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Charakterisierung interagierender

Domänen olfaktorischer Rezeptoren mit

Komponenten der Signalkaskade und dem

Or83b in Drosophila melanogaster

Dissertation zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie und

Biotechnologie an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften der

Ruhr-Universität Bochum

angefertigt in der

Arbeitsgruppe Sinnesphysiologie

vorgelegt von

Robert F. Freyberger

aus

Hannover

Bochum

Oktober 2012

Referent: Prof. Dr. Klemens Störtkuhl

Korreferent: Prof. Dr. Günter Schaub

Characterisation of Interacting Olfactory

Receptor Domains with Components of the

Signal Cascade and Or83b in

Drosophila melanogaster

Dissertation to obtain the degree

Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.)

at the Faculty of Biology and Biotechnology, Ruhr-University Bochum

International Graduate School of Biosciences

Ruhr-University Bochum

Working Group Sensory Physiology

submitted by

Robert F. Freyberger

from Hannover, Germany

Bochum

October 2012

First supervisor: Prof. Dr. Klemens Störtkuhl

Second supervisor: Prof. Dr. Günter Schaub

3

Mein Dank gilt Professor Dr. Klemens Störtkuhl für das anspruchsvolle Thema, sein

Interesse an meiner Arbeit und seine Diskussionsbereitschaft.

Professor Dr. Günter Schaub danke ich für die Übernahme des Korreferats, die

konstruktiven Diskussionen und die Möglichkeit zur Durchführung der quantitativen

RNA-Analysen.

Danken möchte ich auch Dr. Carsten Balczun für die hilfreiche Zusammenarbeit und

Unterstützung.

Allen Mitgliedern der AG Sinnesphysiologie möchte ich danken für das hervorragende

freundschaftliche Arbeitsklima und die konstruktiven Diskussionen. Besonders

hervorheben möchte ich Anja Martens, Michael Heeck, Angelika Balzer-Ferrai, Dr. Arnd

Richardt, Yvonne Plutta, Nora Haarmann, Alexander Duscha, Sonja Laroussi und Milena

Baumhoff, die mich in besonderer Weise durch Worte und Taten unterstützt haben.

Ein ganz herzliches Dankeschön geht an meine Familie für ihre Unterstützung und ihr

Vertrauen.

4

Für

meinHerz,

meinen Sonnenschein

und

meinen Schatz

5

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbstständig verfasst und bei keiner anderen

Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet

habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um sechs in Wort und

Bild völlig übereinstimmende Exemplare. Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen

nur die originalen Daten enthalten und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung

vorgenommen wurde.

Bochum, den 31. Oktober 2012

_____________________________

(Robert Freyberger)

6

Inhalt

1 Zusammenfassung/ Summary 9

2 Einleitung 11

2.1 Drosophila melanogaster als Modellorganismus 11

2.2 Morphologie des Geruchssinns von Drosophila 12

2.2.1 Das periphere olfaktorische System 12

2.2.2 Das zentrale olfaktorische System 15

2.3 Neuronale Verarbeitung chemischer Informationen 16

2.4 Signaltransduktion bei Drosophila 17

2.4.1 Signaltransduktion über olfaktorische Rezeptoren (ORs) 18

2.4.2 Signaltransduktion über gustatorische Rezeptoren (GRs) und ionotrope

Rezeptoren (IRs) 20

2.5 Domänen olfaktorischer Rezeptoren 22

2.6 Zielsetzung 24

3 Material und Methoden 25

3.1 Material 25

3.1.1 Fliegenstämme 25

3.1.2 Primer 27

3.1.3 Enzyme und Nukleotide 27

3.1.4 Antikörper und Seren 27

3.1.5 Lösungen, Puffer und Medien 28

3.1.6 Verbrauchsmaterial und Kits 29

3.1.7 Chemikalien 30

3.1.8 Geräte 31

3.1.9 Software 32

3.2 Methoden 33

7

3.2.1 Fliegenhaltung 33

3.2.2 Herstellung transgener Tiere des Gal4-Systems 33

3.2.3 Treiber-Responder-Kreuzungen des Gal4-Systems 33

3.2.4 Isolierung von genomischer DNA 34

3.2.5 Genotypisierung über PCR 35

3.2.6 DNA-Auftrennung durch Gelelektrophorese 35

3.2.7 DNA-Sequenzierung und in silico-Analysen 35

3.2.8 Antikörper-Färbung auf Kryoschnitten 36

3.2.9 Quantitative Expressionskontrolle auf Ebene der mRNA 36

3.2.10 Elektrophysiologie 38

3.2.11 Verhaltenstests (T-Maze) 40

4 Ergebnisse 41

4.1 Expression der Or43a-Domänen 41

4.1.1 Herstellung von Treiberlinien zur Expression der IC2 und IC4 41

4.1.2 Zelluläre Lokalisation der IC2 und IC4 45

4.1.3 Expressionsrate der Domänen am Beispiel der IC4 über quantitative RT-

PCR 48

4.2 Von den extrazellulären Domänen zeigt nur EC4 erhöhte Amplituden im

Elektroantennogramm 51

4.3 Expression der intrazellulären Domäne IC1 führt zu wildtypischen

Elektroantennogramm-Amplituden 54

4.4 Die Elektroantennogramm-Amplituden der intrazellulären Domäne IC3

entsprechen größtenteils dem Wildtyp 55

4.5 Bei Expression der IC4 entsprechen die Elektroantennogramm-Amplituden

teilweise denen des Wildtyps, teilweise variieren sie 57

4.6 Die Expression der Domänen IC2 und IC4 zusammen führt zu erhöhten

Reizantworten 58

4.7 Die Expression der Domänen wirkt sich auf das olfaktorische Verhalten aus 60

8

4.8 Die Elektroantennogramm-Kinetik wird durch die Expression der Domänen

beeinflusst 63

4.9 Expression der EC4 im Auge führt zu verringerten Amplituden im

Elektroretinogramm 67

5 Diskussion 71

5.1 Expressionsmuster der Domänen IC2 und IC4 71

5.2 Kompetitive Hemmung durch Expression der Or43a-Domänen 72

5.2.1 Bei den extrazellulären Domänen bewirkt nur die Expression der EC4

Veränderungen im EAG 73

5.2.2 Die Expression der Domäne IC1 bewirkt einen wildtypischen Phänotyp 76

5.2.3 IC3 als potentielle Verbindung zum G-Protein 76

5.2.4 Bildet die IC4 die Verbindung zum Or83b? 80

5.2.5 IC2 als potentielle Bindungsstelle für Komponenten der Adaptation 81

6 Ausblick 82

7 Literaturverzeichnis 84

8 Anhang 93

8.1 Abkürzungsverzeichnis 93

8.2 Abbildungsverzeichnis 94

8.3 Ergebnisse der RNA-Analysen 96

8.4 Lebenslauf 104

Zusammenfassung/ Summary

9

1 Zusammenfassung/ Summary

Zusammenfassung

Die Wahrnehmung olfaktorischer Reize geschieht bei Vertebraten wie auch bei Insekten

durch heptahelikale Transmembranproteine. Während bei den Vertebraten die

Signaltransduktion dieser Reize über G-Proteine und cyclische Nukleotide abläuft, gibt es bei

Drosophila melanogaster zwei mögliche Übertragungswege: Bei Aktivierung des

olfaktorischen Rezeptors (OR) kann das Signal direkt an den Ionenkanal Or83b

weitergegeben werden, oder der Or83b wird durch eine Enzymkaskade mit G-Protein und

zyklischen Nukleotiden aktiviert (Buck und Axel, 1991; Sato et al., 2008; Wicher et al.,

2008). Für beide Wege der Signalweitergabe ist es notwendig, dass der OR Interaktionen zu

den jeweiligen Komponenten der Signalkaskade eingeht.

In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob durch die Expression von Fragmenten des

Rezeptors Or43a die Signaltransduktion von Drosophila beeinflusst werden kann. Hierzu

wurden die vier extrazellulären Domänen (EC1, EC2, EC3 und EC4) sowie die vier

intrazellulären Domänen (IC1, IC2, IC3 und IC4) des Or43a jeweils in den olfaktorischen

Rezeptorneuronen exprimiert. Anhand von Elektroantennogrammen (EAG) sowie durch

Verhaltenstests wurden diese Fliegen auf Veränderungen in der olfaktorischen Reizantwort

untersucht.

Die Expression der Domänen EC4, IC2, IC3 und IC4 führte zu Reizantworten, die sich

von wildtypischen Reizantworten unterschieden: Bei Expression der EC4 traten in der

Elektrophysiologie erhöhte Reizantworten auf, während das olfaktorische Verhalten

unverändert war. Die Expression der IC2 bewirkte sowohl eine erhöhte Reizantwort im EAG

als auch eine erhöhte Sensitivität im Verhaltenstest. Bei Expression der IC3 reagierten die

Tiere im Verhaltenstest weniger empfindlich auf den Duftstoff als der Wildtyp; die EAG-

Messungen zeigten größtenteils keine Abweichungen von wildtypischen Amplituden. Die

Kinetik dieser Messungen war allerdings verändert: Sowohl der Anstieg bei der

Depolarisation als auch der Rückgang bei der Repolarisation verliefen langsamer als beim

Wildtyp. Bei Expression der IC4 trat bei den EAG-Messungen eine Kinetik mit einer

verlängerten Zeit bis zum Rückgang bei der Repolarisation auf.

Die Ergebnisse legen nahe, dass die Domänen EC4, IC2 und IC3 sowie wahrscheinlich

auch IC4 für Interaktionen mit Komponenten der Signalkaskade verantwortlich sind. Hierfür

kommen neben dem Or83b vor allem G-Proteine, Proteinkinasen und Arrestine in Frage.

Zusammenfassung/ Summary

10

Summary

The perception of olfactory cues occurs in vertebrates as well as in insects via

heptahelical transmembrane proteins. While in vertebrates olfactory stimuli activate a signal

cascade including G-proteins and cyclic nucleotides, in Drosophila melanogaster two

pathways are possible: in the first pathway odorant activation of the olfactory receptor (OR)

results in direct transfer of the signal to the ion channel Or83b. In the second pathway,

odorant activation of the OR results in indirect transfer of the signal via G-proteins and cyclic

nucleotides to Or83b (Buck und Axel, 1991; Sato et al., 2008; Wicher et al., 2008). In both

pathways interactions of OR and other signal transduction components like Or83b and G-

proteins are necessary.

The aim of this work was to examine whether olfactory responses of Drosophila can be

affected by the expression of Or43a fragments. Therefore the extracellular domains (EC1,

EC2, EC3 and EC4) and the intracellular domains (IC1, IC2, IC3 and IC4) of Or43a have

been misexpressed in odorant receptor neurons, respectively. Using electroantennogram

(EAG) recordings and behavioral tests it was tested whether the flies misexpressing Or43a

domains had altered olfactory responses in comparison to wild type.

The misexpression of the domains EC4, IC2, IC3 and IC4 caused the following effects:

missexpression of EC4 caused increased electrophysiological responses while the olfactory

behavior was unchanged. The expression of IC2 resulted in both, increased EAG amplitudes

and an increased sensitivity in behavioral assay. On expression of IC3 the animals showed

less sensitivity to odorants in behavioral tests. These EAG recordings of IC3 expressing flies

resulted in wild typical amplitudes. However, the kinetic of this measurements was altered:

both, the rise time during depolarization and the decay time during repolarization were slower

compared to wild type. If IC4 was expressed the EAG kinetic showed a prolonged decay time

during repolarisation.

The results suggest that the domains EC4 IC2, IC3 and probably furthermore IC4 are

responsible for the interactions with components of the signal cascade, which might be Or83b

or alternatively G-proteins, protein kinases and arrestins.

Einleitung

11

2 Einleitung

Der Geruchssinn stellt bei vielen Tieren einen der wichtigsten Sinne dar. Neben dem

Sehen und dem Hören ist er oftmals von entscheidender Bedeutung zur Orientierung in der

Umwelt. Viele Tiere setzen den Geruchssinn zur Lokalisation von Fressfeinden, Artgenossen,

potentiellen Fortpflanzungspartnern und Nahrungsquellen ein (Heldmaier und Neuweiler,

2003). Für die präzise Einschätzung der Umgebung muss das Geruchssystem mit sehr hoher

Empfindlichkeit sowohl ein breites Spektrum an flüchtigen chemischen Substanzen

wahrnehmen als auch die Unterscheidung der Duftstoffe gewährleisten (Nichols und Luetje,

2010).

Trotz vielfältiger Forschung am olfaktorischen System gibt es immer noch weite

Bereiche, die noch nicht genau aufgeklärt wurden. Weder die zellulären Abläufe in den

olfaktorischen Rezeptorneuronen noch die zentrale Verarbeitung der Geruchsinformationen

wurde bisher im Detail entschlüsselt. Durch molekulare und neuroanatomische Ansätze

wurden bisher Teile der Neuroanatomie und der Funktion des peripheren Geruchssystems

erforscht. Bei der Taufliege Drosophila melanogaster haben neue Ansätze ein nahezu

komplettes Bild über die periphere Neuroanatomie und Funktion des Geruchssinnes geliefert

(Silbering et al., 2011). Vor allem die Entdeckung der Gene olfaktorischer Rezeptoren (OR)

in Nagetieren (Buck und Axel, 1991) und in D. melanogaster (Clyne et al., 1999; Gao und

Chess, 1999; Vosshall et al., 1999) brachten die Erforschung des Geruchssinnes stark voran.

Drosophila bietet als Versuchstier, neben ethischen Aspekten, weitere Vorteile

gegenüber Säugetieren: Aufgrund einer geringeren Anzahl an Neuronen ist das Riechsystem

von Drosophila sehr übersichtlich. Mit olfaktorischen Sinnesorganen, die an der Oberfläche

des Tieres liegen, ist das Geruchsystem für die Forschung gut zugänglich. Aufgrund eines

kurzen Generationszyklus ist Drosophila für gentechnische Manipulationen gut geeignet

(Gerber und Stocker, 2007; Vosshall und Stocker, 2007).

2.1 Drosophila melanogaster als Modellorganismus

Seit Anfang des 20. Jahrhunderts wird Drosophila in der Wissenschaft eingesetzt. Zuerst

wurde sie nur im Bereich der Evolutionsbiologie genutzt. Später weitete sich ihr Einsatzgebiet

stark aus. Das Hauptargument für die Nutzung der Fliege war die einfache Möglichkeit der

Haltung. Drosophila ist robust, lässt sich bei geringen Kosten halten und besitzt einen

schnellen Generationszyklus mit einer hohen Reproduktionsrate. Bei optimalen Bedingungen

Einleitung

12

durchläuft die Fliege die komplette Entwicklung vom Ei über die drei Larvenstadien und die

Puppe zum geschlechtsreifen, adulten Tier innerhalb von 10 Tagen (siehe Abbildung 1). Mit

der Zeit weitete sich das Feld der Anwendungen weiter aus. An Drosophila wurde

beispielsweise die Natur und Organisation des Erbgutmaterials untersucht, und Details der

Embryogenese wurden aufgeklärt (Arias, 2008).

Neue Methoden, wie die Mutagenese durch Röntgenstrahlen, Herstellung einer

Duplikations-, Deletions- und Klonbibliothek und das chromosome walking, wurden oft an

Drosophila entwickelt oder nach kurzer Zeit bei ihr etabliert (Muller, 1927; Lindsley et al.,

1972; Rubin und Lewis, 2000). Die Drosophila-Forschung gewann durch die Entdeckung und

Aufklärung der Funktion der Riesenchromosomen sowie der vollständigen Sequenzierung des

Genoms noch einmal an Bedeutung (Becker, 1962; Adams et al., 2000; Rubin et al., 2000).

Abbildung 1: Lebenszyklus von D. melanogaster

Modifiziert aus Janning und Knust (2004).

2.2 Morphologie des Geruchssinns von Drosophila

2.2.1 Das periphere olfaktorische System

Der Geruch wird bei adulten D. melanogaster an zwei paarigen Organen

wahrgenommen: Das Hauptgeruchsorgan ist das dritte Antennenglied (Funikulus), das zweite

Geruchsorgan ist der Maxillarpalpus (siehe Abbildung 2a). Die Detektion der Geruchsstoffe

Einleitung

13

erfolgt an den Geruchshaaren, den olfaktorischen Sensillen an der Oberfläche von Funikulus

und Maxillarpalpus. Die Sensillen des Geruchssystems lassen sich morphologisch in drei

Typen einteilen (Abbildung 2b). Sensillum trichodea, Sensillum basiconica und Sensillum

coeloconica, wobei die basikonischen Sensillen in kleine und große basikonische Sensillen

untergliedert werden. Auf dem Funikulus befinden sich alle drei Sensillentypen. Auf dem

Maxillarpalpus finden sich an olfaktorischen Sensillen nur basikonische. Die Sensilla

chaetica, die sich ebenfalls auf dem Maxillarpalpus befinden, dienen der Mechanorezeption.

Von den Sensillentypen gibt es noch Untertypen, die sich morphologisch unterscheiden lassen

(Shanbhag et al., 1999).

Abbildung 2: Olfaktorische Sinnesorgane der adulten Fliege

a) Fliegenkopf mit Antenne (Pfeilspitze) und Maxillarpalpus (Pfeil). Maßstab: 100 µm.

b) Sensillen auf dem dritten Antennenglied von D. melanogaster: i: Sensilla basiconica; ii: Sensilla

coeloconica; iii: Sensilla trichodea. Maßstab: 10 µm. Aus Hallem und Carlson (2004).

Die Geruchsrezeption erfolgt in den Sensillen durch bipolare Neurone. Diese

olfaktorischen Rezeptorneurone (ORNs) erstrecken ihren apikalen Dendriten in den Schaft

eines Sensillums, wobei jedes olfaktorische Sensillum durch zwei bis vier ORNs innerviert

wird (siehe Abbildung 3). Die Dendriten enden in ziliären Fortsätzen. Die Zellkörper der

ORNs werden von Hilfszellen umgeben, die die Lymphflüssigkeit der Sensillen produzieren

und die Sensillen zu ihren Nachbarn hin elektrisch isolieren (Shanbhag et al., 1999, 2000)

Auf den Antennen männlicher Tiere gibt es etwa 20 % weniger große, basikonische

Sensillen und 30 % mehr trichoide Sensillen als bei Weibchen (Stocker, 2001). Am basalen

Einleitung

14

Ende besitzen die ORNs der Antenne ein Axon, das sich entlang des Antennennervs zum

Antennenlobus erstreckt (Strausfeld, 1976; Stocker et al., 1983). Auf dem Maxillarpalpus

liegen ca. 60 olfaktorische Sensillen, die jeweils von zwei ORNs innerviert werden. Hier

wurde kein Sexualdimorphismus beobachtet (de Bruyne et al., 1999). Die Axone der ORNs

des Maxillarpalpus verlaufen entlang des Labialnervs durch das Suboesophagial-Ganglion

zum Antennenlobus (Singh und Nayak, 1985; Stocker et al., 1990).

Abbildung 3: Schema eines olfaktorischen Sensillums

Die verästelten ziliären Fortsätze der ORN-Dendriten stehen über die Lymphflüssigkeit und Poren in

der Sensillenkutikula mit der Außenwelt in Kontakt. Modifiziert aus Vosshall und Stocker (2007).

Das innere Lumen der Sensillen ist mit Lymphe gefüllt, die über Poren mit der

Oberfläche in Verbindung steht. Die Lymphflüssigkeit ist wahrscheinlich wie bei anderen

Insektenarten reich an Kalium. Die Dendriten der ORNs werden von der Lymphe umspült, so

dass Geruchsmoleküle von der Oberfläche zu den Neuronen gelangen können (Kaissling und

Thorson, 1980; Steinbrecht, 1989; Shanbhag et al., 1999). Hierbei könnten Proteine der

Familie der Odor-binding Proteine oder der Chemosensory Proteine eine Rolle spielen. Diese

wasserlöslichen Proteine in der Lymphe können hydrophobe Substanzen binden. Ihre genaue

Funktion wurde bislang nicht geklärt. Möglicherweise dienen sie dem Transport der

Geruchsmoleküle von der Oberfläche der Sensillen zu den ORNs. Möglich ist aber auch, dass

ihre Aufgabe darin besteht, die Duftstoffe von aktivierten Rezeptorneuronen wieder zu

entfernen (Vogt und Riddiford, 1981; Vogt et al., 1985, 1991, 2002; Galindo und Smith,

2001).

Einleitung

15

2.2.2 Das zentrale olfaktorische System

Die ORNs der adulten Fliegen leiten die Geruchsinformationen über ihre Axone zum

Antennenlobus weiter (Abbildung 4). Der Antennenlobus ist eine paarige Struktur im Gehirn,

die aus einzelnen Untereinheiten, den Glomeruli, aufgebaut ist. Alle ORNs, die den gleichen

olfaktorischen Rezeptor (OR) exprimieren, projizieren auf den gleichen Glomerulus oder auf

zwei Glomeruli. Die kontaktierten Glomeruli haben jeweils eine feste Position im

Antennenlobus. Die meisten ORNs projizieren sowohl auf den ipsi- als auch auf den

kontralateralen Antennenlobus (Gao et al., 2000; Vosshall et al., 2000; Couto et al., 2005;

Fishilevich und Vosshall, 2005).

Abbildung 4: Übersicht über die olfaktorische Signalweitergabe von der Antenne

Die olfaktorischen Informationen konvergieren von den ORNs auf die Glomeruli des Antennenlobus.

Dort werden die Informationen verarbeitet und an höhere Hirnregionen, vor allem dem Pilzkörper und

dem lateralen Horn, weitergeleitet. Modifiziert nach Keene und Waddell (2007).

Die Geruchsinformation, die einen Glomerulus erreicht, wird durch die Liganden

bestimmt, welche an den zugehörigen OR binden. Die Verarbeitung der Signale im

Glomerulus erfolgt durch lokale Interneurone und Projektionsneurone. Die hauptsächlich

GABAergen lokalen Interneurone verbinden die einzelnen Glomeruli miteinander. Die

Projektionsneurone sind cholinerge Nervenzellen, die die Signale von den Glomeruli zu zwei

höheren Hirnzentren, dem Pilzkörper und dem lateralen Horn, weiterleiten (Stocker, 1994).

Einleitung

16

Der Calyx des Pilzkörpers ist ein Riechzentrum höherer Ordnung, der als Eingänge

Informationen von den cholinergen Projektionsneuronen erhält. Die Endigungen der

Projektionsneurone bilden in allen Untereinheiten des Calyx große Knopffelder. Außer den

Projektionsneuronen kommen im Calyx noch weitere extrinsische Neurone vor, die

vermutlich GABAerge Neurone sind, und intrinsische Kenyon-Zellen. Die drei Zelltypen

bilden im Calyx hunderte vernetzter Glomeruli aus (Yasuyama et al., 2002).

2.3 Neuronale Verarbeitung chemischer Informationen

Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten zur neuronalen Verarbeitung chemischer

Informationen. Während beim Geschmackssinn der Vertebraten sowohl ionotrope als auch

metabotrope Rezeptoren vorliegen, waren bis vor wenigen Jahren beim Geruchssinn der

Wirbeltiere nur metabotrope Rezeptoren mit einer Signalkaskade über G-Proteine bekannt

(Heldmaier und Neuweiler, 2003). Bei der klassischen olfaktorischen Signaltransduktion der

Vertebraten bindet der Duftstoff an den Rezeptor und das G-Protein Golf wird aktiviert. Golf

wiederum aktiviert die Adenylatzyklase, die ATP in cAMP umwandelt (siehe Abbildung 5).

Die Bildung von cAMP führt zur Öffnung von Ionenkanälen und somit zur Depolarisation der

Zelle. Außerdem aktivieren cAMP sowie das einströmende Ca++

Mechanismen zur

Adaptation der Zelle (Dhallan et al., 1990; Belluscio et al., 1998; Gibson und Garbers, 2000).

Wahrscheinlich gibt es neben der Kaskade über cAMP auch noch eine Signalkaskade

über Inositol-1,4,5-Triphosphat (IP3): Bei Aktivierung des Geruchsrezeptors wird das Signal

über das G-Protein an die Phospholipase C weitergegeben und Phosphatidylinositol-4,5-

bisphosphat in IP3 und Diacylglycerin umgewandelt. IP3 aktiviert den Ionenkanal und die

Zelle depolarisiert (Boekhoff et al., 1990b; Breer et al., 1990; Breer, 1991). Ob es diese

zweite Signalkaskade bei den klassischen Vertebraten-ORs gibt, ist allerdings umstritten

(Gibson und Garbers, 2000).

Erst in den letzten Jahren wurden weitere Signalwege gefunden (Review von Spehr und

Munger, 2009). Neben den klassischen Vertebraten-ORs wurden weitere G-Protein-

gekoppelte Rezeptoren gefunden: In einem kleinen Teil der ORNs der Maus werden TAARs

(Trace amine associated receptors) gebildet. TAARs sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren,

die spezifische Amine in kleinen Konzentrationen binden. Wie die klassischen Vertebraten-

ORs, kommen auch die TAARs in Neuronen vor, die die α-Untereinheit des Golf (Gαo)

exprimieren. Dieses lässt vermuten, dass bei beiden Rezeptoren die Signalweitergabe über die

gleiche Signalkaskade abläuft (Liberles und Buck, 2006).

Einleitung

17

Abbildung 5: Klassische olfaktorische Signaltransduktion bei Vertebraten

Bei Aktivierung des Geruchsrezeptors wird das Signal über das G-Protein an die Adenylatzyklase

weitergegeben und ATP in cAMP umgewandelt. Das cAMP aktiviert den Ionenkanal und die Zelle

depolarisiert. Erstellt entsprechend Heldmaier und Neuweiler (2003).

Zusätzlich zu den klassischen ORs und den TAARs wurden im Riechsystem der Mäuse

noch weitere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren gefunden. Es handelt sich hierbei um zwei

Familien von Rezeptoren des Vomeronasalorgans: Vomeronasal Typ 1 Rezeptor (V1r) und

Vomeronasal Typ 2 Rezeptor (V2r) (Dulac und Axel, 1995; Herrada und Dulac, 1997;

Matsunami und Buck, 1997; Ryba und Tirindelli, 1997). V1r wird in Rezeptorneuronen

zusammen mit Gαi2 exprimiert, V2r zusammen mit Gαo. Obwohl dieses Signalkaskaden über

Gαi2 bzw. Gαo impliziert, steht der Beweis hierfür noch aus (Halpern et al., 1995; Berghard

und Buck, 1996; Mombaerts, 2004).

Außer den G-Protein gekoppelten Rezeptoren fanden sich im olfaktorischen System der

Vertebraten auch noch Rezeptor-Guanylylzyklasen (Gibson und Garbers, 2000). Einer dieser

Rezeptoren (GC-D) reagiert sowohl auf die Peptidhormone Uroguanylin und Guanylin als

auch auf Stimulation mit Urin durch Bildung von cGMP. Das cGMP wiederum kann

Ionenkanäle aktivieren, so dass es zur Depolarisation kommt (Leinders-Zufall et al., 2007).

2.4 Signaltransduktion bei Drosophila

Die Mechanismen der Signaltransduktion beim Riechen der Insekten sind bisher noch

nicht genau aufgeklärt. An der Signaltransduktion sind olfaktorische Rezeptoren (ORs),

gustatorische Rezeptoren (GRs) und wahrscheinlich ionotrope Rezeptoren (IRs) beteiligt

(Benton et al., 2009). Bei den ORs und GRs handelt es sich um zwei Familien von Proteinen

mit sieben Transmembrandomänen, die jedoch nicht mit der Klasse der G-Protein-

Einleitung

18

gekoppelten Rezeptoren von Vertebraten verwandt sind (Clyne et al., 1999; Vosshall et al.,

1999; Störtkuhl und Kettler, 2001; Vosshall und Stocker, 2007). Bei D. melanogaster wurden

bisher 60 Gene identifiziert, die für 62 ORs kodieren und 60 Gene, die für 68 GRs kodieren.

Die abweichende Anzahl von Genen und Proteinen beruht auf alternativem Spleißen

(Robertson et al., 2003). Von den 62 ORs werden 48 in adulten Fliegen exprimiert

(Fishilevich et al., 2005).

2.4.1 Signaltransduktion über olfaktorische Rezeptoren (ORs)

In den meisten ORNs kommen zwei ORs vor: Ein normaler Rezeptor und Or83b. Der

Or83b wird in nahezu allen ORNs exprimiert (Vosshall et al., 1999). Er dimerisiert zusammen

mit einem normalen OR früh im inneren Membransystem. Dabei bindet Or83b den Komplex

in den konservierten, ziliären Transportweg ein und ermöglicht hiermit den Transport des

normalen Rezeptors in die ziliäre Membran des ORNs (Neuhaus et al., 2005; Benton et al.,

2006). Es sind 13 Fälle bekannt, in denen zwei oder drei ORs zusammen mit dem Or83b in

einem ORN coexprimiert werden (Couto et al., 2005; Goldman et al., 2005). Die ORs

besitzen im Vergleich zu den G-Protein-gekoppelten heptahelikalen Transmembranproteinen

der Säuger eine invertierte Anordnung in der Membran, mit dem N-Terminus und den am

meisten konservierten Schlaufen auf der zytoplasmatischen Seite (Benton et al., 2006;

Wistrand et al., 2006).

Für die Signaltransduktion der ORs werden keine zusätzlichen Ionenkanäle zwingend

benötigt, da die OR-Or83b-Komplexe selber einen Ionenkanal bilden. Heterologe Zellen, die

heteromere OR-Or83b-Komplexe exprimieren, zeigen einen Einstrom von extrazellulärem

Kalzium und eine unspezifische Kationenleitfähigkeit bei Stimulation mit Duftstoffen. Dabei

kann der Ionenkanal direkt durch die Bindung des Geruchsstoffes aktiviert werden (Sato et

al., 2008; Wicher et al., 2008).

Seit der Entdeckung der olfaktorischen Rezeptoren von Drosophila 1999 wurde disku-

tiert, ob die ORs in Anlehnung an die olfaktorischen Rezeptoren der Vertebraten und

Nematoden auf Grund ihrer sieben Transmembrandomänen den G-Protein-gekoppelten

Rezeptoren zuzuordnen sind (Clyne et al., 1999; Gao und Chess, 1999; Vosshall et al., 1999).

Diese Diskussion wurde durch die Publikationen von Sato et al. (2008) und Wicher et al.

(2008) neu entfacht: Während bei Sato et al. festgestellt wird, dass die Komplexe nur eine

Funktion als metabotrope Ionenkanäle besitzen und die Signalübertragung durch eine

Funktion als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren ausgeschlossen wird, kommen Wicher et al. zu

dem Ergebnis, dass die OR-Or83b-Komplexe sowohl als metabotrope Ionenkanäle als auch

als G-Protein gekoppelte Rezeptoren fungieren (siehe Abbildung 6): Dabei soll es eine

Einleitung

19

schnelle Übertragung des Signales direkt vom OR zum Or83b geben. Ein zweiter Weg soll

über G-Proteine und zyklische Nukleotide zu einer langsameren Anregung des Or83b führen.

Dieser zweite Weg ist sensitiver und erzeugt ein länger anhaltendes Signal.

Abbildung 6: Model der olfaktorischen Signalkaskade nach Wicher et al. (2008)

Der Duftstoff aktiviert den OR. Dieser gibt das Signal entweder direkt an den Or83b weiter oder über

zyklische Nukleotide. Dies kann über das G-Protein GS und die Adenylatzyklase (AC) erfolgen. Die

Adenylatzyklase wandelt ATP in cAMP um, welches wiederum den Or83b aktiviert. Dieser zweite

Signalweg ist langsamer als der erste, wirkt aber sensitiver und länger anhaltend. Die

Aminosäuresequenz TVVGYLG ist wahrscheinlich an der Ionenpore beteiligt.

Modifiziert nach Wicher et al. (2008).

Viele Faktoren deuten bei Insekten auf eine olfaktorische Signalkaskade über G-Proteine

und sekundäre Botenstoffe hin: Bei verschiedenen Insektenarten wurde bei

Antennenpräparaten ein rascher und anhaltender Anstieg an IP3 als Reaktion auf Duftstoffe

beobachtet (Breer et al., 1990; Boekhoff et al., 1993; Wegener et al., 1993). Dieser Anstieg an

IP3 kann durch Pertussitoxin geblockt werden, was auf eine G-Protein-gekoppelte

Signalkaskade hindeutet (Boekhoff et al., 1990a). Die Phospholipase C ist im Sehsystem von

Drosophila eine essentielle Komponente für die Phototransduktion. Bei norpA-Mutanten,

denen die Phospholipase C fehlt, werden verringerte olfaktorische Antworten am Maxillar-

palpus gemessen. Dies deutet auf eine Beteiligung des IP3-Signalwegs am Riechsystem hin

(Riesgo-Escovar et al., 1995).

Das Genom von Drosophila beinhaltet die Gene für acht α-Untereinheiten der

G-Proteine. Sechs der α-Untereinheiten, Concertina, Gαq, Gαs, Gα73B, Gαo und Gαi, werden

in der Antenne exprimiert (Yao und Carlson, 2010). Dieses legt die Vermutung nahe, dass sie

eine Funktion bei der olfaktorischen Signaltransduktion haben. Außerdem bilden in einem

Einleitung

20

heterologen Zellsystem die ORs Homodimere. Die Signalweitergabe funktioniert hier auch

ohne den Or83b (Wetzel et al., 2001; Neuhaus et al., 2005).

Weitere Hinweise auf eine Signaltransduktion über G-Proteine und zyklische Nukleotide

liefern Messungen von Kain et al. (2008). Bei elektrophysiologischen Messungen an Tieren

mit einer mutierten Alpha-Untereinheit des G-Proteines Gαq wurden sowohl verringerte

Summenpotentiale als auch verringerte Spikeraten bei Single-Sensillum-Ableitungen

gemessen (Kain et al., 2008). Verhaltensversuche mit Tieren, bei denen Gαq durch RNAi

(RNA Interferenz) inaktiviert war, ergaben veränderte Reaktionen auf verschiedene

Duftstoffe: In einem T-Maze reagierten die Fliegen duftstoffabhängig mit normaler

wildtypischer Reaktion, mit einem fehlenden Verhalten oder mit einer zum Wildtyp

unterschiedlichen Reaktionen. Die Art der Antwort hing dabei vom Duftstoff und seiner

Konzentration ab (Kalidas und Smith, 2002). Die Versuche legen nah, dass je nach Duftstoff

die olfaktorische Signaltransduktion teilweise über Gαq und teilweise über andere Wege

bewerkstelligt wird.

Weitere Versuche mit RNAi von Gαq wurden von Yao und Carlson (2010) durchgeführt.

Die Autoren führten Single-Sensillum-Ableitungen an drei einzelnen Typen von ORNs durch,

in denen entweder die Alpha-Untereinheiten von G-Proteinen durch RNAi inaktiviert, die

Untereinheiten durch MARCM-Technik ausgeschaltet oder konstitutiv aktive Untereinheiten

in den Neuronen vorhanden waren. An den drei Klassen von Neuronen konnten dabei keine

oder nur geringe Veränderungen gegenüber der Kontrolle festgestellt werden. Die Autoren

schließen daraus, dass es im olfaktorischen System keine Signalkaskade über G-Proteine gibt

(Yao und Carlson, 2010). Ebenso gut könnte es aber auch sein, dass die geringen

Veränderungen in den Versuchen auf eine Signalkaskade über G-Proteine zurückzuführen ist,

oder dass es je nach OR-Klasse verschiedene Übertragungswege gibt.

Insgesamt sind die Untersuchungen zur Bedeutung von sekundären Botenstoffen und

G-Proteinen in ORs sehr widersprüchlich. Daher sind noch viele Fragen zur

Signaltransduktion der ORs zu klären.

2.4.2 Signaltransduktion über gustatorische Rezeptoren (GRs) und

ionotrope Rezeptoren (IRs)

Die Identifizierung der GRs bei Drosophila erfolgte durch den gleichen

bioinformatischen Algorithmus wie bei der Identifizierung der ORs, bei dem nach sieben-

Transmembranproteinen gesucht wurde (Clyne et al., 2000). Der Mechanismus der

Signaltransduktion über GRs ist bislang noch nicht bekannt. Bei den Vertebraten kommen zur

Einleitung

21

gustatorischen Signaltransduktion verschiedene Mechanismen zum Einsatz. Die Rezeptoren

für sauer und salzig bilden selber den Ionenkanal aus. Die Bindung der Liganden führt hier

zum Schließen (sauer) oder Öffnen (salzig) der Kanäle. Im Gegensatz hierzu verläuft die

Signaltransduktion von süß und bitter über G-Proteine und zyklische Nukleotide (Heldmaier

und Neuweiler, 2003).

Wie bei den Vertebraten sind auch für die Insekten verschiedene Signaltransduktions-

wege möglich. Auf Grund der vorhergesagten sieben Transmembrandomänen der GRs wurde

davon ausgegangen, dass es sich bei ihnen um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren handelt

(Clyne et al., 2000). Da allerdings bei den ORs gezeigt wurde, dass Proteine mit sieben

Transmembrandomänen nicht zwangsläufig die Signalübertragung über G-Proteine

durchführen müssen (Sato et al., 2008; Wicher et al., 2008), ist auch für die GRs die Frage

wieder offen, wie die Signaltransduktion funktioniert.

Im Gegensatz zu den ORs, die alle am Riechsystem beteiligt sind, wurde bei den GRs

nur für die beiden Rezeptoren Gr21a und Gr63a eine Funktion im olfaktorischen System

gefunden. Bei elektrophysiologischen Single-Sensillum-Ableitungen an Or22a-

exprimierenden ORNs, welche die beiden Rezeptoren Gr21a und Gr63a ektopisch expri-

mieren, sind die Zellen sensitiv für CO2. Fliegen, bei denen der Gr63a mutiert ist, reagieren

weder bei elektrophysiologischen Ableitungen noch in Verhaltenstests auf CO2. Es handelt

sich bei den beiden GRs somit um Rezeptoren, die zusammen für die CO2-Detektion

verantwortlich sind (Jones et al., 2007; Kwon et al., 2007).

In Single-Sensillum-Ableitungen, bei denen die Translation verschiedener Alpha-

Untereinheiten potentieller G-Proteine durch RNAi gestört war, zeigten die Gr21a/GR63a

beinhaltenden Neuronen bei RNAi von Gαq verringerte Reizantworten. Diese Effekte traten

auch auf, wenn in diesen Neuronen ein dauerhaft aktives Gαq ektopisch exprimiert wurde.

Auch ein RNAi der Gamma-Untereinheit Gγ30A führte zu einer verringerten Spikerate bei

Single-Sensillum-Ableitungen der Gr21a/GR63a-Neurone. Zusammen deuten diese Versuche

darauf hin, dass die vermittelte CO2-Detektion der Rezeptoren Gr21a und GR63a über eine G-

Protein-vermittelte Signalkaskade abläuft (Yao und Carlson, 2010).

Bei den IRs handelt es sich um Rezeptoren, die mit den ionotropen Glutamatrezeptoren

verwandt sind. Der Neurotransmitter Glutamat bildet zusammen mit den ionotropen

Glutamatrezeptoren einen der am besten charakterisierten Mechanismen zur Übertragung von

Signalen an Synapsen. Im Nervensystem der Säuger resultiert aus dieser synaptischen

Kommunikation in der Regel ein exzitatorisches Signal (Gereau und Swanson, 2008; Abuin et

al., 2011). Im Gegensatz zu den ionotropen Glutamatrezeptoren besitzen die IRs abweichende

Einleitung

22

Liganden-Bindedomänen ohne die charakteristischen Reste, die für die Interaktion mit

Glutamat zuständig sind. Außer dem Ir76b werden die IRs in ORNs exprimiert, die weder

einen normalen OR, den Or83b, noch einen GR bilden. Dabei treten verschiedene

Kombinationen der IRs innerhalb der ORNs auf. Der Ir76b wird zusammen mit dem Or35a

und Or83b in einem ORN gebildet. Neuronen, die IRs exprimieren, sind zur Detektion von

Geruchsstoffen in der Lage. Das Geruchsspektrum dieser ORNs kann durch Missexpression

eines IRs verändert werden. Daher lässt sich davon ausgehen, dass es sich bei den IRs um

Geruchsrezeptoren handelt (Benton et al., 2009).

2.5 Domänen olfaktorischer Rezeptoren

Die ersten ORs von Drosophila wurden unter anderem durch einen

Computeralgorithmus gefunden, der darauf abgestimmt war, Proteine mit sieben

Transmembrandomänen im Genom der Fliege zu finden. Hierzu wurden offene Leserahmen

ausgewählt, die potentiell für ORs kodieren könnten, und nach ihrer Hydropathie und

Polarität ausgewertet (Clyne et al., 1999). Gleichzeitig dazu wurden die ORs auch von zwei

weiteren Gruppen entdeckt, die gestützt auf Computeranalysen sieben

Transmembrandomänen vorhersagten (Gao und Chess, 1999; Vosshall et al., 1999). Ebenso

führten spätere Analysen mit dem HMMTOP Algorithmus zu einer Vorhersage von sieben

Transmembrandomänen (Benton et al., 2006). Daher ist die Wahrscheinlichkeit sehr groß,

dass es sich bei den ORs tatsächlich um heptahelikale Transmembranproteine handelt. Dies

wurde allerdings wieder in Frage gestellt, da die ORs nicht mit den G-Protein-gekoppelten

Rezeptoren von Vertebraten verwandt sind (Vosshall et al., 1999; Benton et al., 2006). Die

ORs besitzen im Vergleich zu den G-Protein-gekoppelten heptahelikalen

Transmembranproteinen der Säuger eine invertierte Anordnung in der Membran, bei der der

N-Terminus auf der zytoplasmatischen Seite liegt (siehe Abbildung 7). Ausgehend von einem

intrazellulären N-Terminus und sieben Transmembrandomänen liegen die Bereiche, die auf

den ersten, dritten, fünften und siebten Membrandurchgang folgen, jeweils extrazellulär

(Domänen EC1, EC2, EC3 und EC4); die Bereiche vor diesen Membrandurchgängen liegen

entsprechend intrazellulär (IC1, IC2, IC3 und IC4). Für die Domänen IC1 (= N-Terminus),

IC3 und IC4 wurde diese Anordnung beim Or83b bestätigt (Benton et al., 2006).

Über die Bedeutung der einzelnen Domänen der Rezeptoren für die Signaltransduktion

ist bislang nicht viel bekannt. Der Bereich am Übergang zwischen dem dritten

Transmembrandurchgang und der EC2 ist beim Or85b an der Bindung des Duftstoffes

beteiligt: In Versuchen nach der „substituted cysteine accessibility“-Methode wurde durch die

Einleitung

23

Modifikation der Cysteingruppen in diesem Bereich die Reizantwort auf den Agonisten

verringert. Der Effekt konnte durch Mutation der Cysteine verhindert werden. Auf Grund der

Homologien zwischen den ORs ist wahrscheinlich auch bei anderen Rezeptoren die EC2 an

der Agonistenbindung beteiligt (Nichols und Luetje, 2010).

Abbildung 7: Topologie olfaktorischer Rezeptoren von Drosophila

Die ORs sitzen mit dem N-Terminus (IC1) intrazellulär in der Membran, die sie mit sieben

Transmembrandurchgängen durchziehen. Dabei befinden sich vier Domänen intrazellulär (IC1, IC2,

IC3 und IC4) und vier Domänen extrazellulär (EC1, EC2, EC3 und EC4). Die Längen der Domänen

deuten die Größenverhältnisse beim Or43a an. Die EC2 ist wahrscheinlich an der Ligandenbindung

beteiligt, der IC4 wird eine Rolle bei der Bindung an den Or83b zugeordnet.

Erstellt entsprechend der erwarteten Membrantopologie nach Gao und Chess (1999) und Benton et al.

(2006).

In einem Versuch mit einem Chimärenrezeptor aus dem N-terminalen Bereich des

Or83b und dem C-terminalen Bereich des Or43a zeigte Benton et al. (2006), dass die

C-terminale Hälfte des Or43a für die Bindung an den Or83b verantwortlich ist. Über two-

hybrid-Versuche grenzten sie die Bindungsstelle auf die IC4 ein, die bei Benton et al. (2006)

als IC3 bezeichnet wird. Da sie bei den Versuchen allerdings nur die intrazellulären Domänen

IC3 und IC4 untersuchten, könnten auch noch andere Bereiche wie die extrazellulären

Domänen eine Beteiligung an der Or83b Bindung besitzen.

Für weitere Faktoren der Signalkaskade gibt es bislang keine Anhaltspunkte, an welchen

Positionen die Interaktionen ablaufen. So fehlen Informationen über mögliche Bindungen zu

G-Proteinen, Proteinkinasen oder Arrestinen.

Einleitung

24

2.6 Zielsetzung

Obwohl sich viele wissenschaftliche Arbeiten mit dem Geruchssinn der Insekten

beschäftigt haben, sind wesentliche Bereiche des olfaktorischen Systems immer noch

unverstanden. Hierzu zählt unter anderem der genaue Ablauf der Signaltransduktion in den

ORNs. Der Komplex aus OR und Or83b bildet selbst einen Ionenkanal und fungiert damit als

ionotroper Rezeptor. Dennoch weisen viele Arbeiten auf eine metabotrope Signalkaskade

über G-Proteine und zyklische Nukleotide hin (Wicher et al., 2008). Über die Bedeutung der

einzelnen Domänen olfaktorischer Rezeptoren bei diesen Prozessen ist bei beiden

Übertragungswegen fast nichts bekannt.

Ziel dieser Arbeit ist es, mehr über die Bedeutung der einzelnen Domänen der ORs am

Beispiel des Or43a zu ergründen. Hierzu sollen, soweit nicht bereits vorhanden, Fliegenlinien

erzeugt werden, die die vier intrazellulären Domänen IC1, IC2, IC3 und IC4 sowie die vier

extrazellulären Domänen EC1, EC2, EC3 und EC4 unter Verwendung des Gal4-Systems

ektopisch in den ORNs exprimieren. Durch Expression der extrazellulären und intrazellulären

Domänen in den ORNs soll herausgefunden werden, welche Bereiche für die

Signaltransduktion eine Rolle spielen.

Durch die ektopische Expression der Domänen könnten Interaktionen des Or43a mit

anderen Komponenten der Signalkaskade durch kompetitive Hemmung geschwächt werden.

Dieses würde sich in einer veränderten Geruchswahrnehmung auswirken. Solche

Veränderungen sollen über elektrophysiologische Untersuchungen sowie über Verhaltenstests

ermittelt werden. Die Ergebnisse dieser Versuche könnten Hinweise zu den Interaktionen der

einzelnen Or43a-Domänen mit anderen Komponenten der Signalkaskade liefern.

Material und Methoden

25

3 Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Fliegenstämme

Fliegenlinien aus dem Bloomington Drosophila-Stock-Center der Indiana Universität

Bloomington sind mit der Stock-Nummer aufgeführt.

Name Genotyp Eigenschaft (Herkunft)

Doppel-

balancer

Balancer fürs zweite und dritte

Chromosom (Bloomington 7199)

EC1 (15-5)

UAS-Responderlinie zur

Expression der EC1 (Lange, 2007)

EC1 (25-1)



EC1 (35-3)



EC2 (9-1)



EC2 (27-1)



EC3 (23-5) (unbekannter

Insertionsort in white)



EC4 (13-1)



EC4 (62-1)




26

Name Genotyp Eigenschaft (Herkunft)

IC1 (10-1)


Expression der IC1 (Lange, 2007)

IC1 (27-1)



IC1 (35-1)



IC3 (5-1)



IC3 (45-1)



Or83b-Gal4

Or83b-Gal4-Treiber (Carlson,

Universität Yale)

Ret.44

Gal4-Expression im Auge in allen

Zellen hinter der morphologischen

Furche (Bloomington 1104)

Ret.53

Gal4-Expression im Auge in allen

Zellen in und hinter der

morphologischen Furche

(Bloomington 8121)

white

Loss-of-function-Mutation des

white-Gens (Bloomington 3605)

Wildtyp

Canton S Wildtyp

(Bloomington 1)


27

3.1.2 Primer

5´-pUAST 5´-AAA TCA ACT GCA ACT ACT GAA ATC TGC C-3´

3´-IC2 5´-CTC GAG TTA GTT CCG AGC CTC CCG TTC C-3´

3´-IC4 5´-AGC TCG AGT TAG GTT TTG CGA AAC CGA GTT CC-3´

Primer 607 5´-TGC ATC ACC ATC ACC ATC AC-3´

Primer 608 5´-TTT TGC GAA ACC GAG TTC CT-3´

Primer 609 5´-CGA CGC TTC AAG GGA CAG TA-3´

Primer 610 5´-CAA TCT CCT TGC GCT TCT TG-3´

Primer 612 5´-TCG GGC CAA TGA AAT ATG C-3´

3.1.3 Enzyme und Nukleotide

dATP (Fermentas)

dCTP (Fermentas)

dGTP (Fermentas)

DNA-Polymerase, Dream-Taq (Fermentas)

dTTP (Fermentas)

RNase (Fermentas)

DNase I, RNase-frei (Fermentas)

3.1.4 Antikörper und Seren

Blockserum 1 % Ziegenserum in TBST-100

Kaninchen α His Pierce 6x-His Epitope tag polycl. Ab. (Thermo Fischer

Scientific)

Maus α nc 82 Maus monoklonaler α nc 82 AK (Hofbauer)

Maus α His Maus IgG1 monoklonaler anti His AK (Qiagen)

Ziege α Kaninchen-Cy2 Ziege IgG polyklonaler anti Ziege-AK konjugiert mit Cy2

(Dianova)

Ziege α Maus-AP Ziege IgG polyklonaler anti Ziege AK konjugiert mit

Alkaline-Phosphatase (Sigma)

Ziege α Maus-Cy3 Ziege IgG polyklonaler anti Ziege-AK konjugiert mit Cy3

(Dianova)

Ziegenserum (Sigma)


28

3.1.5 Lösungen, Puffer und Medien

Agarosegel 1 % Agarose

0,005 % RedSafe

0,5x TAE

Drosophila-Ringer 7,48 g/l NaCl

0,35 g/l KCl

0,26 g/l CaCl2 * 2 H2O

0,198 g/l Na2HPO4 * 7 H2O

0,048 g/l KH2PO4

Fixierlösung für Kryoschnitte 4 % Paraformaldehyd

25 mM Na2HPO4

12,5 mM KH2PO4

pH 7,2 mit NaOH

Fliegenfutter 9,2 g/l Agar-Agar

50 g/l inaktivierte Hefe

50 g/l Sucrose

50 g/l Maismehl

5 ml/l Propionsäure

7 ml/l 25 % Nipagen in Ethanol

Homogenisierungspuffer zur

Isolierung genomischer DNA

0,1 M Tris (pH 9,0)

0,1 M Ethylendiamintetraessigsäure

1 % Natriumdodecylsulfat

Probenpuffer zur

Gelelektrophorese, 10x

15 % Ficoll

0,2 % Bromphenolblau

0,2 % Xylenxyanol FF

TAE, 50x 2 M Tris-Acetat (pH 8,0)

50 mM Ethylendiamintetraessigsäure

TBS 100 mM Tris-HCl (pH 7.4)

150 mM NaCl

TBST-100 0,1 % Triton X-100 in TBS

TBST-20 0,2 % Tween 20 in TBS

TE 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)

1 mM Ethylendiamintetraessigsäure


29

3.1.6 Verbrauchsmaterial und Kits

Aktivkohle gekörnt, 4 mm (Applichem)

Deckgläser (Menzel-Gläser)

Einbettmedium für Kryoschnitte (Jung)

Filterpapier (Whatman)

Glasfritte (Glasbläserei der Ruhr-Universität Bochum)

Größenstandards O´GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas)

O´GeneRuler 50 bp DNA Ladder (Fermentas)

Heißkleber (UHU)

Kanülen SUPRA, 1,80 x 40 mm (Ehrhardt Medizinprodukte)

SUPRA, 2,00 x 60 mm (Ehrhardt Medizinprodukte)

Kapillaren GB150ETF-10 Kapillaren (Science Products)

Kit zur RNA-Analyse Experion RNA StdSens Analysis Kit (Bio-Rad)

Kit zur RNA-Isolierung ZR Tissue & Indect RNA MicroPrep Kit (Zymo

Research)

Kit zur qRT-PCR iScript qRT-PCR Kit (Bio-Rad)

One step MESA GREEN qRT-PCR MasterMix Plus for

SYBR assay Kit (Eurogentec)

Kunststoffröhrchen zur

Fliegenhaltung

(Oehmen)

Nagellack (Rival de Loop)

Objektträger Superfrost Plus (Menzel-Gläser)

Parafilm (American National Can)

Pasteurpipetten (Sarstedt)

Petrischalen (Sarstedt)

Pipettenspitzen (Sarstedt)

Pipettenspitzen mit Filter (Starlab)

Pistill (VWR)

Reaktionsgefäße 0,2 ml (Sarstedt)

1,5 ml (Sarstedt)

Schaumstoffstopfen (Oehmen)

Silberdraht 0,1 mm (Roth)

Sterilstopfen (Oehmen)

Szintillationsgefäß (Wheaton)


30

Watte (Hartmann)

Zahnstocher (Rewe Handelsgruppe)

3.1.7 Chemikalien

Agar Agar-Agar reinst (Applichem)

Agarose NEED Ultra-Qualität (Roth)

Benzaldehyd (BA) ≥ 98 % (Acros Organics)

Bromphenolblau (Roth)

Cyclohexanol (cHOH) ≥ 99 % (J.T. Baker)

Diethylsuccinat (DES) ≥ 99 % (Aldrich)

Ethanol ≥ 98,8 % (Riedel de Haën)

Ethylacetat (EA) ≥ 99,5 % (J.T. Baker)

Ethylcaproat (EC) ≥ 98 % (Fluka)

Ethylendiamintetraessigsäure (Merck)

Ficoll PM 400 (Sigma)

Glycergel (Dako)

Glycerin (J.T. Baker)

Glycin (Applichem)

Hefe (inaktiviert) (Engevita)

Isoamylacetat (IA) ≥ 99 % (Acros Organics)

Isopropanol (VWR)

Kaliumacetat (J.T. Baker)

Kaliumchlorid (J.T. Baker)

Kaliumhydrogenphosphat (J.T. Baker)

Kalziumchlorid (J.T. Baker)

Kalziumchlorid-2-hydrat ≥ 99,5 % (J.T. Baker)

Kohlendioxid (Air Liquide)

Maismehl (Levers)

Methanol (Merck)

Methylacetat (MA) ≥ 99 % (Riedel de Haën)

Natriumchlorid (J.T. Baker)

Natriumdodecylsulfat (Applichem)

Natriumhydrogenphosphat ≥ 99 %, wasserfrei (Roth)


31

di-Natriumhydrogenphosphat-7-

hydrat

≥ 99 % (Riedel de Haën)

Natriumhydroxid (J.T. Baker)

n-Butanol (nBuOH) (J.T. Baker)

Nipagen (Sigma)

1-Octanol (OctOH) ≥ 99,5 % (Riedel de Haën)

Octylacetat (OA) ≥ 99 % (Aldrich)

Paraffinöl (Merck)

Paraformaldehyd (VWR)

Propionsäure (Fluka)

Propionsäureethylester (PEE) ≥ 99 % (Aldrich)

RedSafe (Intron Biotechnology)

Methylsalicylat (MeSa) ≥ 99 % (Fluka)

Natriumdodecylsulfat (Applichem)

Salzsäure 1 mol/l (Waldeck)

Sucrose ≥ 99 % (Applichem)

Stickstoff, flüssig (Air Liquide)

Tris Ultrapure (Applichem)

Triton X-100 (Sigma)

Tween 20 (Sigma)

Xylenxyanol FF (Roth)

3.1.8 Geräte

DNA-Gelelektrophorese-

kammer

Mupid-ex (Advance)

Duftapplikator OktopUSB (Eigenbau AG Sinnesphysiologie)

Elektroden-Puller PIP6 (Heka)

Elektroporator Micropulser (Bio-Rad)

Fluoreszenzmikroskop BX51WI Fixed Stage Upright Microscope (Olympus) mit

MPLN5X Objektiv, LMPLFLN50 Objektiv, U-LH100HG

Lampenhaus, USHIO 100W HG-Dampfbrenner, U-MWIBA3

Filterwürfel, U-M31007 CY3 Filterwürfel und U-M31044v2

CYAN GFP Filterwürfel

Fotoapparat Camedia C5060 (Olympus)


32

Fotoapparat für ERG MDa (Leica)

Homogenisator Precellys 24 lysis & homogenisation (Bertin Technologies)

Kaltlichtquelle KL 1500 (Schott)

Kryomikrotom CM 3050 S (Leica)

Magnetstativ (Primat)

Mikromanipulator M3301 (World Precision Instruments)

Hydraulischer Mikromanipulator (Navishige)

Oszilloskop für EAG PicoScope 3204 (Pico Technology)

Oszilloskop für ERG DSO-2090 USB (Voltcraft)

Photometer 7315 Spectrophotometer (Jenway)

Stereomikroskop SZ51 (Olympus)

Thermocycler Labcycler (Sensoquest)

StepOnePlus qPCR-Thermocycler (Applied Biosystems)

Thermomixer Thermomixer Comfort (Eppendorf)

UV-Lampe Flächenstrahler NU 72 UV (Benda)

Verstärker DP-311 (Warner Instruments)

Waage EW 1500-2M (Kern)

Zentrifuge RC 5B Plus (Sorvall)

5415 D (Eppendorf)

5430 R (Eppendorf)

3.1.9 Software

Bioinformatik Vector NTI (Invitrogen)

Grafikprogramme Photoshop der Creative Suite 3 (Adobe)

CorelDraw der Graphic Suite X5 (Corel)

Messwerterfassung EAG DuftarayV1.4Max (AG Sinnesphysiologie) und Mesfile-

Fewer (AG Sinnesphysiologie), basierend auf LabVIEW

(National Instruments)

Messwerterfassung ERG DSO-2090 (Voltcraft)

Statistik Excel (Microsoft)

Prism (GraphPad)

SPSS (IBM)


33

3.2 Methoden

3.2.1 Fliegenhaltung

Die Fliegen werden, soweit nicht anders erwähnt, entsprechend Ashburner (1989)

gehalten. Die dauerhafte Aufbewahrung der Tiere erfolgt entweder bei 18 °C und einem 12

Stunden Hell-Dunkel-Rhythmus oder bei Raumtemperatur und natürlichem Hell-Dunkel-

Rhythmus. Zum Sortieren der Tiere nach phänotypischen Eigenschaften werden sie auf einer

Glasfritte mit Kohlendioxid betäubt. Das Sortieren geschieht unter optischer Vergrößerung

durch ein Stereomikroskop.

3.2.2 Herstellung transgener Tiere des Gal4-Systems

Die transgenen Fliegen werden entsprechend Rubin und Spradling (1982) hergestellt:

Zur Erzeugung transgener Fliegen wird die gewünschte Plasmid-DNA in Drosophila-Eier von

white-Fliegen injiziert (durchgeführt von Vanedis Drosophila Injection Service, Norwegen).

Die geschlüpften Fliegen werden jungfräulich vereinzelt und mit white Fliegen gekreuzt.

Direkte rotäugige Nachkommen werden wiederum jungfräulich vereinzelt und mit white

Fliegen gekreuzt. Die rotäugigen Nachkommen der zweiten white-Kreuzung werden inter se

gekreuzt. Um das integrierte Genkonstrukt homozygot zu erhalten, werden jungfräuliche

Weibchen mit besonders dunklen Augen mit möglichst dunkeläugigen Männchen verpaart.

Zur stabilen Haltung und zur Bestimmung des Chromosoms, in dem sich das

Genkonstrukt integriert hat, werden Nachkommen der inter se-Kreuzung mit dem

Doppelbalancer ausbalanciert.

3.2.3 Treiber-Responder-Kreuzungen des Gal4-Systems

Bei den Kreuzungen der Treiber- und Responderlinien werden Jungfrauen der einen

Linie mit Männchen der anderen Linie gekreuzt. In der ersten Nachkommengeneration

aktiviert der Transkriptionsfaktor Gal4 die UAS-Sequenz und das Genkonstrukt, das an die

UAS-Sequenz gekoppelt vorliegt, wird exprimiert (Abbildung 8). Die Haltung der Fliegen

erfolgt bei 24 °C. (Elliott und Brand, 2008)


34

Abbildung 8: Expression eines Genes mit dem Gal4-System

Die Kreuzung der Treiber- und der Responderlinie führt zur Bindung von Gal4 an die UAS-Sequenz

und die Aktivierung des Zielgens in der ersten Nachkommengeneration (F1). Hierdurch wird die

Transkription des Zielgenes (hier EC3) eingeleitet. Erstellt entsprechend Elliott und Brand (2008).

3.2.4 Isolierung von genomischer DNA

Zur Isolierung genomischer DNA werden 40 Fliegen in kaltem Homogenisierungspuffer

mit einem Pistill zerkleinert. Nach Zugabe weiterer 400 µl Homogenisierungspuffer wird für

30 Minuten bei 75 °C inkubiert. Es werden 70 l 8 M Kaliumacetat zugegeben und der

Ansatz für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach Zentrifugation für 15 Minuten bei 16.100 x g

wird der Überstand mit 1 µl RNase versetzt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.

Nach Zugabe von 300 l Isopropanol wird für weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur

inkubiert und dann für 30 Minuten bei 16.100 x g zentrifugiert. Das Pellet wird mit 70%

Ethanol gewaschen, getrocknet und in 50 l TE aufgenommen.


35

3.2.5 Genotypisierung über PCR

Bei der Genotypisierung über PCR (modifiziert nach Saiki et al. (1985)) wird durch

Amplifikation überprüft, ob ein bestimmtes DNA-Fragment im Genom der Fliegen enthalten

ist. Pro PCR-Ansatz werden 1 µl genomischer DNA, 1 l 3´-Primer (10 mM), 1 l 5´-Primer

(10 mM), 1 l dNTP´s (je 10 mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP), 0,5 l DNA-Polymerase, 5

l 10x Puffer und 40,5 l Aqua dest. (Nuclease-frei) in einem 0,2 ml Reaktionsgefäß

vermischt. Die PCR wird im Thermocycler mit dem folgenden Programm durchgeführt:

PCR-Programm

Vorkühlung 4 °C

Vorbehandlung 180 Sekunden bei 95 °C

30 Zyklen 30 Sekunden bei 94 °C (Denaturierung)

30 Sekunden bei 50 bis 65 °C (Annealing)

60 Sekunden bei 68 °C (Elongation)

Nachbehandlung 300 Sekunden bei 72 °C

Nachkühlung 4 °C

Die Kontrolle der PCR geschieht durch Gelelektrophorese.

3.2.6 DNA-Auftrennung durch Gelelektrophorese

Die Gelelektrophorese geschieht in der DNA-Gelelektrophoresekammer entsprechend

den Herstellerangaben: Die DNA-Probe wird mit 10x Probenpuffer versetzt und auf ein

Agarosegel aufgetragen. Die gelelektrophoretische Auftrennung erfolgt bei 135 V für 30

Minuten in einer mit 0,5x TAE-Puffer gefüllten Gelkammer. Die DNA wird durch

Bestrahlung mit UV-Licht detektiert.

3.2.7 DNA-Sequenzierung und in silico-Analysen

Die Sequenzierung einer DNA wird vom Sequenzierservice im Lehrstuhl Biochemie II

der Ruhr-Universität Bochum durchgeführt. Die in silico-Analyse der DNA-Sequenzen

geschieht am PC mit Vector NTI.


36

3.2.8 Antikörper-Färbung auf Kryoschnitten

Die Antikörperfärbung auf Kryoschnitten wird entsprechend Richardt et al. (2002)

durchgeführt:

Anfertigung von Kryoschnitten

Für die Präparation der Fliegenköpfe werden die Fliegen mit dem Rücken an einen mit

Nagellack bestrichenen Zahnstocher geklebt. Unter Drosophila-Ringer werden der Rüssel und

die Luftsäcke im Kopf entfernt. Nach drei Stunden in Fixierlösung bei 4°C entwässern die

Fliegen in Drosophila-Ringer mit 25 % Sucrose über Nacht bei 4°C.

Für die Kryoschnitte werden die Köpfe im Einbettungsmedium ausgerichtet, in

flüssigem Stickstoff eingefroren und in das Mikrotom überführt. Die 10 bis 12 μm dicken

Schnitte werden auf Objektträger aufgenommen und bis zur weiteren Behandlung mit

Antikörpern in einer feuchten Kammer aufbewahrt.

Antikörper-Färbung

Vor der Antikörper-Färbung werden die Schnitte zunächst für 20 Minuten mit TBST-

100 gewaschen und für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Blockserum geblockt.

Anschließend wird für eine Stunde bei 37°C oder über Nacht bei 4°C mit dem ersten

Antikörper in Blockserum inkubiert. Nach zweimaligem Waschen für 20 Minuten mit TBST-

100 bei 37 °C, einer Stunde Inkubation mit dem zweiten Antikörper und erneutem

zweimaligem Waschen werden die Präparate in Glycergel eingedeckelt.

3.2.9 Quantitative Expressionskontrolle auf Ebene der mRNA

Die quantitative Expressionskontrolle wird in Zusammenarbeit mit Dr. Carsten Balczun,

AG Zoologie und Parasitologie der Ruhr-Universität Bochum, durchgeführt.

Isolierung von RNA aus Antennen

Zur Isolierung der RNA aus Antennen werden Fliegen einzeln in flüssigem Stickstoff

eingetaucht. Danach werden die Antennen mit einer Kanüle angestoßen, so dass sie in ein

stickstoffgekühltes Reaktionsgefäß fallen. Die isolierten Antennen werden bis zur

Weiterverarbeitung bei -80 °C gelagert. Die RNA wird mit dem „ZR Tissue & Indect RNA

MicroPrep“-Kit entsprechend den Herstellerangaben isoliert: Die Antennen werden mit

„BashingBeats“ und Lysepuffer im Homogenisator in drei Durchgängen a 30 Sekunden bei

6800 rpm (je 15 Sekunden Pause) zerkleinert und die RNA über Säulen aufgereinigt.


37

Überprüfung der Qualität und Quantität von RNA

Die Qualität und Quantität der isolierten RNA wird mit dem „Experion RNA StdSens

Analysis Kit“ nach Herstellerangaben überprüft, mit der Abweichung, dass die RNA vor dem

Aufbringen auf den Chip nicht bei 70 °C denaturiert wird. Hierdurch wird verhindert, dass es

zu einer Insekten-typischen „Degenerierung“ der ribosomalen RNA kommt (Winnebeck et

al., 2010; Balczun et al., 2012).

DNase-Verdau von RNA-Proben

Der DNase-Verdau erfolgt mit Abweichungen entsprechend den Herstellerangaben: Zur

Beseitigung von DNA-Resten in den RNA-Proben werden pro 50 µl-Ansatz jeweils 0,1 µg

RNA mit 3 U DNase I und 10x-Puffer versetzt und für 90 Minuten bei 37°C inkubiert.

Anschließend werden 3 µl 25 mM Ethylendiamintetraessigsäure zugegeben und die DNase

durch 10 Minuten bei 65°C inaktiviert.

Quantitative Expressionskontrolle

Die vergleichende quantitative Expressionskontrolle erfolgt durch Überprüfung der

Menge an mRNA über RT-PCR entsprechend Balczun et al. (2012): Die Analysen werden in

einem StepOnePlus-Thermocycler mit dem „One step MESA GREEN qRT-PCR MasterMix

Plus for SYBR assay“ Kit oder dem „iScript qRT-PCR“ Kit entsprechend den

Herstellerangaben durchgeführt. Die qRT-PCR-Analysen werden dreifach durchgeführt. Der

DNase I-Verdau wird durch qPCR ohne reverse Transkriptase überprüft. Die qRT-PCR-

Experimente erfolgen jeweils mit drei unabhängigen Proben. Die Primer-Effizienz wird

mittels LinRegPCR berechnet (Ramakers et al., 2003). Von drei identischen

Versuchsansätzen wird jeweils der durchschnittliche Ct-Wert ermittelt. Mit den

durchschnittlichen Ct-Werten werden die relativen Expressionsraten unter Berücksichtigung

der primerspezifischen Effizienz entsprechend Pfaffl (2001) errechnet. Zur Normalisierung

wird die mRNA des ribosomalen Proteins rp49 verwendet, deren Ct-Werte parallel

mitbestimmt werden. Die Ergebnisse werden mit der Excel-basierten Software REST

statistisch ausgewertet (Pfaffl et al., 2002).


38

qPCR-Programme

Programm A

(Eurogentec-Kit)

Programm B

(Bio-Rad-Kit)

Reverse Transkription 30 Minuten bei 48 °C

5 Minuten bei 95 °C



PCR: 40 Zyklen 15 Sekunden bei 95 °C

60 Sekunden bei 60 °C

Auslesen der Fluoreszenz



Auslesen der Fluoreszenz

Aufnahme der

Schmelzkurve



Aufnahme von 60° C bis 95° C

in Schritten von 0,3° C



Aufnahme von 55° C bis 95° C

in Schritten von 0,3° C

Ende 15 °C 15 °C

3.2.10 Elektrophysiologie

Elektroantennogramm (EAG)

Die elektrophysiologischen Messungen werden mit Abweichungen entsprechend Ayer

und Carlson (1991) sowie Störtkuhl und Kettler (2001) durchgeführt: Etwa fünf Tage alte

weibliche Fliegen werden in einer abgeschnittenen Pipettenspitze so fixiert, dass der anteriore

Teil des Kopfes aus der Spitze herausragt. Es werden immer nur weibliche Tiere benutzt, um

auch X-chromosomal liegende genetische Elemente vergleichen zu können. Die Pipetten-

spitze wird in Drosophila-Ringer gestellt und mit Knetmasse fixiert, so dass das Abdomen

Kontakt zur Flüssigkeit hat. Eine Referenzelektrode wird in den Kopf eingestochen und die

Fliege über den Drosophila-Ringer geerdet. Zur Ableitung wird die Messelektrode auf dem

dritten Antennensegment (Funiculus) gegenüber der Arista positioniert. Als Elektroden

werden unter Hitzeeinwirkung dünn ausgezogene, mit Drosophila-Ringer gefüllte

Glaskapillaren benutzt. Die Potentialdifferenz zwischen Messelektrode und Referenzelektrode

wird mittels Verstärker und Oszilloskop abgelesen und am Computer aufgezeichnet und

ausgewertet. Die Antenne wird über ein automatisiertes Applikationssystem stimuliert, bei

dem jeweils ein Luftstrom von 1 Liter pro Minute durch ein Gefäß mit einem der Duftstoffe

geleitet wird. Die angereicherte Luft wird in einen konstanten Luftstrom von 3 Liter pro

Minute geleitet, der auf die Antenne gerichtet ist. Die Dauer der Applikation eines Duftstoffes


39

beträgt jeweils eine Sekunde. Zwischen den verschiedenen Duftstoffen wird für jeweils 10

Sekunden Luft ohne Duftstoff in den konstanten Luftstrom geblasen, so dass es keine

Veränderungen im Gesamtvolumen pro Zeiteinheit gibt. Bei verdünnten Duftstoffen erfolgt

die Verdünnung immer in Paraffinöl.

Die Amplituden werden mit „Mesfile-Fewer“ ausgewertet. Dabei werden die Messwerte

manuell ausgelesen. Die Datensammlung erfolgt über Exel. Die statistische Auswertung

geschieht mit SPSS durch den Levene-Test der Varianzgleichheit gefolgt von einem t-Test.

Dabei werden Werte p ≤ 0,05 als „signifikant“, Werte p ≤ 0,01 als „sehr signifikant“ und

Werte p ≤ 0,001 als „hoch signifikant“ gewertet.

Zur Auswertung der Kinetik der EAG-Messungen werden die Zahlenwerte, die den

Stromkurven zu Grunde liegen, aus „Mesfile-Fewer“ exportiert und in Excel ausgewertet:

Anhand der Applikationsdauer werden die Datenbereiche der einzelnen Messungen ermittelt.

Der Bereich eine Sekunde vor der Applikation, während der Applikation und zwei Sekunden

nach der Applikation werden aus den Tabellen isoliert und in eine Kurve umgewandelt. Die

Kurve wird in Photoshop importiert und mit Hilfe von Hilfslinien und Lineal die Nulllinie

und maximale Amplitude abgelesen. Es wird die Zeit ermittelt, die zwischen dem Beginn der

Depolarisation und dem Erreichen von zwei Dritteln der maximalen Amplitude vergeht

(t 2/3). Ebenfalls wird die Zeit t 1/3 bestimmt, die bei Beendigung des Reizes zwischen dem

Beginn der Repolarisation und dem Rückgang auf ein Drittel der maximalen Amplitude

vergeht (siehe Abbildung 27, Kapitel 4.8). Die statistische Auswertung geschieht wie bei den

EAG-Amplituden. Die graphische Auswertung erfolgt in Form eines Box-Whisker-

Diagramms.

Elektroretinogramm (ERG)

Die elektrophysiologischen Ableitungen vom Auge werden modifiziert entsprechend

Kelly und Suzuki (1974) durchgeführt. Die Fliegen werden wie beim EAG fixiert, geerdet

und mit der Referenzelektrode verbunden. Die Messelektrode wird leicht ins Auge

eingestochen, so dass die Spitze innerhalb der Retina liegt. Mittels Kaltlichtquelle und der

Verschlusseinheit eines umfunktionierten Fotoapparates werden die Lichtreize appliziert. Bei

Messungen mit farbigem Licht werden entsprechende Filter in den Strahlengang integriert.

Die Amplituden werden über Verstärker und Oszilloskop an den Computer weitergegeben

und dort aufgezeichnet. Die statistische Auswertung erfolgt entsprechend der EAG-Versuche.


40

3.2.11 Verhaltenstests (T-Maze)

Die Verhaltensversuche im T-Maze werden nach dem Aufbau von Tully und Quinn

(1985) und Helfand und Carlson (1989) durchgeführt: Mindestens 24 Stunden vor dem

Versuch werden die Fliegen mit CO2 betäubt, nach Geschlechtern sortiert und die weiblichen

Tiere auf frischem Fliegenfutter bis zum Test aufbewahrt. In eine Kammer eines vertikalen

Schiebers werden jeweils mindestens 30 Fliegen platziert. An der Rückwand der Kammer

wird kontinuierlich Luft abgesaugt. Nach dem Einfüllen der Fliegen wird der Raum komplett

abgedunkelt. Zu Beginn des Versuches wird die Kammer durch Absenken des Schiebers

zwischen zwei Rohre gebracht, an deren Enden sich entweder 100 µl eines verdünnten

Duftstoffes auf Filterpapier befindet oder Paraffinöl. Die verdünnten Duftstoffe sind dabei

jeweils in Paraffinöl gelöst. Die Fliegen haben nun 30 Sekunden Zeit sich zu dem Duftstoff

hin oder von ihm weg in eines der beiden Rohre zu bewegen. Danach wird durch Anheben

des Schiebers der Durchgang zwischen den Rohren verschlossen. Die Fliegen in den beiden

Rohren werden ausgezählt und der Responseindex (RI) nach der folgenden Formel berechnet:

RI = (K-T) / (K+T)

Dabei steht K für die Fliegen auf der Kontrollseite (Paraffinöl) und T für die Fliegen auf

der Testseite mit dem Duftstoff. Die statistische Auswertung erfolgt entsprechend den EAG-

Versuchen.

Ergebnisse

41

4 Ergebnisse

4.1 Expression der Or43a-Domänen

Bereits in Vorversuchen waren die DNA-Sequenzen der extrazellulären Domänen EC1,

EC2, EC3 und EC4 sowie die intrazellulären Domänen IC1 und IC3 in Responderlinien des

Gel4-Systems eingebaut worden (siehe Abbildung 7, Kapitel 2.5). An Nachkommen von

Kreuzungen mit antennenspezifischen Treiberlinien wurde die Expression anhand von

Antikörper-Färbungen für die Domänen EC1, EC2, EC3 und IC3 nachgewiesen (Lange,

2007).

4.1.1 Herstellung von Treiberlinien zur Expression der IC2 und IC4

Die Domänen IC2 und IC4 lagen noch nicht in Responderlinien des Gal4-Systems vor.

Daher wurde die DNA-Sequenz der Domänen, integriert in den Vektor pUAST-N-His, zur

Injektion in Drosophila-Eier eingeschickt. Dabei wurde ein Gemisch der beiden Vektoren

zusammen in die Embryonen injiziert. Von den erhaltenen Tieren wurden sechs unabhängige

Fliegenlinien gewonnen. Über die entsprechenden Kreuzungen wurde für die sechs Linien

bestimmt, welches Chromosom jeweils das eingebaute genetische Konstrukt trägt. Eine der

Linien hatte eine X-chromosomale Insertion und je zwei der Linien hatten eine zweit- bzw.

drittchromosomale Insertion. Bei der sechsten Fliegenlinie war die Letalität nach Kreuzung

mit der Balancerlinie so hoch, dass der Insertionsort nicht bestimmt werden konnte.

Da die Vektoren der beiden Domänen zusammen in die Embryonen injiziert worden

waren, musste nun bestimmt werden, welche der Domänen jeweils in den Fliegenlinien

vorhanden war. Um dieses zu überprüfen, wurde die genomische DNA von jeweils 40 Fliegen

aufgereinigt und eine PCR zur Genotypisierung durchgeführt. Für die PCR wurde jeweils der

5´-pUAST-Primer verwendet sowie entweder der Primer 3´-IC2 oder 3´-IC4. Bei der

Standarddurchführung mit einer Annealing-Temperatur von 50 °C wurden bei mehreren

Fliegenlinien mit beiden Primerpaaren DNA-Fragmente amplifiziert. Um auszuschließen,

dass es sich hierbei um unspezifische Amplifikationen handelt, wurden die PCR-Bedingungen

entsprechend Mülhardt (2009) angepasst. Zur Gewährleistung einer möglichst hohen

Stringenz wurde eine Gradienten-PCR durchgeführt, bei der die Annealing-Temperatur von

60 °C bis 65 °C variierte. Die Spezifität der PCR wurde anhand des Vektors pUAST-N-His-

IC4 überprüft. Das Ergebnis dieser PCR ist in Abbildung 9 dargestellt. Bei positiver

Amplifikation wäre bei beiden Primern eine Bande im Bereich von 200 Basenpaaren (bp) zu

Ergebnisse

42

erwarten gewesen. In dieser Größenordnung trat nur mit dem 3´-IC4-Primer eine Bande auf.

Dieses war unabhängig von der Temperatur im gewählten Bereich. Daher wurde für die

folgenden PCRs mit 60 °C die Temperatur ausgewählt, die am nächsten am theoretischen

Optimum von 57,5 °C liegt.

Abbildung 9: Gelelektrophoretische Kontrolle der PCR-Spezifität zur IC4-Amplifikation

Bei den Spuren 1-6 wurde mit dem 3´-IC2 Primer amplifiziert, bei den Spuren 7-12 mit dem 3´-IC4-

Primer. Annealing-Temperaturen: Spur 1 und 7: 60 °C; Spur 2 und 8: 60,9 °C; Spur 3 und 9: 61,8 °C;

Spur 4 und 10: 62,7 °C; Spur 5 und 11: 63,6 °C; Spur 6 und 12: 65 °C. M =Marker (O´GeneRuler

100 bp Plus DNA Ladder).

Nach der Optimierung der PCR-Bedingungen wurden die Tests auf Integration von IC2

und IC4 in den transgenen Fliegen wiederholt. Auch hier wurden bei vier der sechs

Fliegenlinien beide Domänen gefunden (siehe Abbildung 10). Durch die Anpassungen der

PCR-Bedingungen waren Amplifikationen aufgrund unspezifischer Bindungen eines

3´-Primers an die DNA-Sequenz der falschen Domäne, ausgeschlossen worden. Daher

beruhten die Ergebnisse mit Banden bei beiden Domänen tatsächlich auf Doppelintegrationen.

Bei diesen Fliegen gab es nun die Möglichkeit, dass entweder beide Domänen zusammen auf

einem Chromosom vorhanden waren oder sie unabhängig in verschiedenen Chromosomen

vorlagen. In dem zweiten Fall hätten die Domänen durch Isomerisierungs-Kreuzungen

getrennt werden können. Daher wurden die sechs Fliegenlinien isomerisiert, indem

Ergebnisse

43

jungfräuliche Tiere mit white-Fliegen gekreuzt wurden. Diese Kreuzung wurde in den

folgenden Generationen fünf Mal wiederholt. Bei Integration auf verschiedenen

Chromosomen wären mit einer Wahrscheinlichkeit von 64:1 die beiden Domänen

voneinander getrennt worden.

Abbildung 10: Gelelektrophoretische PCR-Kontrolle zur Integration von IC2 und IC4 in

transgenen Fliegenlinien

In den acht Spuren nach dem ersten Marker (M) wurde mit dem Primer 3´-IC2 auf die Domäne IC2

getestet. In den acht Spuren nach dem zweiten Marker wurde mit dem 3´-IC4 Primer auf die Domäne

IC4 getestet. 1-6 = getestete transgene Fliegenlinie; WT = Kontrolle an wildtypischen Fliegen;

H = H2O-Kontrolle. M = Marker (O´GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder).

Nach der Isomerisierung wurden die Fliegenlinien wieder über PCR auf die Integration

der beiden Domänen überprüft. Auch hier traten wieder doppelte Insertionen auf. Alle

Fliegenlinien enthielten die Domäne IC4. Zusätzlich enthielten einige Linien die IC2. In der

Abbildung 11 sind die gelelektrophoretischen PCR-Kontrollen derjenigen Linien gezeigt,

welche für die nachfolgenden Versuche ausgewählt wurden. Eine Aufstellung dieser

Fliegenlinien ist in der Tabelle 1 zusammengefasst. Drei der Linien enthalten nur die IC4,

fünf der Linien enthalten die IC2 zusammen mit der IC4.

Ergebnisse

44


isomerisierten Fliegenlinien

In den Spuren zwischen den Markern wurde auf Amplifikation der IC2 überprüft, in den Spuren nach

dem zweiten Marker auf Amplifikation der IC4. Überprüft wurden die angezeigten transgenen

Fliegenlinien sowie white-Fliegen und Wasser als Kontrollen.

Marker: O´GeneRuler 50 bp DNA Ladder.

Tabelle 1: Ausgewählte isomerisierte Fliegenlinien

Name Enthaltene Domäne Betroffenes Chromosom

IC2+4 (1-1) IC2 + IC4 X

IC4 (2-1) IC4 3

IC4 (2-3) IC4 3

IC2+4 (2-4) IC2 + IC4 2

IC2+4 (3-1) IC2 + IC4 X

IC4 (4-1) IC4 X

IC2+4 (6-1) IC2 + IC4 3

IC2+4 (6-2) IC2 + IC4 3

Ergebnisse

45

4.1.2 Zelluläre Lokalisation der IC2 und IC4

Im nächsten Schritt wurden Kreuzungen mit der Treiberlinie Or83b-Gal4 durchgeführt,

um die Domänen in den ORNs zu exprimieren. Es sollte nun die Expression der Domänen

überprüft werden. Hierzu wurden Kryoschnitte der Fliegenköpfe angefertigt und Antikörper-

Färbungen durchgeführt. Als primärer Antikörper wurde ein monoklonaler Mäuseantikörper

verwendet, der gegen den N-terminalen His-Tag der Domänen gerichtet ist. Als sekundärer

Antikörper wurde ein gegen Mäuseantikörper gerichteter Ziegenantikörper verwendet, an den

der Fluoreszenzfarbstoff Cy3 gebunden ist. Die Ergebnisse der Antikörper-Färbung an

Fliegen, die nur IC4 exprimieren, sind in Abbildung 12 A-I zu sehen. Bei den drei

Fliegenlinien wurden Bereiche entlang des Randes der Antennen angefärbt, bei denen es sich

wahrscheinlich um die ORNs handelt. Es sind rundliche bis konische Bereiche mit etwa

zellulärer Größe, die teilweise spitz in Richtung der Sensillen ziehen. In den äußeren

Bereichen der Sensillenschäfte ist keine Fluoreszenz detektierbar.

Ein vergleichbares Ergebnis wie bei der Domäne IC4 ist auch bei den Tieren zu sehen,

die zusätzlich noch die Domäne IC2 in den ORNs exprimieren (siehe Abbildung 13).

Teilweise zieht sich hier die Fluoreszenz noch weiter in die Schäfte der Sensillen hinein, aber

auch bei diesen Fliegen reicht die Fluoreszenz nicht bis in die äußeren Bereiche der

Sensillenschäfte.

Zur Überprüfung, ob es sich bei den Antikörper-Färbungen tatsächlich um Färbungen

der Domänen handelt, wurden Färbungen an den Parentallinien durchgeführt. In Abbildung

12 J und K ist die Parentallinie Or83b-Gal4 zu sehen. Hier ist keine Fluoreszenz in den

Antennen auszumachen.

Ergebnisse

46

Abbildung 12: IC4-Expression in der Antenne

A-I: Horizontale Kryoschnitte des dritten Antennengliedes von Fliegen, die IC4 in allen ORNs

exprimieren. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen in der ersten Spalte zeigen die Expression

der antikörpermarkierten Domäne IC4. In der mittleren Spalte sind Durchlichtaufnahmen derselben

Antennenschnitte dargestellt. Die dritte Spalte zeigt Überlagerungen von Durchlicht- und

Fluoreszenzmikroskopie. Die Expression der IC4 wurde jeweils von der Linie Or83b-Gal4 getrieben.

Die Responderlinie ist bei A-C: IC4 (2-1); bei D-F: IC4 (2-3); bei G-I: IC4 (4-1)

J und K: Horizontale Kryoschnitte des dritten Antennengliedes der Treiberlinie Or83b-Gal4 als

Negativkontrolle. Bei der fluoreszenzmikroskopischen Aufnahme (J) nach Antikörper-Färbung ist

keine Fluoreszenz erkennbar. K zeigt denselben Antennenschnitt in einer Durchlichtaufnahme.

Ergebnisse

47

Abbildung 13: Expression der Domänen IC2 und IC4 zusammen in der Antenne

Abgebildet sind horizontale Kryoschnitte des dritten Antennengliedes von Fliegen, die IC2 zusammen

mit IC4 in allen ORNs exprimieren. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen in der ersten Spalte

zeigen die Expression der antikörpermarkierten Domänen IC2 und IC4. In der mittleren Spalte sind

jeweils Durchlichtaufnahmen derselben Antennenschnitte dargestellt. Die dritte Spalte zeigt jeweils

Überlagerungen von Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie. Die Expression der Domänen wurde

jeweils von der Linie Or83b-Gal4 getrieben. Die Responderlinie ist bei A-C: IC2+4 (1-1); bei D-F:

IC2+4 (3-1); bei G-I: IC2+4 (6-1); bei J-L: IC2+4 (6-2).

Ergebnisse

48

4.1.3 Expressionsrate der Domänen am Beispiel der IC4 über

quantitative RT-PCR

Die fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen zeigten, dass die intrazellulären und

extrazellulären Domänen jeweils in Antennen exprimiert werden. Die

Fluoreszenzmikroskopie erlaubte aber keine Aussagen zur Quantität der exprimierten

Domänen. Um am Beispiel der IC4 Aussagen treffen zu können, wie viel der Domänen-DNA

transkribiert wird, wurden die Responderlinien IC4 (2-1), IC4 (2-3) und, IC4 (4-1) mit der

Linie Or83b-Gal4 gekreuzt und von den weiblichen F1-Nachkommen Antennen präpariert.

Als Kontrolle wurden außerdem Antennen von weiblichen white-Fliegen präpariert. Aus den

Antennen wurde jeweils die RNA aufgereinigt. Die Qualität der RNA wurde durch

Elektrophorese im Chipmaßstab überprüft. Das Ergebnis der Elektrophorese ist am Beispiel

der Nachkommen von [IC4 (2-3) x Or83b-Gal4] in der Abbildung 14 dargestellt. In den

Bereichen von 39 und 40 Sekunden befanden sich die Peaks der 18S und 28S Untereinheiten

der Ribosomen. Die beiden ribosomalen Peaks waren deutlich höher als der Rest der Kurve,

was auf eine nicht degradierte RNA hindeutet. Anhand der Kurve wurde automatisch jeweils

der RQI-Wert errechnet. Dabei besitzt eine völlig intakte RNA einen RQI-Wert von zehn und

eine völlig degradierte RNA einen RQI-Wert von eins. Die RNA der Abbildung 14 besaß

einen RQI-Wert von 9,2. Die Elektrophorese-Diagramme der anderen RNA-Proben sind im

Anhang ab Seite 96 zu finden. Die RNA-Konzentrationen sowie die RQI-Werte der Proben

sind in Tabelle 2 aufgeführt. Mit Ausnahme der Probe C von white-Fliegen, die einen RQI-

Wert von 7,1 besaß, hatten alle Proben einen RQI-Wert größer als acht. Alle Proben konnten

auf Grund der hohen RQI-Werte für die qPCR weiterverwendet werden.

Abbildung 14: RNA-Analyse der Antennen von F1-Tieren aus [IC4 (2-3) x Or83b-Gal4], Probe A

Ergebnisse

49

Tabelle 2: RQI-Werte und Konzentrationen antennaler RNA-Proben von F1-Nachkommen der

angezeigten Treiberlinien x Or83b-Gal4 und von white-Fliegen

RQI-Wert Konzentration (pg/µl)

Probe A Probe B Probe C Probe A Probe B Probe C

IC4 (2-1) 9,4 8,5 8,1 2667 2748 9850

IC4 (2-3) 9,2 9,1 8,5 37004 3715 4498

IC4 (4-1) 9,2 8,6 8,2 4190 4456 5402

white 8,2 8,2 7,1 5788 6249 5725

Die RNA-Proben wurden nach der Qualitätskontrolle mit DNase I behandelt, um zu

verhindern, dass DNA-Rückstände die anschließenden PCR-Versuche beeinflussen. Der

DNase-Verdau wurde durch eine qPCR entsprechend qPCR-Programm A (siehe Seite 38)

überprüft. Es wurden die RNA-Proben aus Tabelle 2 mit den Primern 609 und 610 zur

Amplifikation des Referenzgens rp49 eingesetzt. Dabei wurde jeweils in einem Ansatz die

PCR mit reverser Transkription durchgeführt, in einem weiteren Ansatz wurde die reverse

Transkriptase jeweils durch Wasser ersetzt. Mit reverser Transkriptase zeigte sich bei der

Schmelzkurve eine Schmelztemperatur von 86,5 °C (siehe Seite 101). Da ohne reverse

Transkriptase keine Amplifikation dieser DNA geschah, war der DNase Verdau erfolgreich

verlaufen. In gleicher Weise wie beim rp49 wurde auch mRNA der Domäne IC4 mit den

Primern 207 und 208 aus den RNA-Proben der drei transgenen Linien amplifiziert.

Zur Bestimmung der relativen mRNA Menge der exprimierten Domäne IC4 wurden

weitere qRT-PCRs entsprechend qPCR-Programm B durchgeführt. In jeweils drei identischen

Ansätzen wurden die RNA-Proben aus Tabelle 2 auf IC4-mRNA (Primer 207 und 208) und

auf rp49-mRNA (Primer 609 und 610) getestet. Die Ct-Werte der Amplifikationen sind im

Anhang in Tabelle 5 aufgeführt. Aus den Fluoreszenzdaten der Versuche wurde für die beiden

Primerpaare die Primereffizienz ermittelt: Die Primereffizienz der Referenz rp49 betrug

1,903, diejenige der IC4 betrug 1,993. Aus den Ct-Werten und der Primereffizienz wurde die

relative Expressionsrate der IC4 in den verschiedenen Fliegenlinien ermittelt und in Relation

zu [IC4 (2-1) x Or83b-Gal4]-F1-Fliegen in Abbildung 15 A aufgetragen. Zwischen den

einzelnen Fliegenlinien traten dabei keine signifikanten Unterschiede auf: Mit Faktoren von

0,95 ± 0,57 bei den F1-Nachkommen von [IC4 (2-3) x Or83b-Gal4] und 1,14 ± 0,41 bei den

F1-Nachkommen von [IC4 (4-1) x Or83b-Gal4] gab es keine erkennbaren Unterschiede

zwischen den transgenen Tieren.

In einer weiteren qRT-PCR wurde mit den Primeren 612 und 608 entsprechend PCR-

Programm B auf Expression der IC4 getestet. Bei diesem Primerpaar wurde nicht nur das

Ergebnisse

50

exprimierte IC4-Fragment amplifiziert, sondern zusätzlich auch die endogene IC4 des

Rezeptors Or43a. Somit konnte die Menge an IC4 der transgenen Fliegen mit der Menge an

Or43a in white-Fliegen verglichen werden. Dabei besaßen die Primer eine Primereffizienz

von 1,975. Bei den drei IC4-exprimierenden Fliegenlinien konnte im Vergleich zu den white-

Fliegen jeweils ein vielfaches an IC4-mRNA festgestellt werden (Abbildung 15 B). Bei den

Nachkommen von [IC4 (2-1) x Or83b-Gal4] trat das 29,6-fache (±8,66) auf. Bei den

Abkömmlingen von [IC4 (2-3) x Or83b-Gal4] und [IC4 (4-1) x Or83b-Gal4] waren es die

Faktoren 23,18 (±8,58) bzw. 27,77 (±9,97). Die IC4-Fragment-exprimierenden Fliegen

bildeten damit alle drei hoch signifikant erhöhte Mengen der Domäne. Innerhalb der trans-

genen Tiere wurde keine große Abweichung in der Expressionsrate festgestellt.

Sowohl der Vergleich der Expression des IC4-Fragmentes als auch der Vergleich der

Gesamtmenge an IC4 zeigte keine großen Unterschiede in der Expressionsrate auf der Ebene

der mRNA.

Abbildung 15: Relative Quantifizierung der IC4 mRNA

A: Quantitativer Vergleich IC4-exprimierender Fliegenlinien untereinander: Die relative Menge an

mRNA der IC4-Fragmente der Nachkommen von [IC4 (2-3) x Or83b-Gal4] bzw. [IC4 (4-1) x Or83b-

Gal4] in Relation zu F1-Tieren von [IC4 (2-1) x Or83b-Gal4].

B: Quantitativer Vergleich der Gesamtmenge an IC4 von F1-Nachkommen der angezeigten

Treiberlinien x Or83b-Gal4 in Relation zu white-Fliegen. Die Balken zeigen die Menge an mRNA der

endogenen IC4 des Rezeptors Or43a zusammen mit dem exprimierten IC4-Fragment in Relation zur

endogenen IC4 des Or43a von white-Fliegen.

Fehlerbalken = SEM. Signifikanzen: *** = p ≤ 0,001.

Ergebnisse

51

4.2 Von den extrazellulären Domänen zeigt nur EC4 erhöhte

Amplituden im Elektroantennogramm

Bereits in Vorversuchen waren Tiere, die die extrazellulären Domänen EC1, EC2, EC3

und EC4 in den ORNs exprimieren, auf eine veränderte Reizantwort im

Elektroantennogramm (EAG) stichprobenartig untersucht worden. Dabei waren keine

auffälligen Veränderungen der olfaktorischen Reizantwort gefunden worden (Lange, 2007).

Dieses sollte in der vorliegenden Arbeit anhand eines erweiterten Spektrums an Duftstoffen

überprüft werden. Dafür wurden EAG-Messungen mit den Standard-Duftstoffen

Propionsäureethylester (PEE), Ethylcaproat (EC), Isoamylacetat (IA), Octylacetat (OA),

Diethylsuccinat (DES), 1-Octanol (OctOH), Cyclohexanol (cHOH), n-Butanol (nBUOH),

Methylsalicylat (MeSa), Ethylacetat (EA), Methylacetat (MA) und Benzaldehyd (BA)

durchgeführt. Dabei wurden PEE, EC, OA, MeSa, EA und MA jeweils in einer 1/100

Verdünnung in Paraffinöl eingesetzt. Zusätzlich wurde immer Paraffinöl als Kontrolle mit

appliziert.

Bei EAG-Messungen an zwei Fliegenlinien, die EC1 in allen ORNs exprimieren, lag

kein Unterschied zum Wildtyp vor (siehe Abbildung 16). Nur bei einem einzigen Duftstoff

trat eine signifikante Veränderung auf und das auch nur bei einer der beiden Fliegenlinien:

Bei Messungen mit EA an den F1-Nachkommen von [EC1 (15-5) x Or83b-Gal4] war die

Amplitude mit 23,92±1,85 mV im Vergleich zum Wildtyp (19,75±0,77 mV) erhöht. Ein

weiterer signifikanter Unterschied wurde bei der Kontrollmessung mit Paraffinöl bei den F1-

Tieren [EC1 (35-3) x Or83b-Gal4] gemessen. Bei der zweiten Fliegenlinie war wiederum

keine signifikante Veränderung gegenüber dem Wildtyp feststellbar.

Bei Expression der EC2 in allen ORNs [EC2 (9-1) x Or83b-Gal4] wurden im EAG

Reizantworten beobachtet, die denen des Wildtyps entsprachen (siehe Abbildung 17).

Lediglich bei cHOH lag mit 7,2±0,33 mV eine signifikante Erniedrigung gegenüber dem

Wildtyp (8,84±0,48 mV) vor. Bei cHOH handelt es sich um einen der beiden getesteten

Or43a-Liganden. Der zweite getestete Ligand, BA, führte im Gegensatz hierzu zu einer leicht

erhöhten Reizantwort ohne signifikante Abweichung vom Wildtyp.

Ein ähnliches Bild wie bei EC2 ergab sich auch bei EC3: Bei den F1-Nachkommen aus

[EC3 (23-5) x Or83b-Gal4] lag kein Unterschied zum Wildtyp vor (siehe Abbildung 18).

Lediglich bei DES trat mit 5,29±0,54 mV eine signifikant erniedrigte Reizantwort auf

(Wildtyp: 6,94±0,35 mV).

Ergebnisse

52

Abbildung 16: EAG bei Expression der EC1

Vergleich wildtypischer Fliegen mit EC1-exprimierenden F1-Nachkommen aus EC1 (15-5) bzw. EC1

(35-3) und Or83b-Gal4. Fehlerbalken = SEM. Signifikanz: * = p ≤ 0,05.


Vergleich wildtypischer Fliegen mit EC2-exprimierenden F1-Nachkommen aus [EC2 (9-1) x Or83b-

Gal4]. Fehlerbalken = SEM. Signifikanz: * = p ≤ 0,05.

Ergebnisse

53



Gal4]. Fehlerbalken = SEM. Signifikanz: * = p ≤ 0,05.

Im Gegensatz zu den Messungen an EC1, EC2 und EC3 traten bei der Domäne EC4

größere Abweichungen vom Wildtyp auf (siehe Abbildung 19). Bei den F1-Nachkommen von

[EC4 (13-1) x Or83b-Gal4] sowie [EC4 (62-1) x Or83b-Gal4] lagen bei allen Messungen

erhöhte Werte im Vergleich zum Wildtyp vor. Bei den EC4 (62-1) Nachkommen waren mit

OA, DES, OctOH, MeSa, EA und BA die Reizantworten bei sechs der getesteten zwölf

Duftstoffe signifikant erhöht. Bei OctOH (8,92±0,61 mV gegenüber 6,97±0,26 mV beim

Wildtyp) und BA (6,58±0,58 mV gegenüber 5,06±0,23 mV beim Wildtyp) waren die

Abweichungen sogar sehr signifikant. Die EC4 (13-1) Nachkommen zeigten mit PEE, EC,

OA, DES, OctOH, MeSa, EA, MA und BA bei neun der zwölf Duftstoffe eine signifikante

Erhöhung. Bei OA, DES und MA waren die Erhöhungen sehr signifikant. Bei OctOH

(8,85±0,53 mV gegenüber 6,97±0,26 mV beim Wildtyp) MeSa (14,00±0,67 mV gegenüber

11,17±0,45 mV beim Wildtyp) und EA (25,40±1,20 mV gegenüber 19,75±0,77 mV beim

Wildtyp) waren die Erhöhungen hoch signifikant. Bei diesen Fliegen trat auch eine

signifikante Erhöhung bei der Kontrollmessung mit Paraffinöl auf, wodurch die Aussagekraft

der Ergebnisse etwas abgeschwächt wurde. Da aber bei der Hälfte der Duftstoffe die

Unterschiede sehr signifikant oder hoch signifikant waren, fand sich zumindest für diese

Messungen eine veränderte Reizantwort. Die Erhöhung der Reizantworten war bei beiden

Ergebnisse

54

Linien unabhängig von den Agonisten des Rezeptors Or43a, aus dem die exprimierten

Domänen stammten: Weder bei cHOH noch bei BA traten Abweichungen auf, die im

Vergleich mit den anderen Duftstoffen auffällig waren.



Gal4] bzw. [EC4 (62-1) x Or83b-Gal4]. Fehlerbalken = SEM. Signifikanzen: * = p ≤ 0,05; ** = p ≤

0,01; *** = p ≤ 0,001.

4.3 Expression der intrazellulären Domäne IC1 führt zu

wildtypischen Elektroantennogramm-Amplituden

Wie bei den extrazellulären Domänen waren auch die intrazellulären Domänen IC1 und

IC3 in einer Vorarbeit in Responderlinien des Gal4 Systems integriert worden (Lange, 2007).

Es galt nun zu überprüfen, ob die Expression der Domänen einen Einfluss auf das

Riechvermögen der Fliegen besitzt. Hierzu wurden die Tiere mit der Treiberlinie Or83b-Gal4

gekreuzt und die F1-Nachkommen elektrophysiologisch untersucht.

Bei den Fliegen, die die IC1 exprimieren, entsprachen die Amplituden der Messungen in

etwa denen des Wildtyps (siehe Abbildung 20). Bei den Nachkommen der Linie IC1 (10-1)

trat kein signifikanter Unterschied auf. Bei der Linie IC1 (27-1) gab es eine signifikante

Ergebnisse

55

Reduktion der Reizantwort bei nBuOH. Die Amplitude betrug hier 6,55±0,40 mV, während

beim Wildtyp 8,03±0,37 mV gemessen wurden. Bei den Nachkommen der dritten Linie,

IC1 (35-1), gab es beim Duftstoff BA mit 6,00±0,40 mV eine signifikante Erhöhung

(5,06±0,23 mV beim Wildtyp). Zusätzlich lag es hier auch noch eine signifikante Erhöhung

bei der Paraffinkontrolle vor. Bei den Nachkommen der drei Linien traten weder hoch

signifikante noch sehr signifikante Abweichungen vom Wildtyp auf.

Abbildung 20: EAG bei Expression der IC1

Vergleich wildtypischer Fliegen mit IC1-exprimierenden F1-Nachkommen der Responderlinien

IC1 (10-1), IC1 (27-1) und IC1 (35-1) und der Treiberlinie Or83b-Gal4. Fehlerbalken = SEM.

Signifikanz: * = p ≤ 0,05.

4.4 Die Elektroantennogramm-Amplituden der intrazellulären

Domäne IC3 entsprechen größtenteils dem Wildtyp

Auch bei den Fliegen, die IC3 exprimieren, fand sich größtenteils im EAG kein

Unterschied zum Wildtyp (siehe Abbildung 21). Die Nachkommen der Kreuzung aus

[IC3 (5-1) x Or83b-Gal4] zeigten nur geringe Abweichungen zu den Kontrollfliegen. Die

Werte lagen mal über und mal unter denen des Wildtyps. Lediglich bei OA und DES gab es

signifikante Abweichungen, wobei bei OA mit 4,40±0,30 mV (3,66±0,17 mV beim Wildtyp)

Ergebnisse

56

eine erhöhte Reizantwort vorlag und bei DES mit 5,45±0,47 mV eine erniedrigte

(6,94±3,6 mV beim Wildtyp). Wie bei den Nachkommen der Linie IC3 (5-1) schwankten

auch bei denen der Linie IC3 (45-1) die Werte um die des Wildtyps. Während bei OA die

Amplitude nahezu identisch mit der Kontrolle war (3,32±0,37 mV gegenüber 3,66±0,17 mV),

gab es bei DES mit 4,27±0,28 mV eine hoch signifikante Erniedrigung. Ebenfalls bei MeSa

trat mit 2,41±0,15 mV eine stärkere, sehr signifikante Abweichung vom Wildtyp

(3,38±0,24 mV) auf. Im Gegensatz hierzu lag bei den Messungen von IC3 (5-1) mit MeSa

eine leicht erhöhte Reizantwort ohne Signifikanz vor (3,74±0,53 mV). Bei den Nachkommen

der Linie IC3 (45-1) trat neben den beiden erwähnten sehr bzw. hoch signifikanten

Verringerungen der Reizantwort bei den Duftstoffen DES und MeSa auch noch eine sehr

signifikante Verringerung beim Paraffinöl auf.


Vergleich wildtypischer Fliegen mit IC3-exprimierenden F1-Nachkommen aus [IC3 (5-1) x Or83b-

Gal4] bzw. [IC3 (45-1) x Or83b-Gal4]. Fehlerbalken = SEM. Signifikanzen: * = p ≤ 0,05; ** = p ≤

0,01; *** = p ≤ 0,001.

Ergebnisse

57

4.5 Bei Expression der IC4 entsprechen die Elektroantennogramm-

Amplituden teilweise denen des Wildtyps, teilweise variieren

sie

Der nächste Schritt war die elektrophysiologische Charakterisierung der Domänen IC2

und IC4. Die Ergebnisse für die IC4 sind in Abbildung 22 zusammengefasst. Insgesamt lag

keine veränderte Geruchswahrnehmung im EAG vor. Dennoch gab es für jeweils einzelne

Werte der drei gemessenen Linien Abweichungen vom Wildtyp. Bei der Messung mit OA trat

bei den Nachkommen der Kreuzung aus [IC4 (2-1) x Or83b-Gal4] mit 5,45±0,39 mV im

Vergleich zum Wildtyp (4,02±0,24 mV) eine sehr signifikant erhöhte Reizantwort auf. Bei

den anderen beiden Fliegenlinien, die IC4 exprimieren, war dagegen bei OA keine

signifikante Veränderung festzustellen. Bei den Abkömmlingen von IC4 (2-3) betrug die

durchschnittliche Amplitude 4,76±0,34 mV, bei denen von IC4 (4-1) 3,91±0,18 mV.


Vergleich wildtypischer Fliegen mit IC4-exprimierenden F1-Nachkommen der Responderlinien

IC4 (2-1), IC4 (2-3) bzw. IC4 (4-1) und der Treiberlinie Or83b-Gal4. Fehlerbalken = SEM.

Signifikanzen: * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01.

Neben der sehr signifikanten Erhöhung bei OA gab es auch noch eine signifikant

vergrößerte Amplitude bei cHOH. Im Vergleich zum Wildtyp (9,23±0,57 mV) war der Wert

Ergebnisse

58

der Fliegen, die von IC4 (2-3) abstammen, mit 12,00±1,16 mV signifikant erhöht. Die

Nachkommen der Linien IC4 (2-1) und IC4 (4-1) zeigten mit 10,59±0,76 mV bzw. 9,33±0,54

mV keine signifikante Abweichung.

Zusätzlich zu beiden Erhöhungen gab es auch eine sehr signifikante Erniedrigung: Bei

den Nachkommen der Linie IC4 (4-1) war die durchschnittliche Amplitude bei DES mit

5,01±0,20 mV kleiner als beim Wildtyp (6,19±0,34 mV) und den beiden anderen Linien

(7,28±0,41 mV bzw. 6,83±0,58 mV).

4.6 Die Expression der Domänen IC2 und IC4 zusammen führt zu

erhöhten Reizantworten

Die Nachkommen der Kreuzungen aus IC2+4 (3-1), IC2+4 (6-1) oder IC2+4 (6-2) und

der Treiberlinie Or83b-Gal4 exprimierten die beiden Domänen IC2 und IC4 zusammen in den

ORNs. Die EAG-Messungen an diesen Tieren zeigten eine generell erhöhte Reizantwort

(siehe Abbildung 23). Es traten 17 signifikant erhöhte Amplituden auf, von denen sieben sehr

signifikant und vier hoch signifikant waren. Bis auf die Messung mit MA bei den

Nachkommen von IC2+4 (3-1), bei der die durchschnittliche Amplitude mit 8,8±0,99 mV

gegenüber dem Wildtyp (10,01±0,61 mV) reduziert war, waren alle Werte höher als beim

Wildtyp. Bei den meisten Duftstoffen waren die Reizantworten deutlich erhöht. Teilweise

traten aber stärkere Schwankungen in den Amplituden der Einzelmessungen auf, so dass z.B.

bei cHOH und EA keine signifikanten Abweichungen vorlagen. Bei anderen Duftstoffen

fanden sich dagegen deutliche Unterschiede. Bei PEE (1/100) und MeSa (1/100) waren bei

den drei Fliegenlinien die Werte sehr signifikant bis hoch signifikant erhöht. Bei OctOH war

die Amplitude bei IC2+4 (3-1) signifikant erhöht (5,86±0,52 mV gegenüber 4,65±0,30 mV

beim Wildtyp), bei den beiden anderen Linien war sie hoch signifikant erhöht (6,52±0,28 mV

bei IC2+4 (6-1); 6,44±0,35 mV bei IC2+4 (6-2)). Weniger eindeutig waren die Ergebnisse bei

IA (1/100), OA, DES, nBuOH, MA (1/100) und BA. Hier waren die Differenzen nicht für alle

drei Fliegenlinien signifikant. Bei EA (1/100) schienen die Werte zwar erhöht, es gab aber

keine signifikanten Abweichungen vom Wildtyp. Der einzige Duftstoff, bei dem die Werte

der drei Linien auf einem Niveau mit dem Wildtyp lagen, war EC.

Ergebnisse

59

Abbildung 23: EAG bei Expression der IC2 zusammen mit der IC4

Vergleich wildtypischer Fliegen mit F1-Nachkommen der Responderlinien IC2+4 (3-1), IC2+4 (6-1)

bzw. IC2+4 (6-2) und der Treiberlinie Or83b-Gal4. Diese F1-Nachkommen exprimieren jeweils IC2

zusammen mit IC4. Fehlerbalken = SEM. Signifikanzen: * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01; *** = p ≤ 0,001.

Die Expression der verschiedenen extra- und intrazellulären Domänen in den ORNs

führte, je nachdem welche Domäne exprimiert wurde, zu unterschiedlichen

elektrophysiologischen Ergebnissen (siehe Abbildung 16-23). Die Unterschiede der EAG-

Amplituden zu wildtypischen Amplituden sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Die Expression

einer intrazellulären und einer extrazellulären Domäne bewirkte zum Wildtyp erhöhte

Reizantworten; bei Expression zweier intrazellulärer Domänen waren die EAG-Amplituden

teilweise wildtypisch, teilweise unterschieden sie sich von denen des Wildtyps.

Ergebnisse

60

Tabelle 3: Auswirkung der Expression der extra- und intrazellulären Domänen in den ORNs auf

die Amplituden im EAG

Domäne Auswirkung der Expression aufs EAG

Extrazelluläre Domänen EC1 →

EC2 →

EC3 →

EC4 ↑

Intrazelluläre Domänen IC1 →

IC2 ↑

IC3 ↕→

IC4 ↕→

→ = wildtypisch; ↑ = erhöhte Reizantwort; ↕→ = teils wildtypisch, teils abweichend

4.7 Die Expression der Domänen wirkt sich auf das olfaktorische

Verhalten aus

Die EAG-Messungen belegten, dass die Expression der intra- und extrazellulären

Domänen des Or43a teilweise die Stärke der Reizantworten beeinflussten. Es stellte sich die

Frage, ob diese Veränderungen eine Auswirkung auf das Verhalten der Tiere bewirkt.

Deshalb wurde in T-Maze-Versuchen getestet, ob eine Substanz attraktiv oder abstoßend auf

die Tiere wirkt. Bei attraktiven Duftstoffen ergab sich aus dem T-Maze ein negativer

Responseindex (RI), bei abstoßenden Duftstoffen ein positiver. Getestet wurden neben dem

Wildtyp Fliegen, die die verschiedenen Domänen des Or43a exprimieren. Die

durchschnittlichen RI-Werte für Messungen mit dem Or43a-Agonisten BA, in einer

Konzentration von 1:100, sind in Abbildung 24 dargestellt. Der Wildtyp zeigte mit einem RI

von 0,40±0,05 ein repellentes Verhalten auf den Duftstoff. Ähnliche Werte ergaben sich auch

bei Expression der Domänen IC1, EC1, EC2 und EC4. Bei IC1 (0,32±0,09), EC1 (0,31±0,08)

und EC2 (0,33±0,04) lagen die Werte leicht unter denen des Wildtyps, bei EC4 (4,21±0,12)

leicht darüber. Eine stärkere, aber nicht signifikante Erniedrigung zeigten EC3-exprimierende

Fliegen mit einem RI von 0,22±0,11. Bei Expression der IC3 und der IC4 sowie bei

Expression der IC2 zusammen mit der IC4 waren die Werte wesentlich stärker verringert. Bei

den Abkömmlingen von IC2+4 (1-1) lag mit einem RI von 0,03±0,09 ein indifferentes

Verhalten vor. Diese Abweichung war gegenüber dem Wildtyp hoch signifikant.

Ergebnisse

61

Bei den F1-Nachkommen von [IC2+4 (3-1) x Or83b-Gal4] war der RI mit 0,10±0,09

signifikant verringert. Ebenso waren die RIs bei Expression der IC3 (0,19±0,05 ) sowie der

IC4 (0,12±0,11) signifikant verringert.

Abbildung 24: T-Maze mit BA (1:100)

Die Messungen wurden mit wildtypischen Fliegen durchgeführt oder mit F1-Nachkommen der

angezeigten Fliegenlinien x Or83b-Gal4. Fehlerbalken = SEM. Signifikanzen gegenüber dem Wildtyp:

* = p ≤ 0,05; *** = p ≤ 0,001.

Zusätzlich zu den T-Maze-Messungen mit BA wurden auch Tests mit cHOH, einem

weiteren Liganden des Or43a, bei einer Verdünnung von 1:100 durchgeführt (siehe

Abbildung 25). Wie bei den BA-Messungen bewirkte die Expression der Domänen IC1, EC1,

EC2, EC3 und EC4 auch bei den cHOH-Messungen keine signifikante Abweichung vom

wildtypischen Verhalten. Zusätzlich war die Verringerung des RIs bei Expression der

Domäne IC4 mit 0,33±0,09 im Vergleich zum Wildtyp (0,47±0,04) nicht signifikant. Bei

Expression der Domäne IC3 trat, wie bei den Versuchen mit BA, ein verringerter RI auf. Mit

0,12±0,11 zeigten die Tiere ein fast indifferentes Verhalten, das vom wildtypischen hoch

signifikant abwich.

Während bei den beiden Linien, die IC2 zusammen mit IC4 exprimieren, bei BA eine

signifikante bis hoch signifikante Reduktion des RIs zu beobachten war, wirkte cHOH in der

1:100 Verdünnung wesentlich repellenter auf die Fliegen. Bei den Abkömmlingen von

IC2+4 (1-1) war der RI mit 0,81±0,05 hoch signifikant erhöht. Bei IC2+4 (3-1) war die

Erhöhung mit einem RI von 0,62±0,04 signifikant.

Ergebnisse

62

Abbildung 25: T-Maze mit cHOH (1:100)

Die Messungen wurden mit wildtypischen Fliegen durchgeführt, oder mit F1-Nachkommen der

angezeigten Fliegenlinien x Or83b-Gal4. Fehlerbalken = SEM. Signifikanzen gegenüber dem

Wildtyp: * = p ≤ 0,05; *** = p ≤ 0,001.

Da die Versuche mit BA und cHOH bei jeweils einer 1:100 Verdünnung für die Fliegen,

die IC2 zusammen mit IC4 exprimieren, widersprüchliche Ergebnisse lieferten, wurde im

nächsten Schritt überprüft, ob die Konzentration von cHOH einen Einfluss auf das Verhalten

in den T-Maze-Untersuchungen hat (siehe Abbildung 26).

Beim Wildtyp nahm der RI mit steigender Verdünnung des Duftstoffes ab. Während der

Wildtyp bei einer 1:10 Verdünnung mit einem RI von 0,68±0,08 vom cHOH stark abgestoßen

wurde, sank der RI über 0,50±0,07 bei 5x10-2

, 0,47±0,04 bei 10-2

und 0,20±0,19 bei 5x10-4

auf -0,04±0,07 bei 10-4

, was einem indifferenten Verhalten entspricht. Ein ähnlicher Verlauf

zeigte sich auch bei Expression der IC4. Hier sank der RI von 0,67±0,09 bei 10-1

, über

0,54±0,03 bei 5x10-2

, 0,33±0,09 bei 10-2

und 0,18±0,03 bei 5x10-4

auf -0,16 bei 10-4

. Bei

Expression der IC2 zusammen mit der IC4 gab es bei der 1:10-Verdünnung (RI = 0,72±0,08)

und der 1:20 Verdünnung (RI = 0,61±0,04) keine signifikante Abweichung vom Wildtyp.

Anders verhielt es sich bei der 1:100 Verdünnung, bei der das Verhalten mit einem RI von

0,81±0,05 hoch signifikant repellenter als das des Wildtyps war. Der RI lag hier außerdem

höher als der RI bei der 10-1

-Konzentration. Bei einer Konzentration von 10-4

kehrte sich das

Ganze um. Auch hier lag ein verstärktes Verhalten vor, diesmal aber in die andere Richtung.

Ergebnisse

63

Während beim Wildtyp ein eher indifferentes Verhalten mit einem leicht negativen RI auftrat,

fand sich beim IC2+4 ein attraktives Verhalten mit einem negativen RI von -0,32±0,09.

Anders verhielt es sich bei Expression der IC3. Bei einer Konzentration von 1:10 (RI =

0,90±0,08) und 1:20 (RI = 0,66±0,07) lag der RI über dem des Wildtyps. Diese Erhöhung war

bei der 1:10 Verdünnung signifikant. Bei der 10-2

-Verdünnung kehrte sich das um und der RI

lag mit 0,12±0,11 hoch signifikant unter dem des Wildtyps. Bei weiterer Verdünnung auf

5x10-4

(RI = 0,12±0,04) und 10-4

(RI = 0,05±0,11) veränderte sich der RI kaum und näherte

sich damit dem indifferenten Wert des Wildtyps an.

Abbildung 26: T-Maze mit cHOH verschiedener Konzentrationen

Die Messungen wurden mit wildtypischen Fliegen durchgeführt, oder mit F1-Nachkommen der

angezeigten Fliegenlinien x Or83b-Gal4. Fehlerbalken = SEM. Signifikanzen gegenüber dem

Wildtyp: * = p ≤ 0,05; *** = p ≤ 0,001.

4.8 Die Elektroantennogramm-Kinetik wird durch die Expression

der Domänen beeinflusst

Sowohl die Ergebnisse der EAG-Messungen als auch die Ergebnisse der

Verhaltensversuche zeigen, dass die Expression der Domänen die olfaktorischen Reaktionen

der Tiere verändert. In der Veröffentlichung von Wicher et al. (2008) wurde neben der

direkten schnellen Übertragung des Signales vom OR zum Or83b eine langsamere

Ergebnisse

64

Signalkaskade über G-Proteine und zyklische Nukleotide vermutet, die ein länger

andauerndes Signal auslöst. Bei der Störung dieses Signalweges wäre im EAG eine schnellere

Reizantwort zu erwarten. Andersherum wäre bei der Störung der direkten Signalübertragung

vom OR zum Or83b ein verlangsamtes Signal zu erwarten. Um zu überprüfen, ob eine

zeitliche Veränderung der Signalantwort bei Expression der Domänen in den ORNs auftritt,

wurde die Kinetik der EAG-Messungen untersucht. Anhand des Or43a-Liganden cHOH

wurden die EAG-Messungen bei Expression der intrazellulären Domänen sowie der

extrazellulären Domäne EC4 ausgewertet. Hierzu wurden die Anstiegszeiten zwischen dem

Beginn der Reizantwort und dem Erreichen von zwei Dritteln der maximalen Amplitude

ausgelesen. Weiterhin wurde die Abklingzeit zwischen dem Beginn der Repolarisation und

dem Rückgang bis auf ein Drittel zurück zum Ruhepotential ermittelt. Die Abbildung 27 zeigt

als Beispiel hierfür die EAG-Kurven von IC3-exprimierenden Fliegen [IC3 (45-1) x

Or83b-Gal4] und wildtypischen Fliegen. Die Stromkurven stellen den Durchschnitt aus

jeweils zehn Messungen dar. Bei den IC3-exprimierenden Fliegen ist die Anstiegszeit bis auf

zwei Drittel der Amplitude mit t 2/3 = 0,271±0,019 s (Mittelwert ± SEM) nur 0,060 s

langsamer als beim Wildtyp. Die Abklingzeit bis auf 1/3 der Amplitude ist mit

t 1/3 = 0,569±0,026 s 0,240 s langsamer als bei wildtypischen Fliegen.

Abbildung 27: EAG-Kinetik bei Expression der IC3

Bei Expression der Domäne IC3 (blau) sind sowohl die Anstiegszeit bis 2/3 der Amplitude (t 2/3) als

auch die Abklingzeit nach Applikation von cHOH bis zurück auf 1/3 der Amplitude (t 1/3) im

Vergleich zum Wildtyp (schwarz) verlängert. Die Kurven zeigen Durchschnittswerte von je zehn

Messungen. Die Markierungen zu t 2/3 und t 1/3 beziehen sich auf die IC3-exprimierenden Tiere

[IC3 (45-1) x Or83b-Gal4]. Der Balken oberhalb der Kurven zeigt die Applikationsdauer des cHOH.

Ergebnisse

65

Die Anstiegszeiten t 2/3 der verschiedenen Fliegenlinien sind in Abbildung 28

dargestellt. Die zugehörigen Werte für den Median sowie die Mittelwerte mit SEM sind in

Tabelle 4 zusammengefasst. Bei Expression der IC4 [IC4 (4-1) x Or83b-Gal4] bzw. der EC4

[EC4 (13-1) x Or83b-Gal4] stimmte die Anstiegszeit mit der des Wildtyps (0,211±0,008 s;

Median = 0,205 s) bis auf ≤ 0,01 s überein.

Abbildung 28: Anstiegszeiten bei Stimulation mit cHOH

In dem Boxplot sind die Anstiegszeiten bis zu 2/3 der maximalen Amplitude von je mindestens 10

EAG-Messungen mit cHOH dargestellt. Die verwendeten Fliegen sind der Wildtyp bzw. F1-

Nachkommen der angezeigten Linien x Or83b-Gal4. Signifikanz gegenüber dem Wildtyp: ** = p ≤

0,01.

Tabelle 4: Anstiegszeiten (t 2/3) und Abklingzeiten (t 1/3) von EAG-Messungen wildtypischer

Fliegen oder von F1-Nachkommen verschiedener Fliegenlinien x Or83b-Gal4

Linie Wildtyp IC1

(35-1)

IC2+4

(3-1)

IC2+4

(1-1)

IC3

(45-1)

IC4

(4-1)

EC4

(13-1)

t 2/3

Median 0,205 0,250 0,230 0,225 0,260 0,200 0,215

Mittelwert 0,211 0,246 0,234 0,214 0,271 0,216 0,218

SEM 0,008 0,022 0,016 0,011 0,019 0,013 0,010

t 1/3

Median 0,345 0,300 0,400 0,340 0,570 0,365 0,345

Mittelwert 0,329 0,331 0,427 0,340 0,569 0,385 0,340

SEM 0,015 0,036 0,048 0,029 0,026 0,024 0,014

Ergebnisse

66

Bei den Tieren, die die IC1 exprimierten [IC1 (35-1) x Or83b-Gal4], sowie bei

Expression von IC2 und IC4 zusammen [IC2+4 (3-1) x Or83b-Gal4] und [IC2+4 (1-1) x

Or83b-Gal4], waren die Anstiegszeiten leicht erhöht, es lag aber kein statistischer Unterschied

zum Wildtyp vor. Bei Expression der IC3 [IC3 (45-1) x Or83b-Gal4] war die Anstiegszeit

sehr signifikant erhöht. Der Median betrug hier 0,260 s, der Mittelwert 0,271±0,019 s.

Im Gegensatz zu den Anstiegszeiten traten bei den Abklingzeiten nicht nur bei Fliegen,

die IC3 exprimieren, signifikante Abweichungen vom Wildtyp auf (siehe Abbildung 29 und

Tabelle 4). Bei Expression der IC3 war mit einem Median von 0,570 s ein hoch signifikanter

Unterschied zum Wildtyp (Median t 1/3 = 0,345 s) festzustellen. Bei Expression der IC4 lag

eine signifikant verlängerte Abklingzeit vor (Median t 1/3 = 0,365 s). Die Nachkommen von

IC2+4 (3-1) zeigten ebenfalls eine signifikant verlängerte Abklingzeit (Median t 1/3 =

0,400 s). Bei einer zweiten Linie, welche die zweite und vierte intrazelluläre Domäne

exprimiert, sah das Ergebnis anders aus: Bei den Abkömmlingen von IC2+4 (1-1) entsprach

t 1/3 mit einem Median von 0,340 dem Wildtyp.

Abbildung 29: Abklingzeiten bei Stimulation mit cHOH

In dem Boxplot sind die Abklingzeiten bis zu 1/3 der maximalen Amplitude von je mindestens 10

EAG-Messungen mit cHOH dargestellt. Die verwendeten Fliegen sind der Wildtyp bzw. F1-

Nachkommen der angezeigten Linien x Or83b-Gal4. Signifikanzen gegenüber dem Wildtyp: * = p ≤

0,05; *** = p ≤ 0,001.

Ergebnisse

67

Die Expression der IC1 führte zu keiner signifikanten Abweichung der Abklingzeit. Mit

einem Median von t 1/3 = 0,300 s war sie etwas kürzer als beim Wildtyp. Bei Fliegen,

die EC4 exprimierten, stimmte t 1/3 exakt mit der Zeit wildtypischer Tiere überein (Median

t 1/3 = 0,345)

4.9 Expression der EC4 im Auge führt zu verringerten Amplituden

im Elektroretinogramm

Bei den ORNs ist bislang nicht eindeutig bewiesen, dass G-Proteine einen Anteil an der

Signaltransduktion der olfaktorischen Reize besitzen. Beim Auge dagegen ist eine G-Protein-

vermittelte Signalkaskade nachgewiesen (Fein et al., 1984; Devary et al., 1987; Baer und

Saibil, 1988; Bloomquist et al., 1988; Richardt, 2003). Im Falle einer G-Protein-gekoppelten

Signaltransduktion in der Antenne wäre zu erwarten, dass die Expression der Or43a-Domänen

im Auge eine Auswirkung auf die Reizübermittlung hat. Um dies zu überprüfen, wurde die

Domäne EC4 mit zwei augenspezifischen Treiberlinien (Ret.44 und Ret.53) exprimiert. Bei

den ERG-Ableitungen wurden die Stromlinien aufgezeichnet und sowohl das Rezeptor-

potential als auch die „Ein“- und „Aus“-Transienten ausgemessen (siehe Abbildung 30). Die

Mittelwerte der Rezeptorpotentiale sind in Abbildung 31 dargestellt. Die Amplituden der IC4-

exprimierenden Fliegen waren bei allen Farben, außer bei rot, reduziert. Während die

Abweichungen vom Wildtyp bei weißem, grünem und gelbem Licht nicht statistisch

signifikant waren, lag bei blauem Licht eine signifikante Erniedrigung mit 8,06±0,81 mV

(Ret.44 getrieben) bzw. 8,07±0,69 mV (Ret.53 getrieben) vor. Beim Wildtyp betrug das

Rezeptorpotential bei Blaulicht 12,18±1,57 mV.

Im Gegensatz zu den Rezeptorpotentialen waren die „Ein“- und „Aus“-Transienten

neben Blaulicht auch bei weiteren Lichtqualitäten zum Wildtyp signifikant verändert. Bei den

„Ein“-Transienten (siehe Abbildung 32) gab es bei Rotlicht mit 0,95±0,16 mV bzw.

0,84±0,19 mV jeweils hoch signifikant reduzierte Werte im Vergleich zum Wildtyp

(2,96±0,24 mV). Bei grünem Licht schienen bei den Nachkommen beider Kreuzungen die

„Ein“-Transienten verglichen mit dem Wildtyp (1,27±0,24 mV) reduziert. Diese Reduktion

war allerdings nur bei den Nachkommen der Treiberlinie Ret.53 mit 0,48±0,15 mV

signifikant. Bei blauem Licht waren die Werte bei beiden Linien mit 0,50±0,17 mV und

0,62±0,14 mV sehr signifikant verringert (Wildtyp: 0,82±0,28 mV). Bei weißem und gelbem

Licht fanden sich keine signifikanten Abweichungen der „Ein“-Transienten.

Ergebnisse

68

Abbildung 30: ERG mit Blaulicht bei Expression der EC4

Bei Stimulation mit Blaulicht (blauer Balken) zeigt der Wildtyp (schwarze Kurve) im ERG zunächst

eine „Ein“-Transiente, gefolgt vom Rezeptorpotential. Bei Beendigung des Lichtreizes erscheint eine

kurze „Aus“-Transiente, die in die Repolarisation über geht. Bei Expression der EC4 im Auge (rote

Kurve) sind sowohl das Rezeptorpotential als auch die beiden Transienten verringert. Dargestellt sind

jeweils Messungen an einzelnen Fliegen. Die rote Kurve stammt von einem Tier der F1-Generation der

Kreuzung [EC4 (13-1) x Ret.53].

Abbildung 31: ERG-Rezeptorpotentiale bei Expression der EC4

Dargestellt sind die mittleren Rezeptorpotentiale des Wildtyps bzw. von F1-Nachkommen der

angezeigten Kreuzungen. Diese F1-Nachkommen exprimieren EC4 in der Retina.

Signifikanz gegenüber dem Wildtyp: * = p ≤ 0,05.

Ergebnisse

69

Abbildung 32: „Ein“-Transienten im ERG bei Expression der EC4

Dargestellt sind die mittleren „Ein“-Transienten des Wildtyps bzw. von F1-Nachkommen der

angezeigten Kreuzungen. Signifikanzen gegenüber dem Wildtyp: * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01; *** =

p≤ 0,001.

Bei den „Aus“-Transienten (siehe Abbildung 33) traten bei allen fünf Lichtqualitäten

signifikant bis hoch signifikant verringerte Werte auf, wobei es hier je nach Treiberlinie

Unterschiede gab. Bei den Nachkommen von Ret.44 lagen bei allen fünf Farben signifikante

Abweichungen vor. Während bei Grün nur eine einfache Signifikanz auftrat (2,01±0,45 mV

gegenüber 3,87±0,56 mV beim Wildtyp), gab es bei weißem Licht mit 2,21±0,47 mV

(Wildtyp: 4,94±0,54 mV) und blauem Licht mit 2,08±0,56 mV (Wildtyp: 4,38±0,45 mV) sehr

signifikant verringerte „Aus“-Transienten. Bei rotem (2,29±0,51 mV gegenüber

4,06±0,52 mV beim Wildtyp) und gelbem Licht (1,83±0,48 mV gegenüber 4,41±0,36 mV

beim Wildtyp) waren die Reduktionen sogar hoch signifikant.

Bei den Nachkommen von [EC4 (13-1) x Ret.53] traten auch bei allen Farben reduzierte

„Aus“-Transienten auf; es gab aber bei weißem und rotem Licht keine Signifikanz. Bei

grünem (2,24±0,38 mV) und gelbem Licht (2,65±0,50 mV) lag eine einfache Signifikanz vor,

während bei blauem Licht mit 2,23±0,27 mV eine hoch signifikante Erniedrigung vorlag.

Ergebnisse

70

Abbildung 33: „Aus“-Transienten im ERG bei Expression der EC4

Dargestellt sind die mittleren „Aus“-Transienten des Wildtyps bzw. von F1-Nachkommen der

angezeigten Kreuzungen. Signifikanzen gegenüber dem Wildtyp: * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01; *** =

p≤ 0,001.

Diskussion

71

5 Diskussion

5.1 Expressionsmuster der Domänen IC2 und IC4

Ziel dieser Arbeit war es, zu überprüfen, ob die Expression der intra- und extrazellulären

Domänen des Or43a in den ORNs einen Einfluss auf das Riechvermögen der Tiere besitzt.

Auftretende Veränderungen könnten Rückschlüsse auf eine mögliche Bedeutung der Domäne

für die Signaltransduktion erlauben. Deshalb war es zunächst erforderlich, soweit nicht bereits

in Vorarbeiten geschehen, Fliegenlinien zur Expression der Domänen herzustellen und die

Expression zu überprüfen: Die Domänen IC2 und IC4 wurden in Responderlinien des Gal4-

Systems eingebaut (siehe Kapitel 4.1.1und 4.1.2). Die Aktivierung der Expression erfolgte

durch Kreuzung mit der ORN-spezifischen Treiberlinie Or83b-Gal4. Somit wurde eine ORN-

spezifische Expression der Domänenfragmente erwartet, wie sie auch bei Antikörper-

Reaktionen in der Antenne exprimierter Proteine oder Rezeptor-Fragmente beobachtet wurde

(Benton et al., 2006; Lange, 2007). Eine solche Verteilung der Fluoreszenz trat nach der

Antikörper-Färbung auf (siehe Abbildung 12 und 13). Die Nutzung der Treiberlinie Or83b-

Gal4 sowie die Verteilung der Fluoreszenz innerhalb der Antenne sprechen dafür, dass die

markierten Strukturen die ORNs sind. Ein biochemischer Beweis hierfür steht allerdings noch

aus. Eine Doppelfärbung mit einem alternativen Antikörper führte auf Grund unspezifischer

Färbungen nicht zum Ziel.

Da die exprimierten Rezeptorfragmente keine Transmembran-Sequenz enthalten sollten,

wurde erwartet, dass die Fragmente zunächst zytoplasmatisch gebildet werden. Dieses

bedeutet aber nicht, dass eine zytoplasmatische Lokalisation der Domänen vorliegen musste.

Bei den verschiedenen potentiellen Bindungspartnern waren verschiedene Lokalisationen

innerhalb der Zelle möglich. Durch Bindung der Domänen an membranständige Proteine oder

Transmembranproteine hätten zusätzlich zum Zytoplasma Zellmembranen angefärbt sein

können. Aus den Arbeiten von Neuhaus et al. (2005) und Benton et al. (2006) ist bekannt,

dass der Or43a sowohl Homodimere als auch Heterodimere mit dem Or83b bilden kann.

Dabei werden die Dimere nur bei Anwesenheit des Or83b in die Dendriten der ORNs

transportiert.

Bei Bindung der exprimierten Domänen an den OR oder den Or83b hätten die

Fragmente mit in die Dendriten transportiert werden können und dies zur Anreicherung der

Fluoreszenz in den Schäften der Sensillen geführt. Eine zweite Möglichkeit wäre nach

Diskussion

72

Bindung an den OR oder an den Or83b eine Störung des Transports in die Sensillenschäfte. In

diesem Fall könnte sich der Komplex aus dem exprimierten Fragment und OR und/oder

Or83b in den inneren Membransystemen anreichern.

Bei einer Bindung der Fragmente an zytosolische Komponenten, wie z.B Gα oder

Arrestine könnten diese innerhalb des Zytoplasmas aggregieren. Wahrscheinlicher wäre aber

bei der Bindung an zytosolische Komponenten eine gleichmäßige Verteilung der gebundenen

Fragmente. Solch eine gleichmäßige Verteilung im Zytosol fand sich in der vorliegenden

Arbeit. Deshalb waren eventuell die Fragmente an zytosolische Komponenten gebunden, die

Fragmente ungebunden oder die Menge an gebundenen Fragmenten machte nur einen kleinen

Anteil der exprimierten Domänen aus. Es können daher durch die Expressionsmuster keine

Aussagen über mögliche Interaktionspartner getroffen werden. Hervorzuheben ist aber die

erfolgreiche Expression der Domänen IC2 und IC4.

Die erfolgreiche Expression der Domäne IC4 bestätigt auch die qRT-PCR (siehe Kapitel

4.1.3). Bei dieser quantitativen Analyse war die mRNA der IC4 in einer etwa 25x höheren

Konzentration in der Antenne vorhanden als die Or43a-mRNA (siehe Abbildung 15 B).

5.2 Kompetitive Hemmung durch Expression der Or43a-Domänen

Olfaktorische Rezeptoren müssen verschiedene Bindungen eingehen, um ihre Funktion

ausführen zu können. Zum einen müssen Agonisten an der extrazellulären Seite gebunden

werden, um ein Signal auszulösen, zum anderen muss dieses Signal durch gebundene

Komponenten zu einem intrazellulären Signal umgewandelt werden. Bei den ORs von

Drosophila ist eine dieser Komponenten der Or83b, der mit dem regulären OR zusammen

einen ionotropen Rezeptorkomplex bildet (Sato et al., 2008; Wicher et al., 2008). Weitere

mögliche Komponenten sind die Bestandteile der G-Protein-gekoppelten Signalkaskade

(Breer et al., 1990; Boekhoff et al., 1993; Wegener et al., 1993; Riesgo-Escovar et al., 1995;

Wetzel et al., 2001; Neuhaus et al., 2005; Wicher et al., 2008). Diese Interaktionen geschehen

auf Grund der Topologie mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit an den Domänen der Rezeptoren,

die nicht die Membran durchziehen. Durch die Expression der intrazellulären und

extrazellulären Domänen des Or43a in den ORNs geraten diese in Konkurrenz zu den nativen

Domänen um die Bindungsstellen der verschiedenen Komponenten.

Ein ähnlicher Ansatz, bei dem durch kompetitive Hemmung nach funktionellen

Bereichen eines Proteins gesucht wurde, erfolgte für die Alpha-Untereinheiten von

G-Proteinen. Die Expression eines C-terminalen Bereiches von Gα beeinflusste die

Signaltransduktion von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Das exprimierte Peptid

Diskussion

73

interagierte mit dem Rezeptor und verhinderte durch kompetitive Hemmung die

Signalweitergabe (Hamm et al., 1988; Rasenick et al., 1994; Akhter et al., 1998; Gilchrist et

al., 1999; Yao und Carlson, 2010). In gleicher Weise könnten die exprimierten Domänen des

Or43a eine kompetitive Hemmung bewirken und eine veränderte olfaktorische Reizantwort

hervorrufen.

5.2.1 Bei den extrazellulären Domänen bewirkt nur die Expression der

EC4 Veränderungen im EAG

Die Domänen EC1, EC2, EC3 und EC4 des Rezeptors Or43a befinden sich auf der

Außenseite der Zellmembran (Benton et al., 2006). Hiermit sind sie nicht zugänglich für

intrazelluläre Komponenten der Signalkaskade wie G-Proteine, Arrestine und Proteinkinasen.

Es sollten keine Bindungsstellen zu diesen Komponenten bestehen. Nur Bestandteile der

Signalkaskade, wie der Or83b, die auch einen extrazellulären Anteil besitzen, könnten an

diesen Regionen binden: Bei der Expression der extrazellulären Domänen mit Hilfe der

Treiberlinie Or83b, reichern sich die Domänen im Zytoplasma an (Lange, 2007). Somit sind

sie nicht zugänglich für externe Faktoren wie Duftstoffe und Odor-binding Proteine.

Aufgrund fehlender Bindungsstellen können die drei Fragmente also nicht an interne

Komponenten der Signalkaskade binden und aufgrund der intrazellulären Expression nicht an

extrazelluläre Komponenten. Die einzige bekannte Komponente, mit der Wechselwirkungen

erwartet werden könnten, ist der Or83b. Der Or83b bindet bereits früh im inneren

Membransystem an den jeweiligen OR und ermöglicht den Transport des Komplexes in die

ziliäre Membran des ORNs (Benton et al., 2006). Bereits im Membransystem des

endoplasmatischen Retikulums und Golgi-Apparates könnten die exprimierten Domänen an

den Or83b binden und ihn durch kompetitive Hemmung für den OR unzugänglich machen. Es

wäre eine veränderte Reizantwort im EAG zu erwarten, welche sich auch auf olfaktorische

Verhaltensversuche auswirken könnte.

Bei den Domänen EC1, EC2 und EC3 fand sich keine Veränderung im EAG (siehe

Abbildung 16-18). Es traten hier zwar einzelne einfach signifikante Unterschiede zum Wild-

typ auf, aber die Häufigkeit dieser Abweichungen lag im Bereich der Fehlerwahrscheinlich-

keit: Bei einem Signifikanzniveau von p = 0,05 sind bei EC1 ohne Abweichung des Riech-

vermögens 1,95 positive Signifikanzen zu erwarten, aufgetreten sind zwei. Bei Expression der

Domänen EC2 und EC3 sind jeweils 1,3 positive Signifikanzen zu erwarten, aufgetreten ist

jeweils eine. Die unveränderte olfaktorische Wahrnehmung bei Expression der EC1, EC2 und

Diskussion

74

EC3 spiegelt sich auch in den T-Maze-Untersuchungen wieder (siehe Abbildung 24 und 25).

Bei keiner der drei Domänen war das olfaktorische Verhalten verändert.

Die EAG-Ergebnisse sowie die T-Maze-Resultate lassen vermuten, dass es sich bei den

Domänen nicht um Bereiche des Or43a handelt, die an der Signalweitergabe vom Rezeptor an

Komponenten der Signalkaskade beteiligt sind. Für die Domäne EC2 entspricht dieses

Ergebnis den Resultaten von Nichols und Luetje (2010), die beim Or85b der EC2 eine Rolle

bei der Ligandenbindung zuordneten. Obwohl die Ergebnisse auf keinerlei Funktion der drei

Domänen bei der Signalweitergabe vom Rezeptor an nachgeschaltete Komponenten

hindeuten, lassen sich Bindungsstellen zum Or83b nicht ausschließen. Da die Domänen im

Rezeptor extrazellulär liegen, die Domänenfragmente aber intrazellulär exprimiert werden, ist

es möglich, dass die Fragmente nicht an extrazelluläre Bindungsstellen gelangen. Einen

Hinweis, dass sie nicht an den Or83b binden, liefern die Ergebnisse bei Expression der

Domäne EC4 (siehe unten).

Im Gegensatz zu den ersten drei extrazellulären Domänen tritt bei EC4 eine

Veränderung im EAG auf: Die Reizantworten liegen, verglichen mit denen des Wildtyps,

generell höher (siehe Abbildung 19). Die erhöhten Reizantworten treten bei beiden getesteten

Fliegenlinien und bei allen verwendeten Duftstoffen auf, auch wenn sie nicht bei allen

Messungen signifikant sind. Bei einigen Messungen sind die Unterschiede aber sogar sehr

signifikant bis hoch signifikant. Auch wenn bei den EC4-exprimierenden Nachkommen der

Linie EC4 (13-1) eine einfach signifikant erhöhte Reizantwort bei der Applikation von

Paraffin aufgetreten ist, lassen sich die sehr signifikanten bis hoch signifikanten Erhöhungen

bei den Messungen mit Duftstoffen nicht durch einen methodischen Fehler erklären. Da die

exprimierten EC4-Fragmente keine Möglichkeit haben, an extrazelluläre Komponenten zu

binden, wirken sie wahrscheinlich auf den Or83b und die EC4 oder ein Teil der EC4 stellt

eine Or83b-Binderegion dar. Unerwartet ist allerdings, dass die Amplituden der EAG-

Messungen erhöht und nicht erniedrigt sind. Bei einer kompetitiven Hemmung der

Verbindung von OR und Or83b durch das Domänenfragment und somit einer Störung der

direkten Signalübertragung vom OR auf den Or83b wäre eher eine verringerte Reizantwort zu

erwarten. Möglich ist, dass durch die Expression der EC4 die Zusammensetzung der OR-

Or83b Komplexe verändert ist. Sowohl im heterologen Zellsystem als auch bei Protein-

fragment-Komplementationsversuchen in vivo bildeten sich nicht nur OR-Or83b-Komplexe,

sondern auch Komplexe, die nur aus dem OR bestanden (Wetzel et al., 2001; Neuhaus et al.,

2005; Benton et al., 2006). Ebenso zeigten Proteinfragment-Komplementationsversuche, dass

der Or83b selber Homodimere bilden kann. Diese Bildung der Homodimere verhindert nicht

Diskussion

75

den Transport der OR-Or83b-Komplexe in die ziliäre Membran (Benton et al., 2006). Deshalb

dürfte es sich bei den Komplexen wahrscheinlich um Heterodimere aus jeweils mehreren OR-

und Or83b-Einheiten handeln. Durch die zusätzliche Expression der Domäne EC4 könnte die

Stöchiometrie zugunsten des Or83b verändert sein, so dass mehr Ionen durch die Membran

geleitet werden können und die EAG-Amplitude erhöht ist.

Für die erhöhten EAG-Werte könnten aber auch andere Faktoren verantwortlich sein.

Einen Hinweis hierfür liefern die elektrophysiologischen Messungen am Auge bei EC4-

Expression. Auch hier sind die Amplituden verändert. Da im Auge kein Or83b vorkommt,

kann diese Reduktion der Reizantworten nicht auf einer Bindung der Domäne an den Or83b

beruhen. Es gibt zwei mögliche Erklärungen hierfür: Entweder besitzt die EC4 keine

Binderegion für den Or83b oder sie besitzt eine Binderegion für den Or83b, wirkt aber im

Auge auf eine andere Art und Weise. Die These, dass die EC4 im Auge auf eine andere Weise

wirkt als in der Antenne, wird von der Tatsache gestützt, dass im Auge die Reizantworten

reduziert, hingegen in der Antenne erhöht waren.

Im Gegensatz zu den elektrophysiologischen Messungen traten bei den

Verhaltensversuchen mit EC4 sowohl bei BA als auch bei cHOH, jeweils in einer 1:100

Verdünnung, keine signifikanten Differenzen zum Wildtyp auf. Trotz der größeren Amplitude

der Signale von der Antenne war die Verhaltensreaktion nicht verändert. Dennoch stellen die

Ergebnisse keinen Widerspruch dar, da das Verhalten unabhängig von den Signalen der

ORNs ist und aus den verarbeiteten Signalen im Gehirn resultiert. Da die Eingangssignale im

Antennenlobus und den höheren Hirnregionen verrechnet werden, ist neben der Quantität vor

allem auch die Qualität der Signale entscheidend (Silbering et al., 2011).

In Versuchen, bei denen der Or43a zusätzlich in der Antenne exprimiert wurde, erzielte

BA in einer Konzentration von 10-3

ein EAG-Signal, das dem des Wildtyps entsprach. Im

Gegensatz dazu löste die gleiche Konzentration des Duftstoffes im T-Maze ein verändertes

Verhalten aus (Störtkuhl und Kettler, 2001; Störtkuhl et al., 2005). Der Verhaltensversuch ist

bei diesen Bedingungen also sensitiver, als das EAG. Die höhere Sensitivität des Verhaltens

lässt sich dadurch erklären, dass die Eingangssignale im zentralen olfaktorischen System

verarbeitet werden. Selbst kleine Unterschiede in den eingehenden Signalen, die

elektrophysiologisch nicht detektiert werden können, führen eventuell nach Verrechnung der

verschiedenen Eingänge zu einem veränderten Verhalten. In anderen Versuchen, bei denen

der Or43b durch gezielte Genmodifikation ausgeschaltet war, fehlten die Reizantworten in

elektrophysiologischen Messungen; das Verhalten der Tiere war aber nicht beeinflusst

(Elmore et al., 2003). In diesem Fall sind die elektrophysiologischen Messungen sensitiver als

Diskussion

76

der Verhaltensversuch. Bei Expression der EC4 in den ORNs scheint ebenfalls die

Elektrophysiologie sensitiver als der T-Maze zu sein.

Da bei Expression der EC4 das EAG verändert ist, ist es unwahrscheinlich, dass die

anderen extrazellulären Domänen eine Binderegion für den Or83b besitzen, diese aber auf

Grund der Topologie in der Membran nicht zum Greifen kommen. Von den extrazellulären

Domänen scheint somit nur die EC4 eine Bedeutung für die Signalweitergabe vom Rezeptor

an nachgeschaltete Komponenten zu besitzen.

5.2.2 Die Expression der Domäne IC1 bewirkt einen wildtypischen

Phänotyp

Auf Grund der intrazellulären Lage der Domänen IC1, IC2, IC3 und IC4 kommen diese

als Interaktionsstellen mit Komponenten der Signalkaskade in Frage, die sich im Plasma des

ORNs oder an der Membraninnenseite befinden. Diese Interaktionen könnten durch die

Expression der Domänenfragmente gestört werden und die Geruchswahrnehmung verändern.

Bei Expression der IC1 fand sich solch ein Effekt weder beim EAG noch im

Verhaltensversuch: Die Reizantworten beim EAG entsprachen denen des Wildtyps (siehe

Abbildung 20). Mit drei einfach signifikanten Abweichungen vom Wildtyp, einer

Verringerung und zwei Erhöhungen, lag das Ergebnis leicht über den statistisch zu

erwartenden 1,95 signifikanten Werten. Da eine der Erhöhungen dabei noch die Kontrolle mit

Paraffinöl betraf, sind für die Duftstoffe nur noch eine Erhöhung und eine Erniedrigung zu

verzeichnen. Es muss daher davon ausgegangen werden, dass sich die Fliegenlinien nicht vom

Wildtyp unterscheiden.

Beim Verhaltensversuch stimmten die Werte ebenfalls mit denen des Wildtyps überein.

Weder bei BA (1:100) noch beim cHOH (1:100) traten signifikante Abweichungen der RIs

auf (siehe Abbildung 24 bzw. 25). Die Expression der IC1 bewirkte also weder im EAG noch

im Verhaltensversuch eine Veränderung, so dass kein Hinweis auf eine kompetitive

Hemmung durch die IC1 offensichtlich ist. Die IC1 stellt somit wahrscheinlich keine

Binderegion für eine Komponente der Signalkaskade dar.

5.2.3 IC3 als potentielle Verbindung zum G-Protein

Bei Expression der IC3 veränderten sich im EAG die Amplituden nicht eindeutig.

Dennoch traten bei einigen Messungen Auffälligkeiten auf (siehe Abbildung 21): So waren

beim Duftstoff DES bei beiden gemessenen Linien die Amplituden reduziert. Bei [IC3 (5-1) x

Or83b-Gal4] war diese Reduktion signifikant, bei [IC3 (45-1) x Or83b-Gal4] sogar hoch

signifikant. Bei den Nachkommen von IC3 (45-1) trat außerdem noch bei MeSa eine sehr

Diskussion

77

signifikante Verringerung auf. Dies ist aber nicht eindeutig einer verringerten Reizantwort

zuzusprechen, da auch schon bei Paraffinöl eine sehr signifikante Reduktion auftrat.

Insgesamt ergibt sich bei den Messungen ein inhomogenes Bild: Es gibt einige erhöhte und

einige erniedrigte Werte, wobei die Standardfehler oft relativ groß sind. Die Frage dabei ist,

ob die veränderten Amplituden auf einem erhöhten Fehler bei der Versuchsdurchführung

beruhen oder ob die erhöhten Standardfehler auf Veränderungen in der Reizantwort beruhen.

Für die zweite These sprechen die starken Signifikanzen bei den Messungen mit DES und

MeSa. Für die erste These spricht, dass bei [IC3 (45-1) x Or83b-Gal4] auch die Reaktion auf

Paraffinöl sehr signifikant verringert war und dass sich die Veränderungen weder an den

Liganden des Or43a manifestieren ließen noch in der Art der Veränderung eine einheitliche

Linie vorlag: Bei einem generell wirkenden Mechanismus müsste bei allen Duftstoffen eine

Erniedrigung oder eine Erhöhung auftreten. Dieses war aber nicht der Fall.

Trotz der Hinweise, dass es sich bei den veränderten EAG-Amplituden um „Ausreißer“

handelt, kann nicht ausgeschlossen werden, dass dies der tatsächliche Phänotyp ist. Eventuell

beeinflusst die Expression des IC3-Fragmentes nur einen Teil der ORNs und daher werden

nur einzelne Duftstoffe verändert wahrgenommen. Dies würde in das Bild passen, das die

Kontroverse zu der Bedeutung von G-Proteinen für die Signaltransduktion hinterlassen hat.

Kalidas und Smith (2002) und Kain et al. (2008) betonen, dass bei der Inaktivierung von Gα-

Untereinheiten durch RNAi bzw. Genmutation die elektrophysiologischen Reizantworten auf

verschiedene Duftstoffe herabgesetzt sind. Im Gegensatz dazu finden Yao und Carlson (2010)

keine Veränderung der Geruchswahrnehmung nach Mutagenese oder RNAi der α-

Untereinheiten in einzelnen Neuronen. Möglicherweise liegen, je nach Neuron,

unterschiedliche Übertragungsmechanismen vor. Hiermit könnte erklärt werden, weshalb nur

bei einzelnen Duftstoffen veränderte EAG-Signale auftraten.

Im Verhaltenstest ist das Ergebnis wesentlich eindeutiger als beim EAG. Bei Expression

der IC3 traten sowohl bei BA (1:100) als auch bei cHOH (1:100) jeweils signifikant

reduzierte RIs auf (siehe Abbildung 24 bzw. 25). Beide Duftstoffe wirkten somit in dieser

Konzentration weniger abstoßend auf die IC3 exprimierenden Tiere als auf den Wildtyp. Bei

den T-Maze-Versuchen mit verschiedenen cHOH-Konzentrationen veränderte sich das

Ergebnis mit zunehmender Verdünnung (siehe Abbildung 26). Bei 10-1

war der RI signifikant

höher als beim Wildtyp. Bei 5 x 10-2

näherte sich der RI dem wildtypischen an und sank dann

bei 10-2

auf fast Null ab, was einem indifferenten Verhalten entspricht. Dort blieb der RI auch

bei den größeren Konzentrationen, während er beim Wildtyp erst bei 10-4

den indifferenten

Bereich erreichte. Die Expression der IC3 schien die Empfindlichkeit zu reduzieren. Dies trat

Diskussion

78

auf, obwohl das EAG bei cHOH kaum Unterschiede zum Wildtyp aufwies. Eine mögliche

Ursache dafür, dass der T-Maze bei Expression der IC3 empfindlicher war als das EAG, kann

in der Duftstoffkonzentration gesucht werden. Beim EAG wurde ein Reinstoff verwendet.

Damit könnte sich das System beim EAG in der Sättigung befunden haben und es waren nur

geringe Veränderungen sichtbar. Bei anderen Duftstoffen könnte das System weiter entfernt

von der Sättigung gewesen sein. Dieses wäre ein weiterer Erklärungsansatz für die EAG-

Unterschiede zum Wildtyp, z.B. beim Duftstoff DES.

Eine weitere mögliche Erklärung dafür, dass das Verhalten bei Expression der IC3

verändert war, während beim EAG wildtypische Amplituden auftraten, könnte in der

Applikationszeit zu suchen sein. Während beim EAG der Duftstoff für eine Sekunde

appliziert wurde, waren die Tiere beim T-Maze dem Duftstoff für 30 Sekunden ausgesetzt.

Entscheidend könnte also auch der zeitliche Verlauf der ORN-Aktivierung sein. Nach dem

Model von Wicher et al. (2008) ist für die Signalübertragung direkt vom OR zum Or83b zu

erwarten, dass das Signal sehr schnell weitergegeben wird und nach Beendigung des Reizes

auch schnell wieder beendet wird. Für den zweiten Signalweg über G-Proteine und zyklische

Nukleotide wird eine langsamere Signalweitergabe erwartet, die dafür aber ein länger

andauerndes Signal erzeugt.

Entgegen dem Modell von Wicher et al. (2008) führt der Signalweg über G-Proteine und

zyklische Nukleotide eventuell aber auch zu sehr schnellen Signalen. Das beste Beispiel für

solch eine schnelle Signalweitergabe ist das optische System, in dem das heptahelikale

Transmembranprotein Rhodopsin zusammen mit G-Proteinen und den Komponenten einer

IP3-vermittelten Signalkaskade für eine sehr schnelle Signalweitergabe mit einer Latenzzeit

von 20-100 ms verantwortlich ist (Hardie, 2001). Der Ausfall eines Genes dieser Kaskade,

rdgB, dessen Genprodukt Phosphatidylinositol-Transferprotein benötigt wird, um IP3 für die

Signalkaskade zur Verfügung zu stellen, führt auch im olfaktorischen System zu einem

Phänotyp: Obwohl die Amplituden von EAG-Messungen an rdgB-defizienten Fliegen dem

Wildtyp entsprechen, ist die Kinetik dieser Messungen verändert. Sowohl die Anstiegszeiten

auf 2/3 der Amplitude als auch die Abklingzeiten bis auf 1/3 zurück zum Ruhepotential sind

verlängert. Dabei hängt das Ausmaß dieser Verlängerung von der Konzentration ab: Je kleiner

die Konzentration des Duftstoffes ist, desto mehr sind die Zeiten verlängert (Alcorta, 1991;

Woodard et al., 1992; Hardie, 2001). Bei Expression der IC3 könnte daher die Kinetik der

EAG-Messungen verändert sein, obwohl bei vielen Duftstoffen sich die Amplitude nicht

signifikant verändert hatte.

Diskussion

79

Eine veränderte Kinetik war bei der Expression von IC3 tatsächlich eingetreten

(Abbildung 28 und 29). Sowohl die Anstiegszeit auf 2/3 der Amplitude als auch die

Abklingzeit bis auf 1/3 zurück zum Ruhepotential waren verlängert. Das phänotypische

Erscheinungsbild entspach dem, das bei Knockout des rdgB auftrat (Alcorta, 1991). Sie

untersuchte die Amplituden und Kinetiken von EAG-Messungen bei Verwendung von

Duftstoffen in verschiedenen Konzentrationen und bei unterschiedlichen Applikationsdauern

sowie eine Geruchsmutante, die sich in Verhaltenstests abnormal verhielt. In einem

Auswahltest, ähnlich dem T-Maze, zeigten die Tiere nach 90 Minuten eine höhere

Empfindlichkeit. Bei geringen Konzentrationen von EA bewirkte der Duftstoff ein wesentlich

repellenteres Verhalten als beim Wildtyp. Später wurde diese Mutante als rdgB identifiziert

(Woodard et al., 1992)

Die Ergebnisse von Alcorta (1991) deuten an, dass auch bei den Fliegen, die die IC3

exprimieren, die Signalkaskade über G-Proteine und zyklische Nukleotide gestört ist. In

beiden Fällen waren die EAG-Amplituden unverändert, die Kinetik verlangsamt und das

Verhalten beeinflusst. Es liegt jedoch ein gravierender Unterschied zur vorliegenden Arbeit

vor. Bei Alcorta reagierten die Fliegen sensitiver auf den repellenten Duftstoff, in der

vorliegenden Arbeit weniger empfindlich. Im Gegensatz zu den Versuchen von Alcorta, bei

denen die Verhaltenstests 90 Minuten dauerten, wurden die T-Maze-Untersuchungen an IC3-

exprimierenden Fliegen nach 30 Sekunden beendet. Daher spielen eventuell bei den

Versuchen von Alcorta Adaptationsprozesse eine wesentliche Rolle. Wahrscheinlich werden

die Adaptationsprozesse nach Aktivierung des Rezeptors und der Enzymkaskade durch

Veränderungen in der Kalziumkonzentration ausgelöst, da sowohl Tiere mit einem mutierten

TRP-Kanal als auch einem mutierten IP3-Rezeptor jeweils eine normale

Geruchswahrnehmung besitzen, ihre Adaptation aber gestört ist (Störtkuhl et al., 1999;

Deshpande et al., 2000; Vosshall, 2000).

Nach Aktivierung des Rezeptors wird dieser von Proteinkinasen phosphoryliert und

damit seine Aktivität herabgesetzt. An den phosphorylierten Rezeptor können nun Arrestine

binden, die eine Anlagerung von G-Proteinen verhindern. Der Rezeptor ist somit komplett

inaktiviert. Dieser Prozess geschieht innerhalb weniger Sekunden bis Minuten. Auf ihn folgt

die Internalisierung der Rezeptoren (Ferguson und Caron, 1998). Die Empfindlichkeit der

ORNs wird hiermit heruntergesetzt. Bei einer gestörten Signalkaskade würde wahrscheinlich

selbst nach 90 Minuten keine Adaptation der ORNs eintreten. Dieses könnte die erhöhte

Sensitivität der rdgB-defizienten Fliegen bei Alcorta erklären. Bei den Verhaltenstests mit

IC3-exprimierenden Fliegen kommen mit der Versuchsdauer von 30 Sekunden diese

Diskussion

80

adaptiven Prozesse noch nicht in dem Umfang zum Tragen. Würde hier tatsächlich durch die

IC3-Fragmente eine Signaltransduktion über G-Proteine gestört, so wäre eine verringerte

Sensitivität zu erwarten, wie sie auch eingetreten ist. Obwohl dieses alles nur Indizien sind,

spricht doch einiges dafür, dass die IC3-Fragmente die Bindung von G-Proteinen durch

kompetitive Hemmung stören und damit die Abweichungen in der Kinetik und im Verhalten

auslösen.

5.2.4 Bildet die IC4 die Verbindung zum Or83b?

Bei den elektrophysiologischen Untersuchungen IC4-exprimierender Fliegen zeigten

sich bei den meisten Duftstoffen Reizantworten, die sich statistisch nicht von wildtypischen

unterscheiden ließen (siehe Abbildung 22). Dennoch waren drei signifikante Abweichungen

vom Wildtyp auffällig. Bei cHOH fand sich eine signifikante Erhöhung, bei OA eine sehr

signifikante Erhöhung und bei DES eine sehr signifikante Erniedrigung. Dabei traten diese

Signifikanzen immer nur bei einer der drei gemessenen Fliegenlinien auf. Weiterhin lagen

teilweise recht hohe Abweichungen der Mittelwerte vom Wildtyp vor, die jedoch auf Grund

einer hohen Streuung nicht signifikant waren. Gerade bei den Fliegen IC4 (2-3) gab es häufig

höhere Werte.

Zu diesem unklaren Bild passen auch die Ergebnisse der Verhaltenstests. Während beim

BA (1:100) ein verringerter Responseindex auftrat, war der Responseindex bei cHOH (1:100)

nur wenig kleiner als der wildtypische und statistisch nicht unterscheidbar. Auch bei den

anderen Konzentrationen erzielte cHOH keine signifikante Abweichung.

Ebenfalls brachten die Kinetiken der EAG-Messungen kein klares Bild: Während die

Anstiegszeit der IC4-exprimierenden Fliegen nahezu identisch zu der des Wildtyps war, war

die durchschnittliche Abklingzeit signifikant verlängert. Entsprechend dem Modell von

Wicher et al. (2008) spricht die verlängerte Abklingzeit für eine Hemmung des Signalweges

vom OR direkt zum Or83b. Nach diesem Modell ließe die Hemmung aber auch erwarten,

dass die Anstiegszeit verlängert ist. Wie schon im Kapitel 5.2.3 diskutiert, könnte aber auch

der Signalweg über G-Proteine für die schnelle Reizantwort verantwortlich sein.

Der Insertionsort eines P-Elements in das Genom von Drosophila kann einen großen

Einfluss auf das Expressionslevel eines im P-Element enthaltenen Gens besitzen (Spradling

und Rubin, 1983). Daher können unterschiedliche Expressionslevel für die Unterschiede im

EAG der IC4-exprimierenden Fliegenlinien verantwortlich sein; das heißt, bei den Fliegen-

linien würde das IC4-Fragment in unterschiedlichen Konzentrationen gebildet werden oder im

Extremfall auch gar nicht. Um dieses zu untersuchen, wurde die mRNA der Antennen IC4-

exprimierender Fliegen mit der qRT-PCR untersucht (siehe Abbildung 15). Dabei wurde kein

Diskussion

81

signifikanter Unterschied zwischen den drei Fliegenlinien festgestellt. Obwohl hiermit noch

nicht ausgeschlossen ist, dass posttranskriptionale oder posttranslationale Abbauprozesse wie

etwa das Gen-Silencing (Hammond et al., 2000) die Menge an IC4-Fragment reduzieren, ist

doch ein vergleichbares Transkriptionsniveau der drei Fliegenlinien belegt. Die

Schwankungen in den Messergebnissen beruhen nicht auf Unterschieden im Expressionslevel.

Insgesamt lässt sich aus den Ergebnissen keine klare Aussage zur Bedeutung der IC4

treffen. Entsprechend den Versuchen von Benton et al. (2006) soll die IC4 für die Bindung

des Or83b zuständig sein. Dieses unterstützen die vorliegenden Untersuchungen nicht,

widersprechen dem aber auch nicht. Verglichen mit den extrazellulären Domänen EC1, EC2

und EC3 erscheinen die Ergebnisse der IC4 sehr auffällig mit gehäuften Abweichungen von

den wildtypischen Resultaten. Daher ist davon auszugehen, dass die IC4 tatsächlich

entsprechend Benton et al. (2006) an der Bindung des Or83b beteiligt ist. Zusätzlich scheint

aber die EC4 auch noch an der Interaktion mit dem Or83b beteiligt zu sein.

5.2.5 IC2 als potentielle Bindungsstelle für Komponenten der Adaptation

Bei den elektrophysiologischen Messungen an Fliegen, die die IC2 zusammen mit der

IC4 exprimierten, waren die Reizantworten fast durchgehend erhöht (siehe Abbildung 23). Da

bei Expression der IC4 alleine nur bei OA und cHOH erhöhte Reizantworten auftraten,

dürften die erhöhten Werte durch Effekte der IC2-Fragmente zustande gekommen sein. Wie

bei den anderen Domänen sind auch hier Effekte durch kompetitive Hemmung zu

berücksichtigen. Dabei wäre eigentlich eher eine Verringerung der Reizantworten zu

erwarten. Bei den Verhaltenstests waren die Fliegen, die IC2 zusammen mit IC4 exprimierten,

deutlich sensitiver. Bei Expression nur der IC4 zeigte sich kein Unterschied zum Wildtyp, so

dass dieser Effekt ebenfalls der IC2 zugeordnet werden kann. Auch im Verhaltenstest wäre

bei kompetitiver Hemmung der Reizweitergabe der gegenteilige Effekt zu erwarten gewesen,

also dass die Fliegen weniger sensitiv reagierten. Daher scheinen die IC2-Fragmente nicht die

Reizweitergabe zu blockieren, sondern eher zu verstärken. Offensichtlich sind Mechanismen

der Rezeptorinaktivierung blockiert. Als Komponenten kommen die Bestandteile in Frage, die

für die Adaptation verantwortlich sind, z.B. Arrestine oder Proteinkinasen. Wahrscheinlich

werden aber nicht die Arrestine selber geblockt, da für die Bindung der Arrestine ein

phosphorylierter Rezeptor benötigt wird. Die Positionen, die phosphoryliert werden, betreffen

die Bindestelle des G-Proteines (Ferguson und Caron, 1998). Wahrscheinlicher ist daher die

Bindung einer anderen Komponente des Adaptationsmechanismus an die IC2. Eventuell

binden Proteinkinasen wie die cAMP-abhängige Proteinkinase A oder eine G-Protein-

gekoppelte Rezeptorkinase an die IC2, um die IC3 zu phosphorylieren.

Ausblick

82

6 Ausblick

In der vorliegenden Dissertation wurde untersucht, ob sich die Expression der Domänen

des Or43a, die nicht innerhalb der Membran liegen, auf olfaktorische Reizantworten auswirkt.

Für die Untersuchungen wurden die vier extrazellulären Domänen (EC1, EC2, EC3 und EC4)

sowie die vier intrazellulären Domänen (IC1, IC2, IC3 und IC4) jeweils in den ORNs von

Drosophila exprimiert und der Effekt durch EAG-Messungen und Verhaltensversuche

gegenüber dem Wildtyp überprüft.

Bei der Expression der EC4 waren in der Elektrophysiologie die Reizantworten erhöht,

das olfaktorische Verhalten aber unverändert. Die Expression der IC2 bewirkte sowohl eine

erhöhte Reizantwort im EAG als auch eine erhöhte Sensitivität im Verhaltenstest. Bei

Expression der IC3 reagierten die Tiere im Verhaltenstest weniger empfindlich auf den

Duftstoff als der Wildtyp; die EAG-Messungen wichen meistens nicht von wildtypischen

Amplituden ab. Die Kinetik dieser Messungen war allerdings verändert: Sowohl der Anstieg

bei der Depolarisation als auch der Rückgang bei der Repolarisation verliefen langsamer als

beim Wildtyp. Bei Expression der IC4 trat bei den EAG-Messungen eine Kinetik mit einer

verlängerten Zeit bis zum Rückgang bei der Repolarisation auf.

Die Ergebnisse legen nahe, dass die Domänen EC4, IC2 und IC3 sowie wahrscheinlich

auch IC4 für Interaktionen mit Komponenten der Signalkaskade verantwortlich sind. Hierfür

kommen neben dem Or83b vor allem G-Proteine, Proteinkinasen und Arrestine in Frage. Die

Versuche liefern allerdings keine eindeutigen Beweise. Daher bietet es sich an zu überprüfen,

ob die einzelnen Domänen tatsächlich Interaktionen mit den verschiedenen Komponenten der

Signalkaskade eingehen.

Die Hypothesen zu potentiellen Interaktionspartnern der einzelnen Or43a Domänen

(siehe 5.2) könnten durch bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) überprüft

werden (Hu et al., 2002; Benton et al., 2006). Mit dieser Methode könnte beispielsweise

verifiziert werden, ob der Or43a mit Gα interagiert. Neben der Aussage, ob eine Interaktion

stattfindet, erlaubt diese Methode auch noch Aussagen zu der zellulären Lokalisation dieser

Interaktion (Michnick, 2004). Bei einem positiven Ergebnis könnte versucht werden, die

Interaktion durch zusätzliche Expression der Or43a-Domänen zu unterbinden. Auf diese

Weise ist erfassbar, welche Domäne für die Interaktion verantwortlich ist.

In gleicher Weise wie die bimolekulare Fluoreszenzkomplementation könnte auch der

Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) eingesetzt werden (Förster, 1948; Marullo und

Ausblick

83

Bouvier, 2007; Lohse et al., 2008). Anhand eines Energietransfers würden Interaktionen

zwischen dem Or43a und Komponenten der Signalkaskade nachgewiesen. Durch Expression

der Or43a-Loops könnte diese Energieübertragung wiederum gestört werden. Somit ist

erkennbar, welche Domänen des Or43a für die Interaktionen verantwortlich sind.

Da der Signaltransduktion über G-Proteine und zyklische Nukleotide bei der

Geruchswahrnehmung von Drosophila eine Rolle in adaptiven Prozessen zugeschrieben wird

(Wicher et al., 2008), bietet es sich an, Adaptationsversuche bei Expression der

Rezeptordomänen durchzuführen. Hierzu eignen sich sowohl elektrophysiologische

Messungen als auch Verhaltenstests, bei denen Tiere nach langzeitiger Stimulation mit einem

Duftstoff getestet werden (Störtkuhl et al., 1999). In Kapitel 5.2.3 wird der IC3 als potentielle

Bindestelle für das G-Protein diskutiert und in Kapitel 5.2.5 der IC2 als potentielle Bindestelle

für Komponenten der Adaptation wie die cAMP-abhängige Proteinkinase A oder eine G-

Protein-gekoppelte Rezeptorkinase. Wenn die Expression der Domänen IC2 bzw. IC3 die

Adaptation im Vergleich zum Wildtyp herabsetzt, würde dies die diskutierten Hypothesen

unterstützen.

Die vorliegende Arbeit beruht auf einem Modell des Or43a, nach dem der Rezeptor als

heptahelikales Transmembranprotein mit vier extrazellulären und vier intrazellulären

Domänen vorliegt. Das Modell basiert vor allem auf Vorhersagen von Computeralgorithmen,

mit denen in der genomischen DNA-Sequenz von Drosophila nach potentiellen

heptahelikalen Transmembranproteinen gesucht wurde (Clyne et al., 1999; Gao und Chess,

1999; Vosshall et al., 1999; Benton et al., 2006). Teilweise wurde dieses Modell bereits durch

Fusionierung des OR mit Fluoreszenzproteinen bzw. durch Antikörper-Färbungen gegen

intrazelluläre und extrazelluläre Domänen bestätigt (Benton et al., 2006). Zur Absicherung

des Or43a-Modells bietet es sich an, eine Röntgenstrukturanalyse des Or43a anzufertigen.

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84

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Anhang

93

8 Anhang

8.1 Abkürzungsverzeichnis

AC Adenylatzyklase

BA Benzaldehyd

bp Basenpaare

cAMP Zyklisches Adenosinmonophosphat

cHOH Cyclohexanol

Ct-Wert PCR-Zyklus, ab dem die Fluoreszenz der Probe über dem Schwellenwert

liegt

D. melanogaster Drosophila melanogaster

DES Diethylsuccinat

EA Ethylacetat

EAG Elektroantennogramm: Elektrophysiologische Ableitung des

Summenpotentials an der Antenne

EC Ethylcaproat

ERG Elektroretinogramm: Elektrophysiologische Ableitung des

Summenpotentials am Auge

g Erdbeschleunigung: 1g = 9,81 m/s2

GABA γ-Aminobuttersäure

Golf wichtigstes olfaktorisches G-Protein der Vertebraten

GR gustatorischer Rezeptor

GRK G-Protein gekoppelte Rezeptorkinase

Gαo α-Untereinheit des Golf

IA Isoamylacetat

IC intrazelluläre Domäne

IP3 Inositol-1,4,5-Triphosphat

IR ionotroper Rezeptor

MA Methylacetat

MeSa Methylsalicylat

nBUOH n-Butanol

OA Octylacetat

OctOH 1-Octanol

Anhang

94

OR olfaktorischer Rezeptor

ORN olfaktorisches Rezeptor-Neuron

PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)

PEE Propionsäureethylester

RI Response-Index

RNAi RNA Interferenz

SEM Standardfehler des Mittelwertes (standard error of mean)

TAAR Trace amine-associated receptor

UAS Upstream activating sequence

V1r Vomeronasal Typ 1 Rezeptor

V2r Vomeronasal Typ 2 Rezeptor

8.2 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Lebenszyklus von D. melanogaster 12

Abbildung 2: Olfaktorische Sinnesorgane der adulten Fliege 13

Abbildung 3: Schema eines olfaktorischen Sensillums 14

Abbildung 4: Übersicht über die olfaktorische Signalweitergabe von der Antenne 15

Abbildung 5: Klassische olfaktorische Signaltransduktion bei Vertebraten 17

Abbildung 6: Model der olfaktorischen Signalkaskade nach Wicher et al. (2008) 19

Abbildung 7: Topologie olfaktorischer Rezeptoren von Drosophila 23

Abbildung 8: Expression eines Genes mit dem Gal4-System 34

Abbildung 9: Gelelektrophoretische Kontrolle der PCR-Spezifität zur IC4-Amplifikation 42


transgenen Fliegenlinien 43


isomerisierten Fliegenlinien 44

Abbildung 12: IC4-Expression in der Antenne 46

Abbildung 13: Expression der Domänen IC2 und IC4 zusammen in der Antenne 47

Abbildung 14: RNA-Analyse der Antennen von F1-Tieren aus [IC4 (2-3) x Or83b-Gal4],

Probe A 48

Abbildung 15: Relative Quantifizierung der IC4 mRNA 50

Abbildung 16: EAG bei Expression der EC1 52


Anhang

95



Abbildung 20: EAG bei Expression der IC1 55



Abbildung 23: EAG bei Expression der IC2 zusammen mit der IC4 59

Abbildung 24: T-Maze mit BA (1:100) 61

Abbildung 25: T-Maze mit cHOH (1:100) 62

Abbildung 26: T-Maze mit cHOH verschiedener Konzentrationen 63

Abbildung 27: EAG-Kinetik bei Expression der IC3 64

Abbildung 28: Anstiegszeiten bei Stimulation mit cHOH 65

Abbildung 29: Abklingzeiten bei Stimulation mit cHOH 66

Abbildung 30: ERG mit Blaulicht bei Expression der EC4 68

Abbildung 31: ERG-Rezeptorpotentiale bei Expression der EC4 68

Abbildung 32: „Ein“-Transienten im ERG bei Expression der EC4 69

Abbildung 33: „Aus“-Transienten im ERG bei Expression der EC4 70

Abbildung 34: RNA-Analyse der Antennen von [IC4 (2-1) x Or83b-Gal4] 96



Abbildung 37: RNA-Analyse der Antennen von white-Fliegen 99

Abbildung 38: Referenzmessungen zu den RNA-Analysen 100

Abbildung 39: Schmelzkurve der qRT-PCR von rp49 101

Abbildung 40: Schmelzkurve der qRT-PCR von rp49 ohne reverse Transkriptase 101

Abbildung 41: Schmelzkurve der qRT-PCR der Domäne IC4 102

Anhang

96

8.3 Ergebnisse der RNA-Analysen

Abbildung 34: RNA-Analyse der Antennen von [IC4 (2-1) x Or83b-Gal4]

A-C geben die jeweilige Antennenprobe an, aus der die RNA gewonnen wurde.

Anhang

97



Anhang

98



Anhang

99

Abbildung 37: RNA-Analyse der Antennen von white-Fliegen


Anhang

100

Abbildung 38: Referenzmessungen zu den RNA-Analysen

A zeigt die Referenzmessung zu Abbildung 35 A. Den anderen elektrophoretischen RNA-Analysen

liegt die Referenzmessung B zugrunde.

Anhang

101

Abbildung 39: Schmelzkurve der qRT-PCR von rp49

Die zugehörigen RNA-Proben sind in Tabelle 5 aufgeführt.

Abbildung 40: Schmelzkurve der qRT-PCR von rp49 ohne reverse Transkriptase


Anhang

102

Abbildung 41: Schmelzkurve der qRT-PCR der Domäne IC4


Tabelle 5: Ct-Werte der qRT-PCR des IC4-Fragments

IC4-Fragment rp49

Durchgang 1 2 3

Mittel-

wert 1 2 3

Mittel-

wert

white A / / / 11,25 16,08 16,35 16,22

white B / / / 16,10 16,27 16,74 16,37

white C / / / 15,96 16,97 16,62 16,52

IC4 (2-1) A 15,74 16,10 16,09 15,98 15,03 15,03 15,19 15,08

IC4 (2-1) B 16,06 16,13 16,03 16,07 16,15 16,30 17,10 16,52

IC4 (2-1) C 16,29 16,27 16,14 16,23 15,58 16,37 16,97 16,31

IC4 (2-3) A 16,01 15,27 16,10 15,79 15,14 16,10 16,31 15,85

IC4 (2-3) B 14,72 15,62 15,07 15,14 14,42 14,98 15,48 14,96

IC4 (2-3) C 17,63 17,87 16,07 17,75 16,12 16,78 17,14 16,68

IC4 (4-1) A 16,22 16,85 15,59 16,22 15,38 15,57 15,97 15,64

IC4 (4-1) B 14,98 15,36 15,27 15,20 15,76 15,75 15,67 15,73

IC4 (4-1) C 15,43 15,79 15,36 15,53 15,56 15,37 16,18 15,70

Anhang

103

Tabelle 6: Ct-Werte der qRT-PCR der endogenen Domäne IC4 zusammen mit dem

exprimierten EC4-Fragment

IC4 (endogen + Fragment) rp49

Durchgang 1 2 3

Mittel-

wert 1 2 3

Mittel-

wert

white A 23,74 24,02 23,10 23,62 19,17 20,17 19,63 19,66

white B 23,93 23,37 23,70 23,67 19,28 19,37 19,68 19,45

white C 23,51 23,67 23,49 23,55 19,26 19,85 19,74 19,61

IC4 (2-1) A 19,07 18,94 17,55 18,52 18,36 19,02 18,96 18,78

IC4 (2-1) B 18,88 18,91 18,52 18,77 20,23 19,65 20,10 19,99

IC4 (2-1) C 17,96 17,79 17,90 17,88 19,23 19,16 19,29 19,22

IC4 (2-3) A 18,44 18,61 18,35 18,47 17,72 18,16 18,03 17,97

IC4 (2-3) B 17,49 17,57 16,89 17,32 18,65 18,49 18,78 18,64

IC4 (2-3) C 18,60 18,61 18,34 18,52 18,99 19,49 19,53 19,33

IC4 (4-1) A 18,82 18,78 18,76 18,79 20,06 20,27 20,21 20,18

IC4 (4-1) B 18,34 18,40 18,31 18,35 18,02 19,21 19,81 19,02

IC4 (4-1) C 18,23 18,00 17,81 18,01 18,39 18,08 18,98 18,48

Anhang

104

8.4 Lebenslauf

Persönliche Daten

Name: Robert F. Freyberger

Geburtsdatum: 20.6.1976

Geburtsort: Hannover

Familienstand: Verheiratet, zwei Kinder

Schulbildung:

08.1983 – 07.1987 Grundschule Peterstraße, Wuppertal

08.1987 – 07.1997 Gymnasium an der Siegesstraße, Wuppertal

Erlangung der Allgemeinen Hochschulreife

Zivildienst:

08.1997 – 08.1998 Tätigkeit in der evangelischen Kirchengemeinde in Gladenbach

(Hessen)

Hochschulbildung:

08.1998 – 01.2009 Studium der Biologie an der Ruhr-Universität Bochum

Schwerpunkt: Molekularbiologie und Sinnesphysiologie

Thema der Diplomarbeit: „Aufbau eines neuen Applikationssystems

zur Untersuchung von Drosophila-Larven“, Arbeitsgruppe

Sinnesphysiologie der Fakultät für Biologie und Biotechnologie

Seit 02.2009 Promotion an der Ruhr-Universität Bochum

Thema der Dissertationsschrift: „Charakterisierung interagierender

Domänen olfaktorischer Rezeptoren mit Komponenten der

Signalkaskade und dem Or83b in Drosophila melanogaster“,

Arbeitsgruppe Sinnesphysiologie der Fakultät für Biologie und

Biotechnologie

charakterisierung interagierender domänen olfaktorischer ... · in the second pathway, odorant...

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