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Aus der Chirurgischen Klinik mit Poliklinik des
Universitätsklinikums Erlangen
Direktor: Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Hohenberger
Durchgeführt in der
Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung
in der Chirurgischen Klinik mit Poliklinik des
Universitätsklinikums Erlangen
Leiter der Abteilung: Prof. Dr. med. R. Eckstein
Untersuchung der Effizienz der Herstellung CD14- und CD16-positiver Monozyten mit den Zellseparatoren COBE Spectra und COM.TEC
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Janina Christine Brügel
aus
Nürnberg
Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof. Dr. J. Schüttler
Referent: Prof. Dr. R. Eckstein
Korreferent: Prof. Dr. W. Hohenberger
Tag der mündlichen Prüfung: 07. Juli 2010
Inhaltsverzeichnis Seite
1. Zusammenfassung 1.1 Deutsch 1
1.2 English 3
2. Einleitung 2.1 Immunsystem und Tumoren 5
2.1.1 Die Rolle der dendritischen Zellen 5
2.2 Monozyten 7
2.2.1 Definition 7
2.2.2 Entwicklung und Funktion 8
2.2.3 Monozytenheterogenität 9
2.2.4 Dendritische Zellen als Monozytenderivate 10
2.2.5 Einfluss von Restzellen auf die Anzucht dendritischer Zellen 11
2.3 Tumor-Vakzination mit dendritischen Zellen 11
2.4 Apheresetechnik zur Zellsammlung 13
2.5 Fragestellung der Studie 15
3. Material und Methoden
3.1 Studienprofil 16
3.2 Die Zellseparatoren 19
3.2.1 Der COM.TEC Zellseparator 19
3.2.1.1 Das P1Y Leukozyten-Set 20
3.2.1.2 Die PL1-Kammer 21
3.2.1.3 Das MNC-Programm 22
3.2.1.4 Die COM.TEC Zentrifuge 23
3.2.1.5 Gewinnung CD14-positiver Zellen mit der COM.TEC 25
3.2.2 Der COBE Spectra Zellseparator 26
3.2.2.1 Das WBK-Blutschlauchset 27
3.2.2.2 Der Einphasen-WBK-Kanal 29
3.2.2.3 Die COBE Spectra Zentrifuge 29
3.2.2.4 Der WBK-Betrieb 31
3.2.2.5 Gewinnung CD14-positiver Zellen mit der COBE Spectra 32
3.3 Ablauf der Leukozytapherese 33
3.4 Monozyten 34
3.4.1 Probengewinnung und Probenvorbereitung 34
3.4.2 Durchflusszytometrische Zellanalyse 35
3.4.3 Monozytensubpopulationen und Monozyten-Thrombozyten-
Aggregate
36
3.5 Spenderkollektiv 37
3.6 Statistische Datenauswertung 38
3.7 Berechnungen und Formeln 39
4. Ergebnisse
4.1 Separationsergebnisse mit dem COBE Spectra-Zellseparator 41
4.1.1 Sammelergebnisse mit varianter Zentrifugendrehzahl 41
4.1.2 Sammelergebnisse im Hinblick auf das PBV-TBV-Verhältnis 47
4.2 Separationsergebnisse mit dem COM.TEC-Zellseparator 55
4.2.1 Sammelergebnisse mit varianter Zentrifugendrehzahl 55
4.2.2 Sammelergebnisse im Hinblick auf das PBV-TBV-Verhältnis 65
4.3 Vergleich der Sammelergebnisse von COM.TEC und COBE 71
4.3.1 COM.TEC (1500 rpm) und COBE (646 rpm) 71
4.3.2 COM.TEC (1500 rpm) und COBE (708 rpm) 79
5. Diskussion 5.1 Zusammenfassung der Ergebnisse 87
5.2 Sammelergebnisse einzelner Zellpopulationen 89
5.2.1 Leukozyten und CD14-positive Monozyten 89
5.2.2 CD14- und CD16-positive Monozyten 92
5.2.3 Restzellen 95
5.2.4 Monozyten-Thrombozyten-Aggregate 97
5.3 Rekrutierung monozytärer Subpopulationen 99
6. Literaturverzeichnis 102
7. Abkürzungsverzeichnis 111
8. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen 113
9. Danksagung 114
10. Lebenslauf 115
1
1. Zusammenfassung
1.1 Deutsch Hintergrund und Ziele
Inhalt dieser Arbeit war die Gewinnung CD14-positiver Monozyten und der
CD14+CD16+ sowie der CD14-CD16+ Zellen mittels Leukapherese mit dem
COM.TEC- und dem COBE Spectra-Zellseparator. Besonderes Augenmerk
wurde neben der Effizienz der Sammlung auf die erstmals gesondert
betrachtete Sammlung der CD14+CD16+ Subpopulation gelegt. Auch die Bil-
dung von Monozyten-Thrombozyten-Aggregaten (CD14+CD62+) in den
Apheresaten sowie das Rekrutierungsverhalten der CD14-positiven Zellen
waren von besonderem Interesse.
Methoden Bei 72 gesunden, nicht-zytokinstimulierten Blutspendern wurden 138 Leuk-
apheresen zur Sammlung CD14-positiver Zellen entweder mit dem
COM.TEC (MNC-Programm) oder dem COBE Spectra Zellseparator durch-
geführt und die Ergebnisse in einer gepaarten Analyse miteinander ver-
glichen. Zusätzlich wurde bei beiden Zellseparatoren mit modifizierten Zentri-
fugendrehzahlen gearbeitet (COM.TEC: 1000 U/min. vs. 1500 U/min.; COBE:
708 U/min. vs. 646 U/min.). Für alle betrachteten Zellpopulationen wurden
Sammeleffizienz und Rekrutierungsfaktor berechnet. Die Differenzierung der
Monozytensubpopulationen erfolgte mittels Durchflusszytometrie.
Ergebnisse und Beobachtungen
Der Vergleich von COBE und COM.TEC zeigte einen annähernd gleichen
CD14+ Gehalt in den Apheresaten. Mit der COM.TEC konnten aber für alle
Monozytenpopulationen signifikant höhere Sammeleffizienzen erzielt werden.
Der Thrombozytengehalt war in den Apheresaten der COM.TEC ebenfalls
deutlich höher, was eine ausgeprägte Monozyten-Thrombozyten-Aggregat-
bildung zur Folge hatte. Die Verwendung einer niedrigeren Zentrifugen-
geschwindigkeit führte bei beiden Zellseparatoren zu einem signifikant niedri-
geren Leukozytengewinn und zu durchweg geringeren Sammeleffizienzen für
2
alle Monozytensubpopulationen. Die Rekrutierungsfaktoren variierten in
Abhängigkeit von der jeweiligen Monozytensubpopulation und der jeweils
verwendeten Geräteeinstellung.
Praktische Schlussfolgerungen
Hinsichtlich des Vergleiches mit dem COBE Spectra Zellseparator zeigte das
Standard-MNC-Programm (1500 U/min.) des COM.TEC-Zellseparators die
signifikant höheren Sammelraten der Monozytenpopulationen. Wegen der
ausgezeichneten CD14+CD16+ Sammeleffizienz eignet sich der COM.TEC-
Zellseparator ebenfalls bestens zur Sammlung von CD14- und CD16-
positiven Monozyten, etwa im Rahmen einer therapeutischen Apherese. Das
Rekrutierungsverhalten der Monozyten scheint von der jeweiligen
Monozytenpopulation, dem Blutspender und dem verwendeten
Leukaphereseprogramm abhängig. Geräteeinstellungen, die auf einen sehr
hohen CD14+ Gehalt im Produkt ausgerichtet sind, gehen mit deutlich
höheren Rekrutierungsfaktoren einher.
3
1.2. English
Background and Purposes Leukapheresis procedures were performed with the COM.TEC and the
COBE Spectra cell separator to collect CD14-positive cells and the
CD14+CD16+ as well as the CD14-CD16+ cells. Especially the collection
efficiency of mononuclear cells and the collection of the CD14+CD16+
subpopulation were evaluated. Additionally, the aggregation of monocytes
and thrombocytes in products as well as the recruitment of mononuclear cells
were investigated.
Methods A total of 138 leukapheresis procedures were performed in 72 non-cytokine
stimulated blood donors by the use of either the COM.TEC (MNC program)
or the COBE Spectra (WBK program). In addition to the standard MNC
programs used, different centrifuge velocities were tested (COM.TEC: 1000
rpm vs. 1500 rpm, COBE: 708 rpm vs. 646 rpm). The collection efficiency of
monocyte subpopulations and the monocyte recruitment factors were
calculated. The differentiation of monocyte subpopulations (CD14+,
CD14+CD16+ and CD14-CD16+) was performed on a flow cytometer.
Results and Observations The comparison of the collection results of COBE and COM.TEC showed
nearly equal CD14+ yields in the products. By the use of the COM.TEC,
higher collection efficiencies of all monocyte subpopulations could be
obtained. Platelet counts were higher as well, which lead to enhanced
monocyte-thrombocyte-aggregation. By the use of a lower centrifuge speed
(COM.TEC and COBE), we found a significantly lower leukocyte content and
reduced collection efficiencies of all monocyte subpopulations. Recruitment
factors varied, depending on the monocyte subpopulation and the program
setting used.
4
Practical Conclusions
All monocyte subpopulations showed a trend to significant higher collection
efficiencies by use of the COM.TEC´s MNC-standard-program (1500 rpm)
compared to COBE Spectra´s WBC program. Due to the excellent
CD14+CD16+ collection efficiency, the COM.TEC cell separator is best
suited for the collection of the CD14+CD16+ subpopulation, for instance
within therapeutic leukapheresis. MNC recruitment seems to be higher by
use of high-yield MNC program settings. Additionally, there seems to be a
high variation of monocyte recruitment, depending on the individual blood
donor and the monocyte subpopulation.
5
2. Einleitung
2.1 Immunsystem und Tumoren
Die zweithäufigste Todesursache in den Ländern der westlichen Welt stellen
bösartige Tumoren dar. Die Bekämpfung und Heilung von Malignomen
gelingt bisher nur unzureichend, obwohl sie in der medizinischen Forschung
oberste Priorität einnimmt. In den letzten Jahren ist man angesichts man-
gelnder Erfolge mit den bisher verbreiteten Therapieverfahren, wie Ope-
ration, Chemo- oder Strahlentherapie, dazu übergegangen, neue Behand-
lungsverfahren zu entwickeln, die auf einem besseren Verständnis der Ver-
änderungen, die ein Tumor im Organismus bewirkt, gründen.
Tumorzellen sind transformierte körpereigene Zellen, deren Wachs-
tumskontrolle fehlreguliert ist (56) und die sich in vielen Punkten von einer
normalen Zelle unterscheiden. Das Genom von Tumorzellen ist instabil und
infolgedessen treten gehäuft Mutationen auf, wodurch ständig neue Anti-
gene, sogenannte Neo-Antigene oder auch TAAs (tumor associated anti-
genes) oder PAMP (pathogen associated molecular patterns) entstehen. Die-
se werden durch Moleküle des „Major Histocompatibility Complexes“ (MHC I)
von den Tumorzellen auf ihrer Zelloberfläche präsentiert und von den Zellen
des Immunsystems als „körperfremd“ erkannt. Hinzu kommen epigenetische
Veränderungen, Veränderungen der Anzahl der antigenen Epitope und damit
der Antigenität der Zelle. Kommt es im Laufe der Tumorprogression zu
Gewebeinfiltration und Metastasierung, werden vom geschädigten Gewebe
pro-inflammatorische Zytokine und Chemokine freigesetzt, die Teile des an-
geborenen und des adaptiven Immunsystems aktivieren und so eine Immun-
antwort auf den Tumor in Gang setzen (56).
2.1.1 Die Rolle der dendritischen Zellen
An der Antwort des Immunsystems auf Tumoren sind sowohl das angebo-
rene als auch das adaptive, erworbene Immunsystem beteiligt. Eine Schlüs-
selrolle nehmen hierbei die dendritischen Zellen ein, die wahrscheinlich als
6
Bindeglied zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem fungieren
(3, 28, 36). Dendritische Zellen (DCs) sind antigenpräsentierende Zellen und
können sowohl aus CD34+ Vorläufern im Knochenmark (3) als auch, bei
Anwesenheit bestimmter Wachstumsfaktoren, aus Monozyten, insbesondere
der CD14+CD16+ Subpopulation, hervorgehen (25, 81).
In jedem Entwicklungsstadium sind dendritische Zellen entscheidend
an der Reaktion des Immunsystems auf den Tumor beteiligt, wobei sie die
einzigartige Fähigkeit besitzen, eine primäre Immunantwort zu induzieren (3,
32). Den Ablauf dieser Reaktion stellt man sich heute in etwa so vor: Aus
unreifen DC-Vorläuferzellen im Knochenmark entwickeln sich weitere unreife
Vorläuferzellen, die in Blut, Lymphe und lymphatischen Organen zirkulieren.
Diese zirkulierenden DCs erkennen Tumor-PAMPs („pathogen associated
molecular patterns“) mithilfe ihres PRR („pattern recognition receptor“) und
werden dadurch zur Sekretion von Zytokinen (z.B. TNFα) angeregt, welche
Effektorzellen des unspezifischen Immunsystems (z.B. Makrophagen und na-
türliche Killerzellen) aktivieren, die die transformierten Zellen abtöten. Dabei
entstehen sogenannte „tumor cell bodies“, die von unreifen gewebsständigen
DCs phagozytiert werden.
Diese DCs durchlaufen daraufhin einen Reifungsprozess und wandern
zu den lymphatischen Organen. Dort präsentieren die nun fast ausgereiften
DCs das internalisierte Antigen als Antigen-MHC-Komplex an Antigen-
spezifische CD4- und CD8-positive T-Lymphozyten. Die nun selektierten und
aktivierten T-Lymphozyten wandern zum Ort des Tumorgeschehens,
erkennen antigene Strukturen auf den Tumorzellen und eliminieren im
Optimalfall die neoplastischen Zellen. Eine weitere einzigartige Funktion der
DCs besteht im „Priming“ naiver T-Helfer-Zellen und CTLs. Hierbei wird die
T-Zellantwort folgendermaßen initiiert: Die zunächst unreifen DCs nehmen
auf dem Weg zu den sekundären lymphatischen Organen ein Antigen auf,
das sie während des Zellreifungsprozesses prozessieren. In den
lymphatischen Organen präsentieren die DCs dieses Antigen den naiven T-
Zellen in Form von Peptiden, wobei kostimulatorische Moleküle die
Antigenpräsentation gegenüber diesen T-Zellen unterstützen („T-Zell-
Priming“).
7
2.2 Monozyten
2.2.1 Definition Monozyten stellen die größten mononukleären Zellen (∅ 12- 20 µm) im Blut
des Menschen dar und sind polymorphe Blutzellen. Sie besitzen einen gro-
ßen, meist nieren- oder bohnenförmig gebuchteten oder gelappten Kern. Der
Kernbau ist im Vergleich zu anderen Blutzellen lockerer und chromatinärmer.
Monozyten sind als immunkompetente Zellen zur Phagozytose und Migration
befähigt (58).
Abbildung 1: Monozyt im gefärbten Blutausstrich
Monozyten sind Teil des mononukleären Phagozyten-Systems („MPS“, frü-
her als retikuloendotheliales System bezeichnet). Der Anteil der Monozyten
an den Leukozyten im peripheren Blut beträgt ca. 5-10%. Betrachtet man
Monozyten im Lichtmikroskop, fallen einige morphologische Charakteristika
dieser Zellart auf. Morphologisch imponieren das typischerweise hellblaue
Zytoplasma, die irreguläre Form von Zelle und Zellkern und die hohe Zyto-
plasma-Kern-Ratio (89). Das Chromatin des eingebuchteten, gelappten
Kerns ist streifig angeordnet. Das Zytoplasma enthält feine Azurgranula so-
wie viele peroxidase-und hydrolasehaltige Lysosomen.
Die Identifikation von Monozyten sowie die Abgrenzung der einzelnen
Subpopulationen voneinander gelingt derzeit am besten durch die Kombina-
tion der Durchflusszytometrie mit fluoreszenzmarkierten monoklonalen Anti-
körpern, die gegen Moleküle auf der Zelloberfläche von Monozyten gerichtet
sind (89). Initial wurden Monozyten lediglich anhand einer starken Expres-
8
sion des Oberflächen-Antigens CD14 (Teil des Rezeptors für Lipopoly-
saccharide) als solche identifiziert und definiert. Nachfolgende Untersuchun-
gen zeigten aber nicht nur, dass die einzelnen Monozyten CD14 unterschied-
lich stark exprimieren, sondern auch, dass sie neben CD14 eine Vielzahl
anderer Antigene auf ihrer Oberfläche ausbilden, deren Ausprägung eben-
falls, abhängig vom Aktivierungszustand der Zelle und anderen Faktoren,
stark variiert (25). Unterschiede in der Expression von CD14 und CD16 er-
lauben es, Monozyten in zwei Hauptgruppen zu unterteilen. Es handelt sich
hierbei um die „klassischen“ CD14+CD16- Monozyten, die CD14 sehr stark
und CD16 nicht exprimieren, sowie um die kleinere Population der CD14+
CD16+ Monozyten. Letztere Monozytenpopulation ist CD16-positiv und ex-
primiert CD14 unterschiedlich stark. Da die Anzahl der CD14+CD16+ Mono-
zyten im Rahmen entzündlicher Prozesse im Blut ansteigt, werden diese
Zellen auch als „proinflammatorische“ Monozyten bezeichnet (25). Durch die
Verwendung zusätzlicher monoklonaler Antikörper können weitere Monozy-
tensubpopulationen nachgewiesen werden. Mithilfe der Durchflusszytometrie
gelingt es auch, Aggregate aus Monozyten und anderen Zellen, beispiels-
weise Thrombozyten, als sog. „Monozyten-Thrombozyten-Aggregate (CD14+
CD62+)“ nachzuweisen.
2.2.2 Entwicklung und Funktion Mononukleäre Phagozyten stammen von myeloischen Vorläuferzellen im
Knochenmark ab. Aus diesen Zellen entstehen zunächst Monoblasten, die
sich über Promonozyten zu Monozyten weiterentwickeln. Die reifen Monozy-
ten gehen in die Blutbahn über und zirkulieren dort mit einer Halbwertszeit
von ungefähr 1-3 Tagen, bevor sie in die verschiedenen Gewebe wandern
und sich dort zu funktionell unterschiedlichen Zellen differenzieren, die in
ihrer Gesamtheit nun Makrophagen genannt werden. Schlüsselregulator die-
ser Differenzierungsprozesse ist der Wachstumsfaktor M-CSF (Makropha-
gen-Kolonie stimulierender Faktor). Makrophagen sind morphologisch und
funktionell sehr heterogene Zellen, die je nach Beschaffenheit des jeweiligen
Gewebes auf unterschiedliche Aufgaben spezialisiert sind (z.B. Osteoklasten
9
im Knochen, Langerhanszellen in der Haut, Alveolarmakrophagen in der
Lunge). In ihrer Gesamtheit spielen sie eine wichtige Rolle bei der Aufrecht-
erhaltung der Gewebehomöostase, indem sie alternde Zellen phagozytieren
und durch Entzündungsprozesse geschädigtes Gewebe reparieren (25).
Inzwischen ist bekannt, dass sich nicht nur Makrophagen aus der mo-
nozytoiden Leukozytenreihe entwickeln, sondern auch Zellen, die nicht zur
Phagozytose fähig sind und andere spezifische Funktionen im Organismus
innehaben, wie beispielsweise die dendritischen Zellen.
2.2.3 Monozytenheterogenität Trotz einiger morphologischer Gemeinsamkeiten sind die im peripheren Blut
zirkulierenden Monozyten morphologisch sehr heterogene Zellen, die sich in
Größe, Granulation und Kernmorphologie voneinander unterscheiden. Dass
diese Heterogenität nicht nur die Morphe, sondern auch die funktionellen Ei-
genschaften von Monozyten betrifft, lässt sich bereits anhand der Breite des
Spektrums an funktionell unterschiedlichen Gewebemakrophagen erahnen.
So haben neuere Studien gezeigt, dass die einzelnen Subpopulationen ver-
schiedene Entwicklungs- bzw. Aktivierungsstadien der Monozyten im Blut re-
präsentieren und jeweils eine spezifische Funktion haben (13, 25), welche al-
lerdings bei vielen Subpopulationen noch weitgehend unbekannt ist.
Die Hauptpopulation der CD14+ Monozyten und die CD14+CD16+
Monozyten wurden jedoch bereits in funktioneller Hinsicht analysiert. Bei den
CD14+CD16+ Monozyten handelt es sich um reifere Zellen im Vergleich zu
den „klassischen“ CD14+ Monozyten. Außerdem exprimiert diese Monozy-
tenpopulation die MHC Klasse II-Moleküle und den Oberflächenmarker CD32
(entspricht dem FcγRII-Rezeptor) in größerer Anzahl (25). Zudem besitzen
diese Zellen eine hohe phagozytische Aktivität und sind Hauptproduzent der
inflammatorischen Zytokine TNFα und IL-12p40 (34) sowie der einzige Pro-
duzent von IL-12p70, der biologisch aktiven Form von IL-12, einem potenten
anti-Tumor-Zytokin. Das antiinflammatorische IL-10 produziert diese Zellpo-
pulation im Gegensatz zur Hauptpopulation der klassischen Monozyten
(CD14+CD16-) hingegen kaum (34, 81). Die Anzahl dieser „proinflammatori-
10
schen“ Monozyten ist während eines entzündlichen Prozesses im Körper
deutlich erhöht (25, 81, 82). So zeigten Studien, dass der Anteil der CD14+
CD16+ Monozyten an den Gesamtmonozyten bei Stammzellseparationen
(PBPC: peripheral blood progenitor cell) von Patienten mit malignen oder
chronisch-entzündlichen Erkrankungen circa 20% beträgt, im peripheren Blut
von Gesunden dagegen weniger als 10% (34, 82).
2.2.4 Dendritische Zellen als Monozytenderivate
Monozyten, die im peripheren Blut zirkulieren, können sich sowohl zu Makro-
phagen als auch zu dendritischen Zellen entwickeln. Die Differenzierung zu
dendritischen Zellen erfolgt in Anwesenheit von GM-CSF (Granulozyten- und
Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor) und IL-4 und wird von beiden
beschriebenen Monozytensubpopulationen, den CD14+ und den CD14+
CD16+ Monozyten, durchlaufen (13, 25). Eine Studie beschreibt diesen Dif-
ferenzierungsvorgang in dem sog. „Transendothelial-Migration Model“ (59).
Dieses Modell beschreibt, wie Monozyten aus dem Gefäßlumen durch das
Endothel migrieren und sich in der subendothelialen Matrix entweder zu Ma-
krophagen differenzieren, die in der subendothelialen Matrix bleiben, oder zu
dendritische Zellen, die durch das Endothel in das Ausgangsmedium zurück-
wandern (25, 59). Dieses Modell zeigt außerdem, dass sich die Population
der CD14+CD16+ Monozyten in deutlich größerem Ausmaß zu dendritischen
Zellen entwickelt als die CD14++CD16- Monozyten. Deshalb wird vermutet,
dass es sich bei den CD14+CD16+ Zellen um Vorläufer von dendritischen
Zellen handelt (81, 82).
Für den experimentellen und klinischen Umgang mit Monozyten ist
also entscheidend, dass das Ausmaß, in welchem sich diese heterogenen
Zellen zu Makrophagen oder zu dendritischen Zellen entwickeln, sowohl vom
Phänotyp der kultivierten Monozyten (also der Subpopulation) abhängig ist,
als auch von den Wachstumsfaktoren, die in der Kultur vorhanden sind (25).
Dies bedeutet auch, dass mittels Leukapherese sehr heterogene Monozyten-
produkte gewonnen werden, die sich in ihrer Zusammensetzung aus den ein-
zelnen Subpopulationen unterscheiden. Dies könnte folglich zu einem unter-
11
schiedlichen Verhalten der Ausreifung der einzelnen Monozytenpopulationen
zu DCs führen. Da auch in vitro CD14+CD16+ Monozyten deutlich besser zu
dendritischen Zellen ausreifen als andere Subpopulationen, entscheidet
deren Anteil an den Gesamt-Monozyten im Ausgangsprodukt wesentlich
über die Produktqualität hinsichtlich der zu erzielenden DC-Erträge.
2.2.5 Einfluss von Restzellen auf die Anzucht dendritischer Zellen
Es ist zwar möglich, reife dendritische Zellen für die Herstellung von Zellvak-
zinen zu isolieren. Dieses Vorgehen ist jedoch durch die geringe Menge und
die Inhomogenität der DC-Populationen im Blut wenig effektiv. Deshalb wer-
den DCs aus CD14+ Monozyten ex vivo generiert (sogenannte „Mo-DC“), in-
dem die CD14-positiven Zellen mittels Leukapherese gesammelt und in An-
wesenheit verschiedener Wachstumsfaktoren (z.B. GM- CSF, IL-4) für 5 bis
7 Tage kultiviert werden (je nach Herstellungsprotokoll) (32). Da im Aphe-
resat enthaltene Restzellen (Erythrozyten und Thrombozyten) den späteren
Gehalt an dendritischen Zellen in der Zellkultur (7, 8, 28, 36) beeinflussen,
gibt es, neben einem Mindestgehalt von 1,2 x 109 Monozyten pro Apheresat,
in Abhängigkeit der Nachbearbeitungsmethode ebenfalls Grenzwerte für Ery-
throzyten und Thrombozyten. Für die Aufreinigung der Monozyten mit Hilfe
der Elutra® liegt der Grenzwert für den Gehalt an Erythrozyten (Anteil des
Gesamtvolumens an Erythrozyten im Konzentrat) bei max. 7,5 mL. Für die
Thrombozyten gibt es bei dieser Methode keine Limitierung, denn diese Zel-
len werden durch das Elutra-Verfahren effizient entfernt.
2.3 Tumor-Vakzination mit dendritischen Zellen Bereits seit einigen Jahren werden im Rahmen von Studien Impfungen ge-
gen maligne Tumoren durchgeführt. Ziel dieser Therapie ist es, tumorspezifi-
sche Antigene durch die Beladung von DCs effizient den Effektor-T-Zellen zu
präsentieren. Dadurch werden T-Zell-Populationen aktiviert, die spezifisch für
das jeweils verwendete Tumorantigen sind. Die induzierte Immunantwort soll
12
dabei möglichst tumorspezifisch sein und im Idealfall zur Regression des
Tumors führen. Verwendet werden hierfür verschiedene Antigen-Modalitäten.
Neben antigenen Peptiden, Proteinen (mit oder ohne Adjuvans) oder rekom-
binanten Viren, die TAA-codierende Sequenzen tragen, werden insbesonde-
re mit antigenen Peptiden beladene dendritische Zellen verwendet (9). Ne-
ben ihrer entscheidenden Rolle bei immunologischen Vorgängen im Körper
(3, 28, 32, 51) hat der Gebrauch dendritischer Zellen gegenüber anderen
Verfahren den Vorteil, dass die Monozyten als deren Vorläuferzellen relativ
einfach mittels Leukapherese in großen Mengen aus dem peripheren Blut
von Patienten gesammelt werden können (autologer Therapieansatz), ohne
dass eine vorausgehende Stimulation der Spender mit Zytokinen notwendig
ist, deren späte Auswirkungen auf den Spender noch wenig bekannt sind
(61, 84). Im Anschluss an ihre Anzucht aus CD14+ Monozyten sowie Rei-
fungs- und Differenzierungsprozessen werden die reifen DCs mit tumorspe-
zifischen Antigenen verschiedener Modalitäten beladen. Neben definierten
Peptiden aus dem autologen Tumor werden RNA, Tumor-Lysate oder Hy-
bride aus dendritischen Zellen und Tumorzellen verwendet (3, 51, 55, 69).
Das ideale Tumor-Antigen sollte eine möglichst breite, polyklonale T-Zell-
Antwort mit möglichst hoher Affinität zu dem jeweiligen Antigen induzieren.
Es empfiehlt sich außerdem, mehr als ein spezifisches Antigen (Ag) in den
Impfstoff zu integrieren, um einem Ag-Verlust des Tumors und einer infolge-
dessen ineffektiven Impfung entgegenzuwirken. Zusätzlich können sowohl
kostimulierende Moleküle mit eingebracht werden, welche die DC-Aktivität
weiter steigern, als auch sogenannte „Helfer- Proteine“, mit deren Hilfe man
die Immunogenität der injizierten dendritischen Zellen kontrollieren kann (56,
69).
Bisher wurden Impfungen mit DCs vor allem bei Krebspatienten in fort-
geschrittenen Stadien, insbesondere bei Melanom-Patienten, durchgeführt
(4, 54, 55, 70) und dabei bei einem Teil der Patienten ein objektives klini-
sches Ansprechen der Therapie in Form von Tumorregression oder Aktivie-
rung tumorspezifischer T-Zellen beobachtet, ohne dass ernsthafte Neben-
wirkungen auftraten (7, 9, 55, 69). Da die Studien mittlerweile an deutlich
größeren Patientenkollektiven durchgeführt werden, steigt das Interesse an
13
Verfahren, die es ermöglichen, mit geringem Arbeits- und Kostenaufwand
große Mengen an Zellen für therapeutische Zwecke zu gewinnen (9).
2.4 Apheresetechnik zur Zellsammlung
Die Apherese (von griechisch αϕαιρειν „wegnehmen“) ist ein Verfahren, das
dazu dient, einem Blutspender oder Patienten Blutzellen selektiv zu entneh-
men. Das Zellkonzentrat kann dann außerhalb des Körpers in seine Einzel-
zellfraktionen aufgetrennt werden, während alle anderen Blutbestandteile
dem Spender wieder zugeführt werden (44). Die Auftrennung des Vollblutes
in seine einzelnen Bestandteile kann dabei entweder durch Filtration, Zentri-
fugation oder durch die Kombination der beiden Verfahren erfolgen. Die Fil-
tration kann beispielsweise verwendet werden, um Blutplasma von korpus-
kulären Blutbestandteilen zu trennen, da sie sich die unterschiedliche Größe
von Blutbestandteilen zu Nutze macht. Die Zentrifugation ist ein Verfahren,
das die Blutbestandteile durch Zentrifugalkraft entsprechend ihrer unter-
schiedlichen Dichte in Schichten auftrennt. Erythrozyten weisen die größte
Dichte auf und befinden sich daher nach der Zentrifugation auf der Außensei-
te der Zentrifugenkammer. Plasma hingegen hat eine geringere Dichte und
befindet sich dementsprechend auf der Innenseite der Zentrifugenkammer. In
der Mitte, zwischen Plasma und Erythrozytenschicht, liegt die leukozytenrei-
che Buffy Coat-Schicht (44).
Die Apherese wird eingesetzt, um pathologische Blutbestandteile von
Patienten zu entfernen (therapeutische Apherese) oder, wie im Rahmen die-
ser Dissertation beschrieben, um von einem gesunden Spender eine ge-
wünschte Zellfraktion zu sammeln. Im Gegensatz zur Vollblutspende ermög-
licht es die Apheresetechik, einzelne Blutbestandteile zu gewinnen. So kön-
nen Blutplasma oder zelluläre Blutbestandteile wie Thrombozyten, Erythrozy-
ten oder periphere Stammzellen angereichert und gewonnen werden, ohne
den Spender unnötig durch den Verlust von Blutbestandteilen zu belasten,
die für den geplanten Verwendungszweck nicht benötigt werden. Apherese-
verfahren verlaufen wie folgt. Dem Spender wird Blut über eine Armvene ent-
nommen und nach Passage durch das Apheresegerät über die kontralaterale
14
Armvene zurückgegeben (Zwei-Arm-Verfahren). Das entnommene Blut wird
durch ein geschlossenes, steriles Schlauchsystem (Apherese-Set) geleitet,
wobei eine geringe Menge Antikoagulans (Zitronensäure) zugesetzt wird, um
die Gerinnung des Blutes im Apherese-System zu verhindern. Das antikoa-
gulierte Vollblut wird in die Zentrifuge des Zellseparators geleitet, in deren
künstlichem Schwerefeld sich die Blutbestandteile entsprechend ihrer Dichte
in Schichten auftrennen. Partikel mit höherer Dichte wandern dabei aufgrund
der im Vergleich zur Erdbeschleunigung höheren Zentrifugalbeschleunigung
in der Zentrifugenkammer nach außen (Erythrozyten), leichtere Bestandteile
gelangen durch den dadurch erhöhten Auftrieb in Richtung der Innenseite
bzw. Mitte der Zentrifuge. Von dort aus erfolgt die Absammlung der gewün-
schten Zellfraktion via Sammelleitung in den Produktbeutel. Im Anschluss an
die Apherese werden dem Spender alle nicht benötigten Blutbestandteile
wieder zurückgegeben. Das Antikoagulanz Zitrat (Zitronensäure) wird im Or-
ganismus des Spenders von der Leber abgebaut. Aufgrund der insgesamt
niedrigen Zitratkonzentration im Blut bleibt die Blutgerinnung des Spenders
unbeeinträchtigt.
15
2.5 Fragestellung der Studie
Für die Weiterverarbeitung der durch Apherese gewonnenen Zellkonzentrate
spielt die Produktqualität eine wichtige Rolle. Vor diesem Hintergrund werden
in der vorliegenden Studie 138 Leukapheresen, die von gesunden Blutspen-
dern gewonnen wurden, analysiert. Gegenstand dieser Untersuchung war
die Analyse der Monozyten mit Subpopulationen, der Thrombozyten, der Mo-
nozyten-Thrombozyten-Aggregate und der Erythrozyten im Leukozytenkon-
zentrat. Dabei wurden unterschiedliche Zellseparatoren, die COBE Spectra
und das COM.TEC-Apheresegerät, hinsichtlich der oben genannten Zellen
und Zellaggregate untersucht. Im Einzelnen handelte es sich dabei um fol-
gende Fragestellungen.
1. Untersuchung der CD14-positiven Monozyten und der beiden Monozyten-
populationen (CD14+CD16+ und CD14-CD16+ Zellen).
2. Vergleich der Ergebnisse der Leukozytenkonzentrate, die mit dem
COM.TEC- und dem COBE Spectra-Zellseparator hergestellt wurden.
3. Analyse der Rohdaten und Berechnung der Sammeleffizienzen dieser
Zellpopulationen bei beiden Zellseparatoren.
4. Untersuchung der Sammelergebnisse, die mit einer modifizierten Geräte-
einstellung bei beiden Apheresegeräten erzielt wurden.
5. Analyse des Restzellgehaltes und der Ausbildung von Monozyten-Throm-
bozyten-Aggregaten in den Leukozytenprodukten beider Zellseparatoren.
6. Untersuchung der Rekrutierung von Monozyten-Populationen beim Spen-
der durch den Vergleich der Zellzahl vor und nach der Leukozytenspende.
16
3. Material und Methoden
3.1 Studienprofil An der Studie nahmen 72 gesunde, nicht-zytokinstimulierte Spender teil, wo-
von 15 weiblich und 57 männlich waren. Diese Spender spendeten nach Ein-
willigung in das Studienprotokoll insgesamt 138 Leukapheresate. 75 der
Leukapheresen wurden mit dem COM.TEC-Zellseparator (Fresenius Hemo
Care GmbH) und 63 Apheresen mit dem COBE Spectra Apheresesystem™
(Firma Caridian BCT, Inc., Blood Component Technology) hergestellt. Neben
der Untersuchung dieser zwei Zellseparatoren wurden zusätzlich unter-
schiedliche Geräteeinstellungen analysiert. Im Anschluss an die Leukaphe-
resen verglichen wir die Sammelergebnisse hinsichtlich der im Apheresat
enthaltenen Leukozyten, CD14-positiven Zellen, Monozytensubpopulationen
und Restzellen miteinander. In besonderem Maße interessierten uns hierbei
die erzielten Sammeleffizienzen für Monozyten und ihre Subpopulationen.
Die Zuteilung der Blutspender zu einem Zellseparator ergab sich aus
der Verfügbarkeit des jeweiligen Gerätes zum vereinbarten Spendezeitpunkt.
Die Wahl der Geräteeinstellung, mit der gearbeitet wurde, erfolgte ebenfalls
randomisiert.
Die erste Gruppe (n=75) der Leukapheresen wurde mit dem MNC-Programm
des COM.TEC-Zellseparators durchgeführt, wobei zwei unterschiedliche
Zentrifugengeschwindigkeiten verwendet wurden. 50 Apheresen wurden mit
der standardmäßig eingestellten Zentrifugengeschwindigkeit von 1500 Um-
drehungen pro Minute zentrifugiert. Bei einer deutlich kleineren Spendergrup-
pe (n=8) erfolgte die Leukapherese mit einer modifizierten Zentrifugenge-
schwindigkeit von 1000 Umdrehungen pro Minute. Der Blutfluss betrug dabei
jeweils 50 mL pro Minute. 5 Spender wurden sowohl mit 1500 U/min. als
auch mit 1000 U/min. leukapheresiert. Diese Spender (n=5) wurden einer ge-
paarten Analyse unterzogen. Weiterhin bestimmten wir bei allen Spendern
das Verhältnis von prozessiertem zu totalem Blutvolumen und untersuchten
diesbezüglich die Separationsergebnisse. Alle Spender, deren PBV-TBV-
Verhältnis zwischen 0,5 und 0,8 lag, wurden in eine erste Gruppe (n=43)
17
zusammengefasst und all diejenigen Spender, deren PBV-TBV-Verhältnis
zwischen 0,81 und 1,25 lag, bildeten die zweite Untersuchungsgruppe
(n=15).
Die zweite Gruppe der Leukozytapheresen (n=63) bildeten Spender, die am
COBE Spectra-Zellseparator mit dem WBK-Programm apheresiert wurden.
Dabei wurde in 20 Fällen eine Zentrifugendrehzahl von 646 U/min. bei einem
Blutfluss von 50 mL pro Minute verwendet. In 17 Fällen wurde der Blutfluss
auf 60 mL pro Minute erhöht, was eine Erhöhung der Zentrifugendrehzahl auf
708 U/min. bewirkte. Die jeweils erzielten Sammelergebnisse wurden eben-
falls verglichen (ungepaart). Desweiteren wurde auch hier das Verhältnis von
prozessiertem zu totalem Blutvolumen der Spender bestimmt und die Spen-
der nach der Größe ihres PBV-TBV-Verhältnisses in zwei Gruppen eingeteilt.
Alle Spender, bei denen das PBV-TBV-Verhältnis zwischen 0,8 und 1,2 lag,
bildeten die Gruppe 1 (n= 29) und alle Spender mit einem PBV-TBV-Verhält-
nis zwischen 1,21 und 1,6 die Gruppe 2 (n=20). Die Produktergebnisse der
beiden Gruppen wurden analysiert und miteinander verglichen.
Als eine der wesentlichen Fragestellungen dieser Arbeit verglichen wir die
Sammelergebnisse von 15 Spendern, die jeweils sowohl mit dem COM.TEC-
als auch mit dem COBE Spectra-Zellseparator leukapheresiert wurden. Alle
15 Leukapheresen wurden dabei mit dem MNC-Standardprogramm der
COM.TEC (Zentrifugendrehzahl von 1500 U/min. und Blutfluss von 50
mL/min.) durchgeführt. Bei Verwendung der COBE Spectra wurden zwei ver-
schiedene Geräteeinstellungen verwendet. 6 der insgesamt 15 Leukaphere-
sen erfolgten mit der Zentrifugendrehzahl von 646 U/min. (Blutfluss von 50
mL/min.) und die restlichen 9 mit einem Blutfluss von 60 mL/min., der zu
einer Zentrifugendrehzahl von 708 U/min. führte. Sammelergebnisse und
Produktivität von COBE und COM.TEC wurden in zwei einzelnen gepaarten
Analysen verglichen.
Das Grundprinzip der Leukapherese ist bei beiden Zellseparatoren das glei-
che. Mit Hilfe der Zentrifugation erfolgt die Auftrennung des Vollblutes des
Spenders in einzelne zellreiche Schichten. Der dabei entstehende Buffy Coat
18
(zellreiche Schicht aus Leukozyten und Thrombozyten), der zwischen Plas-
ma und Erythrozytenschicht liegt, wird abgesammelt. Die Erythrozyten und
das Plasma werden dem Spender wieder zurückgeführt. Aus dem Buffy
Coat, der den Großteil der Leukozyten enthält, werden die Monozyten als ge-
wünschte Zellpopulation angereichert. Um sowohl die Quantität (Gehalt an
Monozyten im Apheresat) als auch die Qualität des Apherese-Produktes
(Gehalt an verunreinigenden Restzellen) zu ermitteln, wurden unmittelbar
nach der Leukapherese die Konzentrationen der einzelnen Zellfraktionen,
also der Leukozyten (WBZ) und Leukozyten-Populationen sowie der Restzel-
len (Erythrozyten und Thrombozyten) im Produkt gemessen. Zusätzlich wur-
de der prozentuale Anteil der Monozyten an den Gesamtleukozyten be-
stimmt. Schließlich berechneten wir den absoluten Monozytengehalt im Leu-
kozytenkonzentrat (sog. Zell-Yield), den Gehalt pro Liter prozessiertes Blut-
volumen, die Sammelrate (CR=Yield pro Minute), die Sammeleffizienz (CE)
und den Recruitment Factor (RF). Alle für die Berechnungen verwendeten
Formeln sind im Kapitel „Berechnungen und Formeln“ aufgeführt. Die Analy-
se der Monozyten-Subpopulationen erfolgte mit dem FACS-Calibur-Durch-
flusszytometer (BD Becton Dickinson, Franklin Lakers, NY, USA). Dabei wur-
den folgende Zellpopulationen gemessen: CD14+CD16-, CD14+CD16+ und
CD14-CD16+ Monozyten sowie die Aggregate aus Monozyten und Thrombo-
zyten (CD14+CD62+ Zellen).
Alle in der Studie eingeschlossenen Spender wurden vor der Leukapherese
den Blutspende-Richtlinien entsprechend aufgeklärt und gaben ihr schriftli-
ches Einverständnis zur Durchführung der im Rahmen der Studie erforderli-
chen Blutuntersuchungen.
19
3.2 Die Zellseparatoren
3.2.1 Der COM.TEC Zellseparator Der Blutzellseparator COM.TEC der Firma Fresenius HemoCare ermöglicht
neben der Sammlung anderer Blutbestandteile die Gewinnung von Buffy
Coat aus Vollblut, der die gewünschten CD14-positiven Zellen enthält. Die
Auftrennung des Blutes erfolgt in einer Separationskammer nach dem Prinzip
der Differential-Zentrifugation.
Zur Sammlung von Leukozyten bietet der COM.TEC Zellseparator
zwei Separationsprogramme an, die mit unterschiedlichen Separationskam-
mern arbeiten. Das PBSC-Lymphozyten-Programm benötigt das C4Y Aphe-
rese-Set, das mit der zweistufigen C4-Kammer arbeitet, das MNC-Pro-
gramm benötigt das P1Y Apherese-Set (PL1-Separationskammer), welches
die einstufige PL1-Kammer verwendet. Alle in dieser Studie enthaltenen
Leukapheresen wurden mit dem MNC-Programm der COM.TEC ausgeführt,
das PBSC-Lymphozyten-Programm kam nicht zum Einsatz.
Abbildung 2: COM.TEC Frontplatte
1 Beutelaufhängvorrichtung
2 Frontplatte
3 Schlauchpumpen
4 Zentrifugentür
5 Serviceblende
6 Feststellbremse
7 Lenkrollen vorne
20
3.2.1.1 Das P1Y Leukozyten-Set
Das Apherese-Set P1Y dient der Gewinnung von Leukozyten und von spe-
ziellen Leukozytenpopulationen, wie den Granulozyten und den CD14-positi-
ven Monozyten. Die Auftrennung des Vollblutes erfolgt in einer einstufigen
Kammer, aus der die gesammelten Zellen zyklisch in einen Konzentrat-beu-
tel gesammelt werden. Um die Kontamination des Konzentrats zu minimie-
ren, sind Sterilfilter in alle Leitungen integriert, an denen Lösungen ange-
schlossen werden. Ein Plasma-Transferbeutel, der fest mit dem Set verbun-
den ist, ermöglicht es, während der Separation zusätzlich eine bestimmte
Menge Plasma zu sammeln.
Abbildung 3: P1Y Leukozyten-Set
21
3.2.1.2 Die PL1-Kammer
Die Separationskammer PL1 ist eine einstufige Kammer aus farblosem
Kunststoffmaterial. Das zu separierende Vollblut wird der Kammer über den
Vollblut-Port zugeführt. In dieser Kammerstufe bewirkt die Zentrifugalkraft
eine Trennung in Erythrozyten und zellreiches Plasma, welches am inneren
Rand der Kammer (Plasma-Port) entnommen werden kann. Die Erythrozyten
werden über den EK-Port, der sich am äußeren Rand der Kammer befindet,
abgeführt.
Abbildung 4: PL1-Kammer
PLS Plasma
EK Erythrozyten
VB Vollblut
22
3.2.1.3 Das MNC-Programm
Das Programm MNC arbeitet mit der einstufigen PL1-Kammer und ist ein
zyklisches Sammelverfahren. Jeder Zyklus besteht aus folgenden vier Pha-
sen.
- Sammelphase
- Verdichtungsphase
- Spilloverphase
- Buffy Coat-Phase
Die ersten beiden Phasen (Sammel- und Verdichtungsphase) laufen mit
automatischer Trenngrenzenregelung, d.h. die Plasmapumpe wird durch die
Software geregelt und hält die Grenze zwischen Zellen und plättchenreichem
Plasma konstant auf einer bestimmten Position (7.1). Die beiden sich an-
schließenden Sammelphasen (Spillover- und Buffy Coat-Phase) laufen mit
unterschiedlicher Flussrate, wobei die automatische Trenngrenzenregelung
ausgeschaltet ist. Unter Standardbedingungen werden vom Gerät pro Minute
50 mL antikoaguliertes Vollblut separiert. Die innere Schicht bildet das
thrombozytenreiche Plasma. Das Plasma wird von der Plasmapumpe über
den Plasmaausgang zur Tropfkammer gepumpt, dort mit den Erythrozyten
gemischt und dem Patienten wieder zurückgegeben. Währenddessen baut
sich in der Mitte der Kammer, zwischen Erythrozyten- und Plasmaschicht die
Buffy Coat-Schicht auf. Diese Schicht enthält die gewünschte Zellfraktion der
CD14-positiven Zellen. Am Ende der Sammelphase wird die Buffy Coat-
Schicht in der Separationskammer verdichtet. Dazu werden 5 mL Vollblut
sehr langsam in die Kammer gefördert, während die automatische Trenn-
grenzenregelung aktiv bleibt. Nach dem Verdichten zieht die Plasmapumpe
den Buffy Coat aus der Separationskammer bis vor das Y-Stück, welches
sowohl die Zellen- als auch die Plasmapumpe mit dem Plasmaausgang der
Kammer verbindet. Jetzt übernimmt die Zellenpumpe die Zellfraktion und för-
dert sie in den Konzentratbeutel. Die Plasmapumpe steht während dieses
Vorgangs still. Nach Beendigung des Zellentransports schließt sich eine
neue Sammelphase an, in der wieder Buffy Coat angereichert wird.
23
Im MNC-Programm können zusätzliche 50 - 500 mL Plasma gesammelt wer-
den. Die Plasma-Sammlung beginnt nach Ende des 3. Zyklus. Folgende
Parameter lassen sich im Spillover-Menü beeinflussen:
Das Zyklus-Volumen entspricht dem Volumen, das während eines
Sammelzyklus für die Anreicherung der Buffy Coat-Schicht prozessiert wird.
Bei Spendern mit hohen Leukozytenvorwerten baut sich die Buffy Coat-
Schicht schnell auf, so dass es sinnvoll ist, niedrigere Volumina pro Zyklus zu
wählen als bei Spendern mit niedrigen Leukozytenvorwerten. Durch das
Zyklusvolumen kann die Anzahl der Zyklen pro Spende variiert werden. Das
Volumen, welches die Plasmapumpe benötigt, um den Buffy Coat aus der
Separationskammer zum Y-Stück zu befördern, wird Spillover-Volumen ge-
nannt. Die Größe dieses Volumens hängt auch von der Schichtdicke des
Buffy Coats ab. Wenn beobachtet wird, dass sich die ersten Zellen bereits
über das Y-Stück hinaus zur Plasmapumpe bewegen, kann der Spillover ge-
stoppt werden. Dann wird das bis dahin geförderte Volumen automatisch als
neues Spillover-Volumen festgelegt. Als Buffy Coat-Volumen wird das Volu-
men bezeichnet, das durch die Zellpumpe in den Konzentratbeutel befördert
wird. Das Buffy Coat-Volumen ist umso höher einzustellen, je tiefer in die
Erythrozytenschicht des Buffy Coats hinein gesammelt werden soll. Wenn zu
tief gesammelt wird, also zu viele Erythrozyten in das Zellkonzentrat ge-
langen, kann der Transport des Buffy Coat-Volumens mit Hilfe der optischen
Kontrolle durch den Operator gestoppt werden. Dann wird das Buffy Coat-
Volumen, das bis dahin transportiert wurde, automatisch als neuer Wert in
der Software übernommen und auf dem Ausdruck dokumentiert.
3.2.1.4 Die COM.TEC Zentrifuge Die rotierende Separationskammer ist gleitdichtungsfrei über den Zentrifu-
genschlauch (3 bis 4 Einzelschläuche) mit dem Pumpenadapter des
Schlauchsystems verbunden. Um das Funktionsprinzip der gleitdichtungs-
freien Zentrifuge zu gewährleisten, muss der Zentrifugenschlauch von unten
um die Separationskammer herum, tangential von den beiden Schlauchfüh-
rungen des Zentrifugenrotors zum oben liegenden Zentrifugenadapter ge-
24
führt werden. Bei laufender Zentrifuge dreht sich der Zentrifugenschlauch um
die Separationskammer herum und wird hierbei von einer Schlauchführung
des Zentrifugenrotors geführt. Dadurch dass sich der Zentrifugenschlauch
genau halb so schnell wie die Separationskammer um diese dreht, wird ein
Verdrillen des Schlauches verhindert. Der Zentrifugenrotor, der den Zentri-
fugenschlauch um die Separationskammer führt, dreht sich ebenfalls mit der
halben Separationskammerdrehzahl. Die Drehzahl der Separationskammer
beträgt maximal 2.200 U/min., die des Zentrifugenrotors demnach maximal
1.100 U/min.. Die Drehung erfolgt jeweils gegen den Uhrzeigersinn.
Abbildung 5: COM.TEC Zentrifuge
1 Zentrifugeninnenraum
2 Zentrifugenrotor
3 Kammerverriegelung
4 Kammeraufnahme
5 Antrieb
6 Stroboskoplampe unten
7 Schlauchführung
8 Stroboskoplampe oben
9 Beleuchtungsfenster/Trenngrenzenempfänger
25
3.2.1.5 Gewinnung CD14-positiver Zellen mit der COM.TEC
Die Gewinnung CD14-positiver Zellen mit dem COM.TEC Zellseparator ist
ein zyklisches, halbautomatisches Verfahren. In der Sammelphase erfolgt in
der Separationskammer die Auftrennung des Blutes in thrombozytenreiches
Plasma, das dem Spender zurückgegeben wird, und zelluläre Bestandteile.
Die Zellschicht wird durch Reduktion des Blutflusses verdichtet und anschlie-
ßend in der sogenannten Spilloverphase bis vor den Kammerausgang ge-
pumpt. Von dort werden die Leukozyten schließlich in den Konzentratbeutel
gefördert (Buffy Coat-Phase). Sowohl das Sammelvolumen als auch die Vo-
lumina, die in der Spillover- und Buffy Coat-Phase in Richtung Sammelbeutel
befördert werden, können manuell eingestellt und das Sammelergebnis so
verändert werden. Eine optimale Einstellung der Volumina während des
Sammelprozesses führt zur Gewinnung eines Apheresekonzentrates, in dem
der Anteil an Leukozyten hoch, der an verunreinigenden Erythrozyten und
Thrombozyten dagegen niedrig ist.
Die Standardeinstellung des MNC-Programmes arbeitet mit einem Blutfluss
von 50 mL/min. und einer Zentrifugendrehzahl von 1500 U/min.. Das Zyklus-
volumen beträgt 400 mL, das Buffy Coat-Volumen liegt durchschnittlich bei
10 mL. Die Anpassung des Spillover-Volumens erfolgt durch den Operator
manuell. Durch Betätigen der Taste „Stop Phase“ am Gerät wird das Spill-
over-Volumen adjustiert und die Absammlung von Buffy Coat eingeleitet. Der
Absammelprozess wird hierbei vom Operator durch Betrachten der Sammel-
leitung überwacht. Auch das Buffy Coat-Volumen wird innerhalb der ersten
drei Sammelzyklen manuell eingestellt, wobei darauf geachtet wird, im Aphe-
resekonzentrat einen hohen Leukozyten- und einen niedrigen Erythrozyten-
anteil zu erhalten. Die vorliegenden Untersuchungen vergleichen die bei Ver-
wendung unterschiedlicher Geräteeinstellungen erzielten Sammelergebnis-
se. Die gewonnenen Resultate werden im Ergebnisteil beschrieben.
26
3.2.2 Der COBE Spectra Zellseparator
Das COBE Spectra Apheresesystem™ der Firma Caridian BCT, Inc., Blood
Component Technology ist ein automatischer Blutkomponenten-Separator
und dient der Sammlung von Blutkomponenten. Das System eignet sich
auch zur Anreicherung von Buffy Coat, aus dem mononukleäre Zellen ge-
wonnen werden können. Die Auftrennung des Vollblutes basiert auf dem
Zentrifugenprinzip.
Abbildung 6: COBE Spectra
Das Spectra System besteht aus Einwegteilen (vorbefestigter Trennkanal
und Blutschläuche) und dem eigentlichen Spectra Apheresesystem. Das
System umfasst folgende Bauteile:
- Spectra Blutschlauchsets - bestehend aus einem sich in der Zentrifuge
drehenden Trennkanal, der Blut in seine Bestandteile trennt, und aus
27
Blutschläuchen, in denen Blut und Ersatzflüssigkeiten durch das
System geführt werden.
- Spectra Apheresesystem, ein auf dem Zentrifugenprinzip basierender
automatischer Blutseparator, der die Steuerung und Überwachung
des extrakorporalen Kreislaufs bei der Apherese übernimmt.
Die Gewinnung von Monozyten erfolgt unter Verwendung des Einphasen-
WBK-Kanals und eines WBK-Blutschlauchsets.
3.2.2.1 Das WBK-Blutschlauchset Das WBK-Blutschlauchset wurde in der vorliegenden Arbeit zur Gewinnung
CD14-positiver Monozyten verwendet. Das Set besteht aus einem einphasi-
gen Trennkanal (Einphasen-WBK-Kanal) und einem WBK-Blutschlauch-
system. Der Einphasen-WBK-Kanal trennt mononukleäre weiße Blutkörper-
chen von Erythrozyten, Thrombozyten und Plasma. Der WBK-Schlauch
transportiert das Blut zum Entzug weißer Blutkörperchen. Die gesammelten
Zellen werden kontinuierlich in einen sich außerhalb der Zentrifuge befindli-
chen Sammelbeutel gefördert. Neben dem WBK-Beutel verfügt das Set über
einen Plasma-Beutel, in den während der Separation zusätzlich eine be-
stimmte Menge Plasma gesammelt wird.
28
Abbildung 7: WBK-Blutschlauchset
1 Spender-/Patientenzufluss
2 Zuflussverteiler 15 Plasma-/RBK-Leitung
3 NaCl-Zuflussleitung 17 Plasma-/RBK-Verwurfbeutel
4 Antikoagulans-Leitung 18 Rückflusspumpenkassette
6 Einlassleitung 19 Rückflussdrucksensor
7 Zuflussdrucksensor 20 Rückflussluftkammer
8 Zuflusspumpen-Kassette 21 Verwurfableitungen
9 Einlassluftkammer 22 Fülllösungs-Verwurfbeutel
10 Zentrifugenschleife 23 Rückflussleitung
11 WBK-Anschluss 24 NaCl-Rückflussverteiler
13 Sammel-/Ersatzflüssigkeitsleitung 25 NaCl-Rückflussleitung
14 Sammelbeutel 26 Spender-/Patientenrückfluss
29
3.2.2.2 Der Einphasen-WBK-Kanal
Der Einphasen-WBK-Kanal dient der Sammlung von mononuklären Zellen
(MNZ). Das antikoagulierte Vollblut tritt durch den Einlassschlauch in die Ein-
lasskammer ein. Dort wird das Blut durch die Zentrifugalkraft und die unter-
schiedlichen spezifischen Gewichte der Blutbestandteile in Erythrozyten
(RBK), die gewünschten weißen Blutkörperchen (WBK) und thrombozytenrei-
ches Plasma getrennt.
Abbildung 8: Einphasen-WBK-Kanal
3.2.2.3 Die COBE Spectra Zentrifuge
Die Zentrifuge befindet sich in der Zentrifugenkammer und ist mit den sich
außerhalb der Zentrifugenkammer befindenden Pumpen des Schlauch-
systems gleitdichtungsfrei verbunden. Die Zentrifugenkammer wird beim
COBE Spectra Apheresesystem als Einphasen-WBK-Kanal bezeichnet und
in die Füllvorrichtung der Zentrifuge eingelegt. Bei sich drehender Zentrifuge
30
wird die rotierende Schleife des WBK-Kanals vom Zentrifugenarm und über
die obere und untere Lagerhalterung am Zentrifugenarm festgehalten. Die
maximale Zentrifugengeschwindigkeit beträgt 2400 U/min., die daraus resul-
tierende maximale Schwerkraft, die im Einphasen-WBK-Kanal entwickelt
wird, beträgt 930 g.
Abbildung 9: Zentrifugenkammer
1 Netzschalter 9 Zentrifugenarm
2 Zentrifugendeckel und -tür 10 Untere Lagerhalterung
3 Füllvorrichtung 11 Obere Lagerhalterung
4 Verschlussstift der Füllvorrichtung 12 Obere Kragenhalterung
5 Verriegelungsstift der Füllvorrichtung 13 Strobe
6 Verschlussriegel der Füllvorrichtung 14 Leckanzeiger
7 Zentrifugenkragenhalterung 15 Getriebeabdeckung
8 Ladeöffnung der Zentrifuge
31
3.2.2.4 Der WBK-Betrieb
Der WBK-Betrieb ist ein kontinuierliches Aphereseverfahren, bei dem Spen-
dern mit Hilfe eines WBK-Blutschlauchsets mononukleäre Zellen (MNZ) ent-
nommen werden. Im WBK-Betrieb werden zwei Modi unterschieden, die
nacheinander ausgeführt werden. Im Durchflussmodus wird antikoaguliertes
Vollblut zunächst mit der Zentrifugalmethode in seine Hauptbestandteile zer-
legt und die Fraktion der Leukozyten gesammelt. Im darauffolgenden Rück-
führmodus werden dem Spender anschließend die restlichen Blutkomponen-
ten zurückgegeben.
Zunächst wird der Durchlaufmodus gestartet. Das Vollblut des Spen-
ders wird im Verhältnis 12:1 (Einlass:ACD-A) antikoaguliert. Das Verhältnis
Vollblut zu Antikoagulans kann entsprechend des Hämatokrits und der
Thrombozytenzahl des Spenders verändert werden. Das antikoagulierte Blut
wird in den Einphasen-WBK-Kanal gepumpt, während sich dieser in der Zen-
trifuge im Uhrzeigersinn dreht. Dadurch wird die Zellfraktion mit der höchsten
Dichte (Erythrozyten) an der äußeren Kanalwand abgeordnet, während sich
die Zellfraktionen geringerer Dichte schichtenweise zur inneren Kammer-
wand hin anordnen. Das Plasma ist aufgrund seiner geringen Dichte der
Kammerinnenseite am nächsten. Im Kanal befinden sich mehrere Auslass-
schläuche. Die Einlass- und Sammelkammern sind im Kanal voneinander
getrennt. Die Einlassleitung liefert das antikoagulierte Vollblut in den WBK-
Kanal. Am Eingang dieses Kanals gibt es vier Schläuche, die in die entspre-
chenden Kanalbereiche führen. Der Schlauch für Erythrozyten reicht bis zur
äußersten Wand des Kanals, der Plasmaschlauch befindet sich an der am
wietesten innen liegenden Wand und die Sammel- und Schnittstellen-Kon-
trollschläuche liegen dazwischen, dort wo sich die RBK-Plasma-Schnittstelle
befindet. Als Schnittstelle bezeichnet man die dünne Schicht zwischen den
Erythrozyten und dem Plasma. Darin befinden sich die Leukozyten, die ge-
sammelt werden sollen. Die RBK-Plasma-Schnittstelle wird durch das Ver-
hältnis der Flussraten der roten Blutkörperchen und des Plasmas festgelegt.
So können die Leukozyten nach korrekter Einstellung der Plasmasammelrate
an der Schnittstelle gesammelt werden. Erythrozyten und plättchenreiches
Plasma werden direkt aus den jeweiligen Schläuchen gesammelt. Die RBK-
32
Plasmaschnittstelle kann jederzeit durch den Bediener manuell verändert
werden, wenn das Absammeln der Leukozyten nicht optimal verläuft. Im
Idealfall sollten ein Minimum an Erythrozyten und ein Maximum an WBK ge-
sammelt werden.
Ist der Durchlaufmodus beendet, wird der Rückführmodus gestartet,
um dem Spender Erythrozyten und den überwiegenden Teil des plättchenrei-
chen Plasmas wieder zurückzugeben. Dabei wird physiologische Kochsalz-
lösung (NaCl-Zuflussleitung) in das Aphereseset geleitet. Das COBE Spectra
Apheresesystem spült das erythrozytenreiche Plasma durch Zuführung der
NaCl-Lösung aus dem Aphereseset. Schließlich wird das Rückflussventil des
Spectra Systems geöffnet, um dem Spender das erythrozytenreiche Plasma
zurückzuführen.
3.2.2.5 Gewinnung CD14-positiver Zellen mit der COBE Spectra Im Durchlaufmodus des Spectra Systems bildet sich in der Mitte des Ein-
phasen-WBK-Kanals eine Leukozytenschicht aus, die CD14-positive Zellen
enthält. Diese Leukozyten werden anschließend über den WBK-Sammel-
schlauch in den WBK-Sammelbeutel geleitet. Die äußere Schicht des Trenn-
kanals bilden die Erythrozyten, die innere Schicht das thrombozytenreiche
Plasma. Die Schnittstelle zwischen Erythrozyten und Plasma wird durch das
Spectra System zunächst automatisch eingestellt, kann jedoch vom Bediener
manuell verändert werden, wenn entweder zu viele Erythrozyten oder zu we-
nige Leukozyten gesammelt werden. Eine optimale Einstellung der Schnitt-
stelle zwischen Plasma und Zellen gewährleistet einen möglichst hohen Leu-
kozytenanteil im Apheresekonzentrat bei niedrigem Gehalt an verunreinigen-
den Erythrozyten. Die Kontrolle erfolgt hierbei durch ein Colorgramm, mit
dessen Hilfe der Hämatokritwert im Sammelschlauch geprüft wird. Bei dun-
kelroter Farbe des gesammelten Buffy Coats ist die Beimischung von Ery-
throzyten hoch, bei rosaroter Farbe gering, wobei bei niedrigem Hämato-
kritwert im Produkt auch der Anteil an mononukleären Zellen zunimmt.
33
3.3 Ablauf der Leukozytapherese
Alle Blutspender, die an dieser Studie teilnahmen, wurden vor der Leukozyt-
apherese sorgfältig aufgeklärt und willigten schriftlich in das Verfahren ein.
Sie erfüllten allesamt die Vorgaben der aktuellen Hämotherapie-Richtlinien
zur Blutspendeeignung und waren HIV-, HBV- und HCV-negativ getestet.
Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Friedrich-Alexan-
der-Universität Erlangen-Nürnberg genehmigt und befindet sich zudem im
Einklang mit den oben genannten Richtlinien (71).
Die Buffy Coat-Sammlung erfolgte mit dem COM.TEC Zellseparator
unter Verwendung des MNC-Programmes, das mit der einstufigen PL1-Kam-
mer arbeitet. Die Zentrifugengeschwindigkeit betrug hierbei 1500 U/min.
(Zentrifugalkraft: 297 x g; Kopplungsparameter [CP]: 212). Die zu verglei-
chende Einstellungsoption arbeitete mit einer Zentrifugengeschwindigkeit von
1000 U/min.. Der Blutfluss betrug bei allen Leukapheresen 50 ml/min., das
Verhältnis ACD-A zu Vollblut war initial auf 1:10 und das Zyklusvolumen auf
400 mL eingestellt. Alle übrigen Geräteeinstellungen orientierten sich an den
Empfehlungen des Herstellers.
Die Gewinnung von Buffy Coat mit dem Spectra System erfolgte im
WBK-Programm. Während des sogenannten Durchlaufmodus wurde zu-
nächst im Einphasen-WBK-Kanal Vollblut der Spender in seine Bestandteile
aufgetrennt (Prinzip: Differentialzentrifugation). Leukozyten (Buffy Coat), Ery-
throzyten und plättchenreiches Plasma wurden anschließend aus dem
Trennkanal jeweils in einen extra Sammelbeutel geleitet. Der die gewünsch-
ten CD14-positiven Zellen enthaltende Leukozyten-Sammelbeutel wurde zur
Wieterverarbeitung aufbewahrt, während Erythrozyten und Plasma dem
Spender nach der Sammlung im sogenannten Rückführmodus wieder zu-
rückgegeben wurden.
Die Leukapherese mit dem Spectra Apheresesystem erfolgte unter
Verwendung zweier verschiedener Zentrifugendrehzahlen und Blutflussraten.
Bei einer Einlass-Blutflussrate von 50 mL/min. ergab sich eine Zentrifugenge-
schwindigkeit von 646 U/min., bei einer Blutflussrate von 60 mL/min. eine
Zentrifugengeschwindigkeit von 708 U/min.. Das Verhältnis von Antikoagu-
lans zu Vollblut war initial auf 1:12 (ACD-A:Vollblut) eingestellt und die Spen-
34
dezeit auf 120 Minuten festgelegt. Die Sammelrate von Buffy Coat betrug 1
mL/min.. Diese Einstellungen konnten im Laufe des Verfahrens vom Bedie-
ner modifiziert werden, um die Sammlung zu optimieren. Die Plasmapumpe
wurde hierzu via Plasmaflussrate unter Kontrolle der Farbe des Sammel-
schlauches mithilfe des Colorgramms eingestellt, wobei der Ziel-Hämato-
kritwert im Apheresat zwischen 2% und 5 % liegen sollte. Die übrigen Durch-
laufparameter wurden vom Spectra System anhand der Spenderdaten Ge-
schlecht, Größe, Gewicht und Hämatokrit berechnet.
3.4 Monozyten 3.4.1 Probengewinnung und Probenvorbereitung
Bei allen Spendern wurden vor Beginn und nach Ende der Leukozytapherese
sowie aus dem gewonnenen Zellkonzentrat Blutproben entnommen (2 mL
peripheres Vollblut mit EDTA antikoaguliert). In den meisten Fällen wurde zu-
sätzlich Plasma gesammelt und daraus ebenfalls Blutproben entnommen.
Der Zellgehalt dieser Blutproben wurde an einem Blutbildautomaten (K1000,
Sysmex, TOA Medicals, Kobe, Japan) ermittelt und folgende Parameter ge-
messen: Erythro-, Thrombo- und Leukozytenkonzentration (sowie Leukozy-
tenpopulationen), Hämoglobingehalt, Hämatokrit und mittleres korpuskuläres
Volumen (MCV). Um die Monozytenfraktion der Leukozyten zu bestimmen,
wurde unter Verwendung der May-Grünwald-Färbung ein Leukozyten-Dif-
ferential-Blutbild angefertigt. Alle Blutproben wurden mit dem FACS Calibur-
Durchflusszytometer hinsichtlich des Anteils der CD45+14+ Monozyten
untersucht.
Das Verfahren der Durchflusszytometrie wurde angewendet, um die in
den Blutproben enthaltenen Monozyten und deren Subpopulationen zu be-
stimmen. Vor Beginn der Durchflusszytometrie wurden die Blutproben zu-
nächst mit der „Lyse-no-wash“-Methode für die indirekte Immunfluoreszenz
vorbereitet. Je 50 µL jeder EDTA-Blutprobe wurden mit den fluorochrom-
markierten monoklonalen Antikörpern CD45-Fluorescein und CD14-Phyco-
erythrin (beide Becton Dickinson) versetzt und 15 Minuten unter Zugabe von
35
1 mL FACS „Lysing Solution“-Lösung (Becton Dickinson) in dunkler Umge-
bung bei Raumtemperatur inkubiert. Die monoklonalen Antikörper CD14 und
CD16 wurden zur weiteren Differenzierung der Monozyten und Analyse der
Zellpulationen CD14+CD16-, CD14+CD16+ und CD14-CD16+ im Apheresat
verwendet. Der monoklonale Antikörper CD62 wurde dazu verwendet, Mono-
zyten-Thrombozyten-Aggregate zu bestimmen, die sich nach der Leukaphe-
rese regelmäßig im Konzentrat bilden. Nach Ablauf der Inkubationszeit wur-
den die gefärbten Blutproben mit dem FACS Calibur Durchflusszytometer
analysiert. Die Identifikation der Monozytenpopulationen erfolgte anhand
ihrer Position im Vorwärts- und Seitwärts-Scatter, welche von den morpholo-
gischen Charakteristika der jeweiligen Zelle abhängt. Die Monozyten wurden
anhand der Expression des CD14-Antigens als Anteil der CD45-positiven
Leukozyten definiert.
3.4.2 Durchflusszytometrische Zellanalyse
Die Durchflusszytometrie dient der Unterscheidung von Zellen anhand von
Antigenexpression und Morphologie (Größe und Granularität). Das Verfahren
basiert darauf, dass Einzelzellen in Suspension unterschiedliche Fluores-
zenz- und Streulichteigenschaften haben, anhand derer sie voneinander ab-
gegrenzt und analysiert werden können. Zusätzlich können die Zellen mit Hil-
fe von Antikörpern, die an Fluoreszenz-Farbstoffe gekoppelte wurden, mar-
kiert werden, um spezielle intra- und extrazelluläre Antigene darzustellen.
Meist werden hierfür monoklonale Antikörper verwendet. Im Durchflusszyto-
meter können die so markierten Zellen durch Laserlicht erfasst werden. Hier-
zu werden die Zellen von einem mikroskopisch kleinen Flüssigkeitsstrahl auf-
genommen und durch dünne Kapillaren geleitet, so dass sie in einer Reihe
hintereinander angeordnet liegen, wie Perlen an einer Kette. Anschließend
werden sie durch einen gebündelten Laserstrahl geleitet, dessen Fokus im
Messbereich der Kammer des Durchflusszytometers liegt. Durch Verwen-
dung eines Argon Lasers (488 nm) werden die mit Farbstoff markierten Anti-
körper, die zuvor an Zellrezeptoren gebunden wurden, zur Fluoreszenz an-
geregt. Das Durchflusszytometer analysiert die Fluoreszenz der Farbstoffe,
36
die jeweils ein charakteristisches Anregungs- und Emissionsspektrum auf-
wiesen und so voneinander unterschieden werden können. Häufig einge-
setzte Farbstoffe sind beispielsweise Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) und
Phycoerythrin (PE).
Die Zelle selbst streut das Licht zusätzlich, abhängig von ihrer Größe,
Form, Struktur und Granularität. Diese Lichtstreuung registriert das Durch-
flusszytometer über separate Detektoren als Durchlicht und Streulicht. Alle
entstehenden Lichtsignale werden durch Linsen gebündelt und nach Um-
wandlung in elektrische Signale von sensitiven Detektoren registriert. Die aus
der Lichtstreuung und der emittierten Wellenlänge der fluoreszierenden Farb-
stoffe gebildeten elektronischen Signale werden für jede einzelne Zelle regi-
striert. Die Durchflusszytometrie ist also ein Verfahren, das eine große An-
zahl einzelner Zellen in kurzer Zeit sehr genau misst und analysiert.
Untersucht man Leukozyten mit dem Durchflusszytometer, lassen sich
Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten bereits ohne Verwendung fluo-
reszierender Antikörper anhand der physikalischen Eigenschaften unter-
scheiden, da sie aufgrund unterschiedlicher Form, Größe und Granularität
ein ganz spezifisches „Scatterbild“ der Lichtstreuung erzeugen. Anhand des
Scatterbildes können die Populationen auf dem Bildschirm klar voneinander
abgegrenzt werden (Vorwärts- und Seitwärts-Scatter-Ansicht der Leukozy-
tenpopulationen). Zudem liegen die Zellpopulationen bei richtiger Geräteein-
stellung an typischer Position und können mit fluoreszierenden Antikörpern
weiter differenziert und charakterisiert werden.
3.4.3 Monozytensubpopulationen und Monozyten-Thrombozyten-
Aggregate
Mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurden die einzelnen Monozytensubpopu-
lationen CD14+CD16-, CD14+CD16+ und die CD14-CD16+ Zellen in den A-
pheresaten analysiert. Neben ihrer Konzentration wurde ihr Gehalt (Yield) im
Konzentrat bestimmt. Der Zellgehalt pro Liter prozessiertes Blutvolumen, der
Zellgehalt pro Minute (Collection Rate), die Sammeleffizienz (Collection Effi-
ciency) und der Rekrutierungsfaktor (Recruitment Factor) wurden berechnet.
37
In gleicher Weise wurden die Monozyten-Thrombozyten-Aggregate (CD14+
CD62+) analysiert, die sich nach der Leukapherese regelmäßig im Konzen-
trat ausbilden.
3.5 Spenderkollektiv Alle Blutspender, die an der Studie teilnahmen, waren gesund und entspra-
chen sowohl den Spendereignungskriterien der Hämotherapie-Richtlinien
(71) als auch den Empfehlungen des Council of Europe in der jeweils gülti-
gen Fassung. Alle wurden schriftlich über den Verwendungszweck der Spen-
de und den wissenschaftlichen Hintergrund der Studie aufgeklärt und gaben
ihre schriftliche Einwilligung. Die Spender wurden über den Studieninhalt da-
hingehend informiert, dass diese Untersuchungen der technischen Optimie-
rung der verwendeten Sammelverfahren dienen. Alle Aufklärungs- und
Fragebögen, sowie die Einverständniserklärung der Spender wurden zusam-
men mit dem Studienprofil der Ethikkommission der medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt und ange-
nommen (Ethikvoten Nr. 2247 und 2555).
Spender, die alle Spendereignungskriterien erfüllten, bei denen sich
aber aufgrund gehäufter Infekte oder niedriger Leukozytenzahlen (< 3000/µL
Blut) eine Störung der zellulären Immunabwehr vermuten ließ, wurden nicht
in die Studie aufgenommen. Eine Spende dauerte zwischen 60 und 185 Mi-
nuten. Nach jeder Spende wurden die Spender anhand eines Fragebogens
nach möglichen aufgetretenen Beschwerden gefragt, wobei darauf hinge-
wiesen wurde, nicht nur während oder kurz nach der Spende, sondern auch
längerfristig bestehende Befindlichkeitsstörungen anzugeben. Hierzu gehör-
ten Fragen nach einer möglichen Zitrat-Unverträglichkeit, welche durch ACD-
A, ein Zitronensäure-haltiges Antikoagulans, ausgelöst werden und sich in
Kribbelparästhesien der Extremitäten oder in Muskelkrämpfen äußern kann.
Desweiteren wurde nach Hinweisen auf verminderte körperliche Be-
lastbarkeit, ungewöhnliche Müdigkeit oder erhöhte Infektanfälligkeit gefragt.
38
3.6 Statistische Datenauswertung
Die gesammelten Daten wurden mit dem Tabellenkalkulationsprogramm
SPSS® (SPSS® für Windows®, Version 15.1, SPSS Inc., Chicago, Illinois,
USA) eingegeben und ausgewertet. Dabei wurde die Normalverteilung der
Daten mittels Shapiro-Wilks-Test überprüft. Waren Ergebnisse normalver-teilt, wurde der T-Test für ungepaarte oder gepaarte Stichproben durchge-
führt. Bei nicht-normalverteilten Ergebnissen erfolgte die statistische Analy-
se der Daten mit dem U-Test (Mann-Whitney-Wilcoxon). Unterschiede wur-
den in dieser Arbeit dann als signifikant eingestuft, wenn sich die Mittelwerte
der Daten signifikant (p ≤ 0,05) oder hoch signifikant (p ≤ 0,01) unterschieden
und die Irrtumswahrscheinlichkeit unter 5% lag.
Für die graphische Darstellung der Daten wurde der Box-and-
Whiskers-Plot (kurz als Boxplot bezeichnet) verwendet. Die in den Blutpro-
ben (vor der Spende, nach der Spende, im Apheresat) enthaltenen Zellpopu-
lationen konnten dadurch in einer deskriptiven Statisitk anschaulich darge-
stellt werden. Dabei wurden alle Boxplots, die die Ergebnisse eines Zellsepa-
rators bzw. einer Geräteeinstellung widerspiegeln, jeweils in anderer Farbe
gekennzeichnet als die Kästchen der Vergleichsgruppe, um eine Unterschei-
dung zu erleichtern. Fünf wichtige Kenngrößen werden im Boxplot darge-
stellt: Die Querlinie unterhalb bzw. oberhalb des Kästchens bildet das 25%-
bzw. das 75%-Quantil ab. Der Balken zwischen diesen Quantilen stellt den
Median (50%-Quantil) dar, der Bereich zwischen dem 75%- und dem 25%-
Quantil wird als Interquartilbereich bezeichnet und in Form des Kästchens
dargestellt. Das Kästchen zeigt also die Verteilung der mittleren 50% der
Werte an. Liegt der Median genau in der Mitte des Kästchens, ist die Vertei-
lung der Werte symmetrisch. Dann entspricht der Median dem Mittelwert. Be-
findet sich der Median nicht in der Mitte, sondern ist zu einem Rand des
Kästchens hin verschoben, ist die Verteilung um den Median schief und Me-
dian und Mittelwert entsprechen sich nicht.
39
3.7 Berechnungen und Formeln
Die Konzentration der CD14-positiven Zellen vor der Spende, nach der
Spende, sowie im Konzentrat wurde folgendermaßen berechnet:
(1) Zellkonzentration [Zellen/µL] = CD14+ [%] × WBC [Zellen/µL] / 100
Die Anzahl CD14-positiven Zellen pro Liter Vollblut wurde auf folgende Wei-
se berechnet:
(2) CD14+ im Vollblut = Zellkonzentration [Zellen/µL] × TBV [mL]
Der Gewinn („yield“, Y) einer Zellpopulation im Apheresat wurde wie folgt be-
rechnet:
(3) Zellgehalt (Yield) = Zellkonzentration im Produkt [Zellen/µL] x Konzentratvolumen [mL]
Der Zellgewinn pro Liter prozessiertes Blutvolumen wurde so berechnet:
(4) Zellgehalt pro Liter PBV* [Zellen/L] = Yield / PBV [L]
*PBV (prozessiertes Blutvolumen [mL] ) = totales Blutvolumen [mL] – ACD-
A-Volumen [mL]
Die Sammelrate (SR), d.h. der pro Minute erzielte Zellgewinn, wurde folgen-
dermaßen berechnet:
(5) SR [Zellen/ min.] = Yield / Separationszeit [min.]
40
Die Berechnung der Sammeleffizienz („collection efficiency“, CE) erfolgte fol-
gendermaßen:
(6) CE [%] = (Yield x 100) / [PBV [mL] x 0,5 x (ZK vor der Spende [Zellen
/µL]+ ZK nach der Spende [Zellen/µL])]
Berechnung des Rekrutierungsfaktors („recruitment factor“, RF):
(8) RF = (absolute Zellzahl nach der Spende + absolute Zellzahl im
Apheresat) / absolute Zellzahl vor der Spende
41
4. Ergebnisse
Insgesamt nahmen 72 Blutspender an der Studie teil (n = 72). Davon waren
15 Personen weiblichen und 57 Personen männlichen Geschlechts.
4.1 Separationsergebnisse mit dem COBE Spectra Zellseparator
4.1.1 Sammelergebnisse mit varianter Zentrifugendrehzahl
In einem ungepaarten Vergleich wurden die Sammelergebnisse der COBE
Spectra hinsichtlich der Verwendung unterschiedlicher Zentrifugendrehzah-
len miteinander verglichen. Spender, die mit der Zentrifugengeschwindigkeit
von 646 U/min. des Standard-WBK-Programmes (Blutfluss: 50 mL pro Minu-
te) leukapheresiert wurden, werden im Folgenden als Gruppe A bezeichnet
und Spender, bei denen mit der modifizierten Zentrifugendrehzahl von 708
U/min. (Blutfluss: 60 mL pro Minute) zentrifugiert wurde, als Gruppe B. Alle
relevanten Spenderdaten und Geräteeinstellungen sind in Tabelle 1 zusam-
mengefasst.
Tabelle 1: Spender- und Gerätedaten
Messung (MW ± SA) 646/50 708/60 p-Wert
Anzahl der Spender 29 20
Männlich/weiblich 20/9 20/0
Gewicht (kg) 74,9 ± 10,5 81,6 ± 13,3 0,06*
Separationszeit (min.) 115 ± 17 118 ± 13 0,62*
PBV (mL) 5791 ± 849 6948 ± 789 0,00*
TBV (mL) 5015 ± 767 5530 ± 822 0,03*
Konzentrat-Volumen (mL) 109 ± 17 111 ± 14 0,57*
* T-Test, ♦ U-Test
Die Leukapheresen mit der COBE Spectra dauerten durchschnittlich 115 Mi-
nuten (646 U/min.) bzw. 118 Minuten (708 U/min.). Die totalen Blutvolumina
(TBV) der Spender beider Gruppen differierten signifikant (p = 0,03). Bei
42
Verwendung einer höheren Blutflussrate von 60 mL/min., die mit einer höhe-
ren Zentrifugendrehzahl verbunden war, wurde ein signifikant größeres Blut-
volumen (Mittelwert: 6948 mL) prozessiert als bei Leukapheresen, die mit
niedrigerer Blutflussrate (50 mL/min.) separiert wurden (Zentrifugendrehzahl:
646 Umdrehungen pro Minute, Mittelwert: 5791 mL). Die gewonnenen Kon-
zentratvolumina der beiden Gruppen unterschieden sich nicht signifikant.
Tabelle 2 zeigt die Blutwerte der Spender vor und nach der Leukaphe-
rese. Dabei fanden sich beim Vergleich der beiden Gruppen keine signifi-
kanten Unterschiede für die einzelnen analysierten Zellpopulationen mit Aus-
nahme der Erythrozyten (RBC). Deren Konzentration war in den vor und
nach Ablauf der Leukapherese entnommenen Blutproben von Spendern der
Gruppe B hinsichtlich des Mittelwertes signifikant höher als in den Blutproben
der Vergleichsgruppe.
Tabelle 2: Ergebnisse der Blutproben vor und nach der Spende
Messung (MW ± SA) 646/50 708/60 p-Wert
WBCs (x109/L)
Vor der Spende
5,74 ± 1,45
5,82 ± 1,01
0,64♦
Nach der Spende 5,68 ± 1,41 5,35 ± 1,42 0,21♦
CD14+ Zellen (%)
Vor der Spende 7,71 ± 1,90 7,09 ± 1,56 0,24*
Nach der Spende 7,26 ± 1,67 6,98 ± 1,76 0,57*
CD14+ Zellen (x106/L)
Vor der Spende 436 ± 136 398 ± 158 0,38*
Nach der Spende 406 ± 116 360 ± 164 0,26*
RBCs (x1012/L)
Vor der Spende 4,73 ± 0,39 5,06 ± 0,36 0,00*
Nach der Spende 4,57 ± 0,40 4,81 ± 0,36 0,04*
PLTs (x109/L)
Vor der Spende 228 ± 37 217 ± 43 0,23♦
Nach der Spende 204 ± 37 206 ± 89 0,18♦
* T-Test, ♦ U-Test
43
Tabelle 3 gibt einen Überblick über die Produktdaten der beiden Gruppen.
Die Leukozytenkonzentration im Apheresat lag zwischen 24,7 x 109 und 84,2
x 109 pro Liter (646 U/min.) bzw. zwischen 16,5 x 109 und 55,2 x 109 Leuko-
zyten pro Liter (708 U/min.). Die Mittelwerte der Leukozyten-konzentrationen
unterschieden sich bei beiden Geräteeinstellungen nicht signifikant. Ebenso
war der durchschnittliche Prozentsatz an CD14-positiven Zellen in den Kon-
zentraten der Gruppe A (Spannbreite: 9,0% bis 34,4%) und denen der Grup-
pe B (Spannbreite: 12,8% bis 31,7%) fast gleich. Auch die Erythrozyten- und
Thrombozytenzahlen im Konzentrat zeigten keine signifikanten Unterschiede
zwischen den beiden Gruppen. In den Leukapheresaten der Gruppe A waren
im Durchschnitt höhere Erythrozyten- und minimal höhere Thrombozyten-
konzentrationen enthalten als in denen der Vergleichsgruppe.
Tabelle 3: Produktdaten der Leukozyten und der Restzellen
Messung (MW ± SA) 646/50 708/60 p-Wert
WBCs (x109/L) 40,1 ± 11,9 42,1 ± 12,2 0,29♦
CD14+ Zellen (%) 19,3 ± 5,52 21,2 ± 5,85 0,30♦
RBCs (x1012/L) 0,88 ± 0,39 0,76 ± 0,25 0,22*
PLTs (x109/L) 875 ± 297 857 ± 340 0,74♦
* T-Test, ♦ U-Test
Die absolute Monozytenanzahl (CD14+CD16-) im Apheresat variierte zwi-
schen 0,27 x 109 und 1,19 x 109 (646 U/min.) bzw. zwischen 3,56 x 109 und
15,5 x 109 (708 U/min.) Zellen. Zwar wurden bei höherem Blutfluss und hö-
herer Zentrifugengeschwindigkeit (708 U/min.) durchschnittlich höhere Mono-
zytenwerte bei Zellkonzentration, Zellgehalt, Yield pro Liter PBV und Yield
pro Minute erzielt, die Unterschiede zur Vergleichsgruppe waren aber nicht
statistisch signifikant (Tabelle 4). Die Absammlung von CD14+CD16- Mono-
zyten gelang im Durchschnitt bei höherem Blutfluss mit 708 U/min. effizienter
(Spannbreite: 22,6% bis 61,3%) als bei Verwendung eines Blutflusses von 50
mL/min. bei niedrigerer Zentrifugendrehzahl (Spannbreite: 16,8% bis 58,2%).
Der errechnete Rekrutmentfaktor war für Monozyten bei beiden Gruppen fast
identisch (p = 0,99).
44
Tabelle 4: Produktdaten der CD14+CD16- Zellen (Monozyten)
Messung (MW ± SA) 646/50 708/60 p-Wert
CD14+CD16- (x109/L) 7,61 ± 2,52 9,00 ± 3,82 0,13*
CD14+CD16- Yield (x109) 0,82 ± 0,28 1,01 ± 0,49 0,10*
CD14+CD16- Yield/L PBV (x108) 1,57 ± 0,53 1,59 ± 0,69 0,90*
CD14+CD16- CR (x107/min.) 0,71 ± 0,23 0,85 ± 0,37 0,12*
CD14+CD16- CE (%) 37,7 ± 10,2 40,1 ± 12,7 0,50*
CD14+CD16- RF 1,35 ± 0,21 1,35 ± 0,24 0,99*
* T-Test, ♦ U-Test
Wie Tabelle 5 zeigt, waren Konzentration, Yield, Yield pro Liter PBV, Yield
pro Minute (Collection Rate) und Sammeleffizienz der CD14+CD16+ Subpo-
pulation in den Konzentraten der Gruppe B im Durchschnitt höher. Zudem
waren die Gewinne an CD14+CD16+ Monozyten in den Apheresaten der
Gruppe A deutlich variabler (Spannbreite: 0,04 x 107 bis 16,7 x 107 CD14+
CD16+ Zellen) als in den Produkten der Gruppe B (Spannbreite: 1,97 x 107
bis 10,5 x 107 Zellen). Alleine der Rekrutmentfaktor erreichte bei Spen-dern
der Gruppe A (50 mL/min.) höhere Werte. Alle beschriebenen Unterschiede
zwischen den Gruppen waren jedoch aufgrund der Streubreite der einzelnen
Werte und der kleinen Fallzahlen nicht statistisch signifikant.
Tabelle 5: Produktdaten der CD14+CD16+ Zellen
Messung (MW ± SA) 646/50 708/60 p-Wert
CD14+CD16+ (x106/L) 350 ± 318 419 ± 208 0,08♦
CD14+CD16+ Yield (x107) 3,82 ± 3,36 4,68 ± 2,57 0,07♦
CD14+CD16+ Yield/L PBV (x106) 7,33 ± 7,23 7,37 ± 3,75 0,38♦
CD14+CD16+ CR (x105/min.) 3,28 ± 2,94 3,95 ± 2,01 0,09♦
CD14+CD16+ CE (%) 46,5 ± 17,6 51,9 ± 17,1 0,30*
CD14+CD16+ RF 1,47 ± 0,46 1,33 ± 0,42 0,20♦
* T-Test, ♦ U-Test
Im Hinblick auf die CD14-CD16+ Zellpopulation gab es dagegen signifikante
Unterschiede zwischen beiden Gruppen (Tabelle 6). Die Zellkonzentration
45
und der Zell-Yield der CD14-CD16+ Zellen erreichten bei Leukapheresen mit
höherer Blutflussrate im Produkt signifikant höhere Werte (Spannbreite: 2,20
x 107 bis 16,2 x 107 Zellen) bei gleichzeitig etwas geringerem Restzellgehalt
als bei Leukapheresen mit der Standardeinstellung bei einem Separations-
faktor von 250 (Zentrifugendrehzahl: 646 U/min.). Die Spannbrei-te lag hier-
bei zwischen 0,18 x 107 und 12,9 x 107 Zellen.
Grafik 1: CD14-CD16+ Zellen im Konzentrat (pro Mikroliter)
Auch die Sammelrate, welche als prozessiertes Blutvolumen pro Minute defi-
niert ist, lag bei Apheresen mit höherem Blutfluss (60 mL pro Minute) mit
einem Durchschnittswert von 7,40 x 105 pro Minute signifikant höher als bei
Apheresen der Vergleichsgruppe (Mittelwert: 4,89 x 105; p = 0,02). Der Zell-
gehalt (Yield) pro Liter PBV und die Sammeleffizienz differierten dagegen
nicht signifikant zwischen den beiden Gruppen, wobei bei Leukapheresen
der Gruppe A gelegentlich CD14-CD16+ Sammeleffizienzen von über 100%
erreicht wurden (Spannbreite: 3,0% bis 120%). Bei Leukapheresen der Grup-
46
pe B reichte die Sammeleffizienz von 15,2% bis zu 76,8% und die Spann-
breite zwischen den einzelnen Messungen war damit deutlich geringer als
bei der Vergleichsgruppe.
Tabelle 6: Produktdaten der CD14-CD16+ Zellen
Messung (MW ± SA) 646/50 708/60 p-Wert
CD14-CD16+ (x106/L) 522 ± 287 785 ± 390 0,04♦
CD14-CD16+ Yield (x107) 5,69 ± 3,31 8,90 ± 4,77 0,04♦
CD14-CD16+ Yield/L PBV (x106) 10,8 ± 5,98 13,7 ± 6,82 0,21♦
CD14-CD16+ CR (x105/min.) 4,89 ± 2,66 7,40 ± 3,72 0,02*
CD14-CD16+ CE (%) 41,1 ± 24,7 47,6 ± 18,3 0,33*
CD14-CD16+ RF 1,49 ± 0,53 1,63 ± 1,07 0,94♦
* T-Test, ♦ U-Test
Die in den Aphereseprodukten gemessenen Konzentrationen an Monozyten-
Thrombozyten-Aggregaten unterschieden sich nicht signifikant voneinander.
Gleiches galt für die berechneten Werte Yield, Yield pro Liter PBV, Collection
Rate, Sammeleffizienz und Rekrutmentfaktor. Alle Werte waren im Test auf
Normalverteilung nach Shapiro-Wilk nicht normalverteilt. Die Signifikanz wur-
de deshalb mit dem Wilcoxon-Test für (un-)verbundene Stichproben berech-
net.
Tabelle 7: Monozyten-Thrombozyten-Aggregate (CD14+CD62+) im Produkt
Messung (MW ± SA) 646/50 708/60 p-Wert
CD14+CD62+ (x106/L) 419 ± 646 465 ± 669 0,49♦
CD14+CD62+ Yield (x106) 49,7 ± 90,9 49,7 ± 67,8 0,44♦
CD14+CD62+ Yield/L PBV (x106) 8,60 ± 13,2 8,09 ± 11,4 0,87♦
CD14+CD62+ CR (x105/min.) 3,91 ± 6,03 4,35 ± 6,12 0,51♦
CD14+CD62+ CE (%) 157 ± 243 297 ± 426 0,49♦
CD14+CD62+ RF 2,27 ± 5,89 2,70 ± 4,21 0,61♦
* T-Test, ♦ U-Test
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit Erhöhung der Blutflussrate von
50 mL pro Minute auf 60 mL pro Minute und damit der Zentrifugendrehzahl
47
(von 646 U/min. auf 708 U/min.) die Sammelergebnisse der COBE Spectra
sowohl quantitativ als auch qualitativ verbessert werden konnten. In ver-
gleichbarer Spendezeit wurden bei Leukapheresen mit einer Blutflussrate
von 60 mL/min. durchschnittlich größere Blutvolumina prozessiert und daher
größere Mengen an Leukozyten gesammelt. Auch die gewünschte Zellfrak-
tion der CD14-positiven Zellen sowie die analysierten Subpopulationen, ins-
besondere die CD14-CD16+ Zellen, waren bei Verwendung der höheren
Blutflussrate in größerer Zahl in den Apheresaten enthalten. Gleichzeitig war
der Restzellgehalt hier niedriger.
4.1.2 Sammelergebnisse im Hinblick auf das Verhältnis von
prozessiertem zu totalem Blutvolumen
In einem zweiten ungepaarten Vergleich wurden die Sammelergebnisse der
COBE Spectra mit Blick auf das Verhältnis von prozessiertem zu totalem
Blutvolumen analysiert. Spender, deren PBV-TBV-Verhältnis zwischen 0,8
und 1,2 betrug, wurden zur Gruppe A zusammengefasst und Spender, deren
PBV-TBV-Verhältnis zwischen 1,2 und 1,6 lag, zur Gruppe B. Alle Daten der
Spender und der Produkte sind in Tabelle 8 zusammengefasst.
Tabelle 8: Spender- und Gerätedaten
Messung (MW ± SA) 0,8 – 1,2 (Gr. A) 1,2 – 1,6 (Gr. B) p-Wert
Anzahl der Spender 32 27
Männlich/weiblich 28/4 18/9
Gewicht (kg) 80,6 ± 11,8 71,7 ± 11,3 0,005*
Separationszeit (min.) 116 ± 9,92 127 ± 19,2 0,01*
PBV (mL) 6047 ± 776 6958 ± 1088 0,001*
TBV (mL) 5472 ± 739 4722 ± 742 0,00*
Konzentrat-Volumen (mL) 111 ± 10,4 118 ± 22,5 0,43♦
* T-Test, ♦ U-Test
Die Separationszeit unterschied sich zwischen beiden Gruppen signifikant
(p = 0,01). In dieser Zeit wurden im Schnitt 111 mL (Gruppe A) bzw. 118 mL
48
(Gruppe B) Apheresat gewonnen. Die Leuko- und Thrombozytenzahlen vor
der Spende sowie der Anteil der CD14+ Zellen an den Gesamtleukozyten
waren bei beiden Gruppen nicht signifikant verschieden. Die Erythrozyten-
zahl vor der Spende unterschied sich signifikant (Tabelle 9). Gleiches galt für
die nach der Spende entnommenen Blutproben.
Tabelle 9: Ergebnisse der Blutproben vor und nach der Spende
Messung (MW ± SA) 0,8 – 1,2 1,2 – 1,6 p-Wert
WBCs (x109/L)
Vor der Spende 6,03 ± 1,29 5,71 ± 1,4 0,09♦
Nach der Spende 5,75 ± 1,40 5,41 ± 1,50 0,25♦
CD14+ Zellen (%)
Vor der Spende 7,24 ± 1,69 7,92 ± 2,11 0,18*
Nach der Spende 7,08 ± 1,58 7,07 ± 1,91 0,995*
CD14+ Zellen (x106/L)
Vor der Spende 442 ± 149 431 ± 170 0,79*
Nach der Spende 406 ± 129 362 ± 131 0,19*
RBCs (x1012/L)
Vor der Spende 4,94 ± 0,36 4,72 ± 0,40 0,03*
Nach der Spende 4,76 ± 0,32 4,51 ± 0,41 0,01*
PLTs (x109/L)
Vor der Spende 223 ± 39 231 ± 50 0,61♦
Nach der Spende 206 ± 72 194 ± 38 0,82♦
* T-Test, ♦ U-Test
Die Produktdaten der Leukapheresen sind in Tabelle 10 zusammengefasst.
Die Leukozytenkonzentration im Apheresat variierte zwischen 16,5 x 109 und
84,2 x 109 (PBV/TBV 0,8 – 1,2) bzw. zwischen 32,3 x 109 und 55,5 x109 pro
Liter (PBV/TBV 1,2 – 1,6). Die T- und U-Teste differierten hinsichtlich der mit-
tleren Leukozytenkonzentration in den Apheresaten. Im Gegensatz zum nicht
statistisch signifikanten Ergebnis des U-Tests unterschied sich die mittlere
Leukozytenkonzentration in den Produkten der Vergleichsgruppen nach Aus-
sage des T-Tests signifikant voneinander. Da die Werte aber nicht normal-
verteilt waren, gilt der im U-Test berechnete p-Wert. Der Anteil der CD14-
49
positiven Zellen an den Gesamtleukozyten lag bei Spendern der Gruppe A
zwischen 9,0% und 34,4% (Spender der Gruppe B: 14,5% - 31,7%).
Tabelle 10: Produktdaten der Leukozyten und der Restzellen
Messung (MW ± SA) 0,8 – 1,2 1,2 – 1,6 p-Wert
WBCs (x109/L) 40,5 ± 12,2 51,6 ± 24,8 0,06♦
CD14+ Zellen (%) 20,2 ± 6,94 21,7 ± 5,66 0,39*
RBCs (x1012/L) 0,92 ± 0,39 0,69 ± 0,21 0,007*
PLTs (x109/L) 1016± 518 1655±2071 0,74♦
* T-Test, ♦ U-Test
Die Thrombozytenkonzentration im Produkt war bei den Spendern mit höhe-
rem PBV-TBV-Verhältnis (Spannbreite: 486 x 109 bis 3297 x 109 pro Liter)
deutlich, wenn auch wegen der großen Streubreite der Einzelwerte nicht sig-
nifikant höher als bei den Spendern mit niedrigem PBV-TBV-Verhältnis
(Spannbreite: 363 x 109 bis 1632 x 109 pro Liter). Anders verhielt es sich mit
der Erythrozytenkonzentration im Apheresat, welche bei Spendern mit ho-
hem PBV-TBV-Verhältnis (1,2 – 1,6) deutlich (p = 0,007) niedriger (Mittel-
wert: 0,69 x 1012/L) war als bei Spendern mit niedrigem PBV-TBV-Verhältnis
(Mittelwert: 0,92 x 1012/L).
Tabelle 11: Produktdaten der CD14+CD16- Zellen (Monozyten)
Messung (MW ± SA) 0,8 – 1,2 1,2 – 1,6 p-Wert
CD14+CD16- (x109/L) 8,03 ± 3,10 11,9 ± 9,10 0,047*
CD14+CD16- Yield (x109) 0,89 ± 0,34 1,38 ± 1,03 0,03*
CD14+CD16- Yield/L PBV (x108) 1,64 ± 0,68 2,08 ± 1,19 0,08*
CD14+CD16- CR (x107/min.) 0,77 ± 0,29 1,06 ± 0,67 0,03*
CD14+CD16- CE (%) 38,7 ± 11,4 49,8 ± 16,8 0,004*
CD14+CD16- RF 1,31 ± 0,21 1,47 ± 0,20 0,003♦
* T-Test, ♦ U-Test
Tabelle 11 gibt einen Überblick über die Produktdaten der CD14+CD16- Mo-
nozyten. Sie zeigt, dass ein hohes PBV-TBV-Verhältnis (1,2 - 1,6) der Spen-
der zu signifikant höheren Erträgen an CD14+CD16- Zellen (Spannbreite:
50
0,58 x 109 bis 1,81 x 109 Zellen) im Produkt führte als ein niedriges PBV-
TBV-Verhältnis (Spannbreite: 0,27 x 109 bis 1,24 x 109 Zellen).
Grafik 2: CD14+CD16- Gehalt im Konzentrat (x 109)
Gleiches galt für die CD14+CD16- Konzentration (p = 0,047), den pro Minute
erzielten Zellgehalt (p = 0,03) sowie für Sammeleffizienz (p = 0,004) und
Rekruitment Factor (p = 0,003). Lediglich die Sammelrate zeigte keine signifi-
kanten Unterschiede zwischen den Vergleichsgruppen.
Tabelle 12: Produktdaten der CD14+CD16+ Zellen
Messung (MW ± SA) 0,8 – 1,2 1,2 – 1,6 p-Wert
CD14+CD16+ (x106/L) 380 ± 317 582 ± 564 0,08♦
CD14+CD16+ Yield (x107) 4,13 ± 3,20 6,81 ± 6,40 0,04♦
CD14+CD16+ Yield/L PBV (x106) 7,87 ± 7,36 10,1 ± 7,88 0,13♦
CD14+CD16+ CR (x105/min.) 3,62 ± 2,97 5,16 ± 4,34 0,10♦
CD14+CD16+ CE (%) 46,6 ± 17,8 68,5 ± 26,8 0,001♦
CD14+CD16+ RF 1,33 ± 0,48 1,72 ± 0,51 0,001♦
* T-Test, ♦ U-Test
51
Wie Tabelle 12 zeigt, enthielten die Apheresate der Gruppe B im Schnitt
CD14+CD16+ Zellen in deutlich höheren Konzentrationen (Spannbreite: 180
x 106 bis 802 x 106 pro Liter) als die Apheresate der Gruppe A (Spannbreite:
4 x 106 bis 1724 x 106 pro Liter). Gleiches galt in geringerem Maße auch für
den Gehalt der CD14+CD16+ Zellen pro Liter PBV sowie für die Sammelrate.
Grafik 3: CD14+CD16+ Gehalt im Konzentrat (x 107)
Im Hinblick auf den Zellertrag waren die Mittelwerte der CD14+CD16+ Mono-
zytenpopulation in den Apheresaten der beiden Gruppen statistisch signifi-
kant (p = 0,04) verschieden. Ebenso verhielt es sich mit der Sammeleffizienz
(p = 0,001) und dem Rekrutierungsfaktor (p = 0,001). Die im Durchschnitt hö-
heren Zellerträge fanden sich dabei in den Apheresaten der Spender mit
hohem Verhältnis von prozessiertem zu totalem Blutvolumen.
52
Grafik 4: CD14+CD16+ Sammeleffizienz (in Prozent)
Die CD14-CD16+ Zellkonzentration erreichte in den Produkten Werte zwi-
schen 239 x 106 und 1430 x 106 (Gruppe B) bzw. zwischen 17 x 106 und
1175 x 106 (Gruppe A) pro Liter und unterschied sich bei den beiden Grup-
pen deutlich, aber nicht signifikant. Tabelle 13 gibt einen Überblick über die
relevanten Daten.
Tabelle 13: Produktdaten der CD14-CD16+ Zellen
Messung (MW ± SA) 0,8 – 1,2 1,2 – 1,6 p-Wert
CD14-CD16+ (x106/L) 606 ± 331 839 ± 524 0,06*
CD14-CD16+ Yield (x107) 6,66 ± 3,60 9,96 ± 6,41 0,02*
CD14-CD16+ Yield/L PBV (x106) 12,2 ± 6,75 15,0 ± 8,12 0,16*
CD14-CD16+ CR (x105/min.) 5,78 ± 3,10 7,65 ± 4,49 0,08*
CD14-CD16+ CE (%) 38,4 ± 18,4 61,5 ± 32,0 0,001*
CD14-CD16+ RF 1,38 ± 0,86 1,85 ± 0,73 0,00♦
* T-Test, ♦ U-Test
53
Auch im Hinblick auf die Population der CD14-CD16+ Zellen gab es sig-
nifikante Unterschiede zwischen den beiden Spenderkollektiven. Der Gehalt
an CD14-CD16+ Zellen war in den Apheresaten von Spendern mit hohem
Verhältnis von prozessiertem zu totalem Blutvolumen deutlich größer
(Spannbreite: 2,4 x 107 bis 16,2 x 107) als in den Apheresaten der Ver-
gleichsgruppe (Spannbreite: 0,2 x 107 bis 12,9 x 107). Gleiches galt für die
Sammeleffizienz, die bei Spendern der Gruppe B Werte zwischen 23,4% und
135% annahm, während sie bei Spendern der Gruppe A lediglich zwischen
3% und 78% lag. Eine Sammeleffizienz von mehr als 100% kann durch die
Rekrutierung von Leukozytensubpopulationen während der Apherese erklärt
werden (80). Dazu passt der im Gegensatz zur Vergleichsgruppe signifikant
höhere Rekrutmentfaktor bei Spendern mit hohem PBV-TBV-Verhältnis.
Grafik 5: CD14-CD16+ Gehalt im Konzentrat (x 107)
Die durchschnittliche Konzentration der Monozyten-Thrombozyten-Aggregate
(CD14+CD62+) war in den Produkten von Spendern mit hohem Verhältnis
54
von prozessiertem zu totalem Blutvolumen um den Faktor 2, der CD14+
CD62+ Yield sogar fast um den Faktor 3 höher (Spannbreite: 0,4 x 106 bis
726 x 106) als in den Produkten der Vergleichsgruppe (Spannbreite: 0,7 x 106
bis 91,9 x 106). Aufgrund der ausgeprägten Streubreite der einzelnen Mess-
werte erreichte dieser Unterschied aber keine statistische Rele-vanz.
Gleiches galt in geringerem Ausmaß für alle anderen in Tabelle 14 aufgeführ-
ten Werte. Alle Werte waren im Test auf Normalverteilung nach Shapiro-Wilk
nicht normalverteilt und die Signifikanz wurde deshalb mit dem Willcoxon-
Test für (un-)verbundene Stichproben berechnet.
Tabelle 14: Monozyten-Thrombozyten-Aggregate (CD14+CD62+) im Produkt
Messung (MW ± SA) 0,8 – 1,2 1,2 – 1,6 p-Wert
CD14+CD62+ (x106/L) 516 ± 957 1210±1615 0,08♦
CD14+CD62+ Yield (x106) 59,9 ± 119 152 ± 224 0,06♦
CD14+CD62+ Yield/L PBV (x106) 10,9 ± 21,6 22,3 ± 30,6 0,11♦
CD14+CD62+ CR (x105/min.) 5,06 ± 9,84 10,9 ± 14,4 0,10♦
CD14+CD62+ CE (%) 277 ± 452 383 ± 780 0,84♦
CD14+CD62+ RF 2,71 ± 5,91 3,72 ± 6,52 0,42♦
* T-Test, ♦ U-Test
Ein günstiges, also hohes Verhältnis von prozessiertem zu totalem Blutvolu-
men fand sich bei Spendern mit geringem Körpergewicht. Hierbei wurde das
TBV im Mittel mehr als einmal prozessiert und dies führte zu einer höheren
Leukozytenkonzentration in den Zellapheresaten. Im Vergleich zur Kontroll-
gruppe war die Verunreinigung des Apheresates mit Thrombozyten größer
und mit Erythrozyten geringer. Die einzelnen Monozytensubpopulationen
konnten bei Spendern mit hohem Verhältnis von prozessiertem zu totalem
Blutvolumen ebenfalls in höherer Zellkonzentration und mit besserer Sam-
meleffizienz gesammelt werden.
55
4.2 Separationsergebnisse mit dem COM.TEC Zellseparator
4.2.1 Sammelergebnisse mit varianter Zentrifugendrehzahl
Bei Leukapheresen mit dem COM.TEC Zellseparator wurden bei Gebrauch
des MNC-Programmes zwei verschiedene Zentrifugendrehzahlen, 1500
U/min. (Standard) und 1000 U/min. (modifiziert), verwendet und die jeweils
erzielten Ergebnisse in einem gepaarten Vergleich analysiert. Im Gegensatz
zur Untersuchung mit der COBE Spectra wurde hier die Blutflussrate
konstant bei 50 mL/min. gehalten. Zusätzlich wurde in einem ungepaarten
Vergleich eine weitaus größere Stichprobe von 79 Leukapheresen auf
Unterschiede hinsichtlich der Sammelergebnisse bei Einsatz dieser beiden
Zentrifugengeschwindigkeiten untersucht. Ein Mittelwertvergleich erfolgte in
diesem Fall aufgrund der Inhomogenität der beiden Gruppen nicht.
Tabelle 15: Spender- und Gerätedaten (gepaarte Analyse)
Messung (MW ± SA) U/min.=1500 U/min.=1000 p-Wert
Anzahl der Spenden 5 5
Männlich/weiblich 5/0 5/0
Gewicht (kg) 87,8 ± 7,73 87,4 ± 7,3 0,94*
Separationszeit (min.) 89,0 ± 1,23 96,4 ± 7,40 0,09*
Spillovervolumen (mL) 11,0 ± 1,90 9,04 ± 1,25 0,09*
PBV (mL) 4058 ± 77,9 4396 ± 508 0,21*
TBV (mL) 5856 ± 532 5668 ± 679 0,64*
Konzentrat-Volumen (mL) 103 ± 8,59 117 ± 18,9 0,22♦
* T-Test, ♦ U-Test
Spender, die mit einer Zentrifugengeschwindigkeit von 1500 U/min. leuk-
apheresiert wurden, wurden zur Gruppe A zusammengefasst und Spender,
bei denen mit 1000 U/min. apheresiert wurde, zur Gruppe B. Alle Leukaphe-
resen erfolgten mit dem MNC-Programm der COM.TEC. Der Blutfluss betrug
jeweils 50 mL pro Minute. Tabelle 15 gibt eine Übersicht über alle Daten zu
den Spendern und den Geräteeinstellungen.
56
Die Leukozyten-, Erythrozyten- und Thrombozytenzahlen der Spender vor
und nach der Spende unterschieden sich nicht signifikant voneinander (Ta-
belle 16). Die Separationszeit betrug durchschnittlich 89 Minuten (1500
U/min.) bzw. 96 Minuten (1000 U/min.). Während dieser Zeit wurde im
Durchschnitt 103 mL (1500 U/min.) bzw. 117 mL (1000 U/min.) Apheresat
gewonnen.
Tabelle 16: Blutproben vor und nach der Spende (gepaarte Analyse)
Messung (MW ± SA) U/min.=1500 U/min.=1000 p-Wert
WBCs (x109/L) Vor der Spende 5,31 ± 1,00 5,15 ± 0,61 0,76*
Nach der Spende 5,03 ± 0,97 4,85 ± 1,43 0,83*
CD14+ Zellen (%) Vor der Spende 9,13 ± 2,42 7,54 ± 2,14 0,30*
Nach der Spende 8,64 ± 2,36 6,91 ± 1,85 0,23*
CD14+ (x106/L)
Vor der Spende 490 ± 187 393 ± 142 0,39*
Nach der Spende 428 ± 137 337 ± 150 0,35*
RBCs (x1012/L)
Vor der Spende 4,70 ± 0,27 4,82 ± 0,46 0,62*
Nach der Spende 4,76 ± 0,23 4,68 ± 0,55 0,77*
PLTs (x109/L)
Vor der Spende 233 ± 60,1 234 ± 58,3 0,98*
Nach der Spende 192 ± 43,3 199 ± 57,8 0,84*
* T-Test, ♦ U-Test
Die Analyse der Sammelergebnisse der großen Stichprobe der ungepaarten
Leukapheresen zeigte, dass bei fast gleicher Spendezeit bei beiden Gruppen
eine vergleichbare Menge Blutvolumen prozessiert und ein beinahe gleiches
Konzentratvolumen gewonnen wurde (Tabelle 17).
57
Tabelle 17: Spender- und Gerätedaten (ungepaarte Analyse)
Messung (MW ± SA) U/min.=1500 U/min.=1000
Anzahl der Spenden 71 8
Männlich/weiblich 56/15 8/0
Gewicht (kg) 77,4 ± 10,7 85,8 ± 10,6 Separationszeit (min.) 95,2 ± 11,3 94,0 ± 6,9 Spillovervolumen (mL) 10,7 ± 2,34 9,36 ± 1,13
PBV (mL) 4274 ± 503 4265 ± 425 TBV (mL) 5086 ± 738 5558 ± 729 Konzentrat-Volumen (mL) 111 ± 11,7 113 ± 15,4
Die Leukozytenkonzentration im Apheresat war bei Verwendung der Zentrifu-
gengeschwindigkeit von 1500 Umdrehungen pro Minute mit durchschnittlich
52,3 x 109 Zellen pro Liter signifikant höher als bei Zentrifugation mit 1000
Umdrehungen pro Minute (23,0 x 109 pro Liter). Die gemessenen Leukozy-
tenkonzentrationen im Produkt reichten von 25,2 x 109 bis 71,5 x 109 Zellen
pro Liter (1500 U/min.) bzw. von 8,1 x 109 bis 39,1 x 109 (1000 U/min.) Zellen
pro Liter.
Tabelle 18: Produktdaten der Leukozyten und Restzellen (gepaarte Analyse)
Messung (MW ± SA) U/min.=1500 U/min.=1000 p-Wert
WBCs (x109/L) 52,3 ± 18,9 23,0 ± 13,7 0,02*
CD14+ Zellen (%) 23,1 ± 6,26 18,2 ± 2,54 0,15*
RBCs (x1012/L) 0,68 ± 0,24 0,99 ± 0,41 0,19*
PLTs (x109/L) 3619± 827 2008± 1780 0,12*
* T-Test, ♦ U-Test
58
Grafik 6: Leukozytenkonzentration im Konzentrat (x 109 pro Liter)
Auch der prozentuale Anteil der CD14-positiven Zellen an den Gesamt-
leukozyten war in den Konzentraten der Gruppe A (1500 U/min.) größer als
in denen der Gruppe B und betrug zwischen 18,0% und 33,6 %, während er
in den Apheresaten der Gruppe B (1000 U/min.) Werte zwischen 14,3% und
20,6% annahm.
Wie Grafik 7 verdeutlicht, war die Thrombozytenkonzentration in den
Apheresaten der Gruppe A im Durchschnitt deutlich höher als in Leukaphere-
saten der Gruppe B (Spannbreite: 333 x 109 bis 4115 x 109 pro Liter) und be-
trug zwischen 2958 x 109 und 4777 x 109 pro Liter. Anders verhielt es sich
mit den Erythrozyten im Konzentrat. Hier fanden sich die höheren Konzentra-
tionen in den Apheresaten, bei denen mit der niedrigeren Geschwindigkeit
von 1000 U/min. zentrifugiert worden war. Wegen der großen Streubreite der
Einzelwerte erreichten beide beschriebenen Unterschiede zwischen den Ver-
gleichsgruppen keine statistische Signifikanz.
59
Grafik 7: Thrombozytenkonzentration im Konzentrat (x 109 pro Liter)
Auch bei Betrachtung der großen Gruppe der ungepaarten Leukapheresen
konnte bei annähernd gleichen Ausgangswerten für Leukozyten, Erythrozy-
ten und Thrombozyten (in den Blutproben vor der Spende gemessen) mit der
höheren Zentrifugengeschwindigkeit (1500 U/min.) deutlich mehr Buffy Coat
gesammelt und ein höherer prozentualer Anteil an CD14-positiven Leu-
kozyten erzielt werden. Auch hinsichtlich der Restzellen im Konzentrat ent-
sprachen sich die Ergebnisse der gepaarten und der ungepaarten Analyse
weitgehend. Die Kontamination des Apheresates mit Erythrozyten war bei
der Gruppe B deutlich höher als in Apheresaten der Gruppe A. Die mittlere
Thrombozyten-Kontamination der Apheresate war hier in etwa gleich groß.
Tabelle 19: Produktdaten der Leukozyten und Restzellen (ungepaarte Analyse)
Messung (MW ± SA) U/min.=1500 U/min.=1000
WBCs (x109/L) 43,1 ± 17,8 29,9 ± 15,2 CD14+ Zellen (%) 23,5 ± 6,74 19,5 ± 3,57 RBCs (x1012/L) 0,65 ± 0,26 0,91 ± 0,34 PLTs (x109/L) 2506±1628 2403±1739
60
Die Konzentration an CD14+CD16- Monozyten im Apheresat differierte signi-
fikant zwischen den Leukapheresen der Gruppen A und B. Bei 1500 U/min.
errechnete sich eine Spannbreite zwischen 4,5 x 109 und 24,0 x 109 Zellen
pro Liter. Bei 1000 U/min. lag die Spannbreite zwischen 1,2 x 109 und 7,6 x
109 Zellen pro Liter. Wie aus Tabelle 20 hervorgeht, gab es keine weiteren
signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Die absolute
CD14+CD16- Monozytenzahl im Apheresat lag zwischen 0,48 x 109 und 2,67
x 109 (1500 U/min.) bzw. zwischen 0,14 x 109 und 0,80 x 109 (1000 U/min.).
Mit der höheren Zentrifugengeschwindigkeit (1500 U/min.) war die Ausbeute
an CD14+CD16- Zellen deutlich größer und die Sammeleffizienz (Spannbrei-
te: 42,4% bis 104%) besser als bei Zentrifugation mit 1000 U/min. (Spann-
breite: 8,6% bis 83,7%).
Tabelle 20: Produktdaten der CD14+CD16- Zellen (gepaarte Analyse)
Messung (MW ± SA) U/min.=1500 U/min.=1000 p-Wert
CD14+CD16- (x109/L) 12,7 ± 7,21 4,33 ± 2,78 0,04*
CD14+CD16- Yield (x109) 1,33 ± 0,83 0,49 ± 0,29 0,07*
CD14+CD16- Yield/L PBV (x108) 3,71 ± 2,37 1,28 ± 0,81 0,06*
CD14+CD16- CR (x107/min.) 1,49 ± 0,94 0,53 ± 0,33 0,06*
CD14+CD16- CE (%) 75,3 ± 25,4 45,0 ± 36,4 0,17*
CD14+CD16- RF 1,34 ± 0,17 1,13 ± 0,29 0,22♦
* T-Test, ♦ U-Test
Ähnlich verhielt es sich mit der großen Gruppe der ungepaart betrachteten
Leukapheresen. Mit der Kammerdrehzahl von 1500 U/min. konnte im Schnitt
eine deutlich höhere Konzentration an CD14+CD16- Zellen im Konzentrat er-
reicht werden als mit der niedrigeren Zentrifugengeschwindigkeit. Gleiches
galt für die übrigen Parameter (siehe Tabelle 21).
61
Tabelle 21: Produktdaten der CD14+CD16- Zellen (ungepaarte Analyse)
Messung (MW ± SA) U/min.=1500 U/min.=1000
CD14+CD16- (x109/L) 10,1 ± 5,28 6,09 ± 3,63 CD14+CD16- Yield (x109) 1,11 ± 0,57 0,67 ± 0,37 CD14+CD16- Yield/L PBV (x108) 2,94 ± 1,49 1,79 ± 1,03 CD14+CD16- CR (x107/min.) 1,18 ± 0,60 0,73 ± 0,43 CD14+CD16- CE (%) 72,6 ± 30,5 51,3 ± 29,4 CD14+CD16- RF 1,39 ± 0,31 1,18 ± 0,25
Tabelle 22 gibt einen Überblick über die CD14+CD16+ Zellen im Apheresat.
Die gemessenen CD14+CD16+ Zellzahlen im Produkt lagen zwischen 1,82 x
107 und 6,40 x 107 (Gruppe A) bzw. zwischen 1,09 x 107 und 7,55 x 107
(Gruppe B). Wenn auch alle Produktdaten der Spender der Gruppe A zum
Teil deutlich höhere Werte erreichten als die Produktdaten der Vergleichs-
gruppe, zeigten sich doch keine signifikanten Unterschiede zwischen den
Gruppen.
Tabelle 22: Produktdaten der CD14+CD16+ Zellen (gepaarte Analyse)
Messung (MW ± SA) U/min.=1500 U/min.=1000 p-Wert
CD14+CD16+ (x106/L) 421 ± 201 289 ± 255 0,39*
CD14+CD16+ Yield (x107) 4,42 ± 2,21 3,34 ± 2,74 0,52*
CD14+CD16+ Yield/L PBV (x106) 12,2 ± 6,10 8,63 ± 4,47 0,43*
CD14+CD16+ CR (x105/min.) 4,95 ± 2,46 3,55 ± 3,09 0,45*
CD14+CD16+ CE (%) 96,8 ± 47,9 57,8 ± 42,3 0,21*
CD14+CD16+ RF 1,31 ± 0,41 1,11 ± 0,41 0,47*
* T-Test, ♦ U-Test
Tabelle 23 fasst die Produktdaten der CD14+CD16+ Zellen zusammen (un-
gepaarte Analyse). Wie bereits für den gepaarten Vergleich beschrieben,
wurde auch die CD14+CD16+ Subpopulation der Monozyten bei höherer
Zentrifugendrehzahl von 1500 U/min. in größerer Menge und effektiver abge-
sammelt als mit 1000 U/min..
62
Tabelle 23: Produktdaten der CD14+CD16+ Zellen (ungepaarte Analyse)
Messung (MW ± SA) U/min.=1500 U/min.=1000
CD14+CD16+ (x106/L) 439 ± 264 378 ± 296 CD14+CD16+ Yield (x107) 4,87 ± 3,06 4,19 ± 3,07 CD14+CD16+ Yield/L PBV (x106) 12,8 ± 7,36 11,1 ± 8,43 CD14+CD16+ CR (x105/min.) 5,12 ± 2,90 4,57 ± 3,55 CD14+CD16+ CE (%) 94,8 ± 47,3 64,2 ± 37,1 CD14+CD16+ RF 1,49 ± 0,57 1,08 ± 0,32
Die CD14-CD16+ Zellen erreichten im Apheresat Konzentrationen zwischen
802 x 106 und 1692 x 106 (1500 U/min.) bzw. zwischen 105 x 106 und 1028 x
106 (1000 U/min.) Zellen pro Liter, die mittlere CD14-CD16+ Zellkonzentra-
tion lag in den Apheresaten der Gruppe A um mehr als das Doppelte höher
als in den Apheresaten der Gruppe B und unterschied sich damit signifikant
zwischen den beiden Gruppen.
Tabelle 24: Produktdaten der CD14-CD16+ Zellen (gepaarte Analyse)
Messung (MW ± SA) U/min.=1500 U/min.=1000 p-Wert
CD14-CD16+ (x106/L) 1171± 417 457 ± 369 0,047♦
CD14-CD16+ Yield (x107) 12,1 ± 4,47 5,30 ± 4,03 0,047♦
CD14-CD16+ Yield/L PBV (x106) 33,4 ± 12,1 13,8 ± 10,8 0,047♦
CD14-CD16+ CR (x105/min.) 13,6 ± 4,95 5,63 ± 4,49 0,03*
CD14-CD16+ CE (%) 68,4 ± 35,4 51,1 ± 32,8 0,45*
CD14-CD16+ RF 1,32 ± 0,23 1,04 ± 0,44 0,23*
* T-Test, ♦ U-Test
Gleiches galt für den CD14-CD16+ Yield, der zwischen 8,44 x 107 und 17,1 x
107 (1500 U/min.) bzw. zwischen 1,15 x 107 und 10,8 x 107 (1000 U/min.) lag,
sowie für den pro Liter PBV und den pro Minute erzielten Zellgehalt. Die be-
stehenden Unterschiede der beiden Gruppen hinsichtlich der Sammeleffi-
zienz und des Rekrutmentfaktors der CD14-CD16+ Zellen waren dagegen
nicht signifikant (Tabelle 24).
63
Auch die Betrachtung der großen Gruppe der ungepaarten Leukapheresen
zeigt, dass die CD14-CD16+ Zellen in den Apheresaten, die mit 1500 U/min.
gewonnen wurden, in größerer Anzahl und Konzentration vorhanden waren
als in den Apheresaten der Vergleichsgruppe. Die Unterschiede zwischen
den Gruppen erscheinen erneut sehr deutlich, wenn auch hier der Beleg die-
ser Beobachtung durch eine signifikante statistische Testaussage fehlt.
Tabelle 25: Produktdaten der CD14-CD16+ Zellen (ungepaarte Analyse)
Messung (MW ± SA) U/min.=1500 U/min.=1000
CD14-CD16+ (x106/L) 740 ± 367 526 ± 364
CD14-CD16+ Yield (x107) 8,19 ± 4,11 5,90 ± 3,93 CD14-CD16+ Yield/L PBV (x106) 21,7 ± 10,7 15,7 ± 10,8 CD14-CD16+ CR (x105/min.) 8,70 ± 4,34 6,35 ± 4,33 CD14-CD16+ CE (%) 79,2 ± 39,1 50,3 ± 26,6 CD14-CD16+ RF 1,44 ± 0,48 1,01 ± 0,35
Mit Blick auf das Vorkommen von Monozyten-Thrombozyten-Aggregaten im
Produkt zeigten die Vergleichsgruppen deutliche Unterschiede (Tabelle 26).
So war beispielsweise der mittlere CD14+CD62+ Gehalt in den mit 1500
U/min. erzielten Apheresaten beinahe um den Faktor 3 höher (Spannbreite:
6,54 x 106 bis 303 x 106 Aggregate) als in den Apheresaten der Vergleichs-
gruppe (Spannbreite: 0,89 x 106 bis 107 x 106 Aggregate). Ähnlich verhielt es
sich mit den anderen von Tabelle 26 gezeigten Produktdaten.
Tabelle 26: Monozyten-Thrombozyten-Aggregate (CD14+CD62+) (gepaart)
Messung (MW ± SA) U/min.=1500 U/min.=1000 p-Wert
CD14+CD62+ (x106/L) 917 ± 1075 336 ± 448 0,30*
CD14+CD62+ Yield (x106) 98,0 ± 119 36,0 ± 46,6 0,31*
CD14+CD62+ Yield/L PBV (x106) 27,3 ± 33,5 9,80 ± 12,9 0,31*
CD14+CD62+ CR (x105/min.) 11,1 ± 13,4 3,99 ± 5,22 0,30*
CD14+CD62+ CE (%) 507 ± 481 35,0 ± 39,7 0,09*
CD14+CD62+ RF 2,03 ± 1,57 0,55 ± 0,53 0,08*
* T-Test, ♦ U-Test
64
Aufgrund der sehr großen Streubreite der Messwerte in den einzelnen Pro-
dukten war die Aussagekraft der statistischen Testung eingeschränkt und die
deutlichen Unterschiede zwischen den Vergleichsgruppen erreichten keine
statistische Signifikanz.
Grafik 8: CD14+CD62+ Sammeleffizienz (in Prozent)
Hinsichtlich der Monozyten-Thrombozyten-Aggregate im Apheresat stimmte
das Ergebnis der gepaarten Analyse mit dem Resultat der ungepaarten Da-
tenanalyse weitgehend überein. Wie Tabelle 27 zeigt, waren CD14+CD62+
Konzentration, Yield, Yield pro Liter PBV und Yield pro Minute in den
Apheresaten der Gruppe A im Durchschnitt um ein Vielfaches höher (Faktor
5) als in den Produkten der Gruppe B. Die Streubreite der einzelnen Mess-
werte und die Standardabweichung der Mittelwerte waren hierbei sehr hoch.
Daher erreichten auch diese Unterschiede statistisch keine Signifikanz.
65
Tabelle 27: Monozyten-Thrombozyten-Aggregate (CD14+CD62+) (ungepaart)
Messung (MW ± SA) U/min.=1500 U/min.=1000
CD14+CD62+ (x106/L) 1433±2075 299 ± 377 CD14+CD62+ Yield (x106) 155 ± 222 31,8 ± 39,3 CD14+CD62+ Yield/L PBV (x106) 40,0 ± 55,1 8,69 ± 10,9 CD14+CD62+ CR (x105/min.) 16,1 ± 21,8 3,56 ± 4,41 CD14+CD62+ CE (%) 477 ± 1051 57,4 ± 55,5
CD14+CD62+ RF 2,99 ± 5,94 0,53 ± 0,45
Die Ergebnisse der gepaarten und ungepaarten Analyse zeigen, dass mit Er-
höhung der Zentrifugendrehzahl von 1000 auf 1500 U/min. insgesamt bes-
sere Sammelergebnisse erzielt werden konnten. In kürzerer Zeit wurden leu-
kozytenreichere Apheresate gesammelt, welche die gewünschten CD14-po-
sitiven Zellen in höherer Konzentration enthielten. Zwar wurden auch die ver-
unreinigenden Thrombozyten in größerer Zahl mit abgesammelt, die Ery-
throzytenzahlen waren in den Produkten, die mit der Zentrifugengeschwin-
digkeit von 1500 U/min. gewonnen wurden, aber niedriger.
4.2.2 Sammelergebnisse im Hinblick auf das Verhältnis von
prozessiertem zu totalem Blutvolumen
Ausgehend von Unterschieden im Verhältnis von prozessiertem zu totalem
Blutvolumen der Spender wurden zwei Spenderkollektive gebildet und die
Sammelergebnisse der beiden Gruppen in einem ungepaarten Vergleich
einander gegenübergestellt. Alle Spender, deren PBV-TBV-Verhältnis zwi-
schen 0,5 und 0,8 betrug, wurden zu einer Gruppe zusammengefasst und
alle, deren PBV-TBV-Verhältnis zwischen 0,8 und 1,25 lag, zu einer zweiten.
Alle Daten, die Spender und COM.TEC-Einstellungen betreffen, sind in Ta-
belle 28 zusammengefasst.
66
Tabelle 28: Spender- und Gerätedaten zum PBV-TBV-Verhältnis
Messung (MW ± SA) 0,5 – 0,8 (Gr. A) 0,8 – 1,25 (Gr. B) p-Wert
Anzahl der Spender 56 23
Männlich/weiblich 55/1 9/14
Gewicht (kg) 82,9 ± 8,62 67,0 ± 7,05 0,001♦
Separationszeit (min.)
Spillover-Volumen (mL)
92,5 ± 6,48
10,5 ± 2,17 101 ± 16,2
10,7 ± 2,58 0,02♦
0,94♦
PBV (mL) 4132 ± 246 4616 ± 733 0,008♦
TBV (mL) 5481 ± 495 4288 ± 553 0,001♦
Konzentrat-Volumen (mL) 110 ± 10,2 113 ± 15,8 0,54♦
* T-Test, ♦ U-Test
Ein niedriges Verhältnis von prozessiertem zu totalem Blutvolumen fand sich
bei Spendern mit hohem totalem Blutvolumen. Ein signifikant höheres Ver-
hältnis von prozessiertem zu totalem Blutvolumen wiesen die weiblichen
Spender in der Gruppe mit hohem PBV-TBV-Verhältnis auf, da sie insgesamt
ein niedrigeres totales Blutvolumen haben. Bei etwas längerer Spendezeit
(ebenfalls signifikant) in der weiblichen Spendergruppe wurde deshalb in bei-
den Gruppen eine vergleichbare Menge an Zellkonzentrat gewonnen. In die-
sem Zusammenhang muss noch darauf hingewiesen werden, dass die Men-
ge des Zellkonzentrats von der Voreinstellung des Buffy Coat-Volumens am
Zellseparator abhängt.
Tabelle 29 gibt einen Überblick über die Ergebnisse aus den Untersu-
chungen der Blutproben der Spender vor und nach Ablauf der Leukapherese.
Zwischen beiden Spenderkollektiven unterschieden sich die Leukozytenwer-
te sowohl hinsichtlich des prozentualen als auch des absoluten Zellanteils
signifikant, bei nahezu identischem Anteil der CD14-positiven Zellen in den
Blutproben vor und nach der Spende. Die Erythrozytenwerte nach der
Spende waren bei Spendern mit hohem PBV-TBV-Verhältnis signifikant nie-
driger (Mittelwert: 4,49 x 1012 pro Liter) als bei Spendern mit niedrigem PBV-
TBV-Verhältnis (Mittelwert: 4,71 x 1012 pro Liter). Alle übrigen Messwerte
unterschieden sich bei den Spendern beider Gruppen nicht signifikant.
67
Tabelle 29: Ergebnisse der Blutproben vor und nach der Spende
Messung (MW ± SA) 0,5 – 0,8 0,8 – 1,25 p-Wert
WBCs (x109/L)
Vor der Spende 5,54 ± 1,24 5,55 ± 1,04 0,99*
Nach der Spende 5,09 ± 1,27 5,33 ± 1,26 0,46*
CD14+ Zellen (%)
Vor der Spende 8,28 ± 1,84 7,24 ± 1,65 0,02♦
Nach der Spende 7,84 ± 1,79 6,41 ± 1,46 0,005♦
CD14+ Zellen (x106/L)
Vor der Spende 435 ± 166 328 ± 183 0,03♦
Nach der Spende 384 ± 148 279 ± 161 0,01♦
RBCs (x1012/L)
Vor der Spende 4,81 ± 0,29 4,72 ± 0,41 0,37*
Nach der Spende 4,71 ± 0,29 4,49 ± 0,34 0,01♦
PLTs (x109/L)
Vor der Spende 245 ± 60 232 ± 36 0,35*
Nach der Spende 201 ± 48 179 ± 22 0,12♦
* T-Test, ♦ U-Test
Tabelle 30 zeigt die Zellkonzentrationen der Leukozyten, Erythrozyten und
Thrombozyten im Konzentrat. Die Leukozytenkonzentration lag in den Aphe-
resaten der Spender mit hohem Verhältnis von prozessiertem zu totalem
Blutvolumen zwischen 17,7 x 109 und 69,0 x 109 pro Liter, während bei
Spendern mit niedrigem PBV-TBV-Verhältnis Leukozytenkonzentrationen
zwischen 8,1 x 109 und 82,5 x 109 pro Liter gemessen wurden. Der Prozent-
satz an CD14-positiven Zellen war bei den Vergleichsgruppen annähernd
gleich. In den Apheresaten der Spender mit hohem PBV-TBV-Verhältnis fan-
den sich durchschnittlich etwas höhere Konzentrationen an verunreinigenden
Erythrozyten und Thrombozyten.
68
Tabelle 30: Produktdaten der Leukozyten und der Restzellen
Messung (MW ± SA) 0,5 – 0,8 0,8 – 1,25 p-Wert
WBCs (x109/L) 40,3 ± 17,8 45,3 ± 18,2 0,26*
CD14+ Zellen (%) 23,4 ± 6,27 22,0 ± 7,44 0,29♦
RBCs (x1012/L) 0,65 ± 0,27 0,72 ± 0,32 0,29♦
PLTs (x109/L) 2373± 1583 2784± 1742 0,26♦
* T-Test, ♦ U-Test
Der Gehalt an CD14+CD16- Zellen im Apheresat lag zwischen 1,2 x 109 und
24,0 x 109 (Gruppe A) bzw. zwischen 3,0 x 109 und 27,0 x 109 (Gruppe B) pro
Liter. Der Vergleich der Ergebnisse beider Untersuchungsgruppen erbrachte
keinen signifikanten Unterschied. Nur der Rekrutierungs-faktor war bei Spen-
dern mit hohem PBV-TBV-Verhältnis im T-Test signifikant höher als bei der
Vergleichsgruppe. Hier differieren T- und U-Test in ihrer statistischen Aus-
sage. Da entsprechend dem Shapiro-Wilk-Test keine Normalverteilung der
Werte vorlag, wurde der U-Test zum Mittelwertvergleich herangezogen (p =
0,05).
Tabelle 31: Produktdaten der CD14+CD16- Zellen (Monozyten)
Messung (MW ± SA) 0,5 – 0,8 0,8 – 1,25 p-Wert
CD14+CD16- (x109/L) 9,72 ± 5,10 9,51 ± 5,81 0,70♦
CD14+CD16- Yield (x109) 1,06 ± 0,56 1,07 ± 0,61 0,88♦
CD14+CD16- Yield/L PBV (x108) 2,89 ± 1,55 2,62 ± 1,30 0,57♦
CD14+CD16- CR (x107/min.) 1,16 ± 0,62 1,07 ± 0,53 0,69♦
CD14+CD16- CE (%) 70,5 ± 32,3 69,6 ± 27,4 0,91*
CD14+CD16- RF 1,32 ± 0,28 1,50 ± 0,34 0,05♦
* T-Test, ♦ U-Test
Tabelle 32 gibt einen Überblick über die Daten der CD14+CD16+ Mo-no-
zytensubpopulation. Zwar waren Zellkonzentration, Zellgehalt, Gehalt pro
Liter PBV und Gehalt pro Minute bei Spendern mit hohem PBV-TBV-Verhält-
nis im Durchschnitt deutlich höher als beim Vergleichskollektiv, aufgrund der
ausgeprägten Streubreite der einzelnen Messwerte erreichte dieser Unter-
schied aber keine statistische Signifikanz.
69
Tabelle 32: Produktdaten der CD14+CD16+ Zellen
Messung (MW ± SA) 0,5 – 0,8 0,8 – 1,25 p-Wert
CD14+CD16+ (x106/L) 403 ± 218 514 ± 366 0,49♦
CD14+CD16+ Yield (x107) 4,43 ± 2,41 5,85 ± 4,29 0,41♦
CD14+CD16+ Yield/L PBV (x106) 12,0 ± 6,46 14,3 ± 9,71 0,62♦
CD14+CD16+ CR (x105/min.) 4,82 ± 2,64 5,75 ± 3,70 0,61♦
CD14+CD16+ CE (%) 89,3 ± 48,3 97,0 ± 44,1 0,49♦
CD14+CD16+ RF 1,31 ± 0,53 1,82 ± 0,48 0,001♦
* T-Test, ♦ U-Test
Die Konzentration der CD14+CD16+ Monozyten in Apheresaten von Spen-
dern mit hohem PBV-TBV-Verhältnis lag zwischen 125 x 106 und 1390 x 106
Zellen pro Liter, während sie bei Spendern mit niedrigem PBV-TBV-Ver-
hältnis zwischen 92 x 106 und 918 x 106 Zellen pro Liter betrug. Nur der Re-
krutmentfaktor erreichte bei Spendern mit einem PBV-TBV-Verhältnis zwi-
schen 0,8 und 1,25 signifikant höhere Werte als bei Spendern der Ver-
gleichsgruppe.
Tabelle 33: Produktdaten der CD14-CD16+ Zellen
Messung (MW ± SA) 0,5 – 0,8 0,8 – 1,25 p-Wert
CD14-CD16+ (x106/L) 713 ± 350 728 ± 432 0,88*
CD14-CD16+ Yield (x107) 7,80 ± 3,80 8,33 ± 5,03 0,63*
CD14-CD16+ Yield/L PBV (x106) 21,1 ± 10,1 20,7 ± 13,0 0,89*
CD14-CD16+ CR (x105/min.) 8,44 ± 4,03 8,47 ± 5,36 0,98*
CD14-CD16+ CE (%) 73,3 ± 41,9 83,4 ± 28,6 0,08♦
CD14-CD16+ RF 1,28 ± 0,43 1,70 ± 0,52 0,001♦
* T-Test, ♦ U-Test
Betrachtet man die Population der CD14-CD16+ Zellen, so waren Konzen-
tration und Zellgehalt in den Konzentraten der Spender beider Gruppen nicht
signifikant verschieden (Tabelle 33). Unterschiede zeigten sich jedoch in der
mittleren CD14-CD16+ Sammeleffizienz, die bei Spendern mit hohem Ver-
hältnis von prozessiertem zu totalem Blutvolumen zwischen 31,7% und
136% streute, wobei sich diese Streuung bei Spendern mit niedrigem PBV-
70
TBV-Verhältnis noch deutlicher darstellte (Spannbreite: 12,2% bis 192%). Bei
beiden Spenderkollektiven wurden teilweise Sammeleffizienzen von mehr als
100% erreicht, wobei sich der Rekrutierungsfaktor zwischen den Vergleichs-
gruppen signifikant unterschied.
Die Konzentration von Monozyten-Thrombozyten-Aggregaten im Pro-
dukt von Spendern mit hohem PBV-TBV-Verhältnis (0,8 – 1,25) lag um den
Faktor 3 höher (Spannbreite: 3 x 106 bis 9883 x 106 pro Liter) als die Mittel-
werte der Vergleichsgruppe (Spannbreite: 4 x 106 bis 4179 x 106 pro Liter).
Aufgrund der Streubreite der Werte in beiden Gruppen war dieser Unter-
schied aber nicht statistisch signifikant. Gleiches galt für den Gehalt an
CD14+CD62+ Zellaggregaten, sowie deren Yield pro Liter. Einen Überblick
hierzu gewährt Tabelle 34.
Tabelle 34: Monozyten-Thrombozyten-Aggregate (CD14+CD62+) im Produkt
Messung (MW ± SA) 0,5 – 0,8 0,8 – 1,25 p-Wert
CD14+CD62+ (x106/L) 966 ± 1404 2283± 2950 0,17♦
CD14+CD62+ Yield (x106) 102 ± 143 253 ± 321 0,14♦
CD14+CD62+ Yield/L PBV (x106) 27,7 ± 39,0 61,8 ± 76,5 0,18♦
CD14+CD62+ CR (x105/min.) 11,3 ± 15,9 24,5 ± 29,6 0,16♦
CD14+CD62+ CE (%) 447 ± 1074 386 ± 776 0,82♦
CD14+CD62+ RF 2,64 ± 5,54 2,93 ± 6,09 0,91♦
* T-Test, ♦ U-Test
Insgesamt ließ sich erkennen, dass bei Spendern mit hohem Verhältnis von
prozessiertem zu totalem Blutvolumen zwar alle Zellpopulationen in den
Apheresaten in höherer Konzentration vorhanden waren. Aufgrund der deutli-
chen Streubreite der einzelnen Ergebnisse zeigte sich jedoch nur selten ein
statistisch signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen.
71
4.3 Vergleich der Sammelergebnisse von COM.TEC und COBE
4.3.1 COM.TEC (1500 U/min.) und COBE Spectra (646 U/min.) Die Sammelergebnisse der beiden Zellseparatoren wurden in einem gepaar-
ten Vergleich analysiert. Beim COM.TEC-Zellseparator war die Zentrifugen-
drehzahl auf 1500 U/min. eingestellt (Standard), bei der COBE Spectra auf
646 U/min. (reduzierter Separationsfaktor von 250). Der Blutfluss wurde bei
beiden Geräten auf 50 mL/min. eingestellt.
Tabelle 35: Spender- und Gerätedaten der beiden Zellseparatoren
Messung (MW ± SA) COM.TEC
1500 U/min.
COBE
646 U/min.
p-Wert
Anzahl der Spenden 6 6
Männlich/weiblich 4/2 4/2
Gewicht (kg) 75,8 ± 14,0 75,8 ± 14,0 1,00♦
Separationszeit (min.) 98,3 ± 14,7 127 ± 27,1 0,041♦
PBV (mL) 4332 ± 640 6375 ± 1345 0,004♦
TBV (mL) 4996 ± 972 5022 ± 1007 0,96*
Konzentrat-Volumen (mL) 114 ± 9,82 119 ± 27,1 0,94♦
* T-Test, ♦ U-Test
Leukapheresen am COBE Spectra-Gerät erforderten mit 127 Minuten eine
signifikant längere Separationszeit als Apheresen mit der COM.TEC (98 Mi-
nuten). Folglich wurde bei vergleichbarem totalen Blutvolumen in beiden
Untersuchungsgruppen mit der COBE Spectra ein signifikant größeres Blut-
volumen prozessiert (p = 0,004). Die Konzentratvolumina waren hingegen
vergleichbar (siehe Tabelle 35). Die Leukozyten-, Erythrozyten- und Throm-
bozytenkonzentrationen in den Blutproben der Spender vor und nach der
Leukapherese zeigten keine signifikanten Unterschiede (Tabelle 36).
72
Tabelle 36: Ergebnisse der Blutproben vor und nach der Spende
Messung (MW ± SA) COM.TEC COBE p-Wert
WBCs (x109/L) Vor der Spende 5,65 ± 1,56 5,57 ± 1,12 0,92*
Nach der Spende 5,45 ± 1,24 5,40 ± 0,99 0,94*
CD14+ Zellen (%)
Vor der Spende 7,51 ± 0,94 8,19 ± 1,82 0,43*
Nach der Spende 7,70 ± 1,42 8,08 ± 1,73 0,68*
CD14+ (x 106/L) Vor der Spende 434 ± 166 456 ± 131 0,81*
Nach der Spende 429 ± 175 434 ± 116 0,82♦
RBCs (x1012/L)
Vor der Spende 4,55 ± 0,40 4,52 ± 0,33 0,91*
Nach der Spende 4,52 ± 0,38 4,40 ± 0,38 0,59*
PLTs (x109/L)
Vor der Spende 221 ± 68,2 222 ± 35,0 0,98*
Nach der Spende 194 ± 68,2 204 ± 48,2 0,49♦
* T-Test, ♦ U-Test
Tabelle 37 gibt einen Überblick über die Produktdaten der Leukapheresen
beider Gruppen. Die Leukozytenkonzentration lag in den Produkten zwischen
17,7 x 109 und 67,7 x 109 Zellen pro Liter (COM.TEC) bzw. zwischen 34,5 x
109 und 48,2 x 109 Zellen pro Liter (COBE). Somit war, wie Grafik 11 veran-
schaulicht, die Streubreite der einzelnen Leukozyten-Messwerte bei der
COBE Spectra deutlich geringer als bei der COM.TEC. Die COBE Spectra
lieferte folglich, was die Sammlung des Buffy Coat betrifft, wesentlich kon-
stantere Ergebnisse als der COM.TEC Zellseparator. Die mittlere Leukozy-
tenkonzentration im Apheresat war hingegen bei beiden Zellseparatoren fast
identisch.
73
Grafik 9: Leukozyten im Konzentrat (x 109 pro Liter)
Auch der mittlere Anteil der CD14-positiven Monozyten an den Ge-samtleu-
kozyten war bei beiden Zellseparatoren fast gleich und erreichte Werte
zwischen 16,9% und 20,6% (COM.TEC) bzw. zwischen 15,3% und 25,2%
(COBE).
Tabelle 37: Produktdaten der Leukozyten und der Restzellen
Messung (MW ± SA) COM.TEC COBE p-Wert
WBCs (x109/L) 39,0 ± 26,0 39,7 ± 5,66 0,39♦
CD14+ Zellen (%) 18,4 ± 1,54 19,3 ± 4,31 0,63*
RBCs (x1012/L) 0,51 ± 0,35 0,59 ± 0,14 0,31♦
PLTs (x109/L) 1238± 1051 917 ± 403 0,79♦
* T-Test, ♦ U-Test
Die Kontamination des Apheresates mit Erythrozyten war bei Verwendung
der COBE Spectra etwas größer als bei der COM.TEC. Die Thrombo-zyten-
kontamination lag hingegen in den COM.TEC-Produkten höher (Spannbreite:
558 x 109 bis 3096 x 109 pro Liter) als in den Apheresaten der COBE Spectra
74
(Spannbreite: 487 x 109 bis 1426 x 109 pro Liter). Aufgrund der ausgeprägten
Streubreite der einzelnen Werte war dieser Unterschied zwischen den Zellse-
paratoren nicht statistisch signifikant.
Die mit der COM.TEC gewonnenen Apheresate enthielten zwischen
0,40 x 109 und 1,42 x 109 CD14+CD16- Monozyten, bei Leukapheresen mit
der COBE Spectra lag die Monozytenkonzentration etwas niedriger, bei Zell-
zahlen zwischen 0,58 x 109 und 1,32 x 109 pro Apheresat. Die Unterschiede
zwischen beiden Zellseparatoren waren statistisch nicht signifikant. Die restli-
chen Produktdaten hinsichtlich der CD14+CD16- Zellen sind in Tabelle 38
zusammengefasst.
Tabelle 38: Produktdaten der CD14+CD16- Zellen (Monozyten)
Messung (MW ± SA) COM.TEC COBE p-Wert
CD14+CD16- (x109/L) 7,33 ± 5,18 7,85 ± 2,87 0,42♦
CD14+CD16- Yield (x109) 0,82 ± 0,56 0,90 ± 0,27 0,42♦
CD14+CD16- Yield/L PBV (x108) 2,92 ± 3,03 1,58 ± 0,55 1,00♦
CD14+CD16- CR (x107/min.) 0,87 ± 0,62 0,73 ± 0,26 0,87♦
CD14+CD16- CE (%) 66,6 ± 63,6 36,2 ± 9,91 0,30*
CD14+CD16- RF 1,38 ± 0,18 1,39 ± 0,22 0,92*
* T-Test, ♦ U-Test
Wie Grafik 10 verdeutlicht, sammelte der COM.TEC Zellseparator die CD14+
CD16- Monozyten im Schnitt zwar deutlich effektiver (Spannbreite: 22,8% bis
82,5%) als die COBE Spectra (Spannbreite: 25,9% bis 48,7%), aufgrund der
wiederum sehr großen Streubreite der einzelnen berechneten Sammeleffi-
zienzen ließ sich aber kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den
beiden Zellseparatoren feststellen.
75
Grafik 10: CD14+CD16- Sammeleffizienz (in Prozent)
In den Apheresaten der COBE Spectra wurden Konzentrationen an CD14+
CD16+ Monozyten zwischen 2,6 x 106 und 9,6 x 106 Zellen pro Liter ge-
messen. Im Vergleich zu den Ergebnissen des COM.TEC Zellseparators, die
zwischen 3,2 x 106 und 7,2 x 106 Monozyten pro Liter lagen, zeigte die
COBE Spectra bei dieser Zellpopulation ein besseres Sammelergebnis.
Dementsprechend war auch der Gehalt (Yield) an CD14+CD16+ Monozyten
in den Produkten der COBE Spectra höher als bei der COM.TEC. Der Zellge-
halt reichte dabei von 1,88 x 107 bis 10,1 x 107 Zellen pro Apheresat. Die
Spannbreite dieser Zellen war in den Produkten der COM.TEC ebenfalls ge-
ringer ausgeprägt (1,37 x 107 und 5,18 x 107 Zellen pro Apheresat). Grafik 11
dient der graphischen Veranschaulichung der Unterschiede in der Sammlung
von CD14+CD16+ Monozyten zwischen den Zellseparatoren.
76
Grafik 11: CD14+CD16+ Gehalt im Konzentrat (* 107)
Mit dem COBE Spectra Zellseparator konnten zwar größere Mengen an
CD14+CD16+ Zellen gesammelt werden, die COM.TEC sammelte diese Zel-
len aber deutlich effektiver, wobei die Spannbreite der Sammeleffizienzen
der einzelnen Leukapheresen von 42,4% bis 136% reichte. Leukapheresen
mit der COBE Spectra zeigten lediglich Sammeleffizienzen zwischen 30,5%
und 64,2%.
Tabelle 39: Produktdaten der CD14+CD16+ Zellen
Messung (MW ± SA) COM.TEC COBE p-Wert
CD14+CD16+ (x106/L) 266 ± 131 435 ± 274 0,20*
CD14+CD16+ Yield (x107) 3,02 ± 1,43 5,28 ± 3,70 0,21*
CD14+CD16+ Yield/L PBV (x106) 9,61 ± 6,35 8,78 ± 5,50 0,81*
CD14+CD16+ CR (x105/min.) 3,13 ± 1,65 4,06 ± 2,60 0,48*
CD14+CD16+ CE (%) 95,6 ± 78,4 49,7 ± 14,4 0,26♦
CD14+CD16+ RF 1,66 ± 0,42 1,45 ± 0,34 0,36*
* T-Test, ♦ U-Test
77
Aufgrund der teilweise erneut recht großen Streubreite der einzelnen Mess-
werte war keiner der beschriebenen Unterschiede zwischen den Zellsepara-
toren statistisch signifikant (Tabelle 39).
Wie Tabelle 40 zeigt, waren die Produktdaten der beiden Zellseparato-
ren hinsichtlich der CD14-CD16+ Zellen fast gleich. Ihr Gehalt variierte in den
einzelnen Apheresaten zwischen 2,65 x 107 und 17,1 x 107 (COM.TEC) bzw.
zwischen 5,09 x 107 und 13,7 x 107 CD14-CD16+ Zellen (COBE). Deutliche,
wenn auch aufgrund der hohen Standardabweichung nicht signifikante,
Unterschiede zwischen den beiden Zellseparatoren gab es bei Analyse der
Mittelwerte der CD14-CD16+ Sammeleffizienz. So war die COM.TEC
hinsichtlich der Sammlung jener Zellpopulation im Durchschnitt beinahe
doppelt so effektiv (Spannbreite: 31,7% bis 82,7 %) wie die COBE Spectra
(Spannbreite: 23,4% bis 92,3 %).
Tabelle 40: Produktdaten der CD14-CD16+ Zellen
Messung (MW ± SA) COM.TEC COBE p-Wert
CD14-CD16+ (x106/L) 629 ± 507 654 ± 283 0,42♦
CD14-CD16+ Yield (x107) 7,01 ± 5,50 7,79 ± 3,68 0,42♦
CD14-CD16+ Yield/L PBV (x106) 23,2 ± 20,2 13,2 ± 5,64 0,63♦
CD14-CD16+ CR (x105/min.) 7,49 ± 6,33 6,11 ± 2,71 0,87♦
CD14-CD16+ CE (%) 72,4 ± 36,5 48,7 ± 23,7 0,21*
CD14-CD16+ RF 1,72 ± 0,42 1,62 ± 0,53 0,71*
* T-Test, ♦ U-Test
In den Produkten, die mit dem COM.TEC Zellseparator gewonnenen wurden,
befanden sich doppelt so hohe Konzentrationen an Monozyten-Thrombozy-
ten-Aggregaten (Spannbreite: 35 x 106 bis 2715 x 106 pro Liter) als in den
COBE Spectra-Apheresaten (Spannbreite: 4 x 106 bis 1215 x 106 pro Liter).
Wegen der hohen Streubreite der gemessenen Werte war dieser Unter-
schied aber nicht statistisch signifikant (Tabelle 41). Ähnlich verhielt es sich
mit dem Gehalt, der Sammelrate und der Sammeleffizienz dieser Zellaggre-
gate. Sie erreichten in den Produkten der COM.TEC deutlich, aber nicht sta-
tistisch signifikant höhere Werte. Der Rekrutmentfaktor dagegen lag bei
Apheresen mit der COBE Spectra höher.
78
Tabelle 41: Monozyten-Thrombozyten-Aggregate (CD14+CD62+) im Produkt
Messung (MW ± SA) COM.TEC COBE p-Wert
CD14+CD62+ (x106/L) 1360±2167 644 ± 954 0,75♦
CD14+CD62+ Yield (x106) 150 ± 238 95,0 ± 167 0,63♦
CD14+CD62+ Yield/L PBV (x106) 65,4 ± 120 13,3 ± 20,0 0,87♦
CD14+CD62+ CR (x105/min.) 16,1 ± 25,4 6,08 ± 9,07 0,75♦
CD14+CD62+ CE (%) 366 ± 422 200 ± 204 0,52♦
CD14+CD62+ RF 1,38 ± 0,80 1,94 ± 1,53 0,63♦
* T-Test, ♦ U-Test
Als Quintessenz dieses ersten Vergleichs der Zellseparatoren COM.TEC und
COBE Spectra lässt sich sagen, dass keiner der beiden Zellseparatoren dem
anderen in seiner Eignung, CD14-positive Zellen zu sammeln, deutlich über-
legen war. Dadurch, dass bei Leukapheresen mit der COBE Spectra auf-
grund der signifikant längeren Spendedauer durchschnittlich ein signifikant
höheres Blutvolumen prozessiert wurde, konnten hier in den meisten Fällen
marginal höhere Leukozyten- und CD14+ Konzentrationen sowie größere
Mengen an den untersuchten Monozytensubpopulationen im Apheresat er-
zielt werden. Der COM.TEC-Zellseparator sammelte dagegen in wesentlich
kürzerer Zeit kaum weniger CD14-positive Zellen und andere leukozytäre
Subpopulationen und arbeitete folglich deutlich effizienter. Dabei konnten mit
dem COM.TEC Gerät in Einzelfällen Sammeleffizienzen von über 100 % er-
zielt werden.
79
4.3.2 COM.TEC (1500 U/min.) und COBE Spectra (708 U/min.)
In einem weiteren gepaarten Vergleich wurden die Sammelergebnisse der
COM.TEC (MNC-Programm mit 1500 U/min., Blutfluss mit 50 mL pro Minute)
und der COBE Spectra (WBK-Betrieb mit 708 U/min., Blutfluss mit 60 mL pro
Minute) einander gegenübergestellt. In dieser Versuchsreihe wurde der Blut-
fluss und infolgedessen die Zentrifugendrehzahl bei der COBE Spectra ver-
ändert.
Tabelle 42: Spender- und Gerätedaten der beiden Zellseparatoren
Messung (MW ± SA) COM.TEC
1500 U/min.
COBE
708 U/min.
p-Wert
Anzahl der Spenden 9 9
Männlich/weiblich 9/0 9/0
Alter zum Zeitpkt. d. Spende ± ±
Gewicht (kg) 80,0 ± 10,3 79,1 ± 10,9 0,86*
Separationszeit (min.) 95,2 ± 10,4 122 ± 6,6 0,001♦
PBV (mL) 4351 ± 479 7293 ± 444 0,00♦
TBV (mL) 5398 ± 748 5385 ± 741 0,97*
Konzentrat-Volumen (mL) 109 ± 10,4 117 ± 11,3 0,14*
* T-Test, ♦ U-Test
In der Separationsdauer unterschieden sich die beiden Zellseparatoren sehr
deutlich. Die Blutspende dauerte bei Verwendung der COM.TEC durch-
schnittlich 95 Minuten, mit der COBE 122 Minuten (p = 0,001). Aufgrund der
längeren Separationszeit wurde mit der COBE bei fast identischem totalem
Blutvolumen der Spender ein im Mittel deutlich größeres Blutvolumen pro-
zessiert und mehr Konzentrat gesammelt. Tabelle 43 zeigt die Blutwerte der
Spender vor und nach der Leukapherese. Dabei fanden sich im Vergleich der
beiden Zellseparatoren keine signifikanten Unterschiede zwischen den Zell-
populationen.
80
Tabelle 43: Ergebnisse der Blutproben vor und nach der Spende
Messung (MW ± SA) COM.TEC COBE p-Wert
WBCs (x109/L) Vor der Spende 5,41 ± 1,04 5,94 ± 1,30 0,35*
Nach der Spende 5,18 ± 1,48 5,27 ± 1,62 0,91*
CD14+ Zellen (%)
Vor der Spende 8,13 ± 1,15 7,50 ± 0,99 0,24*
Nach der Spende 8,05 ± 1,50 7,42 ± 1,18 0,34*
CD14+ (x 106/L) Vor der Spende 436 ± 88,8 447 ± 120 0,84*
Nach der Spende 410 ± 112 388 ± 121 0,70*
RBCs (x1012/L)
Vor der Spende 4,92 ± 0,32 4,95 ± 0,36 0,87*
Nach der Spende 4,81 ± 0,33 4,66 ± 0,38 0,39*
PLTs (x109/L)
Vor der Spende 234 ± 44,4 216 ± 24,8 0,31*
Nach der Spende 200 ± 35,4 188 ± 21,9 0,38*
* T-Test, ♦ U-Test
Die Sammelergebnisse des COM.TEC- und des COBE Spectra-Zellsepara-
tors sind in Tabelle 44 aufgeführt. Aus ihr wird ersichtlich, dass sich die Pro-
dukte der beiden Zellseparatoren hinsichtlich der Zusammensetzung der Zel-
len kaum unterscheiden. Die Leukozytenkonzentration der Produkte lag zwi-
schen 24,6 x 109 und 59,6 x 109 pro Liter (COM.TEC) bzw. zwischen 16,5 x
109 und 71,9 x 109 pro Liter (COBE Spectra).
Tabelle 44: Produktdaten der Leukozyten und der Restzellen
Messung (MW ± SA) COM.TEC COBE p-Wert
WBCs (x109/L) 42,5 ± 13,4 42,6 ± 15,4 0,99*
CD14+ Zellen (%) 23,3 ± 3,33 23,1 ± 5,18 0,79*
RBCs (x1012/L) 0,66 ± 0,17 0,79 ± 0,26 0,23*
PLTs (x109/L) 2433± 1456 827 ± 263 0,04*
* T-Test, ♦ U-Test
81
Auch der mittlere prozentuale Anteil der CD14-positiven Zellen an den Ge-
samtleukozyten war nahezu identisch und betrug bei der COM.TEC zwi-
schen 18,0% und 29,4% und bei der COBE Spectra zwischen 13,2% und
31,7%. Deutliche Unterschiede zwischen den Separationsergebnissen der
beiden Zellseparatoren bestanden allerdings im Restzellgehalt der Konzen-
trate.
Grafik 12: Erythrozyten im Konzentrat (x 1012 pro Liter)
Die Verunreinigung der Aphereseprodukte mit Erythrozyten war bei Verwen-
dung der COBE Spectra im Durchschnitt höher als bei der COM.TEC (Grafik
15). Die Apheresate der COM.TEC dagegen wiesen einen um den Faktor 3
und damit signifikant höheren Gehalt an Thrombozyten auf (Spannbreite: 864
x 109 und 4777 x 109 pro Liter). Produkte der COBE Spectra enthielten eine
geringere mittlere Thrombozytenkonzentration (Spannbreite: 494 x 109 und
1271 x 109 pro Liter). Grafik 13 verdeutlicht diesen Sachverhalt.
82
Grafik 13: Thrombozyten im Konzentrat (x 109 pro Liter)
Tabelle 45 gibt einen Überblick über die Sammelergebnisse der CD14+
CD16- Monozyten in den Apheresaten der beiden Zellseparatoren. Die Sepa-
rationszeit der COBE Spectra war zwar deutlich länger und infolge dessen
das prozessierte Blutvolumen deutlich größer (Tabelle 42), dennoch unter-
schieden sich Konzentration und Gehalt an CD14+CD16- Monozyten in den
Aphereseprodukten der beiden Zellseparatoren kaum voneinander.
Tabelle 45: Produktdaten der CD14+CD16- Zellen (Monozyten)
Messung (MW ± SA) COM.TEC COBE p-Wert
CD14+CD16- (x109/L) 10,1 ± 3,61 9,82 ± 4,19 0,87*
CD14+CD16- Yield (x109) 1,11 ± 0,43 1,16 ± 0,54 0,84*
CD14+CD16- Yield/L PBV (x108) 2,85 ± 1,05 1,73 ± 0,75 0,02*
CD14+CD16- CR (x107/min.) 1,17 ± 0,46 0,94 ± 0,40 0,28*
CD14+CD16- CE (%) 68,4 ± 23,6 40,4 ± 11,2 0,008*
CD14+CD16- RF 1,43 ± 0,22 1,35 ± 0,20 0,44*
* T-Test, ♦ U-Test
83
Dies ist damit zu erklären, dass der COM.TEC Zellseparator eine bessere
Sammeleffizienz der CD14+CD16- Zellen aufweist (Spannbreite: 37,1% bis
98,1%) als die COBE Spectra (Spannbreite: 21,7% bis 52,2%). Das
COM.TEC Gerät kann daher in kürzerer Zeit und nach Verarbeitung eines
geringeren Blutvolumens ein vergleichbares Sammelergebnis erzielen.
Grafik 14: CD14+CD16- Sammeleffizienz (in Prozent)
Gleiches zeigte sich bei Analyse der CD14+CD16+ Monozytenpopulation
(Tabelle 46). Trotz deutlich längerer Separationszeiten und größerer prozes-
sierter Blutvolumina bei Leukapheresen mit der COBE, waren CD14+CD16+
Konzentration und -Yield in den Konzentraten von COBE (Yield: 2,07 x 107
bis 10,5 x 107 Zellen) und COM.TEC (Yield: 1,82 x 107 bis 9,67 x 107 Zellen)
vergleichbar.
84
Grafik 15: CD14+CD16+ Sammeleffizienz (in Prozent)
Dies kann wiederum dadurch erklärt werden, dass die Sammeleffizienz und
folglich der pro Liter PBV erzielte Zellgehalt bei Verwendung des COM.TEC
Zellseparators deutlich höhere Werte erreichten (Spannbreite der CD14+
CD16+ Sammeleffizienz: 41,4% bis 125%) als die Ergebnisse, die mit der
COBE Spectra erzielt werden konnten (Spannbreite der CD14+CD16+ Sam-
meleffizienz: 24,1% bis 70,3%).
Tabelle 46: Produktdaten der CD14+CD16+ Zellen
Messung (MW ± SA) COM.TEC COBE p-Wert
CD14+CD16+ (x106/L) 432 ± 244 457 ± 228 0,82*
CD14+CD16+ Yield (x107) 4,75 ± 2,78 5,43 ± 2,94 0,62*
CD14+CD16+ Yield/L PBV (x106) 12,3 ± 7,35 8,07 ± 4,25 0,15*
CD14+CD16+ CR (x105/min.) 5,07 ± 2,99 4,42 ± 2,29 0,61*
CD14+CD16+ CE (%) 77,5 ± 31,3 50,8 ± 15,8 0,04*
CD14+CD16+ RF 1,39 ± 0,49 1,35 ± 0,31 0,84*
* T-Test, ♦ U-Test
85
Auch bei Untersuchung der CD14-CD16+ Zellen fanden sich vergleichbare
Ergebnisse. Der Zellgehalt wies bei Verwendung der COM.TEC (Streubreite:
5,75 x 107 bis 17,4 x 107 Zellen) ähnliche Ergebnisse auf wie in den Produk-
ten der COBE Spectra (Streubreite: 2,20 x 107 bis 16,2 x 107 Zellen). Wie
aus Tabelle 47 ersichtlich, sammelte die COM.TEC pro Liter PBV gerechnet
signifikant mehr CD14-CD16+ Zellen und erreichte eine deut-lich höhere,
wenn auch nicht statistisch signifikant bessere, Sammeleffizienz
(Spannbreite: 30,7% bis 133%) als die COBE Spectra (Spannbreite: 15,2%
bis 68,8%). Der Rekrutierungsfaktor der CD14-CD16+ Zellen war in beiden
Untersuchungsgruppen im Mittel gleich.
Tabelle 47: Produktdaten der CD14-CD16+ Zellen
Messung (MW ± SA) COM.TEC COBE p-Wert
CD14-CD16+ (x106/L) 1002± 393 927 ± 430 0,71*
CD14-CD16+ Yield (x107) 10,9 ± 4,35 11,0 ± 5,24 0,96*
CD14-CD16+ Yield/L PBV (x106) 27,9 ± 10,2 16,2 ± 7,63 0,01*
CD14-CD16+ CR (x105/min.) 11,4 ± 4,32 8,96 ± 4,17 0,23*
CD14-CD16+ CE (%) 75,4 ± 34,8 49,9 ± 15,3 0,07*
CD14-CD16+ RF 1,49 ± 0,36 1,49 ± 0,46 1,00*
* T-Test, ♦ U-Test
Die Ergebnisse der Berechnung der Monozyten-Thrombozyten-Aggregate
fasst Tabelle 48 zusammen. In den Produkten der COM.TEC wurden 0,37 x
106 bis 353 x 106 Monozyten-Thrombozyten-Aggregate gemessen, in den
Apheresaten der COBE Spectra lag der Gehalt an Zellaggregaten zwischen
2,98 x 106 und 174 x 106. Bei Verwendung des COM.TEC Zellseparators lag
die mittlere Konzentration der CD14+CD62+ Zellaggregate im Apheresat im
Durchschnitt jeweils um den Faktor 2 höher als in den Apheresaten der
COBE Spectra. Aufgrund der großen Streubreite der Werte waren diese
Unterschiede aber nicht statistisch signifikant.
86
Tabelle 48: Monozyten-Thrombozyten-Aggregate (CD14+CD62+) im Produkt
Messung (MW ± SA) COM.TEC COBE p-Wert
CD14+CD62+ (x106/L) 838 ± 1039 464 ± 539 0,90♦
CD14+CD62+ Yield (x106) 97,4 ± 126 52,4 ± 55,9 0,90♦
CD14+CD62+ Yield/L PBV (x106) 24,2 ± 31,6 8,16 ± 9,49 0,76♦
CD14+CD62+ CR (x105/min.) 9,65 ± 12,0 4,40 ± 4,99 0,90♦
CD14+CD62+ CE (%) 270 ± 368 207 ± 324 0,90♦
CD14+CD62+ RF 1,84 ± 2,83 1,67 ± 2,38 0,90♦
* T-Test, ♦ U-Test
Insgesamt entsprechen die Ergebnisse der zweiten gepaarten Analyse von
COM.TEC und COBE denjenigen der ersten Gegenüberstellung weitgehend.
Der Leukozyten- und Monozytengehalt der Produkte der beiden Zellsepa-
ratoren war annähernd gleich. Wobei die COM.TEC auch dem modifizierten
Leukozytenprogramm der COBE Spectra hinsichtlich der Sammeleffizienz
der CD14-positiven und der CD14- und CD16-positiven Zellen deutlich über-
legen war. Unterschiede zwischen den beiden Zellseparatoren bestanden
auch im Restzellgehalt der Apheresate. Die Produkte der COM.TEC enthiel-
ten durchschnittlich höhere Thrombozytenkonzentrationen als die Produkte
der COBE Spectra. Die Erythrozytenkontamination war dagegen erneut in
den Apheresaten der COBE Spectra höher.
87
5. Diskussion
5.1 Zusammenfassung der Ergebnisse
In dieser Arbeit wurden die Zellseparatoren COBE Spectra und COM.TEC
hinsichtlich ihrer Eignung untersucht, CD14-positive Monozyten und deren
Subpopulationen bei gesunden nicht-zytokinstimulierten Spendern zu sam-
meln. Dabei wurden die Sammelrate, die Sammeleffizienz und der Gehalt
dieser Zellen in den Leukozytenprodukten untersucht. Da der gesammelte
Buffy Coat in Abhängigkeit von verwendetem Zellseparator und gewählter
Geräteeinstellung eine unterschiedliche Zusammensetzung aufweist, wurde
auch der Restzellgehalt, die Erythrozyten, Thrombozyten und Monozyten-
Thrombozyten-Aggregate in diesen Zellkonzentraten analysiert. Zu diesem
Zweck verglichen wir nicht nur die Standardeinstellungen beider Zellsepara-
toren miteinander, sondern verwendeten auch modifizierte Einstellungen der
Leukozytenprogramme dieser Zellseparatoren.
Eine Änderung der verwendeten Zentrifugendrehzahl der Leukozyten-
programme führte zu deutlichen Unterschieden in den Sammelergebnissen
bei Verwendung des COM.TEC- (1500 U/min. vs. 1000 U/min.) und des
COBE Spectra-Zellseparators (646 U/min. vs. 708 U/min.). Bei Einstellung
der höheren Zentrifugendrehzahl konnte bei beiden Zellseparatoren ein hö-
herer Leukozytengehalt erzielt werden. Daraus resultierten auch bessere
Sammeleffizienzen für die CD14-positiven Zellen bei dem COBE Spectra-
(40,1% vs. 37,7%) und dem COM.TEC-Gerät (75,3% vs. 45,0%). Die Ergeb-
nisse der monozytären Subpopulationen verhielten sich entsprechend. Der
Restzellgehalt der Leukapheresate zeigte ebenfalls deutliche Unterschiede in
Abhängigkeit von der jeweils verwendeten Programmeinstellung.
Bei der COBE Spectra konnten der Erythrozyten- und Thrombozyten-
gehalt bei einem niedrigeren Trennfaktor von 250 (Standard: 500) und einem
höheren Blutfluss von 60 mL pro Minute (Standard: 50 mL pro Minute) und
einer resultierenden Zentrifugendrehzahl von 708 U/min. reduziert werden.
Bei Verwendung der COM.TEC führte der Gebrauch des modifizierten MNC-
Programmes mit einer Zentrifugendrehzahl von 1000 U/min. gegenüber 1500
88
U/min. (Standardeinstellung) ebenfalls zu einer niedrigeren Thrombozyten-
konzentration im Leukapheresat, der Erythrozytengehalt hingegen lag höher.
Da in Abhängigkeit von Körpergröße, Körpergewicht und Geschlecht
bei Blutspendern ein unterschiedliches totales Blutvolumen vorliegt, wurde in
einer weiteren ungepaarten Analyse die Abhängigkeit der Sammelergebnisse
vom Verhältnis des prozessierten zum totalen Blutvolumen untersucht. Dabei
zeigte sich, dass in den Apheresaten von Spendern, bei denen die Leuk-
apherese relativ lange dauerte und infolgedessen ein großes Blutvolumen
prozessiert wurde, Leukozyten, die gewünschte Fraktion der CD14-positiven
Monozyten und die analysierten Monozytensubpopulationen in höheren Kon-
zentrationen vorlagen. Der Restzellgehalt war in den Produkten des
COM.TEC Gerätes ebenfalls höher. Bei der COBE Spectra galt dies nur für
die Thrombozyten, der Erythrozytengehalt war niedriger als in den Apheresa-
ten der Vergleichsgruppe.
In einer gepaarten Analyse verglichen wir die Sammelergebnisse bei-
der Zellseparatoren unter Verwendung der Standardeinstellungen. Dabei fan-
den wir in den Apheresaten der beiden Zellseparatoren annähernd gleiche
Leukozyten- und Monozytenkonzentrationen. Obwohl in der Gruppe der
COBE Spectra eine signifikant längere Separationszeit ermittelt wurde (127
Minuten vs. 98 Minuten; p=0,04), sammelte der COM.TEC Zellseparator
CD14-positive Monozyten (66,6% vs. 36,2%) und die CD14- und CD16-posi-
tive Subpopulation (95,6% vs. 49,7%) deutlich effizienter als die COBE und
erreichte dabei teilweise Sammeleffizienzen von über 100 %. Hinsichtlich der
Kontamination der Leukapheresate mit Restzellen war die Thrombozyten-
konzentration in den Konzentraten der COM.TEC signifikant höher als bei
der COBE Spectra. Hinsichtlich des Erythrozytengehaltes in den Produkten
verhielt es sich hingegen umgekehrt.
In einer zweiten gepaarten Studie wurde die Produktivität des MNC-
Standardprogrammes der COM.TEC mit einem modifizierten WBK-Pro-
gramm der COBE Spectra verglichen. Der Trennfaktor war in diesem Fall bei
der COBE auf 250 reduziert und die Blutflussrate auf 60 mL pro Minute er-
höht worden (Zentrifugendrehzahl: 708 U/min.). Wie in der ersten gepaarten
Analyse waren auch hier der Leukozyten- und Monozytengehalt der Produkte
der beiden Zellseparatoren annähernd gleich und die COM.TEC war der
89
COBE Spectra, infolge der erneut deutlich kürzeren Separationsdauer, in der
Sammeleffizienz der CD14-positiven (68,4% vs. 40,4%) und der CD14- und
CD16-positiven Zellen (77,5% vs. 50,8%) deutlich überlegen. Unterschiede
zeigten sich auch im Restzellgehalt. Produkte der COM.TEC enthielten
durchschnittlich eine um den Faktor 3 höhere Thrombozytenkonzentration als
Produkte der COBE Spectra. Die Apheresate der COBE Spectra zeigten da-
gegen erneut eine höhere Erythrozytenkontamination.
5.2 Sammelergebnisse einzelner Zellpopulationen 5.2.1 Leukozyten und CD14-positive Monozyten
In den letzten Jahren besteht ein zunehmendes Interesse, monozytäre Zell-
konzentrate für die experimentelle Immuntherapie herzustellen. Durch Aphe-
rese gelingt es, mit geringem Arbeits- und Kostenaufwand große Mengen an
CD14-positiven Monozyten für experimentelle und therapeutische Zwecke zu
gewinnen (7). Durch einen zunehmenden Qualitätsanspruch an die
Zellkonzentrate hinsichtlich Reinheit und Zellgehalt steigen auch die Anforde-
rungen an die Zellseparatoren bezüglich Zellertrag, Sammeleffektivität und
Anteil der unerwünschten Restzellen im Produkt (84).
Zahlreiche Studien belegen, dass die Sammlung CD14-positiver Zellen mit
der COM.TEC sehr gut und effektiv gelingt (24, 77, 79). Zur Gewinnung
CD14-positiver Monozyten arbeitet der COM.TEC Zellseparator mit zwei
unterschiedlichen Leukaphereseprogrammen, dem MNC-Programm mit der
einstufigen Separationskammer und dem PBSC-Lym-Programm mit der
zweistufigen Kammer. Ein Vergleich dieser beiden Aphereseprogramme mit
Blick auf die Sammlung CD14-positiver Monozyten zeigte in vorangegange-
nen Studien, dass mit dem MNC-Programm eine im Vergleich zum PBSC-
Lym-Programm signifikant höhere Sammeleffizienz von mehr als 80% erzielt
werden konnte (77). Daher kam in dieser Studie ausschließlich das MNC-
Programm zum Einsatz.
90
Zur Reduktion der unerwünschten Thrombozyten im Apheresat wurde
bei dem COM.TEC Zellseparator eine niedrigere Zentrifugendrehzahl (1000
U/min.) verwendet. Anschließend wurden die Leukozyten- und Monozyten-
erträge in den so gewonnenen Apheresaten analysiert und die Ergebnisse
dieser Modifikation mit den Ergebnissen der Standardeinstellung des Pro-
gramms (1500 U/min.) verglichen. Glaser und Mitarbeiter testeten bereits
2001 beim Vorgängermodell AS.TEC 204 die Verwendung einer niedrigeren
Zentrifugengeschwindigkeit und fanden keine signifikanten Unterschiede im
Leukozyten- und CD14+ Gehalt der Produkte beider Vergleichsgruppen. Bei
dem COM.TEC Gerät führte eine Reduktion der Zentrifugendrehzahl von
1500 U/min. auf 1000 U/min. zu einer Reduktion der Leukozytenkonzentra-
tion um 50% (23,0 x 109 vs. 52,3 x 109 pro Liter) und zu einem deutlich nied-
rigeren CD14+ Gehalt im Konzentrat (0,49 x 109 vs. 1,33 x 109).
Zur Gewinnung dendritischer Zellen für die Herstellung von Impfstoff
ist eine Mindestmenge von 1,2 x 109 CD14-positiven Monozyten erforderlich,
die mit dem Standard-MNC-Programm in einem Zeitraum von 2 Stunden ge-
wonnen werden kann. Die mit dem Standardprogramm gewonnenen Aphere-
sate enthielten zwischen 0,48 x 109 und 2,67 x 109 CD14-positive Zellen. Bei
Verwendung der niedrigeren Zentrifugendrehzahl (1000 U/min.) war der mitt-
lere CD14+ Gehalt im Apheresat niedriger und lag zwischen 0,14 x 109 und
0,80 x 109 Zellen. Folglich gelang die Sammlung der CD14-positiven Zellen
mit der Standardeinstellung von 1500 U/min. wesentlich besser als mit 1000
U/min. (Sammeleffizienz: 75% vs. 45%).
Vorangegangene Studien zeigten, dass mit der COBE Spectra die für die
Gewinnung einer ausreichenden Menge dendritischer Zellen erforderliche
Mindestzellzahl von 1,2 x 109 CD14-positiven Monozyten innerhalb einer
Leukapherese nur dann erreicht wurde, wenn mit einem hohen Separations-
faktor und folglich mit hoher Zentrifugengeschwindigkeit sowie mit längerer
Spendezeit (mindestens 180 Minuten) leukapheresiert wurde (52, 76).
Nguyen berichtet in seiner Studie über die Ergebnisse mit dieser Geräteein-
stellung. Er gewann in durchschnittlich 197 Minuten ein mittleres Konzentrat-
volumen von 191 mL mit einem durchschnittlichen Monozytengehalt von 3,2
x 109 CD14-positiven Zellen. Strasser und Mitarbeiter untersuchten 10 Liter-
91
Leukapheresen und verglichen die Produktdaten der Leukozyten und CD14-
positiven Zellen, die sie in einer durchschnittlichen Spendedauer von 180
Minuten bei gesunden Spendern erzielten. Bei Zentrifugation mit 1001 U/min.
lag der mittlere CD14+ Gehalt im Apheresat bei 2,2 x 109 Zellen, bei Leuk-
apheresen mit 708 U/min. bei 1,4 x 109 Zellen und war damit bei Verwen-
dung der höheren Zentrifugengeschwindigkeit um den Faktor 2 höher. Die
CD14+ Sammeleffizienz war ebenfalls deutlich größer, wenn mit höherer
Drehzahl zentrifugiert wurde.
In der vorliegenden Studie wurden die Sammelergebnisse der COBE
Spectra bei Verwendung eines niedrigeren Trennfaktors von 250 und der da-
raus resultierenden Zentrifugendrehzahl von 646 U/min. bei einem Blutfluss
von 50 mL pro Minute mit einem höheren Blutfluss von 60 mL pro Minute ver-
glichen, der eine höhere Zentrifugengeschwindigkeit von 708 U/min. zur Fol-
ge hatte. Bei gleichem Separationsfaktor (hier 250) wird durch die Erhöhung
des Blutflusses (von 50 auf 60 mL pro Minute) die Zentrifugendrehzahl auto-
matisch angepasst. Die Spendedauer war mit durchschnittlich 115 Minuten
(646 U/min.) bzw. 118 Minuten (708 U/min.) deutlich kürzer als in den oben
genannten Studien. Mit einer mittleren Leukozytenkonzentration von 40,1 x
109 pro Liter, einem CD14+ Gehalt von 0,82 x 109 Zellen und einer CD14+
Sammeleffizienz von 37,7% lagen die mit 646 U/min. erzielten Ergebnisse im
Bereich vorheriger Studien (75). Der zur Anzucht von dendritischen Zellen er-
forderliche Mindestwert von 1,2 x 109 CD14-positiven Zellen wurde dabei bei
keiner der Leukapheresen mit niedrigem Trennfaktor von 250 und Blutfluss
von 50 mL pro Minute erreicht. Mittels Erhöhung des Blutflusses auf 60 mL
pro Minute, konnten zwischen 0,41 x 109 und 1,81 x 109 CD 14+ Zellen ge-
sammelt werden und dadurch der Mindestgehalt an CD14-positiven Zellen
zur Anzucht dendritischer Zellen zumindest bei einem Teil der Leukaphere-
sen erfüllt werden. Auch die Effizienz der Sammlung CD14-positiver Zellen
konnte durch den höheren Blutfluss verbessert werden (40,1% vs. 37,3%).
In einer früheren Studie von Strasser und Mitarbeitern wurde bereits der
COM.TEC-Vorgänger AS.TEC 204 mit der COBE Spectra hinsichtlich der
Sammeleffizienz der CD14-positiven Zellen verglichen (75). Dabei zeigte sich
die AS.TEC 204 bei Kurzzeitleukapheresen (5-Liter-Leukapheresen) der
92
COBE Spectra im Hinblick auf Leukozyten- und Monozytengehalt (1,16 x 109
vs. 0,84 x 109 CD14+ Zellen) der Apheresate und der Sammeleffizienz
CD14-positiver Monozyten (51,9% vs. 31,9%) überlegen. Auch in dieser Stu-
die dauerten die Separationen mit der COBE Spectra länger, die Separa-
tionszeit lag durchschnittlich bei 114 Minuten und es wurde ein signifikant
größeres Blutvolumen prozessiert. In der vorliegenden Studie fanden sich im
Vergleich der COBE Spectra mit dem AS.TEC-Nachfolger COM.TEC bei
Verwendung der Standardeinstellungen beider Geräte keine Unterschiede im
Leukozyten- und CD14+ Gehalt der Leukapheresate. Infolge der deutlich
besseren Sammeleffizienz CD14-positiver Zellen des COM.TEC Gerätes
(66,6% vs. 36,2%) waren die Leukozytenkonzentration und der CD14+ Zell-
gehalt trotz der längeren Spendedauer mit der COBE Spectra (127 vs. 98 Mi-
nuten) in den Produkten beider Zellseparatoren fast gleich. Mit beiden Gerä-
ten konnten die für die Anzucht dendritischer Zellen erforderlichen 1,2 x 109
CD14-positiven Zellen nur bei einem Teil der Leukapheresen erreicht wer-
den. Unter Berücksichtigung der vorliegenden Ergebnisse empfehlen wir für
die Sammlung CD14-positiver Zellen das MNC-Programm des COM.TEC
Zellseparators. Die bessere Sammeleffizienz erlaubt die Gewinnung der ge-
wünschten Zellpopulation in kurzer Spendedauer und ist für den Blutspender
angenehm sowie ökonomisch günstig.
5.2.2 CD14- und CD16-positive Monozyten Die auch als „proinflammatorische Monozyten“ bezeichneten CD14- und
CD16-positiven Monozyten spielen eine wichtige Rolle bei Infektionen und
Entzündungen. Diese Zellpopulation ist beispielsweise im Blut von Patienten
mit chronisch-entzündlichen oder rheumatoiden Erkrankungen und Sepsis
erhöht (20, 27, 30, 38, 90). Die Reduktion dieser Monozytensubpopulation im
Rahmen einer therapeutischen Apherese könnte bei chronisch-entzündlichen
Darmerkrankungen eine nicht-pharmakologische Therapieoption darstellen
(34, 40, 47, 66) und eine Einsparung von Steroiden und anderen nebenwir-
kungsreichen Medikamenten ermöglichen. Eines der Ziele dieser Arbeit war
es, die Sammeleffizienz von COBE und COM.TEC in Bezug auf diese CD14-
93
und CD16-positive Zellpopulation zu prüfen. Da zur Sammlung dieser Mono-
zytenpopulation mittels Leukapherese bisher noch keine Daten veröffentlicht
wurden, werden die Ergebnisse dieser Arbeit mit anderen Studien hinsicht-
lich der Sammlung der Gesamtpopulation der CD14-positiven Zellen vergli-
chen und diskutiert.
In einem Teil der Studie (gepaarte Analyse) wurde die Sammlung der CD14-
und CD16-positiven Monozyten mit der COM.TEC analysiert, wobei zwei Ein-
stellungen mit verschiedenen Zentrifugendrehzahlen untersucht wurden
(1000 U/min. vs. 1500 U/min.). Bei Verwendung der niedrigeren Zentrifugen-
geschwindigkeit (1000 U/min.) fanden wir neben dem bereits beschriebenen
deutlich niedrigeren Gehalt der Gesamtpopulation an CD14-positiven Zellen
einen geringeren Gehalt an CD14- und CD16-positiven Monozyten. Zwar
wurde mit der Zentrifugengeschwindigkeit von 1000 U/min. der insgesamt
höchste Gehalt dieser Monozytenpopulation erzielt, mit 1500 U/min. war die
Streubreite der einzelnen Messwerte aber deutlich geringer und die erzielten
Sammelergebnisse waren folglich konstanter. Die Sammeleffizienz der
COM.TEC war mit beiden Geräteeinstellungen für diese Monozytensubpopu-
lation um einiges besser als für die Gesamtpopulation der CD14-positiven
Zellen. Mit der Zentrifugendrehzahl von 1500 U/min. betrug die mittlere Sam-
meleffizienz für die CD14-positiven Zellen 75,3% und für die Population der
CD14- und CD16-positiven Monozyten 96,8%. Bei Zentrifugation mit 1000
U/min. lag die Sammeleffizienz für CD14-positive Zellen nur noch bei 45,0%
und für die CD14- und CD16-positiven Monozyten bei 57,8%.
Desweiteren wurde in einer ungepaarten Studie die Sammeleffizienz der
CD14- und CD16-positiven Monozyten mit der COBE Spectra untersucht.
Dabei wurde das Gerät auf einen reduzierten Separationsfaktor von 250 ein-
gestellt und zwei verschiedene Blutflussraten, 50 mL pro Minute gegenüber
60 mL pro Minute, geprüft. Aus dieser Einstellung resultierten zwei Zentrifu-
gengeschwindigkeiten, 646 U/min. (bei einem Blutfluss von 50 mL/min.) bzw.
708 U/min. (bei einem Blutfluss von 60 mL/min.). Dabei wurde mit der hö-
heren Zentrifugengeschwindigkeit nicht nur eine größere Menge an CD14-
positiven Zellen gesammelt, sondern auch ein deutlich größerer Gehalt an
94
CD14- und CD16-positiven Monozyten erzielt. Dies ist darauf zurückzufüh-
ren, dass die höhere Blutflussrate zu einem höheren prozessierten Blutvolu-
men führt. Pro Zeiteinheit werden also mehr Blutzellen prozessiert. Die
Spannbreite der Einzelwerte für die CD14- und CD16-positiven Monozyten
war bei dieser Einstellung deutlich kleiner und der erzielte Zellgehalt somit
konstanter. Auch die Sammeleffizienz (51,9% vs. 46,5%; p=0,30) konnte da-
durch im Vergleich zur Sammeleffizienz der gesamten Monozytenpopulation
(37,7% vs. 40,1%; p=0,50) deutlich verbessert werden.
Durch eine längere Separationszeit (127 Minuten vs. 116 Minuten)
und die Verarbeitung eines größeren Blutvolumens konnte die Ausbeute an
CD14- und CD16-positiven Monozyten im Apheresat weiter gesteigert (6,81 x
107 vs. 4,13 x 107 Zellen) und die Sammeleffizienz (68,5% vs. 46,6%) deut-
lich verbessert werden.
In der zweiten gepaarten Studie verglichen wir die Zellseparatoren COM.TEC
und COBE Spectra hinsichtlich der Sammlung der CD14-positiven Zellen und
der Monozytensubpopulationen. Bei Verwendung der Standardeinstellungen
beider Geräte wurde mit der COBE Spectra in signifikant längerer Separa-
tionszeit (127 Minuten vs. 98 Minuten) ein größerer Gehalt an Monozyten
und der CD14- und CD16-positiven Subpopulation erzielt als mit der
COM.TEC. Der höchste mit der COBE gewonnene Absolutwert der CD14-
und CD16-positiven Monozyten war bei vergleichbaren Minimalwerten dabei
um den Faktor 2 größer, als der mit der COM.TEC erzielte Maximalwert.
Dennoch sammelte der COM.TEC Zellseparator neben der Gesamtheit der
CD14-positiven Monozyten (66,6% vs. 36,2%; p=0,30) auch die CD14- und
CD16-positiven Zellen deutlich effektiver als die COBE Spectra (95,6% vs.
49,7%; p=0,26). Beide Zellseparatoren sammelten die CD14- und CD16-po-
sitiven Monozyten deutlich effizienter als die Hauptpopulation der CD14-posi-
tiven Monozyten.
Bei Betrachtung aller Ergebnisse ist der COM.TEC Zellseparator zur Samm-
lung der CD14- und CD16-positiven Monozyten bestens geeignet. Mit ihm
ließen sich sogar deutlich bessere Sammeleffizienzen für diese Subpopu-
lation erzielen als für die Gesamtheit der CD14-positiven Zellen. Aufgrund
95
der im Vergleich zur COBE Spectra wesentlich kürzeren Separationszeit und
der folglich signifikant besseren Sammeleffizienz empfehlen wir das MNC-
Programm des COM.TEC Zellseparators mit der Standardeinstellung (1500
U/min.) zur Sammlung CD14- und CD16-positiver Monozyten, beispielsweise
im Rahmen einer therapeutischen Apherese.
5.2.3 Restzellen
Da Monozyten nur eine Zellpopulation im gesammelten Buffy Coat sind, spie-
len Restzellen, Erythrozyten und Thrombozyten auch für die Kultur dendriti-
scher Zellen aus CD14-positiven Monozyten eine Rolle und nehmen Einfluss
auf die Ausbeute an DCs für die Impfstoffgewinnung (7, 8, 28). Ein hoher
Thrombozytengehalt im Apheresat führt nicht nur, wie zahlreiche Studien be-
legen, zu einer Beeinträchtigung von Reifung und Differenzierung der den-
dritischen Zellen (23, 24, 36, 75), sondern auch zu einem Thrombozytenver-
lust bei dem Leukozytenspender. Leukaphereseprodukte enthalten anteils-
mäßig die Ausbeute von bis zu zwei Thrombozytapherese-Konzentraten, die
zunächst gespendet und anschließend als Abfall verworfen werden. Die hohe Thrombozytenkontamination erfordert Nachbearbeitungs-
schritte vor Kultivierung und Ausreifung der Monozyten zu DCs. Es besteht
die Möglichkeit, Leukozytenkonzentrate mit hohem Thrombozytenanteil (> 1
x 1012 Thrombozyten pro Liter) vor der Zellkultur mit dem Elutra-Zellseparator
(Caridian BCT) zu bearbeiten, um die Monozyten anzureichern und Throm-
bozyten zu entfernen (8, 12, 32, 35, 41). Dabei gehen aber auch Monozyten
verloren, was letztendlich die spätere Ausbeute an dendritischen Zellen ver-
ringert (7, 8, 35, 63, 75, 76). Hohe Erythrozytenkonzentrationen im Apheresat
wiederum vermindern die Effektivität des Elutriation-Verfahrens. Überschrei-
tet der Anteil des Gesamtvolumens an Erythrozyten im Konzentrat 7,5 mL
überschreitet, wird vom Elutra-System ein sog. „Verdichtungsschritt“ ausge-
führt (18). Dieser führt wiederum zu einem weiteren Monozytenverlust, der
bis zu 40% betragen kann. Liegt die Erythrozytenzahl im Apheresat jedoch
unterhalb dieses Grenzwertes, können bis zu 90% der Monozyten, die im
Apheresat enthalten waren, durch Elutriation angereichert werden.
96
In vorangegangenen Studien konnte eine signifikante Reduktion des
Thrombozytengehaltes der Apheresate beim COM.TEC Zellseparator durch
eine Erhöhung des Zyklusvolumens (CV 300 mL vs. CV 450 mL) erreicht und
infolgedessen der relative Gewinn an dendritischen Zellen deutlich erhöht
werden (79). Glaser und Mitarbeiter zeigten bereits 2001, dass eine Vermin-
derung der Zentrifugendrehzahl sowohl beim COM.TEC-Vorgänger AS.TEC
204 als auch beim COBE Spectra Zellseparator ebenfalls zu niedrigeren
Thrombozytenzahlen im Konzentrat führte (23, 24).
Unseren Ergebnissen zufolge führt eine Reduktion der Zentrifugenge-
schwindigkeit auf 1000 U/min. (Standard: 1500 U/min.) auch beim
COM.TEC-Zellseparator zu deutlich niedrigeren Thrombozyten- (3619 x
109/L vs. 2008 x 109/L, p-Wert: 0,12) und Erythrozytenzahlen (0,68 x 1012/L
vs. 0,99 x 1012/L, p-Wert: 0,19) im Produkt. Allerdings war bei Zentrifugation
mit 1000 U/min. auch die Leukozytenausbeute um mehr als den Faktor 2
kleiner. Bei der COBE Spectra fanden wir dagegen bei Verwendung der nie-
drigeren Zentrifugengeschwindigkeit (646 U/min.) nicht nur geringere Leuko-
zytenerträge, sondern auch einen höheren Restzellgehalt im Apheresat
(Thrombozyten: 875 x 109/L vs. 857 x 109/L; Erythrozyten: 0,88 x 1012/L vs.
0,76 x 1012/L) als bei Gebrauch der höheren Kammerbeschleunigung (708
U/min.). Insgesamt scheint die Verwendung einer niedrigeren Zentrifugenge-
schwindigkeit mit dem Ziel der Reduktion des Restzellgehaltes bei COBE
und COM.TEC aufgrund der hohen Einbußen an Leukozyten und Monozyten
nicht gut geeignet zu sein. Vielmehr führte eine Erhöhung der Zentrifugen-
drehzahl von 646 U/min. auf 708 U/min. bei der COBE Spectra in jeder Hin-
sicht zu einer Verbesserung der Separationsergebnisse.
Die vergleichende Analyse der beiden Zellseparatoren zeigte, dass bei fast
identischem Leukozyten- und Monozytengehalt der Apheresate die mittlere
Thrombozytenkonzentration bei der COM.TEC um den Faktor 1,5 (Standard-
programm der COBE) bis 3 (modifizierte Version der COBE) höher war als
bei der COBE Spectra. Bei früheren Studien, die mit der AS.TEC 204 durch-
geführt wurden, wiesen die Produkte der COBE Spectra, verglichen mit dem
COM.TEC-Vorgänger AS.TEC 204, deutlich niedrigere Erythrozytenzahlen
97
auf (75). Bei der COM.TEC lag nun die mittlere Erythrozytenkonzentration in
den Produkten niedriger als bei der COBE Spectra.
Die Bedeutung des Restzellgehaltes der Apheresate für die Anzucht dendriti-
scher Zellen aus Monozyten wird durchaus kontrovers diskutiert. So zeigten
einige Studien (28, 43, 53), dass eine definierte Thrombozytenkontamination
des Monozytenapheresates, etwa im Verhältnis 5 zu 1 (53), bzw. eine Co-
Kultivierung von Monozyten und Thrombozyten zur Generation von reifen
dendritischen Zellen mit sehr starker immunologischer Aktivität führen kann.
Die reifen dendritischen Zellen exprimierten daraufhin costimulierende Mole-
küle wie CD80 und CD86 in größerer Menge und setzten mehr Interleukin 12
frei, was sich schließlich in einer starken T-Zell-Antwort niederschlug. Eine
kontrollierte Thrombozytenkontamination der Monozytenapheresate könnte
also für die Generierung von reifen und immunologisch sehr aktiven dendriti-
schen Zellen von großem Nutzen sein.
5.2.4 Monozyten-Thrombozyten-Aggregate Monozyten und Thrombozyten kommunizieren und interagieren miteinander,
insbesondere im Rahmen immunologischer Abwehrreaktionen und hämosta-
siologischer Ereignisse. Dabei kommt es zur Bindung aktivierter Thrombo-
zyten an Monozyten (2, 10, 33, 62, 68) und zur Ausbildung heterotyper
Monozyten-Thrombozyten-Aggregate, an welcher vor allem der thrombozytä-
re Glykoproteinkomplex IIb/IIIa (CD41a) und der CD62-Rezeptor (P-Selektin)
beteiligt sind (11). P-Selektin ist ein Glykoprotein und wird in den α-Granula
im Zytoplasma von Thrombozyten gespeichert. Bei Aktivierung von Thrombo-
zyten kommt es innerhalb von Sekunden zur Degranulation und zum Einbau
des P-Selektins in die Plasmamembran. Das P-Selektin vermittelt die Interak-
tion der aktivierten Thrombozyten mit geschädigtem Endothel oder Leukozy-
ten, wobei es insbesondere mit dem monozytären P-Selektin-Glykoprotein-
Liganden-1 reagiert, was zur Bildung von Monozyten-Thrombozyten-Aggre-
gaten führt (5, 10, 50, 73, 74).
Dieser Anstieg der P-Selektin-Expression (CD62) auf der Thrombozy-
98
ten-Oberfläche ist in vitro irreversibel und eignet sich somit sehr gut zur Iden-
tifikation aktivierter Thrombozyten. Deshalb wurde in der vorliegenden Studie
eine Kombination des monozytären Oberflächenmarkers CD14 und des
thrombozytären Aktivierungsmarkers CD62 für den Nachweis des Vorkom-
mens von Monozyten-Thrombozyten-Aggregaten in den Leukapheresaten
von Spendern verwendet. CD14- und CD62-positive Ereignisse wurden da-
her als Monozyten-Thrombozyten-Aggregate gewertet.
In den Apheresaten zweier Spendergruppen, die unter Verwendung
verschiedener Einstellungen des Leukozytensammelprogrammes (Blutfluss:
50 mL/min. vs. 60 mL/min., Zentrifugendrehzahl: 646 U/min. vs. 708 U/min.)
mit der COBE Spectra gewonnen wurden, war die mittlere Thrombozyten-
konzentration vergleichbar groß (875 x 109 vs. 857 x 109 pro Liter) und der
mittlere Gehalt an Monozyten-Thrombozyten-Aggregaten sogar identisch
(49,7 x 106). Der Monozytengehalt war jedoch bei den Vergleichsgruppen
unterschiedlich (0,82 x 109 vs. 1,01 x 109, p=0,10). Bei der Gegenüberstel-
lung der Leukaphereseprodukte von COBE und COM.TEC fanden wir in den
Apheresaten der COM.TEC erwartungsgemäß deutlich höhere Thrombozy-
tenkonzentrationen. Folglich war der Gehalt an Zellaggregaten um den Fak-
tor 2 höher, wobei dies mit einem geringeren Gehalt an CD14-positiven
Monozyten einherging. Demzufolge scheint ein hoher Thrombozytengehalt
im Apheresat die Bildung von Monozyten-Thrombozyten-Aggregaten zu be-
günstigen.
Aufgrund der großen Standardabweichungen im Mittelwertsvergleich sind die
Ergebnisse der Monozyten-Thrombozyten-Aggregate schwierig zu beurtei-
len. Dies führte dazu, dass trotz stark divergierender Mittelwerte im Gruppen-
vergleich kein signifikanter Unterschied resultierte. Die hohe Standardabwei-
chung ergab sich aus der großen Variabilität der sich in den Konzentraten
gebildeten Zellaggregate. Zusätzlich ist das verwendete Testverfahren
schwierig zu standardisieren, da keine Positivkontrollen verfügbar sind und
diese Zellaggregate nur anhand der Antigenexpression für Monozyten und
Thrombozyten identifiziert werden können.
Desweiteren bleibt zu klären, welche Faktoren begünstigend bzw.
hemmend auf die Bildung von Monozyten-Thrombozyten-Aggregaten einwir-
99
ken. Eine exakte Kenntnis der zur Aggregatbildung führenden Prozesse
könnte eine Reduktion der Aggregate im Apheresat und infolgedessen höhe-
re Erträge an CD14-positiven Monozyten ermöglichen. Weiterhin bleibt zu
klären, inwieweit die einzelnen Monozytensubpopulationen an der Aggregat-
bildung beteiligt sind. So wurde in vivo bereits von der Arbeitsgruppe um
Boudjeltia beobachtet, dass der Anteil der CD14- und CD16-positiven Sub-
population an den gemessenen Aggregaten größer war als der Anteil der
CD14-positiven monozytären Gesamtpopulation (22,3% vs. 18%) (11).
5.3 Rekrutierung monozytärer Subpopulationen
Ein weiterer Inhalt dieser Dissertation war die Untersuchung des Rekrutie-
rungsverhaltens der analysierten Monozytensubpopulationen. Das Phäno-
men der Zellrekrutierung während der Apherese wurde in der Literatur be-
reits vor Jahren für CD34-positiven Stammzellen beschrieben (14, 31, 37).
Maß für eine stattgefundene Zellrekrutierung ist der Rekrutierungsfaktor
(RF), der sich wie in Kapitel 3.8. beschrieben, berechnen lässt. Ein Rekrutie-
rungsfaktor von 1 bedeutet, dass während der Leukapherese keine Zellen
mobilisiert wurden, ein Rekrutmentfaktor von größer als 1 spricht für eine bis
zum Ende der Leukapherese stattgehabte Zellmobilisierung. Das Rekrutie-
rungsverhalten von einzelnen Monozytensubpopulationen ist nicht nur inter-
individuell sehr verschieden, sondern auch von der jeweiligen Monozyten-
subpopulation abhängig. So beschrieben Hendelmeier und Mitarbeiter signifi-
kante Unterschiede zwischen den Rekrutierungsfaktoren der Monozyten-
hauptpopulation, der CD14+CD16+ sowie der CD33dimCD16+ Subpopulatio-
nen (30). Dies könnte zum einen Ausdruck dafür sein, dass die Apherese als
Eingriff in das Immunsystem für die Rekrutierung und Neubildung der einzel-
nen Monozytenuntergruppen einen unterschiedlichen Stimulus darstellt. Zum
anderen könnten die Unterschiede im Rekrutierungsverhalten mit einer Ver-
schiebung innerhalb der Monozytenpopulationen während der Apherese er-
klärt werden (77, 30).
Wir berechneten die Rekrutierungsfaktoren für die Monozytenhauptpo-
pulation (CD14+CD16-), sowie für die CD14+CD16+ und CD14-CD16+ Zell-
100
populationen und verglichen diese miteinander. Die Ergebnisse reichen da-
bei von keinen detektierbaren Unterschieden bis hin zu sehr deutlichen Diffe-
renzen zwischen den Rekrutmentfaktoren der analysierten Subpopulationen,
unabhängig von dem verwendeten Zellseparator und der verwendeten Gerä-
teeinstellung. Diese Tatsache und die ausgeprägte Spannbreite der einzel-
nen Rekrutierungsfaktoren sowie die hohe Standardabweichung der Mittel-
werte sprechen für große inter- und intraindividuelle Unterschiede im Rekru-
tierungsverhalten der analysierten Zellpopulationen, welche in der Literatur
bereits häufiger vermutet wurden (77, 80).
Spezifische Aussagen lassen sich anhand unserer Ergebnisse bezüglich
möglicher Faktoren treffen, die auf das Rekrutierungsverhalten von Monozy-
ten Einfluss nehmen. In der Literatur wurden bereits die Bedeutung des ver-
wendeten Leukaphereseprogrammes, die damit verbundene Höhe des Mo-
nozytengehaltes im Apheresat sowie die in den Blutproben vor der Spende
gemessene Monozytenkonzentration des Blutspenders als Einflussfaktoren
auf das Rekrutierungsverhalten diskutiert. Strasser und Mitarbeiter beschrie-
ben einen möglichen Zusammenhang zwischen dem Rekrutmentfaktor für
mononukleäre Zellen und der verwendeten MNC-Programmeinstellung. Da-
bei schien der Rekrutmentfaktor bei Geräteeinstellungen, die auf einen ho-
hen MNC-Gewinn zielen, höher zu sein als bei anderen Geräteeinstellungen
(80). Unsere Ergebnisse stützen diese These. War bei COBE und COM.TEC
entweder mit einer hohen Zentrifugendrehzahl gearbeitet oder waren die
Spender über lange Zeit leukapheresiert worden, so dass sie ein hohes
Verhältnis von prozessiertem zu totalem Blutvolumen aufwiesen, waren die
Rekrutierungsfaktoren aller drei analysierten Zellpopulationen höher als in
den Vergleichsgruppen. Nicht selten waren diese Differenzen auch statistisch
signifikant. Aufgrund dieser Beobachtungen gehen wir davon aus, dass
durch Verwendung von Leukaphereseprogrammen, die zu einem hohen Ge-
winn an Monozyten und deren Untergruppen führen, das Ausmaß der Rekru-
tierung dieser Zellen gesteigert werden kann.
Ein anderer vieldiskutierter Punkt ist eine mögliche Auswirkung der vor
der Leukapherese im Blut der Spender gemessenen Monozytenkonzentratio-
nen auf deren Rekrutierungsverhalten während der Spende. Einige Autoren
101
vermuteten in der Vergangenheit aufgrund einer negativen Korrelation zwi-
schen Präwerten der Monozyten und deren Rekrutmentfaktoren die Existenz
einer Art negativen „Feedback“ – Mechanismus. Folglich würden niedrige
Monozytenzahlen zu einer besseren Freisetzung von Zellen und dadurch zu
einem erhöhten Rekrutierungsfaktor führen (37, 72, 80). Unsere Ergebnisse
können diese Hypothese nicht bestätigen, da kein Zusammenhang zwischen
den Monozytenkonzentrationen vor der Spende und dem Rekrutierungsfaktor
der Monozyten gefunden wurde.
Zusammenfassend kann die Leukapherese als Eingriff in die Homöostase
des menschlichen Immunsystems und damit als „Immunintervention“ gese-
hen werden. Sie führt zu Verlusten an Blutzellen, die jedoch schon im Laufe
der Blutspende durch das Phänomen der Zellrekrutierung zu einem Teil aus-
geglichen werden. Das Ausmaß der Zellrekrutierung wiederum ist von ver-
schiedenen Faktoren abhängig, deren detaillierte Kenntnis für die Gewinnung
konstanter Zellzahlen mittels Leukapherese wichtig sein könnte. Ein starker
Einfluss auf das Rekrutierungsverhalten von Monozyten und ihren Subpopu-
lationen wurde bereits der zur Leukapherese verwendeten Geräteeinstellung
zugeschrieben und anhand unserer Ergebnisse bestätigt. Der exakte Mecha-
nismus derartiger Rekrutierungsprozesse im menschlichen Körper und die
Bedeutung der Zellrekrutierung für den Blutspender sind noch nicht im Detail
bekannt und bedürfen weiterer Untersuchungen.
102
6. Literaturverzeichnis
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7. Abkürzungsverzeichnis
AABB American Association of Blood Banks
ACD-A
Ag
Acid Citrate Dextrose-Adenine
Antigen
Ak Antikörper
ASH American Society of Hematology
BC
Blfl
Buffy Coat (leukozytenreiche Zellschicht)
Blutfluss
CE Collection Efficiency (Sammeleffizienz)
CP Kopplungsfaktor
CR Collection Rate (Sammelrate)
CTL Zytotoxische T-Lymphozyten
CV Zyklusvolumen
°C Grad Celsius
DC Dendritic Cell (Dendritische Zelle)
DGTI Deutsche Gesellschaft für Transfusionsmedizin
und Immunhämatologie e.V.
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
FACS Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung
Fc Konstantes Ende von Antikörpern
FITC Fluorescein-Isocyanat
FSC Vorwärtsstreuung (Forward Scatter)
F(VB) Fluss (Vollblut)
G Gramm
G-CSF Granulozyten-Kolonien Stimulierender Faktor
GMP Good Manufacturing Practise
g*min Aufenthaltsdauer im Schwerkraftfeld
Hb Hämoglobin
Hkt Hämatokrit
HLA Humanes Leukozyten Antigen
L Liter
M-CSF Makrophagen-Kolonien Stimulierender Faktor
min. Minuten
112
mL Milliliter
MNC Mononuclear Cells (Mononukleäre Zellen)
n Anzahl
NK-Zellen Natürliche Killerzellen
PBMC Mononuclear cells in peripheral blood
PBSC Peripheral blood stem cells
PBSZ Stammzellen im peripheren Blut
PBV Prozessiertes Blutvolumen
PE Phycoerythrin
PLT Platelets (Thrombozyten)
Thr Thrombozyten
PRP Plättchenreiches Plasma
PPP Plättchenarmes Plasma
RBC Red blood cells (Erythrozyten)
RF Rekrutment Faktor
U/min. Umdrehungen pro Minute
RNA Ribonukleinsäure
SPSS Statistical Package for the Social Sciences
(Statistik-Softwarepaket)
SSC Seitwärtsstreuung
TAA Tumorassoziiertes Antigen
TBV Totales Blutvolumen
TF Trennfaktor
UPM Umdrehungen pro Minute
VB Vollblut
vs. versus, im Vergleich zu
WB whole blood (Vollblut)
WBC white blood cells (Leukozyten)
ZFG Zentrifugengeschwindigkeit
µL Mikroliter
113
8. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen
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Copenhagen, Dänemark
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Collection Efficiency of CD14+CD16+ Monocyte Populations Collected by
the COBE Spectra and the COM.TEC Cell Separator, Transfus Med
Hemother 2009, 36 (suppl 1), 17 (V.7.6)
42. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Transfusionsmedizin
und Immunhämatologie e.V. (DGTI), Karger, Rostock, Deutschland
114
10. Danksagung
Mein Dank gilt dem Leiter der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseo-
logischen Abteilung der Friedrich-Alexander-Universität in Erlangen, Herrn
Prof. Dr. med. Reinhold Eckstein.
Ganz besonders herzlich möchte ich mich bei meinem Betreuer PD Dr. med.
Erwin Strasser bedanken, der jederzeit für mich erreichbar war und mir
immer mit wertvollen Anregungen, konstruktiver Kritik und sehr viel Engage-
ment zur Seite stand. Er begleitete mich bestens durch den Entstehungs-
prozess dieser Arbeit und trug somit ganz wesentlich zum Gelingen der Ar-
beit bei.
Danke für die wunderbare Zusammenarbeit!
Desweiteren danke ich Dr. Martin Hendelmeier, der mich zu Beginn der Ar-
beit mit viel Eifer, Engagement und unter großem Zeitaufwand betreute.
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11. Lebenslauf
Name: Janina Christine Brügel
Geburtstag: 30. August 1983
Geburtsort: Nürnberg
Eltern: Dr. Martin Brügel,
Facharzt für Orthopädie
Sabine Brügel,
Germanistik- und Geschichte-Studium, Stilberaterin
Geschwister: Jacob Brügel, Student der Humanmedizin
Julie-Marie Brügel, Studentin der Humanmedizin
Joscha Brügel, Gymnasiast
Schulbildung: 1989 – 1993 Grundschule Neunhof (Nürnberg)
1993 – 2002 Melanchthon-Gymnasium Nürnberg
(humanistisches Gymnasium)
2002 Abitur
Außerschulische Weiterbildung: Sept. 2002 –
Dez. 2002
Sprachschule in Cambridge, England
Erwerb des Cambridge Certificate of Proficiency
in English
Jan. 2003 – Juni 2003 Sprachschule in Barcelona, Spanien
Studium:
Seit Okt. 2003
(WS 03/04)
Studium der Humanmedizin an der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Sept. 2005 1. Staatsexamen (Physikum)
Aug. 2008 - Juli 2009
Okt./Nov. 2009
Praktisches Jahr am Universitätsklinikum Erlangen-
Nürnberg (Wahlfach: Anästhesiologie)
2. Staatsexamen Humanmedizin