biochemisches praktikum für biologen institut für biochemie peter friedhoff
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Biochemisches Praktikum für Biologen
Institut für BiochemiePeter Friedhoff
Organisationsstufen in der Zelle
Bestandteile einer E. coli Zelle
Bestandteile einer E. coli Zelle
Proteinaufreinigung
Funktion bekannt – Protein unbekanntWelches Protein ist für eine bestimmte Funktion verantwortlich?
Protein bekannt – Funktion unbekanntWelche Funktion hat ein bestimmtes Protein?
Aufreinigung von Proteinen
Proteineigenschaften
Stabilität
Löslichkeit
Ladung
Hydrophobizität
Größe/Form/Masse
spezifische Interaktionen
(Affinität)
Verfahren
Zellaufschluß
Pufferbedingungen
Zentrifugation
Fällung
Dialyse
Säulenchromatographie
Charakterisierung von Proteinen
Aktivitätsassay (z.B. enzymatische Aktivität)
Elektrophorese (1-D/2-D) (IEP/Masse)
Spektroskopische Methoden (Funktion/Struktur)
Massenspektrometrie (Masse/Sequenz)
Edman-Sequenzierung (Sequenz)
Röntgenstrukturanalyse/NMR (Struktur)
Aufreinigungsprotokoll von Proteinen
Aufreinigung von Rattenleber Glucokinase
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Zentrifugation
Dialyse
Dialysemembran lässt nur kleine Moleküle hindurch(z.B. Mr < 5000)
Makromoleküle werden zurückgehalten
Anwendung: Pufferwechsel
Säulenchromatographie
Substanzen gelöste in mobiler Phase durchlaufen eine stationäre Phase.
Wechselwirkung (Verteilung oder Adsorption) mit der Matrix bestimmen die Wanderungsge-schwindigkeit der gelösten Teilchen.
Ionenaustauschchromatographie
Kationenaustausch- stationäre Phase
Anionz.B. MonoS (-CH2SO3
-) oder CM-Cellulose (-COO-) mobile Phase Kation
Anionenaustausch- stationäre Phase
Kationz.B. MonoQ (-CH2N+(CH3)3) oder DEAE-Sepharose (-CH2N+H(CH3)2) mobile Phase Anion
Gelfiltration oder Größenauschlußchromatographie
Affinitätschromatographie
Protein (mobile Phase) bindet mit hoher Affinität und Selektivität an immobilisierten Liganden (stationäre Phase)
Elution erfolgt z.B. mit freiem Liganden (Kompetition)
Affinitätschromatographie
Affinitäts-tag Matrix
Antigen Antikörper (immobiliert)
6His (His6-tag) Ni-NTA
Strep-tag II (Peptid) Streptactin (Streptavidin-Derivat)
Glutathion-S-Transferase Glutathion-Sepharose
Calmodulin-Bindungs-Peptid Calmodulin-Affinitätsmatrix
Maltose-Bindungs-Protein Amylose-Matrix
Glucose-Bindungsprotein
Glucose-Bindungsprotein bindet an immobilisierte Glucose
Elution durch (freie) Glucose, die Glucose-Bindungsprotein von der Matrix ablöst (kompetitive Elution)
Ni-NTA-Affinitätschromatographie
Protein mit Histin-Affinitätstag bindet an immobilisierte Ni2+-Ionen
Elution erfolgt durch Imidazol das mit dem Protein um die Bindung an Ni2+-Ionen konkurriert.
Komplex aus His und Ni2+-NTA
Charakterisierung von Proteinen
Aktivitätsassay (z.B. enzymatische Aktivität)
Elektrophorese (1-D/2-D) (IEP/Masse)Elektrophorese (1-D/2-D) (IEP/Masse)
Spektroskopische Methoden (Funktion/Struktur)
Massenspektrometrie (Masse/Sequenz)
Edman-Sequenzierung (Sequenz)
Röntgenstrukturanalyse/NMR (Struktur)
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Schematische Darstellung einer Protein-Aufreinigung analysiert mit Hilfe der SDS-PAGE
Isoelektrische Fokussierung/ 2-D Gelelektrophorese
2-D Gelelektrophorese
Western-Blotting
Western-Blotting
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Ionisierungsverfahren für Massenspektrometrie
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Massenspektrometrieexakte Bestimmung von Peptid/Proteinmassen
Identifizierung von Proteinen mit Hilfe der Massenspektrometrie
SDS-Gel oder 2D-Gel
Bande/Spot ausschneiden
Tryptischer Verdau der Proteine
Bestimmung der Peptidmassen
Peptid-Fingerabdruck
Datenbanksuche nach Proteinen mit
identischem Peptid-Fingerabdruck
Protein-SequenzierungEdman-Abbau
Affinitätschromatographie/Elektrophorese
Ziel des Versuchs Aufreinigung eines rekombinantes Proteins
exprimiert in Escherichia coli über Affinitätschromatographie
Verfolgung der Aufreinigung mittels Fluoreszenz
Analyse der Aufreinigung mittels SDS-Gelelektrophorese
Untersuchung zur Thermostabilität des Proteins aufgrund seiner Fluoreszenz im nativen Zustand
Grün-fluoreszierendes Protein (GFP)
Die biolumineszierende Qualle Aequorea victoria produziert Licht, wenn
Energie des Ca2+-aktivierten Photoproteins
Aequorin auf das Grün-fluoreszierende
Protein (GFP) übertragen wird
GFP-Chromophor
Chromophor entsteht nach oxidativer Zyklisierung des Tripeptids Ser-Tyr-Gly
Der GFP-Chromophor fluoresziert nur, wenn es im nativ gefalteten Protein vorliegt
In vivo Fluoreszenz mittels GFP
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