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Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik
Dr. Maik BöhmerInstitut für Biologie und Biotechnologie der PflanzenSchlossplatz 7
Schwerpunkte:
Vorlesung 1: Einführung & Enzyme der GentechnikVorlesung 2: Methoden der GentechnikVorlesung 3: Vektoren & KlonierungVorlesung 4: ReportergeneVorlesung 5: Transgene OrganismenVorlesung 6: Genomik und moderne MethodenVorlesung 7: Proteine
Enzyme der Gentechnologie
I. Nukleasen1. Restrikonsendonukleasen2. Exonukleasen
II. Modifizierende Enzyme1. Ligasen2. Phosphatasen / Kinasen / Transferasen
III. Polymerasen1. DNA - Polymerasen2. RNA - Polymerasen3. reverse Transkriptasen
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Klonierung: Das Grundlegende Experiment der Gentechnologie
DNA - Isolation: Wie erhalte ich die DNA die ich untersuchen möchte?
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Aufbrechen der Zellen/Gewebe
Zentrifugation: Trennung von Fraktionen/ Fällung
rpm: rounds per minute
RCF: relative Zentrifugalkraft g
RCF=11,17 x r x (rpm/1000)2
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Phenolextraktion zum Abtrennen von Proteinen
1. Phenol 2. Phenol/Chloroform 3. Chloroform
Ethanolfällung von Nukleinsäuren
+ 0,1 Vol. 3 M NaCl+ 2.5 Vol. Ethanol
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Reinigung von DNA an Silikat- und Anionenaustausch-Säulen
Agarosegelelektrophorese
Ethidiumbromid: 0,5 g/ml
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Ethidiumbromid färbt DNA
Agarose-Konzentrationen zur Separationvon DNA-Fragmenten
Fragmentlänge Agarosekonzentration
1 - 30 kb 0,5 %0,8 - 12 kb 0,7 %0,5 - 7 kb 1,0 %0,4 - 6 kb 1,2 %0,2 - 3 kb 1,5 %0,1 - 2 kb 2,0 %
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Gelelektrophorese zur Separationvon DNA-Fragmenten
Spannung: 0,5 - 5 V/cm Elektrodenabstand
Gelelektrophorese zur Separationvon DNA-Fragmenten
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Gelelektrophorese zur Separationvon DNA-Fragmenten: Das Prinzip
Gelelektrophorese zur Separationvon DNA-Fragmenten: Größenbestimmung
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Autoradiographie zum radioaktiven Nachweis von Nukleinsäuren
„Southern Blot“ zum radioaktiven Nachweis von DNA
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Southern Blot: Transfer der DNA-Fragmente
Southern Blot: Transfer der DNA
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Southern Blot
„Northern Blot“ zum radioaktiven Nachweis von RNA
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Radioaktive Markierungvon DNA - „nick translation“ und „end labeling“
Radioaktive Markierungvon DNA - „random priming“
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Nachweis von Nukleinsäuren-Hybridisierung
Hybridisierung: 1. Denaturierung und Fixierung
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Hybridisierung: 2. Hybridisierung mit markierter Sonde
Hybridisierung: 3. „Waschen“ und Exposition
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Hybridisierung
Nachweis von Nukleinsäuren:Kolonie-Hybridisierung
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Oligonukleotide
in vitro definiert synthetisierte einzelsträngige DNA Fragmente von meist ca. 20 Nukleotiden (im Normalfall kein 5‘-Phosphat)
z.B. 5‘-CCGATGCACTGAATTC-3‘
Anwendung: Primer für „random priming“ (Hexamere)Primer für „primer extension“Primer für PCR
aber auch (doppelsträngige)LinkerAdaptoren
Linker
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Adapter
Nukleotid 1 an Glasmatrix gebunden:
5´OH-Gruppe liegt frei vor
Folgenukleotid ist am 5´Ende mit einer DMT Schutzgruppe abgeschirmtDMT:4‘,4‘-dimethoxytritylam 3‘Ende mit hochreaktiver Gruppebesetzt (z. B. Phosphoamidit)
Nur das 3´Ende des Folgenukleotids kann mit Nukleotid 1 reagieren
Oligonukleotid-Synthese I
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Oligonukleotid-Synthese II
Nach der Kopplung:
Entfernung der Schutzgruppe vom 5‘ durch ZnBr2
Stabilisierung der Phosphatgruppe durch Oxidation mit I2
Nach der Synthese:
Finale Entfernung der Methylgruppen(alkalisch)
Lösen des Oligos von der Matrix
Oligonukleotid-Synthese III
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DNA-Sequenzierung
Didesoxy-Methode nach Sanger
DNA-Sequenzierung
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DNA-Sequenzierung
Radioaktive DNA-Sequenzierung
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DNA-Sequenzierung mit Fluoreszenzfarbstoffen
Animation Sequenzierung
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Wichtige Begriffe der PCR
Template: Substrat der PCR-Reaktion
Primer: kurze Oligo-Nukleotide zur Initiation der Polymerisation
dNTPs: Nukleotidtriphosphate werden in den neuen Strang eingebaut
Polymerase: Enzym zur Synthese der Doppelstränge
Denaturierung: Trennung der Doppelstränge bei 92-98°C
Annealing: Anlagerung der Primer an den geöffneten Doppelstrang
Elongation: Neusynthese des fehlenden Doppelstrangs (1min/kb)
Ablauf einer typischen PCR
Amplifikation eines 1kb DNA Fragments:
Initiale Denaturierung 2 min 95°C
Denaturierung 30 sec95°C
Annealing 45 sec55°C
Elongation 60 sec72°C
Finale Elongation 5 min 72°C
40 Wiederholungen
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Anwendungen der PCR
Amplifikation definierter DNA Fragmente
Nachweis bestimmter Sequenzen im Genom
„geneitscher Fingerabdruck, Vaterschaftstest“
Nachweis von Mutationen „Gendiagnostik“
Herstellung von DNA-Fragmenten zur Klonierung
Nachweis von transgenen Organismen
DNA Sequenzierung
RT-PCR zum Nachweis von Genprodukten / Transkripten
III Polymerasen- Thermostabile DNA Polymerasen -
DNA abhängige Polymerasen, tolerant gegenüber hohen Temperaturen (~ 95 °C)- besonders geeignet für PCR Reaktionen, Sequenzierungen
Eigenschaften:
Bedingungen:- Mg2+, dNTPs, Primer (3‘-OH Ende)
Name Organismus 5’-Exonuclease 3’-Exonuclease
(„Proofreading“)
Produkt-Enden
Taq Pol. Thermus aquaticus ja nein 3’A
Pfu Pol. Pyrococcus furiusus ja ja glatt
Pwo Pol. Pyrococcus woesei ja ja glatt
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PCR
PCR-Polymerase Ketten Reaktion
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PCR
PCR - im Überblick
30 Zyklen = 229 = 536 870 912 Kopien
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Animation PCR
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PCR- zur Klonierung von Fragmenten
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PCR- zur Klonierung von Fragmenten
RT- PCR
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T - Klonierung und Xcm - Vektoren
Xcm I:
5‘-CCANNNNN/NNNNTGCC-3‘ GGTNNNN/NNNNNACGG
Klonierungsvektoren - das Prinzip