diagnostik bei leptospirosen

Zbl. Bakr. Hyg. A 258, 480-491 (1984)

Deutsche Gesellschaft fiir Hygiene und Mikrobiologie

Kommission zur Erarbeitung von Verfahrensrichtlinien(Leitung: Prof. Dr. F. Burkhardt, Erlangen)

Diagnostik bei Leptospirosen1

Mit 1 Abbildung

Allgemeines

Leptospiren wurden 1915 als Erreger der Weilschen Krankheit (Morbus Weill erkannt. Weitere Krankheiten, die durch Leptospiren verursacht werden, sind u. a. dasSchlamm-, Feld-, Ernte-, Reisfeld- und Canicolafieber, die Erbsenpfliicker- und dieSchweinehiiterkrankheit.

Die Gattung Leptospira (1.) wird in die Arten 1. biflexa und 1. interrogans unterteilt (Empfehlung des Subkomitees fiir Taxonomie der Leptospiren, Miinchen, 1978).1. biflexa ist apathogen und 1. interrogans pathogen. Bei letzterer gibt es annahernd180 Serovare, die in ca. 20 Serogruppen zusammengefagt sind.

Leptospiren sind 6-30 Illange, 0,1-0,21l dicke Organismen, die am Ende abgebogensind (Kleiderbiigel- und Hakenformen). Die Erreger sind spiralig gewunden (Primarund Sekundarwindungen). Sie sind im Hellfeldmikroskop ohne Farbung nicht sichtbar.Am besten ist die Dunkelfeldmikroskopie zum Nachweis geeignet. Die Erreger sindaugerdem auch phasenkontrastmikroskopisch erkennbar.

Als Reservoir pathogener Leptospiren gelten weltweit in freier Wildbahn lebendeund in Gefangenschaft gehaltene Tiere (Haus- und Nutztiere). Die wichtigsten in Europa bei Menschen vorkommenden Leptospiren sowie deren Hauptreservoire sind ausder Tabelle 1 ersichtlich.

Die Inkubationszeit der Leptospirosen betriigt 3-30, gewohnlich 7-14 Tage. Die Infektionen verlaufen meist hochfieberhaft, akut und zweiphasig. Die erste Phase beginnt hochakut ("brutal") mit hohem Fieber, Schmerzen (Myalgien, besonders in den Waden) undKonjunktivitis. Nach kurzem fieberfreien Intervall geht die Erkrankung in das zweite Stadium tiber, in dem je nach Organlokalisation u. a. auch Ikterus, Meningitis, Nephritis,Lymphadenitis, MilzvergroBerung, Aniimie und Hiimorrhagien auftreten konnen. Vor allem

1 Erarbeitet von der Arbeitsgruppe 1.11Obmann: Dr. A. Schonberg, BerlinMitarbeiter: Prof. Dr. F. Muller, Hamburg

Prof. Dr. A. Weber, ErlangenFrau Dr. E. Fingscheidt, BraunschweigDr. S. Brem, OberschleiBheimProf. Dr. H. Seeliger, WtirzburgDr. E. Schaal, Arnsberg

Diagnostik bei Leptospirosen 481

Tabelle 1. Die wichtigsten Leprospiren beim Menschen in Europa

Krankheitsbild(Bezeichnung)

FeldfieberCanicolafieberSchlamm-, ErntefieberSchweinehuterkrankh.

Weilsche Krankheit

Serovar

grippotyphosacanicolagrippotyphosa, bataviaepomonatarassoviicterohaemorrhagiaehardjo

HaupterregerreservOir

MausHundMausSchwein, MausSchwein, MausRatteRind (GrolSbrit.)

bei der Weilschen Krankheit wird ein deutlicher Ikterus beobachtet. Erkrankungen des ZNSsind meist durch eine serose Meningitis gekennzeichnet. Die Nieren sind bei allen Leptospireninfektionen betroffen. Todesfalle kommen besonders bei den ikterischen Formen vor,sind aber meist durch das gleichzeitige Auftreten von Nierenschaden bedingt. Gelegentlichwerden auch mild verlaufende, etwa als "Erkaltung" imponierende Verlaufsformen beobachtet.

Leptospirosen sind haufig Berufskrankheiten. Besonders gefahrdet sind Abwasserund Kanalarbeiter, Schweinezuchter und Metzger. Aus diesem Grunde ist eine gezielteAnamnese fur die Diagnose der Leptospirosen wertvoll.

Nach § 3 des Bundesseuchengesetzes in der Neufassung vom 18. 12. 79 (BGBI. IS.2248) ist die Erkrankung sowie der Tod des Menschen an Leptospirose meldepflichtig.Das Auftreten dieser Infektionskrankheit bei Tieren unterliegt gleichfalls der Meldepflicht (VO uber meldepflichtige Tierkrankheiten vom 9. 8. 83 (BGBI. I S. 2262).

Untersuchungsmaterial

Fur Laboruntersuchungen eignen sich in der genannten Reihenfolge: Blut, Liquor,Drin, Gewebematerial und Korperhohlenflussigkeit.

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Stadium derleptospiriimie

Stadium derOrgan manites lotion

event. Ruckfalle

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ISpr6ssig und Anger. 1972)

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§ Antikorpernachweis

-- sehr wahrscheinlich

Blut IUrin, liquor) •

Abb. 1. Schematische Darstellung des klinischen Verlaufs der Leptospirosen.

482 Diagnostik bei Leptospirosen

Gang der Untersuchung

Der Erregernachweis kann mikroskopisch, kulturell, tierexperimentell und serologisch gefiihrt werden.

1. Mikroskopischer Direktnachweis

Das mikroskopische Direktpriiparat ermoglicht den Nachweis der Krankheitserregernur in einem beschriinkten Teil der faile, da sie gewohnlich nur in geringer Menge imBlut, in Zerebrospinalfliissigkeit, Urin oder den anderen, oben aufgefiihrten Materialien vorhanden sind. In Blut und Liquor sind die Leptospiren gewohnlich nur in derersten Krankheitswoche mikroskopisch nachweisbar. Die Untersuchung sollte rasch,moglichst sofort nach Gewinnung der Proben, durchgefiihrt werden. Bei anderemMaterial lassen sich die Erreger in der Regel erst ab der zweiten Krankheitswochebakterioskopisch feststellen. 1m Urin fiihrt die direkte Mikroskopie am ehesten zumErfolg, wenn er korperwarm untersucht wird.

Die mikroskopische Untersuchung wird bei 200- bis 400facher Vergrogerung ambesten mittels Dunkelfeldmikroskop durchgefiihrt. Leptospiren zeigen lebhafte, meistrotierende Bewegungen, wobei die Enden der Mikroorganismen ruckartig hin- undhergeschlagen werden. Gelegentliches Abknicken und Wiederstrecken des ganzen Organismus oder Gleitbewegungen, ganz durch das Gesichtsfeld oder auch ohne grogereOrtsveriinderungen, sprechen fiir Leptospiren.

Da die Erreger dem mikroskopischen Nachweis oft entgehen oder Verwechslungenmit gewissen Strukturen wie Fibrillen oder zelluliiren Bestandteilen eintreten konnen,sollte stets gleichzeitig eine der anderen genannten Nachweismethoden angewandtwerden.

Blutproben werden wiihrend des Fieberstadiums entnommen. Je 5 ml werden durchZusatz von 0,5 ml 1%iger Natriumoxalatlosung oder 0,1 ml 1%iger Heparinlosungungerinnbar gemacht und zur Entfernung der zelluliiren Blutbestandteile anschliegendbei etwa 30 x g 10 min zentrifugiert. Natriumzitratlosung ist als Zusatz wenigergeeignet. Der fliissige Dberstand wird in ein anderes Rohrchen iiberpipettiert und dann1-2 Std. bei hoher Tourenzahl (1.200-3.000 x g) zentrifugiert. Die Leptospiren befinden sich nun im Sediment, das man in dunner Schicht zwischen Objekttrager undDeckglas verlaufen liigt. Die mikroskopische Durchmusterung ist ohne Verzug durchzufiihren.

Zum AusschluB von Zerfallsprodukten von Blutzellen sowie anderen Artefakten, dieLeptospiren vortauschen konnen, empfiehlt es sich, konzentriertes Streptolysin 0 mit einerKapillare an den Deckglasrand zu bringen und unter Ansaugen - etwa mittels FlieBpapierdem gegeniiberliegenden Rand zulaufen zu lassen. Liegen sog. "Pseudospirochiiten" vor,werden diese rasch aufgelost.

Liquor und Korperhohlenflussigkeit werden in der Regel unzentrifugiert untersucht.Urinproben sind bei saurer Reaktion mit n/10 NaOH, stiirker alkalische Proben mit

n/lO Hel zu neutralisieren. Sie konnen zur mikroskopischen Durchmusterung ohneweitere Vorbehandlung auf den Objekttriiger gegeben werden. Da zelluliire PartikelLichtstreuungen und -reflexionen bewirken konnen, die den Nachweis der Erregerstoren, kann es jedoch von Vorteil sein, sie zuvor durch 10 min Zentrifugieren bei 30 xg aus der Fliissigkeit abzuschleudern und dann entweder den Dberstand direkt oder,analog zum Vorgehen bei Blutproben, das Sediment aus dem Dberstand nach 1-2 Std.


Zentrifugieren bei 1.200-3.000 x g fur das mikroskopische Praparat zu verwenden.Organmaterial wird mit der 10fachen Menge steriler isotonischer NaCI-Losung im

Morser homogen verrieben. Nach dem Absetzen der festen Bestandteile wird ein kleiner Tropfen des klaren Dberstandes direkt oder, wie zuvor fiir Blut- und Urinprobenbeschrieben, nach zwei Zentrifugierungsschritten zum Praparat verarbeitet.

Leptospirennachweis mittels Serovar-spezifischer, FITC-konjugierter Seren

Seit mehreren Jahren wird auch die Fluoreszenztechnik zum Nachweis der Leptospiren in Korperflussigkeiten und vor allem in Gewebe angewandt. Der Vorteilliegt in derMoglichkeit, die Erreger auch in starker verunreinigtem Material nachweisen zu konnen. Das Verfahren hat bisher noch keinen Eingang in die Routinediagnostik gefunden.

Bezugsquelle fiir FITC-konjugierte Seren: Fa. Difco, Detroit, Michigan, USA.

Leptospirennachweis mittels Silberimpragnierung (Levaditi-Farbung)

Wird nicht routinernaBig, sondern nur in Spezialinstituten angewandt (Nachweis derErreger in Gewebeschnitten, vor allem im Nierengewebe).

2. Isolierung mittels Kulturverfahren

Der kulturelle Nachweis ist bei den meisten Leptospiren-Stammen mittels Nahrboden moglich, denen Kaninchenserum zugesetzt ist, wie Korthof-, Fletscher- oder StuartMedium. Ein Teil der Stamme entwickelt sich besser in Medien mit Albumin- oderTween-Zusatz wie EMJH-Medium. Wie bei der mikroskopischen Untersuchung gelingt der Erregernachweis im Blut und Liquor in der Regel nur in der ersten Krankheitswoche, aus anderen Proben erst in der Folgezeit. Die Ausscheidung im Urin kann sichu. U. uber Monate hinziehen und intermittierend erfolgen. Die Zahl der Erreger istdabei meist gering. Daher sind wiederholte Untersuchungen zum Nachweis erforderlich. Die Nachweisrate hangt von der zwischen Probengewinnung und Kulturansatzvergangenen Zeit ab; daher sollte die kulturelle Untersuchung moglichst rasch nach derMaterialentnahme durchgefiihrt werden.

Von jeder Probe sollten mindestens 3 Kulturrohrchen, besser je 2 Rohrchen von 2verschiedenen Niihrb6den, beimpft werden. 1m Krankheitsverlauf treten zunehmend,vor allem im Blut, Abwehrstoffe auf, die das Wachstum hemmen. Urn ihren Effektmoglichst gering zu halten, diirfen nur minimale Inokula, z. B. 1 Tropfen Blut pro 5 mlSubstrat, verimpft werden. Die unbeimpften Niihrboden konnen mehrere Monate beiZimmertemperatur gelagen werden. Nach der Beimpfung werden sie bei 28-30°C imDunkeln bebriitet und wochentlich mindestens einmal im Dunkelfeld auf Wachstumgepriift.

Auch wenn keine Leptospiren sichtbar sind, sind nach einer Woche Subkulturenanzulegen. Diese Passagen sind iiber 6 Wochen durchzufiihren. Dabei wird im Abstandvon 5-7 Tagen jeweils eine Menge von 0,1-0,5 ml des beimpften Mediums in frischeRohrchen uberimpft (maximale Dberimpfungsmenge: 10 % des Rohrcheninhaltes).

Wachstum tritt meist nach 7-14 Tagen auf, gelegentlich auch schon friiher, manchmal aber auch erst nach mehreren Wochen. Es zeigt sich in fliissigen Medien als feineTriibung, in halbstarren Medien in Form einer Triibungsscheibe etwa 1-3 cm unter derNahrbodenoberflache; doch konnen trotz Vorhandenseins von Leptospiren diese Veranderungen auch fehlen. Fiir die Herstellung des mikroskopischen Praparates wird einTropfchen aus einigen cm Tide von fliissigen Medien bzw. eine entsprechend kleine


Materialmenge aus dem scheibenformigen Wachstumsbereich von halbstarren Medienentnommen. Die Untersuchung wird zunaehst bei etwa 200faeher VergroBerung, naehFeststellung verdaehtiger Gebilde bei etwa 400faeher VergroBerung durehgefiihrt. 1mpositiven Fall sind die Erreger in der Kultur gewohnlieh naeh 1-2 Woehen naehweisbarund an der eingangs besehriebenen Form und Beweglichkeit zu erkennen. Sie soiltennach Feststellung sofort in frische Medien uberimpft werden.

Zur Aufbewahrung von Kulturen sind halbstarre Nahrbi:iden wie Fletschers Medium ambesten geeignet. Nach Auftreten einer Triibungszone wird die Bebriitung bei Zimmertemperatur fortgefiihrt. Passagen sind in Abstanden von 6-8 Wochen erforderlich. Fliissigkulturenmiissen aile 3-6 Wochen iiberimpft werden.

Verunreinigungen erschweren den kulturellen Nachweis. Rechtzeitiger Ansatz vonSubkulturen durch Passagieren geringer Materialmengen kann die Abtotung vorhandener Leptospiren durch Begleitkeime verhindern helfen. Bei stiirkerer Kontaminationkann es zweckmiilSig sein, Verdiinnungen der verunreinigten Kultur von 1: 10 bis1: 1.000 in geringen Mengen zu uberimpfen. Verwendung von 5-Fluorouracil (1-2 mleiner 1 %igen Losung zu 100 ml Medium) kann bei Fortziichtung kontaminierterKulturen die Beseitigung von Verunreinigungen zusiitzlich erleichtern. Eine andereMoglichkeit der Dekontamination bietet der Tierversuch (s. u.).

Blut und ggf. auch Liquor sind fur den kulturellen Nachweis von Leptospiren meistnur in der ersten Krankheitswoche geeignet. Dazu sollten tiiglich mehrmals Blutproben, am besten direkt in bereitstehende Rohrchen, verimpft werden und zwar nur 1Tropfen pro 5 ml Niihrsubstrat. Kann das Blut nicht sofort nach der Entnahme verimpft werden, wird es mittels Heparin oder Natriumoxalat ungerinnbar gemacht;Zitratzusatz ist wegen moglicher inhibitorischer Effekte weniger geeignet.

Naeh der ersten Woehe ist Blut nur noch zur serologischen Untersuchung geeignet(s. u.).

Urin ist meist erst ab der zweiten Krankheitswoche fiir den kulturellen Nachweisvon Leptospiren geeignet. In saurem Urin ist ihre Lebensdauer auf wenige Stundenbeschriinkt. Die Menge der Leptospiren ist gering, die Ausscheidung intermittierend,daher soliten wiederholte Kulturen angesetzt werden. Wegen moglicher waehstumshemmender Substanzen ist es zweckmiilSig, Urin sowohl unverdiinnt als aueh 1: 10verdiinnt in einer Menge von 1-2 Tropfen zum Niihrsubstrat zuzugeben. Am bestengeeignet ist Blasenpunktions- oder auch Katheterurin. Bei Mittelstrahlurin mulS stetseine Kontamination durch andere Bakterien in Betracht gezogen werden; daher empfiehlt es sieh, solche Proben vor der Verimpfung zu filtrieren (0,45 !.t Porenweite) oderdem Niihrmedium 5-Fluorouracil (s. 0.) zuzusetzen.

Von Verstorbenen eignen sich fiir den kulturellen Nachweis Organproben, vor allemvon Niere und Leber, sowie u. U. Fliissigkeiten aus Korperhohlen. Medien mit 5Fluorouracil-Zusatz verbessern die Ausbeute. Da der Zusatz den kulturellen Nachweisverzogern kann, sollten, soweit nicht offensichtlich Verunreinigungen durch Begleitkeime vorliegen, stets auch Substrate ohne diesen Zusatz angesetzt werden. Die Gewebeproben werden im Morser mit 10 Teilen steriler physiologischer Koehsalzlosung homogenisiert. Nach Absetzen der festen Bestandteile werden yom Oberstand Verdiinnungen 1 : 10 und 1 : 100 der Aufschwemmung angesetzt; davon wird je 1 Tropfen in 5ml Substrat verimpft.

Serovarbestimmung: Es wird empfohlen, sich an das Leptospiren-Labor im Institut fiirVeterinarmedizin des Bundesgesundheitsamtes zu wenden (Adr. s. Anhang, S. 489).


3. Tierexperimenteller Nachweis

Der tierexperimentelle Nachweis hat nur noch Bedeutung, wenn Untersuchungsmaterial durch andere Bakterien kontaminiert ist. Bei aseptisch gewonnenen, kontaminationsfreien Proben bietet der Tierversuch gegenuber der kulturellen Untersuchung keine Vorteile, so daB in solchen Fallen darauf verzichtet werden kann. Eine Ausnahmebilden einzelne Leptospirenstamme wie Serovar hardjo, die kulturell nur schwer isoliertwerden konnen.

Auch bei kontaminierten Proben sollte der Tierversuch nach Moglichkeit durch denEinsatz von hemmstoffhaltigen Nahrmedien eingeschrankt oder ersetzt werden (s. u.).

Geeignet sind Goldhamster (empfanglich fur eine groBe Zahl von Serovaren), femerMause und Meerschweinchen. Je nach GroBe des Tieres werden 0,3-1,0 ml des verdachtigen Materials gewohnlich bei 2-3 Tieren i. p. verimpft. Nach dem Auftreten vonKrankheitserscheinungen, sonst nach 5-8 Tagen, wird Blut und Peritonealexsudatmittels Spritze entnommen und mikroskopisch und kulturell untersucht. Bleiben dieTiere langer als 2 Wochen am Leben, wird emeut Blut entnommen und dieses nunserologisch gepruft.

Beachte: Vor der Impfung mit Patientenmaterial ist eine Kontrollblutentnahme zum AusschluB einer naturlichen Infektion durchzufuhren. Das Blut wird am besten durch Herzpunktion gewonnen (auch fur den spateren kulturellen Nachweis).

4. Serologische Untersuchung

1m Verlauf einer Leptospirose treten im Patientenserum zwischen dem 6. und 10.Tag spezifische Antikorper auf. Der Titer steigt in der 2. Woche deutlich an underreicht in der 3. bis 5. Woche sein Maximum. In einigen Fallen bleibt ein niedrigererAntikorpertiter jahrelang bestehen.

Die serologische Untersuchung ist der fur die praktische Diagnostik wichtigste Wegzum Nachweis einer Leptospiren-Infektion. Zur sicheren Bewertung der Ergebnisse isteine Zweituntersuchung nach 8-14 Tagen anzustreben. Die Diagnose wird durch einenAnstieg der Antikorper urn mindestens das Vierfache zwischen Erst- und Zweitprobegesichert.

In der Praxis werden im wesentlichen folgende Antikorpemachweisverfahren angewandt:- Mikroagglutinationsreaktion (MAR)- Objekttriigeragglutinations-Schnelltest- Komplementbindungsreaktion

Mikroagglutinationsreaktion (MAR)

Dieses Verfahren ist Serovar-spezifisch und arbeitet in der Regel mit Lebendkultureno Daher ist es groBeren bzw. Speziallaboratorien, welche die erforderlichen Stammelaufend fortzuchten, vorbehalten.

Die MAR wurde fruher als Agglutinations-Lysis-Reaktion bezeichnet. Offiziell wird dieBezeichnung "Lysis" nicht mehr verwendet, weiI die "Lysis" durch Bildung kleinster Agglutinate vorgetauscht wird, wobei die Einzelorganismen bei mikroskopischer Betrachtungstark vermindert erscheinen bzw. lichtmikroskopisch nicht mehr sichtbar sind.

Die MAR hat ausschlaggebende Bedeutung unter den serodiagnostischen Verfahren,da sie hochempfindlich und spezifisch ist. Sie beruht darauf, daB die Leptospiren-


Antikorper die ursachliche Serovariante agglutinieren. Auf der Basis von Antigengemeinschaften der Serovare kommt es allerdings zu Kreuzreaktionen. Die Beurteilungder Reaktion erfolgt im Dunkelfeld.

Bei gleicher Technik kann die Reaktion auch mit formolabgetotetem Antigen (0.5 %Formalin) durchgefiihrt werden. Die Sensibilitiit ist dabei etwas vermindert; es entstehenzopfartige Agglutinate.

Hamolytische Seren sollten nicht verwendet werden. Bakteriell kontaminierte Proben sind vor der Untersuchung zu zentrifugieren oder zu filtrieren.

Technik der MAR

Verwendet werden lebende Kulturen von WHO-Standardstammen in fliissigem Medium (Korthof-, EMJH-Medium). Zur Herstellung der Antigene werden die Kulturenso lange bebriitet, bis die Dichte der Leptospiren ca. 1-2 X lO8/ml betragt (4 bis 10Tage). Das Kulturrohrchen zeigt dann im Vergleich zur unbeimpften Kontrolle makroskopisch eine geringe Triibung. Durch Dunkelfeldbetrachtung ist zu priifen, ob dieTriibung nicht durch andere Keime oder durch Ausfallungen bedingt ist. Bei etwa130facher VergrofSerung zeichnet sich das mikroskopische Bild durch dicht aneinanderliegende Leptospiren aus, bei 200facher VergrofSerung finden sich ca. 300-350Leptospiren pro Gesichtsfeld.

"Brutnester" oder Spontanagglutinationen diirfen nicht vorhanden, die Kulturenkeinesfalls alter als 2 Wochen sein. "Brutnester" konnen durch Filtration (0,8 oder1,2 f-l) aus den Kulturen entfernt werden.

Beim Ansatz sind aile epidemiologisch bedeutsamen Serovare als Antigene zu verwenden. Die wichtigsten Serovare in Deutschland sind (Haufigkeit entsprechend derReihenfolge) :

Leptospira interrogans serovar hardjo, - pomona, - tarassovi, - grippotyphosa, canicola, - sejroe, - saxkoebing, - bataviae, - copenhageni (statt serovar icterohaemorrhagiae, da besser antigenwirksam).

Bei Untersuchungen von Tierseren sollten u. U. noch Antigene von folgenden Serovaren mitgetestet werden:Leptospira interrogans serovar javanica, - ballum, - pyrogenes, - autumnalis, - australis, - hebdomadis.

Instrumentariurn

Dunkelfeldmikroskop - Mikrotiterplatten (mit flachem Boden bei direkter mikroskopischer Ablesung in der Platte) oder Rohrchen - Objekttrager - Brutschrank(28-32°C) - Pipetten.

Reaktionsansatz

- Serumverdiinnung 1: 50 mit isotonischer NaCI-Losung oder phosphatgepufferter NaClLosung (PBS, pH 7,2-7,4)z herstellen und davon 0,05 ml3 fiir jede Serovariante in dieVertiefungen der Mikrotiterplatten einpipettieren

z Herstellung der PBS: in 11 isotonischer NaCI-Losung werden 0,49 g KHzP04 und 1,14g NazHP04·2HzO gelost.

3 Die MAR kann auch mit Serum- und Antigenmengen von je 0,025 ml durchgefiihrtwerden. Bei Verwendung von Rohrchen ist es ratsam, je 0,1 ml zu nehmen.


- 0,05 ml3 Antigen zugeben. Dadurch erh6ht sich die Serumverdiinnung auf 1: 100- Kontrollen ansetzen

Antigenkontrolle: mit 0,05 ml3 PBS (statt Serum) und 0,05 ml3 des entsprechenden AntigensNegative Kontrolle: mit negativem SerumPositive Kontrolle: mit positivem Serum

- nach kurzem Schiitteln Reaktionsansatz mindestens 2 Std. in den Brutschrank (28°C)stellen.

Beurteilung

Sie erfolgt dunkelfeldmikroskopisch bei 200-300facher Vergr6gerung. Dazu wird je1 Tropfen der Ansiitze auf einen Objekttriiger iibertragen und, je nach Art des verwendeten Objektives, nach Abdeckung oder ohne Deckglas untersucht.

Negative Reaktion: Leptospiren nach Anzahl und Form unveriindert. Das mikroskopische Bild mug mit dem der negativen Kontrolle iibereinstimmen.

Positive Reaktion: Leptospiren agglutiniert. Hierbei ist erwiihnenswert, dag es auchzu kleinsten Agglutinaten kommt, die lichtmikroskopisch nicht sichbar sind. Zu erkennen ist dies an der Abnahme der Leptospirenzahl pro Gesichtsfeld im Vergleich zurKontrolle ("Lysis"!).

Hochtitrige Seren k6nnen in niedriger Verdiinnung (1 :100, 1: 200) ein fast v611igesVerschwinden der Agglutinate auslosen. Hier ist der Vergleich mit den Kontrollenbesonders wichtig.

Sind in der untersuchten Serumverdiinnung (1 : 100) mehr als 50 % der Leptospirenagglutiniert, wird das Serum in einer Verdunnungsreihe mittels der beschriebenenTechnik austitriert.

Beurteilung der Befunde

Ein positives Ergebnis liegt vor, wenn das Serum in der Verdunnung 1: 400 oderhoher eine 50 %ige Agglutination bewirkt.

Ein verdiichtiges Ergebnis liegt vor, wenn das Serum in der Verdunnung 1 : 200 eineSO%ige Agglutination oder mit der Verdunnung 1 : 100 eine mehr als SO%ige Agglutination bewirkt.

Ein negatives Ergebnis liegt vor, wenn in der Serumverdiinnung 1: 100 weniger als50 % der Leptospiren agglutiniert sind.

Ais Beweis fur eine Leptospirose gilt ein mindestens 4facher Anstieg der Titer vonzwei, im Abstand von 8-14 Tagen entnommenen Serumproben.

Die Titerbestimmung beim Tier ist dieselbe wie fur Humanseren dargestellt. Lediglichbeim pferd gilt ein Titer von 800 oder h6her als positives Ergebnis, wiihrend eine 50%igeAgglutination in der Serumverdunnung 1 :400 oder eine mehr als 50%ige Agglutination inder Verdunnung 1: 200 als verdiichtig angesehen wird.

Modifikationen der MAR

Direkte Ablesung in der Mikrotiterplatte: hierdurch wird das zeitaufwendige Obertragender Reaktionsfliissigkeit auf den Objekttriiger eingespart, jedoch ist fur eine optimaleDurchfiihrung eine Umrustung des Mikroskopes durch Beschaffung folgender Teile erforderlich.- Objektiv mit gro/Sem Arbeitsabstand 170/-, L 10/0.22P; UT 16/0,35 - Best.Nr. 559 141

Leitz, Wetzlar


- Weitwinkelokular, Vergr. 16fach - Best.Nr. 464220, Trockendunkelfeldkondensor 0,710,85, Best.Nr. 465505, Zeiss, Oberkochen

- Mikroskoptisch mit speziellem Objektfiihrer, wodurch die Mikrotiterplatte wie ein Objekttrager bewegt werden kann. Tisch-Nr. 199 18, Best.Nr. 520384, Objektfiihrer,Best.Nr. 520573, Halterahmen fiir Mikrotiterplatten (96 Behalter) Best.Nr. 520589,Leitz, Wetzlar.

Ansatz in Serumpools: fiir die Serumverdiinnung werden mehrere zu priifende Seren in einund demselben Gemisch angesetzt, wobei die Menge der Verdiinnungsfliissigkeit entsprechend der Anzahl der Seren reduziert wird. Es soliten nicht mehr als 5 Seren gleichzeitiguntersucht werden. Beispiel: bei 5 Seren werden 4,5 ml PBS und 5 x 0,1 ml Serum genommen.

Ob;ekttrageragglutinations-Schnelltest

Dieses Verfahren kann als Screeningtest zum Antikorpernachweis im Serum eingesetzt werden.1m Handel werden hierzu angeboten:- stabile, formalinisierte Pool-Antigene, die sich aus je 3 verschiedenen Serovaren zu

sammensetzen- ein durch Hitzebehandlung gewonnener Extrakt aus L. biflexa Patoc I, sog. TR

Leptospirenantigen (TR = thermoresistent). Der Stamm besitzt ein vielen Leptospiren gemeinsames Gruppenantigen, das seine Verwendung fur einen prasumptivenTest bei menschlichen Seren ermoglicht.

Auf fettfreie Objekttrager werden mittels Pipette je 0,01 ml des Serums verbracht und mit0,01 ml Antigen versetzt. Als positive Kontrolle wird ein polyvalentes Leptospirenserum, alsnegative Kontrolle isotonische Kochsalzlosung oder negatives Serum eines Menschen bzw.der zu untersuchenden Tierart mitgefiihrt. Durch Hin- und Herschwenken des Objekttragers werden Antigensuspension und Serum gemischt; die Reaktion wird nach 3-4 min mitblofSem Auge gegen dunklen Hintergrund abgelesen. Die Bewertung hat im Vergleich zurmitgefiihrten positiven Kontrolle zu erfolgen (feine, gleichmafSige Agglutination). Weiteretechnische Details sind den Angaben der Herstellerfirmen zu entnehmen. Bezugsquellen: s.Anhang.

Da es sich beim Objekttrageragglutinations-Schnelltest urn ein Screening-Verfahrenhandelt, das im hiesigen Bereich bisher nur von wenigen Laboratorien vergleichendangewandt wurde, soli ten positiv reagierende Seren mittds der MAR iiberpriift werden.

Komplementbindungsreaktion (KBR)

Zur technischen Durchfuhrung wird auf die DGHM-Verfahrensrichtlinie 3.4 Komplementbindungsreaktion verwiesen. Der Antigentiter sinkt im Laufe der Zeit deutlichab, er ist daher bei nicht haufiger Durchfuhrung der Reaktion vor dem Ansatz zubestimmen. Als Antigengebrauchsdosis wird die doppelte Konzentration des Antigentiters empfohlen.

Die KBR wird in erster Linie von Laboratorien durchgefuhrt, die sich mit der Haltung von Leptospirenkulturen nicht befassen konnen. Sie ist, wie auch die Objekttrageragglutination, genusspezifisch. Komplementbindende Antikorper treten fruh auf; siehalten sich weniger lang im Serum als die mittels MAR nachweisbaren Ar1tikorper.

Bewertet wird dabei diejenige Serumverdunnung, die noch eine wahrnehmbare Hamolysehemmung zeigt.


Allgemein kann festgestellt werden, daIS negative KBR und Objekttrageragglutination bei positiver MAR fiir eine zuriickliegende Infektion sprechen.

Anhang

1. Bezugsquellen von Antigenen, Seren und Ndhrmedien

WHO-Leptospirenstdmme fur die MAR4

- Bundesgesundheitsamt, Institut fiir Veterinarmedizin (Robert von Ostertag-Institut),Post£' 33 00 13, 1000 Berlin 33

- Landesuntersuchungsamt fiir das Gesundheitswesen Siidbayern, Postf. 55, 8042OberschleilSheim

- Koninklijk Instituut voor de Tropen, WHO/FAO Collaborating Centre for Referenceand Research on Leptospirosis, Meibergdreef 39, 1105 AZ Amsterdam Zuidoost

Leptospirenantigene fur die KBR- Behringwerke (u. a. Kontor Frankfurt, Kennedyallee 76, 6000 Frankfurt)

Leptospirenantigene fur den Objekttrdgeragglutinations-Schnelltest- Institut Pasteur (Auslieferung durch

Dr. E. Fresenius KG, Borkenberg 14, 6370 Oberurse1lTs. 1): Leptospirenantigen fiirAgglutinations-Suchtest incl. positivem Kontrollserum (Kat.-Nr. 79623 - TR Leptospira Antigen)

- Difco Laboratories (Auslieferung durchO. Nordwald KG, Heinrichstr. 5, 2000 Hamburg 50, oder Biotest Serum InstitutGmbH, Flughafenstr. 4,6000 Frankfurt 73): Formalinisierte Pool- und Einze1antigene sowie Antiseren.

Fertig-Ndhrmedien- EMJH-Medium: Difco, Detroit, Michigan, USA. Das Medium besteht aus Bacto

Leptospira Medium Base EMJH, Nr. 0794 und Bacto-Leptospira Enrichment EMJH,Nr. 0795

- Stuart-Grundnahrmedium: Difeo (s. 0.) Nr. 0988, mit Leptospira Enrichment, Nr.0452

- Fletscher-Grundnahrmedium: Difco (s. 0.) Nr. 0987, mit Leptospira Enrichment, Nr.0452

Halbfeste Nahrboden konnen auch durch Zusatz von 0,1 % Agar zu Fliissigmedien wieEMJH- oder Stuart-Medien hergestellt werden.

Ndhrmedien mit Hemmstoffen konnen durch Zusatz folgender Substanzen zu den o.g. Medien hergestellt werden:- 5-Fluorouracil, 100-250 [lg/ml (Hoffmann-La Roche AG, Postf. 1380, 7889 Gren

zach-Wyhlen)- Nalidixinsaure, 50 [lg/ml (Winthrop GmbH, Postf. 2209, 6078 Neu-Isenburg) allein

oder in Kombination mit Vancomycin, 10 [lg/ml (Eli Lilly GmbH, Postf. 1420,6380Bad Homburg v. d. H.)

4 Die beiden erstgenannten Institute stehen zur Klarung besonderer Fragen der Leptospiren-Diagnostik in der Bundesrepublik Deutschland zur Verfiigung.


- Sulfadimethoxin (Madribon), 700-2000 Itg/ml (Hoffmann-La Roche AG, s. 0.)- Cycloheximid, 0,5 Itg/ml (Dr. Th. Schuchardt & Co, Eduard-Buchner-Str. 14-20,

8011 Hohenbrunn)

2. Herstellung von Korthof-Medium

Pepton aus Casein 2,0 gNaCl 1,4 gNaHC03 0,02gKCI 0,04 gCaCI2 0,04 gKH2P04 0,18 gNa2HP04 . 2H20 2,0 gAqua dest. ad 1.000 mlSubstanzen durch 30 min Erhitzen im Dampftopf lasen, abkuhlen lassen, filtrieren, pH7,2-7,4 einstellen, abfiillen zu 100 ml in sorgfiiltig gereinigte Kalbchen, Kalbchen 15min bei 121°C autoklavieren. Pro Kalbchen 10 ml inaktiviertes (30 min/56°C), Seitzfiltriertes Kaninchenserum zufugen. Abfullen zu 5 ml in einwandfrei gereinigte Reagenzrohrchen.

Medium vor Beimpfung auf Sterilitiit prufen durch 2tiigige Bebrutung bei 30-37°C.

3. WHO/FAO-Referenzlaboratorien

Koninklijk Instituut voor de Tropen, WHO/FAO Collaborating Centre for Reference and Research on Leptospirosis, Meibergdreef 39, 1105 AZ Amsterdam Zuidoost

Istituto Superiore di Sanita, Viale Regina Elena 299, RomaLeptospira Reference Unit. Public Health Laboratory Service, County Hospital, He

reford HRI 2ER, GB

Literatur

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Dr. Arno Schonberg, Bundesgesundheitsamt, Institut fur Veteriniirmedizin, Postfach330013, D-1000 Berlin 33

diagnostik bei leptospirosen

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