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Bedeutung zellulärer Anheftungsfaktoren für die Ausbreitung

des humanen Immundefizienz-Virus

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur Erlangung des Doktorgrades

vorgelegt von Chawaree Chaipan

aus Bangkok (Thailand)

Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der

Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 16.10.2008 Vorsitzender der Promotionskomission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch Erstberichterstatter: Prof. Dr. Wolfgang Hillen Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Bernhard Fleckenstein

Inhaltsverzeichnis

A) Zusammenfassung 1

A) Summary 2

B) Einleitung 3

C) Ziel der Arbeit 16

D) Material und Methoden 17 1. Material 17

1.1 Standardreagenzien und Chemikalien 17 1.2. Medien, Lösungen und Enzyme 18

1.2.1 Zellkulturmedien 18 1.2.2 Bakterienkulturmedien 18 1.2.3 Lösungen und Puffer 18 1.2.4 Enzyme 19

1.3 Biologisches Material 19 1.3.1 Bakterien 19 1.3.2 Eukaryote Zellen 19

1.3.2.1 Primäre Zellen 19 1.3.2.2 Zelllinien 19

1.3.3 HIV-1-Virusisolate 20 1.3.4 Antikörper und Antiseren 21

1.3.4.1 Monoklonale Antikörper 21 1.3.4.2 Polyklonale Antikörper 21 1.3.4.3 Sekundärantikörper 21

1.4. Nukleinsäuren 22 1.4.1 Oligonukleotide 22 1.4.2 Vektorsysteme und Plasmide 23

2. Methoden 25 2.1 DNA-Methoden 25

2.1.1 Standardmethoden: 25 2.2 Zellbiologische Methoden 25

2.2.1 Kultivierung von adhärenten Zellen und Suspensionszellen 25 2.2.2 Isolierung von Thrombozyten 25 2.2.3 Isolierung von PBMCs aus Buffy Coat mittels Ficoll-Trennung 25 2.2.4 Methoden zur Transfektion eukaryoter Zellen 26

2.2.4.1 Transfektion mit Kalziumphosphat 26 2.2.4.2 Transfektion mit Lipofektamin (Lipofectamine2000TM) 26

2.2.5 Durchflusszytometrie (fluorescence activated cell sorting, FACS) 26 2.3 Virologische Methoden 27

2.3.1 Transduktion von Zellen mit siRNA-exprimierenden Vektoren 27 2.3.2 Herstellung von replikationsfähigen HIV-1 NL4-3 Luc Reporterviren 27 2.3.3 Herstellung von Pseudotypen mit Hilfe eines HIV-1-abgeleiteten Vektors 27 2.3.4 Infektionsanalysen 27 2.3.5 Bindungsanalysen von viralen Partikeln an zelluläre Anheftungsfaktoren 28

2.4 Proteinmethoden 28 2.4.1 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese und Western Blot-Analysen 28

Inhaltsverzeichnis

E) Ergebnisse 30 1. DC-SIGN und CLEC-2 vermitteln die HIV-1-Transmission durch Thrombozyten 30

1.1 CLEC-2: Ein neuer zellulärer Anheftungsfaktor für HIV-1 30 1.2 Die Interaktion von HIV-1 mit CLEC-2-exprimierenden Zellen ist spezifisch 31 1.3 DC-SIGN, jedoch nicht CLEC-2 verstärkt die Infektiosität von Ebola- und SARS- Pseudotypen 32 1.4 CLEC-2 interagiert nicht mit HIV-1 Env 33 1.5 CLEC-2 wird auf Thrombozyten und Megakaryozyten exprimiert 35 1.6 CLEC-2 trägt zur Bindung von HIV-1 an Thrombozyten bei 36 1.7 DC-SIGN wird auf Thrombozyten exprimiert und trägt wesentlich zur HIV-1-Trans- Infektion bei 39 1.8 An Thrombozyten gebundene Viren sind neutralisationssensitiv 41 1.9 Die Bindung von HIV-1 an Thrombozyten konserviert die virale Infektiosität 42

2. Einfluss von Podoplanin auf die CLEC-2-vermittelte HIV-1-Transmission 43 2.1 Expression von Podoplanin auf 293T Zellen 44 2.2 Podoplanin-Überexpression steigert die CLEC-2-Bindung an 293T Zellen 45 2.3 siRNA-vermittelte Suppression der Podoplanin-Expression 47 2.4 Die CLEC-2-vermittelte HIV-1-Trans-Infektion korreliert mit der Podoplanin- Expression auf der Oberfläche virusproduzierender Zellen 49 2.5 Podoplanin-Expression auf HIV-infizierten CEMx174 R5 Zellen 51

F) Diskussion 53 1. DC-SIGN und CLEC-2 vermitteln die Interaktion von Thrombozyten mit HIV-1 53 2. Einfluss von Podoplanin auf die CLEC-2-vermittelte Transmission von HIV-1 57

G) Literaturverzeichnis 61

H) Anhang 74

Zusammenfassung

A) Zusammenfassung

Das Hüllprotein (Env) des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) vermittelt den infektiösen

Eintritt in Zielzellen. Die Interaktion von Env mit dem CD4-Rezeptor und einem

Chemokinrezeptor ist für die Infektion essentiell. Die Bindung an sogenannte

Anheftungsfaktoren ist dagegen für den infektiösen Eintritt nicht erforderlich, sie kann jedoch die

Infektionseffizienz stark erhöhen. Der Anheftungsfaktor DC-SIGN wird auf submukosalen

dendritischen Zellen exprimiert und verstärkt die HIV-Infektion benachbarter T-Zellen (Trans-

Infektion). Es wurde initial postuliert, dass die DC-SIGN-abhängige Bindung von HIV an

dendritische Zellen die sexuelle Übertragung des Virus fördert. Neuere Arbeiten zeigen jedoch,

dass neben DC-SIGN weitere, zum Teil unbekannte Faktoren die effiziente Anheftung von HIV

an dendritische Zellen und Zelllinien vermitteln. Weiterhin wurde dokumentiert, dass

Polymorphismen im DC-SIGN-Gen das Risiko einer HIV-Infektion bei parenteraler, nicht jedoch

bei mukosaler Übertragung beeinflussen. Diese Beobachtung kann dahingehend interpretiert

werden, dass DC-SIGN-exprimierende dendritische Zellen in den Schleimhäuten für die

sexuelle Übertragung von HIV nicht wichtig sind, während bis dato unbekannte DC-SIGN-

positive Zellen nach dem Eindringen des Virus in die Blutbahn dessen Ausbreitung fördern. Das

Ziel dieser Arbeit war es daher, weitere DC-SIGN-positive Zelltypen bzw. weitere HIV-

Anheftungsfaktoren zu identifizieren und deren Bedeutung für die Disseminierung des Virus zu

untersuchen.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte CLEC-2 als neuer HIV-Anheftungsfaktor identifiziert werden.

Es konnte gezeigt werden, dass CLEC-2 auf Thrombozyten und Megakaryozyten exprimiert

wird und dass Thrombozyten in einer zum Teil CLEC-2-abhängigen Weise die HIV-1-Trans-

Infektion von CD4-positiven Zielzellen fördern. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass

Thrombozyten DC-SIGN exprimieren und dass DC-SIGN wesentlich zur HIV-Interaktion mit

Thrombozyten beiträgt. Es ergaben sich Hinweise, dass CLEC-2 im Gegensatz zu DC-SIGN

nicht mit dem HIV-Hüllprotein interagiert, sondern mit einem zellulären Faktor, der im Verlauf

der Virusfreisetzung in die virale Hüllmembran inkorporiert wird. Expressionsanalysen und der

Einsatz von siRNAs lieferten Hinweise darauf, dass es sich bei dem zellulären Faktor um

Podoplanin handelt. Podoplanin ist ein Muzin-ähnliches Protein, das unter anderem auf 293T

Zellen exprimiert wird, welche in der vorliegenden Arbeit für die Herstellung von HIV eingesetzt

wurden. Die Beobachtung, dass auch Viren, die in Podoplanin-negativen Zellen generiert

wurden, mit CLEC-2 interagierten, legt allerdings nahe, dass entweder im Verlauf der HIV-

Infektion die Expression von Podoplanin induziert wird oder weitere CLEC-2-Liganden auf HIV-

permissiven Zellen exprimiert werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass

Thrombozyten HIV mittels DC-SIGN und CLEC-2 binden und an T-Zellen übertragen; ein

Prozess, der möglicherweise zur Ausbreitung von HIV in infizierten Personen beiträgt.

1

Summary

A) Summary

The envelope protein (Env) of human immunodeficiency virus (HIV) mediates infectious entry

into target cells. The interaction of Env with the CD4 receptor and a chemokine receptor is

essential for infection, while binding to so-called attachment factors is dispensable. However,

attachment factor engagement can profoundly augment infection efficiency. The attachment

factor DC-SIGN is expressed on submucosal dendritic cells and it has been postulated that

binding of HIV to DC-SIGN on dendritic cells might promote sexual transmission of HIV.

However, more recent work suggests that dendritic cells can also bind to HIV in a DC-SIGN-

independent manner and that DC-SIGN-negative cells can promote HIV infection of adjacent

cells (trans-infection). Furthermore, it has been shown that polymorphisms in the DC-SIGN

gene influence the risk of HIV infection upon parenteral, but not mucosal HIV transmission. This

observation indicates that DC-SIGN on mucosal dendritic cells might not be involved in sexual

transmission of HIV, whereas hitherto unknown DC-SIGN-positive cells might augment

dissemination of the virus after its entry into the bloodstream. Therefore, the objective of this

work was to identify new DC-SIGN-positive cells and new HIV attachment factors, and to

determine their impact on HIV dissemination.

In the present study the cellular surface protein CLEC-2 could be identified as a new HIV

attachment factor. It could be shown that CLEC-2 is expressed on platelets and

megakaryocytes, and that platelets mediate HIV trans-infection of T-cells in a partly CLEC-2-

dependent manner. Furthermore, it could be demonstrated that platelets also express DC-SIGN

and that this lectin is mainly responsible for HIV binding to platelets. Evidence was obtained that

CLEC-2, in contrast to DC-SIGN, does not interact with the HIV Env protein but with a cellular

factor incorporated into the viral membrane upon virus release. Expression analysis and siRNA-

mediated knock-down demonstrated that this cellular factor is podoplanin, a mucin-type protein

found to be expressed on 293T cells, which were routinely used for virus production. However,

the observation that viruses generated in podoplanin-negative cells still interacted with CLEC-2

suggested that either endogenous podoplanin expression is induced during HIV infection or

additional CLEC-2 ligands are expressed on HIV target cells. In summary, it could be

demonstrated that platelets bind and transmit HIV to T-cells via DC-SIGN and CLEC-2, a

process that might aid HIV dissemination in infected individuals.

2

Einleitung

B) Einleitung

Das humane Immundefizienz-Virus (HIV): Entdeckung und Epidemiologie

HIV Typ 1 (HIV-1) wurde 1983 erstmals von Robert C. Gallo am „National Institute of Health”,

Bethesda (Gallo et al., 1983) und der Arbeitsgruppe von Luc Montagnier (Barre-Sinoussi et al.,

1983) am Pasteur Institut, Paris, als Erreger des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS)

beschrieben. Das Virus wurde aus einem Lymphknoten eines an Lymphadenopathie erkrankten

Patienten isoliert und zunächst fälschlicherweise der Gruppe der humanen T-Zell-Leukämie-

Viren (HTLV) zugeordnet (Gallo et al., 1984) und als humanes T-Zell-Leukämie-Virus III (HTLV

III) bzw. Lymphadenopathie-assoziiertes Virus (LAV) bezeichnet. Das Virus unterscheidet sich

jedoch erheblich von HTLV und ist der Gruppe der Lentiviren zuzuordnen. 1986 einigte man

sich auf die Bezeichnung humanes Immundefizienz-Virus (HIV) (Coffin et al., 1986).

HIV wird aufgrund unterschiedlicher phylogenetischer und biologischer Eigenschaften in die

Spezies HIV-1 und HIV-2 unterteilt. HIV-1, etwa 40% homolog zu HIV-2, ist weltweit verbreitet,

während HIV-2 überwiegend in Westafrika vorkommt. Beide HIV-Typen haben ihren Ursprung

in Afrika und sind das Resultat mehrfacher Übertragungen von Affen-Immundefizienz-Viren

(Simian Immunodeficiency Virus, SIV) auf den Menschen. Als Reservoir gelten im Fall von HIV-

1 Schimpansen (Pan troglodytes troglodytes), bei HIV-2 sind es Halsbandmangaben

(Cercocebus atys). Hinweise auf eine mögliche Transmission von SIV auf den Menschen durch

kontaminierte Polio-Vakzine konnten nicht bestätigt werden (Worobey et al., 2004). Vielmehr

wird vermutet, dass die Affen gejagt und verspeist wurden und so das SIV auf den Menschen

übertragen wurde. Die für die Ausbreitung von HIV-1 bzw. AIDS verantwortlichen Viren wurden

vermutlich um 1931 auf den Menschen übertragen (Korber et al., 2000). Der erste sichere

Nachweis einer HIV-1-Infektion gelang mit einer Blutprobe, die 1959 in Zaire entnommen wurde

(Zhu et al., 1998).

Die HIV-1-Infektion führt nach 5-10 Jahren zu einem Defekt des Immunsystems. Die

Konsequenz ist das gehäufte Auftreten verschiedener opportunistischer Infektionen, die

kollektiv zum Krankheitsbild AIDS zusammengefasst werden. Dagegen ist die HIV-2-Infektion

mit einer deutlich langsameren Krankheitsprogression assoziiert. Im Jahr 2007 waren ca. 37,8

Mio. Menschen mit HIV infiziert (WHO, Stand 2007). Am meisten betroffen ist Afrika in der

Region südlich der Sahara, sowie Südostasien und Indien. Inhibitoren der viralen Enzyme

Reverse Transkriptase (RT) und Protease ermöglichen die wirksame Therapie der HIV-

Infektion. Diese Medikamente stehen jedoch nur einem Bruchteil der Infizierten zur Verfügung

und erlauben nicht die Eradizierung des Virus in infizierten Personen. Im Gegenteil, die

Entstehung und Transmission von resistenten Varianten führt zu einer ständig steigenden

Anzahl an Patienten, denen kaum therapeutische Optionen zur Verfügung stehen (Perno et al.,

3

Einleitung

2008). Die Entwicklung einer Vakzine ist daher die einzige Möglichkeit die HIV-Pandemie

einzudämmen. Ob und wann ein wirksamer Impfstoff zur Verfügung stehen wird, ist jedoch nicht

absehbar.

HIV-Partikelaufbau und Genomorganisation

Infektiöse HIV-Partikel haben einen Durchmesser von etwa 100-120 nm und werden von einer

Lipidmembran umgeben. In die Lipidhülle sind virale Glykoproteine eingebettet, die aus dem

Transmembranprotein gp41 und dem Oberflächenprotein gp120 zusammengesetzt sind (Abb.

1). Die virale Hüllmembran ist zellulären Ursprungs und enthält neben den viralen Hüllproteinen

auch zelluläre Faktoren wie HLA-II, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 und CD2/LFA-2 (Ott, 2002).

gp120

gp41

Matrixprotein(MA, p17)Integrase (IN, p31)

Reverse Transkriptase(p66/p51, RT)

Protease(PR, p11)

Vif, Vpr, Nef und p7

Lipidmembran

Virale RNA

Nukleokapsid(NC, p7)

Kapsid (CA, p24)gp120

gp41

Matrixprotein(MA, p17)Integrase (IN, p31)

Reverse Transkriptase(p66/p51, RT)

Protease(PR, p11)

Vif, Vpr, Nef und p7

Lipidmembran

Virale RNA

Nukleokapsid(NC, p7)

Kapsid (CA, p24)

Abbildung 1: Morphologie des HIV-1-Partikels

Das HI-Virus wird von einer Membran umgrenzt, die von der Wirtszellmembran abgeleitet ist. In die Hüllmembran sind die viralen Glykoproteine gp41 und gp120 eingelagert. Zwischen der Lipidmembran und dem Kapsid befindet sich das Matrixprotein p17, das über Myristinsäurereste in der Hüllmembran verankert ist. Im Inneren des Viruspartikels befindet sich das aus den Kapsidproteinen (p24) bestehende konische Kapsid, in dem das virale RNA-Genom mit den Nukleokapsidproteinen, der Reversen Transkriptase (RT) und der Integrase (IN) komplexiert ist. Weiterhin befinden sich im Kapsid die akzessorischen Proteine Vif, Vpr und Nef.

(Adaptiert aus: Robinson, 2002)

An der Innenseite der viralen Hüllmembran sind p17-Matrixproteine (MA) über aminoterminal

angefügte Myristinsäurereste mit der Hüllmembran verbunden. Das konische Kapsid enthält

zwei Kopien des viralen Genoms, einer einzelsträngigen RNA in Plusstrangorientierung, die 9,2

kb umfasst. Diese enthält die für eukaryote mRNAs charakteristische 5’Cap-Struktur und eine

3’PolyA-Sequenz (Whitcomb and Hughes, 1992). Das virale Genom ist mit den

Nukleokapsidproteinen assoziiert und kodiert für die zwischen Retroviren konservierten

Proteine Gag, (gruppenspezifisches Antigen), Pol (Polymerase) und Env (Envelope-Protein), für

4

Einleitung

die akzessorischen Proteine Nef, Vif, Vpr und Vpu (Cohen et al., 1990; Kotov et al., 1999; Liu et

al., 1995) sowie für die regulatorischen Proteine Tat und Rev (Malim et al., 1988; Weeks et al.,

1990). Neben dem viralen RNA-Genom findet man im Kapsid die Enzyme Reverse

Transkriptase (RT) und Integrase (IN) (Freed, 2001).

Das gag-Gen kodiert für ein Polyprotein, das durch die virale Protease (p9) in das Matrixprotein

(MA, p17), das Kapsidprotein (CA, p24), das Nukleokapsidprotein (NC, p7) sowie das Linker-

Protein p6 prozessiert wird. Das pol-Gen kodiert für die viralen Enzyme Protease p9, RT

(p51/66) und IN (p38). Das Pol-Protein wird als Gag-Pol-Fusionsprotein synthetisiert und durch

die virale Protease während der Assemblierung in die einzelnen Komponenten prozessiert

(Peng et al., 1991; Wain-Hobson et al., 1985). Das env-Gen kodiert für das Vorläuferprotein

gp160. Dieses wird im TGN (trans-golgi-network) durch die zellulären Proprotein-Konvertasen

Furin und PC7 in die Untereinheiten gp120 und gp41 prozessiert (Kantanen et al., 1995;

Moulard et al., 1999). Die Oberflächeneinheit gp120 und die Transmembraneinheit gp41 sind

durch nicht-kovalente Bindungen verbunden, und die gp120/gp41 Dimere lagern sich auf der

Zelloberfläche zu trimeren Komplexen zusammen (Weissenhorn et al., 1997).

Die regulatorischen Genprodukte Tat (transactivator of transcription) und Rev (regulator of

expression of viral proteins) sind für die transkriptionelle und posttranskriptionelle Regulation

der HIV-Genexpression verantwortlich. Tat bindet an das cis-aktive TAR-Element (trans-

activation response) naszierender viraler RNAs und potenziert die Prozessivität der zellulären

RNA-Polymerase II (Weeks et al., 1990). Das Rev-Protein reguliert die Expression viraler Gene

auf posttranskriptioneller Ebene, indem es an das RRE (Rev responsive element) der viralen

mRNA bindet und den Transport partiell gespleißter und ungespleißter viraler mRNAs in das

Zytoplasma reguliert (Emerman and Malim, 1998).

Die akzessorischen Proteine Vif (viral infectivity factor), Vpr (viral protein R), Vpu (viral protein

U) und Nef (negative factor) sind für die Virusreplikation in einigen Zellkultursystemen nicht

essentiell, sind aber in vivo für die effiziente virale Ausbreitung und Pathogenese unverzichtbar

(Aldrovandi and Zack, 1996).

Der HIV-Replikationszyklus

Die HIV-1-Infektion beginnt mit der Interaktion des viralen Hüllproteins Env mit dem zellulären

Rezeptor CD4 (Dalgleish et al., 1984) und einem Chemokin-Korezeptor, in der Regel CCR5

oder CXCR4 (Deng et al., 1996; Feng et al., 1996). CD4 wird nicht nur auf HIV-permissiven T-

Lymphozyten (Barre-Sinoussi et al., 1983) exprimiert, sondern auch auf Makrophagen und

Monozyten (Collman et al., 1989), dendritischen Zellen (Knight et al., 1990) sowie

Mikrogliazellen des Gehirns (Jordan et al., 1991). Die Bindung von gp120 an den primären

5

Einleitung

Rezeptor CD4 löst eine Konformationsänderung in gp120 aus, die eine Interaktion mit dem

Korezeptor ermöglicht. Die Korezeptorbindung induziert konformationelle Umlagerungen in

gp41, die die Fusion der zellulären mit der viralen Membran bewirken. Das Nukleokapsid wird

daraufhin in das Zytoplasma freigesetzt, und die Bildung des Reversen

Transkriptionskomplexes (RT-Komplex) führt dazu, dass die virale RNA durch die RT in eine

komplementäre DNA (cDNA) transkribiert wird (Karageorgos et al., 1993). Der entstehende Prä-

Integrationskomplex (PI-Komplex) wird unter Beteiligung der nukleären Lokalisationssignale im

MA (p17)-Protein und Vpr in den Zellkern transportiert (Sherman and Greene, 2002) und mit

Hilfe der Integrase in das zelluläre Wirtsgenom integriert (Brown et al., 1987). Die integrierte

cDNA dient als Matrize für die Synthese von mRNAs und genomischer RNA. Letztere wird über

die Interaktion mit dem viralen Nukleokapsidprotein in naszierende Partikel eingebaut, die an

der Zytoplasmamembran assembliert werden. Bei der Knospung der unreifen viralen Partikel

werden die viralen Kapside mit zellulärer Membran umhüllt und von der Zelle abgeschnürt. Die

Reifung der Partikel wird durch die autoproteolytische Prozessierung des Gag/Pol-

Vorläuferproteins initiiert und führt zur Bildung von infektiösen Partikeln (Abb. 2).

CD4

HIV-1

Membranfusion

RezeptorbindungRNA

DNA

Gag,Pol,Env

Tat,Rev

reverseTranskription

Knospung

Virusreifung

Translation

Transkription

IntegrationDNA

Chemokinrezeptor

RT

IN

RT

IN

Regulation

CD4

HIV-1

Membranfusion

RezeptorbindungRNA

DNA

Gag,Pol,Env

Tat,Rev


Knospung

Virusreifung

Translation

Transkription

IntegrationDNA

Chemokinrezeptor

RT

IN

RT

IN

Regulation

CD4

HIV-1

Membranfusion

RezeptorbindungRNA

DNA

Gag,Pol,Env

Tat,Rev


Knospung

Virusreifung

Translation

Transkription

IntegrationDNA

Chemokinrezeptor

RT

IN

RT

IN

Regulation

Abbildung 2: HIV-Replikationszyklus

Der Eintritt des HI-Virus in die Zielzelle wird durch sequentielle Interaktion des viralen Hüllproteins mit dem CD4-Rezeptor und einem Chemokin-Korezeptor vermittelt. Nach der Membranfusion wird im Zytoplasma der Zielzelle die virale RNA in DNA umgeschrieben und anschließend in den Zellkern transportiert. Im Zellkern wird die Integration der viralen DNA in das Wirtsgenom durch die virale Integrase vermittelt. Die Transkription und Translation der viralen Gene erfolgt durch die zelluläre Proteinbiosynthese-Maschinerie. Die regulatorischen Proteine Tat und Rev nehmen Einfluss auf die Genexpression. Nachkommen-Viren werden an der Zytoplasmamembran assembliert und schnüren sich anschließend von der Wirtszellmembran ab.

(Adaptiert aus Macpherson et al., 1999)

6

Einleitung

Aufbau und Funktion des HIV-Hüllproteins

Das virale Hüllprotein vermittelt den Eintritt in Zielzellen. Es wird als Homotrimer aus nicht-

kovalent verbundenen gp120/gp41-Dimeren in die Zytoplasmamembran infizierter Zellen bzw.

in die virale Hüllmembran eingelagert. Das Oberflächenprotein gp120 vermittelt die Interaktion

mit dem CD4-Rezeptor und einem Chemokinrezeptor, während das Transmembranprotein

gp41 die Fusion der viralen Membran mit einer zellulären Membran bewirkt.

Das gp120 Glykoprotein besteht aus fünf konservierten Regionen (C1-C5), die durch fünf

zwischen den verschiedenen HIV-Stämmen variable Regionen (V1-V5) unterbrochen werden

(Starcich et al., 1986). Die variablen Regionen werden durch intramolekulare Disulfidbrücken zu

Schleifen geformt. Sowohl variable als auch konstante Bereiche werden massiv durch zelluläre

Enzyme glykosyliert (Geyer et al., 1988). Die Struktur von gp120 wurde auf molekularer Ebene

bestimmt (Kwong et al., 1998). Gp120 wird in eine innere und eine äußere Domäne unterteilt,

die durch ein sogenanntes „bridging sheet“, bestehend aus viersträngigen antiparallelen β-

Faltblättern, miteinander verbunden sind (Kwong et al., 1998; Rizzuto et al., 1998; Zhu et al.,

2001). Die äußere Domäne ist deutlich variabler als die innere Domäne und ihre Oberfläche

wird durch Glykane bedeckt. Im Gegensatz dazu ist die Oberfläche der inneren Domäne

hochkonserviert und nicht-glykosyliert; sie ist vor allem für die Interaktion zwischen gp120 und

gp41 wichtig (Wyatt et al., 1998).

Bereiche innerhalb der konservierten Regionen C2, C3 und C4 in gp120 vermitteln die Bindung

an CD4. Die Interaktion mit CD4 löst eine Konformationsänderung in gp120 aus (Olshevsky et

al., 1990) die bewirkt, dass eine konservierte Bindestelle für einen Chemokinrezeptor

zugänglich wird (Rizzuto et al., 1998). Abschnitte im „bridging sheet“ sind für die

Korezeptorbindung wichtig, außerdem hat die variable Domäne V3 einen entscheidenden

Einfluss auf die Korezeptornutzung (Rizzuto et al., 1998; Trkola et al., 1996a; Verrier et al.,

1999). Die Bindung von gp120 an CD4 und Korezeptor löst schließlich eine

Konformationsänderung im Transmembranprotein gp41 aus, welches die Fusion der viralen

Membran mit der Wirtszellmembran vermittelt (Weissenhorn et al., 1997). Hierzu wird zunächst

das N-terminale Fusionspeptid des gp41 in die Wirtszellmembran inseriert. Anschließend lagern

sich zwei helikale Regionen (HR-1 und HR-2), die zwischen Fusionspeptid und

Transmembrandomäne von gp41 lokalisiert sind, zu einem Bündel aus sechs Helices

zusammen (Chambers et al., 1990). Durch diese Umlagerung werden virale und zelluläre

Membran in enge räumliche Nähe gebracht und die Membranfusion induziert (Melikyan et al.,

2000).

Der erste essentielle Schritt im HIV-Replikationszyklus ist die Bindung von gp120 an das CD4-

Molekül auf der Oberfläche von Zielzellen (Clapham and McKnight, 2001; Doms, 2001). Die

wichtigsten Zielzellen der HIV-Infektion sind CD4-positive T-Lymphozyten und Makrophagen,

7

Einleitung

weiterhin werden u.a. Monozyten (Clapham et al., 1987), dendritische Zellen (Knight et al.,

1990) sowie Mikrogliazellen des Gehirns infiziert (Jordan et al., 1991). Der Zelltropismus wird

wesentlich durch die Auswahl des Korezeptors bestimmt (Kwong et al., 1998). Der

Chemokinrezeptor CCR5 wird auf Makrophagen und Gedächtnis-T-Zellen exprimiert und Viren,

die diese Zellen infizieren, verwenden in den meisten Fällen CCR5 (R5-trope Viren) (Choe et

al., 1996; Alkhatib et al., 1996; Doranz et al., 1996; Deng et al., 1996; Dragic et al., 1996). Im

Gegensatz dazu interagieren T-Zell-trope Viren mit dem Korezeptor CXCR4 (X4-trope Viren),

der hautsächlich auf naiven T-Zellen exprimiert wird (Feng et al., 1996). Chemokinrezeptoren

gehören zur Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren aus der Familie der 7-

Transmembranproteine. Natürliche Liganden des CCR5-Chemokinrezeptors sind die CC-

Chemokine CCL3, CCL4 und CCL5, der einzig bekannte natürliche Ligand von CXCR4 ist das

CXC-Chemokin CXCL12. Diese Chemokine können in vitro die HIV-1-Infektion blockieren

(Alkhatib et al., 1996; Bleul et al., 1996).

Die sexuelle Übertragung von HIV-1 erfolgt durch R5-trope Viren. Polymorphismen im CCR5-

Gen können das Risiko einer HIV-1-Infektion wesentlich beeinflussen. Heterozygote Träger

eines CCR5-Defektallels (Δ32) progredieren langsamer zu AIDS (Liu et al., 1996), und

homozygote Träger sind weitgehend resistent gegenüber einer sexuellen Übertragung von HIV-

1 (Huang et al., 1996). Weitere Polymorphismen im CCR5-Gen, insbesondere im

Promotorbereich, können die Progression von AIDS verlangsamen (Martin et al., 1998;

McDermott et al., 1998). Im Verlauf der Infektion entstehen bei etwa 40% der Patienten Viren,

die zusätzlich zu dem Korezeptor CCR5 auch CXCR4 nutzen (R5X4-trope Viren) oder nur

CXCR4 für den Eintritt verwenden. Das Auftreten von X4-tropen Viren ist mit einer schlechten

klinischen Prognose assoziiert (Connor et al., 1997). Neben CCR5 und CXCR4 sind folgende

alternative Korezeptoren bekannt: CCR2b (Rucker et al., 1996), CCR3 (Choe et al., 1996),

CCR4 (Agrawal et al., 2002), APJ (Choe et al., 1998), CXCR6 (Liao et al., 1997), GRP15

(Unutmaz et al., 1998), GPR1 (Farzan et al., 1997), ChemR23 (Samson et al., 1998), V28

(Reeves et al., 1997), CCR8 (Lee et al., 2000), US28 (Pleskoff et al., 1997) und BLR1 (Forster

et al., 1997; Dimitrov, 1997). Einige HIV-1-Isolate und zahlreiche HIV-2 sowie SIV-Isolate

verwenden alternative Korezeptoren für den effizienten Eintritt in bestimmte Zelllinien. Die

Bedeutung dieser Korezeptoren für die HIV-1-Ausbreitung in vivo ist nicht abschließend geklärt,

jedoch wahrscheinlich gering.

8

Einleitung

Die Inhibition des Eintritts von HIV in Zielzellen ist eine attraktive therapeutische Option

HIV-Eintrittsinhibitoren sollen die Bindung von HIV an die Zielzelle verhindern und die Fusion

der viralen mit der zellulären Membran unterbinden. Folgende Vorgänge werden durch die

jeweiligen Eintrittsinhibitoren unterbunden:

1. Bindung des HIV-gp120 an den CD4-Rezeptor und zelluläre Anheftungsfaktoren

(Attachment-Inhibitoren)

2. Bindung von HIV-1 an Korezeptoren (Korezeptorantagonisten)

3. Fusion der viralen mit der zellulären Membran (Fusionsinhibitoren)

Agenzien wie das tetravalente CD4-IgG2 Fusionsprotein PRO 542 besetzen die CD4-

Bindetaschen des gp120 und blockieren so die Interaktion von HIV mit CD4 (Allaway et al.,

1995) (Abb. 3). Die Bindung des kleinen Moleküls BMS-806 (Lin et al., 2003) an gp120

verhindert ebenfalls den Eintritt der HIV-Primärisolate in CD4-positive Zielzellen. CD4-

Inhibitoren können jedoch potentiell in normale Zellfunktionen eingreifen, ihr therapeutischer

Einsatz ist daher unter Umständen problematisch. Im Gegensatz dazu ist der Einsatz von

CCR5-Antagonisten zur HIV-Therapie attraktiv, denn homozygote Träger eines CCR5-

Defektallels sind gegen sexuell übertragenes HIV-1 geschützt und klinisch unauffällig.

Verschiedene niedermolekulare, nicht-peptidische CCR5-Antagonisten wurden entwickelt und

das Präparat Maraviroc (Celsentri®, Pfizer) wird bereits seit 2007 erfolgreich in der Klinik

eingesetzt (Dorr et al., 2005; Kondru et al., 2008).

Das von gp41-abgeleitete Peptid T20 (Enfuvirtide) (Wild et al., 1994) und das kürzlich von

Münch et al. identifizierte α1-Antitrypsinfragment VIRIP (Virus Inhibitory Peptide) inhibieren die

Fusion der viralen mit der zellulären Membran (Munch et al., 2007). Die blockierende Wirkung

von T20 beruht auf der Inhibition der Ausbildung der 6-Helix-Bündel-Struktur, während VIRIP

mit der Funktion des HIV-1-Fusionspeptids interferiert. VIRIP und T20 blockieren auch den

Eintritt von Viren, die bereits gegen Protease- und RT-Inhibitoren resistent sind und eröffnen

somit neue therapeutische Optionen (Munch et al., 2007).

9

Einleitung

PRO 542BMS-806TNX-355

T20(Enfurvirtide)

Virusmembran

gp41

gp120

VariableSchleifen CD4

Trimer CD4-Bindung Korezeptor-Bindung 6-Helix-Bündelaus HR1 und HR2

& Fusion

Korezeptor

Zwei Env Trimere

AMD3100AMD070

CXCR4-Inhibitoren

SCH-CSCH-DPRO 140TAK-779TAK-220Maraviroc

CCR5-Inhibitoren

VIRIPPRO 542BMS-806TNX-355

T20(Enfurvirtide)

Virusmembran

gp41

gp120

VariableSchleifen CD4

Trimer CD4-Bindung Korezeptor-Bindung 6-Helix-Bündelaus HR1 und HR2

& Fusion

Korezeptor

Zwei Env Trimere

AMD3100AMD070

CXCR4-Inhibitoren

AMD3100AMD070

CXCR4-Inhibitoren


CCR5-Inhibitoren


CCR5-Inhibitoren

VIRIP

Abbildung 3: HIV-Eintrittsinhibitoren im Überblick

Die Bindung von HIV-gp120 an CD4 wird durch PRO 542 (Progenics, Tarrytown, NY), BMS-806 (Bristol-Myers Squibb) und den anti-CD4 Antikörper TNX-355 (Tanox, Houston) unterbunden. Die Interaktion von gp120 mit CD4 führt zur Exposition einer Korezeptorbindestelle. Die Interaktion von gp120 mit CCR5 wird durch SCH-C, SCH-D (Schering-Plough), Maraviroc (Pfizer), TAK-779 (Baba et al., 1999), TAK-220 (Tremblay et al., 2005) und den anti-CCR5 Antikörper PRO 140 (Progenics) blockiert, während die Bindung an CXCR4 durch AMD3100 und AMD070 (AnorMED, Vancouver) inhibiert wird. Das Fusionspeptid (FP) in gp41 wird nach Korezeptorbindung in die zelluläre Membran inseriert, und die Bildung des 6-Helix-Bündels vermittelt die Fusion von viraler und zellulärer Membran. Der Fusionsinhibitor T20 verhindert die Bildung des 6-Helix-Bündels, während der VIRIP vermutlich die Insertion des Fusionspeptids in die Zielzellmembran blockiert (Munch et al., 2007).

(Adaptiert und modifiziert aus Moore und Doms, 2003)

Verstärkung der HIV-1-Infektion durch zelluläre Anheftungsfaktoren

Die Interaktion von HIV mit zellulären Rezeptoren ist für den infektiösen Eintritt essentiell, wobei

die Dichte der Rezeptoren auf der Oberfläche der Zielzellen die Effizienz des Viruseintritts

wesentlich bestimmt (Platt et al., 1998). Im Gegensatz zu Rezeptoren sind sogenannte

Anheftungsfaktoren für den Eintritt des Virus in die Zielzelle nicht erforderlich, sie können

jedoch die Infektion permissiver Zellen massiv verstärken (Geijtenbeek et al., 2000c). Die

infektionsverstärkende Wirkung von Anheftungsfaktoren wie dem Lektin DC-SIGN (Abb. 4) ist

häufig auf die Anreicherung von Viren auf der Oberfläche von Zielzellen zurückzuführen,

wodurch die folgende Bindung an Rezeptoren erleichtert wird. Zudem können Zell-assoziierte

Viruspartikel ihre Infektiosität im Regelfall länger beibehalten als freie Viren, die häufig eine

Halbwertszeit im Stundenbereich aufweisen (Olinger et al., 2000; Jakubik et al., 2000). Zelluläre

Anheftungsfaktoren können sowohl an ein virales Hüllprotein binden, als auch an einen

zellulären Faktor, der in die Virushüllmembran eingelagert ist (Tardif and Tremblay, 2003; Tardif

and Tremblay, 2005; Thibault et al., 2007). So verstärkt z.B. der Einbau von ICAM-1 die HIV-

10

Einleitung

Infektion durch Interaktion mit dem natürlichen Liganden LFA-1 auf CD4-positiven Zellen (Fortin

et al., 1997).

Mehrere HIV-Anheftungsfaktoren gehören zur Familie der Kalzium-abhängigen zellulären

Lektine, wie DC-SIGN (dendritic cell specific ICAM-3 grabbing non-integrin (CD209)) und das

DC-SIGN-verwandte Protein DC-SIGNR (zusammen DC-SIGN/R) (Bashirova et al., 2001;

Pohlmann et al., 2001a; Pohlmann et al., 2001c; Simmons et al., 2003), der Mannose-Rezeptor

(Turville et al., 2001) und Langerin (de Witte et al., 2007b; Turville et al., 2003). Diese Lektine

erkennen Mannose-reiche Glykane im viralen Hüllprotein und benötigen Kalzium-Ionen für ihre

strukturelle Integrität. DC-SIGN/R verstärken sowohl die Infektion der DC-SIGN/R-

exprimierenden Zellen (Infektion in cis), als auch den infektiösen Eintritt in benachbarte

Rezeptor-exprimierende Zellen (Infektion in trans) (Geijtenbeek et al., 2000c) (Abb. 4). Es

wurde postuliert, dass DC-SIGN-positive dendritische Zellen bei der sexuellen Übertragung von

HIV eine wichtige Rolle spielen (Piguet and Sattentau, 2004; Geijtenbeek et al., 2000c), dies ist

jedoch umstritten (Burleigh et al., 2006; Nobile et al., 2005; Turville et al., 2004). Der Mannose-

Rezeptor verstärkt den Eintritt von HIV in Makrophagen (Liu et al., 2004), während Langerin,

welches spezifisch auf Langerhans Zellen exprimiert wird, die Aufnahme und den intrazellulären

Abbau von HIV vermittelt (de Witte et al., 2007b). Langerin bzw. Langerhans Zellen könnten

daher eine natürliche Barriere gegen sexuell übertragene HI-Viren darstellen. Weitere zelluläre

Anheftungsfaktoren, die mit dem HIV-Hüllprotein gp120 interagieren sind Heparansulfat-

Proteoglykane wie z.B. Syndekan-3 (Ugolini et al., 1999; de Witte et al., 2007a), Heparin

(Harrop and Rider, 1998) und Galactosylceramide (Harouse et al., 1991).

A) B)

Dendritische Zelle

DC-SIGN

HIV-1CD4-Rezeptor

Chemokinrezeptor

ICAM-3 T-Zelle

Infektion in trans

Dendritische Zelle

DC-SIGN

HIV-1CD4-Rezeptor

Chemokinrezeptor

ICAM-3 T-Zelle

DC-SIGN

HIV-1CD4-Rezeptor

Chemokinrezeptor

ICAM-3 T-Zelle

CD4-Rezeptor

Chemokinrezeptor

ICAM-3 T-Zelle

Infektion in trans

CD4-Rezeptor Chemokinrezeptor

DC-SIGN

HIV-1

Makrophagen

Infektion in cisCD4-Rezeptor Chemokinrezeptor

DC-SIGN

HIV-1

Makrophagen

CD4-Rezeptor Chemokinrezeptor

DC-SIGN

HIV-1

Makrophagen

Infektion in cis

Abbildung 4: Infektion von HIV-1-permissiven Zellen in trans und cis

DC-SIGN wird unter anderem auf dendritischen Zellen und Makrophagen exprimiert und vermittelt die HIV-1-Infektion in trans und cis. (A) Infektion in trans: Die Bindung von HIV-1 an DC-SIGN-exprimierende Zellen ermöglicht die Übertragung der HI-Viren an benachbarte Rezeptor-positive T-Zellen. Der natürliche DC-SIGN Ligand ICAM-3 wird ebenfalls auf T-Zellen exprimiert; die Bindung von DC-SIGN an ICAM-3 ist für die T-Zellaktivierung wichtig. (B) Infektion in cis: Die Bindung von HIV-1 an DC-SIGN auf Rezeptor-exprimierenden Zellen bewirkt eine Verstärkung der Infektion durch mögliche Ankonzentrierung der viralen Partikel auf der Zelloberfläche.

(Adaptiert und modifiziert aus Soilleux & Coleman, 2003)

11

Einleitung

Die Bedeutung von DC-SIGN bei der HIV-Infektion

Das Ca2+-abhängige Lektin DC-SIGN wurde in plazentalem Gewebe (Curtis et al., 1992), auf

submukosalen dendritischen Zellen des Anogenitaltraktes (Geijtenbeek et al., 2000d) sowie auf

Makrophagen in Lymphknoten (Granelli-Piperno et al., 2005), Hofbauer-Zellen in der Plazenta

(Soilleux et al., 2001) und auf bestimmten B-Zellen (He et al., 2006; Rappocciolo et al., 2006b)

nachgewiesen.

Wiederholungsdomänebestehend aus7,5 Wiederholungseinheiten

Lektinbindungsdomäne(carbohydrate recognition domain CRD)

zytoplasmatische Domänemit Di-Leucin- (LL) undtyrosinbasiertem (YXXL)-Motiv

Bindung an Karbohydratstrukturen auf HIV, SARS, Ebola bzw. ICAM-2, ICAM-3

Tetramerisierung

Internalisierung

Transmembrandomäne

Wiederholungsdomänebestehend aus7,5 Wiederholungseinheiten

Lektinbindungsdomäne(carbohydrate recognition domain CRD)

zytoplasmatische Domänemit Di-Leucin- (LL) undtyrosinbasiertem (YXXL)-Motiv


Tetramerisierung

Internalisierung


Tetramerisierung

Internalisierung

Transmembrandomäne

Abbildung 5: Domänenstruktur von DC-SIGN

(Adaptiert aus: Wu und KewalRamanio, 2006)

DC-SIGN ist ein Typ-II Transmembranprotein, welches in vier Domänen untergliedert wird: eine

N-terminale zytoplasmatische Domäne, eine Transmembrandomäne, gefolgt von 7,5

Wiederholungen einer 23 Aminosäuren umfassenden Sequenz, an die sich die

carboxyterminale Karbohydraterkennungsdomäne (carbohydrate recognition domain, CRD)

anschließt (Abb. 5). Die zytoplasmatische Domäne enthält ein Di-Leucin-(LL)- und ein

tyrosinbasiertes (YXXL)-Motiv, wobei ersteres für die Internalisierung des Rezeptors nach

Ligandenbindung wichtig ist (Mellman, 1996; Wu and KewalRamani, 2006; Trowbridge et al.,

1993). Die Tetramerisierung des DC-SIGN-Proteins, die durch die Wiederholungssequenz

vermittelt wird, ist für die effiziente Erkennung von Liganden essentiell (Drickamer, 1999;

Serrano-Gomez et al., 2008). Für die strukturelle Integrität der CRD und die Bindung an

Liganden ist Kalzium notwendig. Die CRD erkennt mannosehaltige Karbohydrate und

endständige Fukosereste (Feinberg et al., 2001), letztere sind z.B. in LewisX-Blutgruppenzucker

enthalten (van Liempt et al., 2004). DC-SIGN bindet an die körpereigenen Liganden ICAM-2,

ICAM-3 (Geijtenbeek et al., 2000a; Geijtenbeek et al., 2000d), MAC-1 (Makrophagen-1

Antigen), CEACAM1 (CEA Zelladhäsionsmolekül 1) (Bogoevska et al., 2006; van Gisbergen et

al., 2005a; van Gisbergen et al., 2005b) und das B7-homologe Protein Butyrophilin (BTN2A1),

welches kürzlich als neuer DC-SIGN-Ligand identifiziert wurde (Malcherek et al., 2007).

12

Einleitung

Lösliches HIV-1-gp120 Hüllprotein blockiert die Bindung von BTN2A1 an DC-SIGN, was zu der

Annahme führt, dass die DC-SIGN-gp120-Bindesstelle mit der DC-SIGN-BTN2A1-Bindestelle

überlappt. Rekombinantes BTN2A1 könnte daher die Trans-Infektion von HIV-1 durch

dendritische Zellen inhibieren (Malcherek et al., 2007). Die Interaktion von DC-SIGN auf

dendritischen Zellen mit ICAM-3 auf T-Zellen ist für die Ausbildung einer immunologischen

Synapse und die effiziente T-Zell-Aktivierung notwendig (Geijtenbeek et al., 2000d). Die

Bindung von DC-SIGN an MAC-1 und CEACAM1 auf neutrophilen Granulozyten bewirkt eine

Aktivierung der T-Zellproliferation (van Gisbergen et al., 2005a).

Neben den körpereigenen Liganden erkennt DC-SIGN Karbohydratstrukturen auf der

Oberfläche verschiedener Viren wie z.B. HIV-1/2, SIV (Pohlmann et al., 2001b), Ebola-Virus

(Alvarez et al., 2002; Baribaud et al., 2002; Simmons et al., 2003), Hepatitis C-Virus (Lozach et

al., 2003; Lozach et al., 2004; Ludwig et al., 2004; Pohlmann et al., 2003; Wang et al., 2004),

Kaposi-Sarkom-assoziiertes humanes Herpesvirus 8 (HHV-8) (Rappocciolo et al., 2006a;

Rappocciolo et al., 2008), humanes Cytomegalovirus (hCMV) (Halary et al., 2002), Denguevirus

(Tassaneetrithep et al., 2003) und Masernvirus (de Witte et al., 2006). Für die meisten Viren

fungiert DC-SIGN als Anheftungsfaktor, der die virale Infektiosität erhöht. In einigen Fällen

wurde auch eine Rezeptorfunktion von DC-SIGN beschrieben; beispielsweise scheint die DC-

SIGN-Expression ausreichend zu sein, um den Eintritt von Alphaviren in Zielzellen zu vermitteln

(Klimstra et al., 2003). So konnte kürzlich gezeigt werden, dass eine Variante des Sindbis-

Glykoproteins, die effizient an DC-SIGN nicht jedoch an Heparansulfate bindet, spezifisch den

infektiösen Eintritt in DC-SIGN-positive dendritische Zellen vermittelt – eine besonders für

gentherapeutische Ansätze wichtige Beobachtung (Yang et al., 2008).

Die Relevanz der DC-SIGN-Bindung für die virale Ausbreitung ist in vielen Fällen noch unklar.

Die Beobachtung, dass ein Polymorphismus im DC-SIGN-Promotorbereich das Risiko an

Dengue-Fieber zu erkranken wesentlich beeinflusst, zeigt jedoch, dass DC-SIGN eine wichtige

Rolle in der Virus-Ausbreitung spielen kann (Sakuntabhai et al., 2005). Eine Interaktion von DC-

SIGN mit verschiedenen nicht-viralen Pathogenen konnte ebenfalls beobachtet werden, wie

z.B. mit Mycobacterium tuberculosis (Van Kooyk et al., 2003), Helicobacter pylori (Bergman et

al., 2004) und Streptococcus pneumoniae (Koppel et al., 2005), und auch hier wird eine

Verstärkung der Pathogen-Ausbreitung durch DC-SIGN-Bindung vermutet.

Das Lektin DC-SIGN wurde initial als ein HIV-1-gp120 Interaktionspartner in plazentalem

Gewebe beschrieben (Curtis et al., 1992). DC-SIGN bindet mit hoher Affinität an HIV-gp120 und

verstärkt die HIV-Infektion von CD4-positiven Zellen in trans und in cis (Geijtenbeek et al.,

2000c). Es wurde initial postuliert, dass DC-SIGN bei der sexuellen Transmission von HIV-1

eine wesentliche Rolle spielt (Geijtenbeek et al., 2000). So nahm man an, dass sexuell

übertragene Viren lokal die mukosale Barriere überwinden und anschließend durch

13

Einleitung

submukosale dendritische Zellen via DC-SIGN gebunden werden. Da dokumentiert wurde, dass

die Bindung von HIV-1 an DC-SIGN-exprimierende Zelllinien die virale Infektiosität über

mehrere Tage konserviert, wurde vermutet, dass HIV-beladene Zellen in lymphoides Gewebe

einwandern und dort infektiöse Viren, möglicherweise DC-SIGN-abhängig, an T-Zellen

übertragen können (Gejtenbeek et al., 2000). Träfe dieses Modell zu, würde HIV-1 die Fähigkeit

von dendritischen Zellen Antigene aufzunehmen, in lymphoides Gewebe einzuwandern, und

dort das Antigen an T-Zellen zu präsentieren ausnutzen, um die effiziente Disseminierung in

infizierten Personen zu gewährleisten.

Neuere Arbeiten stellen jedoch wichtige Aspekte dieses Modells in Frage. So ergaben sich

Hinweise darauf, dass nur etwa die Hälfte der HIV-Bindungsaktivität von dendritischen Zellen,

die aus Monozyten generiert wurden, auf die DC-SIGN-Funktion zurückführen ist (Granelli-

Piperno et al., 2005), bzw. dass DC-SIGN für diesen Prozess verzichtbar ist (Granelli-Piperno et

al., 2005; Wu et al., 2002a; Baribaud et al., 2002; Gummuluru et al., 2003; Wu et al., 2002b). In

der Tat konnte demonstriert werden, dass unterschiedliche dendritische Zellen über

unterschiedliche Mechanismen an HIV binden, und dass neben DC-SIGN weitere Lektine die

HIV-Anheftung fördern können (Turville et al., 2002; Wu et al., 2002a). Weiterhin wurde gezeigt,

dass die Internalisierung für die DC-SIGN-abhängige HIV-1-Trans-Infektion verzichtbar ist und

dass die Konservierung der HIV-1-Infektiosität durch DC-SIGN-positive Zelllinien und

dendritische Zellen auf die produktive Infektion dieser Zellen zurückzuführen ist (Burleigh et al.,

2006; Nobile et al., 2005; Turville et al., 2004). Schließlich wurde postuliert, dass es sich bei

DC-SIGN-positiven Zellen in lymphatischem Gewebe nicht wie ursprünglich angenommen um

dendritische Zellen, sondern um Makrophagen handelt (Granelli-Piperno et al., 2005; Krutzik et

al., 2005) und dass DC-SIGN nur relativ ineffizient mit ICAM-3 interagiert (Snyder et al., 2005).

Es konnte außerdem gezeigt werden, dass dendritische Zellen für HIV-Infektionen permissiv

sind, und dass die produktive Infektion dieser Zellen, und nicht die DC-SIGN-vermittelte

Internalisierung für die Verbreitung der Viren im Organismus verantwortlich ist (Burleigh et al.,

2006; Kwon et al., 2002; Turville et al., 2002).

Die oben diskutierten Arbeiten stellen in Frage, ob die HIV-1-Trans-Infektion durch DC-SIGN-

positive dendritische Zellen die HIV-Disseminierung befördert. Eine aktuelle Studie zeigt, dass

die Bindung von HIV an DC-SIGN auf dendritischen Zellen die virale Ausbreitung in der Tat

verstärken könnte, allerdings über einen indirekten Mechanismus. Es wurde berichtet, dass die

Interaktion von HI-Viren mit DC-SIGN auf dendritischen Zellen eine Phosphorylierung von

LARG (leukemia-associated Rho guanine nucleotide exchange factor) und eine Aktivierung von

Rho auslöst, die zusammen einen LARG-Rho-Komplex ausbilden. Dieser Komplex reagiert mit

DC-SIGN an der Zellmembran und induziert eine Signaltransduktion, die zu einer aberranten

Reifung von dendritischen Zellen führt (Cunningham et al., 2007; Hodges et al., 2007).

Entsprechende dendritische Zellen fördern die Trans-Infektion von HIV-1, jedoch nicht den

14

Einleitung

Aufbau einer Immunantwort (Hodges et al., 2007). Diese Daten ergänzen eine zuvor publizierte

Studie, die zeigt, dass DC-SIGN zur Ausbildung infektiöser Synapsen beiträgt (Arrighi et al.,

2004; McDonald et al., 2003).

Zusammenfassend demonstrieren diese Arbeiten, dass DC-SIGN die HIV-Ausbreitung über

unterschiedliche Mechanismen beeinflussen kann; es sind jedoch weitere Analysen notwendig,

um den Beitrag von DC-SIGN zur HIV-Vermehrung in vivo zu definieren. Interessanterweise

modulieren Polymorphismen im DC-SIGN-Promotor das Risiko einer HIV-Infektion nach

parenteraler, jedoch nicht nach sexueller Übertragung (Martin et al., 2004). Möglicherweise hat

daher DC-SIGN auf dendritischen Zellen in Schleimhäuten keinen wesentlichen Einfluss auf die

Effizienz der sexuellen HIV-Übertragung, während bis dato unidentifizierte DC-SIGN-positive

Zellen die Ausbreitung von Viren fördern könnten, die direkt in den Blutstrom übertragen

werden.

15

Ziel der Arbeit

C) Ziel der Arbeit

Zelluläre Anheftungsfaktoren, wie das auf dendritischen Zellen exprimierte Lektin DC-SIGN,

können die HIV-Infektion von benachbarten CD4-positiven T-Zellen (HIV-Infektion in trans)

katalysieren. Es wurde postuliert, dass DC-SIGN-positive dendritische Zellen, die unterhalb der

anogenitalen Schleimhäute lokalisiert sind, die sexuelle Übertragung von HIV fördern

(Geijtenbeek et al., 2000c). Neuere Publikationen zeigen jedoch, dass dendritische Zellen auch

unabhängig von CD4 und DC-SIGN mit HIV interagieren (Turville et al., 2002; Wu and

KewalRamani, 2006) und dass DC-SIGN-Polymorphismen das Risiko einer parenteral

erworbenen, nicht jedoch einer sexuell erworbenen HIV-Infektion beeinflussen (Martin et al.,

2004). Darüber hinaus gibt es Hinweise darauf, dass auch verschiedene CD4-negative Zellen

wie Thrombozyten und Erythrozyten, die mit HI-Viren in Kontakt kommen, an HIV binden und

die Trans-Infektion vermitteln können (Olinger et al., 2000). Diese Beobachtungen deuten

darauf hin, dass neben DC-SIGN weitere zelluläre Faktoren die Anheftung von HIV vermitteln

können und dass neben dendritischen Zellen weitere für eine HIV-Infektion relevante Zellen

DC-SIGN exprimieren. Im Rahmen dieser Arbeit sollten daher neue HIV-Anheftungsfaktoren

bzw. DC-SIGN-positive Zellen identifiziert und deren Beitrag zur HIV-Ausbreitung untersucht

werden.

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Material und Methoden

17

D) Material und Methoden

1. Material

1.1 Standardreagenzien und Chemikalien

Acrylamid/Bisacrylamid AppliChem, Darmstadt Agarose Serva, Heidelberg Alkalische Phosphatase (CIP) Roche Diagnostics, Mannheim Ammoniumpersulfat (APS) Invitrogen, San Diego, USA β -Mercaptoethanol (β-ME) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Bromphenolblau Serva, Heidelberg Desoxyribonukleosidtriphosphat (dNTP) Roche Diagnostics, Mannheim Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostics, Mannheim Doxycyclin Sigma-Aldrich, Taufkirchen Essigsäure Sigma-Aldrich, Taufkirche Ethidiumbromid (EtBr) Fluka, Buchs, Schweiz Ethylendiamintetraacetat (EDTA) AppliChem, Darmstadt Fötales Kälberserum (FKS) PAN Biotech, Aidenbach Lipofectamine 2000 TM Invitrogen, San Diego, USA Luziferase Kit Promega, MA, USA Magermilchpulver Saliter, Obergünzburg Methanol Sigma-Aldrich, Taufkirchen Nitrocellulose-Membran Schleicher und Schüll, Dassel N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Paraformaldehyd (PFA) Roth, Karlsruhe Phytohämagglutinin (PHA) Murex, Dartford, UK Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Roth, Karlsruhe Triton X-100 Roche, Diagnostics, Mannheim Tween 20 Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Antibiotika Ampicillin Gerbu Biotechnik, Gailberg Gentamycin Serva, Heidelberg Kanamycin Merck, Darmstadt Penicillin Sigma-Aldrich, Taufkirchen Streptomycin Sigma-Aldrich, Taufkirchen Puromycin Sigma-Aldrich, Taufkirchen Blasticidin Invitrogen, San Diego, USA Zeocin Invitrogen, San Diego, USA


1.2. Medien, Lösungen und Enzyme

1.2.1 Zellkulturmedien

Dulbecco’s modified Eagle Medium (DMEM): Dieses Medium enthielt 350 µg/ml L-Glutamin und wurde von der Firma PAA Laboratories GmbH (Pasching, Österreich) bezogen.

Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium: Dieses Medium enthielt 350 µg/ml L-Glutamin und wurde von der Firma PAA Laboratories GmbH (Pasching, Österreich) bezogen.

Trypsin / EDTA: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,56 mM Na2HPO4, 5 mM D(+)-Glucose, 25 mM Tris/HCl, 0,01% EDTA in 0,25%-iger Trypsin-Lösung, pH 7,0.

1.2.2 Bakterienkulturmedien

Luria-Bertani-Medium (LB-Medium): 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 8 g/l NaCl, 1 g/l Glucose. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,2 eingestellt, anschließend wurde die Lösung autoklaviert.

Luria-Bertani-Platten (LB-Platten): 15 g Agar wurden in 1 Liter LB-Medium gelöst und autoklaviert. Nach dem Abkühlen auf 55°C wurden 50 µg/ml Ampicillin bzw. 20 µg/ml Kanamycin zugegeben

SOC-Medium: 20 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 2,5 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 20 mM Glucose in H2O. Diese Lösung wurde sterilfiltriert.

1.2.3 Lösungen und Puffer

PBS o. (phosphate buffered saline, ohne CaCl2 und MgCl2): 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 6,5 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4.

TNE-Puffer: 0,01 M Tris-HCl pH 7,4, 0,15 M NaCl, 2 mM EDTA.

Lösungen für DNA-Methoden

1x TAE-Puffer: 24,2 g Tris, 1,7 g EDTA und 5,7 ml Eisessig ad 5 l H2O.

6x DNA-Auftragepuffer: 30% Glycerin, 0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylencyanol.

Lösungen für Western Blot-Analysen

10x SDS-PAGE-Puffer: 286 g Glycin, 60,6 g Tris und 20 g SDS in 2 l H2O.

Blotpuffer: 15,1 g Tris, 75 g Glycin und 1 l Ethanol ad 5 l H2O. 4x SDS-Auftragepuffer: 125 mM Tris/HCl pH 6,8, 2 mM EDTA, 20% Glycerin, 4% SDS, 10% β-Mercaptoethanol, 0,01% Bromphenolblau.

Lösungen für die Transfektion eukaryoter Zellen

2x HBS: 16,4 g NaCl, 11,9 g HEPES, 0,21 g Na2HPO4 in 1 l H2O. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,04 - 7,13 eingestellt. Anschließend wurde die Lösung sterilfiltriert. 2,5M CaCl2: 111 g CaCl2 ad 1 l H2O

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Lösungen für FACS-Analysen

FACS-Puffer: 5% FKS und 0,01% NaN3 in PBS o.

Lösungen zur Herstellung kompetenter E. coli Bakterien nach der RbCl-Methode

TFB1-Lösung: 30 mM Kaliumacetat, 10 mM CaCl2, 50 mM MnCl2, 100 mM RbCl, 15% Glycerin. Der pH-Wert wurde mit Essigsäure auf 5,8 eingestellt und die Lösung sterilfiltriert.

TFB2-Lösung: 100 mM MOPS, 75 mM CaCl2, 10 mM RbCl, 15% Glycerin. Der pH-Wert wurde mit KOH auf 6,5 eingestellt und die Lösung sterilfiltriert.

1.2.4 Enzyme

Die Restriktionsenzyme der Firmen New England Biolabs (NEB, Schwalbach), Gibco-BRL

(Karlsruhe), Boehringer (Mannheim) und Fermentas (St. Leon-Rot) wurden gemäß

Herstellerangaben eingesetzt.

1.3 Biologisches Material

1.3.1 Bakterien

Escherichia coli DH10B: F F- endA1 hsdR17 (rk-, mk

+) supE44 thi-1 λ- recA1 gyrA96 relA1 deoRΔ (lacZYA-argF)-U169 (φ80lacΔM15) (Grant et al., 1990)

1.3.2 Eukaryote Zellen

1.3.2.1 Primäre Zellen

PBMC: humane periphere mononukleäre Blutzellen (peripheral blood mononuclear cells), isoliert aus Buffy Coat oder aus humanem Vollblut durch Ficoll-Trennung.

MDDC: humane unreife, aus Monozyten generierte dendritische Zellen (immature monocyte-derived dendtritic cells, MDDC); hergestellt aus Monozyten durch Stimulation mit GM-CSF und IL-4 (Prechtel et al., 2005).

Thrombozyten: humane Thrombozyten wurden aus Buffy Coat oder aus humanem Vollblut gewonnen. Thrombozyten-Konzentrate wurden von der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung des Universitätsklinikums Erlangen bezogen.

1.3.2.2 Zelllinien

Adhärente Zelllinien

293T: humane embryonale Nierenepithelzellen, die durch die Gene E1a und E1b des Adenovirus Typ 5 transformiert wurden und zusätzlich das Wildtyp T-Antigen des SV40-Virus exprimieren (Pear et al., 1993).


293 T-REx: humane 293 Nierenepithelzelllinie mit stabiler Expression des Tet-Repressors. T-REx-Zellen ermöglichen die Doxycyclin-induzierte Expression von Fremdgenen (Invitrogen, San Diego, USA).

GP2-293: pantropische retrovirale Verpackungszelllinie auf Grundlage der 293 Zellen, exprimieren stabil das Gag- und Pol-Protein des Maus-Leukämie-Virus (MLV) (Clontech, Heidelberg).

HeLa: humane Cervix-Karzinom-Zelllinie, HPV18-positiv (Nelson-Rees and Flandermeyer, 1976)

Huh-7: humane Leberkarzinomzelllinie (Nakabayashi et al., 1982).

HFF: humane Vorhaut-Fibroblasten

Cos-7: Nierenepithelzelllinie aus afrikanischen grünen Meerkatzen

Vero: Affennierenzellen aus afrikanischen grünen Meerkatzen

Hep-2: Pharynxkarzinomzellen

HOS: humane Osteoblastenzelllinie

MRC-5: humane embryonale Fibroblastenzelllinie

U373: humane Astrocyten

Suspensionszellen

CEMx174 R5: Hybridzelllinie aus humanen B- und T-Lymphoblasten; exprimiert neben CD4 und CXCR4 auch den Chemokinrezeptor CCR5. Des Weiteren enthalten die Zellen die Reportergene GFP bzw. Luziferase jeweils unter der Kontrolle des HIV-1-Promotors (Hsu et al., 2003).

B-THP (Raji): EBV-transformierte humane Burkitt-Lymphom-Zelllinien (Wu et al., 2004).

Ramos: humane EBV-negative Burkitt-Lymphom-Zelllinie (Wu et al., 2004).

NC-37: EBV-transformierte humane Burkitt-Lymphom-Zelllinie; genetisch verschieden zu B-THP und Raji (Wu et al., 2004).

Sup-T1: humane non-Hodgkin’s T-Lymphoblast Tumorzelllinie (Smith et al., 1984).

DAMI: humane megakaryozytische Leukämiezelllinie (Greenberg et al., 1988)

HEL: humane erythroide Leukämiezelllinie

K-562: humane CML (chronisch myeloide Leukämie) Zelllinie (Lozzio and Lozzio, 1979)

1.3.3 HIV-1-Virusisolate

NL4-3: X4-troper Laborstamm

92/HT/596: X4, R5-tropes HIV-1-Primärisolat, bezogen vom NIH AIDS Research & Reference Reagent Program, Germantown, USA.

92/BR/020: R5-tropes HIV-1-Primärisolat, Subtyp B, bezogen vom NIH AIDS Research & Reference Reagent Program, Germantown, USA.

93/BR/020: R5-tropes HIV-1-Primärisolat, Subtyp F, NIH AIDS Research & Reference Reagent Program, Germantown, USA.

20


21

1.3.4 Antikörper und Antiseren

1.3.4.1 Monoklonale Antikörper

Soweit nicht anders beschrieben wurden die Antikörper in den Konzentrationen 1 µg/ml in

Western Blot-Analysen und 10 µg/ml in FACS-Analysen bzw. in Inhibitionsstudien eingesetzt.

anti-DC-SIGN (DCN46): monoklonaler Mausantikörper, spezifisch für die Wiederholungsregion des humanen DC-SIGN-Moleküls (Geijtenbeek et al., 2000c; Geijtenbeek et al., 2000d) (BD Biosciences, San Diego, USA).

anti-DC-SIGN (507): monoklonaler Mausantikörper, erkennt die Lektin-Domäne des humanen DC-SIGN-Moleküls (Jameson et al., 2002) (BD Biosciences, San Diego, USA).

anti-DC-SIGN (526): monoklonaler Mausantikörper, reaktiv gegen die Lektin-Domäne der humanen DC-SIGN/R-Moleküle (Jameson et al., 2002).

anti-DC-SIGNR (604): monoklonaler Mausantikörper, erkennt die Lektin-Domäne des humanen DC-SIGNR-Moleküls (Jameson et al., 2002).

anti-AU1: monoklonaler Mausantikörper, reaktiv gegen das AU1-Epitop N-Asp-Thr-Tyr-Arg-Tyr-Ile-C (Covance, USA).

anti-human-Podoplanin (NZ-1): monoklonaler Rattenantikörper, erkennt das humane Podoplanin (IgG2a) (Aris Antibodies GmbH, Herford) anti-human-Podoplanin (18H5): monoklonaler Mausantikörper, erkennt das humane Podoplanin (IgG1) (Acris Antibodies GmbH, Herford)

CD61-FITC gekoppelt: selektiver Marker für Thrombozyten und Megakaryozyten (Dako Deutschland GmbH, Hamburg) anti-β-Aktin: monoklonaler Mausantikörper (Sigma-Aldrich, Taufkirchen)

2G12: monoklonaler humaner Antikörper, reaktiv gegen HIV-1-gp120 (Trkola et al., 1996b); bezogen vom NIH AIDS Research & Reference Reagent Program, Germantown, USA.

mAK-13B10/mAK-13H11: monoklonale Mausantikörper, reaktiv gegen das humane CLEC-2-Protein (J.Hoxie)

1.3.4.2 Polyklonale Antikörper

anti-human CLEC-2: polyklonaler Ziegenantikörper, erkennt spezifisch die extrazelluläre C-terminale Domäne des CLEC-2-Moleküls (R&D Systems Inc., USA)

1.3.4.3 Sekundärantikörper

anti-Maus-IgG (H+L) aus Ziege, Meerrettichperoxidase (HRP)-, PE-, Cy5-, Alexa Fluor 647- oder FITC- konjugiert. (Dianova, Hamburg)

anti-Kaninchen-IgG (H+L) aus Ziege, mit HRP gekoppelt. (Dianova, Hamburg)

anti-Mensch-IgG (H+L) aus Ziege, HRP- oder Cy5-konjugiert. (Dianova, Hamburg)

anti-Ratte-IgG (H+L) aus Ziege, Cy5-konjugiert (Dianova, Hamburg)


1.4. Nukleinsäuren

1.4.1 Oligonukleotide

Oligonukleotide wurden von der Firma Biomers (Ulm) bezogen. Die Sequenzen sind von 5´nach

3´notiert. Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen sind hervorgehoben.

Oligonukleotide für die Herstellung von siRNAs

Oligonukleotide, die für siRNAs gegen Podoplanin kodieren und über BamHI und EcoRI

Schnittstellen in den pSIREN-EGFP-RetroQ Vektor ligiert wurden:

Oligonukleotide Sequenz

pSIREN-EGFP-Nonsense_siRNA_forward 5’GATCCCGACTACCGTTGTATAGGTGTTCAAGAGACACCTATACAACGGTAGTTTTTTTG3’

pSIREN-EGFP-Nonsense_siRNA_reverse 5’AATTCAAAAAAACTACCGTTGTATAGGTGTCTCTTGAACACCTATACAACGGTAGTCGG3’

pSIREN-EGFP-siPodoplanin137_forward 5’GATCCGCGAAGATGATGTGGTGACTTTCAAGAGAAGTCACCACATCATCTTCGTTTTTTACGCGTG3’

pSIREN-EGFP-siPodoplanin137_reverse 5’AATTCACGCGTAAAAAACGAAGATGATGTGGTGACTTCTCTTGAAAGTCACCACATCATCTTCGCG3’

pSIREN-EGFP-siPodoplanin167_forward 5’GATCCGCGAAGACCGCTATAAGTCTTTCAAGAGAAGACTTATAGCGGTCTTCGTTTTTTACGCGTG3’

pSIREN-EGFP-siPodoplanin167_reverse 5’AATTCACGCGTAAAAAACGAAGACCGCTATAAGTCTTCTCTTGAAAGACTTATAGCGGTCTTCGCG3’

pSIREN-EGFP-siPodoplanin351_forward 5’GATCCGCAGACAACAGTTGAGAAAGTTCAAGAGACTTTCTCAACTGTTGTCTGTTTTTTACGCGTG3’

pSIREN-EGFP-siPodoplanin351_reverse 5’AATTCACGCGTAAAAAACAGACAACAGTTGAGAAAGTCTCTTGAACTTTCTCAACTGTTGTCTGCG3’

pSIREN-EGFP-siPodoplanin220_forward 5’GATCCGTGTAACAGGCATTCGCATTTCAAGAGAATGCGAATGCCTGTTACACTTTTTTACGCGTG3’

pSIREN-EGFP-siPodoplanin220_reverse 5’AATTCACGCGTAAAAAAGTGTAACAGGCATTCGCATTCTCTTGAAATGCGAATGCCTGTTACACG3’

Oligonukleotide für die Herstellung von löslichen Proteinen


solClec-2-Lektin-HindIII 5’-GTACGAAGCTTTGCAGCCCCTGTGACACAAAC-3’

solClec-2-Lektin-BamHI 5’-GAGTGGATCCAGGTAGTTGGTCCACCTTGG-3’

solClec-2-Neck-Lektin-XhoI 5’-GTAAATCTCGAGGAGGGGGACAGCGCAATTACCTACAAG-3’

solClec-2-Neck-Lektin-PmeI 5’-GCGGGTTTAAACTCATTAAGGTAGTTGGTCCACCTTG-3’

22


23

Oligonukleotide für die Sequenzierung


5' pAB61-seq 5’-GGCTCTGCACAACCACTACACGC-3’

3’ pAB61-seq 5’-CCACGCATGTGACCTCAGGGGTCCGG-3’

5’ pCAGGS-seq 5’- CAGCTCCTGGGCAACGTGCTGG-3’

3’ pCAGGS-seq 5’- CAGAAGTCAGATGCTCAAGGG-3’

BGH reverse 5’- TAGAAGGCACAGTCGAGG-3’

CMV forward 5’- CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’

T7 5’ -TAATACGACTCACTATAGGG-3’

5’ pSIREN-EGFP-siRNA-forward 5’ - CTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAG-3’

3’ pSIREN-EGFP-siRNA-reverse 5’ - GAGGCCAGAGGCCACTTGTGTAGCGC-3’

1.4.2 Vektorsysteme und Plasmide

pcDNA3.1/Zeo (+): eukaryoter Expressionsvektor mit einer Klonierungsstelle zwischen dem HCMV-Promotor und dem BGH-Polyadenylierungssignal, Ampicillinresistenz und Zeocinresistenz (Invitrogen, San Diego, USA).

pAB61: eukaryoter Expressionsvektor mit einer Klonierungsstelle zwischen dem HCMV-Promotor und dem IgΚ-Fc-myc/his Fusionsprotein, geeignet zur Expression löslicher viraler Glykoproteine als Fusion mit der konstanten Region des Immunoglobulin G (IgG), Ampicillinresistenz (Birkmann et al., 2001).

pCAGGS: eukaryoter Expressionsvektor für die Expression von Zielgenen unter Kontrolle des HCMV-Promotors, die gebildete mRNA enthält ein Intron. Das Plasmid trägt eine Klonierungsstelle und eine Ampicillinresistenz (Niwa et al., 1991).

Zur Verfügung gestellte Plasmide und Reporterkonstrukte

pcDNA3-DC-SIGN-AU1: Plasmid zu Expression von humanem DC-SIGN mit einem C-terminalen AU1-Epitop

pcDNA3-DC-SIGNR-AU1: Plasmid zu Expression von humanem DC-SIGNR mit einem C-terminalen AU1-Epitop

pcDNA3-CLEC-2-AU1: Plasmid zu Expression von humanem CLEC-2 mit einem C-terminalen AU1-Epitop

pcDNA3-VSV-G: Plasmid zur Expression des Glykoproteins des vesikulären Stomatitis-Virus (VSV-G).

pCAGGS-SARS-S: Plasmid zur Expression des Spike-Protein (S) des SARS-CoV.

pEGFP-N1: Plasmid zur Expression von EGFP (enhanced green fluorescence) (Clontech, Heidelberg).

pBRNL4-3 Δnef luc: replikationsfähiges HIV-1 NL4-3 Konstrukt mit Insertion eines Luziferase-Gens anstelle des nef-Gens


pNL4-3 env* nef* luc: replikationsdefektes HIV-1 NL4-3 Konstrukt, enthält die durch Punktmutation inaktivierten Gene env und vpr, exprimiert das Luziferase-Gen unter Kontrolle des viralen LTR-Promotors (Connor et al., 1995).

pSIREN-EGFP-RetroQ: selbst inaktivierender retroviraler Expressionsvektor, exprimiert siRNA unter Verwendung des humanen Pol III U6 Promotors, enthält ein Verpackungssignal φ für den Einbau in retrovirale Partikel, Ampicillin- und Puromycinresistenz. Zusätzlich wird von diesem Vektor EGFP exprimiert, das die Quantifizierung der Transduktionseffizienz erlaubt (Clontech, Heidelberg)

pcDNA3-Podoplanin: Plasmid zur Expression von humanem Podoplanin (Kato et al., 2003)

Konstruierte Plasmide

pAB61 gp120: eukaryotes Expressionsplasmid zur Herstellung von löslichem HIV-1-gp120 (Klon JRFL).

pAB61 CLEC-2 Nr. 1: eukaryotes Expressionsplasmid zur Herstellung von löslichem CLEC-2-Protein, enthält die Neck- und die Lektin-Domäne des CLEC-2-Moleküls, kloniert über PmeI und XhoI in den pAB61 Vektor.

pAB61 CLEC-2 Nr. 2: eukaryotes Expressionsplasmid zur Herstellung von löslichem CLEC-2-2-Protein, enthält die Lektin-Domäne des CLEC-2-Moleküls, kloniert über BamHI und EcoRI in den pAB61 Vektor.

pAB61 DC-SIGN: eukaryotes Expressionsplasmid zur Herstellung von löslichen DC-SIGN, enthält die Lektin-Domäne des DC-SIGN-Moleküls, kloniert über BamHI und EcoRI in den pAB61 Vektor.

pAB-61 DC-SIGNR: eukaryotes Expressionsplasmid zur Herstellung von löslichem DC-SIGNR, kloniert über BamHI und EcoRI in den pAB61 Vektor

pSIREN-EGFP-siPodoplanin137 eukaryotes Expressionsplasmid für eine Expression der siRNA gegen das humane Podoplanin (siRNA beginnt an der Position 137 des humanen Podoplanin-Gens), Ampicillinresistenz

pSIREN-EGFP-siPodoplanin167: eukaryotes Expressionsplasmid für eine Expression der siRNA gegen das humane Podoplanin (siRNA beginnt an der Position 167 des humanen Podoplanin-Gens), Ampicillinresistenz



24


25

2. Methoden

2.1 DNA-Methoden

2.1.1 Standardmethoden:

• Chemische Transformation zum Einbringen von DNA in Bakterien (Sambrook et al., 2002)

• Kleine Plasmidpräparation (Zagursky et al., 1985)

• Große Plasmidpräparation mit dem Maxi-Kit von Quiagen (Hilden) nach den Angaben des Herstellers

• Agarosegelelektrophorese (Sambrook & Russell 2001)

• Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen unter Verwendung des Geneclean II Kit (Qbiogene, Heidelberg) nach Herstellerangaben

• Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Amplifikation von DNA-Fragmenten (Sambrook & Russell 2001)

• Automatische Sequenzierung mit einem ABI-Prism3100-Gerät (Applied Biosystems, Weiterstadt) nach Angaben des Herstellers

2.2 Zellbiologische Methoden

2.2.1 Kultivierung von adhärenten Zellen und Suspensionszellen

Alle eukaryoten Zellen wurden bei 37°C, 7,0% CO2 und 80% relativer Luftfeuchtigkeit kultiviert.

2.2.2 Isolierung von Thrombozyten

Die Isolierung von Thrombozyten aus Vollblut oder aus Buffy Coat wurde folgendermaßen

durchgeführt: Das humane Blut wurde bei 1200 rpm (RT) abzentrifugiert. Die obere Phase mit

dem plättchenreichem Plasma (platelet rich plasma, PRP) wurde vorsichtig abgenommen und

bei 4000 rpm (RT) zentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend verworfen und das

Sediment in PBS o. resuspendiert. Die Thrombozytenzahl wurde abschließend auf 1×106

Zellen/ml eingestellt.

2.2.3 Isolierung von PBMCs aus Buffy Coat mittels Ficoll-Trennung

Zur Isolierung von PBMCs aus Vollblut wurden 15 ml Ficoll-Lösung in sterilen 50 ml Gefäßen

vorgelegt und mit EDTA versetztem Vollblut überschichtet. Dieser Ansatz wurde anschließend

30 min bei 1500 rpm (RT) zentrifugiert, wobei die Bremse der Zentrifuge beim Auslaufen

deaktiviert wurde. Die Ficoll-Schicht lässt die Erythrozytenaggregate und die toten Zellen

passieren, während die Granulozyten in die Ficoll-Lösung eindringen und die Monozyten sowie

Lymphozyten sich in der Interphase ansammeln. Die in der Interphase konzentrierten PBMCs

wurden mit einer 5 ml Pipette vorsichtig abgezogen, anschließend mit PBS o. gewaschen und


in RPMI 1640 mit PHA (5µg/ml) und IL-2 (100 U/ml) resuspendiert. Die so gewonnenen PBMCs

wurden auf eine Zellzahl von 1×106 Zellen/ml eingestellt.

2.2.4 Methoden zur Transfektion eukaryoter Zellen

2.2.4.1 Transfektion mit Kalziumphosphat

Die Transfektion von 293T Zellen und der Verpackungszelllinie GP2-293 erfolgte durch die

Kalziumphosphat-Methode. Dabei wurden die Zellen einen Tag vor der Transfektion in einer T-

25-Zellkulturflasche ausgesät, so dass die Zellen am Tag der Transfektion zu 60% konfluent

waren. Pro Transfektionsansatz wurden 12 µg DNA in 200 µl BiH2O vorgelegt und mit 25 µl

CaCl2 (2,5 M) vermischt. Zu diesem Ansatz wurden anschließend 250 µl HBS Lösung

hinzugegeben und das Gemisch tröpfchenweise auf die Zellen pipettiert. Nach 8-12 h

Inkubation wurde das Transfektionsmedium durch 4 ml frisches Medium ersetzt.

2.2.4.2 Transfektion mit Lipofektamin (Lipofectamine2000TM)

Die Transfektion mit Lipofektamin wurde bei Zelllinien eingesetzt, die durch die

Kalziumphosphat-Methode nicht effizient transfiziert werden konnten. Hierzu wurden die Zellen

zunächst mit Antibiotika-freiem Medium versetzt und nach Angaben des Herstellers (Invitrogen,

Karlsruhe) mit 4 µg DNA transfiziert.

2.2.5 Durchflusszytometrie (fluorescence activated cell sorting, FACS)

Die CLEC-2 Expression sowie die Expression von Podoplanin wurden mittels FACS-Analysen

an einem FACScan-Gerät analysiert. Durch Streulicht werden hierbei zunächst Größe (forward

scatter, FSC) und Granularität (side scatter, SSC) der Zellen im linearen Messbereich, sowie

anschließend die Fluoreszenzintensitäten im logarithmischen Bereich analysiert.

Am FACScan-Gerät wurden pro Ansatz 10.000 Zellen im Gate für lebende Zellen gemessen.

Für die Expressionsanalysen wurden die Zellen mit anti-CLEC-2 oder anti-human Podoplanin

für 45 min auf Eis inkubiert und anschließend gewaschen. Nach erneuter Inkubation auf Eis mit

dem sekundären anti-Maus-Cy5 bzw. anti-Ratte-Cy5 wurden die Zellen gewaschen, in FACS

Puffer aufgenommen und gemessen.

Da Thrombozyten als kleine Zellfragmente nur schwache Signale induzieren, wurde für die

Einstellung von FSC und SSC der logarithmische Modus gewählt.

26


27

2.3 Virologische Methoden

2.3.1 Transduktion von Zellen mit siRNA-exprimierenden Vektoren

Die Produktion von pseudotypisierten Retroviruspartikeln erfolgte mit Hilfe der

Verpackungszelllinie GP2-293, die mit pSIREN-EGFP-RetroQ-siRNA Konstrukten und pVSV-G

nach der Kalziumphosphat-Methode kotransfiziert wurde. Der virale Überstand wurde 48 h nach

Transfektion entnommen, sterilfiltriert (Filter mit 0,45 µm Porengröße) und bei 24.000 rpm bei

4°C für 2 h ultrazentrifugiert. Das Virussediment wurde in 2 ml Medium mit 2 µg/ml Polybren

resuspendiert und auf die zu transduzierenden 293T Zellen gegeben. Nach 24 h wurde das

Medium gewechselt und nach 72 h wurden die transduzierten Zellen auf Puromycin (10 µg/ml)

selektioniert. Transduzierte Zellen exprimierten neben den siRNAs auch das EGFP, die

Transduktionseffizienz wurde daher durch Bestimmung der EGFP-Expression mittels FACS

analysiert.

2.3.2 Herstellung von replikationsfähigen HIV-1 NL4-3 Luc Reporterviren

Für die Herstellung von HIV-1-Reporterviren, welche das Luziferase-Gen anstelle des nef-Gens

tragen, wurden 293T Zellen mit dem Plasmid pBRNL4-3 Δnef luc mit Hilfe der

Kalziumphosphat-Methode transfiziert. Die in dem Zellüberstand enthaltenen Viren wurden 48 h

nach der Transfektion durch einen 0,45 µm Filter filtriert und bei -80°C gelagert. Die

Normalisierung der Viruspräparationen erfolgte durch die Bestimmung des Kapsidprotein (p24)-

Gehalts in den Überständen mit Hilfe eines p24-ELISA (Murex, Abott Diagnostics, USA).

2.3.3 Herstellung von Pseudotypen mit Hilfe eines HIV-1-abgeleiteten Vektors

Zur Herstellung von pseudotypisierten Viren auf HIV-1-Basis wurden 293T Zellen mit dem

Reporterkonstrukt pNL4-3 env* nef* Luc (Connor et al., 1995) und einem Plasmid zur

Expression der entsprechenden viralen Glykoproteine oder mit einem Leervektor (bei Env-

negativen Viren) transient transfiziert. Der Virusüberstand wurde 48 h nach der Transfektion

durch einen 0,45 µm Filter filtriert und bei -80°C gelagert. Die Virus-Präparationen wurden auf

p24-Gehalt oder Luziferase-Aktivität in infizierten 293T Zellen bzw. T-Rex Zellen hin

normalisiert.

2.3.4 Infektionsanalysen

Bestimmung der Cis-Infektion

Für die Bestimmung der Lektin-vermittelten Verstärkung der Infektion wurden 293T Zellen

transient mit verschiedenen Lektin-exprimierenden Plasmiden transfiziert. Alternativ wurden

stabile Lektin-exprimierende B-THP Zellen bzw. T-Rex Zellen verwendet. Hierzu wurden die

Zellen einen Tag vor der Infektion in 100 µl Medium in einer Dichte von 3×104 Zellen/Well


ausgesät. Die Infektion erfolgte mit 50 µl der entsprechenden Viruspräparation. Nach 12 h

wurde das Medium gewechselt. Die Infektiosität wurde 72 h nach der Infektion anhand der

Luziferase-Aktivität in den Zelllysaten unter Verwendung des Luciferase Assay Systems

(Promega, Heidelberg) nach Angaben des Herstellers in einem Orion Microplate Luminometer

(Berthold Detection Systems, Pforzheim) bestimmt.

Bestimmung der Trans-Infektion

Die HIV-Trans-Infektion wurde durch Inkubation von Thrombozyten, Megakaryozyten Zelllinien

bzw. B-THP und T-Rex Zelllinien mit HIV-1 NL4-3 Luc oder primären HIV-1-Isolaten analysiert.

Hierzu wurden 1×105 Thrombozyten bzw. 3×104 B-THP bzw. 293T Zellen mit 5 ng bzw. 10 ng

replikationsfähigem NL4-3 Luc oder primären HIV-1-Isolaten für 3 h bei 37°C inkubiert. Nicht

gebundene Viruspartikel wurden durch Waschen mit PBS o. entfernt und die Transmitterzellen

mit CEMx174 R5 Zielzellen für 72 h kokultiviert. Die Infektion der Zielzellen und somit die

Effizienz der Trans-Infektion wurde anhand der Luziferase-Aktivität der CEMx174 R5 Zellen

unter Verwendung des Luciferase Assay Systems (Promega, Heidelberg) nach Angaben des

Herstellers in einem Orion Microplate Luminometer (Berthold Detection Systems, Pforzheim)

bestimmt.

2.3.5 Bindungsanalysen von viralen Partikeln an zelluläre Anheftungsfaktoren

Die Interaktion von replikationsfähigen NL4-3 Luc-Viren an Thrombozyten und Zelllinien wurde

mittels Bindungsanalysen untersucht. Dazu wurden 3×104 Zellen (Thrombozyten selbe Zahl)

pro Ansatz mit 5 ng bzw. 10 ng HIV NL4-3 Luc für 3 h bei 4°C geschüttelt, anschließend

gewaschen und die Zellen in 50 µl 1% Triton X-100 lysiert. Die Menge an gebundenen Viren

wurde anhand des Kapsid (p24)-Gehalts mittels ELISA bestimmt.

2.4 Proteinmethoden

2.4.1 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese und Western Blot-Analysen

Die Auftrennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen erfolgte durch die SDS-

Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS Page) nach Laemmli (Laemmli, 1970). Dazu wurden die

geernteten Zellen mit PBS o. gewaschen, in 100 µl 2×SDS Auftragepuffer aufgenommen und

bei 95°C für 10 min gekocht. Unter nicht reduzierenden Bedingungen wurden die Proben in 100

µl Lysispuffer (10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 0,5% Triton X-100 und 100 mM

Iodoacetamid (Nagamatsu et al., 1992) aufgenommen, für 2 h auf Eis inkubiert und für 30 min

bei 14000 rpm (4°C) abzentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend in 2×SDS

Auftragepuffer ohne β-Mercaptoethanol aufgenommen. Die elektrophoretische Auftrennung der

Proteine erfolgte im Polyacrylamidgel bei einer Spannung von 60 V für 3 h.

28


29

Die aufgetrennten Proteine wurden durch Elektroblotting (Mini-Trans-Blot, Bio-Rad

Laboratories) bei einer Stromstärke von 200 mA für 1 h auf eine Nitrozellulosemembran

übertragen. Um eine unspezifische Anlagerung von Antikörpern zu verhindern, wurde die

Membran nach dem Transfer in einer Magermilchpulverlösung (5%) über Nacht bei 4°C

geschüttelt. Die Inkubation mit dem in Magermilchpulverlösung verdünnten Primärantikörper

erfolgte 1 h bei RT. Darauf folgten Waschschritte für jeweils 5 min mit PBS o. und anschließend

eine einstündige Inkubation mit einem sekundären HRP-gekoppelten Antikörper. Nach

erneutem Waschen wurde die Nitrozellulosemembran mit 10 ml ECL Lösung A, 3,1 µl H2O2 und

100 µl ECL Lösung B Lösung versetzt. Der Proteinnachweis erfolgte mit Hilfe einer CCD-

Kamera (Fujifilm Luminescent Image Analyzer Las-1000), wobei sich die Expositionszeit nach

der Intensität der Chemilumineszenz richtete.

Ergebnisse

E) Ergebnisse

1. DC-SIGN und CLEC-2 vermitteln die HIV-1-Transmission durch Thrombozyten

(Chaipan C. et al., Journal of Virology, 2006)

1.1 CLEC-2: Ein neuer zellulärer Anheftungsfaktor für HIV-1

Zelluläre Anheftungsfaktoren verstärken die HIV-Infektion von CD4-positiven T-Zellen. Der HIV-

Anheftungsfaktor DC-SIGN wird auf dendritischen Zellen exprimiert und es wurde postuliert,

dass die DC-SIGN-vermittelte Bindung von HIV an submukosale dendritische Zellen die

Ausbreitung von sexuell übertragenem HIV im Wirt fördert (Geijtenbeek et al., 2000c). Es

konnte jedoch gezeigt werden, dass dendritische Zellen HIV auch unabhängig von CD4 und

DC-SIGN binden können (Turville et al., 2002; Wu and KewalRamani, 2006), was auf die

Expression weiterer, bis dato unbekannter Anheftungsfaktoren hindeutet. Zur Identifizierung

neuer HIV-Anheftungsfaktoren wurden die Transmissionseigenschaften verschiedener Lektine

und Lektin-ähnlicher Proteine analysiert. Hierzu wurden die entsprechenden Faktoren transient

in 293T Zellen exprimiert und die Zellen auf die Fähigkeit hin untersucht, die Trans-Infektion von

T-Zellen zu vermitteln (Abb. 6 und Daten nicht gezeigt). Für diese Versuche wurde eine

Variante des molekularen HIV-1-Klons NL4-3 verwendet, bei der das nef-Gen durch das

Luziferase-Gen ersetzt wurde (Connor et al., 1995). Die Infektion von Zielzellen mit diesem

Virus kann durch Messung der Luziferase-Aktivität in Zelllysaten quantifiziert werden. Im

Rahmen dieser Analysen wurde das CLEC-2-Protein als HIV-1-Anheftungsfaktor identifiziert

(Abb. 6). CLEC-2 vermittelte jedoch die HIV-1-Trans-Infektion von CEMx174 R5 Zielzellen mit

geringerer Effizienz als die bereits bekannten HIV-1-bindenden Lektine DC-SIGN und DC-

SIGNR (Abb. 6). Diese Beobachtungen konnten durch analoge Versuche mit stabil CLEC-2-

exprimierenden B-THP-(Raji-B-) Zellen bestätigt werden (Daten nicht gezeigt).

30

Ergebnisse

31

102

103

104

105

106

Kontrolle CLEC-2 DC-SIGN DC-SIGNR

Luzi

fera

se-A

ktiv

ität(

c.p.

s.)

102

103

104

105

106

Kontrolle CLEC-2 DC-SIGN DC-SIGNR

Luzi

fera

se-A

ktiv

ität(

c.p.

s.)

Abbildung 6: CLEC-2 vermittelt die HIV-1-Trans-Infektion

Die aufgeführten Lektine bzw. ein Kontrollvektor wurden transient in 293T Zellen exprimiert und die Zellen mit HIV-1 NL4-3 (10 ng) für 3 h bei 37°C inkubiert, gewaschen und anschließend mit CEMx174 R5 Zielzellen kokultiviert. CEMx174 R5 Zellen exprimieren das Luziferase-Gen unter der Kontrolle des viralen LTR-Promotors, die in diesem System erhaltenen Luziferase-Werte korrelieren mit der Infektionseffizienz. Die Luziferase-Aktivität in Zelllysaten wurde 72 h nach Infektion bestimmt. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment aus insgesamt drei unabhängigen, in Triplikaten durchgeführten Experimenten. (c.p.s.: counts per second)

1.2 Die Interaktion von HIV-1 mit CLEC-2-exprimierenden Zellen ist spezifisch

Die Spezifität der Interaktion von CLEC-2 mit HIV-1 wurde zunächst mit Hilfe stabil transfizierter

B-THP Zellen untersucht. Hierzu wurden DC-SIGN- bzw. CLEC-2-positive Zellen mit einem

CLEC-2-spezifischen Antiserum (R&D Systems, Inc.) bzw. einem Kontrollantikörper gleichen

Isotyps präinkubiert und anschließend mit NL4-3 für 3 h inkubiert. Die ungebundene Viren

wurden durch Waschen entfernt, die Zellen lysiert und die Menge an gebundenem p24-Antigen

mittels ELISA quantifiziert (Abb. 7).

0

5

10

15

20

25

30

DC-SIGN DC-SIGN DC-SIGN

anti CLEC-2

CLEC-2 CLEC-2 CLEC-2 Kontrolle

% G

ebun

dene

sp2

4-A

ntig

en

Lektin:

Inhibitor:- -IgG

KontrolleIgG

Kontrolleanti

CLEC-2-

0

5

10

15

20

25

30

DC-SIGN DC-SIGN DC-SIGN

anti CLEC-2

CLEC-2 CLEC-2 CLEC-2 Kontrolle

% G

ebun

dene

sp2

4-A

ntig

en

Lektin:

Inhibitor:- -IgG

KontrolleIgG

Kontrolleanti

CLEC-2-

Abbildung 7: Spezifische Bindung von HIV-1 NL4-3 an B-THP-CLEC-2 Zellen

B-THP Zelllinien, die die angegebenen Lektine stabil exprimieren, wurden mit den aufgeführten Antikörpern präinkubiert und anschließend mit NL4-3 (5ng) für 3 h bei 37°C inkubiert. Nicht gebundene Viren wurden durch Waschen entfernt, die Zellen lysiert und der Kapsid (p24)-Gehalt in den Zelllysaten mittels p24-ELISA bestimmt. Die Ergebnisse eines repräsentativen, in Triplikaten durchgeführten Experiments sind gezeigt.

Ergebnisse

Es wurde eine robuste Bindung von NL4-3 an DC-SIGN-exprimierende Zellen gemessen

(Bindung von ca. 22% des eingesetzten p24-Antigens), die Bindung an Kontrollzellen war

dagegen ineffizient. CLEC-2-exprimierende B-THP Zellen banden NL4-3 etwa fünf Mal

effizienter als Kontrollzellen, jedoch weniger robust als DC-SIGN-positive Zellen. Die Bindung

von HIV-1 an CLEC-2-positive Zellen war spezifisch, da die Präinkubation der Zellen mit einem

gegen CLEC-2 gerichteten Serum die Bindung von HIV-1 an CLEC-2-positive Zellen, jedoch

nicht an DC-SIGN-positive Zellen blockierte. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Analyse des

HIV-1-Transfers durch CLEC-2-exprimierende Zellen erzielt (Abb. 8).

102

103

104

105

106

DC-SIGN

Luzi

fera

se-A

ktiv

ität(

c.p.

s.)

DC-SIGN Kontrolle DC-SIGNCLEC-2CLEC-2 CLEC-2DC-SIGN CLEC-2Lektin:

Inhibitor:Zielzellen

IgGKontrolle

anti CLEC-2

IgGKontrolle

anti CLEC-2

Kontrolle

- - - - -

+ + + + + + + - - -

102

103

104

105

106

DC-SIGN

Luzi

fera

se-A

ktiv

ität(

c.p.

s.)

DC-SIGN Kontrolle DC-SIGNCLEC-2CLEC-2 CLEC-2DC-SIGN CLEC-2Lektin:

Inhibitor:Zielzellen

IgGKontrolle

anti CLEC-2

IgGKontrolle

anti CLEC-2

Kontrolle

- - - - -

+ + + + + + + - - -

Abbildung 8: CLEC-2-vermittelte Transmission von NL4-3

B-THP Zellen, die die genannten Lektine stabil exprimieren, wurden wie in Abb. 7 beschrieben mit den aufgeführten Antikörpern präinkubiert und anschließend mit 10 ng NL4-3 inkubiert. Nach dem Waschschritt wurden die Zellen mit CEMx174 R5 Zielzellen kokultiviert und die Luziferase-Aktivität nach 72 h gemessen. Im Diagramm ist das Resultat eines von drei unabhängigen, in Triplikaten durchgeführten Experimenten dargestellt. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung.

CLEC-2-positive B-THP Zellen vermittelten den HIV-Transfer an T-Zellen mit etwa fünffach

höherer Effizienz als Kontrollzellen (Abb. 8). Dieser Prozess war CLEC-2-abhängig, denn die

Trans-Infektion konnte durch ein CLEC-2-spezifisches Antiserum, jedoch nicht durch einen

Kontrollantikörper gleichen Isotyps blockiert werden. Weiterhin hatte das CLEC-2-Serum keinen

Effekt auf die DC-SIGN-abhängige Transmission. Die HIV-Transmission durch Zelllinien, die

exogenes CLEC-2 exprimieren, ist demnach CLEC-2-spezfisch. CLEC-2-positive Zellen

könnten daher zur HIV-Ausbreitung in infizierten Personen beitragen.

1.3 DC-SIGN, jedoch nicht CLEC-2 verstärkt die Infektiosität von Ebola- und SARS- Pseudotypen

Die Expression von DC-SIGN/R verstärkt die Cis-Infektion durch verschiedene Viren, u.a. durch

Ebolavirus (EBOV) und SARS-Coronavirus (SARS-CoV) (Hofmann et al., 2006; Marzi et al.,

2004; Shih et al., 2006). Um zu klären, ob CLEC-2 ebenfalls mit einem breiten Spektrum an

32

Ergebnisse

33

Viren interagiert, sollte untersucht werden, ob CLEC-2 die Cis-Infektion von Pseudotypen

verstärkt, die das Glykoprotein des Zaire Ebolavirus (ZEBOV-GP), das Spike-Protein des

SARS-Coronavirus (SARS-CoV-S) oder das Glykoprotein (Env) des Maus-Leukämievirus (MLV)

auf der Oberfläche trugen. Die Infektion von ZEBOV-GP- und SARS-CoV-S-Pseudotypen

wurde wie erwartet massiv durch DC-SIGN/R verstärkt, während die CLEC-2-Expression die

Effizienz der Infektion nicht beeinflusste (Abb. 9). In Übereinstimmung mit publizierten Arbeiten

(Lee et al., 2001; Marzi et al., 2004) wurde die MLV-Env-vermittelte Infektion nicht durch die

Lektin-Expression beeinflusst. Diese Beobachtungen zeigen, dass CLEC-2 eine andere

Ligandenspezifität aufweist als DC-SIGN und/oder lediglich die Trans-Infektion, jedoch nicht die

Cis-Infektion verstärkt.

.

102

103

104

105

MLV SARS ZEBOV

Luzi

fera

se-A

ktiv

ität(

c.p.

s.)

KontrolleCLEC-2DC-SIGNDC-SIGNR

102

103

104

105

MLV SARS ZEBOV

Luzi

fera

se-A

ktiv

ität(

c.p.

s.)

KontrolleCLEC-2DC-SIGNDC-SIGNR

Abbildung 9: CLEC-2 hat keinen Einfluss auf die Infektion von SARS-, ZEBOV- und MLV-Pseudotypen

Die Lektine CLEC-2, DC-SIGN oder DC-SIGNR wurden transient in 293T Zellen exprimiert und die Zellen mit pseudotypisierten Viren infiziert, welche die Glykoproteine von SARS-CoV, ZEBOV bzw. MLV auf der Oberfläche trugen. Die pseudotypisierten Viren wurden zuvor auf vergleichbare Infektiosität normalisiert. Das Ergebnis eines repräsentativen, in Triplikaten durchgeführten Experiments ist gezeigt. Das Resultat wurde in zwei weiteren unabhängigen Experimenten bestätigt

1.4 CLEC-2 interagiert nicht mit HIV-1 Env

Die oben aufgeführten Untersuchungen zeigten, dass CLEC-2 wie DC-SIGN an NL4-3 bindet

und den Transfer gebundener Viren an T-Zellen vermittelt (Abb. 6 und Abb. 7). Bisher war

jedoch unklar, ob CLEC-2 wie DC-SIGN an das HIV-1-Hüllprotein gp120 bindet. Zur

Untersuchung dieser Frage wurde ein lösliches Fusionsprotein zwischen gp120 des

molekularen HIV-1-Klons JRFL und der Fc-Region des humanen Immunoglobulin G (IgG1)

hergestellt (Birkmann et al., 2001). Durch Bindungsstudien, die mittels FACS-Analyse

ausgewertet wurden, konnte gezeigt werden, dass CLEC-2 im Gegensatz zu DC-SIGN nicht an

HIV-1-gp120 bindet (Abb. 10B).

Ergebnisse

A)

0

20

40

60

80

100

120

Kontrolle DC-SIGN CLEC-2%

Geb

unde

nes

p24-

Ant

igen

100 101 102 103 1040

50

100150

200250

100 101 102 103 1040

50

100150

200250

100 101 102 103 1040

50

100150

200250

Kontrolle CLEC-2 DC-SIGN

Fluoreszenz

Zellz

ahl

B)

A)

0

20

40

60

80

100

120


Geb

unde

nes

p24-

Ant

igen

100 101 102 103 1040

50

100150

200250

100 101 102 103 1040

50

100150

200250

100 101 102 103 1040

50

100150

200250


Fluoreszenz

Zellz

ahl

B)

0

20

40

60

80

100

120


Geb

unde

nes

p24-

Ant

igen

0

20

40

60

80

100

120

Kontrolle DC-SIGN CLEC-20

20

40

60

80

100

120


Geb

unde

nes

p24-

Ant

igen

100 101 102 103 1040

50

100150

200250

100 101 102 103 1040

50

100150

200250

100 101 102 103 1040

50

100150

200250


Fluoreszenz

Zellz

ahl

100 101 102 103 1040

50

100150

200250

100 101 102 103 1040

50

100150

200250

100 101 102 103 1040

50

100150

200250


Fluoreszenz

Zellz

ahl

B)

Abbildung 10: CLEC-2 interagiert nicht mit dem HIV-1-Hüllprotein

(A) Im Gegensatz zu DC-SIGN bindet CLEC-2 nicht an das HIV-1-Hüllprotein. DC-SIGN- bzw. CLEC-2-exprimierende B-THP Zellen und B-THP Kontrollzellen wurden mit 5 ng NL4-3 mit Env (weißer Balken) bzw. ohne Env (schwarzer Balken) für 3 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und der Kapsid-(p24)-Gehalt in den Zelllysaten bestimmt. Das Balkendiagramm zeigt die Durchschnittswerte aus drei unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung vom Mittelwert. (B) Transient mit den entsprechenden Lektinen transfizierte Zellen wurden mit vergleichbaren Mengen Fc-Kontrollprotein (schwarze Fläche) oder mit gp120-Fc-Protein (graue Linie) inkubiert, anschließend mit dem sekundären Fc-spezifischen Antikörper gefärbt und mittels FACS-Gerät analysiert. Die gezeigten FACS-Daten stellen ein repräsentatives aus drei unabhängigen Experimenten dar.

Um zu untersuchen, ob eine Interaktion zwischen CLEC-2 und Virion-assoziiertem HIV-1-gp120

stattfindet, wurden HIV-1 NL4-3 Varianten mit und ohne Hüllprotein generiert. Hierzu wurden

293T Zellen mit dem Reporterkonstrukt pNL4-3 env* nef* luc (Connor et al., 1995) oder einem

NL4-3 Konstrukt mit intaktem env-Gen transfiziert. Die erhaltenen Viren wurden auf den Kapsid-

Gehalt hin normalisiert und mit B-THP-CLEC-2 Zellen, B-THP-DC-SIGN Zellen bzw.

Kontrollzellen inkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und lysiert. Die

Konzentrationen an p24-Antigen in den Zelllysaten wurden mittels p24-ELISA quantifiziert (Abb.

10A).

Wie erwartet wurde eine effiziente Bindung von Env-positiven Viren an DC-SIGN-exprimierende

Zellen gemessen, während bei Env-defizienten Viren keine Bindung nachweisbar war. Im

Gegensatz zu DC-SIGN-positiven Zellen banden CLEC-2-positive Zellen Viren mit und ohne

HIV-Hüllprotein mit gleicher Effizienz. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CLEC-2 nicht

an das HIV-1-Hüllprotein sondern wahrscheinlich an einen zellulären Faktor bindet, der bei der

Virusfreisetzung in die Virushülle inkorporiert wird.

34

Ergebnisse

35

1.5 CLEC-2 wird auf Thrombozyten und Megakaryozyten exprimiert

Die Expression von CLEC-2-mRNA wurde in Leberzellen nachgewiesen (Colonna et al., 2000).

Ob das CLEC-2-Protein auf der Oberfläche von Zellen exprimiert wird, die für die HIV-1

Infektion relevant sind, war jedoch unklar. Zur Klärung dieser Frage wurde die CLEC-2-

Expression auf Zelllinien und primären Zellen wie PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear

Cells), reifen und unreifen dendritischen Zellen sowie Thrombozyten mittels FACS-Analyse

untersucht (Tabelle 1). Im Gegensatz zu den stabil transfizierten B-THP- bzw. 293-CLEC-2

Zellen konnte auf der Oberfläche von dendritischen Zellen und PBMCs keine CLEC-2-

Expression nachgewiesen werden. Auf der Oberfläche von Thrombozyten und den

megakaryozytischen Zelllinien DAMI, HEL und K562 konnte hingegen CLEC-2 detektiert

werden (Tabelle 1). Die Reinheit der Thrombozyten-Präparationen wurde durch FACS-Analyse

der Expression des Thrombozyten- bzw. Megakaryozyten-spezifischen Markers CD61

nachgewiesen (Abb. 11).

Zelllinien CLEC-2 Expression *

Huh-7 - Hep-2 - Vero - COS-7 - 293T - 293T-REx - 293T-REx CLEC-2 + Jurkat - CEMx174 R5 - B-THP - B-THP-CLEC-2 + HOS - HeLa - HFF - MCR5 - U373 - DAMI + HEL +

Primäre Zellen CLEC-2 Expression *

reife dendritische Zellen - unreife dendritische Zellen - nicht stimulierte PBMCs - stimulierte PBMCs - Thrombozyten +

*+ positiv; - negativ

Tabelle 1: CLEC-2-Expression auf Zelllinien und primären Zellen

Ergebnisse

A)

Zellz

ahl

Fluoreszenz

CLEC-2 (13B10) CD61

100 101 102 103 1040

50

100

150

100 101 102 103 1040

50

100

150

100 101 102 103 1040

50100150200250

100 101 102 103 1040

50100150200250

Fluoreszenz

Zellz

ahl

CLEC-2 (13H11)

CLEC-2 (13B10)

100 101 102 103 1040

20

40

60

80

100 101 102 103 1040

20

40

60

80

Zellz

ahl

Fluoreszenz

CLEC-2 (13B10)

DAMI HEL

B)

C)

B-THP Zellen

Thrombozyten

Megakaryozytische Zelllinien

A)

Zellz

ahl

Fluoreszenz

CLEC-2 (13B10) CD61

100 101 102 103 1040

50

100

150

100 101 102 103 1040

50

100

150

100 101 102 103 1040

50100150200250

100 101 102 103 1040

50100150200250

Fluoreszenz

Zellz

ahl

CLEC-2 (13H11)

CLEC-2 (13B10)

100 101 102 103 1040

20

40

60

80

100 101 102 103 1040

20

40

60

80

Zellz

ahl

Fluoreszenz

CLEC-2 (13B10)

DAMI HEL

B)

C)

B-THP Zellen

Thrombozyten


Zellz

ahl

Fluoreszenz

CLEC-2 (13B10) CD61

100 101 102 103 1040

50

100

150

100 101 102 103 1040

50

100

150

Zellz

ahl

Zellz

ahl

FluoreszenzFluoreszenz

CLEC-2 (13B10) CD61

100 101 102 103 1040

50

100

150

100 101 102 103 1040

50

100

150

100 101 102 103 1040

50100150200250

100 101 102 103 1040

50100150200250

Fluoreszenz

Zellz

ahl

100 101 102 103 1040

50100150200250

100 101 102 103 1040

50100150200250


Zellz

ahl

Zellz

ahl

CLEC-2 (13H11)

CLEC-2 (13B10)

100 101 102 103 1040

20

40

60

80

100 101 102 103 1040

20

40

60

80

Zellz

ahl

Fluoreszenz

CLEC-2 (13B10) CLEC-2 (13H11)

CLEC-2 (13B10)

100 101 102 103 1040

20

40

60

80

100 101 102 103 1040

20

40

60

80

Zellz

ahl

Zellz

ahl


CLEC-2 (13B10)

DAMI HEL

B)

C)

B-THP Zellen

Thrombozyten


Abbildung 11: CLEC-2-Expression auf Thrombozyten und den megakaryozytischen Zelllinien DAMI und HEL

(A) CLEC-2-Expression auf B-THP und B-THP-CLEC-2 Zellen. Der Nachweis der CLEC-2-Expression auf der Zelloberfläche erfolgte mit Hilfe der CLEC-2-spezifischen Antikörper 13B10 bzw. 13H11. Das nach Färbung mit einem Kontrollantikörper erhaltene Signal ist als schwarze Fläche, das Signal nach Färbung mit CLEC-2-spezifischen Antikörpern als schwarze Linie dargestellt. Das Histogramm stellt ein repräsentatives Experiment aus drei unabhängigen FACS-Analysen dar. (B) Die Expression von CLEC-2 (links) bzw. CD61 (rechts) auf Thrombozyten. Thrombozyten wurden mit den jeweiligen Isotyp-Kontrollen (schwarze Fläche) bzw. mit dem CLEC-2 spezifischen Antikörper 13B10 (links, schwarze Linie) bzw. CD61 (rechts schwarze Linie) inkubiert. Identische Ergebnisse konnten mit Thrombozyten aus unterschiedlichen Spendern erzielt werden. (C) CLEC-2-Expression auf den megakaryozytischen Zelllinien DAMI und HEL. Die CLEC-2-Expression wurde mit dem Antikörper 13B10 nachgewiesen; das erhaltene Signal ist als schwarze Linie dargestellt, die schwarze Fläche zeigt das Signal nach Färbung mit einem Kontrollantikörper gleichen Isotyps. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für mindestens drei unabhängig durchgeführte FACS-Experimente.

1.6 CLEC-2 trägt zur Bindung von HIV-1 an Thrombozyten bei

Expressionsanalysen zeigten, dass Thrombozyten und megakaryozytische Zelllinien CLEC-2

exprimieren (Abb. 11). Eine publizierte Arbeit lieferte zudem Hinweise darauf, dass

Thrombozyten mit HIV interagieren (Lee et al., 1998). Es stellte sich daher die Frage, ob

36

Ergebnisse

37

Thrombozyten den Transfer von Viren an Zielzellen vermitteln und ob CLEC-2 an diesem

Prozess beteiligt ist. Zur Untersuchung dieser Frage wurden zunächst Thrombozyten aus

humanem Vollblut isoliert, mit HIV-1 NL4-3 inkubiert, gewaschen und mit CEMx174 R5

Zielzellen kokultiviert. In der Tat konnte eine Trans-Infektion der Zielzellen nachgewiesen

werden (Abb. 12), wohingegen die kernlosen Thrombozyten wie erwartet für die HIV-1-Infektion

nicht permissiv waren. Ob die Trans-Infektion CLEC-2 abhängig erfolgte, wurde durch

Inhibitionsstudien untersucht. Hierzu wurden Thrombozyten mit einem CLEC-2-spezifischen

Antiserum bzw. einem Kontrollantikörper inkubiert, bevor HIV-1 NL4-3 zu den Kulturen gegeben

wurde. Ungebundene Viren wurden anschließend durch Waschen entfernt, die Thrombozyten

mit CEMx174 R5 Zielzellen kokultiviert und die Luziferase-Aktivität in den Zielzellen nach 72 h

bestimmt. Die Trans-Infektion wurde durch das CLEC-2-spezifische Serum um 50% reduziert,

während der Kontrollantikörper die Infektionseffizienz nicht beeinflusste (Abb. 12). Diese

Resultate zeigen, dass Thrombozyten funktionell mit HIV-1 interagieren. Die Bindung von HIV-1

an Thrombozyten erfolgte nur teilweise CLEC-2-abhängig, daher müssen weitere Faktoren an

der HIV-1-Bindung beteiligt sein.

0

20

40

60

80

100

120

140

PBS KontrollIgG

anti CLEC-2

keineZielzellen

% T

rans

mis

sion

0

20

40

60

80

100

120

140

PBS KontrollIgG

anti CLEC-2

keineZielzellen

% T

rans

mis

sion

Abbildung 12: Thrombozyten vermitteln die effiziente HIV-1-Trans-Infektion in einer partiell CLEC-2 abhängigen Weise

Thrombozyten wurden mit PBS bzw. mit den entsprechenden Antikörpern (10 µg/ml) präinkubiert, anschließend mit p24-normalisierten, in 293T Zellen generierten HIV-1 NL4-3 (10 ng) für 3 h im Schüttler bei 37°C inkubiert. Um nicht gebundene Viren zu entfernen wurden die Thrombozyten gewaschen und anschließend mit CEMx174 R5 Zielzellen kokultiviert. Die Luziferase-Aktivität in den Zelllysaten wurde nach 72 h gemessen. Das Diagramm zeigt die Durchschnittswerte aus sieben unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes.

Die Beobachtung, dass CLEC-2 nicht mit dem viralen Hüllprotein interagiert, legt die Möglichkeit

nahe, dass CLEC-2 an einen zellulären Faktor bindet, der bei der Freisetzung von neuen Viren

in die virale Hüllmembran eingebaut wird. Es sollte daher überprüft werden, ob die

virusproduzierende Zelle die Effizienz der CLEC-2-vermittelten Trans-Infektion beeinflusst. Zu

Ergebnisse

diesem Zweck wurden HIV-1 NL4-3 Viren sowohl in den routinemäßig eingesetzten 293T Zellen

als auch in CEMx174 R5 und PBMCs generiert (Abb. 13). Die Virus-Präparationen wurden auf

den Kapsid (p24)-Gehalt hin normalisiert und die Thrombozyten-vermittelte Trans-Infektion

analysiert. Es wurde unabhängig von der virusproduzierenden Zelllinie eine deutliche Reduktion

der Trans-Infektion durch Zugabe eines CLEC-2-spezifischen Antiserums, jedoch nicht durch

einen Kontrollantikörper beobachtet; der mögliche zelluläre Interaktionspartner von CLEC-2

scheint daher ein relativ breites Expressionsspektrum aufzuweisen.

HIV-1 NL4-3 produziert in PBMCs

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

PBS Isotyp-Kontrolle

antiCLEC-2

Luzi

fera

se-A

ktiv

ität

(c.p

.s.)

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000


antiCLEC-2

Luzi

fera

se-A

ktiv

ität (

c.p.

s.)

HIV-1 NL4-3 produziert in

CEMx174 R5 Zellen

A) B)HIV-1 NL4-3 produziert in PBMCs

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000


antiCLEC-2

Luzi

fera

se-A

ktiv

ität

(c.p

.s.)

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000


antiCLEC-2

Luzi

fera

se-A

ktiv

ität (

c.p.

s.)

HIV-1 NL4-3 produziert in

CEMx174 R5 Zellen

A) B)

Abbildung 13: In CEMx174 R5 Zellen (A) bzw. in PBMCs (B) generiertes HIV-1 wird durch Thrombozyten CLEC-2-abhängig auf Zielzellen übertragen

Thrombozyten wurden mit HIV-1 NL4-3 aus CEMx174 R5 Zellen (A) bzw. aus PBMCs (B) für 3 h bei 37°C inkubiert, gewaschen, und anschließend mit CEMx174 R5 Zielzellen kokultiviert. Die Luziferase-Aktivität in den Zelllysaten wurde nach 72 h gemessen. Die gezeigten Daten stehen für ein repräsentatives Experiment und wurden in einem weiteren unabhängigen Versuch reproduziert. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung.

Viren, die den Korezeptor CCR5 für den Eintritt verwenden (R5-trop), werden zwischen

Individuen übertragen, während CXCR4-trope Viren (X4-trop) bei etwa 40% der Infizierten in

der späten Phase des Infektionsverlaufs nachgewiesen werden. Um die Relevanz der

Interaktion mit CLEC-2 für die HIV-1-Ausbreitung weiter zu ermitteln, stellt sich die Frage, ob

der Korezeptor-Tropismus die Bindung an CLEC-2 beeinflusst. Der Laborstamm NL4-3 (X4-

trop) und die HIV-1-Isolate 92/BR/020 und 93/BR/020 (beide R5-trop) wurden CLEC-2-

abhängig durch Thrombozyten auf CEMx174 R5 Zellen übertragen, während das Isolat

92/HT/596 (R5X4-trop) CLEC-2-unabhängig transmittiert wurde (Abb. 14). Die Interaktion von

HIV-1 mit CLEC-2 auf Thrombozyten scheint daher vom Korezeptor-Tropismus unabhängig,

aber Isolat-spezifisch zu sein. Die unterliegenden Mechanismen sind gegenwärtig unklar, wobei

38

Ergebnisse

39

eine Isolat-spezifische Inkorporation des möglichen zellulären Bindungspartners von CLEC-2

denkbar ist. Hinweise auf einen solchen Prozess wurden bereits dokumentiert (Cantin et al.,

1996).

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

NL4-3 92HT596 92/BR/020 93/BR/020

Luzi

fera

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ktiv

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c.p.

s.)

PBSIgG Kontrolleanti CLEC-2

0

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100000

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350000

400000

450000

500000

NL4-3 92HT596 92/BR/020 93/BR/020

Luzi

fera

se-A

ktiv

ität(

c.p.

s.)

PBSIgG Kontrolleanti CLEC-2

Abbildung 14: Die CLEC-2-vermittelte HIV-1-Trans-Infektion ist vom Virus-Isolat abhängig

Thrombozyten wurden mit p24-normalisierten HIV-1-Primärisolaten (10 ng) für 3 h bei 37°C inkubiert, anschließend wurden ungebundene Viren durch Waschen entfernt. Die Thrombozyten wurden mit CEMx174 R5 Zielzellen kokultiviert und die Luziferase-Aktivität in den Zelllysaten nach 72 h bestimmt. Die Resultate wurden durch zwei weitere unabhängige Experimente bestätigt. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung vom Mittelwert.

1.7 DC-SIGN wird auf Thrombozyten exprimiert und trägt wesentlich zur HIV-1-Trans- Infektion bei

Die Thrombozyten-vermittelte HIV-1-Trans-Infektion wird lediglich zu etwa 50% durch CLEC-2-

spezifische Antikörper blockiert (Abb. 12). Dies deutet darauf hin, dass sich neben CLEC-2

noch weitere Faktoren auf der Oberfläche von Thrombozyten befinden müssen, die eine

Transmission von HIV-1 vermitteln. Zur Identifizierung der verantwortlichen Faktoren wurden

Inhibitionsstudien durchgeführt. So wurde untersucht, ob Karbohydrate die Trans-Infektion

blockieren können, was auf eine wichtige Rolle von zellulären Lektinen hindeuten würde. Die

Präinkubation von Thrombozyten mit dem Mannose-Polymer Mannan (Geijtenbeek et al.,

2000b) führte zu einer konzentrationsabhängigen Reduktion der Trans-Infektion, während die

Karbohydrate Fucose bzw. Glucose keine inhibitorische Wirkung zeigten (Abb. 15).

Ergebnisse

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

Mannan Glucose Fucose

Luzi

fera

se-A

ktiv

ität(

c.p.

s.)

0 µg/ml5 µg/ml10 µg/ml20 µg/ml

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

Mannan Glucose Fucose

Luzi

fera

se-A

ktiv

ität(

c.p.

s.)

0 µg/ml5 µg/ml10 µg/ml20 µg/ml

Abbildung 15: Inhibition der HIV-1-Trans-Infektion durch Karbohydrate

Thrombozyten wurden mit den angegebenen Konzentrationen Mannan, Glucose bzw. Fucose präinkubiert und mit 10 ng HIV-1 NL4-3 für 3 h bei 37°C inkubiert. Ungebundene Viren wurden durch Waschen entfernt, die Thrombozyten mit CEMx174 R5 Zielzellen für 72 h kokultiviert und die Luziferase-Aktivität in den Zelllysaten bestimmt. Ein vergleichbares Ergebnis wurde in einem weiteren unabhängigen Experiment erzielt.

Diese Beobachtungen zeigen, dass die Interaktion von Thrombozyten mit HIV-1 zu einem

großen Teil durch ein Mannose-spezifisches Lektin vermittelt wird. Vor diesem Hintergrund

wurde analysiert, ob das Mannose-spezifische Lektin DC-SIGN auf Thrombozyten exprimiert

wird und an der HIV-1-Transmission durch diese Zellfragmente beteiligt ist. Hierbei konnte eine

schwache Expression von DC-SIGN auf Thrombozyten nachgewiesen werden (Abb. 16).

Zellz

ahl

100 101 102 103 1040

40

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120

160

200

Fluoreszenz

Zellz

ahl

Zellz

ahl

100 101 102 103 1040

40

80

120

160

200


Abbildung 16: DC-SIGN-Expression auf Thrombozyten

Die DC-SIGN-Expression auf der Oberfläche von Thrombozyten wurde mit Hilfe des DC-SIGN-spezifischen Antikörpers 507 (hellgraue Linie) bzw. eines Kontrollantikörpers gleichen Isotyps mittels FACS analysiert. Vergleichbare Resultate wurden in drei weiteren unabhängigen Experimenten mit Thrombozyten aus unterschiedlichen Spendern erzielt.

Zur Klärung des Beitrags von DC-SIGN zur HIV-1-Transmission durch Thrombozyten wurden

Inhibitionsexperimente mit dem monoklonalen DC-SIGN/R-spezifischen Antikörper (mAK) 526

(Baribaud et al., 2002) durchgeführt. Der mAK 526 reduzierte die HIV-1-Transmission durch

Thrombozyten um 80%, und die Kombination von mAK 526 mit einem CLEC-2-spezifischen

40

Ergebnisse

41

Antiserum verringerte die Transmissionseffizienz auf Werte nahe des Hintergrundbereichs

(Abb. 17). Diese Beobachtungen zeigen, dass DC-SIGN und CLEC-2 im Wesentlichen für die

Interaktion von HIV-1 mit Thrombozyten verantwortlich sind.

0

2000

4000

6000

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10000

12000

14000

16000

18000

20000

PBS Kontroll-IgG

anti-CLEC-2

526 526 &anti-CLEC-2

ohne Zielzellen

Luzi

fera

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ktiv

ität(

c.p.

s.)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

PBS Kontroll-IgG

anti-CLEC-2

526 526 &anti-CLEC-2

ohne Zielzellen

Luzi

fera

se-A

ktiv

ität(

c.p.

s.)

Abbildung 17: DC-SIGN und CLEC-2 vermitteln die Transmission von HIV-1 durch Thrombozyten

Thrombozyten wurden mit den angegebenen Antikörpern für 30 min bei 37°C präinkubiert, anschließend mit 10 ng HIV-1 NL4-3 für 3 h bei 37°C inkubiert, gewaschen und mit CEMx174 R5 Zielzellen kokultiviert. Die Luziferase-Aktivität in den Zielzellen wurde nach 72 h bestimmt. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.

1.8 An Thrombozyten gebundene Viren sind neutralisationssensitiv

Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass Thrombozyten HIV-1-Partikel und andere

nicht-virale Pathogene internalisieren können (Boukour et al., 2006; Youssefian et al., 2002).

Bisher war jedoch unklar, ob die Internalisierung von HIV-1 durch Thrombozyten für die Trans-

Infektion wichtig ist, oder ob gebundene HIV-1-Partikel auf der Oberfläche von Thrombozyten

verbleiben und von dort auf Zielzellen übertragen werden. Zur Klärung dieser Frage wurden

HIV-1 NL4-3 mit Thrombozyten inkubiert, ungebundene Viren durch Waschen entfernt und die

Virus-beladenen Thrombozyten mit dem Antikörper 2G12 inkubiert. Der Antikörper 2G12 bindet

an ein Karbohydrat-Epitop auf der Oberfläche von gp120 und zeigt eine breite neutralisierende

Aktivität (Trkola et al., 1996b). Die Inkubation von Virus-exponierten Thrombozyten mit 2G12

blockierte die HIV-1 Trans-Infektion konzentrationsabhängig und hocheffizient. Ein

Kontrollantikörper hatte hingegen keinen Einfluss auf die Trans-Infektion. Diese Beobachtung

deutet darauf hin, dass auf der Oberfläche von Thrombozyten verbliebene HIV-1-Partikel auf

Zielzellen übertragen wurden (Abb. 18).

Ergebnisse

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

PBS IgGKontrolle

1 µg/ml2G12

5µg/ml2G12

Kontrolle

% T

rans

mis

sion

0

20

40

60

80

100

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140

160

180

PBS IgGKontrolle

1 µg/ml2G12

5µg/ml2G12

Kontrolle

% T

rans

mis

sion

Abbildung 18: 2G12 blockiert die Thrombozyten-vermittelte HIV-1-Trans-Infektion

Thrombozyten wurden mit p24-normalisiertem HIV-1 NL4-3 für 3 h bei 37°C inkubiert und ungebundene Viren durch Waschen entfernt. Anschließend wurden die mit den Thrombozyten gebundenen Viren mit unterschiedlichen 2G12 Konzentrationen für 30 min inkubiert, gewaschen und mit CEMx174 R5 Zielzellen kokultiviert. Die Luziferase-Aktivität wurde nach 72 h in den Zelllysaten bestimmt. Die gezeigten Daten stehen für ein repräsentatives, in Triplikaten durchgeführtes Experiment. Vergleichbare Resultate wurden in zwei weiteren unabhängigen Experimenten mit unterschiedlichen Viruspräparationen erzielt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.

1.9 Die Bindung von HIV-1 an Thrombozyten konserviert die virale Infektiosität

Laut einer initialen Studie konserviert die Bindung von HIV-1 an DC-SIGN die virale Infektiosität

(Kwon et al., 2002). Es sollte daher analysiert werden, ob auch die Interaktion von HIV-1 mit

Thrombozyten die Viren stabilisiert. Zu diesem Zweck wurde HIV-1 jeweils mit zellfreiem

Medium bzw. mit Thrombozyten inkubiert, anschließend wurden zu den angegebenen

Zeitpunkten Zielzellen hinzugegeben. Um eine eventuelle Korrelation der Stabilisierung der

Viruspartikel mit der Lektin-Interaktion feststellen zu können, wurde in parallelen Ansätzen der

DC-SIGN/R-spezifische Antikörper 526 bzw. das CLEC-2-spezifische Antiserum alleine und in

Kombination zugesetzt (Abb. 14). Bei sofortiger Zugabe von Zielzellen war eine Verstärkung der

HIV-1-Infektiosität durch die Bindung an Thrombozyten nicht zu beobachten (Abb. 19, Zeitpunkt

0 h). Demnach hatten CLEC-2- bzw. DC-SIGN/R-spezifische Antikörper unter diesen

Bedingungen keinen Einfluss auf die virale Infektiosität. Wurde jedoch HIV-1 mit bzw. ohne

Thrombozyten für 24 h bzw. 48 h bei 37°C inkubiert und dann die Zielzellen hinzugegeben, so

wurde in Gegenwart von Thrombozyten eine deutlich geringere Abnahme der Infektiosität

beobachtet (Abb. 19, Zeitpunkt 48 h). Der Thrombozyten-vermittelte Erhalt der viralen

Infektiosität konnte durch Zugabe von CLEC-2- und DC-SIGN/R-spezifischen Antikörpern

blockiert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Thrombozyten durch die Expression von

CLEC-2 und DC-SIGN in der Lage sind, die Infektiosität der HI-Viren zu konservieren; eine

Eigenschaft die die HIV-1-Ausbreitung im Wirt fördern könnte.

42

Ergebnisse

43

100

1000

10000

100000

1000000

0 24 48

Luzi

fera

se A

ktiv

ität (

c.p.

s.)

ohne Thrombozytenmit ThrombozytenThrombozyten+Kontrolle IgGThrombozyten+anti CLEC-2Thrombozyten+526Thrombozyten+526+anti CLEC-2

Luzi

fera

se-A

ktiv

ität(

c.p.

s.)

Zeit in Stunden

100

1000

10000

100000

1000000

0 24 48

Luzi

fera

se A

ktiv

ität (

c.p.

s.)


100

1000

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100000

1000000

0 24 48

Luzi

fera

se A

ktiv

ität (

c.p.

s.)


Luzi

fera

se-A

ktiv

ität(

c.p.

s.)

Zeit in Stunden

Abbildung 19: Thrombozyten konservieren die virale Infektiosität

HIV-1 NL4-3 wurde in Medium mit bzw. ohne Thrombozyten inkubiert und mit Antikörpern gegen DC-SIGN/R (526) bzw. CLEC-2 präinkubiert. CEMx174 R5 Zielzellen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten hinzugegeben und die Luziferase-Aktivität in den Zelllysaten jeweils nach 72 h Kokultivierung bestimmt. Vergleichbare Resultate wurden in zwei weiteren unabhängigen Experimenten mit unterschiedlichen Viruspräparationen erzielt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.

2. Einfluss von Podoplanin auf die CLEC-2-vermittelte HIV-1-Transmission

Die bisher beschriebenen Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass CLEC-2 nicht an

das HIV-1-Hüllprotein bindet, sondern an einen zellulären Faktor, der in die virale Hüllmembran

eingebaut wird. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde die Bindung von löslichem CLEC-2

bzw. DC-SIGN an 293T Zellen untersucht, die das HIV-Hüllprotein oder ein Kontrollplasmid

exprimieren. Zur Herstellung des löslichen CLEC-2- bzw. DC-SIGN-Proteins wurde die

Karbohydraterkennungsdomäne von CLEC-2- bzw. DC-SIGN mit dem Fc-Anteil von humanem

IgG1 fusioniert. Das lösliche CLEC-2-Fc- bzw. DC-SIGN-Fc- Fusionsprotein sowie ein Fc-

Kontrollprotein wurden in 293T Zellen hergestellt, mittels Western Blot-Analysen normalisiert

und in Bindungsstudien eingesetzt (Abb. 20). Um zu überprüfen, ob CLEC-2 an ein

mannosehaltiges zelluläres Oberflächenmolekül bindet, wurden die 293T Zellen zudem mit

Mannan oder PBS präinkubiert, bevor das CLEC-2- bzw. das DC-SIGN-Protein zugegeben

wurde.

Ergebnisse

Zellz

ahl

100 101 102 103 1040

50

100

150

200

Fluoreszenz

100 101 102 103 104

Kontrolle HIV-1 Env

Fc-c

ontr

ol

sDC

-SIG

N

sDC

-SIG

N+

Man

nan

sDC

-SIG

N

sDC

-SIG

N+

Man

nan

Kontrolle HIV-1 Env

10

100

10000

Geo

met

rich

eM

ittel

der

Fluo

resz

enz 1000

0

0

0

0

0

Zellz

ahl

0

50

100

150

200

100 101 102 103 104

Fluoreszenz

100 101 102 103 104

Kontrolle HIV-1 Env

Fc-c

ontr

ol

sCLE

C-2

sCLE

C-2

+ M

anna

n

sCLE

C-2

sCLE

C-2

+ M

anna

n

Kontrolle HIV-1 Env

10

100

1000

10000

Geo

met

rich

eM

ittel

der

Fluo

resz

enz

A)

B)

Zellz

ahl

100 101 102 103 1040

50

100

150

200

Fluoreszenz

100 101 102 103 104

Kontrolle HIV-1 Env

Fc-c

ontr

ol

sDC

-SIG

N

sDC

-SIG

N+

Man

nan

sDC

-SIG

N

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-SIG

N+

Man

nan

Kontrolle HIV-1 Env

10

100

10000

Geo

met

rich

eM

ittel

der

Fluo

resz

enz 1000

Zellz

ahl

100 101 102 103 1040

50

100

150

200

Fluoreszenz

100 101 102 103 104

Kontrolle HIV-1 Env

Fc-c

ontr

ol

sDC

-SIG

N

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-SIG

N+

Man

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-SIG

N

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Man

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Kontrolle HIV-1 Env

10

100

10000

Geo

met

rich

eM

ittel

der

Fluo

resz

enz 1000

100 101 102 103 1040

50

100

150

200

Fluoreszenz

100 101 102 103 104

Kontrolle HIV-1 Env

Fc-c

ontr

ol

sDC

-SIG

N

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-SIG

N+

Man

nan

sDC

-SIG

N

sDC

-SIG

N+

Man

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Kontrolle HIV-1 Env

10

100

10000

Geo

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Fluo

resz

enz 1000

0

0

0

0

0

Zellz

ahl

0

50

100

150

200

100 101 102 103 104

Fluoreszenz

100 101 102 103 104

Kontrolle HIV-1 Env

Fc-c

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ol

sCLE

C-2

sCLE

C-2

+ M

anna

n

sCLE

C-2

sCLE

C-2

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Kontrolle HIV-1 Env

10

100

1000

10000

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0

0

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0

Zellz

ahl

0

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100

150

200

100 101 102 103 104

Fluoreszenz

100 101 102 103 104

Kontrolle HIV-1 Env

Fc-c

ontr

ol

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C-2

sCLE

C-2

+ M

anna

n

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C-2

sCLE

C-2

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Kontrolle HIV-1 Env

10

100

1000

10000

Geo

met

rich

eM

ittel

der

Fluo

resz

enz

A)

B)

Abbildung 20: CLEC-2 bindet an 293T Zellen unabhängig von der Expression des HIV-1-Hüllproteins

293T Zellen wurden mit einem HIV-1 Env bzw. Leervektor transfiziert und mit Mannan (100µg/ml) bzw. PBS präinkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit löslichem CLEC-2-Protein (sCLEC-2) (A) bzw. löslichem DC-SIGN-Protein (sDC-SIGN) (B) für 45 min auf Eis inkubiert, gewaschen und mit einem sekundären anti-Mensch-Cy5 Antikörper inkubiert. Die Bindung wurde mittels FACS analysiert (links). Aus den Bindungsdaten (links) wurde das geometrische Mittel der Fluoreszenz (GMCF) errechnet und die Durchschnittswerte aus drei unabhängigen Experimenten in einem Balkendiagramm dargestellt (rechts).

Das lösliche CLEC-2-Protein und das lösliche DC-SIGN-Protein, nicht jedoch das

Kontrollprotein, banden mit hoher Effizienz an 293T Zellen (Abb. 20). Die Expression des HIV-1

NL4-3 Hüllproteins auf 293T Zellen verstärkte wie erwartet die DC-SIGN-Bindung, während

keine Veränderung der Bindung von CLEC-2 gemessen wurde. Schließlich hatte Mannan

keinen Einfluss auf die Interaktion von CLEC-2 mit 293T Zellen, während die DC-SIGN-

Bindung, im Einklang mit publizierten Daten (Geijtenbeek et al., 2000c), durch Mannan inhibiert

wurde. Diese Beobachtungen weisen auf die Expression eines CLEC-2-Liganden auf der

Oberfläche von 293T Zellen hin, welcher von CLEC-2 erkannt wird, unabhängig von der

Modifikation mit Mannose-reichen Glykanen.

2.1 Expression von Podoplanin auf 293T Zellen

Suzuki-Inoue und Kollegen identifizierten kürzlich das zelluläre Protein Podoplanin als

Bindungspartner von CLEC-2 (Suzuki-Inoue et al., 2007). Podoplanin ist ein Typ-I

transmembranes Sialoglykoprotein, das in bestimmten Tumoren exprimiert wird, wie in

44

Ergebnisse

45

spinozellulären Karzinomen (Kato et al., 2005), in kolorektalen Karzinomen (Kato et al., 2003)

und in Kaposi Sarkom-assoziierten Tumoren (Weninger et al., 1999). Podoplanin-Expression

konnte in vivo ebenfalls in lymphatischen Gefäßen nachgewiesen werden (Breiteneder-Geleff et

al., 1999). Welche Zelllinien Podoplanin exprimieren war jedoch nicht ausführlich untersucht

worden. Zur Klärung dieser Frage wurde die Podoplanin-Expression auf verschiedenen

Zelllinien überprüft. Dabei wurden insbesondere Zelllinien untersucht, die für HIV-1-permissiv

sind, wie beispielsweise CEMx174 R5 Zellen und PBMCs. Die Analyse der

Oberflächenexpression mittels FACS zeigte eine deutliche Podoplanin-Expression auf 293T

Zellen, jedoch nicht auf CEMx174 R5 Zellen oder PBMCs (Abb. 21).

100 101 102 103 1040

50100150200250

100 101 102 103 1040

50100150200250

100 101 102 103 1040

50100150200250

Fluoreszenz

Zellz

ahl

293T CEMx174 R5 PBMCs

100 101 102 103 1040

50100150200250

100 101 102 103 1040

50100150200250

100 101 102 103 1040

50100150200250

Fluoreszenz

Zellz

ahl

293T CEMx174 R5 PBMCs

Abbildung 21: Podoplanin-Expression auf 293T Zellen

Die Podoplanin-Expression auf 293T Zellen, CEMx174 R5 Zellen und PBMCs wurde mit einem Podoplanin-spezifischen Antikörper (NZ-1) durch FACS-Analyse nachgewiesen (graue Linie). Die schwarze Fläche stellt das für die Isotyp-Kontrolle erhaltene Signal dar. Das gezeigte Experiment ist repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Vergleichbare Ergebnisse wurden mit dem Podoplanin-spezifischen Antikörper 18H5 erzielt.

2.2 Podoplanin-Überexpression steigert die CLEC-2-Bindung an 293T Zellen

293T Zellen sind für die HIV-Infektion nicht permissiv, wurden jedoch in dieser Arbeit

routinemäßig zur Produktion von HIV-1 eingesetzt. Zunächst sollte daher analysiert werden, ob

die Podoplanin-Expression auf 293T Zellen zur CLEC-2-Bindung beiträgt. Zu diesem Zweck

wurde die Interaktion des CLEC-2-Proteins mit 293T Zellen untersucht, die entweder mit einem

Podoplanin-Expressionsvektor oder einem Kontrollvektor transfiziert wurden (Abb. 22).

Podoplanin-Expression (Abb. 22A) und CLEC-2-Bindung (Abb. 22B) wurden parallel analysiert.

Wie erwartet wurde CLEC-2-Bindung an kontrolltransfizierte 293T Zellen nachgewiesen, die

Bindungseffizienz konnte jedoch durch Expression von exogenem Podoplanin deutlich erhöht

werden (Abb. 22B). Diese Ergebnisse deuten an, dass Podoplanin in der Tat die Bindung von

CLEC-2 an 293T Zellen vermitteln kann; eine Schlußfolgerung die durch nachfolgende

Experimente mit siRNAs bestätigt wurde (siehe Abschnitt 2.3).

Ergebnisse

A)

0

20

40

60

80

100

120

% P

odop

lani

n-E

xpre

ssio

n

Antikörper:

Kontrolle Kontrolle Podoplanin Podoplanin

IgG 18H5 IgG 18H5

100 101 102 103 1040

20406080

100

Zellz

ahl

Fluoreszenz

100 101 102 103 1040

20406080

100

Fluoreszenz

Zellz

ahl

B)

Antikörper:

0

20

40

60

80

100

120

% B

indu

ngan

lösl

iche

sC

LEC

-Fc


IgG-Fc CLEC-2-Fc IgG-Fc CLEC-2-Fc

A)

0

20

40

60

80

100

120

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odop

lani

n-E

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ssio

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Antikörper:


IgG 18H5 IgG 18H5Antikörper:


IgG 18H5 IgG 18H5

100 101 102 103 1040

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100

Zellz

ahl

Zellz

ahl


100 101 102 103 1040

20406080

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Zellz

ahl

Zellz

ahl

B)

Antikörper:

0

20

40

60

80

100

120

% B

indu

ngan

lösl

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sC

LEC

-Fc


IgG-Fc CLEC-2-Fc IgG-Fc CLEC-2-Fc

Abbildung 22: Spezifische CLEC-2-Bindung an humanes Podoplanin

(A) Podoplanin-Expression auf 293T Zellen, die transient mit dem Leervektor bzw. einem Podoplanin-Expressionsvektor transfiziert wurden (links). Die schwarze Fläche bzw. Linie stellt die Isotyp-Kontrolle dar, die dunkelgraue Linie repräsentiert die endogene Podoplanin-Expression, die hellgraue Fläche zeigt die Podoplanin-Expression der mit dem Podoplanin-Expressionsvektor transfizierten 293T Zellen. Das dargestellte Experiment ist repräsentativ für insgesamt vier Experimente. Das Balkendiagramm (rechts) zeigt die Durchschnittswerte aus vier unabhängigen FACS-Auswertungen in Prozent, wobei das geometrische Mittel der Fluoreszenz bestimmt wurde und die Podoplanin-Expression (Nachweis mit 18H5) auf Podoplanin-transfizierten 293T Zellen als Bezugswert auf 100% gesetzt wurde. Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes. (B) FACS-Analyse der Bindung von Podoplanin an das lösliche CLEC-2-Fc Protein (links). Die in (A) verwendeten Zellen wurden mit löslichem CLEC-2-Fc (dunkelgraue Linie und hellgraue Fläche) bzw. mit einem Kontroll-Fc-Protein (schwarze Fläche) für 45 min auf Eis inkubiert und anschließend mit einem Sekundärantikörper gefärbt. Ein repräsentatives aus drei unabhängigen Experimenten ist gezeigt. Das Balkendiagramm (rechts) stellt die CLEC-2-Bindung in Prozent dar, wobei als Bezugswert die CLEC-2-Bindung an Podoplanin-transfizierte 293T Zellen auf 100% gesetzt wurde. Die dargestellten Daten entsprechen dabei den Durchschnittswerten aus drei unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes.

Parallel wurde die Podoplanin-Expression auf CEMx174 R5 Zellen untersucht, die für die HIV-

Infektion permissiv sind. Wie aus Abb. 21 hervorgeht, konnte Podoplanin auf der Oberfläche

dieser Zellen nicht nachgewiesen werden. Interessanterweise wurde jedoch trotz fehlender

Podoplanin-Expression eine Bindung von löslichem CLEC-2 an CEMx174 R5 Zellen beobachtet

(Abb. 23B). Dieses Resultat deutet auf die Expression eines bis dato unbekannten CLEC-2-

Liganden auf CEMx174 R5 Zellen hin.

46

Ergebnisse

47

B)

A)

100 101 102 103 1040

30

60

90

120

Zellz

ahl

100 101 102 103 1040

30

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Fluoreszenz

293T CEMx174 R5

Antikörper:0

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20

30

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50

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100 101 102 103 1040

30

60

90

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Zellz

ahl

293T CEMx174 R5

0

20

40

60

80

100

120

Antikörper: IgG-Fc IgG-FcCLEC-2-Fc CLEC-2-FcFluoreszenz293T CEMx174 R5

293T CEMx174 R5

Geo

met

risch

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B)

A)

100 101 102 103 1040

30

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Zellz

ahl

100 101 102 103 1040

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Fluoreszenz

293T CEMx174 R5

Antikörper:0

10

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100 101 102 103 1040

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Zellz

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293T CEMx174 R5

0

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100

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Antikörper: IgG-Fc IgG-FcCLEC-2-Fc CLEC-2-FcFluoreszenz293T CEMx174 R5

293T CEMx174 R5

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100 101 102 103 1040

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Zellz

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100 101 102 103 1040

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60

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120

Fluoreszenz

293T CEMx174 R5

Antikörper:0

10

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IgG IgG18H5 18H5

100 101 102 103 1040

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100 101 102 103 1040

30

60

90

120

Zellz

ahl

Zellz

ahl

293T CEMx174 R5

0

20

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80

100

120

Antikörper: IgG-Fc IgG-FcCLEC-2-Fc CLEC-2-FcFluoreszenzFluoreszenz293T CEMx174 R5293T CEMx174 R5

293T CEMx174 R5293T CEMx174 R5

Geo

met

risch

esM

ittel

der

Fluo

resz

enz

Abbildung 23: Bindung von löslichem CLEC-2 an CEMx174 R5 Zellen

(A) Podoplanin-Expression auf 293T bzw. CEMx174 R5 Zellen. Der Nachweis der Expression von Podoplanin auf der Zelloberfläche erfolgte mit dem Podoplanin-spezifischen Antikörper 18H5 (graue Linie). Die schwarze Fläche stellt die Isotyp-Kontrolle dar. Aus den links gezeigten FACS-Daten wurde das geometrische Mittel der Fluoreszenz (GMCF) bestimmt und in einem Balkendiagramm dargestellt (rechts). Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment aus insgesamt vier Experimenten. (B) Bindung von löslichem CLEC-2-Fc Protein. Die in (A) verwendeten Zellen wurden mit dem Kontroll-IgG-Fc Protein (schwarze Fläche) bzw. mit löslichem CLEC-2-Fc Protein (hellgraue Fläche) inkubiert und anschließend mit einem Cy5-gekoppelten Sekundärantikörper gefärbt. Aus den FACS-Daten (links) wurden die GMCF-Werte bestimmt und in einem Balkendiagramm dargestellt (rechts).

2.3 siRNA-vermittelte Suppression der Podoplanin-Expression

Die für die bisherigen Experimente verwendeten HI-Viren wurden, wenn nicht anders

beschrieben, in 293T Zellen generiert, welche Podoplanin auf der Zelloberfläche exprimieren.

Dies legte die Vermutung nahe, dass bei der Freisetzung der Viren Podoplanin in die virale

Hüllmembran eingelagert wurde, welches zur Bindung von HIV-1 an CLEC-2-exprimierende

Zelllinien und Thrombozyten beitrug. Es wurde daher analysiert, ob eine Reduktion der

Podoplanin-Expression mit einer Reduktion der CLEC-2-vermittelten HIV-1-Transmission

einhergeht.

Zu diesem Zweck wurden vier Podoplanin-spezifische siRNAs generiert, die in den retroviralen

pSIREN-RetroQ-EGFP-Vektor (Clontech Laboratories, Inc.) kloniert wurden. Dieser auf dem

Murinen-Leukämie-Virus (MLV) basierende, selbst-inaktivierende retrovirale Vektor verfügt über

5’- und 3’-LTRs, die eine Insertionsstelle für siRNA-kodierende Sequenzen sowie das Gen für

den Selektionsmarker Puromycin flankieren. Zusätzlich enthält dieser Vektor ein

Ergebnisse

Verpackungssignal, welches den Einbau der RNA in virale Kapside vermittelt, sowie ein

Reporter-Gen, welches für das GFP kodiert und die Überprüfung der Transduktionseffizienz

erlaubt.

Um die Wirksamkeit der vier ausgesuchten siRNAs zu testen, wurden die entsprechenden

Vektoren in 293T Zellen transfiziert. Als Kontrolle diente eine siRNA, die zwar eine

Hairpinstruktur ausbildet, aber keine Sequenzhomologie zu zellulären oder viralen Genen

aufweist (nonsense siRNA, ns siRNA). Der Einfluss der siRNAs auf die Podoplanin-Expression

wurde anhand von FACS-Analysen quantifiziert (Abb. 29A). Das geometrische Mittel der

Fluoreszenz (GMCF) wurde bestimmt und die Reduktion der Podoplanin-Expression in Prozent

in einem Balkendiagramm dargestellt. Dabei wurden die mit der ns siRNA erhaltenen

Ergebnisse als Bezugswert auf 100% gesetzt (Abb. 29B). Eine effiziente Reduktion der

Podoplanin-Expression auf der Oberfläche von 293T Zellen wurde durch siRNA 137 erzielt.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

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trolle

Moc

k

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A

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bezo

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nse

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NA

siR

NA

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siR

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220

siR

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B)

A) siRNA 167

Kontrolle Mock Nonsense siRNA Podoplanin siRNA

Zellz

ahl

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Fluoreszenz

100 101 102 103 1040

50

100

150

200

100 101 102 103 1040

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200

100 101 102 103 1040

50

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150

200

100 101 102 103 1040

50

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150

200

0

20

40

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B)

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B)

A) siRNA 167


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ahl


Fluoreszenz

100 101 102 103 1040

50

100

150

200

100 101 102 103 1040

50

100

150

200

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50

100

150

200

100 101 102 103 1040

50

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Zellz

ahl


Fluoreszenz

100 101 102 103 1040

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100 101 102 103 1040

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100 101 102 103 1040

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200siRNA 167


Zellz

ahl


Fluoreszenz

100 101 102 103 1040

50

100

150

200

100 101 102 103 1040

50

100

150

200

100 101 102 103 1040

50

100

150

200

100 101 102 103 1040

50

100

150

200

Abbildung 24: Die siRNA-vermittelte Reduktion der endogenen Podoplanin-Expression auf 293T Zellen

(A) 293T Zellen wurden transient mit Vektoren transfiziert, die für Podoplanin-spezifische siRNAs bzw. für eine nonsense siRNA (ns siRNA) kodieren, und die endogene Podoplanin-Expression auf der Zelloberfläche mittels FACS analysiert. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment aus insgesamt drei unabhängigen FACS-Experimenten. (B) Das Balkendiagramm zeigt die Auswirkung der einzelnen siRNAs auf die endogene Podoplanin-Expression. Dargestellt sind die Durchschnittswerte aus drei unabhängigen Experimenten, wobei als Bezugsgröße die Podoplanin-Expression der mit ns siRNA transfizierten 293T Zellen auf 100% gesetzt wurde. Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes.

48

Ergebnisse

49

2.4 Die CLEC-2-vermittelte HIV-1-Trans-Infektion korreliert mit der Podoplanin- Expression auf der Oberfläche virusproduzierender Zellen

Die Podoplanin-Expression auf 293T Zellen wurde durch die transiente Expression der siRNA

137 um etwa 50% reduziert (Abb. 24). Es sollte untersucht werden, ob eine Verminderung der

Podoplanin-Expression auch mit einer Reduktion der CLEC-2-vermittelten HIV-1-Trans-

Infektion einhergeht. Hierzu wurden Podoplanin-positive 293T Zellen stabil mit Vektoren

transduziert, die für siRNA 137 bzw. ns siRNA kodierten. Für die Transduktionsexperimente

wurden Viren mit Hilfe der Verpackungszelllinie GP2-293 (Clontech Laboratories, Inc.)

hergestellt und die Transduktionseffizienz durch Analyse der Expression von EGFP in

transduzierten Zellen bestimmt. Es wurde eine homogene Expression von EGFP beobachtet

(Abb. 25B). Nach Expression der siRNA 137, nicht jedoch der ns siRNA, wurde eine deutliche

Reduktion der Podoplanin-Expression auf der Zelloberfläche gemessen (Abb. 25A).

A)

B)

Fluoreszenz

Zellz

ahl

Fluoreszenz

Zellz

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0

50

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100 101 102 103 1040

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A)

B)

Fluoreszenz

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Fluoreszenz

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50

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200250

Abbildung 25: Reduktion der Podoplanin-Expression durch siRNA-Expression in 293T Zellen

(A) 293T Zellen wurden mit Vektoren transduziert, die für siRNA gegen Podoplanin bzw. nonsense siRNA (ns siRNA) kodieren. Die Podoplanin-Expression auf der Oberfläche der transduzierten 293T Zellen wurde zwei Wochen nach Transduktion unter Verwendung des Podoplanin-spezifischen Antikörpers 18H5 mittels FACS analysiert (links). Das Diagramm rechts zeigt die siRNA-vermittelte Reduktion der Podoplanin-Expression in transduzierten 293T Zellen. Hierzu wurde aus den links gezeigten FACS-Daten das geometrische Mittel der Fluoreszenz (GMCF) bestimmt und die Werte der ns siRNA-exprimierenden Zellen als Bezugswert auf 100% gesetzt. (B) Als Kontrolle für die erfolgreiche Transduktion wurden die Zellen aus (A) auf die Expression von EGFP hin mittels FACS untersucht (links). Das Balkendiagramm rechts zeigt die EGFP-Expression in den transduzierten Zellen. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung vom Mittelwert.

Ergebnisse

Die stabil siRNA-exprimierenden 293T Zellen wurden anschließend für die Virusproduktion

eingesetzt. Der Einbau von Podoplanin in die resultierenden Viren konnte aufgrund mangelnder

Sensitivität des Western Blot-Nachweises nicht bestimmt werden (Daten nicht gezeigt).

Allerdings zeigten Zellen, die stabil siRNA 137 exprimierten, eine im Vergleich zu den

Kontrollzellen deutlich verminderte Bindung an lösliches CLEC-2 (Abb. 26). Diese Ergebnisse

weisen darauf hin, dass die Podoplanin-Expression ausreichend reduziert war, um die Bindung

an den natürlichen Liganden zu vermindern.

100 101 102 103 1040

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ns siRNA ns siRNA siRNA 137

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Antikörper Kontrolle 18H5 18H5

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ns siRNA siRNA 137ns siRNA

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B)

Zellz

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Zellz

ahl

Protein: Kontrolle CLEC-2-Fc CLEC-2-Fc

Abbildung 26: Reduktion der Podoplanin-Expression durch siRNA-Expression korreliert mit einer reduzierten Bindung an CLEC-2

293T Zellen wurden mit Vektoren, die für Podoplanin-spezifische siRNA bzw. nonsense siRNA (ns siRNA) kodieren, transduziert und auf Podoplanin-Expression (A) bzw. CLEC-2-Bindung (B) überprüft. Hierzu wurden die transduzierten Zellen mit dem Podoplanin-spezifischen Antikörper 18H5 bzw. CLEC-2-Fc für 45 min auf Eis inkubiert, gewaschen, mit einem sekundären Cy-5-gekoppelten Antikörper gefärbt und mittels FACS analysiert. Die Balkendiagramme (rechts) zeigen die siRNA-vermittelte Reduktion der Podoplanin-Expression (A) bzw. die CLEC-2 Bindung (B) an transduzierte 293T Zellen. Hierzu wurde aus den links gezeigten FACS-Daten das geometrische Mittel der Fluoreszenz aus insgesamt drei Experimenten bestimmt und die Werte der ns siRNA-exprimierenden Zellen als Bezugswert auf 100% gesetzt. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung vom Mittelwert.

Viren, die in siRNA 137- bzw. ns siRNA-exprimierenden Zellen generiert wurden, wurden auf

vergleichbaren Kapsid (p24)-Gehalt hin normalisiert und für Trans-Infektions-Experimente

eingesetzt. Eine Reduktion der Podoplanin-Expression in Virus-produzierenden Zellen führte zu

einer deutlich verminderten CLEC-2-vermittelten Trans-Infektion. Die Trans-Infektion durch DC-

SIGN-exprimierende Zellen wurde hingegen nicht beeinflusst (Abb. 27A). Die Analyse der HIV-

1-Transmission durch Thrombozyten lieferte vergleichbare Ergebnisse (Abb. 27B). Diese Daten

zeigen, dass mit hoher Wahrscheinlichkeit die Bindung von Podoplanin in der viralen

50

Ergebnisse

51

Hüllmembran an CLEC-2 auf Zelllinien bzw. Thrombozyten für die CLEC-2-vermittelte HIV-1-

Transmission verantwortlich ist.

A)

0

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NL4-3 NL4-3 ns siRNA NL4-3 siRNA 137NL4-3NL4-3 NL4-3 ns siRNANL4-3 ns siRNA NL4-3 siRNA 137NL4-3 siRNA 137


Abbildung 27: Die siRNA-vermittelte Reduktion der CLEC-2-Expression in virusproduzierenden Zellen interferiert mit der CLEC-2-abhängigen Trans-Infektion

Für die Virusproduktion (HIV-1 NL4-3) wurden mit ns siRNA bzw. siRNA 137 transduzierte 293T Zellen verwendet. Die B-THP Zellen mit den entsprechenden Lektinen (A) bzw. die Thrombozyten (B) wurden mit 10 ng Virus für 3 h bei 37°C inkubiert. Ungebundene Viren wurden durch Waschen entfernt und anschließend mit CEMx174 R5 Zellen kokultiviert. Nach 72 h wurde die Luziferase-Aktivität in den Zelllysaten bestimmt. Das Balkendiagramm zeigt die Durchschnittswerte aus drei unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes.

2.5 Podoplanin-Expression auf HIV-infizierten CEMx174 R5 Zellen

Expressionsanalysen (siehe Abb. 21) zeigten, dass 293T Zellen relative hohe Mengen an

Podoplanin exprimieren. Diese Zellen wurden für die Virusproduktion eingesetzt, sind aber für

HIV nicht permissiv. Im Gegensatz dazu wurde auf CEMx174 R5 Zellen und PBMCs, in denen

HIV repliziert, keine Podoplanin-Expression nachgewiesen (Abb. 21). Dennoch vermittelte

CLEC-2 die Trans-Infektion von Viren, die in CEMx174 R5 Zellen oder PBMCs hergestellt

wurden (Abb. 13). Diese Ergebnisse können wie folgt interpretiert werden: Entweder induziert

die HIV-1-Infektion die Podoplanin-Expression in CEMx174 R5 Zellen und PBMCs, und/oder

diese Zellen exprimieren einen bis dato unbekannten CLEC-2-Liganden. Die effiziente Bindung

von löslichem CLEC-2 an CEMx174 R5 Zellen (Abb. 23) deutet auf letztere Möglichkeit hin.

Dennoch wurde auch untersucht, ob die HIV-1-Infektion die Podoplanin-Expression in

CEMx174 R5 bzw. PBMCs induziert. Hierzu wurden CEMx174 R5 Zellen, die unter Kontrolle

der viralen LTRs das Luziferase-Gen bzw. das Gen für GFP exprimierten, mit NL4-3 bzw. mit

Pseudotypen, die das Hüllprotein des vesikulären Stomatitis-Virus (VSV-G) trugen, infiziert. Die

Zellen wurden 72 h nach Infektion mit einem Podoplanin-spezifischen Antikörper (18H5) bzw.

Ergebnisse

mit einem Kontrollantikörper gleichen Isotyps gefärbt und die Podoplanin-Expression mittels

FACS analysiert.

A)

% P

odop

lani

n-ex

prim

iere

nde

infiz

iert

eC

EMx1

74 R

5 Z

elle

n

Virus:

Antikörper:

- -

Kontrolle Kontrolle

VSV-G

18H5 18H5

VSV-G NL4-3

Kontrolle 18H5

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0

10

20

30

40

50

60

NL4-3 uninfiziert VSV-G NL4-3

% T

ote

Zelle

n

B)A)

% P

odop

lani

n-ex

prim

iere

nde

infiz

iert

eC

EMx1

74 R

5 Z

elle

n

Virus:

Antikörper:

- -

Kontrolle Kontrolle

VSV-G

18H5 18H5

VSV-G NL4-3

Kontrolle 18H5

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0

10

20

30

40

50

60

NL4-3 uninfiziert VSV-G NL4-3

% T

ote

Zelle

n

B)

Abbildung 28: Podoplanin-Expression auf HIV-infizierten Zellen

Podoplanin-Expression auf infizierten CEMx174 R5 Zellen. CEMx174 R5 Zellen wurden mit VSV-G Pseudotypen oder NL4-3 infiziert und die Podoplanin-Expression mit einem Podoplanin-spezifischen Antikörper (18H5) 72 h nach Infektion im FACS-Gerät analysiert. Die Prozentzahl der infizierten Podoplanin-exprimierenden Zellen ist in (A) dargestellt. Der Anteil der toten Zellen in den in (A) gezeigten Kulturen wurde mit Hilfe eines entsprechenden Gates ermittelt und ist in (B) dargestellt. Gezeigt sind die Durchschnittswerte aus sieben unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes.

Die FACS-Daten ergaben erste präliminäre Hinweise darauf, dass Podoplanin möglicherweise

auf der Oberfläche von toten Zellen exprimiert wird (Abb. 28 und Daten nicht gezeigt). Die

Anzahl der toten Zellen in den infizierten Kulturen korrelierte mit der Effizienz des infektiösen

Eintritts (Abb. 28), jedoch stellten die Podoplanin- und HIV-positiven Zellen nur eine kleine

Untermenge der Gesamtpopulation der infizierten Zellen dar. Weitere Analysen müssen nun

zeigen, ob die Bindung des Podoplanin-Antikörpers an tote Zellen spezifisch ist oder auf eine, in

der Literatur bereits dokumentierte, unspezifische Bindung von Antikörpern durch tote Zellen

zurückzuführen ist (Maecker et al., 2005; O'Brien and Bolton, 1995; Perfetto et al., 2004;

Schmid et al., 1999).

52

Diskussion

F) Diskussion

1. DC-SIGN und CLEC-2 vermitteln die Interaktion von Thrombozyten mit HIV-1

Thrombozyten sind kernlose Zellen im Blut, die sich von Megakaryozyten abschnüren und für

die Hämostase wichtig sind. Es wurde beschrieben, dass Thrombozyten mit Pathogenen wie

Hepatitis C-Viren (HCV) (Pugliese et al., 2004) und Staphylococcus aureus (Youssefian et al.,

2002) interagieren. Weiterhin konnte demonstriert werden, dass Thrombozyten HIV-1

aufnehmen und dass eine substantielle Menge der HI-Viren im Blut infizierter Patienten an

Thrombozyten gebunden vorliegt (Lee et al., 1998). Die experimentell induzierte Anheftung von

HIV an Thrombozyten steigert die virale Infektiosität (Rusert et al., 2004), und eine Korrelation

zwischen der Thrombozytenzahl und der AIDS-Progression wurde beschrieben (Miguez-

Burbano et al., 2005; Scaradavou, 2002). Die Interaktion von HIV mit Thrombozyten könnte

daher die Ausbreitung des HI-Virus im Körper infizierter Patienten beeinflussen. Die

Mechanismen, die die Anheftung von HIV-1 an Thrombozyten fördern, waren jedoch unklar. Im

Rahmen dieser Arbeit wurde die Interaktion von HIV-1 mit Thrombozyten auf molekularer und

funktioneller Ebene analysiert. Hierbei konnte CLEC-2 als neuer zellulärer Anheftungsfaktor für

HIV-1 identifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass CLEC-2 auf Thrombozyten

exprimiert wird, und dass Thrombozyten die Trans-Infektion von CD4-positiven Zielzellen in

einer partiell CLEC-2-abhängigen Weise vermitteln. Die Untersuchungen demonstrierten

weiterhin, dass Thrombozyten das DC-SIGN-Protein exprimieren, und dass DC-SIGN

wesentlich zur Bindung von HIV-1 an Thrombozyten beiträgt. Die DC-SIGN- und CLEC-2-

abhängige Bindung von HIV-1 an Thrombozyten konservierte die virale Infektiosität über

mehrere Tage und könnte somit die Ausbreitung des Virus im Wirt fördern.

Das kalziumabhängige C-Typ-Lektin-ähnliche Protein CLEC-2 (C-type lectin like receptor) ist

ein Typ-II Transmembranprotein mit einem Molekulargewicht von 33 kDa (Colonna et al., 2000).

Anhand von Sequenzanalysen wurden vier Domänen identifiziert: eine N-terminale,

zytoplasmatische 31 Aminosäuren umfassende Domäne, gefolgt von einer

Transmembrandomäne, einer Neck-Region und einer putativen Karbohydrat-

erkennungsdomäne (CRD). Die CRD enthält sechs Cysteinreste, die zwischen C-Typ Lektinen

hochkonserviert sind (Colonna et al., 2000). Allerdings fehlt das Aminosäuremotiv, das für die

Kalzium-Komplexierung verantwortlich ist. Dies lässt darauf schließen, dass die Bindung von

CLEC-2 an Liganden möglicherweise Karbohydrat-unabhängig erfolgt (Colonna et al., 2000). In

der Tat konnte gezeigt werden, dass CLEC-2 das Schlangengift Rhodozytin unabhängig von

dessen Glykosylierung bindet (Christou et al., 2008).

53

Diskussion

CLEC-2 und DC-SIGN vermittelten die HIV-1-Trans-Infektion von permissiven Zellen.

Inhibitionsexperimente zeigten, dass CLEC-2 auf Thrombozyten für etwa 50% der

Thrombozyten-vermittelten HIV-1-Trans-Infektion verantwortlich ist (Abb. 12). Im Gegensatz

dazu konnte die Trans-Infektion durch das Mannose-Polymer Mannan, das die

Ligandenbindung an DC-SIGN blockiert (Geijtenbeek et al., 2000c), um bis zu 80% reduziert

werden (Abb. 17). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Megakaryozyten (Boukour et al.,

2006) und Thrombozyten DC-SIGN exprimieren (Abb. 16) und dass DC-SIGN-spezifische

Antikörper die Thrombozyten-vermittelte HIV-1-Trans-Infektion mit ähnlicher Effizienz blockieren

wie Mannan (Abb. 17). Vergleichbare Resultate wurden durch Boukour S. und Kollegen

beschrieben (Boukour et al., 2006). Allerdings wurde in dieser Studie DC-SIGN nur auf einer

Untermenge der Thrombozyten nachgewiesen, was den Immunfluoreszenzdaten, jedoch nicht

den FACS-Daten entspricht, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit erhoben wurden (Abb. 16).

Der Grund für diese Diskrepanz ist gegenwärtig unklar, könnte jedoch auf unterschiedliche

Affinitäten der verwendeten Antikörper zurückzuführen sein. Zusammenfassend exprimieren

Thrombozyten sowohl DC-SIGN als auch CLEC-2. Die HIV-1-Anheftung an diese Zellfragmente

wird im Wesentlichen durch DC-SIGN vermittelt, CLEC-2 dagegen spielt eine geringere Rolle.

Das C-Typ Lektin DC-SIGN wird auf dendritischen Zellen (Geijtenbeek et al., 2000d) sowie auf

bestimmten Makrophagen (Granelli-Piperno et al., 2005), B-Lymphozyten (Rappocciolo et al.,

2006b) und, wie in der vorliegenden Studie gezeigt, auf Thrombozyten exprimiert. DC-SIGN

bindet an Mannose- und Fukosereste (Feinberg et al., 2001) und fungiert als Anheftungsfaktor

für verschiedene virale und nicht-virale Pathogene (Alvarez et al., 2002; Bergman et al., 2004;

de Witte et al., 2006; Halary et al., 2002; Pohlmann et al., 2003; Tassaneetrithep et al., 2003;

van Kooyk et al., 2003). DC-SIGN vermittelt die HIV-Trans-Infektion und es wurde postuliert,

dass die DC-SIGN-abhängige Bindung von HIV-1 an dendritische Zellen bei der sexuellen

Übertragung von HIV eine wichtige Rolle spielt (Geijtenbeek et al., 2000c). Laut der

Modellvorstellung könnten dendritische Zellen sexuell übertragenes HIV via DC-SIGN binden, in

lymphoides Gewebe einwandern und dort das Virus DC-SIGN-abhängig auf T-Zellen

übertragen (Geijtenbeek et al., 2000c). Dieser Mechanismus ist jedoch umstritten, da neuere

Arbeiten zeigen, dass die Bindung von HIV an DC-SIGN auf dendritischen Zellen verschiedene

Konsequenzen haben kann (Burleigh et al., 2006; Nobile et al., 2005; Turville et al., 2004). Der

Hauptteil der Viren wird endozytiert, degradiert und virale Proteinkomponenten werden via MHC

präsentiert (Moris et al., 2004; Moris et al., 2006). Ein kleiner Anteil der Viren entkommt jedoch

der lysosomalen Degradation. Diese Viren können entweder zu einer produktiven Infektion der

dendritischen Zellen führen oder sie werden an benachbarte T-Zellen weitergegeben (Burleigh

et al., 2006; Geijtenbeek et al., 2000c). Kürzlich veröffentlichte Studien zeigen weiterhin, dass

die Bindung von gp120 an DC-SIGN auf dendritischen Zellen die Produktion von IL-10 stimuliert

(Gurney et al., 2005; Shan et al., 2007; Gringhuis et al., 2007). Die dadurch induzierten

54

Diskussion

Signaltransduktionsereignisse bewirken, dass die dendritischen Zellen eine unvollständige

Reifung durchlaufen und in einem Stadium verharren, in dem sie die HIV-1-Trans-Infektion

effizient fördern können (Cunningham et al., 2007; Gringhuis et al., 2007; Hodges et al., 2007).

DC-SIGN könnte also auf verschiedene Weisen auf die HIV-Ausbreitung Einfluss nehmen. Es

sind daher weitere Studien notwendig, um den Beitrag von DC-SIGN zur HIV-Ausbreitung

genau zu definieren.

Bestehen Ähnlichkeiten zwischen der DC-SIGN-vermittelten Interaktion von HIV mit

dendritischen Zellen und Thrombozyten? DC-SIGN auf Zelllinien und dendritischen Zellen

vermittelt die Internalisierung von HIV-Partikeln (Kwon et al., 2002). Im Gegensatz zu einem

initial aufgestellten Postulat (Geijtenbeek et al., 2000c) trägt die DC-SIGN-abhängige Aufnahme

von HIV jedoch wahrscheinlich nicht zur Trans-Infektion bei (Burleigh et al., 2006; Nobile et al.,

2005; Turville et al., 2004). Die (DC-SIGN-unabhängige) Aufnahme von Viren in dendritischen

Zellen kann dennoch für die virale Ausbreitung wichtig sein, denn es wurde gezeigt, dass Viren

an der Schnittstelle zwischen dendritischer Zelle und T-Zelle, der sogenannten infektiösen

Synapse, konzentriert und effizient an die T-Zelle weitergegeben werden (Arrighi et al., 2004;

McDonald et al., 2003). Interessanterweise vermittelt DC-SIGN die Aufnahme von HIV-1 in

Thrombozyten (Boukour et al., 2006). Dabei wurden sowohl intakte als auch degradierte

Partikel in Thrombozyten nachgewiesen. Intakte Viren waren in Vesikeln nahe der

Plasmamembran lokalisiert, während degradierte Viren im kanalikulären System detektiert

wurden, wo sie mit alpha-Granula, die antipathogene Substanzen wie z.B. CCL5 enthalten, in

Kontakt kommen (Boukour et al., 2006; Holme et al., 1998). Das Schicksal der intakten

endozytierten Viren ist jedoch unklar. Möglich wäre, dass die internalisierten Partikel in den

Thrombozyten nach Kontakt mit T-Zellen an die Oberfläche transportiert und auf die T-Zellen

übertragen werden, analog zur Ausbildung einer infektiösen Synapse zwischen dendritischer

Zelle und T-Zelle. Allerdings spricht die Beobachtung, dass die Anheftung von HIV an

Thrombozyten die Viren nicht vor der Neutralisation durch den Antikörper 2G12 schützt (Abb.

18) gegen diese Hypothese. So muss gegenwärtig davon ausgegangen werden, dass DC-

SIGN-positive dendritische Zellen und Thrombozyten die Trans-Infektion von Viren vermitteln,

die an der Zelloberfläche lokalisiert sind. Während DC-SIGN die Internalisierung von HIV-1 in

Thrombozyten fördert, ist dies nach Bindung an CLEC-2 nicht zu erwarten. Die Bindung von

CLEC-2 an Liganden löst eine Signalkaskade aus, die die Aktivierung und Aggregation von

Thrombozyten bewirkt (Suzuki-Inoue et al., 2006). Die Hauptfunktion von CLEC-2 ist daher

möglicherweise die Signaltransduktion, für eine Rolle als Rezeptor für die Antigen-Aufnahme

gibt es gegenwärtig keine eindeutigen Hinweise. Im Einklang dazu zeigen vorläufige

Ergebnisse, dass eine Deletion der zytoplasmatischen Domäne des CLEC-2-Moleküls die

Transmission von HIV-1 nicht beeinflusst (Daten nicht gezeigt). Möglicherweise sind daher

55

Diskussion

weder eine mögliche Internalisierung noch die Signaltransduktion für die HIV-Transmission

wichtig.

CLEC-2 und DC-SIGN vermitteln die Trans-Infektion von permissiven Zellen. Bindungsstudien

zeigten jedoch, dass sich diese Faktoren fundamental in ihrer Interaktion mit HIV-1

unterscheiden. DC-SIGN interagierte mit dem HIV-1-Hüllprotein gp120 (Abb. 10), und die

Bindung von Virionen an DC-SIGN war von der Präsenz des viralen Hüllproteins abhängig

(Abb. 10). Im Gegensatz dazu konnte keine Bindung von CLEC-2 an das virale Hüllprotein

gp120 gemessen werden, und Viren mit bzw. ohne Hüllprotein interagierten mit vergleichbarer

Effizienz mit CLEC-2. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass CLEC-2 nicht an das HIV-1-

Hüllprotein bindet (Abb. 10), sondern wahrscheinlich mit einem bis dato unbekannten zellulären

Faktor interagiert, der bei der Freisetzung des Virus aus der infizierten Zelle in die virale

Hüllmembran inkorporiert wird. Die Inkorporation zellulärer Faktoren in die retrovirale Hülle ist

bereits bekannt (Tremblay et al., 1998); so konnte gezeigt werden, dass verschiedene zelluläre

Proteine wie MHC-I, MHC-II und ICAM-1 in die HIV-Hüllmembran inkorporiert werden (Cantin et

al., 2005). Exprimieren HIV-Zielzellen die natürlichen Liganden dieser Proteine, so kann die

Interaktion zwischen den Rezeptoren auf der Virusoberfläche und den Liganden auf der

Oberfläche von Zielzellen die virale Anheftung und Infektiosität steigern. ICAM-1 beispielsweise

weist eine hohe Affinität zu seinem Liganden LFA-1 auf und der Einbau von ICAM-1 in HIV-1-,

HIV-2- und SIV-Partikel steigert die virale Infektiosität für LFA-1-exprimierende Zielzellen

(Cantin et al., 2005). Im Rahmen dieser Arbeit wurden vorwiegend transfizierte 293T Zellen für

die Produktion von HIV-1 eingesetzt. Um auszuschließen, dass sich die CLEC-2-vermittelte

Transmission auf Viren beschränkt, die in diesen Zellen generiert wurden, wurde ebenfalls die

CLEC-2-Interaktion mit HIV-1-Präparationen untersucht, die in CEMx174 R5 Zellen und PBMCs

generiert wurden. Auch diese Viren wurden durch CLEC-2 auf Zielzellen übertragen (Abb. 13),

demnach muss ein zellulärer Faktor, der durch CLEC-2 gebunden wird, auch auf diesen Zellen

exprimiert werden. Interessanterweise variierte die Effizienz der CLEC-2-Bindung jedoch

zwischen den verschiedenen HIV-1-Isolaten. Es muss daher postuliert werden, dass die

Effizienz der Inkorporation der relevanten zellulären Faktoren vom jeweiligen Isolat abhängt. In

der Tat konnte gezeigt werden, dass verschiedene HIV-Stämme zelluläre Proteine mit

unterschiedlicher Effizienz in die virale Hüllmembran inkorporieren (Cantin et al., 1996). Die

Analyse der CLEC-2-abhängigen Transmission mit einer größeren Anzahl an HIV-1, HIV-2 und

SIV-Isolaten und Laborstämmen ist notwendig, um die Hypothese der isolatspezifischen

Inkorporation zu überprüfen. Schließlich ist anzumerken, dass DC-SIGN und CLEC-2 die Trans-

Infektion von HIV-1 vermittelten, jedoch nur DC-SIGN in der Lage war, die Cis-Infektion von

Ebolavirus (EBOV)- bzw. SARS-Pseudotypen zu verstärken. Es ist daher möglich, dass der

CLEC-2-Ligand (oder die Liganden) in Abhängigkeit des viralen Hüllproteins in Virus-Partikel

inkorporiert wird, oder dass die Interaktion von CLEC-2 mit Liganden zur Ausbildung von

56

Diskussion

sogenannten infektiösen Synapsen zwischen Transmitter- und Zielzelle beiträgt, die für die

Trans-Infektion wichtig sind.

Bei etwa 30% der HIV-infizierten Patienten wird eine Thrombozytopenie (Thrombozytenzahl

unter 150.000 Thrombozyten/µl Blut) beobachtet, eine der häufigsten Komplikationen, die mit

der HIV-Infektion einhergehen (Harbol et al., 1994; Miguez-Burbano et al., 2005; Scaradavou,

2002). Die Reduktion der Thrombozytenzahl in HIV-1-infizierten Patienten ist unter anderem auf

die verringerte Produktion von Thrombozyten durch infizierte Megakaryozyten zurückzuführen

(Chelucci et al., 1998; Scaradavou, 2002; Boukour et al., 2006; Louache et al., 1991; Monte et

al., 1992). Diese Zellen exprimieren den CD4-Rezeptor und die Korezeptoren CXCR4 und

CCR5 auf ihrer Oberfläche und sind daher für den infektiösen Eintritt von HIV empfänglich

(Scaradavou, 2002). Inwieweit DC-SIGN und CLEC-2 die Cis-Infektion von Megakaryozyten

fördern und damit zur Ausbildung einer Thrombozytopenie beitragen, ist gegenwärtig noch

unklar. CLEC-2 wird auf den megakaryozytischen Zelllinien DAMI und HEL exprimiert und ist an

der HIV-1-Trans-Infektion durch diese Zelllinien beteiligt (Abb. 11 und Daten nicht gezeigt). Es

ist daher möglich, dass CLEC-2 zur Infektion von Megakaryozyten mit HIV beiträgt. In den

multivesikulären Einschlusskörperchen der Megakaryozyten konnte eine Akkumulation von HIV-

1-Partikeln nachgewiesen werden (Boukour et al., 2006). Diese Internalisierung der HIV-Partikel

durch Megakaryozyten schützt die Viren vor dem Immunsystem. Megakaryozyten durchlaufen

mehrere Endomitosen, die eine Integration des viralen Genoms in HIV-1-infizierten

Megakaryozyten fördern (Dolzhanskiy et al., 1996). Dies könnte unter anderem zur

Reduzierung der Thrombozytenzahl beitragen.

Zusammenfassend konnte CLEC-2 als ein neuer zellulärer Anheftungsfaktor für HIV-1

identifiziert werden, welcher die Bindung und Transmission von HIV-1 an CD4-positive Zellen

fördert. Die Interaktion von HIV mit Thrombozyten wird durch die Anheftungsfaktoren DC-SIGN

und CLEC-2 vermittelt. Die an Thrombozyten gebundenen Viren verbleiben für mehrere Tage

infektiös; Thrombozyten könnten daher die HIV-Disseminierung in infizierten Patienten fördern.

2. Einfluss von Podoplanin auf die CLEC-2-vermittelte Transmission von HIV-1

Das Schlangentoxin Rhodozytin, das aus der malaysischen Mokassinschlange isoliert wird, ist

ein natürlicher Ligand von CLEC-2 (Suzuki-Inoue et al., 2006). Rhodozytin bindet mit hoher

Effizienz an CLEC-2 auf Thrombozyten und induziert eine Syc-vermittelte Signaltransduktion,

die die Aggregation dieser Zellfragmente bewirkt. Kürzlich konnten Suzuki-Inoue und Kollegen

den zellulären Faktor Podoplanin als CLEC-2-Liganden identifizieren (Suzuki-Inoue et al.,

2007). Podoplanin wird hauptsächlich auf Tumorzellen exprimiert und löst, ähnlich wie

57

Diskussion

Rhodozytin, nach Bindung an CLEC-2 die Aktivierung und die darauf folgende Aggregation von

Blutplättchen aus (Kato et al., 2007; Suzuki-Inoue et al., 2006; Suzuki-Inoue et al., 2007).

Podoplanin wurde erstmals 1997 auf der Oberfläche von glomerulären Ratten-Epithelzellen

(Podozyten) beschrieben (Breiteneder-Geleff et al., 1997). Auf molekularer Ebene handelt es

sich bei Podoplanin um ein Typ-I transmembranes Sialoglykoprotein von 43 kDa, welches eine

extrazelluläre Domäne mit O-Glykosylierungsmotiven, eine Transmembrandomäne und eine

zytoplasmatische Domäne mit einer putativen Phosphorylierungsstelle enthält (Kaneko et al.,

2006). Podoplanin spielt bei der Entstehung von lymphatischen Gefäßen eine entscheidende

Rolle (Breiteneder-Geleff et al., 1999; Schacht et al., 2003) und dient als wichtiger Marker zur

Unterscheidung von Lymph- und Blutgefäßendothelzellen (Breiteneder-Geleff et al., 1999).

Außerdem wird Podoplanin auf verschiedenen Tumorzellen exprimiert, insbesondere auf

Kaposi Sarkom-assoziierten Tumoren (Weninger et al., 1999), spinozellulären Karzinomen

(Kato et al., 2005), kolorektalen Karzinomen (Kato et al., 2003) und Hirntumoren, wobei

Podoplanin auf Tumorzellen als Thrombozyten-Aggregationsfaktor fungiert (Kato et al., 2003).

Die durch Podoplanin aggregierten Thrombozyten schützen die Tumorzelle(n) vor dem

Immunsystem und fördern so deren Verbreitung durch die Blutbahn (Kunita et al., 2007;

Mishima et al., 2006; Kato et al., 2007).

Frühere Studien zeigten Podoplanin-mRNA-Expression auf den Zelllinien MG63 und Saos-2

(humane Osteosarkom Zelllinien) (Hantusch et al., 2007). Im Rahmen dieser Arbeit wurde

Podoplanin auch auf der Oberfläche von 293T Zellen nachgewiesen (Abb. 21). Die Bindung des

CLEC-2-Rezeptors an Podoplanin auf 293T Zellen konnte mit Hilfe eines löslichen CLEC-2-

Fusionsproteins nachgewiesen werden (Abb. 22A). 293T Zellen wurden für die Herstellung von

HIV-1 für die oben beschriebenen Experimente eingesetzt. Dies legte die Vermutung nahe,

dass Podoplanin in die Hüllmembran der in 293T Zellen generierten Viren eingebaut wurde, und

die Anwesenheit von Podoplanin in der Virushülle für die CLEC-2-abhängige Transmission

verantwortlich war. Die Inkorporation von Podoplanin in Virionen konnte aufgrund mangelnder

Sensitivität des Western Blot-Nachweises nicht bestimmt werden. Die Reduktion der

Podoplanin-Expression auf Virus-produzierenden 293T Zellen mit Hilfe von siRNAs führte

jedoch zu einer reduzierten CLEC-2-vermittelten HIV-Transmission. Es ist daher sehr

wahrscheinlich, dass die Interaktion von Podoplanin auf Virionen mit CLEC-2 auf

transmittierenden Zellen für die HIV-1-Trans-Infektion durch Zelllinien und Thrombozyten

verantwortlich war.

Podozyten sind für HIV permissiv (Gupta et al., 2004; Husain et al., 2002; He et al., 2007), und

Nierenerkrankungen, die vermutlich durch die HIV-Infektion von Podozyten hervorgerufen

werden, sind häufig auftretende Komplikationen bei HIV-infizierten Patienten (Winston et al.,

1998). Podozyten kommen normalerweise nicht mit Thrombozyten in Kontakt, jedoch könnte

58

Diskussion

eine Verletzung der Niere die Interaktion von den in Podozyten generierten HIV-Varianten mit

CLEC-2 auf Thrombozyten bewirken (Christou et al., 2008). Expressionsanalysen ergaben

keine Hinweise auf eine Expression von Podoplanin auf weiteren für die HIV-1-Infektion

relevanten Zelltypen wie CEMx174 R5 oder PBMCs (Abb. 21). In diesen Zellen generierte HI-

Viren wurden dennoch CLEC-2-abhängig auf Zielzellen übertragen (Abb. 13), des Weiteren

wurde für lösliches CLEC-2-Fc Protein eine spezifische Bindung an CEMx174 R5 Zellen

gemessen. Diese Beobachtungen deuten auf die Existenz eines weiteren, bis dato

unbekannten CLEC-2-Liganden hin (Abb. 23).

Weitere Untersuchungen lieferten Hinweise darauf, dass tote CEMx174 R5 Zellen Podoplanin

auf ihrer Oberfläche exprimieren. Allerdings sind apoptotische Zellen für ihre hohe

unspezifische Reaktivität bekannt, daher müssen die Daten in weiteren Experimenten bestätigt

werden. Die Apoptose ist ein wichtiger Verteidigungsmechanismus gegen die Virus-Infektion

und wird unter anderem durch die HIV-Hüllproteine (Koga, 1996; Koga and Sasaki, 1997) und

die HIV-vermittelte Bildung von Synzytien (Stevenson et al., 1988) induziert. Die Podoplanin-

Expression korrelierte mit der Zunahme der toten Zellen in HIV-1-infizierten CEMx174 R5

Kulturen (Abb. 28). Hinweise auf eine Podoplanin-Expression auf infizierten Zellen wurden

jedoch nicht erhalten. Während eine mögliche Podoplanin-Expression auf apoptotischen oder

nekrotischen Zellen interessant wäre, würde dieser Effekt möglicherweise nicht zur

Inkorporation von Podoplanin in die virale Membran.

Zusammenfassend konnte im zweiten Teil der Arbeit demonstriert werden, dass die Interaktion

von Podoplanin, das wahrscheinlich in Virionen eingebaut wird, mit CLEC-2, das auf

Thrombozyten exprimiert wird, die Trans-Infektion von HIV vermitteln kann. Die Analyse der

Bedeutung dieses Effektes für die Ausbreitung von HIV ist Gegenstand laufender

Untersuchungen.

59

Literaturverzeichnis

G) Literaturverzeichnis

Agrawal,L., Vanhorn-Ali,Z., and Alkhatib,G. (2002). Multiple determinants are involved in HIV

coreceptor use as demonstrated by CCR4/CCL22 interaction in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). J Leukoc Biol 72, 1063-1074.

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Anhang

H) Anhang

Abkürzungen Abb. Abbildung AS Aminosäure bp Basenpaar c.p.s. counts per second Cy5 Indodicarbocyanin DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleosidtriphosphat EBV Epstein-Barr-Virus E.coli Escherichia coli EGFP (Enhanced GFP) verstärktes grün-fluoreszierendes Protein ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay FACS Fluorescence Activated Cell Sorting FKS fötales Kälberserum FITC Fluorescein-Isothiocyanat GFP grün fluoreszierendes Protein (green fluorescent protein) h Stunde HCMV Humanes Cytomegalovirus HCV Hepatitis C-Virus HIV Humanes Immundefizienz-Virus HRP Meerrettichperoxidase kbp Kilobasenpaare kDa Kilodalton l Liter µ- mikro- m- milli- mAK monoklonaler Antikörper min Minute MLV murines Leukämie-Virus mRNA messenger RNA MW molare Masse ng Nanogramm OD optische Dichte ORF offener Leserahmen (Open Reading Frame) PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction) RNA Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur s Sekunde SDS Natriumdodecylsulfat SIV Affen-Immundefizienz-Virus (Simian Immunodeficiency Virus) u.a. unter anderem z.B. zum Beispiel %(v/v) Volumenprozent %(w/v) Gewichtsprozent

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Anhang

Danksagung

Herrn Prof. Dr. Wolfgang Hillen danke ich für die Bereitschaft, diese Arbeit vor der Naturwissenschaftlichen Fakultät II der Universität Erlangen-Nürnberg zu vertreten.

Herrn Prof. Dr. Fleckenstein danke ich für die Begutachtung, die ausgezeichneten Arbeitsbedingungen und die Möglichkeit, die Arbeit in seinem Institut für klinische und molekulare Virologie durchführen zu können.

Herrn Prof. Dr. Stefan Pöhlmann danke ich besonders für die ausgezeichnete wissenschaftliche Betreuung, für die zahlreichen Diskussionen und für die Unterstützung während meiner Arbeit.

Natürlich möchte ich auch meinen Kollegen aus dem Graduiertenkolleg (GRK1071) und PD. Dr. Brigitte Biesinger für den wertvollen wissenschaftlichen Austausch danken.

Ein herzlicher Dank geht an meine Mentorin PD. Dr. Barbara Schmidt für die hilfreichen wissenschaftlichen Vorschläge, für die umfangreiche Unterstützung und insbesondere für die aufmunternden Gespräche! Danke, danke, danke!

Vielen Dank an Prof. Dr. Manfred Marschall für die vielen wissenschaftlichen Ideen und Vorschläge.

Allen ehemaligen Mitgliedern des Labors Pöhlmann danke ich für die gute Zusammenarbeit. Ganz besonders danken möchte ich Heike für die liebe Unterstützung in jeder erdenklichen Hinsicht, Tanja und Tom für die fachliche und freundschaftliche Unterstützung, und Katja, Eva, Mandy, Martina und Anja für die gute und schöne Zusammenarbeit.

Allen aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Instituts danke ich für die hilfreiche Unterstützung, insbesondere allen Mitgliedern der AG Schmidt, der AG Mach und der AG Metzner.

Danken möchte ich auch allen meinen Freunden, die während dieser Zeit für mich da gewesen sind. Ganz besonders danke ich Christian für das viele Zuhören und für seine Unterstützung.

Ganz besonders Danken möchte ich der Familie Paprotka: Vielen herzlichen Dank für die verständnisvollen Gespräche, für die Unterstützung jeglicher Art und für Eure Zeit für mich!! Danke für ALLES!!

Ein Dankeschön an meinen Freund Tobi, der mir immer verständnisvoll in allen Situationen zur Seite stand und es immer wieder schaffte, mich in jeder Lage aufzumuntern.

Ein Dankeschön geht auch an meine Eltern und meine Schwester, die mich immer von der Ferne unterstützt haben.

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Anhang

Eigene Publikationen

1. Hofmann H, Simmons G, Rennekamp AJ, Chaipan C, Gramberg T, Heck E, Geier M, Wegele A, Marzi A, Bates P, Pöhlmann S. (2006): Highly conserved regions within the spike proteins of human coronaviruses 229E and NL63 determine recognition of their respective cellular receptors J. Virol 80, 8639-8652

2. Gramberg T, Zhu T, Chaipan C, Marzi A, Liu H, Wegele A, Andrus T, Hofmann H, Pöhlmann S. (2006): Impact of polymorphisms in the DC-SIGNR neck domain on the interaction with pathogens J. Virol. 347, 354-363

3. Chaipan C, Soilleux E.J, Simpson P., Hofmann H, Gramberg T, Marzi A, Geier M, Stewart E.A, Eisemann J, Steinkasserer A, Suzuki-Inoue K, Fuller G.L, Pearce A.C, Watson S.P, Hoxie J.A, Baribaud F, Pöhlmann S. (2006) : DC-SIGN and CLEC-2 mediate human immunodeficiency virus type 1 capture by Platelets J. Virol 80, 8951-8960

4. Münch J, Ständker L, Adermann K, Schulz A, Schindler M, Chinnadurai R, Pöhlmann S, Chaipan C, Biet T, Peters T, Meyer B, Wilhelm D, Lu H, Jing W, Jiang S, Forssmann WG, Kirchhoff F. (2007): Discovery and Optimization of a Natural HIV-1 Entry Inhibitor Targeting the gp41 Fusion Peptide Cell 129, 263–275

5. Marzi A., Mitchell D.A., Chaipan C., Fisch T., Doms R.W., Carrington M., Desrosiers R.C., Pöhlmann S. (2007): Modulation of HIV and SIV neutralization sensitivity by DC-SIGN and mannose-binding lectin Virology 368, 322-330

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Beiträge zu nationalen und internationalen Kongressen

1. Third European Congress of Virology (Jahrestagung GfV), 2007 Nürnberg

”HIV transmission by platelets” (Poster)

2. Third European Congress of Virology (Jahrestagung GfV), 2007 Nürnberg

”Proteolytic activation of hemagglutinin (HA) of 1918 influenza virus” (Poster)

3. 4th IAS Conference on HIV Pathogenesis, Treatment and Prevention, 2007

Sydney, Australia “Analysis of HIV-1 transmission by CLEC-2, an HIV-1 attachment factor expressed on platelets” (Poster)

4. 2nd International Workshop on Targeting HIV Entry, 2006

Boston, USA “HIV-1 capture by platelets is mediated by DC-SIGN and CLEC-2” (Mündlicher Beitrag)

5. 1st International GK Symposium: Regulators of adaptive Immunity, 2006

Erlangen ”HIV-1 capture by platelets is mediated by DC-SIGN and CLEC-2” (Poster)

6. Retroviruses CSHL, 2006

New York, USA “HIV-1 capture by platelets is mediated by DC-SIGN and CLEC-2” (Mündlicher Beitrag)

7. Gesellschaft für Virologie (GfV), 2006

München “HIV-1 capture by platelets is mediated by DC-SIGN and CLEC-2” (Mündlicher Beitrag)

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bedeutung zellulärer anheftungsfaktoren für die ... · pdf file2.3.2 herstellung von...

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