rechterhaltung und Funk-tionen der einzelnenMembranenstrukturenund ihrer Transportsys-teme in Zellen zu ver-stehen.

Alle biologischen Membranen besitzen eine gemeinsa-me Grundstruktur. Es ist eine Doppelschicht aus überhundert verschiedenen Lipiden. Die meisten Membran-lipide gehören zur Klasse der Phospholipide. Sie besit-zen einen hydrophilen (wasserliebenden) Kopf auseiner Phosphatgruppe und zwei hydrophobe (wasser-abweisende) Fettsäureketten. In wässrigen Lösungenformen diese Moleküle spontan eine bimolekulareSchicht, in der die Fettsäureketten der Lipide einenhydrophoben Kernbereich bilden und die hydrophilenKöpfe dem Wasser zugewandt sind. Zusätzlich sind inbiologischen Membranen Proteine eingelagert, dieeinen geregelten Transport durch diese Membranenermöglichen oder wichtige enzymatische Reaktionenkatalysieren.

Lipiddynamik in biologischen MembranenDie meisten Lipide und Membranproteine entstehenam endoplasmatischen Reticulum (ER), einem weitver-zweigten Membransystem, das sich durch das Cyto-plasma eukaryotischer (kerntragender) Zellen ziehtund einen einzigen Innenraum, das ER-Lumen,umschließt. Die verschiedenen Phospholipide werdendabei ausschließlich auf der cytoplasmatischen Seiteder ER-Membran produziert. Um ein gleichmäßigesWachstum der Lipiddoppelschicht zu gewährleisten,muss ein Teil der neu synthetisierten Lipide auch aufdie lumenale Hälfte der Membran verteilt werden. Einsolcher Seitenwechsel von Lipidmolekülen wird alsFlip-Flop bezeichnet und umfasst sowohl die Einwärts-bewegung (Flip) als auch die Auswärtsbewegung(Flop). Obwohl für die Bildung von Membranen uner-lässlich, ist eine Flip-Flop-Bewegung energetisch sehrungünstig, da die Lipide mit ihren polaren Kopfgruppendurch das hydrophobe Membraninnere wandern müs-sen. Zahlreiche Untersuchungen deuten darauf hin,dass dieser Wechsel durch membranständige Trans-portproteine vermittelt wird, die man als Flippasenbezeichnet. Obwohl im ER bisher keine Flippasen iden-tifiziert werden konnten, scheinen diese Proteine ohnedirekten Energieverbrauch schnell und gleichmäßig dieverschiedenen Phospholipide zwischen den Membran-hälften umzuverteilen.

Im Gegensatz zur ER-Membran sind in der Plasma-membran nahezu aller eukaryotischen Zellen die Phos-

pholipide überraschenderweise zwischen den Mem-branhälften nicht gleichverteilt. Besonders asymme-trisch ist die Anordnung des Phosphatidylserins: Die-ses Lipid ist ausschließlich auf der inneren, d.h. derdem Cytoplasma zugewandten Membranhälfte zu fin-den. Veränderungen in der asymmetrischen Verteilungkontrollieren zahlreiche physiologische Prozesse. So istder Verlust der Lipidasymmetrie und das damit ver-bundene Auftreten von Phosphatidylserin auf der Zell-oberfläche ein Merkmal alternder Zellen und dient derErkennung sowie Eliminierung dieser Zellen durchMakrophagen (Fresszellen). Für den Aufbau und Erhaltder asymmetrischen Lipidverteilung wird ein aktiverTransport von Lipiden durch spezifische energie-getriebene Flippasen verantwortlich gemacht. SolcheTransportproteine nutzen die Energie, die bei der Spal-tung der energiereichen Verbindung Adenosintriphos-phat (ATP) frei wird, um Lipide auf einer Seite derMembran anzureichern. Untersuchungen zur Chemore-sistenz von Tumorzellen führten zur Identifizierung vonATP-getriebenen Proteinen aus der Familie der ABC-Transporter, die einen auswärts gerichteten Transportvon Lipiden zur Zelloberfläche vermitteln. Für dieAnreicherung von Phosphatidylserin in der cytoplasma-tischen Plasmamembranhälfte wird dagegen die Akti-vität eines anderen Transportproteins angenommen.Es konnte bislang nicht eindeutig identifiziert werden.Mögliche Kandidaten gehören zu einer neuen Unter-gruppe von P-Typ ATPasen, einer Proteinfamilie, diebisher nur mit dem aktiven Transport von Ionen überbiologische Membranen in Verbindung gebracht wurde.

Viele Vertreter aus den Familien der ABC-Transporterund P-Typ ATPasen sind beim Menschen von medizini-scher Relevanz. So ist zum Beispiel ein Defekt in einem

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Zellen von Pflanzen, Tieren und Menschen verfügen über ein komplexes Systemverschiedener Membranen (Abb. 2). Durch die Plasmamembran wird eine Zelle vonihrer Umgebung abgegrenzt und ein kontinuierlicher Stoff- und Informationsaus-tausch ermöglicht. Intrazelluläre Membranen gliedern die Zelle in zahlreiche Kom-partimente. Ohne diese Unterteilung in einzelne Funktionsräume wäre die großeAnzahl der biochemischen Reaktionen und ein geordneter Stoffwechsel nicht mög-lich. Unsere Untersuchungen an der Bäckerhefe dienen dazu, die Bildung, Auf-

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LLB

IOPH

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Stefanie VehringNele Alder-BaerensUrsula MuschickThomas Pomorski

FLIP–FLOP DER LIPIDEAuf der Suche nach Lipidtransportern

und ihrer biologischen Funktion

Die Juniorprofessur »Zellbiophysik« stellt sich vor

Abb. 1Zellen der Hefe Saccharomyces cerevisiae wurden mit einergrün fluoreszierenden Lipidsonde inkubiert, um deren Aufnah-me in das Zellinnere zu untersuchen. Die Lipidsonde hat sichinsbesondere in den Mitochondrien der Zellen angereichert.Eine einzelne Zelle hat einen Durchmesser von etwa 10 µm.

ABC-Transporter (CFTR-Protein), welcher an der Auf-rechterhaltung des Chloridhaushalts in Lungenzellenbeteiligt ist, die Ursache für die Mukoviszidose. BeiPatienten mit einer erblichen Lipidstoffwechselstörung(intrahepatische Cholestase) scheint ein Mitglied derP-Typ ATPasen in seiner Funktion defekt zu sein.Dadurch kommt es zu Beeinträchtigungen in der Bil-dung von Gallenflüssigkeit durch die Leberzellen. EinFunktionsverlust eines anderen Vertreters aus dieserFamilie wird beim Menschen mit dem Angelman-Syn-drom in Verbindung gebracht, einem neurologischenGendefekt, der durch eine schwere geistige Behinde-rung gekennzeichnet ist. Wie die Defekte mit der ver-muteten biochemischen Funktion dieser Transportpro-teine in Verbindung stehen, ist bisher nicht bekannt.Ein weiteres hochaktuelles Problem ist die Resistenzvon Tumorzellen und Parasiten gegenüber Medikamen-ten, auch hier sind oft ABC-Transporter und P-TypATPasen beteiligt.

Lipidtransportern auf der SpurIn unserem Labor arbeiten wir deshalb mit Unterstüt-zung der Deutschen Forschungsgemeinschaft, desDAAD und der Schering Forschungsgesellschaft inten-siv an der Identifizierung und Charakterisierung vonlipidtransportierenden Proteinen. Enge Kooperationenbestehen mit der Arbeitsgruppe »Molekulare Biophy-sik« am Institut für Biologie der Humboldt-Universitätzu Berlin, mit dem Institut für Physiologische Chemieder Ruhr-Universität Bochum, mit der UniversitätUtrecht in den Niederlanden sowie dem Institut fürParasitologie und Biomedizin in Spanien. Durchgemeinsame Anstrengungen hoffen wir, die Ursachendieser Funktionsstörungen aufzuklären und deren bio-chemische Folgen besser zu verstehen.

Für unsere Untersuchungen wählten wir die BäckerhefeSaccharomyces cerevisiae. Dieser einzellige eukaryoti-sche Mikroorganismus ist ein bewährtes Modellsystemder zellulären Grundlagenforschung. Er entspricht inseinem Aufbau und in vielen grundlegenden zellulärenVorgängen den höheren Eukaryoten Pflanzen, Tierenund Menschen. Um den Lipidtransport über zelluläreMembranen messbar zu machen, verwenden wir u.a.von uns synthetisierte Lipidsonden, die in ihrem Grund-aufbau aus hydrophilem Kopf mit zwei hydrophobenFettsäureketten den natürlichen Phospholipiden ent-sprechen. Eine dieser Fettsäuren trägt jedoch zusätz-lich eine fluoreszierende (leuchtende) Gruppe, die eineLokalisierung und Verfolgung der Sonde erlaubt. NachZugabe dieser Lipidsonden zu Hefezellen lässt sich bei-spielsweise unter dem Mikroskop für Phosphatidylserineine schnelle Aufnahme und Anreicherung beobachten,die auf einem Transport über die Plasmamembran der

Zellen beruht (Abb. 1). Auf der Suche nach den verant-wortlichen Transportproteinen konzentrieren wir unsgegenwärtig auf die bereits erwähnte Untergruppe vonP-Typ ATPasen. Dabei konnten wir zwei Mitglieder inder Plasmamembran der Hefe identifizieren. Ihr geziel-tes Ausschalten verhindert die Aufnahme bestimmterfluoreszierenden Lipidsonden über die Membran. Die-ser Befund unterstützt unsere Vermutung, dass die bei-den P-Typ ATPasen als Lipidtransporter in der Plasma-membran der Hefe fungieren.

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Abb. 2Hefezellen besitzen bereitseine komplexe Unterteilung,wie sie im Prinzip auch inZellen von Pflanzen, Tierenund Menschen gefundenwird. Neben der Plasma-membran (PM) haben dieseOrganismen in ihrem Inne-ren weitere, durch eineMembranhülle vom übrigenZellraum abgegrenzte Kom-partimente, wie z.B. dasEndoplasmatische Retikulum(ER) (Bild oben). Die ver-schiedenen Membranenunterscheiden sich erheblichin der Zusammensetzungund Anordnung ihrer Lipide(Bild unten). Unterschied-liche Membranproteine ver-mitteln den Transport vonLipiden zwischen beidenMembranhälften und regu-lieren dadurch deren Vertei-lung.

Einblick in die physiologische FunktionWelche biologische Funktion könnte der gerichteteTransport von Lipiden in zellulären Membranen haben?Erste Hinweise erhielten wir aus Untersuchungen zurEndozytose, einem essenziellen Vorgang, der der Zelleermöglicht, große Moleküle aufzunehmen. Dabeikommt es zu einer Einstülpung eines kleinenAbschnitts der Plasmamembran und der Bildung einesintrazellulären membranbegrenzten Vesikels. Mit Hilfeeines Farbstoffes (FM4-64) konnten wir zeigen, dassdieser Vorgang in Zellen, denen die beiden ATPasen inder Plasmamembran fehlen, beeinträchtigt ist (Abb. 3).Dies weist auf eine Beteiligung der Transporter unddes aktiven Transports von Membranphospholipidenhin. Bei der Bildung eines der Endozytosevesikel istaufgrund der Membrankrümmung eine Flächenver-größerung der inneren Hälfte der Lipiddoppelschichterforderlich, die durch einen gerichteten Transport von

spezifischen Lipiden hergestellt werden kann. Im Hin-blick auf die kritische Funktion der ATPasen bei derBildung von Endozytosevesikeln ist es wahrscheinlich,dass die Aktivität dieser Proteine einer zellulärenRegulation unterliegt. Interessanterweise wurde vorkurzem ein weiteres Protein in der Hefe identifiziert,das am einwärts gerichteten Lipidtransport über derPlasmamembran beteiligt, jedoch kein aktiver Trans-porter ist. Wir vermuten, dass dieses Protein eineregulatorische Untereinheit der ATPasen darstellt.

Isolieren, reinigen und analysierenMittlerweile haben wir zwei weitere Mitglieder dieserP-Typ ATPasen in den Kompartimenten des Golgi-Kom-plexes lokalisiert. Dieses Kompartiment ist eine ArtZwischenstation im Vesikelverkehr zwischen dem ERund der Plasmamembran und könnte eine zentrale Rol-le im Aufbau der Lipidasymmetrie besitzen. Tatsächlichlassen erste experimentelle Ergebnisse daraufschließen, dass die Golgi-lokalisierten ATPasen an derRegulation der Lipidverteilung in diesem Kompartimentbeteiligt sind. Den endgültigen Beweis sollen Untersu-chungen an künstlich hergestellten Membranen liefern(Abb. 4). Dazu lösen wir zunächst mit Hilfe von Deter-genzien (synthetische Waschmittel) alle Proteine ausder biologischen Membran heraus. Einmal in Lösung,kann die ATPase gereinigt und anschließend in künstli-che Phospholipidmembranen eingebaut werden. Aufdiese Weise können Proteine einzeln untersucht unddamit deren Funktion eindeutig bestimmt werden. Die-se Strategie nutzen wir auch für die Identifizierung derFlippase(n) im ER. Beim Zellaufschluss zerfällt das ERin kleine, geschlossene als Mikrosomen bezeichneteVesikel. Aufgrund ihres Dichteunterschiedes können siedurch Zentrifugation von den anderen Zellbestandteilenabgetrennt werden. Kürzlich ist es uns gelungen, aussolchen Mikrosomen Proteinfraktionen anzureichern,

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Abb. 3Zellen der Hefe Saccharomy-ces cerevisiae wurden miteinem fluoreszierendenEndozytosemarker (FM4-64)angefärbt, um den Vesikel-transport in das Zellinnerezu untersuchen. Der Mutan-te fehlen, im Gegensatz zumWildtyp, zwei P-Typ ATPasenin der Plasmamembran.Unmittelbar nach der Mar-kierung befindet sich dieProbe ausschließlich in derPlasmamembran der Zellen.Nach einer Inkubation von 4 Stunden hat sich der Farb-stoff in Wildtyp-Zellen fastvollständig auf die Membrander Vakuole umverteilt,während in den Mutanten-Zellen noch ein beträcht-licher Anteil des Markers inder Plasmamembran lokali-siert ist. Balken, 10 µm.

Abb. 4Funktionsanalyse von Lipid-transportern. Die für denFlip-Flop verantwortlichenProteine werden aus der bio-logischen Membran heraus-gelöst und in ein Modellsys-tem aus einer künstlichenMembran gebracht (A), diefluoreszierende Lipidsonden(B) enthält. Durch selektiveZerstörung der Fluoreszenzin der äußeren Membran-hälfte ist es möglich, dieVerteilung dieser Lipidson-den zwischen den Membran-hälften zu ermitteln. Im Fal-le eines Flip-Flops ist einhöherer Fluoreszenz-Anteilzerstörbar (blaue Kurve inC) als die zu erwartenden50% (schwarze Kurve) einergleichmäßig markiertenMembran.

die nach Einbau in reine Phospholipidmembraneneinen schnellen Flip-Flop von Lipiden katalysieren.Damit sind die Voraussetzungen für eine weitere pro-teinchemische Anreicherung und Identifizierung der ERFlippase(n) gegeben.

AusblickUnsere Hefestämme setzen wir auch bei der Suchenach weiteren Lipidtransportern anderer Organismenein. So haben wir in Zusammenarbeit mit einer spani-schen Forschergruppe mit der Funktionsanalyse vonpotentiellen Lipidtransportern im Parasiten Leishma-nia begonnen, einem Einzeller, der beim Menschen dieLeishmaniose verursacht (Abb. 5). Dabei prüfen wir,ob sich die Defekte im Transport einzelner Phospholipi-de über die zellulären Membranen der Hefe durchbestimmte Transportproteine des Parasiten korrigierenlassen. Auf diesem Weg können auch die zahlreichenmedizinisch wichtigen Kandidaten der menschlichenLipidtransporter charakterisiert werden. Deren Analy-se wird dazu beitragen, in Zukunft unser Verständnisder molekularen Ursachen für die bereits erwähntenFunktionsstörungen bei Menschen zu vertiefen.

Internethttp://www.biologie.hu-berlin.de/~cellbp/

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Abb. 5Lokalisation eines potentiellen Lipidtransporters im Parasi-ten Leishmania. Die Zellen wurden genetisch verändert, sodass sie den Transporter als leuchtmarkiertes Protein syn-thetisieren, dessen Fluoreszenz anzeigt, wo sich das Proteinin der Zelle befindet. (Aufnahme: Javier Pérez-Victoria)

Prof. Dr. Thomas PomorskiJg. 1968. Studium der Bio-physik an der Humboldt-Uni-versität zu Berlin, 1996 Pro-motion, Forschungsaufent-halte am Institut de BiologiePhysico-Chimique Paris undan der Universität Utrecht(Niederlande), 1997–1999Postdoc am Max-Planck-Institut für Infektionsbiologiein Berlin, 1999–2002 EMBOStipendiat am Universitäts-klinikum in Amsterdam. Seit2002 Juniorprofessor fürZellbiophysik an der Hum-boldt-Universität zu Berlin.Forschungsschwerpunkte:Lipidorganisation und -transport in zellulärenMembranen, Identifikationund Funktionsanalyse vonLipidtransportern, Rolle vonLipiden bei der zellulärenSignalübertragung.

KontaktHumboldt-Universitätzu BerlinMathematisch-Naturwis-senschaftliche Fakultät IInstitut für Biologie/Bio-physikInvalidenstr. 42D–10115 BerlinTel.: +49 30 2093–8326Fax: +49 30 2093–8585E-Mail: thomas.pomorski@rz.hu-berlin.de

Dipl.-Biophys.Stefanie VehringJg. 1976. Studium der Biolo-gie an der Universität Kon-stanz und der Biophysik ander Humboldt-Universität zuBerlin. 2002 Diplom. For-schungsaufenthalte 2001 amKing's College in London,2002 an der University ofWisconsin in Madison (USA).Forschungsschwerpunkte:Eigenschaften biologischerMembranen, Lipid-Protein-Wechselwirkungen, Lipid-transport und -dynamik.

Dipl.-Biophys.Nele Alder-BaerensJg. 1978. Studium der Bio-physik an der Humboldt-Uni-versität zu Berlin. 2002Diplom. Seit 2003 Stipendia-tin der Schering Forschungs-gesellschaft und Kollegiatindes Graduiertenkollegs»Dynamik und Evolution zel-lulärer und makromolekula-rer Prozesse«. 2003 Arbeits-aufenthalt an der UniversitätUtrecht (Niederlande).Forschungsschwerpunkt: Lipid-transport durch ATPasen.

Ursula MuschickJg. 1945. Medizinisch-tech-nische Assistentin und Fach-assistentin für Experimen-telle Medizin. Ab 1969 Mit-arbeiterin am Institut fürPharmazie der Humboldt-Universität zu Berlin. Seit2002 Mitarbeiterin in derAG Zellbiophysik.

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Stefanie Vehring

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Ursula Muschick