Chemische und elektronenoptische Untersuchungen uber die Reaktion von Uranylacetat mit Kollagen

Von ELISABETH GERIIARDT und KLAUS K~JHK

Nit 3 dbbildungen

Professor Ulrich Hofmann xum 60. Gebzcrtstnge gewidmet

Inhaltsiibersicht Kollagenfibrillen zeigen nach Behandeln mit Uranylacetat im Elektronenmikroskop

ein unterteiltes Querstreifungsmuster. Es wird gezeigt, daB die Ausbildung der Querstreifen auf einer ordnenden Querver-

netzung der Kollagenmolekeln iiber die Seitenketten der sauren Aminosiiuren zuriickzu- fuhren ist.

Summarbry After treatment with uranyl acetate, fibrils of collagen exhibit a cross-banded structure

under the electron microskope. This striation is due to a cross linking of collagen molc- cules via the side chains of the amino acids.

Kollagenfibrillen zeigen im Elektroneiimikroskop ein charakteristi- sches Querst,reifungsinuster, das nach Rehandeln mit Phosphorwolfram- s&ure (PWS) und gerbenden Chrom(II1)-komplexen besoiiders scharf und hochunterteilt hervortritt l). Den gleichen Effekt erzielt man mit Uranyl- kationen. Nach Untersuchungen von KCHN, GRASSNANN und HOFMANN l )

hat die FJnt,stehung der hochunt'erteilten Qnerstreifung nach ,,Anfirhen" folgende Ursache : Die Grundeinheit des Kollagens, das 2800 A lange Tropokollagen(TK)-Molekiil, besteht aus drei miteinander verdrillten Polypeptidketten, die durch Wasserstoffbrucken zusammengehalten werden 2). Langs der Yolypeptidketten wechseln Anhiiufnngen schwerer und polarer und Anhaufungen leichter Aminosaiuren einander ab 3)4). Die TK-Molekule laqern sich bei der Fibrillenbildung, durch elektro-

I) K. KUHN, W. GRASSMANN u. U. HOFMANN, Z. Naturforsch. 13b, 154 (1958). ?) A. RICH u. F. H. CRICK, Nature [London] 176,915 (1955). J. Mol. Biol. 3,483 (1961). 3, K. KUHN, U. HOFIMANN, W. GRASSMANN u. E. CEBHARDT, Natunvissenschaften

") K. KUHN, Leder 11, 110 (191(J). 45, 521 (1958).

72 Zeitschrift fur anorganische urid s1lg:cii~eiiic Chcmie. Hmd 3-20. 1963

statische Krafte gesteuert, seitlich so zusaninien, da13 die Anhaufungen der schweren und polaren Aminosauren nebeneinander zu liegen kommen wid im Elektronenmikroskop als dunkle Querstreifen siclitbar werden 5)6).

Diese Ordnuiig wird durch eine Quervernetzung der Molekeln iiber die Seitenket ten der basischen und sauren Aminosauren in den Dunkelteilen h i t Hilfe von PWS uiid Chrom(II1)-komplexen fixiert. Sie bleibt wahrend der Praparatioii fur das Elektrorienmikroskop erhalten.

Die PWS wird salzartig an die stark basischen Guanidogruppen des Arginins gebunden. Dabei reagiert eiii dreibasisches Phosphorwolframat- Ion stochionietrisch mit 3 Argininresten aus drej verschiedenen Tropo- kollagenrriolekeln l). Die Chrom(II1)-komplexe wirken uber die Carb- osylgruppen der Glutamin- uiid Asparaginsailire quervernetzend. Dabei werden die Cavboxylgruppen koordinativ in die Chronikomplexe aufge- nomnien'). Es ist wahrscheinlich, dall auch die Uranylkatioiien mit den Carhoxylntiorien des Kollapens reagiereii.

Da das Uranylacetat zur , ,Anfarbung.' des Kollageiis geeigneter er- sclieint als die Chrom(I11)-koniplexe. wurde seirie R8eaktion mit Kollagen ridher nntersucht. Auch in der elektronenmikroskopischen Histologie wird es haufig als Koiitrastmittel verwendet, so dall die Reaktion zwischen dem TTraiiylkathi iintl EiweiB von allgemeinerem Interesse ist.

Ergebnisse Ma13 tur tlie Reaktion ewisclien Uranj lavetat und Kollagen-

fihrilleli wurdeii uiitersucht a ) die Uranaufnahme, angegeben als UO? in niy/g Kollagen, b) die ini E:lektroiienmikrosko~~ sichtbare unterteilte Queistreifung der Fibrillen als Test fur die ordneride Wirkung und c) die Schrumpfungsteniperatur der Fibrillen uiit er M'asser als Test fur die ver- festigende Wirkung der Uranylkationen.

1. L)ie fieaktion zwischeii nativem Kollagen und Ursnylacetat Die Uranaufiia hme der Kollageniibrillen schwnnkt mit der Dauer der

Behalidlung in uicht iibersehbarer Weise zwischeri 157 mg uiid 221 mg (0,51 uiid 0,82 mMol) UO','/g Kollagen (Tab. 1). 1 g Kollagen enthalt O,B mMol Asparagin- und Glutaniinsaure mit freieii y- bzw. d-Carboxyl- gruppen. Weiin man annimmt. daB ein Uraiiylkatioii niit zwei Carboxyl- gruppen reagieit. ist tlie Aufnahme bei allen Kollngen1)raparaten zu hoch . Dies durfte auf eine unspezjfische Bindiing von bnsischeii Uranylacetaten

K. KUHX, W. GRASWANN u. LJ. HOFDIANN, Naturivissenschaftcn 47, 258 (1960). 6 , K. KtJHN 11. E. ZIMNIER, Z. Naturforuch. l f ih, 658 (1961). 7) K K ~ T H ~ 11. 13. (+RBH \ R D ~ ' , %. Naturforsch. 15 b, 2 3 (1960).

E. GEHHARDT u. K. Knrn, Keaktion von Urai~ylacetat mit Ko!lagoii 7 3

oder auf eine iiicht stochiometrische Reaktiori der limnylkationeii zu- ruckzafuhren sein.

A4uswaschversuche ergaben, daS das Uranylkation iiicht besonders fest am Kollagen haftet !Tab. 2 ) . Nach zweitagigem Stehen unter Wasser werden etwa lo./;,, nacli LO 'J'agen etwa die Halfte des urspriinglich gek~undenen Urans wieder ahgegeben.

Die niit Uranylacetat he- handelten Kollagenfibrillen zei- gen i m Elektronenmikroskol) eiiie gut unterteilte Querstrei- fung (Abb. 1). Die relative Lage der einzelnen Querstreifen 16irgs der Periode von 700 i%

gleicht den Querstreifnngs- mustern nach Behandlung mit PWS undbasischen@hrom( 111)- komplexen. Die Intensitat der einzelnen Querstreifen ahnelt demQuerstreifungsmuster nach Chromg erbu ng .

'l'abelle I ti raiiauf t i h 111 e u nd S c h r I I uipf u iigsy U I I k t (T,) vonKol lagenf ibr i l len n a c h verschic-

dencr H a h n n d l u n g s d a u c r m i t Uranp l - a c e t a t

Behandlungsdauer mg LJOZ+/g I T,

'IL Stande 1 Stunde 2 Stunden 4 Stunden ,i Stunden

12 Stunden 24 Stunden 10 Tage

2 Wochell 3 Wochen 1 Monat, 2 Monatct

137 1 78 22 1 81 184 7!l 197 i ! ) 193 32 193 3c I

175 S2 171 SI 157 $2 136 82 167 81 172 8"

Tabelle 2 U r a n g e h a1 t v o 11 m i t U r a n y 1 a u e t a t be h a n d e 1 t e n K o 11 a g M n f i b r i 11 e n t L ii e h

Waschen m i t des t i l l i e r tem Wasser

Kone.

Std. 2% 1 137 ' 43 7 0 14 Tg. 2% I L57 I 82 I 141 I 79 8 77 I 79 14Tg. 0,5% 1 102 80 , 93 , 7G , 63 i 2

UO$+/g Kollagen T, = Schrumpfungspunkt, 'J', von nativein Kollagen = GG "C. Urannufnahint. in nig

Die Schrumpfuiigspunkte liegen zwischen 78 "C und 82°C. Sie Bind nicht so stark erhoht wie nach Chromgerkmng (83 -1 00 "C). Xie siiid etwa deli nach PWX-Behandlung erhaltenen (um 80 "C) vergleichhar.

2. Die Reaktion zwischen Uranylacetat und Kollagenprlparaten mit ver- anderton funktionellen Gruppen

Um festzustellen, welche funktionellen Gruppen des Kollageiis fur die Bindung der Uranylkationen nnd fur die Ausbildung der unterteilten

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Querstreifung verantwortlich sind. wurden diese spstematisch ver- andert.

Durch Rehandeln mit salpetriger Saure be1 pH 2 aurden die Ammoniumgruppen des Lysins und Hydi-oxylysins vollstandig durch Hydroxylgruppen ersetzt. Die Guanidogruppen des Arginins werden unter diesen Bedingungeii so verandert, da13 pie nicht mehr als Kat- ionen reagieren. Jhc Hydroxylgruppen des Hydroxyprolms, des Hydroxplysins und des Serins wurdcn durch Acetylierung und die Carboxylgruppen der Asparagin- und Glutamin- saure durrhVerestern mit Methylalkohol hlockiert. (Vgl. Tab. 2 in KUHX iind c*EBHAROT7).)

Abh. 1. Ko!lagenfibrille mit 2proz. Uranylacetatlosuiig behandelt, 1 9 7 mg UO;+/g Kolla- gen, e1rktr.-opt. Vergr. 50000: 1

Ahb. 2. Fibrille aus Desamino-Bcetylkollagen niit 2pproz. Uranylacetatlosung behandelt, 99 mg UOTf/g Kollagen, rlektr.-opt. Vergr. 24000: 1

Nach Methylierung der Carboxylgruppen sinkt die Uranaufnahme praktisch auf Null. I m Elektronenmikroskop unterscheiden sich die mit Uranylacetat behandelten Fibrillen nicht voii unbehandeltem Methyl- kollagen (Abb. 2 ) . Eine Schrumpfuiigspunkterhohimg konnte nicht fest- gestellt werden (Tab. 3).

Nach Ausschaltung der basischen Gruppen und der Hydroxylgruppen bei intakten Carboxylgruppen geht die Uranaufnahme zwar zuriick, im

Elektronenmikroskop erkeriiit man aber ein gut unterteiltes Querstrei- fungsmuster (Abh. 3). Die Schrixmpfungspiiiikterhohuiig ist gegenuber nativem Hollagen nicht verringert (Tab. 3).

Abh. 3. Fihrille ails Methylkollagen mit 2proz. Uranylacetatlosung hehandelt, 11 mg UO:+/g Kollagen. e1cktr.-opt. Vergr. 6 100: 1

Tabelle 3 Ur an a u f n a h m e I- o n K o 11 a g e n f i b r i 11 e n mi t v e r - a n d e r t c n s a u r e n u n d bas ischen G r u p p e n u n d

Hydro x y 1 gr u p p e n n a c h 4 s t ii n di g e m B e h a n d e In m i t U r a n y l a ce t a t

Kollagen nat,iv Desaminokollagen

Desamino (pH 2, 6 Tp.) - Acetylkollagen Methylkollagen

(PH 2,6 Tag4

/IT, = Schrumpfungspunkt (,,angefarbt")-Schrumpfungs- punkt (unbchandelt) ; Qu = Querstreifung ; $- + + =

8-12 Querstreifen, ++ = 4-8 Querstreifen, + = 2-4 Querstreifen

Diskussiori Diese Ergebnisse zeigen deutlich, da13 die fur die Ausbilduiig der unter-

teilten Querstreifung und fur die Erhohung des Schrumpfungspunktes, d. h. die fur die Quervernetzung der Tropokollagenmolekile in den Fibril- len verantwortliche Bindung der Uranylkationen uber die Carboxyl- gruppen an den Seitenketten der Aspamgin- und Glutaminsaure ge- schieht. nie hasischen Gruppen und die Hydroxylgruppen hahen nur in

7 t i Zeitsclirift fiir anoigaiiischc und allgemoine Cheniie. h i i d 320. 1963

( k g e n w a rt der i iitakte ti Carboxylgruppen a.uf die Uranaufnahme des Kollagens eine Wirkung.

Aus der Erhiihung des Schrum pfungspunktes kann niaii schlielSen ~ da13 eine salzartige Bindung zwischen den Carboxylationen und den Uranyl- katioiien vorliegt. Die koordinative Bindung nach der Chromgerbung verursacht 10-15 O hob-ere Schrumpfungspunkte.

Besonders wichtig sind diese Ergebnisse fiir el~ktronenrnik~oskopische Unt)ersuchuiigen uber die Verteilung der basischen und sauren Amino- siiureii kings der Yolypeptidketten der TK-Nolekel, die an einer kiinst- lichen Kollagenforni, den I,orig-spa,cing-Segrnenteii (SLS), durchgefiihrt wurdens).

Wiihrend die 5'800 L$ langen TK-Molekeln in den Fibrillen des iiativen Typs nm eiri Viertel ihrcr Lange gcgeneinander versetzt angeordnet sind und so die Querstreifungs- pcriode von 700 verursachen, liegen sie in den 2800 A langen SLS mit den Endcn ab- schneidend parallel nebeneinander. In ihreni Querst,reifungsmuster spicgelt sicti dalier direkt die anordnung der Aminosauren langs der Polypeptidket,ten widere).

Ein genauer \;ergleich der mit PWS und Uranylacetat angeflirbten Segmente ergab eine Ubereinstimmung in den relativeri Lagen der Quer- &reifen Iangs des Xegmeiites, zeigte aber charakt.eristische Unt,erschiede i n den Intensitaten der einzelnen Querstreifen. Unsere TJntersuchungen iiber die Bindung von YWS und Uranylacetat an Kollagen berechtigeri zu tlem SchluB, daB die Querstreifen, die nach PWS-Anftirbung besonders intensiv erscheinen: vorwiegend basische Aniinosauren enthalteii, wlihrend tliejenigen, die nach Uranjlacetatbehandlung besonders kontrastreich sitid, hauptsiichlich aus sauren Aminosauren bestehen. Der genaue photo- inetrische Vergleich ergab AufschluIJ uber die Verteilung der sauren und lmsischeii Arninosiiuren langs des 7'ropokollagenmolekuls "8).

Experimentc4ler Teil his -~.lusgaiigsiiiatri.ial diente Achillessehne vom Rind. Die Hehiieri wurden in einem

Gcfriermikrotom gosohnitten und dureh einen Homogenisator fein verteilt. Wenn nicht anders angegrben, wurden die Fasern vier Stnnden mit Zproz. Ursiiylaee-

tatlosung behandelt. AnschlielJend mit Wasser, Alkohol und Ather gewaschen und iiber I getro ckne t .

Die Veranderungen der funktionellen Gruppen des Kollagens wurdcn wie bei KUIIF. HOFMANN und GRASSMANN beschrieben, durchgefiihrt l)7).

Bestimmung des Schrumpfungspunktes siehe 7) .

Zur Bestimmung des Urangehaltes der Korallenpraparate wurde die Bildung des gelben Farbkomplexes zwischen Uranylkationen und Dibenzoylmethan ausgeniitzty).

8 ) K. KUHK, U. HOFMANN 11. W. GRASSMANN, Naturwissenschaften 46, 51% (1959);

9) .J . H. YOE, b'. WILL u. R. A. BLACK, Aiialyt. Chem. 2.5, 1200 (1953). 47, 15 (19(iO).

R. GEBHARDT u. K. KUHN. Keaktion \on liranylacrtat mrt Kollagrn 77

Es wurden 20 mg Kollagen mit 2 em3 Salpetersiiurc am Sandbd bis zur Entwicklung brauner Dampfe erhitzt. AnschlicBend wurde auf 5 om3 aufpefiillt. Davan wurde 1 em3 mit 40 cm3 50proz. Athanol verdiinnt und mit Nntronlauge auf pH 5 bis 5,5 gebracht.

NachZugabe von 1 em3 Farbreagenz ( l g Uibenzoylmethan in 100 cm3 96proz. hhanol ) wurde der pH auf 7-8 erhoht und mi t Athanol auf 50 cm3 aufgefiillt. Nach riner Skinde wurde bei 418 mp gemessen.

Die elektronenmikroskopischen Untersuchungen wnrden \vie bci KUHN. HOFMANK und GRASSMANN~) angegeben durchgefiihrt.

Der Deutschen Forschungsgemeiiischaft dankrn T\ 11' f u i groI3znqige I'nterstdtsuncr.

Hei del b erg, Aiior~aiiisch-chemisc2lE?s Institut der Universitiit,.

Rei der Redaktion eingegangen am 9. Juli 1962.