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Tierärztliche Hochschule Hannover
Die Transplantation autologer Lymphknotenfragmente als
Therapiemöglichkeit des sekundären Lymphödems
Einfluss der VEGF-C-Applikationsparameter auf die Regeneration und den
Wiederanschluss der Transplantate
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades
einer Doktorin der Veterinärmedizin
-Doctor medicinae veterinariae- (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Lia Schindewolffs
Rendsburg
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Gerhard Breves
Physiologisches Institut
Tierärztliche Hochschule Hannover
Univ.-Prof. Dr. Reinhard Pabst
Institut für Immunmorphologie
Medizinische Hochschule Hannover
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Gerhard Breves
Physiologisches Institut
Tierärztliche Hochschule Hannover
Univ.-Prof. Dr. Reinhard Pabst
Institut für Immunmorphologie
Medizinische Hochschule Hannover
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Christiane Pfarrer
Anatomisches Institut
Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 10.10.2012
Meiner Familie und Christoph
Die Ergebnisse dieser Dissertation wurden in Form von Postern auf folgenden
Fachtagungen präsentiert:
17th
IVBM 2012 – International Vascular Biology Meeting, Wiesbaden:
VEGF-C application pattern improves the regeneration of autotransplanted lymph node fragments
and the reconnection with the lymphatic system
Autoren: L. Schindewolffs, M. Büttner, C. Hadamitzky, G. Breves, R. Pabst
38th
ESL 2012 - European Congress of Lymphology in Berlin:
VEGF-C-application and the regeneration and reconnection of autotransplanted lymph node
fragments in rats: the effects of time point, location and dosage
Autoren: L. Schindewolffs, M. Büttner, C. Hadamitzky, G. Breves, R. Pabst
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG ......................................................................................................................... 1
2. LITERATURÜBERSICHT ........................................................................................................ 5
2.1. Aufgaben des Lymphsystems ................................................... ............................................. 5
2.1.1. Immunabwehr .................................................. ................................................... ........ 5
2.1.2. Transport im Fettstoffwechsel .................................................. ................................. 6
2.2. Flüssigkeitshaushalt und anatomischer Aufbau des Lymphsystems ................................. 6
2.3. Anatomischer Aufbau des Lymphknotens .................................................. ......................... 9
2.4. Entstehung des Lymphsystems .................................................. .......................................... 11
2.4.1. VEGF-C und VEGF-R3 .................................................. ...............................................11
2.5. Pathologie .................................................. ................................................... .......................... 12
2.5.1. Das primäre Lymphödem .................................................. ........................................12
2.5.2. Das sekundäre Lymphödem .................................................. ....................................13
2.5.2.1. Filariose .................................................. ................................................... .....13
2.5.2.2. Lymphangitis .................................................. ................................................14
2.5.2.3. Brustkrebstherapie .................................................. ......................................14
2.5.2.4. Folgen eines sekundären Lymphödems .................................................. .....15
2.5.2.5. Konservative Therapie eines sekundären Lymphödems ............................16
2.5.2.6. Chirurgische Therapie eines sekundären Lymphödems .............................16
2.6. Ziel dieser Arbeit .................................................. ................................................... ...............19
3. MATERIAL UND METHODEN ............................................................................................ 20
3.1. Allgemeines .................................................. ................................................... ....................20
3.2. Vorversuch .................................................. ................................................... .........................20
3.3. Tiere .................................................. ................................................... .................................... 20
Inhaltsverzeichnis
3.4. Gruppengröße .................................................. ................................................... . ..................21
3.5. Haltung .................................................. ................................................... ............................... 21
3.6. Präoperative Versorgung .................................................. ................................................... .21
3.7. Chirurgie .................................................. ................................................... ............................. 22
3.7.1. chirurgische Modifikationen .................................................. ...................................22
3.7.2. Operationsabschluss .................................................. ................................................23
3.8. Postoperative Versorgung .................................................. .................................................. 23
3.9. Die Gruppen .................................................. ................................................... .......................24
3.10. Transplantat-Entnahme .................................................. ................................................... ...26
3.11. Makroskopische Untersuchung und Auswertung .................................................. ............26
3.12. Technische Aufbereitung der Proben .................................................. ................................ 27
3.13. Mikroskopische Untersuchung und Färbung .................................................. ....................27
3.13.1. Lichtmikroskopische Untersuchung .................................................. .......................27
2.13.2. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung .................................................. ...........28
3.14. Statistik .................................................. ................................................... .............................. 31
3.14.1. Zeitpunkt .................................................. ................................................... ................32
3.14.2. Lokalisation .................................................. ................................................... ............33
3.14.3. Dosis .................................................. ................................................... .......................34
4. ERGEBNISSE ....................................................................................................................... 35
4.1. Vorversuch .................................................. ................................................... .........................35
4.2. Chirurgische Modifikation .................................................. ................................................... 35
4.3. Makroskopisch .................................................. ................................................... ..................37
4.3.1. Statistik .................................................. ................................................... ..................40
4.3.1.1. Zeitpunkt .................................................. ................................................... ..40
4.3.1.2. Lokalisation .................................................. .................................................41
4.3.1.3. Dosis .................................................. ................................................... .........42
Inhaltsverzeichnis
4.4. Mikroskopisch .................................................. ................................................... . ..................43
4.4.1. Statistik .................................................. ................................................... ..................49
4.4.1.1. Zeitpunkt .................................................. ................................................... ..49
4.4.1.2. Lokalisation .................................................. .................................................50
4.4.1.3. Dosis .................................................. ................................................... .........51
5. DISKUSSION ....................................................................................................................... 52
5.1. Die Modifikation der Methode .................................................. ...........................................53
5.2. Die Parameter: Zeitpunkt, Lokalisation, Dosis .................................................. ..................54
5.2.1. Der Wiederanschluss der Transplantate an das Lymphgefäßsystem .....................55
5.2.1.1. Zeitpunkt .................................................. ................................................... ..55
5.2.1.2. Lokalisation .................................................. .................................................56
5.2.1.3. Dosis .................................................. ................................................... .........57
5.2.2. Die Regeneration der Transplantate ................................................... ......................58
5.2.2.1. Zeitpunkt .................................................. ................................................... ..58
5.2.2.2. Lokalisation .................................................. .................................................58
5.2.2.3. Dosis .................................................. ................................................... .........59
5.2.3. Résumé: Einfluss der Parameter auf die Transplantate ..........................................59
5.3. Aussichten und Diskussion von Material und Methoden .................................................. 60
5.4. Schlussfolgerung .................................................. ................................................... ...............65
6. ZUSAMMENFASSUNG ....................................................................................................... 66
7. SUMMARY ......................................................................................................................... 69
Inhaltsverzeichnis
8. LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................................... 72
9. ANHANG ............................................................................................................................ 80
9.1. Verzeichnis verwendeter Abkürzungen .................................................. .............................80
9.2. Verzeichnis verwendeter Abbildungen .................................................. .............................82
9.3. Verzeichnis verwendeter Tabellen .................................................. .....................................85
9.4. Details zur Statistik .................................................. ................................................... ...........87
9.4.1. Ergebnisse zum Wiederanschluss der Transplantate mit dem Lymphgefäßsystem ... 87
9.4.2. Ergebnisse zur Regeneration der Transplantate .................................................. ....94
10. DANKSAGUNGEN ............................................................................................................ 101
Einleitung
1
1. Einleitung
Das Lymphsystem übernimmt im Körper verschiedene essentielle Aufgaben. Diese bestehen
nicht nur in der Steuerung der Immunabwehr und der Produktion lebenswichtiger
Antikörper (TAMMELA et al. 2010), sondern ebenso aus seiner Beteiligung am
Fettmetabolismus (OHTANI u. OHTANI 2008 A) und der Erhaltung der Homöostase von
Körperflüssigkeiten (TAMMELA et al. 2010).
Wird dieses System gestört, kommt es zu einer pathologischen Akkumulation proteinreicher
Flüssigkeiten im Gewebe, dem Lymphödem. Dieses kann primären oder sekundären
Ursprungs sein.
Primäre Lymphödeme sind angeboren und entstehen z.B. durch genetische Defekte wie bei
der Milroy Disease (BUTLER et al. 2007) oder durch Mutationen von Transkriptionsfaktoren
wie bei dem Hypotrichose-Lymphödem-Teleangiektasie-Syndrom (IRRTHUM et al. 2003). Sie
sind seltener als das sekundäre Lymphödem, das durch äußere Einflüsse und somit erst nach
der Geburt erworben wird.
Weltweit ist die häufigste Ursache für ein sekundäres Lymphödem eine Infektion mit
Fadenwürmern, die Filariose (PFARR et al. 2009). Das Lymphödem manifestiert sich bei
dieser Erkrankung hauptsächlich an den unteren Extremitäten.
In den Industrienationen ist dagegen eine andere Ursache für das sekundäre Lymphödem
vorherrschend: die Krebstherapie (ALITALO et al. 2005). Insbesondere die Therapie von
Brustkrebs kann eine Lymphödementstehung auslösen. Doch auch die Therapie anderer
Krebsarten, wie Zervikal- und Vulvakarzinome, Hautkrebs oder Peniskarzinome können ein
sekundäres Lymphödem verursachen.
Bei der Brustkrebstherapie stehen heutzutage wesentlich differenziertere Methoden als
noch vor einigen Jahren zur Verfügung. Während früher eine komplette Ausräumung der
Achsellymphknoten, die Axilladissektion, oder gar die Abnahme der Brust, die Mastektomie,
als die Therapien der Wahl bei Brustkrebs galten, wird heute zu weniger radikal-invasiven
Mitteln gegriffen, sofern dies das Krankheitsstadium erlaubt. Nach dem Fund von
tumorösem Drüsengewebe wird in der Regel eine Entfernung des Tumors und des
Wächterlymphknotens (engl.: Sentinel Lymph Node, SLN) vorgenommen. Sollten sich in
Einleitung
2
diesem Lymphknoten keine Metastasen befinden, folgt keine weitere chirurgische
Intervention. Zusätzliche Maßnahmen werden erst erforderlich, sollte die histologische
Untersuchung des SLN Metastasen aufweisen. Nach einem solchen Fund werden
anschließend alle axillären Lymphknoten der betroffenen Körperseite entfernt. Allerdings
besteht unabhängig von der Methode, aufgrund der Störung des Lymphgefäßsystems, für
die Patientinnen die Gefahr ein ipsilaterales Lymphödem auszubilden.
Ein Lymphödem birgt für die Patientinnen eine Vielzahl von Risiken und einen
mannigfaltigen Leidensdruck. Diese Probleme können psychischer Natur sein wie Angst vor
der Rückkehr des Krebses, ein negatives Körpergefühl und Frustration (MORGAN et al 2005).
Sie können sich aber auch physisch auswirken. Durch Umbauprozesse des Gewebes bei
einem chronischen Lymphödem (MORGAN et al. 2005) kann es zu einer Verschlechterung
der Hautqualität kommen, wodurch langanhaltende und schlecht heilende Wundinfektionen
auftreten können.
Die derzeitige Lymphödemtherapie ist rein symptomorientiert und besteht aus einer
Kombination von manueller Entstauungstherapie -der Lymphdrainage- und körperlicher
Aktivität wie beispielsweise Schwimmeinheiten, sowie dem Tragen von Bandagen.
Diese Behandlungen können den Patientinnen zwar für kurze Zeit Linderung verschaffen,
bieten aber keine Möglichkeit einer dauerhaften Minderung oder gar Ausheilung des
Ödems.
Nachhaltig wirkungsvolle chirurgische Therapieansätze gibt es momentan keine (MEHRARA
et al. 2011).
In den letzten Jahren haben sich einige Arbeitsgruppen damit beschäftigt, autologe
Lymphknotenfragmente avaskulär, also ohne direkte chirurgische Verbindung der
verbleibenden Blut- und Lymphgefäße an das Lymphknotenfragment, subkutan zu
transplantieren. Dies wurde bereits beim Schaf (TOBBIA et al. 2009), Schwein (PABST u.
ROTHKOTTER 1988, ROTHKOTTER u. PABST 1990, BLUM et al. 2010), der Maus (TAMMELA et
al. 2007) und der Ratte (BLUM et al. 2006, HADAMITZKY et al. 2009, SOMMER et al. 2012 B)
erfolgreich durchgeführt.
Um den Wiederanschluss der Transplantate zu fördern, wurde dabei z.B. das Platelet Rich
Plasma (PRP) nach der Transplantation injiziert. PRP besteht neben Blutplättchen auch aus
einer Reihe von Wachstumsfaktoren, die sich auf die Gefäßneubildung (Angiogenese)
auswirken. Einer dieser Faktoren ist der Vascular Endothelial Growth Factor-C (VEGF-C).
Einleitung
3
TAMMELA et al. (2007) haben im Zusammenhang mit der avaskulären Transplantation
autologer Lymphknotenfragmente einen positiven Effekt des VEGF-C auf das
Lymphgefäßwachstum feststellen können.
Kürzlich haben auch SOMMER et al. (2012 B) ihre Ergebnisse der autologen, avaskulären
Transplantation von Lymphknotenfragmenten in Kombination mit der Injektion von VEGF-C
veröffentlicht. Die Versuche wurden hierbei an weiblichen Lewis Ratten durchgeführt, denen
avaskulär autologe Lymphknotenfragmente in die rechte Leiste transplantiert wurden.
Anschließend wurde den Tieren in der ersten Woche an 3 Tagen intradermal 6,67µg VEGF-C
pro Tier in die unmittelbare Nähe der Transplantate injiziert. Die Tiere bekamen eine
Ruhephase von 4 Wochen bevor die Transplantate entnommen und histologisch sowie
immunhistochemisch untersucht wurden.
Mit dieser Methode wurde ein positiver Einfluss von VEGF-C auf sowohl die
Lymphangiogenese als auch auf die Regeneration der Lymphknotenfragmente gezeigt
(SOMMER et al. 2012 B).
In diesen Experimenten wurde allerdings nicht untersucht, welche Auswirkungen eine
Veränderung der VEGF-C-Applikations-Parameter „Zeitpunkt“, „Lokalisation“ und „Dosis“ auf
die Regeneration und den Wiederanschluss der Transplantate hat.
Primäres Ziel dieser Arbeit war es daher, die Grundlagen und Methoden der Arbeit von
SOMMER et al. (2012 B) aufzugreifen und die VEGF-C-Applikations-Parameter „Zeitpunkt“,
„Lokalisation“ und „Dosis“ auf ihre Einflüsse auf d ie Regeneration und den Wiederanschluss
der Transplantate zu untersuchen.
In Form eines Vorversuches wurde dabei ebenfalls untersucht, ob die Länge der Ruhephase,
die bei SOMMER et al. (2012 B) mit 4 Wochen angegeben ist, Einfluss auf die Regeneration
der Lymphknotenfragmente hat. Eine 8 wöchige Ruhephase wurde erprobt.
In diesem Zusammenhang wurden Probleme durch die von SOMMER et al. (2008 B)
verwendete Technik der Lymphknoten-Fixierung entdeckt, die sich bei der Entnahme der
Lymphknotenfragmente äußerten. Eine Entfernung der Transplantate war in den meisten
Fällen mit Substanzverlusten dieser verbunden, da es in der Ruhephase zu Verwachsungen
der transplantierten Lymphknotenfragmente mit dem Knoten des nicht resorbierbaren
Nahtmaterials kam.
Zunächst bestand das Ziel dieser Arbeit somit darin, die Methodik der avaskulären
Transplantation autologer Lymphknotenfragmente dahingehend zu modifizieren, dass ihre
substanzverlustfreie Entnahme durchgeführt werden kann.
Einleitung
4
Insgesamt sollte so eine möglichst effektive und zuverlässige avaskuläre Transplantation und
Entfernung autologer Lymphknotenfragmente ermöglicht und damit die Regenerations- und
Wiederanschlussraten der Transplantate verbessert werden.
Insbesondere in Hinblick auf eine Prävention des sekundären Lymphödems, wie es z.B. nach
einer Brustkrebstherapie entsteht, könnte eine erfolgreiche Lymphknotentransplantation
dienen.
Literaturübersicht
5
2. Literaturübersicht
2.1. Aufgaben des Lymphsystems
Das Lymphsystem ist an vielen lebenswichtigen Funktionen des Körpers beteiligt.
So spielt es unter anderem im Immunsystem eine zentrale Rolle. Nach dem Eindringen von
Antigenen in den Körper starten zwei Immunmechanismen. Zum einen die unspezifische,
zum anderen die spezifische Immunabwehr. Insbesondere die spezifische Immunabwehr ist
eng mit dem Lymphsystem verbunden; transportiert dieses doch die Immunzellen und stellt
mit seinen Lymphknoten einen essentiellen Part für die Entstehung spezifischer
Abwehrzellen sowie den Austausch dieser untereinander dar.
2.1.1. Immunabwehr
Die Vorgänge der Immunabwehr werden in zahlreichen Übersichten in der Literatur
beschrieben, so u.a. auch von STEINIGER (2008):
Im unspezifischen Teil spielen vor allem die Monozyten, Makrophagen und Granulozyten
eine zentrale Rolle, die durch die Abgabe bakterizider Substanzen und der Phagozytose eine
erste Barriere für eindringende Antigene darstellen. Dieses System startet zwar schnell, stellt
jedoch eine nicht so effiziente Abwehr bei Wiederkontakt wie das spezifische Immunsystem
dar. Zudem gelingt es einigen Erregern sich dieser ersten Abwehr zu entziehen, so dass
spezifischere Mechanismen notwendig werden.
Die Produktion und Sekretion von Immunglobulinen durch Plasmazellen bilden den
humoralen Teil der spezifischen Immunabwehr, während die Aktivierung von T-Lymphozyten
die wesentliche Komponente des zellulären Teils darstellt.
Die B- und T-Lymphozyten tragen Antigenrezeptoren, die immer nur kleine und spezielle
Abschnitte eines Antigens, das sogenannte Epitop, erkennen. Sobald ein B-Lymphozyt
Kontakt mit einem solchen Epitop hatte, ist er aktiviert und wandelt sich zu einer
Plasmazelle um. Diese wiederum produziert Immunglobuline. Neben dem Blutsystem dient
insbesondere das Lymphsystem dazu diese im Körper zu verteilen.
Die Aufgabe von T-Lymphozyten in der zellulären Abwehr besteht darin, nach
Antigenkontakt z.B. Virus-infizierte Zellen zum Absterben zu bringen.
Literaturübersicht
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Eine Sonderstellung in diesem System aus unspezifischer und spezifischer Abwehr nehmen
die dendritischen Zellen (DC) ein. Sie lassen sich zu keiner der beiden Einheiten eindeutig
zuordnen.
Dendritische Zellen sind sehr effektive antigenpräsentierende Zellen, die als einzige in der
Lage sind CD4-positive T-Lymphozyten zu stimulieren und ihnen Antigene zu präsentieren.
Sie werden mit der Lymphe in die regionären Lymphknoten transportiert und verbleiben
dann im Paracortex, einer T-Lymphozyten-reichen Region im Lymphknoten. Hier wandeln sie
sich vermutlich zu interdigitierenden DCs (IDC) um.
Ähnlich benannte, aber dennoch grundverschiedene Zellen sind die ortsständigen und nicht
wandernden follikulär dendritischen Zellen (FDC). Sie sind in den Follikeln von Tonsillen,
Lymphknoten und anderen sekundären lymphatischen Organen beherbergt. FDCs sind
essentiell für wandernde B-Lymphozyten, die in den Keimzentren der Follikel ausreifen und
nur durch den Kontakt mit den FDCs überleben.
Somit stellen die sekundär lymphatischen Organe und das Lymphsystem wichtige Pfeiler für
die Abwehr dar.
2.1.2. Transport im Fettstoffwechsel
Auch im Fettstoffwechsel ist das Lymphsystem als Transportmedium beteiligt. So werden
Lipide und die fettlöslichen Vitamine E, D, K und A nach ihrer Resorption aus dem Darmtrakt
über das Lymphsystem transportiert (OHTANI u. OHTANI 2008 A). Sind die Lipide in die
Lymphe aufgenommen, stellt sich diese milchig dar.
2.2. Flüssigkeitshaushalt und anatomischer Aufbau des Lymphsystems
Nicht nur Fettbestandteile und Immunzellen werden über die Lymphe transportiert, sondern
insbesondere beträchtliche Mengen an Gewebsflüssigkeit.
Bei einem erwachsenen Menschen werden pro Minute durchschnittlich 4-6 Liter Blut durch
das Kapillarsystem gepumpt. Dabei wird das Blut über das arterielle System zu den feinen
Kapillaren transportiert und ein Teil der darin enthaltenen Flüssigkeit gelangt in das
Interstitium (v. RAUTHENFELD u. DRENCKHAHN 2008). Der andere Teil wird von den feinen
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Venulen des Blutsystems aufgenommen und überschüssige Flüssigkeit wird über die Niere
ausgeschieden. Damit schließt sich über das venöse System der Blutkreislauf.
Der im Interstitium verbliebene Teil wird vom Lymphsystem aufgenommen. Einzelheiten
zum Aufbau des Lymphsystems und der Verteilung der Immunzellen wurden von
v. RAUTHENFELD u. DRENCKHAHN (2008) beschrieben und hier im Folgenden
zusammengefasst.
Die in der Regel parallel zu den Venen laufenden Lymphgefäße finden ihren Ursprung in
einem blind beginnenden kleinen Lymphkapillarnetz, dem Rete lymphocapillare.
Das Endothel in diesem Bereich ist, im Gegensatz zu den kontinuierlichen Zellverbindungen
der Blutgefäße, diskontinuierlich. Diese Verbindungen des Lymphendothels werden als
button like junctions bezeichnet (BALUK et al. 2007). Die Lymphendothelzellen überlappen
einander und bilden mäanderförmige Intrazellularspalte. Diese Spalte, im Zusammenhang
mit einer fehlenden Basallamina und einem ausgeklügelten Filamentbündel-System,
ermöglichen die Aufnahme von Gewebsflüssigkeit und deren Bestandteilen, ohne dass bei
erhöhtem interstitiellen Flüssigkeitsdruck die Lymphkapillaren kollabieren.
Der Einstrom von Flüssigkeit in die Kapillaren ist ein durch den Druck bestimmter
Mechanismus. Steigt der Gewebsdruck, wird die Flüssigkeit durch die Spalten der
Lymphendothelzellen hindurchgedrückt. Die Einflussventile klappen dabei nach innen und
bieten dem Einstrom Platz. Sobald der Druck in den Lymphkapillaren den Gewebsdruck
übersteigt werden die Intrazellularspalte durch das Hochdrücken der Einflussventile wieder
verschlossen.
Die aufgenommene Flüssigkeit wird über Präkollektoren weiter transportiert. Im Gegensatz
zu den Kapillaren besitzen die Präkollektoren nun Klappen, die die Lymphe daran hindern
retrograd zu fließen. Die Präkollektoren münden in die größeren Kollektoren, welche nicht
nur die Klappen im Inneren besitzen, sondern außerdem mit einer feinen Muskelschicht aus
glatten Myozyten umhüllt sind.
Ein Abschnitt von Klappe zu Klappe innerhalb der Kollektoren wird als Lymphangiom
bezeichnet. Lymphangiome kontrahieren, induziert durch die Schrittmacherfunktion der
Muskelzellen (Myozyten) (OHTANI u. OHTANI 2008 A).
Während der Transport von Lymphe grundsätzlich durch Körperposition, Atembewegung
und nicht gefäßassoziierter Muskelaktivität gestaltet wird (FOLDI u. FOLDI 2006), bieten die
Myozyten der Kollektoren in Kombination mit den Klappen, die den Lymphrückfluss
verhindern, eine eigene, zusätzliche Komponente zum gerichteten Lymphtransport, der
Lymphpropulsion.
Die Kollektoren unterteilen sich in afferente und efferente Kollektoren. Die afferenten sind
die pränodalen Lymphgefäße, die die Lymphe zu den Lymphknoten hin leiten. Die efferenten
Literaturübersicht
8
leiten die Lymphe von den Lymphknoten weg; sie sind somit postnodal. Zwischen ihnen
liegen die Lymphknoten. Bei zwei nacheinander geschalteten Lymphknoten ist das efferente
Gefäß gleichzeitig das afferent des nachfolgenden Knotens.
Die efferenten Kollektoren leiten die Lymphe weiter in die großen Lymphstämme, die Trunci
lymphatici.
Die Lymphstämme schließen sich ihrerseits zu Lymphgängen (Ductus lymphatici), zu welchen
auch der Milchbrustgang (Ductus thoracicus) gehört, zusammen und münden in den rechten
und linken Venenwinkel.
Der linke Venenwinkel nimmt die Lymphe aus der linken Körperhälfte, den Beinen und aller
Bauchorgane und somit den größeren Teil der Lymphe auf (FOLDI u. FOLDI 2006).
Die Lymphe aus der oberen rechten Körperhälfte und den Organen der rechten Brusthöhle
(zusammen der sogenannte rechte obere Körperquadrant) fließt in den rechten Venenwinkel
und anschließend über das Blutgefäßsystem ab.
Im Ductus thoracicus kommen von den im Interstitium anfallenden Flüssigkeitsmengen nur
ca. 2-3 Liter pro Tag an, denn auf ihrem Weg über das Lymphsystem wird der Lymphe an
verschiedenen Stellen des Lymphsystems Wasser entzogen. Eine Station dafür sind die
initialen Lymphgefäße (Kapillaren und Präkollektoren). Eine andere Station ist der
Lymphknoten. Hier lässt sich feststellen, dass die Osmolarität der Lymphe vor dem Eintritt in
den Lymphknoten geringer ist als nach ihrem Austritt, was zu dem Schluss führt, dass ca.
35% des Wassers und der Elektrolyte aus der afferenten Lymphe im Lymphknoten an das
Blutplasma zurückgegeben werden (OHTANI et al. 2003). Über den genauen
Transportmechanismus und die daran beteiligten Strukturen ist noch vieles unklar (OHTANI
u. OHTANI 2008 B). Da jedoch festgestellt werden konnte, dass der Membrankanal
Aquaporin-1 (AQP-1) vielzählig an Blutgefäßen, initialen Lymphgefäßen und innerhalb des
Lymphknotens an speziellen postkapillären Venulen (HEV) exprimiert wird, geht man von
einer Beteiligung von AQP-1 am Lymph-Plasma-Strom aus (OHTANI et al. 2003).
Der Lymphknoten wird somit sowohl durch seinen Beitrag zum Immunsystem als auch durch
seine Fähigkeiten zur Wasserresorption zum Schlüsselelement des Lymphgefäßsystems.
Literaturübersicht
9
2.3. Anatomischer Aufbau des Lymphknotens
Der anatomische Aufbau des Lymphknotens gliedert sich in verschiedene Segmente. Ein
Segment stellt eine funktionelle Einheit des Lymphknotens dar, wobei ein Lymphknoten aus
nur einem oder vielen Segmenten bestehen kann (WILLARD-MACK 2006). Umhüllt wird der
Lymphknoten durch eine bindegewebige Kapsel, von der aus feine Trennwände, die
Trabekel, in das Innere des Lymphknotens und zwischen die einzelnen Segmente ziehen.
Einzelheiten zum anatomischen Aufbau und die Verteilung der Immunzellen können bei
PABST (2008) nachgelesen werden. Es folgt eine Zusammenfassung.
In den Lymphknoten hinein münden die afferenten Lymphgefäße, die die Lymphe in die
Randsinus leiten. Die lymphatischen Sinus umgeben und durchziehen die einzelnen
Segmente.
Sie werden, je nach Literatur, unterteilt in Randsinus, Intermediärsinus und Marksinus, oder
in subkapsulären, trabekullären, transversen und medullären Sinus (WILLARD-MACK 2006).
Über dieses System wird die Lymphe aus ihren Drainagegebieten in den Lymphknoten
transportiert und optimal verteilt. Einen Abfluss findet die Lymphe über efferente
Lymphgefäße, die wie Vene und Arterie über den Hilus des Lymphknotens in ihn eintreten.
Während viele afferente Lymphgefäße in den Lymphknoten münden, führt in der Regel nur
ein einziges Lymphgefäß vom Lymphknoten weg (WILLARD-MACK 2006).
Ein Segment lässt sich vom Rand zum Hilium in 3 Zonen aufteilen: Cortex, Paracortex und
Medulla.
Lymphozyten sind im Cortex zu Follikeln angesammelt, sogenannten Noduli lymphoidei. Man
kann diese Follikel wiederum in Primär- und Sekundärfollikel unterteilen. Primärfollikel
bestehen nur aus einer Lymphozytenart.
Sekundärfollikel unterteilen sich in eine Corona und ein Keimzentrum. Im Keimzentrum
findet die Differenzierung vom B-Lymphozyten statt.
Follikel sind reich an FDCs und B-Lymphozyten. Dagegen sind T-Lymphozyten hier nur in
geringer Zahl aufzufinden. Diese sind größtenteils in dem Paracortex beheimatet. Hier
können auch die IDCs aufgefunden werden.
Im Bereich der Medulla sind wenige Lymphozyten sowie Plasmazellen, die als Antikörper-
Produzenten dienen, vorhanden.
Der Paracortex beinhaltet neben den zahlreichen T-Lymphozyten noch spezialisierte
postkapilläre Venulen. Diese besitzen bei den meisten Spezies ein kubisches Endothel,
weshalb sie als hochendotheliale Venulen (HEV) bezeichnet werden. Es ist bekannt, dass
Lymphozyten über die HEVs in den Lymphknoten eintreten können (OHTANI u. OHTANI
Literaturübersicht
10
2008), dass sie über diesen Weg auch wieder aus dem Lymphknoten austreten können, ist
bisher nur für das Schwein nachgewiesen (BINNS et al. 1985).
Abbildung 1.: „Schema der Kompartimentierung des Lymphknotens“ PABST (2008):
Die Abbildung stellt die Aufteilung in Cortex, Paracortex und Medulla, den Blut- und Lymphfluss, sowie die
verschiedenen Zellen des Lymphknotens dar.
Literaturübersicht
11
2.4. Entstehung des Lymphsystems
Die Entstehung des Lymphsystems ist ein Prozess, der noch nicht vollends geklärt ist.
ALITALO u. CARMELIET (2002) haben in ihrem Review zu den molekularen Mechanismen der
Lymphangiogenese die wichtigsten Thesen und Tatsachen zusammengefasst.
Es wird beschrieben, dass 1902 Sabin die Theorie begründete, dass aus embryonalen Venen
Endothelzellen knospen und sich daraus ein primitiver Lymphsack bildet. Das periphere
Lymphsystem soll nach seiner Theorie von diesem primären Lymphsack sprießen und sich zu
Lymphkapillaren ausbilden.
Weiterhin wird in dem Review auf heutige genetische Studien verwiesen, die zeigen, dass
sich venöse Endothelzellen, angeregt durch bislang unbekannte Signale, zu lymphatischen
Endothelzellen differenzieren und so Lymphgefäße sprießen.
Außerdem beschreiben sie als eine weitere These die Entstehung des Lymphsackes aus dem
Mesenchym durch Vorläuferzellen, den Lymphangioblasten. Der initiale Lymphsack hat
zunächst keine Gefäßverbindung. Diese entwickelt sich erst im weiteren Verlauf.
ALITALO u. CARMELIET (2002) gehen von einer Kombination dieser beiden Thesen zur
Entstehung des Lymphsystems aus.
Gesichert ist, dass das primitive Blutgefäßsystem aus Vorläuferzellen, den Angioblasten,
entsteht. Der Prozess wird als Vaskulogenese bezeichnet (ALITALO u. CARMELIET 2002). Im
weiteren Verlauf verfeinern und differenzieren sich diese Strukturen zusehends und man
spricht von der Angiogenese (ALITALO u. CARMELIET 2002). Die Entstehung des
Lymphgefäßsystems, die Lymphangiogenese, schließt sich unmittelbar an (ALITALO u.
CARMELIET 2002). Die Wachstumsfaktoren aus der VEGF-Familie spielen bei der Stimulation
und Lenkung der Angiogenese und insbesondere der Lymphangiogenese eine zentrale Rolle
(ALITALO u. CARMELIET 2002).
2.4.1. VEGF-C und VEGF-R3
ALITALO u. CARMELIET (2002) beschreiben weiter, dass der Vascular Endothelial Growth
Factor Rezeptor-3 (VEGFCR-3) zunächst in Blutendothelzellen exprimiert wird und nach
Differenzierung zu Lymphendothelzellen auch an diesen zu finden ist. VEGFCR-3 ist ein
Rezeptor für den Wachstumsfaktor Vascular Endothelial Growth Factor - C (VEGF-C). Dieser
Rezeptor wurde neben Lymphatic Vessel Hyaluronan Receptor - 1 (LYVE-1) und Prospero-
Related Homeobox Transcprition Factor - 1 (Prox-1) in der Arbeit von TAMMELA u. ALITALO
von 2010 an allen sich entwickelnden Lymphgefäßen detektiert. Im ausgereiften Zustand
Literaturübersicht
12
werden diese Rezeptoren an den einzelnen Lymphgefäßabschnitten jedoch unterschiedlich
stark exprimiert (TAMMELA u. ALITALO 2010).
VEGF-C und VEGFCR-3 sind also immer dort zu finden, wo neue Lymphgefäße sprießen,
sowohl im Embryo als auch bei Regenerationen während eines Krankheitsprozesses
(ALITALO u. CARMELIET 2002). VEGF-C fungiert dabei als Stimulator für das Wachstum, die
Migration und das Überleben von Lymphendothelzellen (ALITALO u. CARMELIET 2002). Auf
die Stimulation von VEGF-C auf die Lymphangiogenese wird in weiteren Übersichten in der
Literatur verwiesen. In dem Review von LOHELA et al. (2003) wird die Bedeutung von VEGF-C
für die Lymphangiogenese deutlich. Auch NORRMEN et al. (2011) beschreiben kürzlich, dass
VEGF-C der einzige Wachstumsfaktor ist, der spezifisch auf die Entwicklung von
Lymphgefäßen gerichtet ist. Wie fatal das Fehlen von VEGF-C ist, führen ALITALO et al.
(2005) in einem weiteren Review aus. Hier wird beschrieben, dass das Fehlen von VEGF-C in
Mäuse-Embryonen zu einer kompletten Abwesenheit von Lymphgefäßen führt.
2.5. Pathologie
Wird die Integrität des Lymphsystem gestört, hat dies weitreichende Folgen für den
Organismus, insbesondere bezogen auf den Flüssigkeitshaushalt. Es bildet sich ein
Lymphödem aus. Diese pathologische Akkumulation von Gewebswasser resultiert aus einem
gestörten Gleichgewicht zwischen lymphatischen Lasten und der lymphatischen
Transportkapazität (ROCKSON 2010).
Störungen können primärer oder sekundärer Natur sein. Ihre Einteilung erfolgt daher auch in
„primäres Lymphödem“ und „sekundäres Lymphödem“.
2.5.1. Das primäre Lymphödem
Insbesondere kongenital hereditäre Erkrankungen, wie beispielsweise die Krankheit Milroy
Disease oder das Hypotrichose-Lymphödem-Teleangiektasie-Syndrom, führen zu einem
primären Lymphödem.
Milroy Disease ist eine autosomal dominant vererbbare Krankheit, die zu einem primären
Lymphödem insbesondere in den Beinen führt (BUTLER et al. 2007). Sie kann bereits bei der
Geburt ausgebildet sein oder nach 2 Lebensjahren in Erscheinung treten (WARREN et al.
Literaturübersicht
13
2007). Ursache für die Krankheit ist eine Mutation des Gens „flt 4“. Dieses kodiert für den
VEGF-Rezeptor-3 (RADHAKRISHNAN u. ROCKSON 2008). Defekte dieses Rezeptors führen zu
einer fehlerhaften Entwicklung oder gar einer Aplasie der peripheren Lymphkanäle
(RADHAKRISHNAN u. ROCKSON 2008).
Beim Hypotrichose-Lymphödem-Teleangiektasie-Syndrom steht als Auslöser eine Mutation
des Transkriptionsfaktor-Gens SOX18 in Verdacht (IRRTHUM et al. 2003). Auch bei dieser
Erkrankung ist ein Lymphödem insbesondere in den Beinen zu beobachten (IRRTHUM et al.
2003).
Primäre Lymphödeme sind sehr selten. Deutlich häufiger treten sekundäre Lymphödem auf.
Sie entstehen immer dann, wenn durch äußere Einflüsse das Lymphsystem gestört wird.
2.5.2. Das sekundäre Lymphödem
An der Spitze der Ursachen eines sekundären Lymphödems steht eine Infektion mit
Parasiten. Weltweit waren 2009 schätzungsweise 120 Millionen Menschen mit
Fadenwürmern infiziert (PFARR et al. 2009).
2.5.2.1. Filariose
Die sogenannte Filariose ist die häufigste Erkrankung nach Malaria und Tuberkulose
(RADHAKRISHNAN u. ROCKSON 2008) und somit ein beträchtliches Problem auf der Welt. In
der Regel findet eine Infektion mit den Nematoden (Fadenwürmern) „Wuchereria
bancrofti“, „Brugia malayi“ und „Brugia timori“ statt (PFARR et al. 2009). Nach ihrer Invasion
in den Körper, gelangen diese in das Lymphgefäßsystem. Es entstehen Granulome um die
Würmer, was zu einer retrograden Lymphangitis und Lymphadenitis führt (PFARR et al.
2009). Es schließt sich eine Dilatation der Gefäße an, die in einer verminderten Effektivität
des Lymphtransportes resultiert (PFARR et al. 2009). Ein Lymphödem ist eine typische
klinische Präsentation der Infektion (RADHAKRISHNAN u. ROCKSON 2008).
Literaturübersicht
14
2.5.2.2. Lymphangitis
Auch eine Lymphangitis kann zu einem sekundären Lymphödem führen. Sie wird verursacht
durch eine Entzündung von Lymphgefäßen während einer Infektion mit beispielsweise
Bakterien, Viren oder Pilzen (RADHAKRISHNAN u. ROCKSON 2008).
2.5.2.3. Brustkrebstherapie
Auch wenn die Filariose die weltweit häufigste Ursache eines sekundären Lymphödems ist,
so ist sich in den Industrienationen eine ganz andere vorherrschend: die Brustkrebstherapie
(ALITALO et al. 2005).
Auch andere sekundäre Faktoren, wie Unfälle, bei denen die Lymphknoten geschädigt
werden, oder auch weitere Krebsarten wie Vulva-, Zervix- oder Peniskarzinome so wie
Hautkrebs können zu sekundären Lymphödemen führen.
Insbesondere wird im Folgenden aber auf die Brustkrebstherapie eingegangen, da
Brustkrebs die häufigste Krebserkrankung der Frau ist.
Die geschätzten jährlichen Brustkrebsneuerkrankungen lagen 2009 in den USA bei 27%
(JEMAL et al. 2009) aller bösartigen Tumoren und führten die Liste der
Krebsneuerkrankungen bei Frauen an.
Die Problematik des Brustkrebses liegt in der Metastasierung. Einzelne Zellen lösen sich vom
Tumor ab und wandern über afferente Lymphgefäße in den drainierenden Lymphknoten.
Sind regionäre Lymphknoten in der Achsel betroffen, müssen diese entfernt werden. Das
chirurgische Entfernen von Lymphknoten führt zu einem Trauma des Lymphgefäßsystems
und damit zu einem gestörten Transport von Gewebswasser. Das Resultat kann ein
sekundäres Lymphödem im ipsilateralen Arm sein. Die Inzidenz eines Armlymphödems nach
Brustkrebstherapie liegt bei bis zu 30% (WILLIAMS et al. 2005).
Die Rate für Lymphödeme nach einer kompletten Ausräumung der Achsel in Kombination
mit einer Entfernung der Brust (Mastektomie) liegt zwischen 24% und 49% (WARREN et al.
2007).
Auch bei anderen Krebsarten, wie beispielsweise Vulva- oder Zervixkarzinomen, müssen bei
Befall regionäre Lymphknoten ausgeräumt werden. Die Entfernung der inguinalen
Lymphknoten kann ebenfalls zu einem Lymphödem führen. Die Inzidenz liegt hierbei nach
einigen Studien sogar bei 40% (WILLIAMS et al. 2005).
Literaturübersicht
15
Die Behandlung von Brustkrebs hat sich im Laufe der Zeit gewandelt. Hat man früher oft
direkt nach Brustkrebserkennung eine Mastektomie vollzogen, so ist man im Laufe der Zeit
dazu übergegangen, den Tumor und die regionalen Lymphknoten auszuräumen und das
restliche Brustgewebe zu erhalten.
Heutzutage bedient man sich einer Methode, bei der nach Tumordiagnose und unter der
Entfernung des Tumorgewebes eine Sentinel Lymph Node (SLN, Wächterlymphknoten)
Biopsy durchgeführt wird.
Der Wächterlymphknoten ist der erste Lymphknoten, der das Tumorgebiet drainiert. Er wird
unter einer SLN Biopsie entnommen und auf Metastasen untersucht. Sollten histologisch
keine Metastasen auffindbar sein, wird nicht weiter interveniert (GIULIANO et al. 2011). Sind
Metastasen vorhanden, müssen regionäre Lymphknoten entfernt werden (GIULIANO et al.
2011). Man erhofft sich durch die Methode eine minimale Morbidität (GOLDBERG et al.
2011). Trotz verbesserter Inzidenz für ein Lymphödem, erkranken allerdings auch unter der
Methode der SLN Biopsie weiterhin bis zu 22% (GOLDBERG et al. 2011). Die meisten Quellen
geben eine Inzidenz von 3-7% an (GOLDBERG et al. 2011).
Bei einer lokalen Bestrahlung des Gewebes, wie es häufig zusätzlich notwendig ist, steigt die
Inzidenz noch weiter.
2.5.2.4. Folgen eines sekundären Lymphödems
Die Folgen eines sekundären Lymphödems sind für die betroffenen Frauen weitreichend. Sie
äußern sich in psychischen Beschwerden wie ein negatives Körpergefühl, das Gefühl der
Isolation, Traurigkeit, Hilflosigkeit und Ängsten (MORGAN et al. 2005), aber auch in
physischem Leiden wie Schmerzen (MORGAN et al. 2005). Die Mobilität der Gliedmaße wird
zudem eingeschränkt, so dass alltägliche Arbeiten zum Teil nicht mehr möglich werden
(MORGAN et al. 2005). Die Schwellung hat weiter zur Folge, dass die Hautqualität
verschlechtert wird (MORGAN et al. 2005) und dadurch schlecht heilende Infektionen mit
Bakterien und Pilzen möglich werden.
In besonders schlimmen, aber seltenen, Fällen kann ein chronisches Lymphödem zu einer
Ausbildung des Stewart-Treves-Syndroms (STS) führen. Das STS ist ein aggressives
Lymphangiosarkom der oberen Extremitäten (CHUNG et al. 2000). Die Überlebenszeit der
Patientinnen nach Diagnose eines STS liegt zwischen nur 8 und 15 Monaten (CHUNG et al.
2000).
Literaturübersicht
16
2.5.2.5. Konservative Therapie eines sekundären Lymphödems
Die Therapie von sekundären Lymphödemen erfolgt nahezu ausschließlich
symptomorientiert. Sie basiert hauptsächlich auf einer Kompression des Ödemgebietes von
peripher nach zentral. So werden unter anderem viellagige unelastische Bandagen benutzt,
welche um die Gliedmaße gewickelt werden oder es wird eine kontrollierte
Kompressionstherapie verfolgt, in der die Größe der Kompressionsstrümpfe nach und nach
reduziert wird (WARREN et al. 2007). Auch eine entstauende manuelle Lymphdrainage wird
in Verbindung mit Hauthygiene und körperlicher Aktivität durchgeführt (WARREN et al.
2007). Diese Art der Therapie führt zu einer Volumenabnahme der betroffenen Gliedmaße
zwischen 40 und 60% (WARREN et al. 2007). Allerdings müssen diese Therapiemaßnahmen
ein Leben lang und zum Teil mehrmals pro Woche durchgeführt werden. Dies bedeutet für
die Patientinnen einen kaum zu bewältigenden Aufwand.
2.5.2.6. Chirurgische Therapie eines sekundären Lymphödems
Eine adäquate chirurgische Therapie für das sekundäre Lymphödem fehlt bisher (MEHRARA
et al. 2011).
Aus dieser Problematik heraus wurden in der Vergangenheit viele unterschiedliche
Methoden untersucht.
In der Arbeit von MEHRARA et al. (2011) wurde kürzlich eine Übersicht verschiedener
chirurgischer Therapieansätze dargestellt. Hier wurden die Methoden in reduktive und
physiologische Methoden eingeteilt.
Zu den reduktiven Methoden zählen die direkte Exzision und die Liposuktion. Bei der
direkten Exzision wird das ödematöse Gewebe großzügig chirurgisch entfernt und eine
Verbindung des oberflächlichen Lymphsystems mit dem tiefen geschaffen. Die Ergebnisse
sind nicht dokumentiert. Eine Problematik der Wundheilung sowie Infektionen und
Schmerzen werden vermutet.
Die Liposuktion ist das Absaugen von Fettgewebe. Durch den reduzierten Umfang der
betroffenen Gliedmaße empfinden die meisten Patientinnen nach diesem Eingriff zunächst
eine Linderung der Symptome. Die Re-Akkumulation von Gewebsflüssigkeit findet jedoch
sehr schnell statt.
Zu den physiologischen Methoden zählt z.B. der lymphatische Bypass. Beim lymphatisch-
lymphatischen Bypass werden die beschädigten Lymphgefäße mit gesunden Lymphgefäßen
einer anderen Körperregion chirurgisch verbunden. Beim lymphatikovenösen Bypass wird
ein Lymphgefäß mit einer oberflächlichen Vene verbunden. Die Ergebnisse einer
Literaturübersicht
17
lymphatischen Bypass-Operation waren bisher sehr unstet und variierten zwischen keiner
Verbesserung des Lymphödems bis hin zu einer moderaten Reduktion.
Auch eine Flap interposition, also eine Eingliederung eines Gewebssegmentes mit intakter
Vaskularisation, wird beschrieben. Es wird hierbei ein Teil eines gesunden, subkutanen
Gewebes chirurgisch entfernt und in eine geschädigte Körperregion transplantiert. Diese
Prozedur wird aufgrund ihrer schlechten Ergebnisse nur noch sehr selten durchgeführt.
Als eine weitere physiologische Methode führen MEHRARA et al. (2011) die
Lymphknotentransplantation auf.
Die Basis der Lymphknotentransplantation ist das chirurgische Entfernen eines intakten
Lymphknotens aus einer gesunden Körperregion und sein anschließendes Verbringen in das
geschädigte Areal.
Aktueller Bestandteil der Forschung ist die avaskuläre Transplantation von
Lymphknotenfragmenten.
Bereits am Schaf (TOBBIA et al. 2009), Schwein (PABST u. ROTHKOTTER 1988, ROTHKOTTER
u. PABST 1990, BLUM et al. 2010), an der Maus (TAMMELA et al. 2007) und an der Ratte
(BLUM et al. 2006, HADAMITZKY et al. 2009, SOMMER et al. 2012 B) wurde gezeigt, dass
diese Methode möglich ist.
Neben der alleinigen Transplantation von Lymphknotenfragmenten kam bei HADAMITZKY et
al. (2008) die Gabe von Platelet Rich Plasma (PRP) zur Anwendung. PRP ist Plasma mit vielen
Blutplättchen, welches durch ein mehrschrittiges Verfahren aus dem Blut gewonnen wurde.
Es enthält Wachstumsfaktoren wie transforming growth factor – beta, platelet-derived
epidermal growth factor und die vaskulär endothelialen Wachstumsfaktoren C und D. Das
PRP wurde den Tieren in das Drainagegebiet der Transplantate injiziert. Es konnte ein
positiver Effekt auf die Regeneration der transplantierten Lymphknotenfragmente gezeigt
werden.
In der Praxis gestaltet sich die Herstellung von PRP als sehr aufwendig und könnte im
Zusammenhang mit einer klinischen Verwendung nur in bestimmten dafür ausgestatteten
medizinischen Stätten durchgeführt werden.
Eine andere Methode ist es, direkt einen bei der Lymphangiogenese beteiligten vaskulär
endothelialen Wachstumsfaktor zu verwenden. TAMMELA et al. (2001) haben dahingehend
Versuche an Mäusen durchgeführt. Die Ergebnisse der Studie haben gezeigt, dass sich eine
Therapie mit Wachstumsfaktoren positiv auf die Regeneration von Lymphgefäßen auswirkt.
Um eine Therapiemöglichkeit für das Lymphödem zu ergründen, muss ein adäquates
Tiermodell geschaffen werden, das die Konditionen unter einer Lymphknotenentfernung
widerspiegelt und zu einer Ödembildung führt. Die Notwendigkeit eines geeigneten Modells
Literaturübersicht
18
haben HADAMITZKY et al. (2008) zusammengefasst. Zwar gibt es bereits Modelle für Hunde
(CHEN et al. 1989) und Kaninchen (CASLEY-SMITH et al. 1977), sowie Großtiermodelle für
Schafe (TOBBIA et al. 2009); ein Tier-Modell für die Ratte fehlte bislang jedoch gänzlich.
SOMMER et al. (2012 A) haben nun ihre Erfolge bei der Findung eines solchen Modells
veröffentlicht.
Auf der Basis dieses Tiermodells wurde die avaskuläre Transplantation autologer
Lymphknotenfragmente in Kombination mit der Gabe von VEGF-C durchgeführt (SOMMER et
al. 2012 B).
Es erfolgte nach der Entfernung der Lymphknoten aus der rechten Leiste eine Bestrahlung
des Gebietes. Anschließend wurde eine avaskuläre Transplantation von autologen
Lymphknotenfragmenten aus der linken in die rechte Leiste vorgenommen. Jedes der Tiere
erhielt 6,67 µg VEGF-C an den postoperativen Tagen 1, 2 und 5. Ein positiver Effekt der
Verwendung von VEGF-C auf die Lymphknotenregeneration und den Wiederanschluss an das
Lymphgefäßsystem im Drainagegebiet konnte nachgewiesen werden (SOMMER et al.
2012 B).
Literaturübersicht
19
2.6. Ziel dieser Arbeit
Die Durchführbarkeit einer avaskulären autologen Lymphknotentransplantation wurde
durch die oben genannten Arbeiten bestätigt. Die Gabe von VEGF-C hat sich dabei als positiv
herausgestellt.
Parameter, wie Dosis, Zeitpunkt und Lokalisation der VEGF-C Applikation sind jedoch bislang
noch nicht untersucht worden.
Ziel dieser Arbeit war es, auf der Basis des etablierten Tiermodells von SOMMER et al.
(2012 B) ein Applikationsschema mit Fokus auf Dosis, Zeitpunkt und Lokalisation, für VEGF-C
zu entwickeln um verbesserte Raten im Bereich der Lymphknotenregeneration, sowie des
Wiederanschlusses des Lymphgefäßsystems zu erzielen.
Eine erfolgreiche Lymphknotentransplantation würde vor allem der Prävention von
sekundären Lymphödemen z.B. nach Brustkrebsbehandlung dienen.
Material und Methoden
20
3. Material und Methoden
3.1. Allgemeines
Alle folgenden Untersuchungen und Versuchstechniken wurden dem Niedersächsischen
Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES, Sitz Oldenburg) unter
der Antragsnummer 33.94502-04-07/1420 angezeigt und von diesem genehmigt.
3.2. Vorversuch
Der Vorversuch wurde mit 7 Ratten durchgeführt. Informationen zu den Tieren, der Haltung,
prä- und postoperativen Versorgung sowie der Chirurgie und anschließenden Methode zur
Aufbereitung der Proben sowie den Auswertungskriterien können aus den Kapiteln 3.3.-
3.13.1. entnommen werden. Die Tiere wurden wie die Kontrollgruppe (Gruppe E) behandelt
und bekamen daher kein VEGF-C. Außerdem unterschied sich die Vorversuchsgruppe durch
eine achtwöchige Ruhephase von der Kontrollgruppe (4 Wochen Ruhephase) und ihre
Proben wurden ausschließlich lichtmikroskopisch untersucht.
3.3. Tiere
Für die Versuchsreihen wurden insgesamt 90 junge, erwachsene und gesunde weibliche
Lewis Ratten von Charles River (Sulzfeld, Deutschland) verwendet.
Jedes Tier wog im Schnitt 200g und hatte somit ein Alter von 8 bis 12 Wochen erreicht.
Material und Methoden
21
3.4. Gruppengröße
Die Tiere wurden in 5 Gruppen eingeteilt. Gruppe A bestand aus 10 Tieren und die
Gruppen B bis E aus je 20 Tieren. In Gruppe B wurde eine Ratte wegen des andauernden und
hochgradigen autoaggressiven Verhaltens nach Verletzung der distalen und medialen
Phalanx des 3. Digitus der linken Vorderpfote frühzeitig aus dem Versuch genommen. Sie
wurde mittels zervikaler Dislokation getötet. Die Gruppe B dezimierte sich somit auf 19
Tiere.
3.5. Haltung
Die Tiere wurden nach ihrer Ankunft zu fünft in Spezifiziert Pathogen Frei – Haltung
(SPF-Haltung) im Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover untergebracht
und mit standardisiertem Total Pathogen Frei – Futter (TPF-Futter) und Osmose Filter
gereinigtem Wasser ad libitum versorgt. Sie wurden in 4S-Käfigen (Höhe 21cm, Grundfläche
1370 cm2) gehalten. Die Hell-Dunkel-Phasen waren so eingestellt, dass in den Räumen
14 Stunden Helligkeit und 10 Stunden Dunkelheit herrschte.
Alle Ratten erhielten vor Versuchsbeginn eine einwöchige Eingewöhnungszeit um den Stress
für die Tiergruppen zu minimieren.
3.6. Präoperative Versorgung
Am Operationstag wurde jedem Tier mindestens 30 Minuten und maximal 1,5 Stunden vor
dem Eingriff eine Dosis von 5mg/kg Carprofen (Rimadyl, Pfizer GmbH, Berlin, Deutschland)
subkutan injiziert.
Die Tiere wurden vom Operationsgeschehen mit einem Tuch über dem Käfig abgeschirmt
und so weit wie möglich vom OP-Tisch entfernt untergebracht. Dies diente dazu möglichst
standardisierte Bedingungen für das Einzeltier zu schaffen und Stress und Aufregung
möglichst gering zu halten.
Material und Methoden
22
3.7. Chirurgie
Die Operation erfolgte im Prinzip wie in der Veröffentlichung von SOMMER et al. (2012 B)
beschrieben.
Alle 89 Ratten wurden zur Narkoseeinleitung in eine mit 4-5%igem Isofluran (Isofluran
Baxter, Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Deutschland) geflutete Kammer
verbracht. Nach Rasur der rechten Leisten- und Kniekehlregion wurde die Inhalationsnarkose
über eine Maske bei 1,5-2,5%igem Isofluran aufrechterhalten.
Das Einzeltier wurde zunächst in Bauchlage gelagert. Anschließend wurde die OP Region in
der Kniekehle mit Softasept Spray (Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland)
desinfiziert. Es folgte ein ca. 1cm kurzer Hautschnitt in der Fossa poplitea und die
Freipräparation der Muskulatur. Zwischen den Muskelsträngen wurden die
Kniekehllymphknoten, die Lymphonodi poplitei, aufgesucht und stumpf entfernt. Die
Entfernung diente dazu, die Möglichkeit einer Übernahme der Drainage durch die
Kniekehllymphknoten zu verhindern und zu gewährleisten, dass ausschließlich afferente und
damit unfiltrierte Lymphe im Bereich der Transplantation ankommt. Nach Stillung
eventueller Blutungen wurde der Hautschnitt subkutan mit resorbierbarem Nahtmaterial
(Marlin violett, Catgut GmbH, Markneukirchen, Germany) der Stärke 5-0 verschlossen.
Zusätzlich wurden, ebenfalls mit dem resorbierbaren Nahtmaterial der Stärke 5-0,
Einzelhautnähte zum Verschluss der Wunde verwendet.
Anschließend wurde die Ratte in Rückenlage gelagert und es wurde nach einer
Hautdesinfektion mit Softasept Spray ein knapp 1cm kurzer Hautschnitt in der rechten
Leistengegend vollzogen. Nach Freipräparation des subkutanen Fettgewebes wurden die
Leistenlymphknoten, die Lymphonodi inguinales, aufgesucht und stumpf entfernt.
Drei der Lymphknoten wurden von verbleibendem Fettgewebe und Lymphgefäßresten
befreit und jeweils einer der Pole wurde entfernt (BLUM et al. 2010 u. SOMMER et al.
2012 B). Es folgte eine Modifikation zu der Methode von SOMMER et al. (2012 B) (Kapitel
3.7.1.).
3.7.1. chirurgische Modifikationen
Nach der Polentfernung, schloss sich nun eine modifizierte Variante zu der von SOMMER et
al. (2012 B) verwandten Technik an. Im Gegensatz zu einer einfachen Schlinge aus nicht
resorbierbarem Nahtmaterial, auf die die Transplantate aufgefädelt wurden und die an dem
subkutanen Fettgewebe befestigt wurde, wurde hier mit nicht resorbierbarem Nahtmaterial
(Prolene, Ethicon GmbH, Norderstedt, Germany) der Stärke 5-0 ein Teil des subkutanen
Material und Methoden
23
Fettgewebes zunächst nur einmal durchstochen. Anschließend wurden die drei
fragmentierten Lymphknoten aufgefädelt, das Fettgewebe erneut durchstochen und das
Nahtmaterial somit auf der gegenüberliegenden Seite der Transplantate verknotet. Dies
diente dazu, die Transplantate vor mechanischen Einflüssen des Knotens zu schonen.
Verschlossen wurde das Transplantationsgebiet subkutan mit resorbierbarem Nahtmaterial
und zusätzlichen Hautnähten.
3.7.2. Operationsabschluss
Das Wundareal wurde sowohl in der Kniekehle als auch in der Leiste mit Aluminium Spray
(MeproVet, Mepro Dr. Jäger&Bergmann GmbH, Vechta Deutschland) versorgt und die Tiere
wachten unter meiner tierärztlichen Beobachtung in einem separaten Käfig mit einer
Wärmequelle (Rotlichtlampe) auf. Das Erwachen dauerte je nach Individuum etwa
2-5 Minuten.
Im Anschluss an die Operation und nach vollständigem Erwachen (ca. 30 Minuten) aus der
Narkose wurden die Tiere wieder in ihre ursprünglichen Gruppen zurückgeführt.
3.8. Postoperative Versorgung
An den darauf folgenden 3 Tagen erhielten alle Tiere unabhängig von ihrer
Gruppenzugehörigkeit subkutan eine Analgesie (5mg/kg Rimadyl, Pfizer GmbH, Berlin,
Deutschland) zur Linderung des postoperativen Schmerzes und es erfolgte eine regelmäßige
Visite der Tiere durch mich über die komplette Versuchslaufzeit.
Material und Methoden
24
3.9. Die Gruppen
Für die Versuchsgruppen wurde VEGF-C (VEGF-C rr, ReliaTech GmbH, Wolfenbüttel,
Deutschland) in sterilem Phosphate Buffered Saline (PBS) gelöst. Für eine Ampulle à 100µg
VEGF-C wurden 1700µl steriles PBS verwendet.
In Gruppe A (n=10) erhielt jedes Tiere eine Dosis von 6,67µg VEGF-C (120µg der VEGF-C/PBS-
Lösung) intradermal in die Bauchwand der rechten Körperhälfte in die unmittelbare Nähe
des Transplantationsgebietes an den postoperativen Tagen 1, 2 und 3 (Abb.2.).
Die Tiere aus Gruppe B (n=19) erhielten die gleiche Dosis VEGF-C und zum gleichen Zeitpunkt
wie Gruppe A; einziger Unterschied war die Lokalisation. Die Injektion erfolgte intradermal in
die mediale Seite des rechten Oberschenkels (Abb.2.).
Den Ratten aus Gruppe C (n=20) wurde die gleiche Dosis VEGF-C an der gleichen Lokalisation
wie in Gruppe B intradermal injiziert, doch die Injektion erfolgte zu einem anderen
Zeitpunkt, nämlich an den Tagen 14, 15 und 16 post OP (Abb.2.).
Die Injektionsparameter „ Zeitpunkt“ und „Lokalisation“ in Gruppe D (n=20) waren die
gleichen wie in Gruppe B. Die Dosis und damit auch die Injektionsmenge der
VEGF-C/PBS-Lösung war in Gruppe D verdoppelt worden. Jedes Tier erhielt in dieser Gruppe
eine Dosis von 13,34µg VEGF-C (Abb.2.) und damit ein Injektionsvolumen von 240µl der
Lösung.
Hinweis: Im Verlauf der Färbeverfahren konnten aus technischen Gründen die Proben eines
Tieres aus dieser Gruppe wohl lichtmikroskopisch, jedoch nicht weiter immunhistochemisch
untersucht werden. Das Tier wurde in dem immunhistochemischen Teil der Auswertung
nicht berücksichtigt, so dass sich hierbei die Anzahl der Gruppe auf n=19 reduzierte.
Die Gruppe E (n=20) diente als Kontrollgruppe und wurde neben der, für alle Versuchstiere
gleichen, Analgesie-Verabreichung und der regelmäßigen Visite keiner weiteren Intervention
unterzogen (Abb.2.).
Die Gruppen A-C und die Gruppe E wurden verblindet ausgewertet. Die Verblindung, bei der
die Tiere randomisierte Nummern zugeteilt bekamen, diente dazu, möglichst
unvoreingenommene Bedingungen für die Auswertung zu schaffen.
Material und Methoden
25
Abbildung 2.: Übersicht über die Versuchsgruppen.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Gruppe An = 10
Gruppe Bn = 19
Gruppe Cn = 20
Gruppe Dn = 20
Gruppe En = 20
Tage
Gruppenübersicht
Ruhephase
Applikation Bauchwand,6,67µg VEGF-C
Applikation Oberschenkelmedial, 6,67µg VEGF-C
Applikation Oberschenkelmedial, 13,34µg VEGF-C
Material und Methoden
26
3.10. Transplantat-Entnahme
Nach einer Versuchslaufzeit (inkl. Ruhephase, siehe Abb. 2.) von insgesamt 4 Wochen wurde
allen Tieren eine Injektionsnarkose, bestehend aus 90mg/kg Ketamin (Ketamin Gräub,
Albrecht GmbH, Aulendorf, Deutschland) und 10mg/kg Xylazin (Rompun, Bayer Health Care,
Leverkusen, Deutschland), intraperitoneal verabreicht.
Nach Eintritt der Narkosewirkung wurde der Farbstoff Patent Blau (Patentblau V, Gerbet
GmbH, Sulzbach, Deutschland) intradermal in die mediale Seite des rechten Oberschenkels
injiziert.
Der Abfluss des Patentblaus wurde durch das Beugen und Strecken der rechten
Hintergliedmaße im Zeitraum von 1-2 Minuten angeregt. Im Anschluss an diese Prozedur
wurden die Ratten mittels zervikaler Dislokation getötet.
Um eine Übersicht über die Verteilung der Lymphgefäße und einer eventuellen Färbung der
Transplantate und damit die Bestätigung eines Wiederanschlusses an das
Lymphgefäßsystem zu erhalten, wurde die Haut großflächig von der Oberschenkelinnenseite
bis hinauf an das Sternum von der Bauchwand abpräpariert und makroskopisch inspiziert.
3.11. Makroskopische Untersuchung und Auswertung
Die makroskopische Untersuchung des Transplantationsgebietes diente zur Beurteilung des
Wiederanschlusses der Lymphgefäße an das Transplantat und damit der Integrität des
Lymphgefäßsystems.
Die Verwendung des nicht resorbierbaren Nahtmaterials zur Fixierung der Transplantate
unter der Operation, sollte nicht nur eine mögliche Migration der Transplantate verhindern;
es sollte auch die Transplantate markieren.
Die Identifikation der Transplantate wurde also durch das nicht resorbierbare Nahtmaterial
vereinfacht.
Durch die Verteilung des Patentblaus über die Lymphgefäße des superfiziellen Systems
wurden die Lymphgefäße identifiziert und bei Färbung des Transplantates der
Wiederanschluss an das Lymphgefäßsystems als erfolgreich bewertet.
Alle Tiere mit einem Transplantat-Wiederanschluss wurden in „Ratte mit Transplantat-
Wiederanschluss“ eingeordnet.
Material und Methoden
27
Anschließend fand eine großzügige Exzision der Transplantate statt. Diese wurden von
Fettgewebe und anhängenden Lymphgefäßen befreit und umgehend in flüssigem Stickstoff
gefroren. Die Lagerung der Proben erfolgte bei -80°C.
3.12. Technische Aufbereitung der Proben
Nach dem Gefrieren der Proben wurden diese unter Verwendung eines Leica CM3050S
Kryostats (Leica Mikrosysteme Vertrieb GmbH, Wetzlar, Deutschland) geschnitten. Dazu
wurden die Proben in der Kryostat-eigenen Kammer, die auf eine konstante Temperatur von
-20°C eingestellt wurde, mit Tissue Tek (Sakura Finetek Europe B.V., Zoeterwoude,
Niederlande) aufgeblockt und in dieser Kammer geschnitten. Für die mikroskopische
Untersuchung wurden von allen entnommenen Proben 5µm dünne Schnitte angefertigt.
3.13. Mikroskopische Untersuchung und Färbung
3.13.1. Lichtmikroskopische Untersuchung
Von jeder Probe wurden in regelmäßigen Abständen Schnitte Hämatoxylin-Eosin (HE)
gefärbt.
Hierbei wurden die auserwählten Schnitte zunächst 10 Minuten in PBS verbracht und
anschließend 10 Minuten in Hämalaun (Mayers Hämalaunlösung, Merck AGaA, Darmstadt,
Deutschland) gefärbt. Nach dem Bläuen mit Leitungswasser kam der Farbstoff Eosin
(Certistain Eosin G, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland), welcher nur 2 Minuten einwirkte,
hinzu. Es schlossen sich Alkoholbäder mit steigender Prozentzahl an, an deren Ende
100%iger Alkohol stand. Nach einem Bad in Xylol für etwa 10 Minuten wurden die Schnitte
anschließend mit Roti-Histokitt II (Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe, Deutschland)
eingedeckt.
Die mikroskopischen Beurteilung der HE gefärbten Schnitte diente einer ersten Beurteilung
der Probe und zur Einordnung, ob das vorliegende Gewebe ein potentiell regeneriertes
Lymphknotenfragment war. Alle Schnitte, die potentiell regenerierte
Lymphknotenfragmente aufwiesen, wurden in die Kategorie „vorläufig als regeneriert
Material und Methoden
28
eingestuft“ eingestuft. Es wurde bei der histologischen Begutachtung insbesondere auf die
Dichte und Form des vorliegenden Gewebes geachtet. Zusätzlich wurde für die Zuordnung
das Vorhandensein so wie die physiologische Verteilung von Lymphozyten, HEVs,
Lymphsinus und einer bindegewebigen Kapsel berücksichtigt.
Alle in „vorläufig als regeneriert“ eingestuften Proben wurden in der IHC-Färbung auf ihren
Regenerationsstatus hin untersucht.
2.13.2. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung
Im Anschluss an diese lichtmikroskopische Untersuchung folgte für alle ausgewählten
Proben, die sich zuvor als potentielles Regenerat auszeichneten, eine immunhistochemische
Färbung (IHC-Färbung).
Ziel dieser Färbung war es, mittels spezieller primärer und sekundärer Antikörper (AK)
zunächst B-Lymphozyten und T-Lymphozyten durch Fluoreszenz sichtbar zu machen und
somit ihre im Lymphknoten typische Verteilung zu beurteilen. Das bedeutet, dass sich
B-Lymphozyten im Randgebiet, dem Cortex des Lymphknotens, befinden sollten. Außerdem
sollte eine Anordnung zu Follikeln erkennbar sein. T-Lymphozyten sollten vermehrt in den
parakortikalen Teilen des Transplantates aufzufinden sein. Sowohl T-Lymphozyten-, als auch
B-Lymphozyten-Bereiche mussten auffindbar sein; fehlte einer der Bereiche gänzlich, wurde
die Regeneration als nicht erfolgreich bewertet.
Die IHC-Färbung erfolgte in einer Doppelmarkierung, d.h. B- und T-Zellen konnten auf einem
Schnitt zusammen angefärbt werden.
Hierzu wurden die Objektträger mit den ungefärbten Schnitten zunächst bei -20°C
10 Minuten in Aceton getaucht und anschließend 3 mal 5 Minuten mit PBS gespült. Zum
Puffern möglicher Fehlbindungen der Antikörper wurden die Schnitte mit Swine Serum
(DakoCytomation, Glostrup, Dänemark) in einer Verdünnung von 1:10 benetzt. Nach
30 Minuten wurde für die B-Lymphozyten-Färbung der primäre AK BM 4013 (Tab. 1.) in einer
Verdünnung von 1:500 aufgetragen und nach einer 60 minütigen Einwirkzeit mit 3 mal
5 minütigen Spülgängen PBS abgespült. Es schloss sich das Aufbringen des sekundären AK
AF 546 (Tab.1.) in einer Verdünnung von ebenfalls 1:500 an, welcher nach 30 Minuten
ebenfalls mit 3 mal 5 minütigen Spülgängen PBS abgespült wurde.
Zum Zwecke der T-Lymphozyten-Färbung wurde sich des Antikörpers R73 FITC (Tab. 1.)
bedient, welcher sowohl die Bindung an die T-Lymphozyten als auch die Fluoreszenz
kombiniert und damit primären und sekundären AK in einem darstellte.
Abschließend wurde nach einem weiteren 3 mal 5 minütigen Spülgang eine Zellkernfärbung
mit DAPI (SIGMA, Missouri, USA) in der Verdünnung von 1:1000 durchgeführt.
Material und Methoden
29
Die IHC-Färbung wurde mit einem letzten 3 mal 5 minütigen Spülgang und der Eindeckung
der Schnitte abgeschlossen. Als Kontrollfärbung wurden außerdem zwei Schnitte eines
inguinalen Lymphknotens einer Ratte in der gleichen Weise gefärbt, allerdings wurde einer
statt der Antikörper nur mit PBS benetzt. So konnte der direkte Vergleich zwischen
erfolgreicher AK-Färbung des einen Schnittes und der erfolgreichen Nichtfärbung des
anderen gezogen werden.
Die Verteilung der T- und B-Lymphozyten wurde am Fluoreszenz-Mikroskop beurteilt und die
Proben wurden abhängig von dem Vorhandensein einer physiologischen Verteilung dieser
Zellen vorläufig in „Ratte mit regenerierten Transplantaten“ und „Ratte ohne regenerierte
Transplantate“ eingestuft.
Zur weiteren Abklärung des Vorhandenseins einer Regeneration wurde zusätzlich bei allen
mit „Ratte mit regenerierten Transplantaten“ eingestuften Proben eine weitere IHC-Färbung
zur Feststellung von HEVs und Lymphendothel durchgeführt.
Das Färbeprotokoll las sich ähnlich wie das für die B- und T-Lymphozyten-Färbung und auch
die Kontrollfärbungen wurden in gleicher Weise vollzogen. Es wurde neben den vielzähligen
Spülgängen ebenso Swine Serum, wie auch DAPI verwendet. Zur Detektion der HEVs wurde
der primäre AK HIS 52 (Tab. 1.), zum Zwecke der Lymphendotheldarstellung der primäre AK
LYVE-1 (Tab. 1.) verwendet.
Bei beiden primären Antikörpern wurde als sekundärer AK CY™ 3 (Tab. 1.) verwendet.
Stellten sich HEVs und Lymphendothel dar, wurde die Probe endgültig in „Ratte mit
regenerierten Transplantaten“ eingestuft.
Material und Methoden
30
Primäre AK Firma Spezies monoklonal polyklonal
BM 4013
Acris antibodies,
Herford,
Deutschland
Mouse X
R73 FITC
(inkl. sek. AK)
AbD serotec,
Düsseldorf,
Deutschland
Mouse X
LYVE-1
Relia Tech GmbH,
Wolfenbüttel,
Deutschland
Rabbit X
HIS 52
Abcam,
Cambrige,
USA
Mouse X
Sekundäre AK Firma Spezies monoklonal polyklonal
CY™3
Dianova GmbH,
Hamburg,
Deutschland
Goat anti Rabbit
X
AF 546
Invitrogen
GmbH,
Darmstadt,
Deutschland
Goat anti Mouse
X
Tabelle 1.: Liste der primären und sekundären Antikörper (AK) und ihrer Herkunft.
Material und Methoden
31
3.14. Statistik
Im Anschluss an die makroskopische und die mikroskopische Auswertung folgte die
statistische Auswertung.
Zur Verarbeitung der Daten wurde mit dem Programm GraphPad Prism (Version 5.02, Firma
GraphPad Software, USA) gearbeitet. Aufgrund der geringen Stichprobengröße pro Gruppe
wurde der Fisher‘s exact test durchgeführt.
Hierbei ergaben sich folgende Signifikanzstufen für die Irrtumswahrscheinlichkeit p (Tab. 2.):
p-Wert Bezeichnung Symbol
0,05 ≤ p ≤ 0,10 Tendenz (*)
< 0,05 signifikant *
< 0,01 hoch signifikant **
<0,001 höchst signifikant ***
Tabelle 2.: Übersicht über die Signifikanzstufen
Zur Untersuchung der Parameter „Zeitpunkt“, „Lokalisation“ und „Dosis“ wurden
unterschiedliche Gruppen-Konstellationen gewählt und diese statistisch miteinander
verglichen.
Material und Methoden
32
3.14.1. Zeitpunkt
Zur Untersuchung des Zeitpunktes wurden folgende Gruppen miteinander verglichen
(Abb.3.):
• die Kontrollgruppe (Gruppe E) mit der Gruppe B mit dem Zeitpunkt „Tag 1,2,3 post
OP“
• die Kontrollgruppe (Gruppe E) mit der Gruppe C mit dem Zeitpunkt „Tag 14,15,16
post OP“
• die beiden Versuchsgruppen miteinander (Gruppe B mit Gruppe C) um einen
Unterschied zu Gunsten einer der Gruppen zu ermitteln
Abbildung 3.: Übersicht über die Gruppen, die zur Bestimmung des Parameters „Zeitpunkt“ miteinander verglichen wurden.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11121314 151617 181920 21222324 252627 28
Gruppe Bn = 19
Gruppe Cn = 20
Gruppe En = 20
Gruppen Parameter "Zeitpunkt"
Ruhephase
Applikation
Oberschenkel medial,
6,67µg VEGF-C
Tage
Material und Methoden
33
3.14.2. Lokalisation
Um die Lokalisation für eine VEGF-C Applikation zu bestimmen, wurden folgende Gruppen
miteinander verglichen (Abb.4.):
• die Kontrollgruppe (Gruppe E) mit der Gruppe A mit der intradermalen Applikation in
die Bauchwand
• die Kontrollgruppe (Gruppe E) mit der Gruppe B, in der den Ratten in die mediale
Seite des Oberschenkels VEGF-C intradermal injiziert wurde
• die beiden Versuchsgruppen miteinander (Gruppe A mit Gruppe B) um einen
Unterschied zu Gunsten einer der Gruppen zu ermitteln
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 1314 1516 171819 2021 2223 2425 2627 28
Gruppe An = 10
Gruppe Bn = 19
Gruppe En = 20
Gruppen Parameter "Lokalisation"
Ruhephase
Applikation Bauchwand,
6,67µg VEGF-C
Applikation
Oberschenkel medial,
6,67µg VEGF-C
Tage
Abbildung 4.: Übersicht über die Gruppen, die zur Bestimmung des Parameters „Lokalisation“ miteinander verglichen wurden.
Material und Methoden
34
3.14.3. Dosis
Die Dosis-Untersuchung erfolgte mit dem Vergleich folgender Gruppen (Abb. 5.):
• die Kontrollgruppe (Gruppe E) mit der Gruppe B, in der jeder Ratte 6,67µg VEGF-C
injiziert wurde
• die Kontrollgruppe (Gruppe E) mit der Gruppe D, in der jede Ratte 13,34µg VEGF-C
erhielt
• die beiden Versuchsgruppen miteinander (Gruppe B mit Gruppe D) um einen
Unterschied zu Gunsten einer der Gruppen zu ermitteln
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Gruppe Bn = 19
Gruppe Dn = 20
Gruppe En = 20
Gruppen Parameter "Dosis"
Ruhephase
Applikation
Oberschenkel medial,
6,67µg VEGF-C
Applikation
Oberschenkel medial,
13,34µg VEGF-C
TageTage
Abbildung 5.: Übersicht über die Gruppen, die zur Bestimmung des Parameters „Dosis“ miteinander verglichen wurden.
Ergebnisse
35
4. Ergebnisse
4.1. Vorversuch
Bei der HE Auswertung der Schnitte aus dem Vorversuch hat sich ergeben, dass nach
8 Wochen Ruhephase 57% (4 aus 7 Tieren) der Tiere potentiell regenerierte
Lymphknotenfragmente besaßen.
Die Kontrollgruppe (Gruppe E), die nur eine vierwöchige Ruhephase bekommen hat, wies
nach der immunhistochemischen Auswertung 70% (14 aus 20 Tieren) der Tiere mit
regenerierten Lymphknotenfragmenten auf.
4.2. Chirurgische Modifikation
Die Modifikation bezüglich der Transplantation ist in der Abb.6. a-f veranschaulicht.
Die Lymphknotenfragmente befanden sich bei der Entnahme bei 88 der 90 Versuchstiere
(98%) noch immer an dem nicht resorbierten Nahtmaterial.
Die Entfernung des Transplantats war nach Öffnung der Nahtschlinge und dem
anschließenden Herausziehen des Fadens ohne Schwierigkeiten möglich. Es befand sich bei
keinem der 90 Versuchstiere Gewebereste am Nahtmaterial in Bereich der identifizierten
Transplantate.
Ergebnisse
36
Abbildung 6.: Transplantationsvorgang: Aufsuchen des subkutanen Fettgewebes in der Leiste (a), Durchstechen
des Fettposters mit nicht resorbierbarem Nahtmaterial (b), Auffädeln der Lymphknotenfragmente (c), erneutes
Durchstechen des Fettpolsters (d), Verknoten des Nahtmaterials (e) und Verschließen der Wunde mit
resorbierbarem Nahtmaterial (f).
Ergebnisse
37
Abbildung 7.: Position der Patentblau-Applikation in die mediale Seite des
Oberschenkels und Verteilung des Farbstoffes über das superfizielle Lymphsystem.
4.3. Makroskopisch
In der Kontrollgruppe (Gruppe E) konnte bei 3 von 20 Ratten ein Wiederanschluss der
Transplantate an das Lymphsystem (Abb. 7. bis 9.) nachgewiesen werden. Es ergibt sich
damit eine Rate von 15%.
Eine Applikation in die Bauchwand, wie sie die Tiere in Gruppe A erhielten, hatte eine
Erfolgsrate von 50%. Es konnten 5 Tiere von 10 mit einem Wiederanschluss gefunden
werden.
In der Gruppe B, die VEGF-C zu dem Zeitpunkt „Tag 1, 2, 3 post OP“ in die rechte
Oberschenkelinnenseite gespritzt bekommen hat, beläuft sich die Wiederanschlussrate auf
53%. Das heißt 10 von 19 Tieren wiesen eine Blaufärbung des Transplantats (Abb.9.) und der
Lymphgefäßen auf.
In Gruppe C war der Wiederanschluss bei 7 von 20 Tieren erfolgreich. Die Rate einer VEGF-C
Applikation an den Tagen 14, 15 und 16 post OP liegt damit bei 35%.
In der Gruppe D mit einer VEGF-C Dosis von 13,34µg wiesen 17 aus 20 Tieren gefärbte
Transplantate auf. Damit ließ sich in der Gruppe D mit 85% die höchste Transplantat-
Wiederanschlussrate detektieren.
Ein Übersicht über den Transplantat-Wiederanschluss der einzelnen Gruppen bieten die
Abbildungen 10. und 11..
Ergebnisse
38
Abbildung 9.: Darstellung eines entnommenen und angefärbten
Transplantats
Abbildung 8.: Darstellung eines Transplantats mit Wiederanschluss an das Lymphgefäßsystem.
Erkennbar sind zu- und ableitendes Lymphgefäß (schwarzer Pfeil) sowie die Fixierung des
Transplantats mit nicht resorbierbarem Nahtmaterial (weißer Pfeil). Das Transplantat ist eingebettet
in Fettgewebe und noch nicht frei präpariert.
2mm
Ergebnisse
39
5
9
13
3
175
10
7
17
3
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Gruppe A Gruppe B Gruppe C Gruppe D Gruppe E
Ra
tte
n
Wiederanschluss an das Lymphgefäßsystem
Ratten mit Transplantat-
Wiederanschluss
Ratten ohne Transplantat-
Wiederanschluss
Abbildung 10.: Diagramm über den Transplantat-Wiederanschluss der einzelnen Gruppen.
Abbildung 11.: Diagramm über den Transplantat-Wiederanschluss der einzelnen Gruppen in Prozent.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Gruppe A Gruppe B Gruppe C Gruppe D Gruppe E
50% 47%
65%
15%
85%
50% 53%
35%
85%
15%
Wiederanschluss an das Lymphgefäßsystem prozentual
mit Wiederanschluss
ohne Wiederanschluss
Ergebnisse
40
4.3.1. Statistik
4.3.1.1. Zeitpunkt
Zunächst wurde die Kontrollgruppe (Gruppe E) mit der Gruppe B verglichen. In Gruppe B
bekamen die Tiere eine Dosis von 6,67µg VEGF-C in die Oberschenkelinnenseite zum
Zeitpunkt „Tag 1, 2 und 3 post OP“ injiziert. Die Analyse mit dem Fisher’s Exact Test ergab
einen p-Wert von 0,0187. Es konnte somit eine statistische Signifikanz nachgewiesen werden
(Abb. 12.).
Ein weiterer Vergleich wurde zwischen der Kontrollgruppe (Gruppe E) und der Gruppe C
gezogen. Die Tiere in Gruppe C erhielten eine Dosis von 6,67µg VEGF-C zu dem Zeitpunkt
„Tag 14, 15 und 16 post OP“ in die rechte Oberschenkelinnenseite. Der p-Wert beträgt hier
0,2733. Eine Signifikanz konnte somit nicht nachgewiesen werden (Abb.12.).
Ein Vergleich der beiden Versuchsgruppen zueinander ergab mit einem p-Wert von 0,3406
keine statistische Signifikanz (Abb.12.).
17
9
13
3
10
7
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Gruppe E Gruppe B Gruppe C
Ra
tte
n
Transplantat-Wiederanschluss
Ratte mit Transplantat-
Wiederanschluss
Ratte ohne Transplatat-
Wiederanschluss
*
Abbildung 12.: Diagramm über die miteinander verglichenen Gruppen und ihrer ermittelten
Signifikanzstufen für den Parameter „Zeitpunkt“ bezogen auf den Transplantat-
Wiederanschluss.
* p < 0,05
Ergebnisse
41
4.3.1.2. Lokalisation
Der Vergleich zwischen der Kontrollgruppe (Gruppe E) mit der Gruppe A ergab mit einem
p-Wert 0,0778 zwar eine statistische Tendenz (Abb 13.), jedoch keine Signifikanz.
Die statistische Signifikanz und der p-Wert beim Vergleich zwischen der Kontrollgruppe
(Gruppe E) und der Gruppe B ist bereits bei dem Kapitel 4.3.1.1. beschrieben worden
(p-Wert = 0,0187) (Abb. 13.).
Ein Vergleich zwischen beiden Versuchsgruppen Gruppe A und Gruppe B führte zu einem
p-Wert von 1 und ist somit statistisch nicht signifikant (Abb. 13.).
17
5
9
3
5
10
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Gruppe E Gruppe A Gruppe B
Ra
tte
n
Transplantat-Wiederanschluss
Ratte mitTransplantat-
Wiederanschluss
Ratte ohne Transplatat-
Wiederanschluss
(*)
*
Abbildung 13.: Diagramm über die miteinander verglichenen Gruppen und ihrer ermittelten
Signifikanzstufen für den Parameter „Lokalisation“ bezogen auf den Transplantat-Wiederanschluss.
* p< 0,05
(*) 0,05<p<0,10
Ergebnisse
42
4.3.1.3. Dosis
Zur Ermittlung des Parameters „Dosis“ ist zunächst die Kontrollgruppe (Gruppe E) mit der
Gruppe D, in der jedes Tier eine Dosis von 13,34µg VEGF-C in die Oberschenkelinnenseite
injiziert bekam, verglichen worden.
Der p-Wert bei dem Vergleich lag bei <0,0001 und ist damit statistisch höchst signifikant
(Abb. 14.).
Die statistische Signifikanz und der p-Wert beim Vergleich zwischen der Kontrollgruppe
(Gruppe E) und der Gruppe B ist bereits bei dem Kapitel 4.3.1.1. beschrieben worden
(p-Wert = 0,0187) (Abb. 14.).
Der Vergleich zwischen den beiden Versuchsgruppen, Gruppe B und Gruppe D, ergab einen
p-Wert 0,0407. Damit ist eine statistische Signifikanz zugunsten der Gruppe D nachgewiesen
(Abb. 14.).
17
9
3
3
10
16
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Gruppe E Gruppe B Gruppe D
Ra
tte
n
Transplantat-Wiederanschluss
Ratte mit Transplantat-
Wiederanschluss
Ratte ohne Transplatat-
Wiederanschluss
***
**
Abbildung 14.: Diagramm über die miteinander verglichenen Gruppen und ihrer ermittelten
Signifikanzstufen für den Parameter „Dosis“ bezogen auf den Transplantat-Wiederanschluss.
* p< 0,05
*** p< 0,001
Ergebnisse
43
4.4. Mikroskopisch
Zunächst erfolgte eine erste Vorauswahl der gefärbten HE Präparate in potentiell
regenerierte und nekrotisierte Transplantate (Abb. 15), erst danach erfolgte die
Immunhistochemie, um die Proben auf ihren Regenerationsstatus hin zu beurteilen.
Unter Berücksichtigung der im Kapitel 3. (Material und Methoden) genannten Parameter
wurden in der Kontrollgruppe E eine Regenerationsrate von 70% erreicht. Es wiesen also 14
von 20 Ratten regenerierte Lymphknotenfragmente (Abb. 16., 19., 21.)auf.
In Gruppe A konnten bei 8 (80%) von 10 Tieren regenerierte Lymphknotenfragmente
detektiert werden. In der Gruppe B waren es 17 (89%) aus 19 Tieren und in Gruppe C
17 (85%) aus 20 Tieren.
Die Gruppe D erwies sich auch hier als die Gruppe mit der höchsten Rate. Bei 95% (18 aus 19
Tieren) der Ratten konnte hier die Einstufung in „Ratte mit regenerierten Transplantaten“
erfolgen.
Eine Übersicht über den Regenerationsstatus (Abb. 16.-21.) und die Ergebnisse in den
einzelnen Gruppen (Abb.: 22. Und 23.) bieten die folgenden Abbildungen:
Abbildung 15.: a. HE-Färbung eines nekrotisierten Transplantats in der Vergrößerung: 5x; b. HE-Färbung eines
potentiellen Regenerats in der Vergrößerung: 5x
Ergebnisse
44
Abbildung 16.: Ein regeneriertes Lymphknotenfragment nach Immunhistochemie. a. Die Zellkernfärbung
(DAPI); b. die T-Lymphozyten (1.Ak R73, 2.Ak FITC) befinden sich im parakortikalen Bereich des
Lymphknotens; c. die B-Lymphozyten (1.Ak BM 4013, 2. Ak AF 564) sind randständig. d. Zusammengefügte
Darstellung der B- und T-Zellen (d). Vergrößerung (a-d): 5x.
Ergebnisse
45
Abbildung 17.: Ein nicht regeneriertes Lymphknotenfragment nach Immunhistochemie. a. die Zellkernfärbung
(DAPI); b. die T-Lymphozyten (1.Ak R73, 2.Ak FITC) befinden sich zwar vorwiegend, jedoch nicht deutlich abgegrenzt,
im parakortikalen Bereich des Lymphknotens; c. die B-Lymphozyten (1.Ak BM 4013, 2.Ak AF 564) sind zudem nicht
randständig angeordnet, sondern diffus auch über den kortikalen Bereich hinaus verteilt. d. zusammengefügte
Darstellung der B- und T-Zellen. Vergrößerung (a-d): 5x.
Ergebnisse
46
Abbildung 19.: Regenerierte Lymphknotenfragmente. a. HEVs
(1.Ak His 52, 2.Ak Cy3) in der Vergrößerung 10x; b. in der Vergrößerung 40x
nach der Immunhistochemie.
Abbildung 18.: Ein nicht regeneriertes Lymphknotenfragment. a.
Zellkernfärbung (DAPI); b. HEV-Färbung (1.Ak His 52, 2.Ak Cy3) mittels
Immunhistochemie. Vergrößerung 5x (a,b).
Ergebnisse
47
Abbildung 21.: Ein regeneriertes Lymphknotenfragment. a. die Lymphendothel-Färbung (1. Ak LYVE-1, 2. Ak Cy3) in der
Vergrößerung 5x und b. in der Vergrößerung 40x (b).
Abbildung 20.: Ein nicht regeneriertes Lymphknotenfragment. a. die Zellkern-Färbung
(DAPI); b. die Lymphendothel-Färbung (1. Ak LYVE-1, 2. Ak Cy3) mittels Immunhistochemie
in der Vergrößerung 5x (a,b).
Ergebnisse
48
2 2 31
6
8
1717
18
14
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Gruppe A Gruppe B Gruppe C Gruppe D Gruppe E
An
zah
l R
att
en
Regeneration
Ratte mit regenerierten
Transplantaten
Ratte ohne regenerierte
Transplantate
Abbildung 22.: Diagramm über die Transplantat-Regeneration der einzelnen Gruppen.
Abbildung 23.: Diagramm über die Transplantat-Regeneration der einzelnen Gruppen in Prozent.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Gruppe A Gruppe B Gruppe C Gruppe D Gruppe E
20%11% 15%
5%
30%
80%89% 85%
95%
70%
Regerneration prozentual
Ratte mit regenerierte
Transplantate
Ratte ohne regenerierten
Transplantaten
Ergebnisse
49
4.4.1. Statistik
4.4.1.1. Zeitpunkt
Der Vergleich zwischen den Gruppen: Kontrollgruppe (Gruppe E) und der Gruppe B, in der
jeder Ratte 6,67µg VEGF-C an den Tagen 1, 2 und 3 post OP in die rechte
Oberschenkelinnenseite injiziert wurde, ergab mit dem p-Wert 0,2351 keine statistische
Signifikanz (Abb. 24.).
Auch der Vergleich zwischen der Kontrollgruppe (Gruppe E) und der Versuchsgruppe C
(6,67µg VEGF-C in die rechte Oberschenkelinnenseite, Tag 14, 15, 16 post OP) ergab keine
statistische Signifikanz und wies einen p-Wert von 0,4506 auf (Abb. 24.).
Die Gruppen untereinander wiesen mit einem p-Wert von 1 ebenfalls keine statistische
Signifikanz auf (Abb. 24.).
Abbildung 24.: Diagramm über die miteinander verglichenen Gruppen und ihrer ermittelten
Signifikanzstufen für den Parameter „Zeitpunkt“ bezogen auf die Transplantat-Regeneration.
6
2 3
14
1717
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Gruppe E Gruppe B Gruppe C
Ra
tte
n
Regeneration
Ratte mit regenerierten
Transplantaten
Ratte ohne regenerierte
Transplantate
Ergebnisse
50
4.4.1.2. Lokalisation
Der Vergleich zwischen der Kontrollgruppe (Gruppe E) und der Gruppe A, in der jeder Ratte
6,67µg VEGF-C an den Tagen 1, 2 und 3 post OP in die Bauchwand injiziert wurde, ergab
einen p-Wert von 0,6821 und ist damit nicht signifikant (Abb. 25.).
Der Vergleich zwischen den Gruppen „Kontrollgruppe“ (Gruppe E) und der „Gruppe B“
wurde bereits in dem Kapitel 4.4.1.1. beschrieben und ergab mit dem p-Wert 0,2351 keine
statistische Signifikanz (Abb. 25.).
Auch der Vergleich zwischen den beiden Versuchsgruppen Gruppe A und Gruppe B ergibt
keine Signifikanz. Der p-Wert liegt bei 0,592 (Abb. 25.).
Abbildung 25.: Diagramm über die miteinander verglichenen Gruppen und ihrer ermittelten
Signifikanzstufen für den Parameter „Lokalisation“ bezogen auf die Transplantat-Regeneration.
6
2 2
14
8
17
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Gruppe E Gruppe A Gruppe B
Ra
tte
n
Regeneration
Ratte mit regenerierten
Transplantaten
Ratte ohne regenerierte
Transplantate
Ergebnisse
51
4.4.1.3. Dosis
Eine statistische Tendenz ergab der Vergleich zwischen der Kontrollgruppe (Gruppe E) und
der Gruppe D, in der den Ratten je eine Dosis von 13,34µg VEGF-C an den Tagen 1, 2 und 3
post OP in die Oberschenkelinnenseite injiziert wurde (Abb 26.). Der p-Wert lag bei 0,0915.
Der Vergleich zwischen den Gruppen „Kontrollgruppe“ (Gruppe E) und der „Gruppe B“
wurde bereits in Kapitel 4.4.1.1. beschrieben und ergab mit dem p-Wert 0,2351 keine
statistische Signifikanz (Abb. 26.).
Auch der Vergleich zwischen den beiden Versuchsgruppen ergab mit dem p-Wert 1 keine
statistische Signifikanz (Abb. 26.).
Abbildung 26.: Diagramm über die miteinander verglichenen Gruppen und ihrer ermittelten
Signifikanzstufen für den Parameter „Dosis“ bezogen auf die Transplantat-Regeneration.
62 1
14
17 18
02468
101214161820
Gruppe E Gruppe B Gruppe D
Ra
tte
n
Regeneration
Ratte mit regenerierten
Transplantaten
Ratte ohne regenerierte
Transplantate
(*)
(*) 0,05<p<0,10
Diskussion
52
5. Diskussion
In den Industriestaaten ist die häufigste Ursache für ein sekundäres Lymphödem die
Brustkrebstherapie (ALITALO et al. 2005). Die Entfernung regionärer Lymphknoten führt zu
einem gestörten Gleichgewicht des Wasserhaushaltes. Daraus resultiert eine pathologische
Akkumulation von Gewebswasser im Interstitium und damit ein Ungleichgewicht zwischen
lymphatischen Lasten und der lymphatischen Transportkapazität (ROCKSON 2010).
Die Therapie eines sekundären Lymphödems besteht derzeit hauptsächlich aus manueller
Entstauungstherapie, unterstützt durch das Tragen von Kompressionsstrümpfen, und ist
damit primär symptomorientiert.
Zu einer Ausheilung des sekundären Lymphödems führen diese Maßnahmen in der Regel
nicht. Die Patientinnen sind somit auf eine z.T. lebenslange Therapie und medizinische
Nachsorge angewiesen.
Die Bemühungen eine chirurgische Therapie zu erarbeiten, waren bisher leider wenig
erfolgreich, wie in der Arbeit von MEHRARA et al. (2011) dargestellt. Die avaskuläre
Transplantation von Lymphknotenfragmenten hat sich in der Vergangenheit jedoch bereits
beim Schaf, Schwein, der Maus und Ratte als vielversprechend erwiesen (PABST u.
ROTHKOTTER 1988, ROTHKOTTER u. PABST 1990, TAMMELA et al. 2007, TOBBIA et al. 2009,
HADAMITZKY et al. 2009, BLUM et al. 2010 u. SOMMER et al. 2012 B). In diesem
Zusammenhang veröffentlichten SOMMER et al. (2012 B) kürzlich ihre Ergebnisse darüber,
dass die Injektion mit VEGF-C dabei zu besseren Regenerationsraten der
Lymphknotenfragmente führt. Nicht untersucht wurde allerdings, wie sich unterschiedliche
Applikations-Parameter des Wachstumsfaktors VEGF-C auf die Ergebnisse auswirken.
In der hier vorliegenden Dissertation wurde sich, auf Grund der guten Ergebnisse, an dem
Tier-Modell und der chirurgischen Technik von SOMMER et al. (2012 B) orientiert und der
Wachstumsfaktor VEGF-C wurde bezüglich der Applikations-Parameter „Zeitpunkt“,
„Lokalisation“ und „Dosis“ auf seine Wirkung auf die Regeneration und den Wiederanschluss
der Transplantate hin untersucht.
Diskussion
53
5.1. Die Modifikation der Methode
Die Technik, die SOMMER et al. (2012 B) bei ihren Untersuchungen verwendet haben,
verursachte jedoch, wie bereits im Kapitel 1. (Einleitung) beschrieben, einige Schwierigkeiten
bei der Entnahme der Transplantate. Durch die Nähe der Transplantate zum Knoten des
Nahtmaterials, mit dem die Transplantate im subkutanen Fettgewebe fixiert wurden, war
eine Entfernung dieser vom Nahtmaterial in den meisten Fällen nur mit einem
Substanzverlust möglich.
Eine Änderung der Nahttechnik, wie in dem Kapitel 3.7.1. beschrieben, führte zu einer
substanzverlustfreien Entfernung der Transplantate vom Nahtmaterial bei allen Tieren.
Durch diese Technik ist außerdem eine zusätzliche Verminderung mechanischer Reize im
Bereich der Transplantate durch das starre, nicht resorbierbare Nahtmaterial auf Grund der
Barriere aus Fettgewebe, die hierbei entsteht, anzunehmen. Dies bietet insbesondere bei
Versuchen Vorteile, in denen die Masse der Transplantate untersucht werden soll.
Außerdem konnten die Vorteile der Migrationsverhinderung sowie einer leichten Auffindung
der Transplantate durch das nicht resorbierte Nahtmaterial mit der in dieser Arbeit
vorgenommenen chirurgischen Modifikation beibehalten werden. In nur 2% der Fälle waren
die Transplantate in der Umgebung des Transplantationsgebietes und nicht am Faden zu
finden.
Auch die Methode eines „free grafts“, also einer Transplantation ohne Fixierung der
Transplantate, ist gegeben und in der Arbeit von TOBBIA et al. (2009) beschrieben. Damit
wären Substanzverluste und mechanische Reizungen durch einen Knoten verhindert.
Möglicherweise wäre hierbei jedoch problematisch, dass die Transplantate durch ihre freie
Beweglichkeit im subkutanen Fettgewebe zur Migration neigen könnten. Außerdem ginge
bei dieser Methode der Vorteil einer leichten Auffindung der Transplantate verloren, welche
durch die Markierung des nicht resorbierten Nahtmaterials gegeben ist.
Weitere Details über die Fixierungs-Methoden sind in den zuvor genannten Arbeiten, die
sich ebenfalls mit der avaskulären Transplantation von Lymphknotenfragmenten
beschäftigen, leider nicht angegeben (BLUM et al. 2010, TAMMELA et al. 2007, TOBBIA et al.
2009, HADAMITZKY et al. 2009, BLUM et al. 2010 u. SOMMER et al. 2012 B).
Nach Abwägung der Methoden von SOMMER et al. (2012 B), TOBBIA et al. (2009) und der in
dieser Dissertation modifizierten Technik nach SOMMER et al. (2012 B), wird deutlich, dass
nur mit der modifizierten Variante alle wichtigen Vorteile bei einer Entnahme der
Transplantate erhalten bleiben.
Die Modifikation behält zunächst einmal alle Vorteile durch das bereits von SOMMER et al.
(2012 B) verwendete nicht resorbierbare Nahtmaterial bei. Damit ist die langanhaltende
Diskussion
54
Fixierung der Lymphknotenfragmente im Transplantationsgebiet gesichert, eine Migration
also verhindert und eine Auffindung der Transplantate bei deren Entnahme leicht möglich.
Außerdem bietet die Modifikation aber auch noch zwei entscheidende Verbesserungen.
Zum einen wird bei dieser Technik das Nahtmaterial so verknotet, dass zwischen Knoten und
Transplantate eine Gewebsbrücke entsteht. Damit ist einer mechanischen Reizung der
Transplantate durch das nicht resorbierbare Nahtmaterial vorgebeugt. Zum anderen führt
diese Methode dazu, dass durch die Lage des Knotens Verwachsungen der Transplantate mit
dem Knoten ausgeschlossen sind und sie sich bei ihrer Entnahme leicht und
substanzverlustfrei vom Nahtmaterial entfernen lassen.
Unter diesen Aspekten hat sich eine Verwendung der in dieser Dissertation beschriebenen
modifizierten Methode bewährt.
In zukünftigen Tierversuchen sollte dennoch geklärt werden, ob eine Fixierung der
Lymphknotenfragmente mit Fibrinkleber möglich ist, denn die Verwendung von nicht
resorbierbarem Nahtmaterials wäre in der Klinik nicht sinnvoll und ein Wiederauffinden
wäre zudem nicht notwendig.
Diskussion
55
5.2. Die Parameter: Zeitpunkt, Lokalisation, Dosis
Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation haben zum einen gezeigt, dass eine avaskuläre
Transplantation von autologen Lymphknotenfragmenten verbessert werden kann.
Zum anderen haben sie auch bestätigt, dass sich VEGF-C, wie bereits von TAMMELA et al.
(2007) und SOMMER et al. (2012 B) beschrieben, dabei als förderlich erweist.
Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf den Untersuchungen der Applikations-Parameter des
VEGF-C, da in keiner der beschrieben Arbeiten diese bisher eingehend untersucht wurden
und Daten zu Dosis, Zeitpunkt und Lokalisation unzureichend, oder nicht vorhanden waren
(TAMMELA et al. 2007 u. SOMMER et al. 2012 B). So beschreiben z.B. TAMMELA et al.
(2007), dass die Mäuse mit VEGF-C behandelt wurden. Der Versuchsansatz ist jedoch anders
als der, der der z.B. der SOMMER et al. (2008 B) zugrunde liegt. VEGF-C wird bei TAMMELA
et al. (2007) durch eine adenovirale Genexpression endogen in den Mäusen produziert.
Damit kommt es zu einer kontinuierlichen Abgabe von VEGF-C und die Dosierung kann somit
nicht bestimmt werden. Der Einsatz dieser Technik würde beim Menschen unter anderem
ethische Probleme auslösen.
In der Arbeit von SOMMER et al. (2012 B) wird VEGF-C intrakutan injiziert. Zwar sind hier
Dosis, Zeitpunkt und Lokalisation beschrieben, die Einflüsse bei einer Veränderung der
Parameter wurden jedoch nicht näher untersucht.
In der hier vorliegenden Dissertation wurden deutliche Einflüsse dieser Applikations-
Parameter auf die Regeneration und den Wiederanschluss der Transplantate gezeigt. Diese
sollen im Folgenden diskutiert werden.
5.2.1. Der Wiederanschluss der Transplantate an das Lymphgefäßsystem
Der Wiederanschluss der Transplantate an das Lymphgefäßsystems wird durch VEGF-C in
besonderem Maße verbessert. Dabei hat sich VEGF-C auf alle drei der untersuchten
Parameter als förderlich heraus gestellt.
Diskussion
56
5.2.1.1. Zeitpunkt
Betrachtet man den Vergleich zwischen der Kontrollgruppe und der Gruppe B, die VEGF-C zu
einem frühen Zeitpunkt gespritzt bekam, so fördert diese frühe Applikation einen
Wiederanschluss signifikant
Ein späterer Zeitpunkt weist dagegen im Vergleich zu der Kontrollgruppe diesen Erfolg nicht
auf. Auch ein Vergleich der beiden Versuchsgruppen zueinander führte statistisch zu keinem
eindeutigen Unterschied zu Gunsten einer der beiden Gruppen.
Auf Grund der statistischen Einzelwerte ist aber festzuhalten, dass eine frühe Injektion des
Wachstumsfaktors VEGF-C mit den Tagen 1, 2 und 3 post OP nach einer
Lymphknotentransplantation zu besseren Wiederanschlussraten der
Lymphknotenfragmente mit dem Lymphsystem führt.
Es ist nachgewiesen, dass die Neovaskularisation nach einer Lymphknotenentfernung
innerhalb der ersten 7 Tage nach einer Lymphknotendissektion beginnt und nach 4 Wochen
abgeschlossen ist (Übersicht BUETTNER u. BODE 2012). Die vorliegenden Ergebnisse
bestätigen diese Aussage und zeigen, dass zu einem späteren Zeitpunkt eine Neubildung der
Gefäße immer unwahrscheinlicher wird.
5.2.1.2. Lokalisation
Die Ergebnisse bei der statistischen Untersuchung zum Parameter Lokalisation zeigten, wie
bereits im Kapitel 3. (Material und Methoden) beschrieben, eindrucksvoll, dass sich die Wahl
der Lokalisation ebenfalls auf die Wiederanschlussrate auswirkt.
Zwar fördert eine intrakutane Applikation von VEGF-C in die Bauchwand im Vergleich zu der
Kontrollgruppe den Wiederanschluss statistisch tendenziell, eine Applikation in den
medialen Oberschenkel, fördert diesen jedoch im Vergleich zur Kontrollgruppe statistisch
signifikant.
Damit wird deutlich, dass sich zunächst einmal generell VEGF-C positiv auf den
Wiederanschluss auswirkt, denn bei beiden Versuchsgruppen ist ein statistisch belegbares
Ergebnis der Förderung von VEGF-C nachzuweisen.
Ein Unterschied zugunsten der einen oder anderen Versuchsgruppe ist, wie auch zwischen
den Versuchsgruppen der Zeitpunkt-Untersuchung, statistisch nicht auszumachen.
Dies mag in diesem Fall wie auch beim Zeitpunkt daran liegen, dass die Unterschiede
bezogen auf die Zahl der Tiere, die wiederangeschlossene Transplantate aufwiesen, zu
gering waren. Bei der Untersuchung der Lokalisation, wiesen in der Gruppe B
10 von 19 Tieren einen Wiederanschluss auf, in der Gruppe A 5 von 10 Tieren. Der
prozentuale Unterschied zwischen den beiden Gruppen beträgt damit nur 3%. Dass dies
Diskussion
57
statistisch nicht zu einem Ergebnis zu Gunsten der einen oder anderen Versuchsgruppe
führen kann, wird bei Betrachtung dieser Zahlen deutlich.
Aufgrund der besseren statistischen Einzelergebnisse ist aber dennoch eine Applikation
intrakutan in die Oberschenkelinnenseite empfehlenswert.
Eine mögliche Erklärung, warum sich eine Applikation in den Oberschenkel etwas besser auf
den Wiederanschluss der Transplantate auswirkt, könnte in der Anatomie zu finden sein.
Dabei sind zwei Aspekte bei der Überlegung wichtig:
1. Führt man eine Entfernung der Lymphknoten durch, so werden die afferenten und
efferenten Kollektoren durchtrennt.
2. Wenn man eine Substanz intrakutan appliziert, wird diese über das superfizielle
Lymphsystem aufgenommen und darüber in die regionären Lymphknoten transportiert.
Spritzt man nun nach einer Transplantation den Wachstumsfaktor VEGF-C in die Bauchwand
nahe dem Transplantationsgebiet, so wird diese Substanz auch vom superfiziellen System
aufgenommen, jedoch findet es in diesem Bereich keinen direkten Anschluss zu den
afferenten Kollektoren, die sich im weiteren Verlauf der Ruhephase mit den Transplantaten
verbinden sollen. Zwar gelangt der Wachstumsfaktor auch in das Gebiet und entfaltet dort
seine Wirkung, jedoch wird er nicht gezielt an den Ort geleitet, an dem er für die
Lymphangiogenese benötigt wird.
Spritzt man dagegen in den ipsilateralen Oberschenkel, befindet man sich anatomisch in
einem Bereich, in dem die afferenten Kollektoren noch teilweise intakt sind. Das VEGF-C
kann somit von ihnen aufgenommen werden und ein erneutes Gefäßwachstum ist gezielter
möglich.
5.2.1.3. Dosis
Besonders deutliche Unterschiede bei der Wiederanschlussrate finden sich bei der
Untersuchung des Parameters „Dosis“.
Wie bereits beschrieben, fördert eine geringe Dosis den Wiederanschluss an das
Lymphgefäßsystem signifikant. Wird jedoch eine Verdopplung der Dosis auf 13,34 µg
vorgenommen und diese bei gleichen Zeitpunkts- und Lokalisationsparametern injiziert, wird
der Wiederanschluss statistisch höchst signifikant gefördert.
Prozentual liegt der Unterschied zwischen den beiden Versuchsgruppen bei 38%. Damit ist
auch der Unterschied der beiden Gruppen untereinander deutlich. Statistisch konnte zudem
ein signifikanter Unterschied zu Gunsten der Gruppe mit der hohen Dosis nachgewiesen
werden.
Diskussion
58
Eine höhere Dosis von 13,34 µg ist somit also empfehlenswert.
Mit diesen statistischen Ergebnissen ist klar gezeigt worden, dass die Parameter einen
erheblichen Einfluss auf den Wiederanschluss der autologen Lymphknotenfragmente nach
avaskulärer Transplantation haben.
5.2.2. Die Regeneration der Transplantate
Die Regeneration der Transplantate wurde durch den vaskulär endothelialen
Wachstumsfaktor VEGF-C grundsätzlich weniger stark beeinflusst als ihr Wiederanschluss.
Ein Einfluss der Parameter auf die Regeneration konnte aber dennoch entdeckt werden.
5.2.2.1. Zeitpunkt
Betrachtet man den frühen Zeitpunkt der VEGF-C Applikation an den Tagen 1, 2 und 3 post
OP, scheint dieser etwas besser (p=0,2351) im Vergleich zu der Kontrollgruppe zu sein, da
der p-Wert für den Vergleich zwischen der Gruppe mit dem späteren Zeitpunkt an den
Tagen 14, 15 und 16 post OP mit der Kontrollgruppe bereits bei 0,4506 liegt. Statistisch ist
jedoch keiner der beiden Applikationszeitpunkte für die Regeneration relevant. Auch der
versuchsgruppeninterne Vergleich weist keine statistischen Unterschiede auf.
Die Lokalisation ist somit für die Regeneration der Transplantate zwar nicht völlig außer Acht
zu lassen; die Statistik bietet aber bei den verwendeten Tierzahlen keinen Beweis für ihre
Wichtigkeit.
5.2.2.2. Lokalisation
Ebenso wie bei dem Zeitpunkt, scheint auch bei der Lokalisation der p-Wert für die
Regeneration nicht ganz unbedeutend zu sein, denn die Lokalisation „Bauchwand“ weist
einen Wert von 0,6821 auf, während die Lokalisation „Oberschenkelinnenseite“ mit einem
Wert von 0,2351 einen augenscheinlich deutlich besseren p-Wert zeigt. Allerdings sind auch
diese Werte statistisch nicht relevant. Damit ist auch der Vergleich zwischen den beiden
Versuchsgruppen von keiner statistischen Relevanz.
Die p-Werte, die bei dem Vergleich der Versuchsgruppen mit der Kontrollgruppe entstanden
sind, lassen ebenso wie die des untersuchten Parameters „Zeitpunkt“ lediglich die
Diskussion
59
Vermutung zu, dass eine Applikation intrakutan in die Oberschenkelinnenseite, genau wie
beim Wiederanschluss der Transplantate an das Lymphgefäßsystem, vorteilhaft ist.
5.2.2.3. Dosis
Statistisch aussagekräftige Ergebnisse erbrachte bei der Untersuchung der Regeneration nur
der Parameter „Dosis“. Die Ergebnisse der Gruppenvergleiche zeigen, dass eine Veränderung
der Dosis auch auf die Regeneration einen positiven Einfluss hat.
Eine hohe Dosis fördert die Regeneration der transplantierten Lymphknotenfragmente
statistisch tendenziell, eine geringe Dosis hat mit einem p-Wert von 0,2351 dagegen keine
statistische Relevanz. Auch wenn der Unterschied zwischen den beiden Versuchsgruppen
statistisch nicht relevant zu Gunsten der höheren Dosis ausfällt, ist trotzdem zu vermerken,
dass auf Grund der Ergebnisse des Vergleichs mit der Kontrollgruppe, die Applikation einer
höheren Dosis erstrebenswert ist.
5.2.3. Résumé: Einfluss der Parameter auf die Transplantate
Übergreifend lässt sich also festhalten, dass vor allem die Dosis bezüglich der Regeneration
der Lymphknotenfragmente als auch des Transplantat-Wiederanschlusses einen Einfluss hat.
Insbesondere eine hohe Dosis fördert diese. Zeitpunkt und Lokalisation wirken sich
hauptsächlich auf den Wiederanschluss der Transplantate mit dem Lymphsystem aus. Ein
früher Zeitpunkt an den Tagen 1, 2 und 3 post OP sowie eine intrakutane Injektion des
Wachstumsfaktors VEGF-C in die mediale Seite des Oberschenkels wirken sich fördernd aus.
Diskussion
60
5.3. Aussichten und Diskussion von Material und Methoden
Um genauere Daten über die tatsächlich effektivste Dosis zu erhalten, müssten diesbezüglich
Untersuchungen vorgenommen werden. Hierbei sollte der Fokus nicht nur auf den Effekt der
VEGF-C Dosen auf die Regeneration und den Wiederanschluss der Transplantate liegen,
sondern zusätzlich auf dem Einfluss hoher Dosen VEGF-C auf die Permeabilität der
Blutgefäße.
Es ist bekannt, dass eine zu hohe Dosis VEGF-C zu einer erhöhten Permeabilität und einem
gesteigerten Wachstum der Blutgefäße führt (LOHELA et al. 2003). Es scheint also ein
schmaler Grat zwischen den positiven Effekten einer hohen Dosis VEGF-C auf die
Regeneration der Lymphgefäße und den negativen Effekten dieser auf die Blutgefäße zu
liegen. Bei den in dieser Dissertation untersuchten Tieren konnten bei einer Dosis von
13,34 µg VEGF-C allerdings makroskopisch keine Auffälligkeiten der Blutgefäße festgestellt
werden. Auch Nebenwirkungen unter der Behandlung tauchten nicht auf. Um jedoch ein
Behandlungskonzept für die Klinik zu erarbeiten, müssen eine sichere Anwendung von
VEGF-C möglich und eventuelle Nebenwirkungen bekannt sein. Diesbezüglich ist es
unerlässlich VEGF-C weiteren Studien zu unterziehen.
Sollte sich VEGF-C dabei als geeignet erweisen, ist der Einsatz in der Klinik denkbar, auch
wenn eine hohe Dosis VEGF-C dabei zum gegenwärtigen Zeitpunkt einen enormen
Kostenfaktor darstellt.
Momentan beträgt der Preis für 100µg VEGF-C in der Wissenschaft 775€. Damit können bei
einer Dosis von 13,34 µg VEGF-C pro Ratte (200g) gerade einmal 2,5 Ratten diese Therapie
über 3 Tage erfahren. Hochgerechnet auf einen Menschen (durchschnittlich 70kg) fallen die
Zahlen selbstverständlich dementsprechend deutlich höher aus.
Wenn man sich jedoch die Kosten anschaut, die bei einem sekundären Lymphödem
entstehen, beinhalten diese, wie bereits QUIRION (2010) in einem Review dargestellt, z.B.
die Beträge für die ambulante Pflege, die Physiotherapie, die medizinische Nachsorge und
den Bedarf an Versorgungsgütern (Bsp. Stützstrümpfe und Bandagen). Eine Übersicht über
die entstehenden Kosten zur Behandlung eines durch die Brustkrebstherapie entstandenen
Lymphödems wurde z.B. von SHIH et al. (2009) veröffentlicht. In der Arbeit wird ein Betrag
von 14 877 $ bis 23 167 $ innerhalb von 2 Jahren bei Patientinnen mit einem
brustkrebsassoziierten Lymphödem angegeben (SHIH et al. 2009).
Betrachtet man nun also die Beiträge, die zur Therapie und Nachsorge des sekundären
Lymphödems entstehen, relativiert sich die Verhältnismäßigkeit der Aufwendungen.
Zudem ist anzunehmen, dass bei vermehrtem Einsatz von VEGF-C der Preis durch die
größeren Herstellungsmengen und die Konkurrenz unter den Herstellern sinken wird.
Diskussion
61
VEGF-C ist außerdem besser kontrolliert herzustellen als andere Mittel wie beispielsweise
das PRP.
Um PRP zu produzieren, bedarf es einer aufwendigen Aufreinigung unter sterilen, Good
Laboratory Praxis (GLP) - Bedingungen. Damit können nur spezielle medizinische Stätten, die
geeignete Einrichtungen besitzen, PRP herstellen.
Bei der Herstellung von VEGF-C entfällt dieser Aufwand durch die einzelne Klinik. Der
Wachstumsfaktor kann industriell hergestellt und vertrieben werden, so dass auch Kliniken
und Institute, die weniger aufwendig eingerichtet sind, das Mittel beziehen können.
Das in dieser Dissertation vorgestellte Modell beschäftigt sich mit einer Transplantation, die
am gesunden Tier durchgeführt wurde.
Klinisch wäre es interessant zu untersuchen, ob die guten Regenerations- und
Wiederanschluss-Raten der Transplantate auch in einem Tiermodell mit einem bereits
ausgebildeten, chronischen Lymphödem bestehen blieben, denn viele Patientinnen leiden
bereits an einem Armlymphödem und hoffen auf eine chirurgische Therapie.
Nur wenn die Lymphknotenfragmente auch in ödematösem Gewebe ihre Funktion
aufnehmen, wäre diesen Frauen chirurgisch zu helfen.
Dass ein gesundes Gewebe nicht mit dem eines bereits bestehenden Lymphödems zu
vergleichen ist, ist in verschiedenen wissenschaftlichen Arbeiten belegt.
So beschreiben z.B. MORGAN et al. (2005), dass sich in ödematösem Gewebe, wenn es
unbehandelt bleibt, eine Fibrose entwickelt. Diese Fibrose besteht aus zwar verdicktem,
aber dennoch fragilem Gewebe (MORGAN et al. 2005).
Fibrotisches Gewebe birgt eine gravierende Problematik für das Vorhaben einer avaskulären
Transplantation: es hemmt die Lymphgefäßregeneration (AVRAHAM et al. 2009). Diese
äußert sich z.B. in der Entwicklung einer gestörten Proliferation der Lymphendothelzellen
und einer abnormalen lymphatischen Mikroarchitektur (AVRAHAM et al. 2009).
Es herrschen damit deutlich andere gewebsassoziierte Bedingungen bei einer Patientin mit
einem chronischen Lymphöden im Vergleich z.B. zu einer Patientin direkt nach einer
Axilladissektion vor.
Ein weiterer Faktor, der die erfolgreiche Transplantation und Funktionswiederaufnahme der
Lymphknotenfragmente in einem chronischen Lymphödem erschweren könnte, wurde
kürzlich von COUTO et al. (2011) beschrieben. Die Arbeit beschäftigt sich mit der
Problematik der Neovaskularisation in ödematösem Gewebe (COUTO et al. 2011).
Die Untersuchungen von COUTO et al. (2011) ergaben, dass eine Neovaskularisation in der
Pathogenese des Lymphödems unwahrscheinlich ist.
Diskussion
62
Dass die in der hier vorliegenden Dissertation beschriebenen Ergebnisse Wiederanschlüsse
der Transplantate und damit Gefäßbildungen, wenn auch in unterschiedlich ausgeprägtem
Maße, bei allen untersuchten Gruppen zeigen, mag daran liegen, dass die Transplantation an
gesunden Tieren stattfand. Ob VEGF-C eine Neovaskularisation auch in ödematösem
Gewebe zu stimulieren vermag, bleibt zu erforschen.
Die hier vorgestellte Methode der avaskulären, autologen Transplantation von
Lymphgefäßfragmenten würde sich zunächst einmal also hauptsächlich zur Prävention
eignen.
In der Klinik entwickeln ältere Frauen häufiger ein Lymphödem als junge. Dies wurde bereits
in den 80er Jahren von PEZNER et al. (1986) beschrieben. Die Rate für Frauen über 60 Jahre
liegt in der genannten Veröffentlichung bei 25%, die Rate für Frauen unter 60 Jahre liegt bei
nur 7%.
Die Tiere, die für die hier vorliegende Dissertation verwendet wurden, waren alle etwa 200g
schwer und damit im Durchschnitt 8-12Wochen alt. Es handelte sich also um zwar adulte,
aber junge Ratten.
Die Problematik, die im Alter entsteht, liegt in der Umstrukturierung der Lymphknoten. Die
Lymphknoten unterliegen im Laufe der Jahre histologischen Veränderungen (DENZ 1947 u.
HADAMITZKY et al. 2010). Diese bestehen beispielsweise aus unklar abgegrenzten B- und T-
Zellbereichen, dem Ersetzen lymphatischer Strukturen durch Bindegewebe und einer
generellen Degeneration (HADAMITZKY et al. 2010).
Aus diesem Wissen heraus müssten Studien vorgenommen werden, die sich mit den
histologischen Veränderungen von Ratten-Lymphknoten befassen und diese Veränderungen
mit den Ergebnissen aus der Studie von HADAMITZKY et al. (2010) vergleichen. Ziel wäre es,
ein Modell zu schaffen, das die alterstypischen Gewebsstrukturen abbildet und damit
klinikähnliche Bedingungen nachstellt.
Doch nicht nur das Alter hat einen Einfluss auf die Entstehung des Lymphödems, auch die
Zeitspanne zwischen der Brustkrebsbehandlung und dem Auftreten des Ödems ist nicht zu
vernachlässigen.
NORMAN et al. (2009) beschreiben, dass 80% der Patientinnen innerhalb der ersten 2 Jahre
nach der Axilladissektion on ein Lymphödem entwickeln. Wobei sich die Anzeichen eines
sekundären Lymphödems offenbar erst nach einigen Monaten entwickeln. Der Verlauf
dieser Entwicklung müsste aber erst noch weiter erforscht und mit Studien belegt werden.
Diskussion
63
Damit ein Tier in dieser Dissertation als „regeneriert“ eingestuft wurde, mussten seine
Transplantate bei der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung eine physiologische
Lymphknotenstruktur aufweisen. Damit ist anzunehmen, dass die transplantierten
Lymphknotenfragmente ihre drainierende Funktion wieder erfüllen können. Fraglich bleibt
jedoch, ob diese ihre Funktion auch über einen langen Zeitraum aufrechterhalten.
Alle Tiere bekamen in dieser Arbeit eine Ruhephase von 4 Wochen. Interessant, auch unter
dem Gesichtspunkt, den NORMAN et al. (2009) nannten, wäre die Überprüfung ob die
Verhinderung eines Ödems auch noch nach 4 Wochen besteht.
Eine Ödementwicklung bei Ratten zu detektieren und das Volumen zu messen, ist allerdings
problematisch. Dieser Problematik haben sich SOMMER et al. (2012 A) angenommen. Am
Menschen kommen i.d.R. das Maßband, die Wasserverdrängungs-Messung oder das
Perometer zum Einsatz. Diese Methoden sind, wie in der Veröffentlichung von SOMMER et
al. (2012 A) beschrieben, an der Ratte kaum durchzuführen. Die Untersuchungsergebnisse
aus der Arbeit zeigen, dass das Magnetic-Resonance-Imaging (MRI) eine geeignete Methode
ist, um auch bei kleinen Nagern eine Volumenmessung durchzuführen.
Der Aspekt der längeren Ruhephase ist insbesondere auch in Hinblick auf die Vorversuchs-
Ergebnisse nicht zu vernachlässigen. Die Regenerationsraten waren nach 8 Wochen (57% der
Tiere mit potentiell regenerierten Transplantaten) weniger erfolgversprechend als nach
4 Wochen (70% der Tiere mit regenerierten Transplantaten). Dies mag allerdings bei der
geringen Anzahl an Ratten (Vorversuch: 7 Tiere, Kontrollgruppe: 20 Tiere) noch nicht
aussagekräftig sein, denn statistisch wären diese feinen Unterschiede nicht zu belegen.
Dennoch sollte eine Untersuchung, wie sich die Zeit auf die Entwicklung der Transplantate
auswirkt, nicht ausbleiben.
Eine Möglichkeit, auch über einen längeren Zeitraum und zum wiederholten Mal an
demselben Tier den Lymphgefäßanschluss der Transplantate zu überprüfen, wäre die
intradermale Applikation eines Fluoreszenzfarbstoffes in die Oberschenkelinnenseite.
Die hier gewählte Methode des Patent-Blau-Spritzens bot sich deshalb an, weil damit eine
Euthanasie der Tiere und eine Transplantatentnahme verbunden waren. Die Tiere wurden
gespritzt, der Farbstoff verteilte sich über das superfizielle Lymphgefäßsystem und nach
zervikaler Dislokation und der Freipräparation des Gewebes konnten die angefärbten
lymphatischen Strukturen verfolgt werden.
Der Fluoreszenzfarbstoff Indocyanin Green (ICG) könnte hingegen auch am lebenden Tier
und wiederholt appliziert werden. Er wird, genau wie das Patent Blau, vom superfiziellen
Lymphsystem aufgenommen und über die afferenten Kollektoren auch zum Lymphknoten
geleitet und über die efferenten von ihm weg geleitet.
Bereits am Menschen ist diese Technik unter Operationen erprobt (OGATA et al. 2007 u.
POLOM et al. 2011). ICG ist in der Medizin bereits vielfach im Einsatz, z.B. bei der
Diskussion
64
SLN-Biopsie und Komplikationen bei der Gabe von ICG sind sehr selten (0,17%); können
jedoch bei Patienten, die allergische Reaktionen auf Jod aufweisen, auftreten (OGATA et al.
2007). Sie äußern sich in der Regel in Übelkeit und Fieber (OGATA et al. 2007).
Sichtbargemacht, wird der Farbstoff durch die Verwendung einer speziellen Apparatur, die
als Photodynamic Eye (PDE) bezeichnet wird. Das PDE wird von der Firma Hamamatsu (Sitz
Japan) hergestellt und besteht aus einer CCD-Kamera, die als Detektor fungiert, speziellen
lichtemittierenden Dioden (LED) und einem Lichtfilter (OGATA et al. 2007).
Strukturen können mit ICG durch Weichteilgewebe bis zu 1cm Tiefe mit dem PDE sichtbar
gemacht werden (POLOM et al. 2011). Auch bei der Ratte wurde ICG bereits in Verbindung
mit einem Rattenschwanz-Ödem-Modell eingesetzt und damit das Schwanzvolumen durch
die Intensität der Fluoreszenz bestimmt (SERIZAWA et al. 2011).
Da die Verwendung der Indocyaninmethode und des PDE im o.g. Ratten-Modell erst nach
Abschluss der Versuche dieser Dissertation veröffentlicht wurden, konnten sie hier noch
keine Anwendung finden. Bei zukünftigen Versuchen sollte eine Untersuchung mittels
Indocyanin und PDE aber angestrebt werden.
Ein sekundäres Lymphödem kann als Folge der Behandlung unterschiedlichster Krebsarten,
wie dem Hautkrebs, Vulva-, Zervix- oder Peniskarzinomen und dem Brustkrebs entstehen.
Die Therapie von Brustkrebs hat sich in den letzten Jahren sehr gewandelt. Doch trotz der
Verwendung von immer gering-invasiveren Methoden gelingt es bisher nicht, das Auftreten
eines sekundären Lymphödems zu verhindern. Bis zu 30% der Frauen leiden unter dieser
Krankheit nach einer Brustkrebstherapie mit Entfernung der Achsellymphknoten (WILLIAMS
et al. 2005). Doch auch nach der weniger invasiven SLN-Biopsie ohne weitere Intervention
bilden noch bis zu 22% der Patientinnen ein sekundäres Lymphödem aus (GOLDBERG et al.
2011).
Der chirurgische Eingriff scheint damit nicht allein ursächlich für die Entstehung des
Lymphödems und tatsächlich führen neueste Forschungsergebnisse auch noch eine weitere
Ursache für die Entstehung des sekundären Lymphödems an: ein Gendeffekt.
FINEGOLD et al. (2012) veröffentlichten kürzlich, dass Mutationen des Gens „Connexin 47“
das Risiko für ein sekundäres Lymphödem nach einer Brustkrebstherapie erhöht. Außerdem
vermuten FINEGOLD et al. (2012), dass dieser Gendeffekt erst dann zu einem sekundären
Lymphödem führt, wenn sich lokal die Bedingungen durch eine Behandlung für das Gewebe
ändern, wie also unter einer Axilladissektion, als auch unter einer SLN-Biopsie.
Diese Erkenntnis könnte dazu genutzt werden, in Zukunft diejenigen Frauen zu bestimmen,
welche besonders für ein sekundäres Lymphödem prädisponiert sind und insbesondere
Ihnen mit einem präventiven chirurgischen Eingriff zu helfen.
Diskussion
65
5.4. Schlussfolgerung
In dieser Dissertation konnte gezeigt werden, dass eine avaskuläre Transplantation autologer
Lymphknotenfragmente möglich und die Modifikation der Operationstechnik auf Grund der
dadurch geringeren Substanzverluste des Transplantats und der Verhinderung mechanischer
Reize sinnvoll ist.
Außerdem wurde bestätigt, dass VEGF-C sowohl die Regeneration als auch den
Wiederanschluss der Transplantate an das Lymphgefäßsystem fördert.
Ein früher Zeitpunkt an den Tagen 1, 2 und 3 post OP sowie eine intrakutane Applikation von
VEGF-C in die mediale Seite des Oberschenkels fördern dabei statistisch erwiesen
insbesondere den Transplantat-Wiederanschluss. Ein positiver Einfluss auf die Regeneration
der Transplantate ist auf Grund guter p-Werte anzunehmen, diese waren für den Nachweis
einer statistischen Signifikanz jedoch nicht ausreichend.
Besonders deutlich waren die Ergebnisse bei der Untersuchung des Einflusses der Dosis auf
den Wiederanschluss und die Regeneration der Transplantate.
Eine Dosis von 13,34 µg VEGF-C fördert beide Untersuchungs-Kriterien erheblich.
Durch die in dieser Dissertation präsentierten Ergebnisse zu der Modifikation der
Operationstechnik unter einer avaskulären Transplantation wurde ein Tier-Modell für die
Untersuchung der transplantierten Lymphknotenfragmente geschaffen, das neben der
Verhinderung der Migration eine Unversehrtheit der Transplantate in Zukunft gewährleistet.
Die vorliegenden Ergebnisse der wissenschaftlichen Untersuchungen bestätigten außerdem
zum einen, dass der chirurgische Therapieansatz einer avaskulären Transplantation
autologer Lymphknotenfragment eines sekundären Lymphödems möglich ist.
Zum anderen zeigen sie eindrucksvoll, dass VEGF-C insbesondere den Wiederanschluss der
Regenerate, in einer hohen Dosis aber auch die Regeneration fördert und dass die
Applikation-Parameter „Zeitpunkt“, „Lokalisation“ und „Dosis“ einen vielfältigen Einfluss auf
den Wiederanschluss und die Regeneration haben. Durch diese Erkenntnisse rückt die
Möglichkeit eine avaskuläre Transplantation autologer Lymphknotenfragmente,
insbesondere in Zusammenhang mit einer Prävention des sekundären Lymphödems, auch in
klinischen Studien zu testen näher.
Eine präventive chirurgische Maßnahme zur Verhinderung eines sekundären Lymphödems
wäre für die Patientinnen unter Umständen die einzige Möglichkeit nicht lebenslang auf eine
symptomorientierte Therapie angewiesen zu sein.
Zusammenfassung
66
6. Zusammenfassung
Lia Schindewolffs:
Die Transplantation autologer Lymphknotenfragmente als Therapiemöglichkeit des
sekundären Lymphödems
Einfluss der VEGF-C-Applikationsparameter auf die Regeneration und den
Wiederanschluss der Transplantate
Ein effektiver Transport von Körperflüssigkeiten ist nur durch ein funktionstüchtiges
Lymphsystem zu gewährleisten. Nach einer Entfernung der Lymphknoten in der Axilla im
Rahmen einer Brustkrebstherapie kann das Gleichgewicht aus anfallender Lymphflüssigkeit
und dem Abtransport dieser gestört sein. Dies resultiert in einem sekundären Lymphödem
bei etwa 30% der Patientinnen. Die Therapie für das sekundäre Lymphödem ist bisher rein
symptomorientiert.
Ein chirurgischer Therapieansatz ist die avaskuläre Transplantation autologer
Lymphknotenfragmente. Diese wurde in der Vergangenheit zur Prävention eines sekundären
Lymphödems an der Ratte erforscht. Dabei konnte ein positiver Effekt von VEGF-C
festgestellt werden.
Die VEGF-C-Applikations-Parameter „Zeitpunkt“, „Lokalisation“ und „Dosis“ waren bislang
jedoch nicht untersucht worden.
Das Ziel der Arbeit war es, die Grundlagen und Methoden dieses Ratten-Modells
aufzugreifen und zu verbessern, indem die Applikations-Parameter auf ihre Einflüsse auf die
Regeneration und den Wiederanschluss der Transplantate untersucht wurden.
Außerdem wurden die Effekte einer längeren Ruhephase von 8 Wochen auf die
Regeneration der Transplantate wurden in Form einer Vorversuchsgruppe erforscht.
Die Operationstechnik des Ratten-Modells verursachte allerdings Probleme bei der
Entnahme der Transplantate. In den meisten Fällen verwuchsen diese während der
Ruhephase mit dem Knoten des Nahtmaterials, so dass ihre Entfernung nur unter
Substanzverlusten möglich wurde.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit bestand somit darin, die chirurgische Technik dahingehend zu
modifizieren, dass eine substanzverlustfreie Entnahme der Transplantate durchgeführt
werden kann.
Zusammenfassung
67
Sechsundneunzig adulten, gesunden, weiblichen Lewis Ratten (durchschnittliches
Gewicht: 200g) wurden alle poplitealen und inguinalen Lymphknoten der rechten
Körperhälfte entfernt. Drei der inguinalen Lymphknoten wurden fragmentiert und subkutan
zurück in die rechte Leiste transplantiert. Dabei wurde die Operationstechnik dahingehend
modifiziert, dass eine Verwachsung der Transplantate mit dem Knoten verhindert wird.
Gruppe A (n=10) erhielt eine intradermale Injektion von 6,67 µg VEGF-C pro Ratte an den
Tagen 1, 2 und 3 post OP in Bauchwand nahe des Transplantationsgebietes.
Die Tiere in Gruppe B (n=19) erhielten die gleiche Dosis VEGF-C zum gleichen Zeitpunkt wie
die Gruppe A, allerdings erfolgte die Injektion intrakutan in die mediale Seite des rechten
Oberschenkels. In der Gruppe C (n=20) wurden die Ratten wie die in Gruppe A behandelt,
erhielten VEGF-C jedoch an den Tagen 14, 15 und 16 post OP. Auch in Gruppe D (n=20)
wurden die gleichen Parameter wie in der Gruppe A gewählt, allerdings wurde die Dosis auf
13,34 µg VEGF-C verdoppelt. Die Gruppe E (n=20) fungierte als Kontrollgruppe und erhielt
keine VEGF-C-Applikation. Die Tiere in der Vorversuchsgruppe (n=7) bekamen wie die in der
Kontrollgruppe auch kein VEGF-C.
Nach entweder 4 (Gruppe A-E) oder 8 (Vorversuchsgruppe) Wochen Ruhephase wurde die
Verbindung der Transplantate mit dem Lymphsystem und die Lymphdrainage-Fähigkeit der
Transplantate überprüft. Zu diesem Zweck wurde Patent Blau intrakutan in den ipsilateralen
Oberschenkel injiziert. Die Verteilung des Farbstoffes wurde anschließend überprüft und die
Tiere wurden in „Ratte mit Transplantat-Wiederanschluss“ und „Ratte ohne Transplantat-
Wiederanschluss“ eingestuft. Anschließend wurden die Transplantate entnommen und es
erfolgte eine HE-Färbung (Vorversuchsgruppe, Gruppe A-E) und eine immunhistochemische
Färbung (Gruppe A-E), um die Regenerate auf ihre physiologische Verteilung von
B- und T-Lymphozyten, HEVs und Lymphendothelzellen zu überprüfen.
Die Tiere wurden nach der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung ihrer Transplantate in
„Ratte mit regenerierten Transplantaten“ oder „Ratte ohne regenerierte Transplantate“
eingestuft.
Vorversuch: Nach einer achtwöchigen Ruhephase waren bei 4 von 7 Tieren (57%) potentiell
regenerierte Transplantate festzustellen. In der Kontrollgruppe, in der die Tiere 4 Wochen
Ruhephase hatten, waren nach der Immunhistochemie bei 14 von 20 Tieren (70%)
regenerierte Transplantate vorhanden.
Chirurgische Modifikation: Bei keiner der Ratten kam es zu Verwachsungen der
Transplantate mit dem Knoten des Nahtmaterials und bei nur 2 der Ratten (2%) waren die
Transplantate bei der Entnahme nicht mehr am Nahtmaterial, sondern in der nahen
Umgebung des Transplantationsgebietes aufzufinden.
Zusammenfassung
68
Transplantat-Wiederanschluss mit dem Lymphsystem: In der Gruppe A konnte bei 5 von 10
Tieren (50%) ein Wiederanschluss beobachtet werden. In der Gruppe B waren es 10 von 19
(53%) und in der Gruppe C 7 von 20 (35%) Tieren. Die Gruppe D wies 17 von 20 Tieren (85%)
mit einem Wiederanschluss an das Lymphsystem auf; die Gruppe E nur 3 von 20 Tieren
(15%).
Regeneration der Transplantate: In der Gruppe A konnten bei 8 von 10 Tieren (80%)
regenerierte Transplantate festgestellt werden; in der Gruppe B waren es 17 von 19 Tieren
(89%). Bei der Gruppe C wiesen 17 von 20 Tieren (85%) regenerierte Lymphknotenfragmente
auf und bei der Gruppe D waren es 18 von 19 Tieren (95%). In der Kontrollgruppe (Gruppe E)
konnten dagegen nur 14 von 20 Ratten (70%) mit regenerierten Transplantaten gefunden
werden.
Die hier vorliegende Dissertation hat bestätigt, dass eine avaskuläre Transplantation
autologer Lymphknotenfragmente möglich ist und sich eine verlängerte Ruhephase von
8 Wochen nicht in besseren Regenerations-Raten der Transplantate widerspiegelt.
Eine Modifikation der Operationstechnik hat sich als sinnvoll erwiesen und führt zu einer
leichten Entnahme der Transplantate ohne Substanzverlust.
Darüber hinaus wurde eindrucksvoll gezeigt, dass sich die VEGF-C-Applikations-Parameter
unterschiedlich auf die Regeneration und den Wiederanschluss der Transplantate auswirken
und VEGF-C diese beiden Untersuchungs-Fokusse generell fördert.
Ein früher Zeitpunkt an den Tagen 1, 2 und 3 post OP sowie die intradermale Injektion von
VEGF-C in die mediale Oberschenkelseite stimulieren den Wiederanschluss der
Transplantate an das Lymphgefäßsystem. Eine Förderung der Regeneration konnte in
diesem Zusammenhang statistisch jedoch nicht erwiesen werden.
Nur die Dosis wirkt sich sowohl auf den Wiederanschluss als auch auf die Regeneration der
Transplantate statistisch relevant aus. Eine Dosis von 13,34 µg fördert eine Regeneration
statistisch tendenziell und einen Wiederanschluss statistisch höchst signifikant.
Diese Dissertation bestätigt, dass eine avaskuläre Transplantation autologer
Lymphknotenfragmente eine mögliche Therapie für das sekundäre Lymphödem ist.
Insbesondere in Form einer präventiven chirurgischen Maßnahme könnte diese Methode in
Zukunft bedeutsam sein.
Summary
69
7. Summary
Lia Schindewolffs (2012)
The transplantation of autologous lymph node fragments as a possible secondary
lymphedema therapy
Influence of the VEGF-C application parameters on the regeneration of the transplants and
the reconnection with the lymphatic system
An effective transport of body fluids is only guaranteed by a functional lymphatic
system. Within the context of an axillary dissection during breast cancer treatment this
balance can be disturbed, resulting in a secondary lymphedema in about 30% of the
patients. The therapy of secondary lymphedema is only symptomatical so far.
As a possible surgical therapy, fragments of autologous lymph nodes had been transplanted
to prevent lymphedema in rats. VEGF-C showed a beneficial effect in this context.
The VEGF-C application pattern with regards to the parameters “time point”, “location” and
“dosage” remained unexplored.
The aim of this study was to verify these parameters and determine their effects on the
regeneration and reconnection of the transplants by using this rat model.
In addition, the effects of an extended recovery period (8 weeks) on the regeneration of the
transplants were also investigated.
During the studies the surgical technique of this rat model caused difficulties regarding the
transplant removal. The transplants got attached to the node of the suture, thus the
sampling was only manageable with a loss of transplant substance.
Therefore, the secondary aim consisted in altering the technique so that a removal without
any loss of the substance is possible.
Summary
70
Ninety-six adult, healthy female Lewis rats (approximately 200g) underwent surgery,
in which all right popliteal and inguinal lymph nodes were removed. Three inguinal lymph
nodes of each rat were fragmented and transplanted back into the subcutaneous fat tissue
of their right groin by using the modified surgical procedure in which an attachment of the
transplants to the node was avoided.
The rats in group A (10 rats) were injected with 6.67µg VEGF-C per rat intradermally into the
right abdominal wall close to the transplantation area on day 1, 2, 3 post OP.
All animals in group B (19 rats) were given 6.67µg VEGF-C per rat intradermally in the medial
side of the right thigh on day 1, 2, 3 post OP. In group C all rats (20) were injected with the
same dosage of VEGF-C and at the same location as group B, but on day 14, 15, 16 post OP.
The rats in group D (20 rats) were injected 13.34µg VEGF-C per rat on the same time points
and location as group B.
In group E (20 rats) there was no further intervention after surgery, likewise in the pilot
group (7 rats).
After 4 weeks (group A-E) or 8 weeks (pilot group) the lymphatic drainage and the
connection of lymphatic vessels with the transplants were tested. Therefore, Patent Blue
was injected intradermally into the medial side of the right thigh. The distribution of the dye
was examined and graded as “rat with transplant reconnection” or “rat without transplant
reconnection”. Afterwards the transplants were prepared for HE staining (pilot group, group
A-E) and immunohistochemistry (group A-E) to detect T-lymphocytes, B-lymphocytes, HEVs
and lymphatic endothelial cells.
The rats were graded as “rat with regenerated transplants” or “rat without regenerated
transplants” due to the cell distribution detected by fluorescent immunohistochemistry.
Pilot Study: After a recovery period of 8 weeks 4 out of 7 (57%) rats showed possibly
regenerated lymph nodes. In group E 14 out of 20 (70%) of the animals revealed regenerated
lymph nodes after a recovery period of 4 weeks.
Surgery modification: The removed transplants showed no attachment to the node of the
suture and in only 2 of the rats (2%) were the transplants found in the close surrounding of
the transplantation area; they did not remain fixed to the non-absorbable suture.
Transplant reconnection with the lymphatic system: In group A 5 out of 10 rats (50%)
showed a reconnection of the transplants with the lymphatic system. In group B 10 out of 19
rats (53%) and in group C 7 out of 20 rats (35%) had a reconnection of the transplants. In
group D there were 17 out of 20 rats (85%) with a detectable transplant reconnection. The
control group (group E) showed a reconnection in only 3 out of 20 rats (15%).
Summary
71
Transplant regeneration: In group A 8 out of 10 rats (80%) and in group B 17 out of 19 rats
(89%) showed regenerated lymph nodes. In group C there were 17 out of 20 rats (85%) with
a successful regeneration of the transplants and in group D there were 18 out of 19 rats
(95%). The control group (group E) showed 14 out of 20 rats (70%) with regenerated lymph
nodes.
This work shows that an avascular transplantation of autologous lymph node
fragments is possible and that an extended recovery period does not result in better
regeneration rates. A change in the surgical procedure leads to an easier sampling while
avoiding loss of substance.
Furthermore, VEGF-C enhances the regeneration of the transplants and the reconnection of
lymph node fragments with the lymphatic system.
An early time point on days 1, 2 and 3 post OP and the intradermal injection into the medial
side of the thigh especially improve the reconnection of the transplants with the lymphatic
system. The modifications in both of the parameters do not affect the regeneration of the
transplants statistically.
Only the dosage shows an effect on the transplant reconnection as well as the transplant
regeneration. A dosage of 13.34 µg VEGF-C revealed a statistical tendency to improve
regeneration; it also enhances the reconnection extremely significantly.
This study confirms that the avascular transplantation of autologous lymph node
fragments is a possible therapy for secondary lymphedema, especially with respect to the
prevention after breast cancer treatment.
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Anhang
80
9. Anhang
9.1. Verzeichnis verwendeter Abkürzungen
AG Aktiengesellschaft
AK Antikörper
AQP-1 Aquaporin – 1
C Celsius
cm Zentimeter
DC Dendritic Cell, Dendritische Zellen
FDC Follicular Dendritic Cells
g Gramm
GLP Good Laboratory Praxis
GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung
HE Hämatoxylin-Eosin
HEV Hochendotheliale Venule
ICG Indocyanin Green
IDC Interdigitierende dendritische Zellen
IHC Immunhistochemie
kg Kilogramm
Anhang
81
LAVES Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und
Lebensmittelsicherheit
LED Lichtemittierende Dioden
Lnn. Lymphonodi
LYVE-1 Lymphatic Vessel Hyaluronan Receptor – 1
mm Millimeter
mg Milligramm
µ Mikro
MRI Magnet-Resonance-Imaging
n Anzahl
NaCl Natriumchlorid
PBS Phosphate Buffered Saline
PDE Photodynamic Eye
Prox-1 Prospero-Related Homeobox Transcprition Factor – 1
SLN Sentinel Lymph Node, Wächterlymphknoten
STS Stewart-Treves-Syndrom
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
VEGF-C Vascular Endothelial Growth Factor – C
VEGFR-3 Vascular Endtohelial Growth Factor Receptor – 3
Anhang
82
9.2. Verzeichnis verwendeter Abbildungen
Abbildung 1.: „Schema der Kompartimentierung des Lymphknotens“ PABST (2008):
Die Abbildung stellt die Aufteilung in Cortex, Paracortex und Medulla,
den Blut- und Lymphfluss, sowie die verschiedenen Zellen des
Lymphknotens dar.
Abbildung 2.: Übersicht über die Versuchsgruppen.
Abbildung 3.: Übersicht über die Gruppen, die zur Bestimmung des Parameters
„Zeitpunkt“ miteinander verglichen wurden.
Abbildung 4.: Übersicht über die Gruppen, die zur Bestimmung des Parameters
„Lokalisation“ miteinander verglichen wurden.
Abbildung 5.: Übersicht über die Gruppen, die zur Bestimmung des Parameters
„Dosis“ miteinander verglichen wurden.
Abbildung 6.: Transplantationsvorgang: Aufsuchen des subkutanen Fettgewebes in
der Leiste (a), Durchstechen des Fettposters mit nicht resorbierbarem
Nahtmaterial (b), Auffädeln der Lymphknotenfragmente (c), erneutes
Durchstechen des Fettpolsters (d), Verknoten des Nahtmaterials (e)
und Verschließen der Wunde mit resorbierbarem Nahtmaterial (f).
Abbildung 7.: Position der Patentblau-Applikation in die mediale Seite des
Oberschenkels und Verteilung des Farbstoffes über das superfizielle
Lymphsystem.
Abbildung 8.: Darstellung eines Transplantats mit Wiederanschluss an das
Lymphgefäßsystem. Erkennbar sind zu- und ableitendes Lymphgefäß
(schwarzer Pfeil) sowie die Fixierung des Transplantats mit nicht
resorbierbarem Nahtmaterial (weißer Pfeil). Das Transplantat ist
eingebettet in Fettgewebe und noch nicht frei präpariert.
Abbildung 9.: Darstellung eines entnommenen und angefärbten Transplantats
Abbildung 10.: Diagramm über den Transplantat-Wiederanschluss der einzelnen
Gruppen.
Anhang
83
Abbildung 11.: Diagramm über den Transplantat-Wiederanschluss der einzelnen
Gruppen in Prozent.
Abbildung 12.: Diagramm über die miteinander verglichenen Gruppen und ihrer
ermittelten Signifikanzstufen für den Parameter „Zeitpunkt“ bezogen
auf den Transplantat-Wiederanschluss.
Abbildung 13.: Diagramm über die miteinander verglichenen Gruppen und ihrer
ermittelten Signifikanzstufen für den Parameter „Lokalisation“
bezogen auf den Transplantat-Wiederanschluss.
Abbildung 14.: Diagramm über die miteinander verglichenen Gruppen und ihrer
ermittelten Signifikanzstufen für den Parameter „Dosis“ bezogen auf
den Transplantat-Wiederanschluss.
Abbildung 15.: a. HE-Färbung eines nekrotisierten Transplantats in der Vergrößerung:
5x; b. HE-Färbung eines potentiellen Regenerats in der Vergrößerung:
5x
Abbildung 16.: Ein regeneriertes Lymphknotenfragment nach Immunhistochemie. a.
Die Zellkernfärbung (DAPI); b. die T-Lymphozyten (1.Ak R73, 2.Ak FITC)
befinden sich im parakortikalen Bereich des Lymphknotens; c. die B-
Lymphozyten (1.Ak BM 4013, 2. Ak AF 564) sind randständig. d.
Zusammengefügte Darstellung der B- und T-Zellen (d). Vergrößerung
(a-d): 5x.
Abbildung 17.: Ein nicht regeneriertes Lymphknotenfragment nach
Immunhistochemie. a. die Zellkernfärbung (DAPI); b. die T-
Lymphozyten (1.Ak R73, 2.Ak FITC) befinden sich zwar vorwiegend,
jedoch nicht deutlich abgegrenzt, im parakortikalen Bereich des
Lymphknotens; c. die B-Lymphozyten (1.Ak BM 4013, 2.Ak AF 564) sind
zudem nicht randständig angeordnet, sondern diffus auch über den
kortikalen Bereich hinaus verteilt. d. zusammengefügte Darstellung der
B- und T-Zellen. Vergrößerung (a-d): 5x.
Abbildung 18.: Ein nicht regeneriertes Transplantat. a. Zellkernfärbung (DAPI); b. HEV-
Färbung (1.Ak His 52, 2.Ak Cy3) mittels Immunhistochemie.
Vergrößerung 5x (a,b).
Abbildung 19.: Regenerierte Lymphknotenfragmente. a. HEVs (1.Ak His 52, 2.Ak Cy3)
in der Vergrößerung 10x; b. in der Vergrößerung 40x nach der
Immunhistochemie.
Anhang
84
Abbildung 20.: Ein nicht regeneriertes Lymphknotenfragment. a. die Zellkern-Färbung
(DAPI); b. die Lymphendothel-Färbung (1. Ak LYVE-1, 2. Ak Cy3) mittels
Immunhistochemie in der Vergrößerung 5x (a,b).
Abbildung 21.: Ein regeneriertes Lymphknotenfragment. a. die Lymphendothel-
Färbung (1. Ak LYVE-1, 2. Ak Cy3) in der Vergrößerung 5x und b. in der
Vergrößerung 40x (b).
Abbildung 22.: Diagramm über die Transplantat-Regeneration der einzelnen Gruppen.
Abbildung 23.: Diagramm über die Transplantat-Regeneration der einzelnen Gruppen
in Prozent.
Abbildung 24.: Diagramm über die miteinander verglichenen Gruppen und ihrer
ermittelten Signifikanzstufen für den Parameter „Zeitpunkt“ bezogen
auf die Transplantat-Regeneration.
Abbildung 25.: Diagramm über die miteinander verglichenen Gruppen und ihrer
ermittelten Signifikanzstufen für den Parameter „Lokalisation“
bezogen auf die Transplantat-Regeneration.
Abbildung 26.: Diagramm über die miteinander verglichenen Gruppen und ihrer
ermittelten Signifikanzstufen für den Parameter „Dosis“ bezogen auf
die Transplantat-Regeneration.
Anhang
85
9.3. Verzeichnis verwendeter Tabellen
Tabelle 1.: Liste der primären und sekundären Antikörper (AK) und ihrer Herkunft.
Tabelle 2.: Übersicht über die Signifikanzstufen
Tabelle 3.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der
Gruppe E mit der Gruppe B.
Tabelle 4.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der
Gruppe E mit der Gruppe C.
Tabelle 5.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der
Gruppe B mit der Gruppe C.
Tabelle 6.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der
Gruppe E mit der Gruppe A.
Tabelle 7.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der
Gruppe A mit der Gruppe B.
Tabelle 8.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der
Gruppe E mit der Gruppe D.
Tabelle 9.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der
Gruppe B mit der Gruppe D.
Tabelle 10.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der
Gruppe E mit der Gruppe B.
Tabelle 11.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der
Gruppe E mit der Gruppe C.
Tabelle 12.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der
Gruppe B mit der Gruppe C.
Tabelle 13.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der
Gruppe E mit der Gruppe A.
Anhang
86
Tabelle 14.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der
Gruppe A mit der Gruppe B.
Tabelle 15.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der
Gruppe E mit der Gruppe D.
Tabelle 16.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der
Gruppe B mit der Gruppe D.
Anhang
87
9.4. Details zur Statistik
Ergebnisse aus dem Programm PrismGraph 5.02, tabellarisch:
9.4.1. Ergebnisse zum Wiederanschluss der Transplantate mit dem Lymphsystem
Table Analyzed
Transplantat-Wiederanschluss: Gruppe E
(Kontrolle) gegen Gruppe B (6,67µg VEGF-C und
Tag 1,2,3 Oberschenkelinnenseite)
Fisher's exact test
P value 0,0187
P value summary *
One- or two-sided Two-sided
Statistically significant?
(alpha<0.05) Yes
Strength of association
Odds ratio 6,296
95% confidence interval 1.373 to 28.87
Data analyzed Col A Col B Total
Row 1 17 9 26
Row 2 3 10 13
Total 20 19 39
Tabelle 3.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der Gruppe E mit der
Gruppe B.
Anhang
88
Table Analyzed
Transplantat-Wiederanschluss: Gruppe E
(Kontrolle) gegen Gruppe C (6,67µg VEGF-C und
Tag 14,15,16 Oberschenkelinnenseite)
Fisher's exact test
P value 0,2733
P value summary ns
One- or two-sided Two-sided
Statistically significant?
(alpha<0.05) No
Strength of association
Odds ratio 3,051
95% confidence interval 0.6583 to
14.14
Data analyzed Col A Col B Total
Row 1 17 13 30
Row 2 3 7 10
Total 20 20 40
Tabelle 4.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der Gruppe E mit der
Gruppe C.
Anhang
89
Table Analyzed
Transplantat-Wiederanschluss: Gruppe B (6,67µg
VEGF-C und Tag 1,2,3 Oberschenkelinnenseite)
gegen Gruppe C (6,67µg VEGF-C und Tag 14,15,16
Oberschenkelinnenseite)
Fisher's exact test
P value 0,3406
P value summary ns
One- or two-sided Two-sided
Statistically significant?
(alpha<0.05) No
Strength of association
Odds ratio 0,4846
95% confidence interval 0.1338 to
1.755
Data analyzed Col A Col B Total
Row 1 9 13 22
Row 2 10 7 17
Total 19 20 39
Tabelle 5.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der Gruppe B mit der
Gruppe C.
Anhang
90
Table Analyzed Transplantat-Wiederanschluss: Gruppe E (Kontrolle) gegen
Gruppe A (6,67µg VEGF-C und Tag 1,2,3 Bauchwand)
Fisher's exact test
P value 0,0778
P value summary ns
One- or two-sided Two-sided
Statistically
significant?
(alpha<0.05)
No
Strength of
association
Odds ratio 5,667
95% confidence
interval
0.9898 to
32.44
Data analyzed Col A Col B Total
Row 1 17 5 22
Row 2 3 5 8
Total 20 10 30
Tabelle 6.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der Gruppe E mit der
Gruppe A.
Anhang
91
Table Analyzed
Transplantat-Wiederanschluss: Gruppe A
(6,67µg VEGF-C Tag 1,2,3 Bauchwand) gegen
Gruppe B (6,67µg VEGF-C Tag 1,2,3
Oberschenkelinnenseite)
Fisher's exact test
P value 1
P value summary ns
One- or two-sided Two-sided
Statistically significant?
(alpha<0.05) No
Strength of association
Odds ratio 1,111
95% confidence interval 0.2400 to
5.144
Data analyzed Col A Col B Total
Row 1 5 9 14
Row 2 5 10 15
Total 10 19 29
Tabelle 7.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der Gruppe A mit der
Gruppe B.
Anhang
92
Table Analyzed
Transplantat-Wiederanschluss: Gruppe E
(Kontrolle) gegen Gruppe D (13,34µg VEGF-C und
Tag 1,2,3 Oberschenkelinnenseite)
Fisher's exact test
P value P<0.0001
P value summary ***
One- or two-sided Two-sided
Statistically significant?
(alpha<0.05) Yes
Strength of association
Odds ratio 22,67
95% confidence interval 4.372 to
117.5
Data analyzed Col A Col B Total
Row 1 17 4 21
Row 2 3 16 19
Total 20 20 40
Tabelle 8.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der Gruppe E mit der
Gruppe D.
Anhang
93
Table Analyzed
Transplantat-Wiederanschluss: Gruppe B (6,67µg
VEGF-C und Tag 1,2,3 Oberschenkelinnenseite)
gegen Gruppe D (13,34µg VEGF-C und Tag 1,2,3
Oberschenkelinnenseite)
Fisher's exact test
P value 0,0407
P value summary *
One- or two-sided Two-sided
Statistically significant?
(alpha<0.05) Yes
Strength of association
Odds ratio 5,1
95% confidence interval 1.112 to
23.38
Data analyzed Col A Col B Total
Row 1 9 3 12
Row 2 10 17 27
Total 19 20 39
Tabelle 9.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der Gruppe B mit der
Gruppe D.
Anhang
94
9.4.2. Ergebnisse zur Regeneration der Transplantate
Table Analyzed Regeneration: Gruppe E (Kontrolle) gegen Gruppe B (6,67µg
VEGF-C und Tag 1,2,3 Oberschenkelinnenseite)
Fisher's exact test
P value 0,2351
P value summary ns
One- or two-sided Two-sided
Statistically
significant?
(alpha<0.05)
No
Strength of
association
Odds ratio 3,643
95% confidence
interval
0.6330 to
20.97
Data analyzed Col A Col B Total
Row 1 6 2 8
Row 2 14 17 31
Total 20 19 39
Tabelle 10.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der Gruppe E mit der
Gruppe B.
Anhang
95
Table Analyzed Regeneration: Gruppe E (Kontrolle) gegen Gruppe C (6,67µg
VEGF-C und Tag 14,15,16 Oberschenkelinnenseite)
Fisher's exact test
P value 0,4506
P value summary ns
One- or two-sided Two-sided
Statistically
significant?
(alpha<0.05)
No
Strength of
association
Odds ratio 2,429
95% confidence
interval
0.5122 to
11.52
Data analyzed Col A Col B Total
Row 1 6 3 9
Row 2 14 17 31
Total 20 20 40
Tabelle 11.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der Gruppe E mit der
Gruppe C.
Anhang
96
Table Analyzed
Regeneration: Gruppe B (6,67µg VEGF-C und Tag 1,2,3
Oberschenkelinnenseite) gegen Gruppe C (6,67µg VEGF-C
und Tag 14,15,16 Oberschenkelinnenseite)
Fisher's exact test
P value 1
P value summary ns
One- or two-sided Two-sided
Statistically
significant?
(alpha<0.05)
No
Strength of
association
Odds ratio 0,6667
95% confidence
interval
0.09854 to
4.510
Data analyzed Col A Col B Total
Row 1 2 3 5
Row 2 17 17 34
Total 19 20 39
Tabelle 12.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der Gruppe B mit der
Gruppe C.
Anhang
97
Table Analyzed
Regeneration: Gruppe E (Kontrolle) gegen
Gruppe A (6,67µg VEGF-C und Tag 1,2,3
Bauchwand)
Fisher's exact test
P value 0,6821
P value summary ns
One- or two-sided Two-sided
Statistically significant?
(alpha<0.05) No
Strength of association
Odds ratio 1,714
95% confidence interval 0.2774 to
10.59
Data analyzed Col A Col B Total
Row 1 6 2 8
Row 2 14 8 22
Total 20 10 30
Tabelle 13.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der Gruppe E mit der
Gruppe A.
Anhang
98
Table Analyzed
Regeneration: Gruppe A (6,67µg VEGF-C und Tag 1,2,3
Bauchwand) gegen Gruppe B (6,67 µg VEGF-C und Tag 1,2,3
Oberschenkelinnenseite)
Fisher's exact test
P value 0,592
P value summary ns
One- or two-sided Two-sided
Statistically
significant?
(alpha<0.05)
No
Strength of
association
Odds ratio 2,125
95% confidence
interval
0.2518 to
17.94
Data analyzed Col A Col B Total
Row 1 2 2 4
Row 2 8 17 25
Total 10 19 29
Tabelle 14.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der Gruppe A mit der
Gruppe B.
Anhang
99
Table Analyzed Regeneration: Gruppe E (Kontrolle) gegen Gruppe D (13,34µg
VEGF-C und Tag 1,2,3 Oberschenkelinnenseite)
Fisher's exact test
P value 0,0915
P value summary ns
One- or two-sided Two-sided
Statistically
significant?
(alpha<0.05)
No
Strength of
association
Odds ratio 7,714
95% confidence
interval
0.8297 to
71.73
Data analyzed Col A Col B Total
Row 1 6 1 7
Row 2 14 18 32
Total 20 19 39
Tabelle 15.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der Gruppe E mit der
Gruppe D.
Anhang
100
Table Analyzed
Regernation: Gruppe B (6,67 µg VEGF-C und Tag 1,2,3
Oberschenkel) gegen Gruppe D (13,34µg VEGF-C und Tag 1,2,3
Oberschenkelinnenseite)
Fisher's exact test
P value 1
P value summary ns
One- or two-sided Two-sided
Statistically
significant?
(alpha<0.05)
No
Strength of
association
Odds ratio 2,118
95% confidence
interval
0.1754 to
25.56
Data analyzed Col A Col B Total
Row 1 2 1 3
Row 2 17 18 35
Total 19 19 38
Tabelle 16.: Resultate des Programms GraphPad Prism 5.02 bei Vergleich der Gruppe B mit der
Gruppe D.
Danksagungen
101
10. Danksagungen
Mein besonderer Dank geht an Herrn Prof. Reinhard Pabst für die Überlassung eines so
interessanten Themas und die tolle Unterstützung und Beratung bei meinen Fragen, Ideen
und Vorhaben. Ich habe mich an Ihrem Institut immer wohl und sehr gut betreut gefühlt.
In diesem Zusammenhang möchte ich auch Herrn Prof. Gerhard Breves für seine
Unterstützung, Beratung und die Übernahme der Betreuung an der TiHo danken.
Den Mitarbeitern der Biometrie der MHH, insbesondere Frau Annika Müller-Heine und Frau
Stefanie Ernst, möchte ich meinen Dank für ihre Beratung bei der Versuchsplanung und den
Gruppenkonstellationen aussprechen.
Der Deutschen Forschungsgemeinschaft (PA 240/10-1) und der Gesellschaft der Freunde der
MHH möchte ich für die finanzielle Unterstützung danken.
Herzlichen Dank auch an Cornelia Höpfel für ihre technische Assistenz, die vielen
gemeinsamen Stunden im OP, ihren Einsatz am Kryostat und das Lehren der Färbetechniken.
Dr. Manuela Büttner danke ich für ihre kompetente Beratung am Fluoreszenz-Mikroskop
und ihre stete Hilfsbereitschaft. In diesem Zusammenhang möchte ich mich auch bei
Dr. Catarina Hadamitzky bedanken; trotz ihrer zahlreichen Dienste hatte sie immer ein
offenes Ohr: „Ich habe Dienst, aber du kannst mit mir laufen.“
Sheila Fryk und Sabine Buhmann danke ich für ihre Hilfe bei Bestellungen, Dienstreise-
Fragen (Danke Sheila) und anderen bürokratischen Herausforderungen. Auch noch mal
Danke Sheila, dass du meine Summary durchgesehen hast.
Nicht zu vergessen sind selbstverständlich alle Mitarbeiter des Instituts für Funktionelle und
Angewandte Anatomie der MHH. Ich möchte mich bei euch allen bedanken, dass ihr mich so
herzlich aufgenommen habt.
Auch den Tierpflegern des Zentralen Tierlabors der MHH möchte ich an dieser Stelle einmal
meinen Dank aussprechen. Sie haben mich immer auf dem Laufenden gehalten und einen
tollen Job gemacht.
Danksagungen
102
Meine Freunde verdienen ein großes Dankeschön für die tollen gemeinsamen Stunden und
dafür, dass sie medizinische Fachtermini über sich ergehen lassen, ganz gleich ob sie aus
dem Bereich kommen, oder nicht. Meikie, dir einen besonderen Dank.
Mein größter Dank gilt meiner Familie und Christoph.
Die Unterstützung, die meine Eltern mir nicht nur während der Doktorarbeit entgegen
gebracht haben, ist einfach wunderbar. Dafür danke ich euch sehr. Papa, dir noch einmal
einen riesigen Dank für deine Korrekturen und beratenden Worte. Meinen Geschwistern
danke ich für ihren Witz, den tollen Familiensinn und die besten Familienfeiertage.
Vielen Dank Christoph, dass du immer für mich da bist, mich unterstützt, mit mir lachst und
mich zwischendurch auf andere Gedanken bringst, das ist mir eine große Hilfe und bedeutet
mir sehr viel.