer vorliegt.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Monomer
Tetramer
Trimer
Dimer
116
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
kDa
Auffällig in diesem Gel ist, dass die Proteine im Vergleich zu Abb. 3.4 kürzer gelaufen
sind, was auf den unterschiedlichen Anteil an Acrylaimd im SDS-Gel zurückzuführen ist.
Um eine bessere Auftrennung zu erreichen, enthielten alle SDS-Gel in dieser Arbeit 12,5
% Acrylamid,.
NirC wurde auch mittels D10M erfolgreich aufgereinigt.
Abb. 3.7.B: SDS-PAGE (12,5% Acrylamid) zur Kontrolle der Affinitätschromatographie (HisTrap). M: Protein Molecular Weight Marker von Fermentas. 1-5: Durchfluss (Fraktionen 1-5 in der Abb. 3.7.A). 6-9: Waschfraktionen (entsprachen jeweils den Waschschritten 30 mM, 50 mM, 100 mM, 125 mM Imidazol). 10-18: Elutionsfraktionen. Vier Banden für NirC wurden in Ansätze 10-18 deutlich beobachtet. Sie entsprachen jeweils Monomer (ca. 24 kDa), Dimer (ca. 45 kDa), Trimer (ca. 70 kDa) und Tetramer (ca. 100 kDa).
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59
3.5.4 Größenausschlußchromatographie
Das konzentrierte Protein wurde auf eine HiLoad 16/60 Superdex 200 geladen, da NirC
wahrscheinlich Tetramere bildet. In der Abb. 3.8 ist das Chromatogramm von NirC/D10M
gezeigt. Der Aufreinigungspuffer bestand aus: 50 mM HEPES pH 8, 200 mM NaCl, 10 %
Glycerol und 0,2 % D10M. Drei Peaks, die jeweils einer Größe von 1400 kDa, 460 kDa
und 200 kDa entsprachen, waren zu beobachten. Die gesammelten Fraktionen wurden
mittels SDS-PAGE analysiert. Die Abb. 3.8.B zeigt, dass alle drei Peaks nur NirC
enthielten. Dies bedeutete, dass die ersten beiden Peaks Aggregationen von NirC sein
sollten. Deswegen wurden nur die Fraktionen im dritten Peak gesammelt und bis ca. 1 ml
konzentriert.
Manual Run 3:10_UV Manual Run 3:10_Conc Manual Run 3:10_Fractions
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
mAu
0 50 100 150 min1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41
Abb. 3.8.A Chromatogramm der Gelfiltrationschromatographie von NirC/D10M mittels einer HiLoad 16/60 Superdex 200 Säule. Drei Peaks waren zu erkennen, die jeweils eine Größe von 1400 kDa, 460 kDa und 200 kDa nach Reihenfolge entsprachen. Die ersten beiden Peaks sollten Aggregation von NirC sein. Der dritte Peak entspricht ungefähr der Größe von Tetramer mit Detergenz.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
60
3.5.5 Bestimmung der Proteinkonzentration
Die Konzentration des aufgereinigten NirC wurde mit einem BCA-Test und zusätzlich mit
der Ehresmann-Methode bestimmt (Ehresmann et al., 1973).
In Abb. 3.9 ist eine Eichgerade BSA-Standards dargestellt. Anhand dieser wurde die
Konzentration von NirC mit 50,8 ± 0,4 mg/ml (1,45 ml) gerechnet. Dies entspricht einer
Ausbeute von 2,7 mg NirC/ 1 g Zellen.
Die Ehresman-Methode lieferte ein ähnliches Ergebnis wie der BCA-Test.
BCA Protein Assay
y = 273.25x - 6.6458
0
50
100
150
200
250
300
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Absorbtion (562 nm)
Con
cent
ratio
n ( μ
g/m
l)
Abb. 3.9 Eichgrade von BSA zur Bestimmung der Konzentration von NirC.
Abb. 3.8.B SDS-PAGE (12,5% Acrylamid) der Gelfiltration. M: Protein Molecular Weight Marker von Fermentas. 1-2: Peak 1; 3-5: Peak 2; 6-11: Peak 3. Vier Banden für NirC wurden in den Ansätzen 10-18 deutlich beobachtet. Sie entsprachen jeweils Monomer (ca. 24 kDa), Dimer (ca. 45 kDa), Trimer (ca. 70 kDa) und Tetramer (ca. 100 kDa).
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
61
3.6 Quantitative Bestimmung der Zusammensetzung von Detergenzien und Lipiden im Protein-Detergenz-Komplex (PDK)
3.6.1 Bestimmung des Detergenz-Protein-Verhältnisses im PDK
Die Konzentration an Detergenz in der Proteinlösung spielt eine wichtige Rolle sowohl bei
der Solubilisierung (Stabilität und Solubilität des PDK) als auch bei der Kristallisation
(Wechselwirkung zwischen PDK) von Membranproteinen. Daher wurde die
Detergenzkonzentration nach Ankonzentrierung mittels Dünnschichtchromatographie
quantifiziert. Gleichzeitig wurde das Detergenz-Protein-Verhältnis inm PDK berechnet
(Eriks et al., 2003; daCosta et al., 2002).
In Abb. 3.10 sind die unterschiedlichen Laufhöhen verschiedener Detergenzien in einer
DC-Platte gezeigt.
Eine Eichgerade wurde mit einer Serie bekannter LDAO-Mengen erstellt (Abb. 3.11),
deren Daten die gemittelten Werte von drei unabhängigen Versuchen entsprechen. Nur vier
Banden (0,01-0,15 mg) wurden für die Eichgerade eingesetzt, da die Kurve in diesem
Bereich linear war und die Menge an LDAO in der Proteinprobe ebenfalls in diesem
Bereich lag. Die Menge an Detergenz in der Proteinprobe sowie in dem Durchfluss wurde
Abb. 3.10 Charakteristische Laufhöhe einiger Detergenzien. NirC/LDAO und NirC/D10M entsprechen NirC, das jeweils mit LDAO bzw. D10M aufgereinigt wurde. Das Laufmittel: Chloroform/ Methanol/ Ammonium Hydroxid (63/ 35/ 5).
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
62
durch Vergleich mit der Eichgerade bestimmt. Die Konzentration von LDAO im
Durchfluss war 0,12 %±0,02 %, d.h. LDAO wurde während der Ankonzentrierung von
NirC nicht ankonzentriert. Daher konnte das Detergenz-Protein-Verhältnis in dem PDK
berechnet werden: (58,4±0,6)-LDAO Moleküle binden an ein NirC.
Abb. 3.11 Quantitative Bestimmung des Detergenz-Protein-Verhältnisses in dem PDK mittels DC. A: Die Banden von LDAO mit verschiedenen Mengen. Die ersten zwei Banden waren zu schwach und nicht quantifizierbar. B: Das mittels einer Ultrazentrifugationsmembran mit einer Ausschlussgröße von 50 kDa und Zentrifugation (3000 x g, 4 °C) ankonzentrierte NirC/LDAO wurde in drei verschiedenen Verdünnungen auf die Platte aufgetragen. Der Durchfluss war die untere Flüssigkeit bei Ankonzentrierung. C: Eichgerade für 0,01 – 0,15 mg. Die Intensität jeder Band im A wurde als die Funktion von der Menge an LDAO gezeichnet. Nur vier Banden wurden genommen, da die Kurve in diesem Bereich linear war.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
63
3.6.2 Bestimmung der Lipidzusammensetzung im PDK
Der Lipidgehalt im PDK kann ebenfalls wichtig für die Kristallisation von
Membranproteinen sein, da die Lipide sich auch an der Interaktion zwischen den PDK-
Molekülen beteiligen. Da bereits bekannt ist, dass Gelfiltrationschromatographie eine
Delipidierung verursachen kann, wurde die Lipidzusammensetzung im PDK quantitativ
bestimmt.
Eine qualitative Untersuchung wurde zuerst mittels DC durchgeführt und die extrahierten
Lipide wurden anhand der Laufhöhe im Vergleich zu dem Standard identifiziert (Abb.
3.12). Die Ergebnisse zeigten, dass PE, PG und CL die Hauptphospholipide in der
Membran von E. coli waren, die NirC überexprimierten. Desweiteren deuten die
Ergebnisse an, dass in NirC/LDAO noch PE vorhanden war. Zudem kann das
Vorhandensein von PG nicht ausgeschlossen werden, da es möglicherweise von der
starken Bande von LDAOH+ verdeckt wurde.
Abb. 3.12 Qualitative Analyse der Lipide in NirC/LDAO vor und nach der Gelfiltration. PC: Phosphatidylcholin; PI: Phosphatidylinositol; PE: Phosphatidylethanolamin; PG: Phosphatidylglycerol; PA: Phosphatidyl Acid; CL: Cardiolipin; Mem 1 und 2: jeweils 2 und 4 μl Extrakt der Membranfraktion aus E. coli C43, die NirC exprimieren; HisTrap: NirC/LDAO vor Gelfiltration; Gelfiltration: NirC/LDAO nach Gelfiltration; Puffer: Puffer der Proteinlösung. 1: PE; 2: PG; 3: CL; 4: LDAOH+; 5: LDAO. Das Laufmittel: Chloroform/ Methanol/ Essigsäure (65/ 25/ 8).
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
64
Die Fettsäurezusammensetzung der Phospholipide in NirC/LDAO ohne vorhertige
Gelfiltration wurde mittels GC/MS quantitativ bestimmt (Tabelle 3.1). Es waren sechs
unterschiedliche Fettsäuren vorhanden, von denen Ölsäure (18:1, 9Z) und Palmitinsäure
(16:0) die häufigsten waren. Insgesamt kamen auf ein mg NirC/LDAO ca. 1,39 μg
Fettsäure, die 1 Mol Fettsäure pro 6,8 Mol NirC/LDAO entspricht. Da ein Mol
Phospholipide zwei Mol Fettsäuren enthalten, beträgt das Verhältnis von Phospholipid zu
NirC/LDAO im PDK ca. 1: 13,6.
Tabelle 3.1 Die Fettsäurezusammensetzung von Phospholipiden in NirC/LDAO ohne Gelfiltration.
Fettsäure μg/mg
NirC/LDAO Anteil MW
μMol/mg NirC/LDAO
Myristinsäure, 14:0 0,0416 3,00 % 228 0,000182456
Palmitinsäure, 16:0 0,278264857 20,04 % 256 0,001086972
Palmitoleinsäure, 16:1 (9Z) 0,160355556 11,55 % 254 0,000631321
Heptadecenoinsäure,17:1 (10Z) 0,135111111 9,73 % 268 0,000504146
Stearinsäure, 18:0 0,04186546 3,01 % 284 0,000147414
Oleinsäure, 18:1 (9Z) 0,731377778 52,67 % 282 0,002593538
Σ(Fettsäure) 1,388574761 0,005145847
Phospholipid/NirC (Mol/Mol) 1 / 13,6
3.7 Aggregationstest
Um die Relevanz von Detergenz auf die Kristallisation von Membranproteinen zu
berücksichtigen, müssen einige Detergenzien ausgewählt und getestet werden. Das
Ergebnis ist in Abb. 3.13 dargestellt. Das mit DDM (0,01 %) gereinigte NirC wurde für
dieses Experiment ausgewählt, da es nicht so stabil war: die Proteine fielen einige Tage
nach Aufreinigung teilweise aus. Dieses Experiment ergab, dass die Absorptionen bei 320
nm von OGP, Fos-Cholin-iso9 und der Verdünnung mit der Zeit stiegen und die
Absorptionen der anderen fünf Detergenzien sanken. Dies bedeutet, dass OGP und Fos-
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
65
Cholin-iso9 auf keinen Fall mit NirC kompatibel sind. Im Gegensatz dazu sind LDAO,
DDPO, D10M und D11M mögliche geeignete Detergenzien für NirC.
OGPVerdünnung
Fos Cholin iso 9
Fos Cholin 12LDAODDPO
D11MD10M
3.8 Austausch von Detergenz
Es wurden insgesamt fünf Detergenzaustausche durchgeführt: LDAO→DDPO
LDAO→D10M, D10M→D9M, D10M→D11M, D10M→DDM.
In der Abb. 3.14.A ist das Chromatogarmm des Austausches (LDAO→DDPO) dargestellt.
Der Elutionspuffer besteht aus: 50 mM HEPES pH 8,0, 500 mM NaCl, 10 % Glycerol und
Abb. 3.13 Aggregationstest. Die mit DDM (0,01%) gereinigten Proteinproben, wurden mit verschiedenen Detergenzien (bis zu 300 μl) gemischt, in der die Konzentration an Protein 1 mg/ml betrug und die Konzentration des neuen Detergenz das 10 fach seines CMC ausmachte. Die Absorption bei 320 nm wurde mit einem Zeitabstand von 20 Sekunden für 30 Minuten gemessen. Verdünnung: Die Proteinprobe wurde mit Puffer ohne Detergenz 10 fach verdünnt.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
66
0,2 % DDPO. Die Fraktionen in dem Durchflusspeak und Elutionspeak wurden mit Hilfe
eines SDS-Gel analysiert (Abb. 3.14.B). In der Durchflussfraktion war noch NirC zu
erkennen, was auf die limitierte Säulenkapazität zurückgeführt werden kann. Das eluierte
Protein war relativ sauber und wurde mittels einer Ultrazentrifugationsmembran mit einer
Ausschlussgröße von 50 kDa und Zentrifugation (3000 x g, 4 °C) für weitere
Kristallisationsversuche ankonzentriert.
Manual Run 6:10_UV Manual Run 6:10_Conc Manual Run 6:10_Fractions
0
200
400
600
800
1000
mAu
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 min1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Durchfluss
NirC_DDPO
Abb. 3.14.A Chromatogramm des Detergenzaustausches (LDAO→DDPO) mittels Affinitätschromatographie. Das mit LDAO gereinigte NirC wurde auf eine 1 ml HisTrap FF Säule geladen. Die Säule wurde mit etwa 35 ml DDPO-haltigen Puffer gewaschen und anschließend über einen linearen Gradienten von 0-100% Elutionspuffer eluiert (100% Elutionspuffer entsprach 500 mM Imidazol). Dabei war ein scharfer Peak zu erkennen.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
67
M 1 2 3 4 5
25 kDa
45 kDa
In der Abb. 3.15.A ist das Chromatogramm des Austausches (D10M→D9M) gezeigt.
Manual Run 9:1_UV Manual Run 9:1_Conc Manual Run 9:1_Fractions
0
50
100
150
mAu
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 min
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Durchfluss
NirC_D9M
100 mMImidazol
120 mMImidazol
Abb. 3.15.A Chromatogramm des Detergenzaustausches (D10M→D9M) mittels Affinitätschromatographie. Das mit D10M gereinigte NirC wurde auf einer 1 ml HisTrap FF Säule geladen. Die Säule wurde mit etwa 20 ml D9M-haltigem Puffer gewaschen, und NirC anschließend mit einem linearen Gradienten von 24-100% Elutionspuffer eluiert (100% Elutionspuffer entsprach 500 mM Imidazol). Dabei war ein scharfer Peak zu erkennen.
Abb. 3.14.B SDS-PAGE des Detergenzaustausches (LDAO→DDPO). M: Protein Molecular Weight Marker von Fermentas. 1: Durchflussfraktion, 2-5: Elutionsfraktionen.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
68
Der Elutionspuffer besteht aus: 50 mM HEPES pH 8,0, 500 mM NaCl, 10 % Glycerol, 0,6
% D9M. Die Analyse der Fraktionen mittels eines SDS-Gels zeigte, dass das eluierte
Protein ebenfalls sauber war (Abb. 3.15.B). Daher wurde es mit Hilfe einer
Ultrazentrifugationsmembran mit einer Ausschlussgröße von 30 kDa auf ca. 10 mg/ml
ankonzentriert.
M 1 2 3 4 5 6
45 kDa
25 kDa
Die Austausche von D10M→D11M und D10M→DDM wurden ebenfalls durchgeführt
(Daten hier nicht gezeigt), wobei der Austausch noch über DC zu verifizieren ist.
Abb. 3.15.B SDS-PAGE des Detergenzaustausches (LDAO→DDPO). M: Protein Molecular Weight Marker von Fermentas. 1: Durchflussfraktion, 2-6: Elutionsfraktionen.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
69
3.9 Kristallisation von NirC
Die Kristallisationsversuche fanden unter den in 2.7 angegebenen Bedingungen statt.
Kristalle von NirC/LDAO wurden zuerst einige Tage nach Pipettierung in einigen initialen
Bedingungen gefunden.
a). b). c).
Sie waren jedoch entweder zu klein (Abb. 3.16.b und c) oder nicht regelmäßig (Abb.
3.16.a). Durch zur Optimierung des pH-Werts, der Konzentration an Präzipitant und der
Ionenstärke konnten größere (Abb. 3.17.b) bzw. plattenförmige Kristalle (Abb. 3.17.a)
gefunden werden.
a). b).
Die plattenförmigen Kristalle konnten durch Mikroseeding hinsichtlich ihres
dreidimensionalen Wachstums verbessert werden, jedoch waren sie für
Röntgenbeugungsexperimente immer noch zu klein bzw. nicht regelmäßig angeordnet.
Abb. 3.16 Kristalle von NirC/LDAO in drei initialen Bedingungen. a): 0,2 M Imidazolmalat pH 5,5, 33% PEG 600, 4°C; b): 0,1 M MES pH 6,5, 2,4 M Diammoniumsulfat, 20 °C; c) 0,1 M Natriumcitrat pH 3,5, 0,1 M Lithiumsulfat, 30% PEG 400. 4 °C. Proteinkonzentration: 10 mg/ml.
Abb. 3.17 Kristalle von NirC_LDAO in Finescreens. a): 0,1 M Natriumcitrat pH 4,5, 0,12 M Lithiumsulfat, 28% PEG 400; b): 0,2 M Imidazolmalat pH 5,5, 35% PEG 600. Proteinkonzentration: 10 mg/ml, 4 °C.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
70
Daher wurden weitere Additive und Detergenzien ausprobiert. Um die kinetischen
Eigenschaften der Kristallisation zu ändern, wurde das Reservoir mit Paraffinöl
überschichtet. Die besten Kristalle konnten nach Zugabe von vier Additiven (Additive 1:
10 % Pluronic F68, Additive 2: 4 mM Zwittergent 3-14, Additive 3: 1,1 mM C12E8,
Additive 4: 60 mM NaNO2) und 100 μl Paraffinöl im Reservoir beobachtet werden (Abb.
3.18).
Für das mit anderen Detergenzien gereinigte NirC wurden die oben genannten
Kristallisationsbedingungen wiederholt. Mit Ausnahme von NirC/DDPO konnten überall
Kristalle gefunden werden. Es wurde ebenfalls Finescreens, Mikroseeding, Additive
Screens und Detergent Screens durchgeführt, die bisher besten Kristalle sind in Abb. 3.19
dargestellt. Die Kristalle von NirC_D10M waren zwar dreidimensional und groß, jedoch
war ihre Oberfläche unregelmäßig, was darauf hindeutet, dass die Proteinmoleküle
innerhalb des Kristalls nicht perfekt angeordnet waren.
Die bisher besten Bedingungen sind in Tabelle 3.2 zusammengefasst:
Tabelle 3.2 Kristallisationsbedingungen.
Protein Detergenz Puffer Präzipitant Salz Additive 1 Additive 2 Bemerkung
NirC LDAO 0,1 M NaCitrat, pH 4,5
28 % PEG 400 0,12 M Li2SO4
10 % Pluronic F68
1.1 mM C12E8
100 μl Paraffinöl
in Reservoir
NirC DDM 0,1 M NaCitrat, pH 4,9
36 % PEG 400 0,12 M Li2SO4
NirC D11M 0,1 M NaCitrat, pH 4,4
33 % PEG 400 0,12 M Li2SO4
NirC D10M 0,1 M NaCitrat, pH 4,3
35 % PEG 400 0,12 M Li2SO4
15 % 1,2,3-Heptantriol
NirC D9M 0,1 M NaCitrat, pH 3,9
40 % PEG 400 0,12 M Li2SO4
Abb. 3.18 Kristall von NirC_LDAO. Die Bedingungen im Reservoir: 0,1 M Natriumcitrat pH 4,5, 0,12 M Lithiumsulfat, 28% PEG 400, Additive 1: 10% Pluronic F68, Additive 2: 4 mM Zwittergent 3-14, Additive 3: 1,1 mM C12E8, Additive 4: 60 mM NaNO2. 100 μl Paraffin wurde als Zusatz in Reservoir verwendet, um die Kristallisationsgeschwindigkeit zu verringern. Proteinkonzentration: 10 mg/ml, 4 °C.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
71
a). b). c).
d). e). f).
3.10 Röntgenbeugungsexperimente
Ungefähr fünfzig Kristalle von NirC_LDAO bzw. NirC_D10M wurden getestet. Sie
streuten jedoch entweder nicht oder nur sehr schlecht, daher wurden drei
Kristallmanipulationen probiert: „crystal annealing“, Kristalldehydration und „cross-link“.
Sie erbrachten aber keine Verbesserung, so dass bis jetzt die Auflösungsgrenze bei ca. 8 Å
(NirC_D10M) liegt.
Abb. 3.19 Kristalle von NirC_D10M (a, b, c), NirC_D11M (d), NirC_DDM (e), NirC_D9M (f). Kristallisationsbedingungen: a): 0,1 M Natriumcitrat pH 4,3, 0,12 M Lithiumsulfat, 35% PEG 400, Additive: FOS-Choline-12; b): 0,1 M Natriumcitrat pH 4,3, 0,12 M Lithiumsulfat, 34% PEG 400, nach Mikroseeding; c): 0,05 M HEPES, pH 8,0, 25% PEG 4000, 10% MPD; d): 0,1 M Natriumcitrat, pH 4,4, 0,12 M Lithiumsulfat, 33% PEG 400; e): 0,1 M Natriumcitrat, pH 4,9, 0,12 M Lithiumsulfat, 36% PEG 400;f): 0,1 M Natriumcitrat pH 3,9, 0,12 M Lithiumsulfat 40% PEG 400. Proteinkonzentration: 10 mg/ml, 4 °C.
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
72
3.11 ITC (engl. Isothermal Titration Calorimetry)
Das ITC-Experiment wurde bei 20 °C bei unterschiedlichen pH Werten (pH 3, 5, 6, 8)
sowie Protein- und Ligandenkonzentration durchgeführt. Als Protein wurden NirC/LDAO
und NirC/D10M getestet und als Liganden Natriumnitrit, Natriumnitrat und
Natriumformiat getestet (Tabelle 3.3). Eine Bindung zwischen Protein und Ligand war
jedoch bei allen Versuchen nicht zu beobachten. In der Abb. 3.20 ist ein Beispiel gezeigt.
Die Puffer bestand aus 20 mM MES pH 6, 300 mM NaCl, 10 % Glycerol und 0,1 %
LDAO. Die Konzentration an Protein (NirC_LDAO) und Ligand (NaNO2) betrug jeweils
0,116 mM bzw. 30 mM. Nach Berücksichtigung des Einflusses einer Puffer-Puffer-
Titration konnte keine sigmoidale Kurve detektiert werden. Die lineare Messkurve war
wahrscheinlich eine Folge der Proteinverdünnungsenthalpie.
Tabelle 3.3 Die getesteten Bedingungen für ITC.
Versuch Detergenz pH CProtein (mM) Ligand CLigand (mM)
1 LDAO 8 0,005 Nitrit 0,15
2 LDAO 8 0,05 Nitrit 1,25
3 LDAO 8 0,05 Nitrit 2,5
4 LDAO 6 0,037 Nitrit 1,5
5 LDAO 6 0,116 Nitrit 30
6 LDAO 5 0,108 Nitrit 5
7 LDAO 3 0,13 Nitrit 10
8 LDAO 8 0,125 Nitrat 10
9 LDAO 8 0,125 Formiate 3,75
10 D10M 8 0,063 Nitrit 5
EERRGGEEBBNNIISSSSEE
73
Abb. 3.20 ITC-Experiment. Protein: NirC_LDAO (0,116 mM), Ligand: NaNO2 (30 mM), Puffer: 20 mM MES pH 6, 300 mM NaCl, 10% Glycerol und 0,1% LDAO. Der Versuch wurde bei 20 °C durchgeführt. Es konnte keine Bindung beobachtet werden. Die lineare Messkurve spiegelt wahrscheinlich die exothermische Proteinverdünnungsenthalpie wider.
DDIISSKKUUSSSSIIOONN
74
4 DISKUSSION
4.1 Solubilisierung und Aufreinigungen von NirC
NirC war zu Anfang mit DDM solubilisiert und aufgereinigt worden. Aber die
Solubilisierungseffizienz von DDM war nicht hoch und das Protein NirC/DDM war
ebenfalls nicht sehr stabil, da es einige Tage nach der Reinigung teilweise präzipitierte.
Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass DDM ein nichtionisches Detergenz und
daher relativ milder ist.
Anhand der Ergebnisse der Aggregationstests wurde LDAO für die weiter führenden
Experimente gewählt. LDAO ist zwitterionisch und stärker als DDM. Das Detergenz
funktionierte sowohl bei der Solubilisierung als auch bei der Aufreinigung des NirC sehr
effizient. Die Ausbeute war sehr hoch (2,7 mg NirC/ 1 g Zellen) und die Proteine waren
nach HisTrap Reinigung schon sehr sauber. Außerdem waren NirC/LDAO für lange Zeit
stabil.
Daraus ergibt sich jedoch ein Problem: LDAO ist ein zwitterionisches Detergenz und hat
daher eine hohe Affinität zum Membranprotein, was zur starken Delipidierung führen kann
(le Maire et al., 2000). Anhand des Ergebnisses der Phospholipidanalyse (3.6.2) beträgt das
Phospholipid-Protein-Verhältnis in dem Protein-Detergenz-Komplex ca. 1:13,6 (Mol:Mol).
Dieser Wert ist im Vergleich zu dem des Glycerol-3-Phosphat-Tranporters (41,1:1 nach
Affinitätschromatographie), welcher mit DDM aufgereinigt wurde, sehr niedrig.
Die Effekte der Membranprotein-Lipid-Interaktion sind unterschiedlich. Sie sind
möglicherweise notwendig für die Stabilität des Membranproteins. Sie können als
Chaperonin bei der Insertion und Faltung funktionieren. Sie können sich ebenfalls direkt
am molekularen Funktionsmechanismus beteiligen, wie etwa der enzymatischen Aktivität
oder dem Transportprozess (Palsdottir et al., 2004).
Die Wechselwirkungen zwischen Membranprotein und Lipid beruhen auf zwei Ursachen.
Die erste, auch die stärkste und häufigste ist die Wechselwirkung der negativ geladenen
Kopfgruppe des Lipids mit der positiv geladenen Seitenkette von Aminosäuren an der
Proteinoberfläche. Als zweites kann die hydrophobe Lipidseitenkette fest in einer Furche
DDIISSKKUUSSSSIIOONN
75
der Proteinoberfläche binden und dort durch die van-der-Waals-Kräfte stabilisiert werden
(Palsdottir et al., 2004).
Es ist bekannt, dass eine zu starke Delipidierung zur Inaktivierung des Proteins führen
kann, wie z.B. beim Cytochrom-bc1-Komplex (Schagger et al., 1990) und der Na+,K+-
ATPase (Esmann et al., 1984). Außerdem benötigen einige Membranproteinkristalle die
Phospholipide für bessere Beugungsqualität wie z.B. im Fall der Ca2+-ATPase (Toyoshima
et al., 2000) und des Lichtsammelkomplexes in Pflanzen (Nussberger et al., 1993). Daher
kann die starke Delipidierung des NirC/LDAO in dieser Arbeit möglichweise für die
schlechte Beugungsqualität des Kristalls und die nicht erfolgreichen ITC-Experimente
verantwortlich sein.
Einige Maßnahmen können getroffen werden, um eine starke Delipidierung zu vermeiden.
Zuerst können mildere Detergenzien anstelle von LDAO zur Solubilisierung verwendet
werden. Nichtionische Detergenzien sind generell von allen drei Typen am mildesten. Es
wurde jedoch gezeigt, dass DDM für NirC nicht geeignet ist und kein anderes
nichtionisches Detergenz in unserem Labor in großer Menge vorliegt. Deshalb könnte eine
Detergenzmischung aus z.B. LDAO und DDM eingesetzt werden. Damit wird
möglicherweise ein Optimum von Solubilisierung und minimaler Delipidierung erreicht
(Esmann, 1983).
Zweitens kann man versuchen, möglichst wenig Detergenzien bei der Solubilisierung zu
benutzen. In der Abb. 4.1 wird der Solubilisierungsprozess biologischer Membran mit
Protein dargestellt. Die Detergenzien werden schrittweise zu einer Membransuspension
hinzugefügt. Nach jedem Schritt wird die Suspension bei 100,000 x g zentrifugiert. Die
Masse des Sediments und die Konzentration an Protein und Lipid im Überstand wird
gemessen und somit der Solubilisierungsgrad von Protein und Lipid bestimmt. Dieser
Prozess kann in drei Phasen eingeteilt werden. In der Phase I findet noch keine
Solubilisierung des Proteins statt, so dass bei einer Zentrifugation bei 100,000 x g für 1 h
die Membranen nahezu vollständig sedimentiert würden. Diese Phase entspricht ebenfalls
der Phase a in der Abb. 1.7: Die Detergenzmoleküle dringen zunehmend in die
Lipiddoppelschicht ein, aber die Lipide überwiegen noch. In der Phase II werden die
Membranproteine und Lipide kontinuierlich mit dem Detergenz solubilisiert. Der in dieser
Phase entstehende Protein-Detergent-Komplex enthält noch relativ viele Lipide. In der
Phase III werden sowohl die Lipide als auch die Membranproteine vollständig solubilisiert
und die vorher noch im PDK vorhandenen Lipide werden schrittweise durch Detergenz
ersetzt. Am Ende werden die Proteine fast ausschließlich von Detergenzien umhüllt.
DDIISSKKUUSSSSIIOONN
76
Anhand des Diagramms sollen die Proteine kurz vor dem Übergangsbereich von Phase II
zur Phase III solubilisiert werden. Damit können die Membranproteine effizient gelöst
werden, ohne dass sie gleichzeitig zu stark delipidiert werden (Kragh-Hansen et al., 1998).
Als dritte Möglichkeit können die Phopholipide auch bei der Aufreinigung des Proteins
eingesetzt werden (Causes et al., 1997). Dafür muss zuerst analysiert werden, welche
Phospholipide in den Membranen vorhanden sind. So können bestimmte Phospholipide
gezielt zugesetzt werden. Anhand der Ergebnisse aus Abschnitt 3.6.2, liegen drei
verschiedene Phospholipide in der Membran von E. coli C43 vor, bei denen NirC
überexprimiert wird: Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylglycerin (PG) und
Cardiolipin (CL).
Abb. 4.1 Ein schematischer Solubilisierungsprozess. Die Phase I ist charakteristisch durch eine nahezu vollständige Sedimentierung von Membranen nach einer Zentrifugation bei 100,000 x g für 1 h. In der Phase II werden Membranproteine und Lipide kontinuierlich solubilisiert. Der in dieser Phase entstehende Protein-Detergent-Komplex enthält noch relativ viele Lipide. In der Phase III werden sowohl Lipide als auch Membranproteine vollständig solubilisiert und die vorher noch im PDK vorhandenen Lipide werden schrittweise durch Detergenz ersetzt. Am Ende werden die Proteine fast ausschließlich von Detergenzien umhüllt (Kragh-Hansen et al., 1998).
DDIISSKKUUSSSSIIOONN
77
Ein anderes Problem während der Aufreinigung des Proteins war die Größe von NirC. Die
theoretische molekulare Größe von NirC ist 28.562 kDa. Deshalb wurde am Anfang eine
Superdex 75 Säule, die für die Trennung von Proteinen mit einer molekularen Größe von
3-70 kDa effizient ist, für die Größenausschlusschromatographie verwendet. Hier fand sich
NirC aber immer im Ausschlussvolumen. Dies kann darauf zurückführen sein, dass die am
Protein gebundenen Detergenzmoleküle sowie die möglichen Multimerformen des Proteins
vernachlässigt wurden. Aufgrund der Tatsache, dass NirC im SDS-Gel in vier Banden
(Monomer, Dimer, Trimer, Tetramer) auftrat und alle Proteine nach der Zertrifugation
mittels einer Zentrifugationsmembran mit einer Ausschlussgröße von 50 kDa
aufkonzentriert werden konnten, wird vermutet, dass NirC als Tetramer vorliegt. Diese
Vermutung wurde durch eine Gelfiltration mit einer Superdex 200 Säule bestätigt, welche
Proteine mit einer Größe von 10-600 kDa effektiv trennen kann.
4.2 Bestimmung der Detergenz-/Phospholipidzusammensetzung im PDK
Die qualitative und quantitative Analyse der Zusammensetzung von Detergenz und
Phospholipid im Protein-Detergenz-Komplex liefert wichtige Informationen über
Delipidierung. Wegen des Zeitlimits wurde jedoch die Analyse nur auf das mit LDAO
aufgereinigte NirC eingegangen. Weitere Experimente sollen mit Protein ausgeführt
werden, das mit anderem Detergenz aufgereinigt worden ist. Ein Vergleich des
Lipidgehalts von Protein vor und nach der Gelfiltration sollte ebenfalls durchgeführt
werden. Damit könnte die Delipidierungsfähigkeit der Gelfiltration bzw. verschiedener
Detergenzien verglichen werden (Lemieux et al., 2003).
DDIISSKKUUSSSSIIOONN
78
4.3 Kristallisation
Die Kristallisation ist eine der entscheidenden und auch schwierigsten Schritte in der
Ermittlung einer dreidimensionalen Proteinstruktur. Bei Membranproteinen tritt ein
Kristall normalerweise in der Nähe der LLPS (engl. liquid-liquid phase separation) auf, bei
der sich die wässrige Phase und die Detergenzphase voneinander trennen. Die LLPS wird
wiederum durch mehrere Faktoren beeinflusst, wobei der Typ des Detergenz, die
Präzipitanzkonzentration, die Temperatur und eventuell ein zusätzliches Amphiphil zu den
wichtigsten gezählt werden (Tanaka et al., 2003; Rosenow et al., 2000; Yu et al., 2000).
Detergenz vermittelt die Interaktion im Protein-Detergenz-Komplex (Abb. 4.2). In dieser
Arbeit wurden insgesamt 6 verschiedene Detergenzien getestet, D9M, D10M, D11M,
DDPO und LDAO. D9M, D10M, D11M sind nichtionische Detergenzien und haben alle
einen Maltopyranosid-Kopf, aber unterschiedlich lange Alkylketten. DDPO ist ein
nichtionisches Phosphinoxid und LDAO ist ein zwitterionisches Aminoxid (Tabelle 1.3).
Es wurde Kristalle bei allen Dergentien außer DDPO gefunden. Die besten
Kristallisationsbedingungen sowie die Gestalt des Kristalls waren jedoch leicht
unterschiedlich, was den Einfluss des Detergenz bei der Kristallisation widerspiegelt. Bis
jetzt sind die Kristalle aus NirC/LDAO am besten gewachsen. Sie sind vergleichsweise
groß und dreidimensional und haben typisch eine oktaedrische Gestalt (Abb. 3.18). Leider
streuten sie sehr schlecht (≥ 18 Å). Bei NirC/D10M wurden auch viele große
dreidimensionale Kristalle produziert. Sie waren hexagonal und relativ dünn. Ihre
Oberflächen waren unregelmäßig (Abb. 3.19), was vermutlich darauf hindeutet, dass die
Proteinmoleküle im Kristall nicht perfekt angeordnet waren. Solche Kristalle streuten
maximal bis ca. 8 Å. Einige Kristallmanipulationen, wie z.B. „crystal annealing“,
Kristalldehydration und „cross-link“ wurden durchgeführt. Sie erbrachten jedoch keine
Verbesserung. Vor kurzem wurden Kristalle bei NirC/D9M, NirC/D11M und NirC/DDM
(Abb. 3.19) beobachtet. Sie hatten die gleiche Gestalt wie Kristalle aus dem NirC/D10M,
aber waren dicker und ihre Oberflächen waren ebenfalls glatter im Vergleich zu
NirC/D10M. Sie sind aber noch zu klein für Beugungsexperimente.
DDIISSKKUUSSSSIIOONN
79
Es wurde beobachtet, dass das Präzipitanz PEG 400 bei der Löslichkeit des Proteins
NirC/LDAO eine interessante Rolle spielt. Das Auftreten von Präzipitat nimmt deutlich zu,
wenn die Konzentration an PEG 400 höher als 32 % ist, da PEG 400 die Löslichkeit des
Proteins verringern kann. Ist Jedoch die Konzentration niedriger als 28 %, fällt das Protein
wieder aus, was schwieriger zu erklären ist. Vielleicht kann die OH-Gruppe der PEG-
Moleküle den Protein-Detergenz-Komplex mittels polarer Wechselwirkungen stabilisieren,
so dass eine bestimmte Konzentration an PEG benötigt wird. Dieses Phänomen wurde
jedoch bei der Kristallisation von NirC mit D9M, D10M, D11M oder DDM nicht
beobachtet. Diese Proteinsolubilisate sind generell stabiler als NirC/LDAO bei höherer
Präzipitanzkonzentration (34 % - 40 % PEG 400).
Für die Verbesserung des Kristalls sollen vor allem andere Detergenzien oder
Detergenzmischungen getestet werden. Eine Mischung von Detergenzien mit
unterschiedlicher Kettenlänge hat den Vorteil, dass sie die reale Lipidumgebung innerhalb
der Membrandoppelschicht besser simulieren kann (Esmann 1983). Als nächstes soll das
Protein ohne eine starke Delipidierung ausprobiert werden. Der für die
Affinitätschromatographie eingesetzte HisTag sollte ebenfalls nicht vernachlässigt werden.
Acht Aminosäuren (sechs Histidin und zwei Aminosäuren aus der Schnittstelle von XhoI)
werden am C-Terminus des NirC eingefügt, was möglicherweise die Proteine instabil
macht. Deshalb kann eine Schnittstelle für eine Protease vor dem HisTag eingebaut werden,
so dass der HisTag nach der Aufreinigung des Proteins entfernt werden kann. Die TEV-
Abb. 4.2 Die durch Detergenz vermittle Interaktion zwischen Membranproteinmoleküle innerhalb Kristalle. a): Typ I 3D Kristall; b): Typ II 3D Kristall (Ostermeier et al., 1997).
DDIISSKKUUSSSSIIOONN
80
Protease passt perfekt zu NirC, da ihre Erkennungssequenz Gly↓Gln-Phe-Tyr-Leu-Asn-
Glu ist und ein Glycin genau die letzte Aminosäure von NirC ist.
Die Beugungsqualität des Kristalls hängt darüberhinaus von der Kryobedingung ab. In
dieser Arbeit wurde dieselbe Lösung aus dem Reservoir, jedoch mit 35 % PEG 400 als
Kryobedingung, benutzt. Hirebei wurde häufig beobachtet, dass sich entweder die Kristalle
lösten oder die Oberflächen der Kristalle rauher wurden. Deshalb müssen bessere
Kryobedingungen gefunden werden.
4.4 ITC
Bei dem ITC-Experiment wurden insgesamt zehn verschiedene Bedingungen (Tabelle 3.3)
getestet. Aber keine richtige Bindung wurde beobachtet. Bei fast allen Fällen fand sich ein
linearer Verlauf (Abb. 3.20). Dies sollte vielmehr ein Ergebnis der Verdünnung des
Proteins bzw. Ligands sein. Da die Experimente in einem großen Bereich von
Bedingungen durchgeführt wurden, wird vermutet, dass die Bindung noch von anderen
Faktoren abhängt, als bisher getestet wurde.
Eine Möglichkeit ist, dass die Proteine in einer durch Detergenz inaktivierten Form
aufgereinigt wurden. Genau wie in Abschnitt 4.2 erläutet, führt eine zu starke
Delipidierung häufig zur Inaktivierung eines Membranproteins. Mit Blick auf die
Ergebnisse in Abschnitt 3.6.2 wurde NirC/LDAO wahrscheinlich durch Delipidierung
inaktiviert. D10M ist ein nichtionisches Detergenz und ist eigentlich milder als LDAO.
Aber das NirC/D10M wurde durch den Detergenzaustausch aus NirC/LDAO erhalten,
deshalb sollte es wahrscheinlich ähnlich stark delipidiert worden sein. Um diese
Deaktivierung zu vermeiden, könnte vor allem das weniger delipidierte Protein verwendet
werden. Als eine alternative Möglichkeit können andere Detergenzien als Zusätze benutzt
werden. C12E10 scheint hier eine gute Wahl zu sein, da es eine Mischung aus
Polyoxyethylen mit unterschiedlichen Oxyethylenkettenlängen ist. Deshalb sollte es die
essentiellen Phospholipide teilweise ersetzen. In einigen Fällen konnte die enzymatische
Aktivität dadurch fast vollständig wiederhergesetzt werden. Zum Beispiel wird bei der
durch C12E8 solubilisierten Na+,K+-ATPase irreversible inaktivierung beobachtet, wenn
das C12E8/Protein-Verhältnis (mg/mg) höher als vier ist. Wenn aber 1 mg/ml C12E10
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81
eingesetzt wird, bleibt die Aktivität bei ca. 90-95 %, selbst wenn die Konzentration an
Protein in der Lösung 0,35 mg/ml, C12E8 2 mg/ml beträgt (Esmann, 1983).
Da die vermutliche Funktion von NirC im Nitrittransport liegt, ist es möglich, dass es in
zwei Konformationen auftritt. Die erste Form sollte eine höhere Affinität zu Nitrit bzw.
HNO2, so dass Nitrit bzw. HNO2 an der periplasmatischen Seite der Cytoplasmamembran
binden kann. Die zweite Form sollte im Gegensatz dazu eine niedrigere Affinität zu Nitrit
bzw. HNO2 haben, so dass das Substrat auf der cytoplasmatischen Seite wieder ins
Medium freigesetzt werden kann. Daher kann NirC, wenn es in der zweiten Form
aufgereinigt wird, seine Substrate nicht binden. In diesem Fall ist die Inaktivierung vom
Detergenz unabhängig und kann deshalb nicht vermieden werden.
ZZUUSSAAMMMMEENNFFAASSSSUUNNGG
82
5 ZUSAMMENFASSUNG
Denitrifikation ist ein anaerober Prozess, bei dem Nitrat anstelle von Sauerstoff als
terminaler Elektronenakzeptor fungiert. Der Nitrit/ Protonen-Symporter NirC ist an diesem
Prozess beteiligt. Er ist ein Membranprotein mit sechs Transmembranhelices und gehört
zur FNT-Familie (Formiat/Nitrat-Transporter). Das durch NirC importierte Nitrit wird mit
Hilfe der cytoplasmatischen Nitritreduktase NirB zu Ammoniak reduziert, welches die
wichtigste Sticktsoffquelle für die Biosynthese von Aminosäuren und Nukleinsäuren
darstellt.
Um den Transportmechanismus aufzuklären, wurde in dieser Diplomarbeit das Gen nirC
aus E. coli mit PCR amplifiziert und dann in den Expressionsvektor pET-21a(+) kloniert.
NirC wurde in E. coli C43 überexpremiert und anschließend mit LDAO solubilisiert. Die
Aufreinigung erfolgte mittels Affinitätschromatographie und Gelfiltration. Mit dem reinen
NirC/LDAO wurden Detergenzaustausche (LDAO→DDPO, LDAO→D10M,
D10M→D9M, D10M→D11M, D10M→DDM) durchgeführt. Kristalle wurden überall bei
all diesen Protein-Detergenz-Komplexen mit Ausnahme von NirC/DDPO gefunden. Sie
beugten jedoch nicht ausreichend für die Strukturaufklärung.
Zur Charakterisierung der Bindungsaffinität (Ka), der Bindungsenthalpie (ΔH) und der
Bindungsstöchiometrie (n) von NirC mit seinem Liganden Nitrit wurden ITC-Experimente
durchgeführt. Eine Bindung von Ligand und Protein konnte nicht nachgewiesen werden,
da das Protein möglicherweise in einer inaktivierten Form aufgereinigt wurde.
Zusätzlich wurde die Zusammensetzung des Detergenz bzw. Phospholipids im Protein-
Detergenz-Komplex qualitativ und quantitativ bestimmt, was die Informationen für die
Verbesserung der Kristallisation bzw. der ITC-Experimente in der Zukunft liefert.
LLIITTEERRAATTUURRVVEERRZZEEIICCHHNNIISS
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AANNHHAANNGG
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7 ANHANG
7.1 Abkürzungsverzeichnis
Å Angstrøm = 10-10 m (keine SI-Einheit)
ε molarer Extinktionskoeffizient
Amp Ampicillin
APS Ammoniumpersulfat
BCA 2,2'-Bichinolin-4,4'-dicarbonsäure Dikaliumsalz
bp Basenpaare (base pairs)
BCA Bicinchroninsäure
BSA Rinderserum-Albumin (bovine serum albumin)
C12E8 Polyoxyethylene(8)dodecyl ether
C12E10 Polyoxyethylene(10)dodecyl ether
CIAP calf intestine alkaline phosphatase
CL Cardiolipin
D9M n-Nonyl-ß-D-Maltopyranosid
D10M n-Decyl-ß-D-Maltopyranosid
D11M n-Undecyl-ß-D-Maltopyranosid
Da Dalton [g/mol]
DDM n-Dodecyl-ß-D-Maltopyranosid
DDPO Dimethyl-Decylphosphin
DC Dünnschichtchromatographie
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleinsäure
GC Gaschromatographie
HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
His-Tag Histidin Marker
AANNHHAANNGG
93
IPTG Iso-propylthiogalactosid
ITC Isothermal Titration Calorimetry
Kan Kanamycin
kDa KiloDalton, 1 kDa = 1000 g·mol-1
LB Luria Bertani
LDAO n-Dodecyl-N,N-Dimethylamin-N-Oxid
M mol/L
MS Massenspektrometrie
MW Molekulargewicht [g/mol]
OD Optische Dichte
PA Phosphatidyl Acid
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PC Phosphatidylcholin
PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
PDK Protein-Detergenz-Komplex
PE Phosphatidylethanolamin
PEG Polyethylenglykol
PG Phosphatidylglycerol
PI Phosphatidylinositol
SDS Natriumdodecylsulfat
TEMED N, N, N´, N´ Tetramethylethylendiamin
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
UV Ultraviolett
v/v Volumenprozent (volume per volume)
w/v Gewichtsprozent (weight per volume)
AANNHHAANNGG
94
7.2 Basensequenz von NirC
1 atgtttacag acactattaa taagtgtgcg gctaacgctg cgcgcattgc acgcctgtcg
61 gcaaataacc cgctcggctt ttgggtcagc tccgccatgg cgggcgcgta tgtgggtctt
121 gggatcatcc tgattttcac gctcggtaat ttgctcgatc catccgtacg ccctttggtg
181 atgggcgcga cctttggtat cgccttaacg ctggtgatta tcgccggttc tgaactgttc
241 accggacaca ccatgttcct cacctttggg gtaaaagcgg gcagcatcag ccacgggcaa
301 atgtgggcaa tcctgccgca aacctggctg ggtaacctgg tcggttccgt cttcgttgcc
361 atgctctata gctggggcgg cggtagcctg ctgccggtag ataccagcat cgttcactcc
421 gtcgcgctgg ctaaaaccac tgcaccggca atggtactct tcttcaaagg tgcattgtgt
481 aactggctgg tttgcctggc aatctggatg gcgctgcgca ctgaaggggc ggcgaaattt
541 atcgctatct ggtggtgtct gctggcattt atcgcgtccg gctacgagca ctctatcgct
601 aacatgacgc tgttcgcgct ctcctggttc ggcaaccaca gcgaagccta cacgctggcg
661 ggtattggtc ataacctgct gtgggtgacg ctgggtaata ctttatcagg tgccgtattc
721 atgggattgg gttattggta tgctacgccg aaagcgaatc gtccggttgc ggacaaattt
781 aatcaaactg aaacggctgc cggttaa
7.3 Aminosäuresequenz von NirC
1 mftdtinkca anaariarls annplgfwvs samagayvgl giiliftlgn lldpsvrplv
61 mgatfgialt lviiagself tghtmfltfg vkagsishgq mwailpqtwl gnlvgsvfva
121 mlyswgggsl lpvdtsivhs valakttapa mvlffkgalc nwlvclaiwm alrtegaakf
181 iaiwwcllaf iasgyehsia nmtlfalswf gnhseaytla gighnllwvt lgntlsgavf
241 mglgywyatp kanrpvadkf nqtetaag
DDAANNKKSSAAGGUUNNGG
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Ich danke herzlich:
Herrn Prof. Dr. Oliver Einsle für eine hochspannende Aufgabenstellung und
seine engagierte und lehrreiche Betreuung.
Herrn Prof. Dr. Ralf Ficner für die Übernahme des Korreferates.
Herrn Daniel Heitmann für die hervorragende Betreung und Diskussion im
Verlauf der Diplomarbeit.
Frau Dr. Susana Andrade für die hilfreiche Unterstützung.
den Mitgliedern der M’n’M-Gruppe: Andreas, Anja, Haitham, Maren, Peer
und Sarah für die äußerst angenehme Arbeitsumgebung und viele
beantwortete Fragen sowie allen weiteren Mitgliedern der Abteilung
molekulare Strukturbiologie für Hilfestellungen.
meinen Eltern für ihre Liebe und finanzielle Unterstützung.
Juan für alles
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