die expressionsmuster pulmonaler metastasen klarzelliger nierenzellkarzinome spiegeln das...
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Die Expressionsmuster pulmonaler Metastasen klarzelliger
Nierenzellkarzinome spiegeln das krankheitsfreie Intervall sowie die
Anzahl der Lungenmetastasen eines Patienten wider
D. Wuttig 1, B. Baier 2, S. Fuessel 1, M. Meinhardt 3, S. Zastrow 1, C. Höfling 1, M.-O.
Grimm 1, A. Meye 1, A. Rolle 2, M.P. Wirth 1
Transkriptomweite Expressionsanalysen
an pulmonalen Nierenzellkarzinom-Metastasen
gefördert von der Dr. Robert-Pfleger-Stiftung
1 Klinik und Poliklinik für Urologie, Technische Universität Dresden2 Fachkrankenhaus Coswig, Zentrum für Pneumologie, Beatmungsmedizin,
Thorax- und Gefäßchirurgie3 Institut für Pathologie, Technische Universität Dresden
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Nierenzellkarzinom und Metastasierung
Nierenzellkarzinom (NZK)
dritthäufigster urologischer Tumor
Dtl.: 10.000 Neuerkrankungen/Jahr [RKI, Stand 11/2004]
urolog. Tumor mit höchster prozentualer Todesrate
Metastasen (60% der Patienten; 50-60% in Lunge)
medianes Überleben: 6–12 Monate
Einleitung
metastatic colonization
dormancy
Metastasierung
metastasierungs-assoziierte Faktoren: Angiogenese, Zelladhäsion, Invasion, Migration
[http://www.nccr-oncology.ch]
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Zielstellung
Zielstellung
molekulare Faktoren, die mit Ausbildung variierender DFI und verschiedener
Mets-Zahlen assoziiert (Microarray-Analysen)
Untersuchungsmaterial
20 kryokonservierte Lungen-Mets von 18 Patienten mit klarzelligem NZK
homogenes Patientenkollektiv: Nephrektomie, keine anderen Tumoren, nur operative
Therapien (außer 1 Pat.), klin. keine distanten Mets vor Lungen-Mets-Diagnose
Patienten mit frühen (synchronen) Mets sowie Patienten mit multiplen Mets
haben extrem schlechte Prognose
molekulare Ebene: „aggressivere“ Tumorherde (höhere Proliferationsrate, aktivierte
Angiogenese, bessere Fähigkeit zu Anlagerung und Anwachsen in Sekundärorganen)
Hypothese
Zielstellung
Untersuchung pulmonaler Mets (1318nm Nd-YAG-Laser, FKH Coswig)
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Oligonukleotid-Microarrays: Methodik und Auswertung
Material & Methoden
HG-U133 Plus 2.0 (Affymetrix), 47.400 Transkripte (38.500 Gene)
Probenaufarbeitung
Gewebeschnitte RNA cDNA biotinylierte cRNA Fragmentierung
Hybridisierung und Waschen
Scannen
- Detektion via Phycoerythrin-markiertes Streptavidin (750 nm)
- Fluoreszenzsignal Transkriptmenge
25nt-Sonden auf Glasmatrix
Auswertung (Software: RMAExpress)
- globale Background-Korrektur, Quantil-Normalisierung
- Signalberechnung, Logarithmieren (Pseudonormalisierung)
- differenziell exprimierte Transkripte:
Fold Change = MW Gruppe 1 / MW Gruppe 2 ≥ |1,8| (t-Test, FDR<0,05)
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Gruppeneinteilung: frühe vs. späte Metastasen
DFI ≤9 Monate (0-9 Mon., Med=1 Mon.; n=5) vs.
DFI 5 Jahre (60-156 Mon., Med=92,5 Mon; n=6)
306 differenziell expr. Transkripte
(„späte Mets“: 279, 27; 414 Sondensets)
Expressionsunterschiede bei unterschiedlichem DFI I
Ergebnisse: frühe vs. späte Metastasen
DFI 5 years
DFI ≤ 9 months
Visualisierung:
Principal component analysis, heat map (Auszug)
DFI ≤ 9 months
DFI ≥ 5 years
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Biologische Prozesse (Gene Ontology-Analyse)
Motilität / Migration der Zellen
Zelladhäsion
Angiogenese
aktiviert in
„späte Mets“
(z.B. KDR, PDGFB, PDGFA, PDGFRB, ETS1, CD31)
Literaturrecherche
lt. Literatur 73/306 (47%) metastasierungsassoziiert
75% in „späten Mets“ reguliert wie für Tumoren beschrieben
unerwartet, da Patienten mit „frühen Mets“ schlechtere Prognose haben
Biologische Relevanz der differenziell exprimierten Transkripte
Ergebnisse: frühe vs. späte Metastasen
„späte Mets“ weisen höheres metastatisches Potential auf als „frühe Mets“
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306 Gene (414 Sondensets) Vorhersagemodell (k-nearest neighbouring)
Tumorbiologische Ursache?
molekularen Unterschied zwischen synchronen und metachronen Mets
Theorie
Primärtumor bei Mets-Wachstum noch anwesend und somit selbst in der Lage
zur Metastasierung metastatisches Potential der Mets gering
Primärtumor bereits entfernt bei Beginn des Mets-Wachstums
Mets entwickeln von Beginn an höheres Metastasierungspotential
Ergebnisse: frühe vs. späte Metastasen
frühe Mets (DFI ≤ 9 Monate) späte Mets (DFI ≥ 5 Jahre)
1/8 Mets (DFI=15 Monate) 7/8 Mets (DFI=11 - 30 Monate)
8 Mets (DFI = 11 – 30 Monate)
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viele Mets wenige Mets
Expressionsunterschiede bei unterschiedlicher Mets-Anzahl I
135 differenziell exprimierte Transkripte
(„viele MS“: 50, 85; 163 Sondensets)
Visualisierung:
Principal component analysis, heat map
Ergebnisse: viele vs. wenige Metastasen
Gruppeneinteilung: wenige vs. viele Metastasen
≤8 (1-8, Med=3, n=10) vs. 16 (16-80, Med=24, n=7) Lungen-Mets/Pat.
(klinisch: längeres Überleben für ≤9 vs. >9 Mets) [Rolle et al., J Thorac Cardiovasc Surg, 2006]
viele Mets
wenige Mets
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Biologische Relevanz der differenziell exprimierten Transkripte
Ergebnisse: viele vs. wenige Metastasen
Grund für Unterschiede in MS-Anzahl sind möglicherweise
verschiedene Wachstumseigenschaften der Tumorzellen
Biologische Prozesse (Gene Ontology-Analyse)
Zellteilung und Zellzyklus (z.B. PBK, Survivin, PTTG1)
aktiviert in „viele Mets“
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Erstellung von Vorhersagemodellen
Ausgangspunkt:
Sondensets, deren differenzielle Expression mit zwei weiteren mathematischen
Algorithmen validiert (GCOS, dCHIP)
k-nearest neighbouring, weighted voting
Vorhersagemodell zum DFI (11 + 1 Mets)
6-Gen-Signatur: korrekte Leave-1-Out cross validation
richtige Einordnung einer weiteren Proben
Ergebnisse: Vorhersagemodelle
Vorhersagemodell zur Metastasenanzahl (17 + 3 Mets)
11-Gen-Signatur: korrekte Leave-1-Out cross validation
richtige Einordnung dreier weiterer Proben
Expressionsprofile der Mets besitzen prognostisches Potential
11
0,001
0,01
0,1
1
10
1 2
Fold Change=5,5 p=0,004*
(n=6)
(n=5)
0,1
1
10
1 2
0,1
1
10
1 2
späte Mets frühe Metsviele Mets wenige Mets
Fold Change=2,5 p=0,002*
(n=10) (n=19)
Validierung der Microarray-Ergebnisse
Ergebnisse: Validierung
Expression von 6 Genen mittels quantitativer PCR validiert (TBP, CP)
PTTG1 (pituitary tumor-transforming 1) GALNTL2
( Median; * zweiseitiger t-Test basierend auf log2-Daten)
(n=7)(n=10)
Fold Change=2,7 p=0,001*
Übe
rexp
ress
ion
rela
tiv z
u fik
tive
r P
robe
mit
CP
=0
Fold Change=5,1 p=0,001*
(n=11)(n=8)
Array: Fold Change=2,1 p=0,002 Array: Fold Change=3,4 p=0,002
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Zusammenfassung und Ausblick
molekulare Unterschiede verschiedener Mets-Charakteristika:
verschiedene DFI spielgeln sich in unterschiedlichem metastatischen
Potential der Mets wider
verschiedene Mets-Zahlen aufgrund variierendem Wachstumspotentials
Expressionsprofile der Mets besitzen prognostisches Potential
Ausblick
Primärtumoren einbeziehen:
Microarrays, Validierung (qPCR, Immunhistochemie)
prognostisch relevante Gensignaturen Therapieregime anpassen
Zusammenfassung