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Superparamagnetische Ferrit-Nanopartikel als
Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie
Dissertation
Zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
dem Fachbereich Chemie
der Universität Hamburg
vorgelegt von
Ulrich Ingmar Tromsdorf
aus Hamburg
HO
OH
HO
OH
HO
O H
Nanopartikel∼5 nm
Mizellen∼100 nm
Nanosomen∼250 nm
T1 T2 T2*
Hamburg, 2009
Die vorliegende Arbeit wurde von Oktober 2006 bis Oktober 2009 im Institut für
Physikalische Chemie der Universität Hamburg in der Gruppe von Prof. Dr. Horst Weller
angefertigt. Teile der Arbeit entstanden in enger Kooperation mit dem Institut für Molekulare
Zellbiologie von Prof. Dr. Dr. Ulrike Beisiegel an dem Universitätsklinikum Hamburg-
Eppendorf sowie der Klinik für Diagnostische und Interventionelle Radiologie von Prof. Dr.
Gerhard Adam am Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf.
1. Gutachter: Prof. Dr. Horst Weller
2. Gutachter: Prof. Dr. Stephan Förster
Disputation: 05.02.2010
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Theoretische Einführung 4
2.1 Grundlagen des Magnetismus 4
2.1.1 Dia- und Paramagnetismus 4 2.1.2 Kollektiver Magnetismus 6 2.1.3 Antiferro- und Ferrimagnetismus 7 2.1.4 Magnetische Eigenschaften eines Ferromagneten 8 2.1.5 Magnetismus von Nanopartikeln 10
2.2 Magnetresonanztomographie 14
2.2.1 Grundlagen der Kern-Resonanz 14 2.2.2 Signal und Kontrast 17 2.2.3 Tomographische Bildgebung 20 2.2.4 Kontrastmittel in der Magnetresonanztomographie 22
3 Experimenteller Teil 27
3.1 Chemikalien 27
3.2 Synthese von Ferrit-Nanopartikeln 27
3.2.1 Synthese von Fe3O4-Nanopartikeln 27 3.2.2 Synthese von MnFe2O4-Nanopartikeln 28 3.2.3 Aufreinigung der Nanopartikel 28
3.3 Monophosphatierung Polyethylenglykol basierter Liganden 28
3.3.1 Veresterung von Polyethylenglykol-monomethylether 28 3.3.2 Veresterung von Polyethylenglykol-monoacrylat 28 3.3.3 Synthese von Polyethylenglykol-Liganden mit Carbonsäure- 29 Ankergruppe
3.4 Ligandenaustauschreaktionen 29
3.4.1 Ligandenaustausch mit Phosphat-funktionalisiertem 29 Polyethylenglykol 3.4.2 Ligandenaustausch mit Carboxylat-funktionalisiertem 29 Polyethylenglykol
3.5 Zytotoxizitätsuntersuchungen 30
3.5.1 Untersuchungen an J774-Makrophagen mittels MTT 30 3.5.2 Berliner Blau-Zellfärbung an J774-Makrophagen 30
3.6 Charakterisierungsmethoden 32
3.6.1 Transmissionselektronenmikroskopie 32 3.6.2 Pulver-Röntgendiffraktometrie 32 3.6.3 Foner-Probenvibrationsmagnetometrie 32 3.6.4 Infrarot-Spektroskopie 33 3.6.5 Thermogravimetrie 33 3.6.6 Kernresonanz-Spektroskopie 33 3.6.7 Gel-Filtrations-Chromatographie 33 3.6.8 Dynamische Lichtstreuung 34 3.6.9 Atomabsorptionsspektroskopie 34 3.6.10 Kernresonanz-Relaxometrie 34 3.6.11 Magnetresonanztomographie 35
4 Ergebnisse und Diskussion 36
4.1 Synthese und Charakterisierung von Ferrit-Nanopartikeln 37
4.2 Oberflächenmodifizierung an Ferrit-Nanopartikeln 46
4.2.1 Synthese Polyethylenglykol-basierter Liganden 47 4.2.2 Ligandenaustausch ohne Aggregation der Partikel 51
4.3 Entwicklung positiver MR-Kontrastmittel unter
Verwendung nicht-aggregierter Eisenoxid-Nanopartikel 58
4.3.1 Stabilitätsuntersuchungen an PEGylierten Eisenoxid-Nanopartikeln 59
4.3.2 Untersuchungen zur Kontrastgebung 64 4.3.3 Untersuchungen zur Toxizität 69 4.3.4 Aufnahme der Nanopartikel in Zellen 73 4.3.5 Funktionalisierung von Eisenoxid-Nanopartikeln zur Kopplung an Biomoleküle 75
4.4 Entwicklung negativer MR-Kontrastmittel 78
4.4.1 Oberflächeneffekte auf die transversalen Relaxivitäten 78 4.4.2 Synthese eines T2-Kontrastmittels unter Verwendung von Triblockcopolymeren 83 4.4.3 Synthese eines Negativ-Kontrastmittels auf Basis biologischer Mizellen – Nanosomen 86
5 Zusammenfassung 94
6 Summary 96
7 Literatur 98
8 Anhang 105
8.1 Abkürzungsverzeichnis 105
8.2 Chemikalien 107
8.3 Gefahrenhinweise und Sicherheitsratschläge 108
8.4 Danksagungen 114
8.5 Lebenslauf 116
8.6 Erklärung 118
1 Einleitung
1
1 Einleitung
Nanoskalige Systeme zeichnen sich durch besondere physikalische und chemische
Eigenschaften aus. Sie sind dabei als Übergang vom atomaren bzw. molekularen Bereich zu
dem ausgedehnter Festkörperstrukturen zu betrachten[1].
Während für Festkörperstrukturen die Gesetze der klassischen Physik Gültigkeit besitzen,
sind die Gesetze der Quantenmechanik für zahlreiche Eigenschaften der Nanostrukturen
verantwortlich. Als eindrucksvollstes Beispiel ist hier der Größenquantisierungseffekt bei
nanoskaligen Halbleiterstrukturen zu nennen, der deren optische Eigenschaften definiert und
ihnen somit einzigartige Einsatzmöglichkeiten erschließt. Die besonderen Eigenschaften von
Nanopartikeln rühren ferner daher, dass sie im Vergleich zu den entsprechenden
Festkörperstrukturen eine sehr große Oberfläche relativ zum Volumen besitzen. So sinkt der
Anteil der Oberflächenatome von etwa 80 % für ein 2 nm großes Teilchen auf nur noch 20 %
für ein 10 nm großes Partikel[2]. Auch der Magnetismus von Materialien ist im Nanometer-
Bereich stark größenabhängig und zeigt durch den Superparamagnetismus eine Eigenschaft,
die im Festkörper nicht beobachtet werden kann[3].
Auf Grund der starken Größenabhängigkeit der physikalischen Eigenschaften der
Nanopartikel war die Entwicklung von präzisen Synthesestrategien notwendig. Heute werden
Nanopartikel nasschemisch durch Hochtemperatursynthesen in hochsiedenden unpolaren
organischen Lösungsmitteln hergestellt. Dadurch ist die Herstellung größeneinheitlicher
Proben in einem weiten Bereich mit definierter Morphologie möglich[4]. Die Teilchen
besitzen außerdem ein hohes Maß an Kristallinität und eine genau einstellbare chemische
Zusammensetzung.
Die Verwendung maßgeschneiderter Nanopartikel mit genau kontrollierbaren Eigenschaften
bietet zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten[5]. Eine besonders viel versprechende
Perspektive bietet der Einsatz von Nanomaterialien im Bereich der Lebenswissenschaften und
der Biomedizin[6, 7]. Tatsächlich bedient sich auch die Natur in ihrer Komplexität Strukturen
im Nanometerbereich, um auf sub-zellulärer Ebene Funktionalität zu gewährleisten, was
durch kleine Moleküle nicht möglich wäre[8]. So besitzt beispielsweise der DNA-
Doppelstrang einen Durchmesser von 2 nm. Einige Lipoproteine haben Durchmesser von
etwa 20 nm. Die Natur nutzt also ebenfalls überall dort, wo spezifische Erkennungs- oder
Vermittlungsprozesse stattfinden, nanoskalige Systeme.
1 Einleitung
2
Neben diesen günstigen Größeneigenschaften ergibt sich das große Potential anorganischer
Nanopartikel für biomedizinische Anwendungen aus deren großer Oberfläche und der damit
verbundenen Möglichkeit der passgenauen Funktionalisierung. So können die physikalischen
Eigenschaften des Kernes über eine präzise Oberflächenmodifizierung mit den erforderlichen
chemischen und biologischen Eigenschaften verknüpft werden.
Zentrales Ziel der Verwendung von anorganischen Nanopartikeln in der Biomedizin ist eine
molekulare oder zelluläre Bildgebung[9]. Dabei handelt es sich um die Charakterisierung und
Darstellung biologischer Prozesse auf zellulärer und molekularer Ebene. Langfristig sollen
frühe molekulare Abnormitäten erkannt werden. Die konventionelle Bildgebung basiert
hingegen auf der Visualisierung der sich später aus diesen Abnormitäten entwickelnden
Krankheiten[10]. Auf diese Weise sollen beispielsweise Tumor-Erkrankungen oder
atherosklerotische Plaques frühzeitig erkannt werden[11-13].
Konkrete Anwendungen sind die Lebendzell-Mikroskopie mit fluoreszierenden Halbleiter-
Nanopartikeln oder die Intravital-Mikroskopie mit im nahen Infrarot emittierenden
Nanokristallen. Eine der wohl wichtigsten Anwendungen basiert auf dem Einsatz
superparamagnetischer Metalloxid-Nanopartikel als Kontrastmittel für die
Magnetresonanztomographie (MRT), wobei die klinische Applikation bislang auf Eisenoxid
beschränkt ist. Die MRT hat sich in den vergangenen Jahren zum wichtigsten nicht-invasiven
Bildgebungsverfahren entwickelt und bietet den Vorteil, dass Gewebe in hoher Auflösung
ohne die Verwendung schädlicher Röntgenstrahlung abgebildet werden können.
MR-Kontrastmittel werden entweder dazu eingesetzt, die longitudinale Relaxationszeit T1
eines Gewebes zu verkürzen, was zu einem helleren Bild führt, oder die transversalen
Relaxationszeiten T2 und T2* zu reduzieren, wodurch das Bild im Bereich der
Kontrastmittelakkumulation dunkel erscheint. T1-Kontrastmittel heißen auch positive
Kontrastmittel, deren typische Vertreter paramagnetische Gadolinium-Komplexe sind. Die
T2/T2*-Kontrastmittel werden negative Kontrastmittel genannt und werden durch die
erwähnten superparamagnetischen Eisenoxid-Partikel (SPIO) repräsentiert. Gegenwärtig
werden anorganische Nanostrukturen zahlreicher Materialien sowohl für die T1- als auch für
die T2/T2*-gewichtete Bildgebung getestet. Neben magnetischen Nanopartikeln wurden auch
paramagnetische Teilchen sowie Hybrid-Materialien verwendet, welche gleichzeitig eine
optische Bildgebung oder Therapieansätze ermöglichen[14-18].
In dieser Arbeit wird die Entwicklung von T1-, T2- und T2*-Kontrastmitteln auf Basis von
Eisenoxid- und Manganferrit-Nanopartikeln aufgezeigt. Die Teilchen werden mittels
1 Einleitung
3
organometallischer Hochtemperatursynthese hergestellt und durch maßgeschneiderte
Oberflächenmodifikationen im Hinblick auf Stabilität, Kontrastgebung, Toxizität und
biologische Spezifität optimiert. Die Kontrastmittel sind dem heutigen klinischen Standard in
diesen Kriterien überlegen und bieten langfristige Perspektiven für die Kontrastmittel-
unterstützte MRT.
2 Theoretische Einführung
4
2 Theoretische Einführung
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit zwei verschiedenen Ursprüngen von Magnetismus.
Einerseits bewirken Bewegungen von Elektronen in Atomen oder auch ausgedehnten
Festkörperstrukturen materialintrinsischen Magnetismus unterschiedlichster Form, welchem
bei der Entwicklung neuartiger nanoskaliger Materialien entscheidende Bedeutung zukommt.
Diese Effekte finden ihren Ursprung ausschließlich in der elektronischen Struktur von
Atomen oder Festkörpern. Andererseits beinhaltet diese Arbeit die Verwendung und
Manipulation von kernmagnetischen Effekten, welche insbesondere in der Kernmagnetischen
Resonanz (NMR) zum Tragen kommen.
2.1 Grundlagen des Magnetismus
Jede Form des Magnetismus beruht auf der Bewegung von elektrischen Ladungen[19].
Ladungsträger können Elektronen in den Orbitalen der Atome sein oder die positiv geladenen
Atomkerne. Diese kernmagnetischen Effekte sind um Größenordnungen schwächer und
werden daher bei der Behandlung des Magnetismus von Stoffen vernachlässigt. Die
Bewegung der Ladung, die den Magnetismus von Stoffen verursacht, hat im Wesentlichen
zwei Ursachen, nämlich den Spin der Elektronen und ihren Bahndrehimpuls. Durch diese
Bewegung besitzt ein Elektron ein magnetisches Dipolmoment, welches die kleinste Einheit
des Magnetismus ist und durch welches er überhaupt messbar wird.
2.1.1 Dia- und Paramagnetismus
Stoffe, deren Atome, Moleküle oder Ionen abgeschlossene Elektronenschalen besitzen, sind
diamagnetisch, da sich die magnetischen Momente der einzelnen Elektronen gegenseitig
kompensieren. Wird ein Diamagnet einem äußeren Magnetfeld H ausgesetzt, so werden,
anschaulich betrachtet, in den Orbitalen seiner Atome Kreisströme induziert, deren
magnetische Momente gemäß der Lenz’schen Regel dem äußeren Feld entgegengesetzt
gerichtet sind. Die magnetische Suszeptibilität χ, welche die Effektivität einer magnetischen
Induktion durch ein äußeres Feld darstellt, nimmt für einen Diamagneten entsprechend
negative Werte an. Diamagnetismus wirkt also repulsiv. Allgemein ist die Suszeptibilität
durch folgenden Differentialquotienten gegeben[20]:
Hd
Md�
�
=χ (Gl. 2.1)
2 Theoretische Einführung
5
M ist dabei die Magnetisierung (Dipolmoment pro Volumen) und trägt dieselbe Einheit wie
die magnetische Feldstärke.
Im Allgemeinen wird die magnetische Feldstärke H für Felder verwendet, welche aus so
genannten freien Strömen resultieren, also beispielsweise einen makroskopisch messbaren
Strom durch eine Spule. Die Magnetisierung hingegen bezieht sich auf den Magnetismus von
Materialien und Stoffen. Dieser resultiert aus mikroskopischen Strömen, also Bahndrehimpuls
und Spin der Elektronen. Diese Ströme werden auch Äquivalentströme genannt. Die
Überlagerung beider Größen wird in der magnetischen Flussdichte B zusammengefasst:
)(0 MHB���
+= µ (Gl. 2.2)
Besitzen Atome, Moleküle oder Ionen ungepaarte Elektronen, ist der Stoff paramagnetisch.
Dadurch, dass sich die magnetischen Momente der einzelnen Elektronen nicht zu null
kompensieren, ergeben sich atomare magnetische Momente, die von einem äußeren
Magnetfeld feldverstärkend ausgerichtet werden können.
In Abwesenheit eines äußeren Magnetfeldes ist die Magnetisierung eines Paramagneten
gleich null, da die stets vorhandene thermische Energie eine statistische Ausrichtung der
magnetischen Momente bewirkt. Wird ein magnetisches Feld angelegt und in seiner Stärke
langsam erhöht, so richten sich die Momente zunehmend aus, was in einem langsamen
Anstieg der Magnetisierung und einer positiven Suszeptibilität resultiert. Der Verlauf einer
solchen Magnetisierungskurve (M-H-Auftragung) ist also im Wesentlichen durch die
Konkurrenz von thermischer und magnetostatischer Energie charakterisiert. Diese
Konkurrenz wird in einfacher Form im Langevin-Modell berücksichtigt. Für die
Magnetisierung gilt hier:
)()( xLMxLNM S ⋅=⋅= µ (Gl. 2.3)
In Gl. 2.3 ist N die Zahl der magnetischen Momente pro Volumen und µ das magnetische
Moment. Das Produkt beider Größen wird als Sättigungsmagnetisierung bezeichnet. Ferner
gilt:
1coth)( −−= xxxL und (Gl. 2.4)
kT
Hx
µ= (Gl. 2.5)
Der Quotient x gibt die eben beschriebene Konkurrenz aus der thermischen (kT) und
magnetostatischen Energie wieder. Für große x (große Feldstärken) dominiert die
2 Theoretische Einführung
6
magnetostatische Energie. Folglich strebt L(x) gegen eins und es resultiert
Sättigungsmagnetisierung.
Das Langevin-Modell besitzt im atomaren Bereich die Einschränkung, dass
quantenmechanische Effekte wie die Quantisierung des Gesamtdrehimpulses nicht
berücksichtigt werden. Das Magnetisierungverhalten superparamagnetischer Nanopartikel
hingegen lässt sich durch diese Theorie zuverlässig beschreiben.
2.1.2 Kollektiver Magnetismus
Ein Charakteristikum des Paramagnetismus ist, dass die einzelnen atomaren magnetischen
Momente als isolierte Zentren betrachtet werden und sich in ihrer Ausrichtung nicht
gegenseitig beeinflussen. Es gibt aber kooperative Mechanismen, die dazu führen, dass die
magnetischen Momente unter bestimmten Bedingungen richtenden Kräften ausgesetzt
werden. Dadurch können in bestimmten Bereichen eines solchen Stoffes magnetische
Ordnungen entstehen. Diese Ordnungen liegen beim Ferromagnetismus, Ferrimagnetismus
und Antiferromagnetismus vor. Zusammenfassend werden diese Magnetismen als kollektiver
Magnetismus bezeichnet.
Kollektiver Magnetismus tritt in diesen Stoffen aber nur unterhalb einer bestimmten
Temperatur auf. Beim Ferromagneten ist dieses die Curie-Temperatur TC. Unterhalb von TC
richten sich die magnetischen Momente in bestimmten Bereichen parallel aus. Oberhalb von
TC bricht die magnetische Ordnung infolge der hohen thermischen Energie vollständig
zusammen und der Stoff wird zum Paramagneten. Für die Suszeptibilität gilt das Curie-
Weiss-Gesetz:
CTT
C
−=χ (Gl. 2.6)
C ist die Curie-Konstante. Oberhalb von TC beschreibt die Suszeptibilität als Funktion der
Temperatur eine Hyperbel. Bei der Curie-Temperatur ändern sich nicht nur die magnetischen
Eigenschaften deutlich, sondern auch andere physikalische Größen wie die
Wärmeleitfähigkeit.
Die parallele Ordnung der magnetischen Momente im Ferromagneten wird
quantenmechanisch durch die Austauschwechselwirkung beschrieben. Zwei Elektronen
können auf Grundlage des Pauli-Prinzips entweder eine parallele Ausrichtung (Triplett-
Zustand) oder eine antiparallele Ausrichtung (Singulett-Zustand) einnehmen. Der
2 Theoretische Einführung
7
Energieunterschied zwischen Singulett- und Triplett-Zustand heißt Austauschenergie. Um die
Austauschenergie zu berechnen, wird der Heisenberg-Operator verwendet:
ji SS ⋅−= exex JH 2 (Gl. 2.7)
In Gl. 2.7 sind Si und Sj die Spinmatrizen der beiden Elektronen. Jex ist das Austauschintegral
der beiden Elektronen. Es kann sowohl ein positives als auch ein negatives Vorzeichen haben.
Falls Jex<0 ist der Singulett-Zustand der energetisch niedrigere. Dieser Zustand wird als
antiferromagnetische Kopplung bezeichnet. Ist hingegen Jex>0 ist der Triplett-Zustand
energetisch begünstigt und es ergibt sich eine ferromagnetische Kopplung. Im
Periodensystem der Elemente sind Eisen, Kobalt und Nickel die typischen ferromagnetischen
Elemente mit positivem Austauschintegral. Hingegen sind Chrom und Mangan
antiferromagnetische Elemente. Einen empirischen Zusammenhang zwischen dem
Vorzeichen des Austauschintegrals und dem Quotienten aus Gitterkonstante und Radius der
unvollstängig besetzten d-Schale gibt die Bethe-Slater-Kurve wieder (Abb. 2.1). Sie sagt den
Ferromagnetismus von Nickel, Eisen und Kobalt in der richtigen Reihenfolge ihrer Curie-
Temperaturen voraus.
Abb. 2.1: Die Bethe-Slater Kurve. Positive Austauschintegrale führen zur ferromagnetischen,
negative zur antiferromagnetischen Kopplung.
2.1.3 Antiferro- und Ferrimagnetismus
Ein Antiferromagnet weist ein negatives Austauschintegral auf. Bei hohen Temperaturen zeigt
ein Antiferromagnet analog zum Ferromagneten paramagnetisches Verhalten. Der Übergang
zwischen beiden Phasen ist hier durch die Neél-Temperatur TN gegeben.
Strukturell kann ein Antiferromagnet betrachtet werden, als sei er aus zwei ferromagnetischen
Untergittern aufgebaut. Die magnetischen Momente der beiden Gitter kompensieren sich
dabei zu null. Aus diesem Grund besitzen Antiferromagneten bei niedrigen Temperaturen
2 Theoretische Einführung
8
sehr kleine positive Suszeptibilitäten, die allerdings mit steigender Temperatur zunehmen, da
die thermische Energie die antiferromagnetische Ordnung stört.
Ferrimagneten haben ebenfalls ein negatives Austauschintegral. Somit sind auch sie aus zwei
entgegengesetzt ausgerichteten ferromagnetischen Untergittern aufgebaut. Die magnetischen
Momente der beiden Gitter kompensieren sich allerdings nicht zu null, d. h. sie sind von
unterschiedlichem Betrag. Oberhalb der Curie-Temepratur zeigen auch Ferrimagneten
Paramagnetismus. Unterhalb von TC gleichen seine magnetischen Eigenschaften denen eines
Ferromagneten.
Die bekanntesten ferrimagnetischen Materialien sind die Ferrite, die in kubische und
hexagonale zu unterscheiden sind. Kubische Ferrite haben die allgemeine Zusammensetzung
MO⋅Fe2O3 (MFe2O4), wobei M ein divalentes Kation wie Ni2+, Co2+, Mn2+ oder Fe2+ ist. Der
bekannteste Vertreter ist das Magnetit (Fe3O4). Abb. 2.2 zeigt zusammenfassend die
schematische Ausrichtung der magnetischen Momente in Ferro-, Antiferro-, und
Ferrimagneten.
Abb. 2.2: Schematische Darstellung der kollektiven Ausrichtung der magnetischen Momente
im Ferro-, Antiferro- und Ferrimagneten.
2.1.4 Magnetische Eigenschaften eines Ferromagneten
Bisher wurde der Ferromagnetismus als ein kooperatives Phänomen beschrieben, das durch
eine parallele Ausrichtung der atomaren magnetischen Momente in alle Raumrichtungen
gekennzeichnet ist. Tatsächlich ist ein Ferromagnet jedoch aus einzelnen Bereichen, den
Domänen aufgebaut. Diese werden auch als Weisssche Bezirke bezeichnet. Innerhalb einer
2 Theoretische Einführung
9
Domäne richten sich die magnetischen Momente parallel aus, wohingegen die Ausrichtung
der Domänen untereinander nicht parallel ist.
Der Grund für die Aufteilung eines Ferromagneten in einzelne Domänen ist eine Reduzierung
der Gesamtenergie, die als Summe verschiedener Beiträge gegeben ist. Ein Beitrag besteht in
der magnetostatischen Energie. Bestünde der Ferromagnet aus einer einzigen
makroskopischen Domäne, enthielte das von ihr verursachte Magnetfeld eine sehr große
magnetostatische Energie. Diese wird reduziert, indem der Stoff viele kleinere Domänen
ausbildet. Mit zunehmender Zahl und abnehmender Größe der Domänen nimmt jedoch die
Austauschenergie an den Grenzen der Domänen zu, da hier eine antiparallele Ausrichtung der
magnetischen Momente erreicht werden muss. Diese ist wegen des positiven
Austauschintegrals für Ferromagneten nicht begünstigt. Durch diese Konkurrenz bilden sich
Domänen einer bestimmten Größe aus. Typische Größen von Domänen liegen im Bereich von
100 nm. Die Ein-Domänen-Größe von Magnetit beträgt 128 nm. An der Grenze zwischen den
Domänen bilden sich Domänenwände einer bestimmten Dicke aus. Diese werden auch als
Blochsche Wände bezeichnet.
Die Magnetisierungskurve eines Ferromagneten ist durch einen Hystereseverlauf
gekennzeichnet. Wird ein Ferromagnet einem stärker werdenden äußeren Magnetfeld H
ausgesetzt, so steigt die Magnetisierung zunächst entlang der Neukurve bis zur
Sättigungsmagnetisierung an. Wird die Feldstärke anschließend bis auf null abgesenkt, so fällt
auch die in der Probe induzierte Magnetisierung ab. Allerdings verbleibt auch in Abwesenheit
eines äußeren Feldes eine Magnetisierung in der Probe, welche als Remanenzmagnetisierung
Mr bezeichnet wird. Um den Stoff vollständig zu entmagnetisieren, ist die Koerzitivfeldstärke
HC erforderlich. Das magnetische Feld hat dabei ein entgegengesetztes Vorzeichen. Wird der
Betrag des magnetischen Feldes in dieser Richtung weiter erhöht, so wird in umgekehrter
Richtung die Sättigungmagnetisierung erreicht. Diese Hystereseschleife kann beliebig
durchlaufen werden (Abb. 2.3).
2 Theoretische Einführung
10
Abb. 2.3: Hysteresekurve eines Ferro- oder Ferrimagneten. Charakteristische Größen sind
die Sättigungsmagnetisierung (MS), die Remanenz (Mr) sowie die Koerzitivfeldstärke (HC).
2.1.5 Magnetismus von Nanopartikeln
Wie bereits beschrieben, sind ferromagnetische Stoffe zur Minimierung der Gesamtenergie
aus Domänen aufgebaut. Wird der Teilchendurchmesser d eines Ferromagneten reduziert, so
besteht das Teilchen unterhalb einer bestimmten Größe nur noch aus einer Domäne. Die
magnetostatische Energie ist proportional zu d3, während die mit der Bildung von Domänen
verbundene Domänenwandenergie proportional zu d2 ist. Da diese Oberflächenenergie mit
abnehmender Teilchengröße sehr stark zunimmt, ist die Bildung von Domänen unterhalb der
Ein-Domänen-Größe nicht mehr begünstigt[21].
Die Koerzitivfeldstärke HC ist, wie in 2.1.4 diskutiert, ein Maß dafür, wie ausgeprägt die
Hysterese eines Ferromagneten ist. Da sie die Feldstärke darstellt, die nötig ist, um ein
Material vollständig zu entmagnetisieren, gibt sie außerdem an, wie stabil die Ausrichtung der
Magnetisierung in Abwesenheit eines äußeren Feldes ist. HC zeigt eine starke Abhängigkeit
von der Teilchengröße. Im Multi-Domänenbereich ist HC zunächst relativ gering, steigt aber
mit abnehmender Partikelgröße stark an. Entspricht der Partikeldurchmesser der Ein-
Domänen-Größe, so erreicht HC ein Maximum. Anschließend fällt die Koerzitivfeldstärke
stark ab, bevor sie bei einer bestimmten Größe den Wert null erreicht. Unterhalb dieser Größe
ist das Partikel superparamagnetisch (Abb. 2.4).
2 Theoretische Einführung
11
Abb. 2.4: Abhängigkeit der Koerzitivfeldstärke (HC) vom Partikeldurchmesser.
Um diesen Verlauf der Koerzitivfeldstärke zu erklären, müssen zwei Prozesse betrachtet
werden. Im Multi-Domänen-Bereich finden Änderungen in der Magnetisierung über die
Bewegung der Domänenwände statt. Da dieser Prozess relativ wenig Energie benötigt, ist HC
hier vergleichsweise gering. An der Ein-Domänen-Grenze verlaufen Änderungen in der
Magnetisierung über Rotation des magnetischen Gesamtmomentes der Domäne. Dieser
Prozess ist mit einem höheren Energieaufwand verbunden. Die Rotation ist durch die
magnetische Anisotropie charakterisiert.
Magnetische Anisotropie beschreibt allgemein das Phänomen, dass die Suszeptibilität eines
Stoffes in unterschiedlichen Raumrichtungen verschiedene Werte annimmt. Die
Magnetisierung des Stoffes bevorzugt also eine bestimmte räumliche Ausrichtung. Diese
bevorzugte Ausrichtung wird als leichte Achse bezeichnet. Die wichtigste Art der
magnetischen Anisotropie ist die magnetokristalline Anisotropie. Sie ist eine
materialintrinsische Eigenschaft. Die Richtung der leichten Achse wird hier durch die
Kristallstruktur bestimmt. Im Bereich von Nanopartikeln existieren weitere Arten der
Anisotropie wie beispielsweise die Form-Anisotropie.
Um den Vektor der Magnetisierung aus der leichten Achse herauszudrehen, muss die
Anisotropieenergie EA aufgewendet werden (Abb. 2.5). Sie ist im Falle nur einer leichten
Achse gegeben durch
θ2sinKVE A = . (Gl. 2.8)
K ist die Anisotropiekonstante und V das Teilchenvolumen. θ ist der Winkel zwischen der
Magnetisierung und der leichten Achse.
2 Theoretische Einführung
12
Abb. 2.5: Anisotropiebarrieren für Teilchen mit großer (∆E1) und kleiner (∆E2) magnetischer
Anisotropie.
Die Koerzitivfeldstärke HC ist am Wert der Ein-Domänen-Größe maximal, weil hier
Änderungen der Magnetisierung ausschließlich durch Anisotropieeffekte gesteuert werden.
Der Anisotropiebeitrag ist hier gleichzeitig maximal. Wird die Größe des Ein-Domänen-
Teilchens weiter verringert, so nimmt auch die aufzubringende Anisotropieenergie gemäß
Gl. 2.8 stark ab. Unterhalb einer bestimmten Größe dSP ist die Anisotropieenergie so klein,
dass die thermische Energie ausreicht, um die Richtung der Magnetisierung frei auszulenken.
Das magnetische Gesamtmoment eines solchen Ein-Domänen-Teilchens fluktuiert also.
Dadurch ist überhaupt keine stabile Magnetisierung mehr möglich und die Koerzitivfeldstärke
hat den Wert null, d. h. es ist keine Hysterese mehr vorhanden. Diese Form des Magnetismus
wird als Superparamagnetismus bezeichnet. Qualitativ gleicht die Magnetisierungskurve der
eines Paramagneten, wodurch zu deren Beschreibung ebenfalls das Langevin-Modell
herangezogen werden kann. Das Magnetisierungsverhalten eines Superparamagneten ist
ebenfalls durch eine Konkurrenz von magnetostatischer Energie (µH) und thermischer
Energie (kT) gekennzeichnet. Durch das im Vergleich zu einem isolierten paramagnetischen
Atom sehr große magnetische Moment eines superparamagnetischen Partikels dominiert der
Term der magnetostatischen Energie sehr schnell. Dadurch ist in einer Probe eines
Superparamagneten schon bei sehr viel niedrigeren Feldstärken die Sättigungsmagnetisierung
erreicht.
2 Theoretische Einführung
13
Bisher wurde ausführlich auf die Größenabhängigkeit der Koerzitivfeldstärke HC und der
Anisotropieenergie eingegangen und der Superparamagnetismus als ein Phänomen
beschrieben, dass bei sehr kleinen Teilchen ferro- oder ferrimagnetischer Stoffe auftritt. Ein
weiterer wichtiger Parameter, der sich im superparamagnetischen Bereich stark
größenabhängig zeigt, ist die Sättigungsmagnetisierung MS[22]. Im makroskopischen
Festkörper ist die ferromagnetische Ordnung innerhalb der Domäne über alle Dimensionen
gleichmäßig. Wird die Teilchengröße eines Ein-Domänen-Partikels reduziert, nimmt das
Verhältnis der Oberfläche zum Volumen zu. Da an der Oberfläche die Austauschenergie
geringer ist, bilden sich glasartige Spinstrukturen aus. Die ferromagnetische Ordnung ist hier
gestört. Mit abnehmender Teilchengröße fällt dieser Effekt zunehmend ins Gewicht, was sich
in einem Abfall der Sättigungsmagnetisierung MS mit abnehmender Teilchengröße bemerkbar
macht[22]:
[ ]3/)( rdrMm SS −= (Gl. 2.9)
Hierbei ist Ms die Sättigungsmagnetisierung des Festkörpers, r der Teilchenradius und d die
Schichtdicke. Diese Effekte wurden insbesondere für Fe3O4-Nanopartikel in einem
Größenbereich zwischen 4 und 12 nm gezeigt[23]. So ist die Sättigungsmagnetisierung 12 nm
großer Fe3O4-Nanopartikel mit 101 emu/g viermal höher als für 4 nm große Fe3O4-
Nanoteilchen (25 emu/g).
2 Theoretische Einführung
14
2.2 Magnetresonanztomographie
2.2.1 Grundlagen der Kern-Resonanz
Die MRT beruht auf der kernmagnetischen Resonanz (NMR) von Protonen und deren
Relaxationsprozessen in einem externen magnetischen Feld[24, 25]. Wird ein Ensemble von
Protonen einem homogenen externen magnetischen Feld B0 ausgesetzt, kommt es zu einer
Präzession der Spins um die Richtung des magnetischen Feldes (z-Richtung). Die
Rotationsfrequenz dieser Präzession wird als Larmor-Frequenz ω0 bezeichnet und ergibt sich
zu
00 B⋅= γω . (Gl. 2.10)
γ ist das gyromagnetische Verhältnis des Protons und beträgt γ=42.6 MHz/T. Da Protonen
einen Spin von ½ besitzen, ergeben sich grundsätzlich zwei mögliche Spinausrichtungen,
welche durch die Spinquantenzahlen +1/2 und -1/2 gegeben sind. In einem externen
Magnetfeld B0 ist die energetische Entartung zwischen diesen beiden Zuständen aufgehoben,
wobei die relativ zur Richtung des äußeren Feldes günstigere Orientierung energetisch
herabgesetzt wird (α-Zustand) und die ungünstigere energetisch angehoben wird (β-Zustand).
In der Konsequenz ergibt sich ein Boltzmann-verteilter Besetzungsunterschied von α- und β-
Spins. Dieser Spinüberschuss an α-Spins lässt sich näherungsweise nach
kTNhussSpinübersc
20ωℏ
≅ (Gl. 2.11)
abschätzen[25]. Der Spinüberschuss bewirkt im thermischen Gleichgewicht eine kleine, aber
messbare Magnetisierung M0 entlang B0, welche proportional zu B0 und zur Protonenspin-
Dichte ρ0 ist:
0
220
04
BkT
Mℏγρ
= . (Gl. 2.12)
Die NMR beruht auf der Fähigkeit, die mit der Präzession einhergehende Magnetisierung M0
zu detektieren. Dazu wird zwischen zwei verschiedenen Anteilen der Magnetisierung
unterschieden, nämlich einem der ihre Änderung entlang B0 beschreibt (longitudinal) und
einem der den entsprechenden xy-Anteil (transversal) beinhaltet.
Grundlage der Detektierbarkeit der Magnetisierung M0 ist die Absorption von
elektromagnetischer Radiofrequenzstrahlung, deren Wellenlänge die Larmor-Gleichung
2 Theoretische Einführung
15
erfüllt. In einem einfachen NMR-Experiment wird ein Radiofrequenzpuls über eine
bestimmte Dauer auf die Probe eingestrahlt. Dieser Radiofrequenzpuls enthält die
Larmorfrequenz der Protonen der Probe (im einfachsten Fall reinen Wassers). Durch die
Absorption kommt es zu einem Übergang von Spins vom α- in den β-Zustand, bis gleich
viele α- wie β-Spins vorhanden sind. Durch diese Gleichbesetzung der beiden Zustände
verschwindet die Magnetisierung M0 entlang B0 (Abb. 2.6). Unmittelbar nach dem Puls
beträgt die longitudinale Magnetisierung also Mz=0.
Das eingestrahlte Radiofrequenzfeld ist in der transversalen Ebene, also senkrecht zu B0,
zirkular polarisiert. In einfacher Betrachtung rotiert der Vektor dieses Feldes (Feldstärke B1)
mit der Lamorfrequenz um die z-Achse. Da die Frequenz des eingestrahlten Feldes gleich der
Lamorfrequenz ist, erfahren die Protonen-Spins für die Pulsdauer (hier γB0/2π) ein konstantes
Feld B1. Dieses bewirkt ein Umklappen des Magnetisierungsvektors aus der z-Richtung in die
xy-Ebene (Abb. 2.6). Die Richtung des Magnetisierungsvektors ändert sich bei diesem
Übergang also um 90° (π/2), weshalb der hier diskutierte RF-Puls auch als 90°-Puls
bezeichnet wird[26].
Der 90°-Puls bewirkt außerdem, dass die Spins der Protonen unmittelbar nach seinem
Abschalten in Phase um die z-Achse rotieren. Die Rotationsfrequenz entspricht dabei der
Larmorfrequenz. Daher ist der Betrag des Vektors der transversalen Magnetisierung zu
diesem Zeitpunkt maximal (Mxy=M0). Um die transversale Magnetisierung zu detektieren, ist
in y-Richtung eine Detektorspule positioniert, in welcher ein entsprechend der
Rotationsfrequenz oszillierendes Signal induziert wird.
Im Anschluss an das hier beschriebene Resonanzexperiment finden zwei unabhängige
Relaxationsmechanismen statt. Der erste Mechanismus, welcher als longitudinale oder Spin-
Gitter-Relaxation bezeichnet wird, beschreibt die Rückkehr der longitudinalen
Magnetisierung vom Wert Mz=0 bis zu ihrem Ursprungswert Mz=M0:
)1()( 1/0
Ttz eMtM −−= (Gl. 2.13)
T1 ist die longitudinale Relaxationszeit. Die T1-Relaxation charakterisiert die Rückkehr zur
Boltzmann-Verteilung im thermischen Gleichgewicht, welche mit einem Überschuss an α-
Spins einhergeht. Die T1-Relaxation ist also mit einem Energietransfer an die Umgebung (das
Gitter) verbunden. Der zweite Relaxationsmechanismus ist die transversale oder Spin-Spin
Relaxation und findet ohne Energietransfer statt. Sie beschreibt den kontinuierlich
2 Theoretische Einführung
16
fortschreitenden Phasenverlust der Spins, welcher sich in einer Abnahme der transversalen
Magnetisierung zeigt.
Abb. 2.6: Einfaches Kern-Resonanz-Experiment. Nach einem 90°-Anregungspuls, welcher die
Larmorfrequenz beinhaltet, finden zwei unabhängige Relaxationsmechanismen statt. T1
charakterisiert die longitudinale Relaxation, T2 und T2* die transversale Relaxation.
Der Phasenverlust setzt sich aus zwei sich überlagernden Anteilen zusammen. Einerseits
kommt es durch fluktuierende Inhomogenitäten in der mikroskopischen Umgebung der
einzelnen Protonen zu spontan entstehenden Phasenunterschieden[27]. Die Lamorfrequenz der
Protonen ändert sich dabei nicht. Der hierdurch bewirkte Verlust der transversalen
Magnetisierung wird durch die transversale Relaxationszeit T2 beschrieben. Tatsächlich
existieren aber auch stationäre örtliche Inhomogenitäten im Magnetfeld B0 und im Gewebe
des untersuchten Körpers. Diese bewirken, dass zusätzlich zum bereits erwähnten
Phasenverlust einzelne Spinpakete unterschiedliche Larmorfrequenzen erfahren, anschaulich
betrachtet, mit verschiedenen Geschwindigkeiten um die z-Achse rotieren[27]. Diese
zusätzlichen Inhomogenitäten bewirken einen beschleunigten Verlust der transversalen
Magnetisierung, welcher häufig in einer separaten Zeitkonstante T2’ zusammengefasst wird.
Sie werden häufig auch als Suszeptibilitätseffekte bezeichnet. Beide Prozesse sind
vergleichend in Abb. 2.7 dargestellt.
B0
RF-Puls ω0=γB0
z
x
y
z
y y
z
x x
Mz
Relaxation T1
T2/T2*
Mz
Mxy
2 Theoretische Einführung
17
ω1
ω2 ω3
ω4
ω0
ω0
ω0 ω0
ω0
ω0
x
y
ϕ1
ϕ2
Mxy Mxy
ϕ3
a b
T2 -Relaxation T2’-Relaxation
Abb. 2.7: a) Fluktuierende Inhomogenitäten führen zu spontanen Phasenunterschieden der
Spins. Die Larmorfrequenz bleibt gleich. b) Stationäre Suszeptibilitätseffekte bewirken
Unterschiede in den Larmorfrequenzen verschiedener Spinpakete[27].
Der beobachtete Abfall der transversalen Magnetisierung, welcher sich in einem Signalverlust
in der Detektorspule äußert, ist daher durch die Summe beider Beiträge gegeben und wird als
freier Induktionsabfall (FID) bezeichnet. Es gilt:
*2/
0)( Ttxy eMtM −= (Gl. 2.14)
In Gl. 2.14 ist T2* die effektive transversale Relaxationszeit. Sie hängt mit den Zeitkonstanten
T2 und T2’ wie folgt zusammen:
'22
*2
111
TTT+= (Gl. 2.15)
Ein entscheidender Unterschied zwischen T2 und T2’ ist, dass der zusätzliche Signalverlust
durch T2’ reversibel ist. Durch Verwendung geeigneter Puls-Sequenzen kann er ausgeglichen
werden und der reine T2-Abfall und die T2-Relaxationszeit ermittelt werden. Wie bereits
erwähnt, beruht letzterer auf fluktuierenden dynamischen Prozessen wie etwa der Diffusion
und kann daher nicht eliminiert werden.
2.2.2 Signal und Kontrast
Das Signal ist in der MRT durch den Betrag der transversalen Magnetisierung gegeben. Es
wird durch ihren Vektor oszillierend in der Detektorspule induziert. Grundsätzlich sind in der
MR-Bildgebung Bereiche voneinander abgrenzbar, wenn sie unterschiedliche
2 Theoretische Einführung
18
Signalintensitäten besitzen. Dadurch zeigen sie verschiedene Helligkeiten. Um also z. B. zwei
Gewebe A und B deutlich voneinander zu unterscheiden, muss die Differenz ihrer
Signalintensitäten möglichst groß sein. Diese Differenz wird als Kontrast bezeichnet[25]:
BAAB SSC −≡ (Gl. 2.16)
Das MR-Signal eines bestimmten Gewebes hängt hauptsächlich von drei intrinsischen
Parametern ab, die bereits in 2.2.1 eingeführt wurden. Es sind die Relaxationszeiten T1 und T2
(T2*) sowie die Protonenspindichte ρ0. Letztere steht gemäß Gl. 2.12 in direkt proportionalem
Verhältnis zur Magnetisierung M0. Unterschiedliche Bildgebungssequenzen können diese
Parameter durch Wahl geeigneter Einstellungen unterschiedlich gewichten, um möglichst
kontrastreiche Bilder zu erhalten.
Wie in 2.2.3 ausführlich dargestellt wird, ist für eine tomographische Bildgebung, d. h. die
Erstellung ortsaufgelöster Bilder, die Verwendung so genannter Gradientenfelder
Voraussetzung. Dabei ändert sich das Magnetfeld bzw. die Larmorfrequenz entlang einer
Ortskoordinate linear. Die Gradientenfelder bewirken eine Dephasierung der Protonenspins,
in gleicher Weise wie sie bei den transversalen Relaxationsmechanismen in 2.2.1 beschrieben
wurde. Um den Verlust der transversalen Magnetisierung zu kompensieren, müssen in der
MRT Puls-Sequenzen eingesetzt werden, die zu einer partiellen Rephasierung der Spins
führen. Die wichtigsten dazu eingesetzten Puls-Sequenzen sind die Gradientenecho- sowie die
Spinecho-Sequenz. Sie unterscheiden sich im Wesentlichen im Einfluss der transversalen
Relaxation. Während das Signal in der Gradientenecho-Sequenz von der Zeit T2* abhängt, ist
das Spinecho in der Lage die stationären Inhomogenitäten (Signalverlust durch T2’) zu
kompensieren, weshalb lediglich T2 das Signal einer Spinecho-Sequenz beeinflusst. Das
Signal zur Echozeit TE im Gradientenecho errechnet sich zu[25]:
*21 //
0 )1()( TTETTRE eeTS −−−= ρ (Gl. 2.17)
TR ist die Wiederholzeit, d. h. die Zeit, nach der die komplette Sequenz wiederholt wird. Die
mehrfache Wiederholung einer Sequenz ist für die dreidimensionale räumliche Darstellung
notwendig.
In der MRT werden grundsätzlich bipolare Gradienten verwendet. Dabei wird für eine
bestimmte Zeit ein magnetischer Gradient in einer Richtung angelegt und dieser anschließend
für einen anderen Zeitraum umgekehrt. In der typischen Gradientenechosequenz wird bereits
während des 90° Anregungspulses ein solcher Gradient eingesetzt, um bestimmte Protonen im
Körper selektiv anzuregen. Die dadurch entstandenen Phasenwinkel der angeregten Protonen
2 Theoretische Einführung
19
werden durch den umgekehrt gepolten Gradienten wieder zusammengeführt, so dass die
Phasenkohärenz wiederhergestellt wird, was sich in einer Zunahme der Mxy-Magnetisierung
äußert und schließlich in einem Maximum gipfelt. Der Auslesezeitraum, also die zur
Bildkonstruktion nötige Signaldetektion, beinhaltet dieses Signalmaximum, welches als Echo
bezeichnet wird. Entscheidend ist, dass das Gradientenecho in allen Bildgebungssequenzen
immer enthalten ist und beim im Folgenden diskutierten Spinecho überkompensiert wird. Die
Wirkung eines Gradienten ist der in 2.2.1 diskutierten Wirkung der in der Zeitkonstante T2’
zusammengefassten stationären Feldinhomogenitäten vergleichbar. Das ist der Grund für die
Reversibilität des durch sie bewirkten Signalverlusts.
Für das Signal in einer Spinecho-Sequenz zeigt sich folgende Abhängigkeit von der Echozeit
TE[25]:
21 //0 )1()( TTETTR
E eeTS −−−= ρ (Gl. 2.18)
Beim Spinecho erfolgt derselbe Einsatz von Gradientenfeldern wie beim Gradientenecho-
Verfahren. Der für den Signalverlauf entscheidende Unterschied liegt im Einsatz der 180°
Refokussierungspulse. Kurz nach der Schaltung der zur Ortsauflösung nötigen Gradienten
wird von der Senderspule ein 180°-Puls in den untersuchten Bereich eingestrahlt (nach einer
Zeit von TE/2 nach dem 90° Anregungspuls). Dieser bewirkt eine Inversion der Phasenwinkel
der mit unterschiedlichen Larmorfrequenzen rotierenden Spinpakete (T2’-Anteil). Durch
diesen Puls werden die durch die stationären Inhomogenitäten (B0 und gewebeintrinsische)
und Gradientenfelder bewirkten Unterschiede in den Larmor-Frequenzen kompensiert. Das
gemäß des FID abgefallene Signal schwillt daraufhin bis zur Echozeit TE wieder an und fällt
nach dem Echo wieder ab. Dieser Prozess kann durch das Einstrahlen weiterer 180°-Pulse in
einem Multispinecho-Verfahren beliebig oft wiederholt werden. Da das Spinecho in der Lage
ist, die stationären (T2’), nicht aber die z.B. durch Diffusion bewirkten fluktuierenden (T2)
Inhomogenitäten zu kompensieren, fällt die Einhüllende der Echos exponentiell mit der
Zeitkonstante T2 ab (Abb. 2.8).
2 Theoretische Einführung
20
90°180°180° 180°
Time
exp(-t/T2*)
FIDexp(-t/T2)
TETE TE
Abb. 2.8: Schematische Darstellung des klassischen Spinecho-Experiments zur Kompensation
der stationären Feldinhomogenitäten. Das Spineecho refokussiert auch den durch die
Gradientenbeschaltung bewirkten Signalverlust.
Der für die Bildkonstruktion verwendete Auslesevorgang erfolgt sowohl im Gradientenecho
als auch im Spinecho üblicherweise zur Zeit des ersten Echos. Anschließend (nach der Zeit
TR) wird die komplette Sequenz mit dem Einstrahlen des nächsten 90° Pulses mehrfach
wiederholt. Für diesen 90° Puls steht aber nur der Teil der longitudinalen Magnetisierung Mz
zur Verfügung, der durch die T1-Relaxation bereits wieder die Gleichgewichtslage erreicht
hat. Dieser Sachverhalt wird in Gl. 2.17 und Gl. 2.18 durch die entsprechenden Faktoren
(1-exp(-TR/T1) ausgedrückt. Dadurch führen große T1-Zeiten häufig zu einer langen
Messdauer, weil hohe Wiederholzeiten TR gewählt werden müssen.
Die T2-gewichtete Bildgebung ist gegenüber der T2*-gewichteten weniger artefaktanfällig und
liefert höhere Auflösungen. Dafür ist das Spinecho-Verfahren zeitlich aufwändiger.
Außerdem werden kontrastverbessernde intrinsische Suszeptibilitätsunterschiede
kompensiert.
Die genaue Natur der zur dreidimensionalen Ortsauflösung nötigen Gradientenfelder
(Schichtselektion, Frequenzkodierung und Phasenkodierung) wird in 2.2.3 ausführlich
beschrieben.
2.2.3 Tomographische Bildgebung
Bisher wurden die Grundlagen der Kern-Resonanz beschrieben und diskutiert, wie es zu
einem messbaren Signal kommt. Um aber eine ortsaufgelöste Bildgebung zu ermöglichen,
müssen die NMR Signale der Protonen im Körper Ortskoordinaten zugeordnet werden. Der
2 Theoretische Einführung
21
Schlüsselschritt dazu ist, dass verschiedene Regionen im Körper unterschiedliche
magnetische Feldstärken erfahren. Dadurch wird jeder dieser Regionen eine eigene
Larmorfrequenz zugeordnet, was sie beispielsweise selektiv anregbar macht.
Die Ortsauflösung soll hier am Beispiel der Schichtselektion kurz dargestellt werden. Um eine
Ortsabhängigkeit der Larmorfrequenz in z-Richtung zu erreichen, wird in dieser Richtung ein
magnetischer Feldgradient Gz angelegt, der das statische Feld B0 überlagert (Abb. 2.9).
Dadurch gilt für die Larmorfrequenz:
)()()( 0 zGBzBz z+⋅=⋅= γγω (Gl. 2.19)
Dieser Feldgradient wird durch eine zusätzliche Spule verursacht, welche das Magnetfeld in z
linear ändert.
0
γB0
ω=γ(B 0+G z
z)
Schichtauswahl-Position
Lar
mor
freq
uenz
ω
∆ω
∆z
0
γB0
ω=γ(B 0+G z
z)
Schichtauswahl-Position
Lar
mor
freq
uenz
ω
∆ω
∆z
Abb. 2.9: Schematische Darstellung der selektiven Anregung von Protonen in der Schicht ∆z
durch Anlegen eines Magnetgeldgradienten Gz.
Jetzt wird ein Radiofrequenz-Puls eingestrahlt, der alle Protonen, die eine Larmorfrequenz im
Intervall ∆ω besitzen, anregt. Die Frequenzbreite ∆ω korreliert dabei mit der Schichtdicke ∆z,
wie in Abb. 2.9 dargestellt. Da der Puls alle zu anderen Ortskoordinaten gehörigen
Larmorfrequenzen nicht enthält, werden diese nicht angeregt und tragen somit zur Bildgebung
nicht bei. Dieser Vorgang wird daher auch als Schichtselektion bezeichnet. Nach der
Schichtselektion wird zur Auflösung der y-Koordinate ein Phasenkodiergradient angelegt. Die
weiterhin notwendige Auflösung in x-Richtung erfolgt über den Frequenzkodiergradienten.
Als Beispiel sind in Abb. 2.10 MR-Bilder einer Maus in sagittaler und transversaler
2 Theoretische Einführung
22
Schichtung dargestellt. In den Bildern sind einzelne Regionen bzw. Blutgefäße durch
unterschiedliche Helligkeiten gut erkennbar. So zeichnen sich in b beispielsweise die große
Hohlvene und weitere Gefäßstrukturen durch eine hohe Helligkeit aus, wohingegen der
Magen durch eine geringe Signalintensität gekennzeichnet ist und somit dunkel erscheint.
a
b
Abb. 2.10: Sagittales (a) bzw. transversales (b) MR-Bild einer Maus. Unterschiedliche
Gewebe und Organe oder Blutgefäße sind durch unterschiedliche Signalintensitäten
(Helligkeiten) deutlich voneinander unterscheidbar.
2.2.4 Kontrastmittel in der Magnetresonanztomographie
Das NMR Signal eines Gewebes und somit auch der Kontrast zwischen verschiedenen
Regionen ist im Wesentlichen durch die intrinsischen Parameter Protonendichte und
Relaxationszeit charakterisiert. Durch Bildgebungssequenzen können diese Parameter
unterschiedlich gewichtet werden. In bestimmten Fällen ist trotzdem der Einsatz von
Kontrastmitteln erforderlich, um bestimmte Regionen oder Gewebe deutlich voneinander
abzugrenzen. Ein solches Kontrastmittel verändert das MR-Signal im Bereich seiner
Akkumulation. Daher sollte das Ziel einer Kontrastmittelapplikation immer seine selektive
Anreicherung im gewünschten Bereich sein, um dort das Signal zu verändern. Nur so ist eine
Kontrastverbesserung zum umliegenden Gewebe möglich, dessen Signal unverändert bleibt.
2 Theoretische Einführung
23
Die Wirkung eines Kontrastmittels besteht allgemein in der Verkürzung der T1- oder T2/T2*-
Relaxationszeiten. Die zur Kontrastmittelapplikation verwendete Sequenz ist also entweder
T1- oder T2-gewichtet. Grundsätzlich lassen sich Kontrastmittel in zwei Typen unterscheiden.
Positive Kontrastmittel verkürzen die longitudinale Relaxationszeit T1. In den gängigen
Bildgebungssequenzen führt das zu einer Signalzunahme. Dadurch erscheint das Bild in der
betrachteten Region hell. Konventionelle T1-Kontrastmittel bestehen aus paramagnetischen
Chelaten der Ionen Gadolinium(III) oder auch Mangan(II). Wichtig ist hier, dass die parallel
zur T1-Verkürzung stattfindende T2-Verkürzung minimiert wird, da es sonst zur
Signalauslöschung kommt. Negative Kontrastmittel bewirken eine drastische Verkürzung der
transversalen Relaxationszeiten T2 und T2*. Dieser Effekt überwiegt den trotzdem
vorhandenen T1-Effekt deutlich. Diese T2/T2*-Kontrastmittel führen zu einer signifikanten
Signalreduktion im Bereich ihrer Akkumulation und erzeugen somit ein dunkles Bild.
Negative Kontrastmittel bestehen aus superparamagnetischen Eisenoxid Partikeln (SPIO) und
finden seit 20 Jahren klinische Anwendung. Es handelt sich dabei allerdings um Systeme, die
durch breite Teilchengrößenverteilungen, hohe Tendenz zur Aggregatbildung und ein
geringes Maß an biologischer Spezifität gekennzeichnet sind. Trotzdem lassen sie sich gemäß
ihres hydrodynamischen Durchmessers in verschiedene Klassen unterteilen[28].
Um die Effektivität eines Kontrastmittels quantitativ zu beschreiben, werden die Relaxivitäten
wie folgt eingeführt:
][][11
0,
0,
CArRRCArTT
iiii
ii
+=≡+= (Gl. 2.20)
Dabei sind Ti die entsprechenden Relaxationszeiten, Ri die Relaxationsraten, [CA] die
Kontrastmittelkonzentration und ri die Relaxivitäten. Letztere beschreiben die Verkürzung der
Relaxationszeit pro Konzentrationseinheit und sind auf Grund des linearen Zusammenhanges
konzentrationsunabhängige Werte. In der weiteren Diskussion werden daher nur noch die
Relaxivitäten zur Beschreibung der Kontrastmittel verwendet.
Die Relaxivität eines Kontrastmittels setzt sich grundsätzlich aus zwei Beiträgen
zusammen[29, 30]. Die inner-sphere Relaxivität riIS berücksichtigt Beiträge durch
Wassermoleküle, die direkt an das Kontrastmittel gebunden sind. Sie ist ein wichtiger Beitrag
bei der Behandlung von T1-Kontrastmitteln wie der paramagnetischen Gd-Komplexe. Die
outer-sphere Relaxivität riOS erfasst die Relaxation der Protonen von Wasser-Molekülen, die
in der Umgebung diffundieren. Sie stellt den wichtigsten Beitrag bei der Behandlung von T2-
Kontrastmitteln, wie etwa der oben beschriebenen SPIO, dar. Das große magnetische Moment
2 Theoretische Einführung
24
eines superparamagnetischen Nanopartikels ist dafür verantwortlich, dass der magnetische
Wirkradius deutlich größer ist als bei einem einzelnen paramagnetischen Ion. Für ein
superparamagnetisches Partikel hängt der outer-sphere Beitrag zur transversalen Relaxation
von zahlreichen Parametern ab. Es gilt:
][)(4135
6412
0
2
CADR
NxLN
T H
AgP ⋅
⋅= µ
π
γµπ (Gl. 2.21)
Ng beschreibt die Zahl der Partikel in einem Aggregat, µP das magnetische Moment eines
einzelnen Partikels, RH den hydrodynamischen Radius und D den Diffusionskoeffizienten.
L(x) ist die Langevin-Funktion (vgl. 2.1.1) und gibt an, ob das System bis zur
Sättigungsmagnetisierung magnetisiert ist, was für kleine Teilchen bei gängigen Feldstärken
(1-2 T) nicht notwendigerweise der Fall ist. Gl. 2.21 zeigt, dass für die Konstruktion
neuartiger Negativ-Kontrastmittel sowohl materialintrinsische Parameter wie die
Zusammensetzung als auch Größe und Form präzise einstellbar sein müssen. Wie in 2.1.5
erläutert wurde, hängt die Sättigungsmagnetisierung MS sehr stark von der Teilchengröße ab.
Die r2-Relaxivität wiederum wird direkt über MS bestimmt. Zusammensetzung, Form und
Größe werden heute durch organometallische Hochtemperatursynthesen auch für Eisenoxid
und andere Ferrite oder Metall-Nanopartikel zielgenau eingestellt. Ein weiterer
Schlüsselaspekt ist die Aggregation der Partikel, welche idealerweise verhindert oder nach
Möglichkeit ebenfalls kontrollierbar sein sollte. Dazu wurden verschiedene Strategien
entwickelt, um hydrophobe, durch organometallische Hochtemperatursynthese hergestellte
Nanopartikel in wässrige Lösung zu überführen. Eine vollständige Verhinderung der
Aggregation ist insbesondere für die Entwicklung von positiven Kontrastmitteln notwendig,
da die r2-Relaxivität hierfür begrenzt werden muss.
Die kontrollierte Aggregation von Partikeln etwa in Mizellen gilt als viel versprechender
Ansatz bei der Entwicklung von negativen Kontrastmitteln[31-35]. Der Relaxivitätskoeffizient
r2 steigt dabei stark an. Grundsätzlich stehen verschiedene Theorien zur Verfügung, welche
die transversale Relaxation von Protonen in Anwesenheit magnetischer Partikel beschreiben.
Diese sind schematisch in Abb. 2.11 dargestellt. Für relativ kleine Partikel gilt das Motional
Averaging Regime (MAR), für das auch die in Gl. 2.21 angegebene Relaxationsformel gilt.
Ein Größenanstieg bewirkt hier einen Anstieg in der transversalen Relaxivität, was durch die
Diffusionskorrelationszeit τ=r2/D ausgedrückt wird. Der Phasenverlust der Protonen wird in
dieser Theorie durch irreversible Diffusionseffekte bewirkt. Der hierdurch bewirkte
Signalverlust wird durch die Refokussierungspulse einer Spinecho-Sequenz nicht wieder
2 Theoretische Einführung
25
hergestellt. Dadurch sind die Relaxivitäten r2 und r2* im MAR gleich. Bei weiterer
Größenzunahme des magnetischen Partikels kommt es ab eines bestimmten Radius zu keiner
weiteren Steigerung der Relaxivitäten r2 und r2*. An diesem Punkt ist der Wirkradius des
magnetischen Partikels so groß, dass Diffusion keinen Einfluss mehr auf den Signalverlust
hat. Die Wassermoleküle werden hier als statisch betrachtet. In diesem Größenbereich wird
die Protonenrelaxation durch das Static Dephasing Regime (SDR) beschrieben. Das
Kontrastmittel verursacht im Bereich des SDR den maximalen T2*-Beitrag. Daher gibt das
SDR eine Obergrenze für die transversale Relaxivität an, also die mit dem Partikel maximal
erreichbare Effektivität des Kontrastmittels.
Bei weiterer Größenzunahme geht das System schließlich ins Echo-Limiting Regime (EL)
über. In diesem Bereich nimmt die in Spinecho-Sequenzen eingehende Relaxivität r2 ab,
wohingegen die für den Signalverlauf einer Gradientenecho-Sequenz charakteristische
Relaxivität r2* gleich maximal bleibt. Der Grund für die Abnahme der Relaxivität r2 liegt in
der Reversibilität des durch die stationären Inhomogenitäten verursachten Signalverlusts. Je
kürzer in der Spinecho-Sequenz die Echozeiten TE gewählt werden, desto größer wird der
refokussierbare Anteil des Signals. Dadurch wird die Relaxationszeit T2 größer.
2 Theoretische Einführung
26
Echo-Limiting-Regime
Static-Dephasing-RegimeMotional-Averaging-
Regime
r2*
/ r2
τ=r2/D
Abb. 2.11: Darstellung der verschiedenen theoretischen Bereiche zur Beschreibung der
transversalen Relaxivitäten r2 und r2* in Abhängigkeit von der Diffusionskorrelationszeit τ
im MAR, SDR und EL.
In 2.2.2 wurde erläutert, dass in den typischen Bildgebungssequenzen das detektierbare Signal
sowohl eine Funktion der longitudinalen Relaxation als auch der transversalen Relaxation ist.
Daher müssen auch bei der Charakterisierung der Kontrastmittel immer beide Prozesse
berücksichtigt werden. Für die Entwicklung eines positiven Kontrastmittels ist es neben einer
möglichst hohen r1-Relaxivität wichtig, dass die r2-Relaxivität minimiert wird. Gemäß
Gl. 2.21 wird das erreicht, indem Aggregation verhindert wird und das magnetische Moment
pro Partikel µP nicht zu große Werte annimmt. Ein negatives Kontrastmittel, welches in
Spinecho-Sequenzen eingesetzt werden soll, sollte im für das SDR gültigen Größenbereich
liegen. Negative Kontrastmittel für Gradientenecho-Sequenzen sollten ebenfalls durch das
SDR beschreibbar sein. In Kombination mit biologischer Spezifität ist es hier möglich,
Stoffwechsel-Kinetiken zu untersuchen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf Basis superparamagnetischer Nanopartikel optimierte
Kontrastmittel für die T1-, T2- und T2*-gewichtete Bildgebung entwickelt und somit alle
beschriebenen Aspekte beachtet und diskutiert.
3 Experimenteller Teil
27
3 Experimenteller Teil
3.1 Chemikalien
Alle Chemikalien wurden, soweit nicht ausdrücklich erwähnt, ohne zusätzliche Aufreinigung
in der höchsten erhältlichen Reinheit eingesetzt. Im Anhang sind alle Chemikalien mit ihren
Sicherheitshinweisen aufgeführt.
3.2 Synthese von Ferrit-Nanopartikeln
3.2.1 Synthese von Fe3O4-Nanopartikeln
Es wurden drei alternative Vorschriften verwendet, um die Größe der Nanopartikel zu
variieren.
Nach Sun et al.[36-38] wurden zur Synthese von 4 nm großen Nanopartikeln 700 mg (2 mmol)
Eisen-trisacetylacetonat, 1.7 g (6.0 mmol) Ölsäure, 1.6 g (6.0 mmol) Oleylamin, 2.6 g
(10 mmol) 1,2-Hexadekandiol und 20 ml Diphenylether unter einem N2-Strom für 30 min auf
200 °C geheizt. Anschließend wurde unter N2-Atmosphäre für weitere 30 min auf ∼270 °C
erhitzt. Dann wurde auf Raumtemperatur abgekühlt.
Die Synthese von 6 nm großen Partikeln erfolgte in Dibenzylether. Dabei wurde für 2 h auf
200 °C und für 1 h auf ∼300 °C erhitzt.
Die Darstellung von 10 nm großen Teilchen erfolgte nach Hyeon et al.[39] Unter N2-
Atmosphäre wurden 1.28 g (4.56 mmol) Ölsäure und 10 ml Dioctylether auf 100 °C erhitzt.
Anschließend wurden 0.2 ml (1.5 mmol) Eisenpentacarbonyl schnell in die Lösung injiziert
und diese für 1 h bei 300 °C refluxiert. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden
0.34 g (4.5 mmol) Trimethylamin-N-oxid zugesetzt und das Reaktionsgemisch für 1 h auf
130 °C geheizt. Dann wurde für 1 h bei ∼300 °C refluxiert und auf Raumtemperatur
abgekühlt.
Für die Synthese größerer Teilchen (20-30 nm) wurde die Synthese von Yu et al.[40]
verwendet. Dabei wurden 0.18 g (2.0 mmol) Eisen(III)oxyhydroxid mit 2.3 g (8.0 mmol)
Ölsäure und 5.0 g 1-Octadecen versetzt und unter N2-Atmosphäre für 1 h auf 320 °C erhitzt.
Die Größenvariation erfolgte über das Verhältnis von Ölsäure zu Eisen(III)oxyhydroxid.
3 Experimenteller Teil
28
3.2.2 Synthese von MnFe2O4 Nanopartikeln
Nach Kang et al.[41] wurden 170 mg (0.45 mmol) Decacarbonyl-dimangan und 2.3 ml
(7.3 mmol) Ölsäure in 10 g Dioctylether gelöst und unter N2-Atmosphäre auf 130 °C erhitzt.
Unter intensivem Rühren wurden 0.2 ml (1.5 mmol) Eisenpentacarbonyl schnell in die
Lösung injiziert. Dann wurde für 1 h auf 300 °C erhitzt und zügig auf ∼50 °C abgekühlt.
Anschließend wurden 0.34 g (4.5 mmol) Trimethylamin-N-oxid zugegeben und das
Reaktionsgemisch für 1 h auf 140 °C erhitzt. Dann wurde erneut 1 h bei ∼300 °C refluxiert.
3.2.3 Aufreinigung der Nanopartikel
Die Nanopartikel wurden zunächst mit ∼50 ml Fällungsmittel (Ethanol oder Aceton) versetzt
und zentrifugiert (10 min, 3260g). Der Überstand wurde verworfen und der Rückstand in 5 ml
Lösungsmittel (Hexan oder Chloroform) dispergiert. Dann wurden erneut ∼30 ml
Fällungsmittel zugegeben und zentrifugiert (10 min, 3260g). Der schwarze Niederschlag
wurde in 5 ml Hexan oder Chloroform gelöst, durch einen 0.2 µm PTFE Spritzenfilter filtriert
und dann als kolloidale Lösung gelagert.
3.3 Synthese der Polyethylenglykol-Liganden
3.3.1 Veresterung von Polyethylenglykol-monomethylether mit POCl3
Zur Phosphatesterbildung wurden 5 mmol des entsprechenden Polymers im Vakuum bei
80 °C 1 h gerührt um Spuren von Wasser zu entfernen. Nach dem Abkühlen auf
Raumtemperatur wurden 15 ml Tetrahydrofuran zugegeben und die Lösung mit einem Eisbad
gekühlt. Unter intensivem Rühren wurden 0.6 ml POCl3 zugegeben, wobei darauf zu achten
war, dass die Temperatur nicht über 5 °C stieg. Die klare Lösung wurde anschließend 3 h bei
Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 ml Wasser beendet und
das Rohprodukt dreimal mit je 15 ml Chloroform extrahiert. Das Lösungsmittel wurde am
Rotationsverdampfer entfernt und das Produkt im Vakuum getrocknet.
3.3.2 Veresterung von Polyethylenglykol-monoacrylat mit POCl3
Die Veresterung erfolgte analog der in 3.3.1 beschriebenen. Allerdings wurden dem
Reaktionsgemisch vor der Phosphorylierung 0.9 ml Triethylamin zugesetzt, um eine Spaltung
des Acrylsäureesters zu verhindern.
3 Experimenteller Teil
29
3.3.3 Synthese von Polyethylenglykol-Liganden mit Carbonsäure-
Ankergruppe
Zur Micheal-Addition wurden 2.5 mmol Polyethylenglykol-monoacrylat mit 2.5 mmol
3-Merkaptopropionsäure oder 2-Merkaptobernsteinsäure und 7.5 mmol
N-Ethyldiisopropylamin versetzt. Anschließend wurde das Gemisch ∼5 ml in einer Lösung
aus Methanol und Chloroform (80:20, V/V) für ∼24 h auf 40 °C erhitzt. Das Rohprodukt
wurde durch Zugabe von Diethylether gefällt und im Vakuum getrocknet.
3.4 Ligandenaustausch-Reaktionen
3.4.1 Ligandenaustausch mit Phosphat-funktionalisiertem
Polyethylenglykol
10 mg der entsprechenden Nanopartikel wurden in 0.3 ml Tetrahydrofuran dispergiert.
Parallel dazu wurden 50 µl des Polymers in 1 ml einer 0.05 M Kaliumhydroxidlösung gelöst.
Beide Ansätze wurden vereinigt und für ∼12 h auf 60 °C erhitzt. Das Tetrahydrofuran wurde
nach dem Abkühlen im N2-Strom verdampft und die so erhaltene wässrige Lösung durch
einen 0.2 µm PTFE Spritzenfilter filtriert. Zur weiteren Aufreinigung und um das
überschüssige Polymer zu entfernen, wurde die Probe dreimal mittels eines Vivaspin
10000 MWCO Zentrifugenfilters bei 4000g aufkonzentriert und verdünnt.
3.4.2 Ligandenaustausch mit Carboxylat-funktionalisiertem
Polyethylenglykol
10 mg der Nanopartikel wurden in 0.2 ml Dichlorbenzol gelöst. 100 mg des Liganden wurden
in 0.2 ml Dimethylsulfoxid gelöst. Die beiden Lösungen wurden vereinigt und unter Rühren
für ∼24 h auf 100 °C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden die Teilchen durch Zugabe von
0.3 ml Ethanol, 0.05 ml Chloroform und ∼1 ml n-Hexan gefällt und zentrifugiert (10 Minuten,
4000g). Anschliend wurden die Teilchen in ∼1 ml Wasser gelöst. Die weitere Aufreinigung
wurde wie in 3.4.1 beschrieben durchgeführt.
3 Experimenteller Teil
30
3.5 Zytotoxizitäts-Untersuchungen
Um die Zytotoxizität von Nanopartikeln zu untersuchen, wurden verschiedene Zelllinien
verwendet, um die typischen Aufnahmewege anorganischer Nanopartikel zu erfassen. In
dieser Arbeit wurden A549 Lungenkrebszellen, humane Fibroblasten, CaCo-2 Darmzellen
sowie murine J774 Makrophagen verwendet. Als etablierte Zelltests wurden MTT-, Wst-8-,
LDH- und ROS-Tests durchgeführt. Die Wst-8-, LDH-, und ROS-Tests wurden im Zentrum
für Angewandte Nanotechnologie (CAN) durchgeführt und werden hier nicht näher
beschrieben. Der MTT-Test sowie die Zellfärbung wurden am Universitätkrankenhaus
Hamburg-Eppendorf in der Gruppe von Prof. Dr. Ulrike Beisiegel (Institut für Molekulare
Zellbiologie) durchgeführt.
3.5.1 Untersuchungen an J774-Makrophagen mittels MTT
Murine Makrophagen (J774) wurden im 96 Well-Mikrotiterplatten-Maßstab in einer
Konzentration von 104 Zellen pro Well in RPMI 1640 + Glutamax mit 10 % FCS, 25 mM
Hepes und 0.5 % Penicillin-Streptomycin kultiviert. Die Eisenoxid-Nanopartikel wurden aus
konzentrierter wässriger Lösung so zugegeben, dass die Eisenkonzentration in den Wells
200 µg/ml, 20 µg/ml, 2 µg/ml oder 0,2 µg/ml betrug. Die Inkubationszeit der Ansätze betrug
24 h. Das Inkubationsmedium wurde dann entfernt und durch neues ersetzt, welches
0.5 mg/ml MTT enthielt. Die Zellen wurden weitere 3 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend
wurde das Medium erneut entfernt und die Zellen mit DMSO lysiert. Die Absorption wurde
bei 540 und 620 nm gemessen.
3.5.2 Berliner Blau-Zellfärbung an J774-Makrophagen
Die Makrophagen wurden mit einer Dichte von 50000 Zellen pro Well im 24-Well-Platten-
Ansatz in RPMI 1640 + Glutamax mit 10 % FCS, 25 mM Hepes und 0.5 % Penicillin-
Streptomycin auf Deckgläschen aus Glas kultiviert. Um die Konzentrationsabhängigkeit der
unspezifischen Aufnahme von Eisenoxid-Nanopartikeln zu untersuchen, wurden die Teilchen
aus konzentrierter Lösung so zugegeben, dass drei verschiedene Inkubationskonzentrationen
erreicht wurden (200 µg/ml, 20 µg/ml und 2 µg/ml). Die Zellen wurden 24 h mit den
Nanopartikeln inkubiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und
mit 4 % Paraformaldehyd für 30 min bei Raumtemperatur fixiert. Zur intrazellulären
Eisenfärbung wurden die Zellen bei 37 °C mit 2 ml einer Lösung aus gleichen
3 Experimenteller Teil
31
Volumenanteilen von 2 % Salzsäure und 2 % Kalium-hexacyanoferrat(II)-trihydrat-Lösung
versetzt und 30 min inkubiert. Abschließend wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen.
3 Experimenteller Teil
32
3.6 Charakterisierungsmethoden
3.6.1 Transmissionselektronenmikroskopie (high resolution transmission
electron microscopy (HRTEM))
Die transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden an einem Philips CM-300
UT Mikroskop bei 300 kV und alternativ an einem Jeol JEM-1011 bei 100 kV vorgenommen.
Zur Messung wurde eine verdünnte Dispersion der Nanopartikel in ca. 0.5 ml Lösungsmittel
hergestellt. Von dieser Dispersion wurden 10 µl auf einen mit amorphem Kohlenstoff
beschichteten Kupfer-Träger aufgetragen und das Lösungsmittel abgezogen. Der Träger
wurde anschließend mindestens 24 h an der Luft getrocknet.
3.6.2 Pulver-Röntgendiffraktometrie (powder X-ray diffraction (XRD))
Die Pulver-Röntgendiffraktometrie wurde an einem Philips X’Pert-Diffraktometer mit Bragg-
Brentano-Geometrie gemessen. Dabei wurde Kupfer-Kα-Strahlung (Wellenlänge
λ=0.154 nm) verwendet. Da Proben aus kristallinen Nanopartikeln eine größenabhängige
Linienverbreiterung der Reflexe im Diffraktogramm bewirken, wurde zur Größenbestimmung
die Debye-Scherrer-Gleichung herangezogen. Für die Linienbreite in Höhe der halben
Maximalintensität gilt[42]:
θ
λ
cos
3.57
⋅
⋅⋅=
D
KH B (Gl. 3.1)
In Gl. 3.1 ist HB die Reflex-Halbwertsbreite, K der Formfaktor (K≈0.89 für sphärische
Teilchen) und D der Durchmesser der kristallinen Domänen oder der Teilchen, falls diese
einkristallin sind.
Die Proben wurden vorbereitet, indem einige Tropfen einer konzentrierten Dispersion der
Nanopartikel auf einen Silizium-Träger aufgetragen wurden.
3.6.3 Foner-Probenvibrationsmagnetometrie
Die Magnetometermessungen wurden auf einem Probenvibrationsmagnetometer (Princeton,
Model 155, Magnet: Bruker B-E 25C 8u) durchgeführt. Für eine typische Messung wurden
15-20 mg der Nanopartikel eingewogen. Die magnetische Feldstärke wurde zwischen 0 und
1 T variiert.
3 Experimenteller Teil
33
3.6.4 Infrarot-Spektroskopie (IR)
Zur Untersuchung der Oberflächenbeschichtung der Nanopartikel wurde ein Bruker Equinox
55 FT-IR-Spektrometer verwendet. Dazu wurde eine ATR (attenuated total reflectance)
Einheit verwendet. Die kolloidale Lösung wurde auf die Diamantzelle getropft und
eingetrocknet.
3.6.5 Thermogravimetrie (TG)
Die Thermograviemetriemessungen wurden auf einem Netzsch TG 209 F1 durchgeführt.
Dabei wurden 5 mg Trockenmasse der zu untersuchenden Probe in einem Al2O3-Tiegel
eingetrocknet. Die Probe wurde mit einer Heizrate von 10 K/min bis auf 900 °C aufgeheizt
und der Massenverlust detektiert. Bei 900 °C wurde die Temperatur zunächst 30 min unter
N2-Strom (20 ml/min) und dann unter N2/O2-Strom (20 ml/min) 15 min gehalten.
3.6.6 Kernresonanz-Spektroskopie (NMR)
Die 1H-NMR Spektren wurden mit einem Bruker AMX400 Spektrometer bei einer Frequenz
von 400 MHz aufgenommen. Alternativ wurde auf einem Bruker DRX500 Avance
Spektrometer bei 500 MHz gemessen. Die Vorbereitung der Proben erfolgte, indem ∼10 mg
Substanz in 0.7 ml deuteriertem Lösungsmittel (Chloroform-d1 oder DMSO-d6) gelöst
wurden. Zur Auswertung der Spektren wurde das Programm MestRe-C (4.7.0.0) verwendet.
3.6.7 Gel-Filtrations-Chromatographie (GFC)
Die Gel-Filtrations-Chromatographie wurde auf einer Superose-6 10/300 GL Säule
(Amershan Bioscience) bei einem Fluss von 0.5 ml/min durchgeführt.
Zur Eisenbestimmung[43] in den Fraktionen wurden 200 µl jeder Fraktion mit 50 µl 5 M
Salzsäure versetzt und bei 70 °C 30 min inkubiert. Anschließend wurden von jeder so
behandelten Fraktion 50 µl entnommen und mit 150 µl einer 2 M Acetat-Pufferlösung
(pH=4.8), die 10 % Ascorbinsäure enthielt, versetzt. Dann wurden 100 µl einer
Bathophenanthrolin-Lösung (1 mg/ ml) zugesetzt. Nach 15 min Inkubation wurde bei 540 nm
die Absorption gemessen.
3 Experimenteller Teil
34
3.6.8 Dynamische Lichtstreuung (DLS)
Die dynamische Lichtstreuung wurde an einem Malvern Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 bei
einer Laser-Wellenlänge von 633 nm durchgeführt. Dispersionen in organischen
Lösungsmitteln wurden in Quarzglasküvetten, wässrige Lösungen in Plastikküvetten bei einer
optischen Weglänge von 1 cm vermessen. Zur Bestimmung des hydrodynamischen
Durchmessers wurde die Autokorrelationsfunktion pro Messung über drei Zyklen je 30 s
aufgenommen und aus drei Messungen der Mittelwert gebildet. Die Proben wurden vor der
Messung durch einen 0.2 µm PTFE-Spritzenfilter filtriert.
3.6.9 Atomabsorptionsspektroskopie (AAS)
Die Atomabsorptionsspektroskopie wurde mit einem Perkin-Elmer Graphitrohr AAS 4100
mit HGA 700 Heizeinheit am Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf in der Abteilung für
Biochemie und Molekularbiologie II durchgeführt. Die anorganischen Nanopartikel wurden
dazu in einem Gemisch aus Salpetersäure 65 % (w/V) und Wasserstoffperoxid 30 % (w/V)
nassverascht.
3.6.10 Kernresonanz-Relaxometrie
Zur Bestimmung von T1- und T2-Relaxationszeiten wurde ein minispec mq-60 NMR
Analyzer von Bruker bei einer magnetischen Flussdichte von 1.41 T verwendet.
Die Messung der T1-Relaxationszeit erfolgte über eine Inversion-Recovery-Sequenz bei
20 nicht-äquidistanten Verzögerungszeiten TI zwischen dem Inversionspuls (180°) und dem
90°-Detektionspuls (üblicherweise TI=5-400 ms). Die erhaltenen Datenpunkte wurden mit der
Gleichung M(TI)=M0(1-exp(-TI/T1)) gefittet. Dabei ist M(TI) die Signalintensität zur Zeit TI,
M0 die Gleichgeweichtssignalintensität vor dem Inversionspuls und T1 die longitudinale
Relaxationszeit.
T2 wurde mittels einer Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) Spin-Echo-Sequenz gemessen.
Dabei wurden 200 äquidistante Datenpunkte (t=nTE=2nτ) als vielfaches der Echozeit TE
aufgenommen. τ ist das Zeitintervall zwischen dem 90°-Anregungspuls und dem ersten 180°-
Refokussierungspuls. Die erhaltenen Datenpunkte wurden als monoexponentieller Abfall über
die Gleichung M(t=nTE)=M0 exp(-t/T2) gefittet, wobei M(t=nTE) die Signalintensität zur Zeit
t und T2 die transversale Relaxationszeit ist.
3 Experimenteller Teil
35
3.6.11 Magnetresonanz-Tomographie (MRT)
Alle dynamischen und statischen MRT-Untersuchungen wurden an einem klinischen 3T
Ganzkörper Magnetresonanztomographen (Philips Medical Systems) in der Gruppe von Prof.
Dr. Gerhard Adam in der Abteilung für Klinische und Interventionelle Radiologie,
Universitätskrankenhaus Hamburg-Eppendorf, durchgeführt. Die dynamischen Messungen
der Leber wurden mittels Gradientenecho-Sequenz bei einer Voxel Auflösung von 0.28 ×
0.33 × 2 mm3 durchgeführt. Die zeitliche Auflösung betrug 5.5 s bei einem Signal-zu-Rausch-
Verhältnis von ∼40. Es wurde eine T2*-gewichtete Bildgebung vorgenommen, d.h. es wurde
davon ausgegangen, dass die zeitliche Änderung im Signal S(t) hauptsächlich durch die T2*-
Relaxation verursacht wird (r2*= 800 mM-1s-1, r1= 2.5 mM-1s-1, bei 37 °C). Die Änderung der
Relaxationsrate R2* konnte nach ∆R2*= -ln(S(t)/S0)/TE berechnet werden und korreliert linear
mit der Kontrastmittelkonzentration (Nanosomen) ∆C= ∆R2*/r2* falls r2* sich während der
Messung nicht ändert.
4 Ergebnisse und Diskussion
36
4 Ergebnisse und Diskussion
Die Magnetresonanztomographie (MRT) beruht auf der kernmagnetischen Resonanz von
Protonen, aus denen der menschliche Körper zu 63 % seiner Atome besteht[25]. Für die MRT
ist der Einsatz von Kontrastmitteln daher nicht in jedem Fall erforderlich. Auch wurden in den
vergangenen Jahren große Fortschritte in der technischen Weiterentwicklung von
Tomographen gemacht. Trotzdem ist die Applikation von Kontrastmitteln unerlässlich, wenn
der untersuchte Bereich im Körper trotz optimierter Geräte und Pulssequenzen nicht klar
dargestellt werden kann. Heutige klinische MR-Kontrastmittel lassen sich in zwei Klassen
unterteilen. Die aus paramagnetischen Gadolinium-Komplexen bestehenden positiven
Kontrastmittel führen zu einer Verkürzung der T1-Relaxationszeiten[29, 30], während die aus
superparamagnetischen Eisenoxid-Partikeln (sogenannte SPIO) bestehenden negativen
Kontrastmittel zu einer drastischen Verkürzung der T2- und T2*-Relaxation führen[28, 44-46].
In dieser Arbeit wurden sowohl positive als auch negative Kontrastmittel auf der Grundlage
von superparamagnetischen Ferrit-Nanopartikeln, insbesondere Magnetit (Fe3O4) und
Manganferrit (MnFe2O4) entwickelt. Diese Entwicklung begann mit der Synthese der
anorganischen Nanopartikel. Die Größe und Zusammensetzung der Teilchen hat
entscheidenden Einfluss auf die magnetischen und damit auch auf die kontrastgebenden
Eigenschaften[47, 48]. Neben dieser Einstellung der physikalischen Eigenschaften des
anorganischen Kernes war die Modifizierung der Oberfläche ein wesentlicher Bestandteil der
Arbeit. Diese Modifizierung umfasste das Binden von bestimmten Liganden mit dem Ziel,
Aggregationseffekte sowie chemische und biologische Eigenschaften steuern zu können, was
mit den heutigen klinisch angewandten Kontrastmitteln nur sehr begrenzt möglich ist. Dazu
gehört die Stabilität der Partikel unter physiologischen Bedingungen, welche durch
charakteristische pH-Werte, ionische Stärken und das Vorhandensein von zahlreichen
Proteinen im Blutplasma gekennzeichnet sind. Für diesen Zweck wurden die Teilchen mit
Polyethylenglykol (PEG) umhüllt. Der dritte Aspekt der Entwicklung neuartiger
Kontrastmittel ist einerseits durch das Ziel der Kopplung von Biomolekülen zur molekularen
und zellulären Bildgebung zu beschreiben. Andererseits ist ein Ziel der Entwicklung,
Stoffwechselvorgänge direkt über dynamische MR-Messungen zu verfolgen, d. h. die
Änderung des MR-Signals in der untersuchten Region mit der Akkumulation des
Kontrastmittels und dem metabolischen Vorgang zu korrelieren. Die in dieser Arbeit
beschriebene Entwicklung und Charakterisierung der Kontrastmittel wird sich allen diesen
Aspekten widmen.
4 Ergebnisse und Diskussion
37
4.1 Synthese und Charakterisierung von Ferrit-Nanopartikeln
Heutige klinische auf Eisenoxid basierende Kontrastmittel werden in wässriger Lösung bei
Raumtemperatur hergestellt. Sie sind durch eine breite Teilchengrößenverteilung, erhebliche
Neigung zur Aggregation sowie ein geringes Maß an Kristallinität gekennzeichnet[28, 46]. Ihre
magnetischen und kontrastgebenden Eigenschaften sind daher nur schlecht einstellbar. Daher
werden Nanopartikel nasschemisch heute durch organometallische Hochtemperatursynthesen
hergestellt[34, 37, 49, 50]. Größe, Form, Zusammensetzung, Kristallinität und
Aggregationsverhalten sind dadurch deutlich besser kontrollierbar[51-57]. Entscheidende
Bedeutung kommt den Stabilisatoren zu. Stabilisatoren sind Moleküle, die über eine
bestimmte funktionelle Gruppe auf der Oberfläche binden und somit eine weiteres Wachsen
der Nanokristalle verhindern. Sie verhindern außerdem die Aggregation der Nanoteilchen, da
sie lange organische Ketten aufweisen, die das Nanopartikel sterisch abschirmen (Abb. 4.1).
Die Stabilisatoren bestimmen auch die Löslichkeit der Nanopartikel. Bei den in dieser Arbeit
hergestellten Ferrit-Nanopartikeln wurde Ölsäure als Stabilisator eingesetzt, welche durch
ihre Carboxylgruppe auf der Teilchenoberfläche bindet und mit ihrer langen Alkylgruppe für
eine sterische Stabilisierung sowie eine Löslichkeit in unpolaren Lösungsmitteln wie
Chloroform oder Hexan sorgt.
Fe3O4
Abb. 4.1: Schematische Darstellung der Ölsäure-stabilisierten Fe3O4-Nanopartikel.
Typischerweise wird durch die organometallische Hochtemperatursynthese ein
Teilchengrößenbereich von 4 bis etwa 30 nm abgedeckt, wobei verschiedene Synthesen
4 Ergebnisse und Diskussion
38
veröffentlicht wurden[49, 58, 59]. Eine gängige Methode besteht in der Thermolyse von
Eisenpentacarbonyl in Dioctylether[39]. Abb. 4.2 zeigt als Ergebnis der Synthese 10 nm großer
Magnetitpartikel TEM-Aufnahmen sowohl in der Übersicht als auch in der Hochauflösung.
Die Übersichtsaufnahme belegt eine sehr enge Teilchengrößenverteilung
(Standardabweichung≈5-10 %). Die Hochauflösung (Abb. 4.2) zeigt die Einkristallinität der
Partikel.
50 nm5 nm
Abb. 4.2: TEM-Aufnahmen unterschiedlicher Vergrößerung einer Probe monodisperser
10 nm großer Fe3O4-Nanokristalle. Die Hochauflösung zeigt die Einkristallinität des
Teilchens.
Das Röntgendiffraktogramm der Probe belegt deren Kristallinität. So sind die Reflexe der
kubischen Spinell-Kristallstruktur des Magnetit (Fe3O4) zuzuordnen (Abb. 4.3). Die ermittelte
Teilchengröße nach Debye-Scherrer aus der Halbwertsbreite der Reflexe stimmt ferner gut
mit der aus den TEM-Aufnahmen ermittelten überein. Die gute Größenübereinstimmung von
TEM und XRD belegt die Einkristallinität der Partikel.
4 Ergebnisse und Diskussion
39
20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
norm
iert
e In
tens
ität /
%
2θ / °
Abb. 4.3: Röntgendiffraktogramm einer Probe 10 nm großer Fe3O4-Nanopartikel. Zum
Vergleich sind die Reflexe des Magnetit-Festkörpers gezeigt (rot).
Teilchen geringerer Größe konnten auf ähnliche Weise durch Thermolyse von Eisen-
trisacetylacetonat mit dem Reduktionsmittel 1,2-Hexadekandiol in den Lösungsmitteln
Diphenylether oder Dibenzylether hergestellt werden[36, 37, 55]. So wurden beispielsweise
monodisperse Proben von 6 nm großen Magnetit-Teilchen erhalten (Abb. 4.4 a). Die Synthese
größerer Teilchen (20 nm) erfolgte durch Thermolyse von Eisen-oleat-Komplexen in
1-Octadecen[40, 60]. Auch hier konnten größeneinheitliche Proben synthetisiert werden
(Abb. 4.4 b).
a b
Abb. 4.4: Übersichtsaufnahmen monodisperser Proben von 6 nm (a) und 20 nm (b) großen
Magnetit-Nanopartikeln.
4 Ergebnisse und Diskussion
40
Grundsätzlich wird davon ausgegangen, dass alle hier beschriebenen Synthesen über die
Eisen-Oleat-Zwischenstufen verlaufen[61-63]. Dabei handelt es sich um typische
Aufheizsynthesen, in denen der Metallkomplex, der Stabilisator und das Lösungsmittel
vorgelegt werden und das Gemisch bis zur erforderlichen Temperatur aufgeheizt wird. Die
nasschemische Synthese von Metalloxid-Nanopartikeln wird, wie auch bei Halbleiter- und
Metall-Nanoteilchen nach LaMer[64] in eine Nukleations- und eine Wachstumsphase
unterteilt[58, 62, 65, 66]. Um die Größeneinheitlichkeit der Proben zu gewährleisten, wird die ab
einer Temperatur von ∼200 °C stattfindende Nukleation möglichst kurz gehalten[50].
Auf ähnliche Weise wurden andere Spinell-Ferrite (MxFe3-xO4, x=0-1) wie Manganferrit mit
unterschiedlichem Dotierungsgrad hergestellt[41]. Der Mangan-Anteil wurde durch EDX-
Messungen bestimmt. Auch hier konnte die Größe über einen Bereich von 3-18 nm variiert
werden (Abb. 4.5). Der höchste Anteil an Mangan wurde bei Verwendung des Mn2(CO)10
Komplexes erhalten. Synthesen die neben Eisen-trisacetylacetonat Mangan-bisacetylacetonat
(Mn(acac)2) verwenden, ergaben wegen der schlechten Löslichkeit von Mn(acac)2 nur einen
geringen Dotierungsgrad[52].
4 Ergebnisse und Diskussion
41
a b
c d
Abb. 4.5: TEM-Aufnahmen von MnFe2O4-Nanopartikeln einer Größe von 18 nm (a) und 9 nm
(b) sowie Mangan dotierter Fe3O4-Nanopartikel (6 nm (c) und 7.5 nm (d)).
Untersuchungen zum Magnetismus wurden mit einem Probenvibrationsmagnetometer an
pulverförmigen Proben durchgeführt. Die hergestellten Eisenoxid-Nanopartikel weisen
superparamagnetisches Verhalten auf. Ihre Magnetisierungskurven zeichnen sich daher durch
das Fehlen einer Hysterese aus und unterscheiden sich in Abhängigkeit von der Teilchengröße
sehr stark (Abb. 4.6). So ist deutlich erkennbar, dass die Magnetsierungskurve 8 nm großer
Fe3O4-Nanopartikel bereits bei etwa 5000 Oe (entspricht 0.5 T) in den Sättigungsbereich
übergeht. Die Magnetisierungskurve der 4 nm großen Magnetit-Partikel hingegen ähnelt in
ihrem Verlauf deutlich eher der Magnetisierungskurve eines Paramagneten. Die
Sättigungsmagnetisierung der Probe 4 nm großer Partikel ist außerdem um einen Faktor drei
geringer. Die ermittelten Werte stimmen gut mit anderen Untersuchungen überein[22, 23].
4 Ergebnisse und Diskussion
42
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
100
200
300
400
M /
emu/
cm3
H / Oe
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
100
200
300
400
M /
emu/
cm3
H / Oe
MS=390 emu/cm3
MS=120 emu/cm3
Abb. 4.6: Magnetisierungskurven superparamagnetischer Fe3O4-Nanopartikel
unterschiedlicher Größe. Die Sättigungsmagnetisierung MS 8 nm großer Teilchen
(390 emu/cm3) ist ca. 3 mal höher als die von 4 nm großen Partikeln (120 emu/cm3).
Die Magnetisierungskurven der superparamagnetischen Partikel genügen ferner dem
Langevin-Verhalten, wie durch die Fits der Datenpunkte deutlich wird. Daraus folgt, dass
Anisotropieeffekte nur geringen Einfluss auf das Magnetisierungsverhalten der Partikel
haben. Das superparamagnetische Verhalten der Nanopartikel konnte durch Mößbauer-
Spektroskopie bestätigt werden.
Die Nanopartikel wurden nach der Synthese routinemäßig für die weitere Verwendung
gewaschen. Dabei wurden sie aus der Dispersion durch Zugabe eines Fällungsmittels (z.B.
Ethanol) sedimentiert. Der Überstand wurde durch Zentrifugation abgetrennt und die Teilchen
redispergiert. Auf diese Weise wurden die im Überschuss zugesetzten organischen
Bestandteile entfernt. Um trotzdem den prozentualen Anteil der Stabilisatoren auf der
Teilchenoberfläche zu bestimmen und Erkenntnisse über die Bindungsstärke der
Stabilisatoren zu gewinnen, wurden Thermogravimetriemessungen durchgeführt und
untersucht, wie groß der pro Waschgang von der Teilchenoberfläche entfernte Anteil ist
(Abb. 4.7).
4 Ergebnisse und Diskussion
43
200 400 600 80050
60
70
80
90
100 2 x gefällt 3 x gefällt 4 x gefällt 5 x gefällt
Mas
senv
erlu
st /
%
Temperatur / °C
Abb. 4.7: Thermogravimetrie-Kurven von 4 nm großen Fe3O4-Nanopartikeln. Mit
zunehmender Waschhäufigkeit sinkt der Anteil an Stabilisatoren auf der Teilchenoberfläche.
Die TG-Kurven zeigen, dass nach einer üblichen Aufreinigung von zwei Waschgängen ∼40 %
organische verdampfbare Verbindungen vorhanden sind. Bei diesen dürfte es sich um
Stabilisatoren (Ölsäure) auf der Teilchenoberfläche handeln. Die TG-Kurven zeigen ferner
einen kontinuierlichen Massenverlust bis etwa 600 °C, welcher durch Zersetzungsreaktionen
erklärbar ist. Eine plötzlich stattfindende Desorption der Ölsäure ist nicht zu beobachten.
Jeder weitere Waschgang bewirkt einen zusätzlichen Massenverlust von ∼2-3 %.
Um die Bindung der Ölsäure an die Teilchen genauer zu untersuchen und um in Lösung
stattfindende dynamische Gleichgewichte zu erkennen, wurde die Synthese unter Einsatz von 14C-radiomarkierter Ölsäure durchgeführt. Die Arbeiten wurden am Institut für Molekulare
Zellbiologie von Prof. Dr. Ulrike Beisiegel am Universitätskrankenhaus Hamburg-Eppendorf
in enger Kooperation mit PD Dr. Jörg Heeren durchgeführt. 14C ist ein β-Strahler mit einer
Halbwertszeit von 5730 Jahren. Die Standard-Synthese 4 nm großer Fe3O4-Nanopartikel
wurde dazu in einem zehnfach verkleinerten Ansatz durchgeführt. In der Synthese wurde ein
Aktivität von 6⋅108 cpm bezogen auf 0.6 mmol Ölsäure eingesetzt. Die Teilchen wurden
anschließend zweimal gewaschen und dann in 6 ml Hexan gelagert.
Ausgehend von dieser Lösung wurden Stabilitätsuntersuchungen durchgeführt. Zunächst
wurde analog zur thermogravimetrischen Analyse der Einfluss des Waschens auf die
Nanopartikel untersucht. Dabei wurde die Aktivität nach jedem weiteren Waschschritt im
Überstand und in der Dispersion gemessen. Die Detektion von β-Strahlung erfolgt unter
4 Ergebnisse und Diskussion
44
Einsatz von Szintillations-Lösungen. Diese Lösungen enthalten eine Farbstoff und weitere
Additive. Trifft ein β-Elektron auf ein Farbstoffmolekül, so kommt es zur Emission eines γ-
Quants. Die γ-Quanten werden über einen Lichtleiter und einen Photomultiplier kollektiert.
Dadurch dienen sie der Quantifizierung der β-Strahlung. Abb. 4.8 a zeigt die erhaltenen
Aktivitäten in Überstand und Lösung nach den Waschschritten 3-6.
3 4 5 60
1x105
2x105
3x105
4x105
5x105
Akt
ivitä
t / c
pm
Waschschritt
Überstand Rückstand
0 5 10 15 20 25 300
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Akt
ivitä
t / c
pm
Konzentration Ölsäure / mM
a) b)
Abb. 4.8: Stabilitätsuntersuchungen an 14C markierten Fe3O4-Nanopartikeln. (a) Einfluss des
Waschens auf die verbleibende Aktivität. (b) Verdrängungsexperiment mit Ölsäure
verschiedener Überschüsse bei Raumtemperatur für 24 h.
Es ist erkennbar, dass der durch Fällung entfernbare Anteil an Ölsäure von Waschschritt zu
Waschschritt sinkt. Nach dem 6. Schritt verbleibt etwa 95 % der Ölsäure auf der
Teilchenoberfläche. Dieses Ergebnis bestätigt das der TG-Messungen.
In einem weiteren Experiment (Abb. 4.8 b) wurde geprüft, inwieweit sich die gebundene
radioaktive Ölsäure durch nicht-aktive verdrängen lässt. Dazu wurden in Dreifach-
Bestimmungen unterschiedliche Überschüsse an Ölsäure zugegeben und die in Chloroform
gelösten Teilchen bei Raumtemperatur für 24 h gerührt. Die Aktivität wurde im Überstand
gemessen. Es ergab sich eine deutliche Abhängigkeit der Menge der verdrängten Ölsäure von
der zugesetzten. Es ist also ein dynamisches Gleichgewicht vorhanden und offensichtlich
möglich, die gebundene aktive Ölsäure vollständig gegen nicht-aktive auszutauschen (der
Wert von 5500 cpm entspricht der eingesetzten Aktivität). Für die in 4.2 beschriebenen
Ligandenaustauschreaktionen ergeben sich daraus zwei Konsequenzen. Unter Einsatz eines
großen Überschusses des neuen Liganden ist es möglich, die gebundenen Stabilisatoren
vollständig zu verdrängen. Darüber hinaus muss der einzuführende Ligand über feste
4 Ergebnisse und Diskussion
45
Ankergruppen verfügen, so dass die Teilchenoberfläche auch beim Entfernen des
Überschusses bei der Aufreinigung dicht belegt bleibt, um eine Aggregation zu verhindern.
Anorganische Ferrit-Nanopartikel wurden durch organometallische Hochtemperatursynthese
in einem Größenbereich von 3-30 nm hergestellt. Dabei wurden sehr enge
Teilchengrößenverteilungen erreicht (s.d<10 %). Die Zusammensetzung der Teilchen konnte
durch Wahl geeigneter Metall-Komplexe zwischen Magnetit (Fe3O4) und Manganferrit
(MnFe2O4) variiert werden. Magnetometermessungen demonstrierten den
Superparamagnetismus der Proben, wobei der Verlauf der Kurven sowie die
Sättigungsmagnetisierung stark größenabhängig sind. Durch die synthesebedingte
Größenkontrolle lassen sich die magnetischen Eigenschaften somit den Anforderungen
entsprechend einstellen. Untersuchungen der Teilchenoberfläche ergaben, dass die gebundene
Ölsäure in Gleichgewichtsreaktionen unter milden Bedingungen vollständig ausgetauscht
werden kann. Durch wiederholtes Fällen der Partikel verbleibt hingegen ein Anteil von etwa
30 % organischer Verbindungen auf der Teilchenoberfläche.
4 Ergebnisse und Diskussion
46
4.2 Oberflächenmodifizierung an Ferrit-Nanopartikeln
Die organometallische Hochtemperatursynthese erlaubt die gezielte Synthese von Ferrit-
Nanopartikeln unterschiedlicher Größe und Form mit hoher Kritallinität. Durch diese
Flexibilität sind beispielsweise die magnetischen Eigenschaften gezielt einstellbar. Ein
entscheidender Nachteil gegenüber wasserbasierten Synthesen ist jedoch, dass die Partikel
durch den Einsatz von Stabilisatoren mit langen unpolaren Alkylketten nur in unpolaren
organischen Lösungsmitteln wie Hexan oder Chloroform löslich sind. Um sie für den Einsatz
in der Biomedizin wie etwa nur Kontrastverbesserung in der MRT nutzbar zu machen,
müssen Oberflächenmodifizierungen durchgeführt werden. Erst die
Oberflächenmodifizierung der Partikel ermöglicht einen Transfer ins wässrige Medium. Zur
Oberflächenmodifizierung sind im Wesentlichen drei Strategien entwickelt worden[32, 67], die
im Rahmen dieser Arbeit angewendet und im Hinblick auf ihren Einfluss auf die einzelnen
MR-Relaxationsprozesse verglichen wurden. Abb. 4.9 zeigt diese Strategien[68].
Abb. 4.9: Schematische Darstellung der verschiedenen Oberflächenmodifikationen an
Nanopartikeln. Ligandenaustausch (oben), Einkapselung in Mizellen von einzelnen (Mitte)
und mehreren (unten) Partikeln[68].
4 Ergebnisse und Diskussion
47
Der erste Weg besteht in einem Austausch der hydrophoben Stabilisatormoleküle gegen
Moleküle, die dem Partikel z.B. wegen ihrer Ladung oder Polarität Wasserlöslichkeit
verleihen[69]. Wichtig ist, dass auch diese Moleküle über funktionelle Gruppen verfügen, die
fest an die Teilchenoberflächen von Metalloxiden binden. Beispiele für solche Gruppen sind
Carbonsäuren[70-72], Dopamine[73, 74], Amine[75], Phosphanoxide[76, 77] und Phosphonate[78].
Die zweite Strategie besteht in der Einkapselung der Nanopartikel z. B. unter Verwendung
von Amphiphilen[79, 80]. Der hydrophobe Teil des Amphiphils tritt dabei mit den unpolaren
Ketten der Stabilisatoren in Wechselwirkung, der hydrophile Teil zeigt nach außen und
bewirkt eine Wasserlöslichkeit[67]. Es können einzelne[81] oder auch viele Partikel in einer
solchen mizellaren Struktur eingebettet werden[31, 32, 82]. Das Amphiphil kann ein
synthetisches Blockcopolymer oder auch ein biologischer Mizellenbildner sein. Die
ursprünglichen Stabilisatoren bleiben bei dieser Methode erhalten. Generell wird bei
synthetischen Liganden häufig versucht, eine dichte und stabile Hülle aus Polyethylenglykol
(PEG) um die Teilchen zu bilden. PEG ist biokompatibel und bewirkt hohe Stabilität[83-87].
In diesem Kapitel werden die hier skizzierten Strategien eingesetzt, um Eisenoxid-basierte
Kontrastmittel herzustellen. Generell werden durch Ligandenaustausch-Reaktionen kleine
wasserlösliche Teilchen hergestellt, welche für die T1-gewichtete Bildgebung geeignet sind.
Die anderen Oberflächenmodifikationen werden verwendet, um negative Kontrastmittel für
die T2- und T2*- gewichtete Bildgebung zu entwickeln.
4.2.1 Synthese Polyethylenglykol-basierter Liganden
Um Eisenoxid-Nanopartikel mittels Ligandenaustausch in wässrige Lösung zu transferrieren,
wurden Liganden nach folgenden Anforderungen getestet. Einerseits sollten die Moleküle
robuste Ankergruppen zur Bindung auf der Teilchenoberfläche aufweisen. So sollte eine
Aggregation der Teilchen verhindert werden. Der PEG-Teil sollte eine hohe Stabilität unter
physiologischen Bedingungen bewirken und eine Adsorption von Proteinen aus dem
Blutplasma verhindern oder wenigstens reduzieren. Außerdem sollte das PEG verhindern,
dass die Teilchen eine unspezifische Phagozytose durch Zellen des Retikulo-Endothelialen
Systems (RES) erfahren und somit nur sehr geringe Bluthalbwertszeiten besitzen. Abb. 4.10
zeigt zur Übersicht die zum Ligandenaustausch verwendeten Polymere zur Darstellung
homogen dispergierter Teilchen.
4 Ergebnisse und Diskussion
48
HO
O
O
O
n
SCOOH
COOH
HO
O
O
O
nS
COOH
O
O
O
H3C
n
P
OH
OH
O
Abb. 4.10: Strukturformeln der zum Ligandenaustausch verwendeten PEG basierten
Liganden. Die Ankergruppen zur Bindung auf der Teilchenoberfläche sind rot dargestellt.
Dabei wurden Phosphorsäuregruppen und Carbonsäuregruppen verwendet. Die PEG-Kette
bewirkt eine hohe Wasserlöslichkeit und hohe Stabilität unter physiologischen Bedingungen.
Die Synthese der Phosphorsäure-funktionalisierten PEG erfolgte durch Umsetzung von
Polyethylenglykol-monomethylether mit Phosphorylchlorid. Um sicherzustellen, dass es zur
Bildung eines Monoesters kommt, wurde ein Überschuss an Phosphorylchlorid eingesetzt[88,
89]. Die verbleibenden zwei P-Cl-Bindungen wurden dann durch Zugabe von Wasser
hydrolysiert (Abb. 4.11).
HOO
On
CH3O
OO
n
CH3PHO
OH
OPOCl31)
2) H2O
Abb. 4.11: Reaktionsschema zur Phosphorylierung von PEG. Zur Bildung des Monoesters
wird ein Überschuss an POCl3 eingesetzt.
Zur Charakterisierung des Polymers wurden 31P-NMR-Spektren aufgenommen (Abb. 4.12).
In Abhängigkeit von der Länge des verwendeten PEG-Moleküls gibt es kleine Unterschiede
zwischen den Spektren. Das Spektrum eines phosphorylierten PEG-2000-Moleküls weist nur
ein einziges charakteristisches Signal bei 1.27 ppm auf. Dieses Signal ist mit der Bildung nur
eines Produktes, nämlich des Monoesters zu begründen.
4 Ergebnisse und Diskussion
49
20 10 0 -10 -20δ [ppm]
1.27
PEG 2000PEG 550
20 10 0 -10 -20δ [ppm]
0.95
a b
Abb. 4.12: 31P-NMR-Spektren phosphatfunktionalisierter PEG-Moleküle unterschiedlicher
Molmasse.
Das 31P-NMR Spektrum eines phosphorylierten PEG-Moleküls geringerer Molmasse (PEG-
350 und PEG-550) weist neben dem Hauptsignal bei 0.95 ppm noch ein zweites Signal von
deutlich kleinerer Intensität auf. Offensichtlich führt die Phosphorylierung hier, trotz des
Einsatzes eines Überschusses an Phosphorylchlorid, zur Bildung eines kleinen Anteils an
Biester. Der Biester hat entsprechend eine etwas geringere chemische Verschiebung.
Die Synthese der Carbonsäure-funktionalisierten PEG-Liganden erfolgte unter Verwendung
von Polyethylenglykol-monoacrylaten durch Umsetzung mit 3-Merkaptopropionsäure (MPA)
zur Einführung einer Carboxylat-Ankergruppe oder mit 2-Merkaptobernsteinsäure (MSA) zur
Einführung von zwei Carboxylat-Gruppen. Mechanistisch verläuft die Reaktion unter
Basenkatalyse über eine Michael-Addition unter milden Reaktionsbedingungen (40 °C,
24-48 h) (Abb. 4.13).
4 Ergebnisse und Diskussion
50
O
O
O
n
HOOC
S O
O
O
n
OH
OH
HOOC
S O
O
O
nOH
HOOC
SH
COOH
HOOC
SH
COOH
N-Ethyldiisopropylamin
N-Ethyldiisopropylamin
Abb. 4.13: Reaktionsschema zur Synthese der Carbonsäure-funktionalisierten PEG-Moleküle
aus den PEG-Monoacrylaten.
Dabei kann die Reaktion sowohl 1H-NMR-spektroskopisch als auch IR-spektroskopisch
verfolgt werden. Die Vollständigkeit der Reaktion ist im 1H-NMR-Spektrum am
Verschwinden der Acrylprotonen erkennbar (Abb. 4.14). Hier wurde beispielhaft ein
PEG-1000-Acrylat mit Merkaptobernsteinsäure zur Reaktion gebracht. Für PEG-Moleküle
größerer Molmasse (M(PEG)>2000 g/mol) müssen höhere Reaktionstemperaturen gewählt
werden, um in gleicher Zeit quantitative Umsetzungen zu erreichen.
4 Ergebnisse und Diskussion
51
7 6 5 4 3 2 1
Inte
nsitä
t
δ / ppm
O
O
O
n
OH
HOOC
S O
O
O
nOH
COOH
1
2
3
1,2,3
4
4
4’
4’1’,2’
3’
5,5’
6
1’,2’,3’,5,5’,6
Abb. 4.14: 1H-NMR-Spektren des PEG-1000-Acrylats vor der Reaktion (rot) sowie des
resultierenden PEG-1000-MSA-Polymers nach der Michael-Addition (schwarz).
Die Signale der entstehenden Alkylprotonen sind nach der Addition zusammen mit den
Alkyl-Protonen der MSA-Funktion (5, 5’, 6) bei 2.6 bis 3.2 ppm lokalisiert. Die IR-
spektroskopische Charakterisierung basiert auf der Verfolgung der symmetrischen Acrylat-
Streckschwingung und bestätigt die Resultate der NMR-Spektroskopie.
4.2.2 Ligandenaustauschreaktionen ohne Aggregation der Partikel
Die in 4.2.1 hergestellten Liganden sollten im Folgenden mit Eisenoxid-Nanopartikeln
umgesetzt werden und dabei Ligandenaustauschreaktionen eingehen, um den Partikeln
Wasserlöslichkeit zu verleihen. Ziel war es hier, eine möglichst dichte Hülle an PEG-
Molekülen um das Partikel zu erzeugen. Bedingung dafür ist, dass die eingesetzten
Ankergruppen fest an die Partikeloberfläche binden und die Liganden nicht in möglichen
Gleichgewichtsreaktionen in das wässrige Lösungsmedium übergehen. Eine dichte Hülle an
PEG-Molekülen verhindert die Aggregation der Partikel und verleiht ihnen extrem hohe
Stabilität unter physiologischen Bedingungen. Dazu zählen die Stabilität unter bestimmten
pH-Bedingungen und Salzkonzentrationen sowie die Resistenz gegen eine unspezifische
Adsorption von Serum-Proteinen und Phagozytose. Im Rahmen der in dieser Arbeit
verwendeten Polymere wurden bezüglich dieser Kriterien große Unterschiede festgestellt.
4 Ergebnisse und Diskussion
52
Abb. 4.15 zeigt TEM-Übersichtsaufnahmen 4 nm großer Fe3O4-Nanopartikel vor (a) und nach
dem Ligandenaustausch mit PEG-Phosphat unterschiedlicher Molmasse (b, c). In (d) sind
außerdem die mittels dynamischer Lichtstreuung gemessenen hydrodynamischen
Durchmesser der Partikel dargestellt. Der Ligandenaustausch erfolgte in einer Lösung aus
Tetrahydrofuran und Wasser bei 60 °C mit großem Polymer-Überschuss. Es ist deutlich
erkennbar, dass die Teilchen vor dem Ligandenaustausch in Chloroform einen Durchmesser
von ∼7 nm aufweisen. Dieser Durchmesser erscheint realistisch, wenn man ihn als die Summe
des Kern-Durchmessers (4 nm) und der Ölsäure-Stabilisatorhülle (∼1.5 nm) versteht. In der
dazu gehörigen TEM-Aufnahme (a) ist erkennbar, dass die Teilchen ohne Aggregation
gleichmäßig auf dem TEM-Probenträger verteilt sind. Nach erfolgtem Ligandenaustausch mit
PEG-Phosphat wurden in wässriger Lösung hydrodynamische Durchmesser von 8-10 nm
gemessen, wobei es nicht möglich war, zwischen verschiedenen PEG-Kettenlängen zu
unterscheiden (d). Die TEM-Aufnahmen (b) und (c) zeigen deutlich, dass die Teilchen aber
auch hier nach dem Verdampfen des Wassers auf dem TEM-Probenträger gleichmäßig
verteilt sind. Außerdem ist ersichtlich, dass die Abstände zwischen den Teilchen mit
zunehmender PEG-Kettenlänge größer werden. Durch Korrelation beider Methoden konnte
also festgestellt werden, dass mit PEG-Phosphat ein Ligandenaustausch unter vollständiger
Verhinderung von Aggregation durchgeführt werden konnte. Als Grund hierfür kann die hohe
Affinität der Phosphat-Gruppe zum Eisenoxid und die daraus resultierende hohe
Oberflächendichte der Polymermoleküle angesehen werden. Außerdem erscheint ein
hydrodynamischer Durchmesser von ∼10 nm sinnvoll, wenn von einer Addition des
Kerndurchmessers (4 nm) sowie dem geschätzten Durchmesser eines PEG-2000-Moleküls in
Lösung (∼2.8 nm) ausgegangen wird[90].
Der Einsatz von kürzeren PEG-Ketten (350 g/mol) führte zu partieller Aggregation. Es ist
also eine Mindestlänge von ∼500 g/mol erforderlich, um homogendispergierte Teilchen zu
erzeugen.
4 Ergebnisse und Diskussion
53
1 10 100 10000
5
10
15
20
25
Fe3O
4 - Ölsäure
Fe3O
4 - PEG550
Fe3O
4 - PEG2000
Vol
umen
ante
il /
%
dhyd
/ nm
a b
c d
Abb. 4.15: TEM-Übersichtsaufnahmen monodisperser 4 nm großer Magnetit-Nanopartikel
vor (a) und nach dem Ligandenaustausch mit PEG-550-Phosphat (b) und PEG-2000-
Phosphat (c). Die entsprechenden hydrodynamischen Durchmesser der Ölsäure-stabilisierten
Teilchen in Chloroform sowie der PEG-stabilisierten Partikel in Wasser zeigt (d).
Um die Oberflächenbeschaffenheit der Teilchen nach dem Ligandenaustausch genauer zu
charakterisieren, wurden IR-Spektren der Teilchen vor und nach dem Ligandenaustausch
aufgenommen. Diese sind in Abb. 4.16 dargestellt. Vor der Aufnahme der Spektren wurden
die Proben durch Ultrafiltration aufgereinigt, um freie Liganden zu entfernen. Das IR-
Spektrum der hydrophoben Nanopartikel weist neben den typischen Alkylgruppen-
Schwingungen der Ölsäure bei ∼2800 cm-1 eine intensive Bande bei 1421 cm-1 auf. Sie ist
vermutlich der Carboxylgruppe der Ölsäure zuzuordnen und nach dem Ligandenaustausch
nicht mehr vorhanden. Darüber hinaus gleicht das IR-Spektrum nach dem Ligandenaustausch
dem des reinen PEG-Moleküls. Es ist daher davon auszugehen, dass der Ligandenaustausch
nahezu quantitativ verlaufen ist.
4 Ergebnisse und Diskussion
54
3500 3000 2500 2000 1500 1000
Wellenzahl / cm-1
1421
Inte
nsitä
t
Abb. 4.16: IR-Spektren der Fe3O4 Nanopartikel vor (schwarz) und nach dem
Ligandenaustausch (blau). Zum Vergleich ist das IR-Spektrum des PEG-2000-Phosphat
Polymer gezeigt (rot).
Die hier beschriebenen in wässriger Lösung homogen dispergierten Nanopartikel wurden
erhalten, sofern große Überschüsse der PEG-Liganden im Verhältnis zur auf der Oberfläche
gebundenen Ölsäure eingesetzt wurden. Wurde der PEG-Anteil in den
Ligandenaustauschreaktionen allerdings schrittweise reduziert, so konnten zunächst
wurmartige und später auch mizellare Strukturen dargestellt werden. Abb. 4.17 zeigt TEM-
Übersichtsaufnahmen der 4 nm großen Magnetit-Nanokristalle mit PEG-2000-Phosphat-
Liganden in Abhängigkeit vom Verhältnis des eingesetzten Liganden zum Nanopartikel.
4 Ergebnisse und Diskussion
55
1 10 100 1000 10000
volu
me
/ a.
u.
dhyd
/ nm
a b c
Zunehmende Menge Polymer
c
b
a
Abb. 4.17: Einfluss des Verhältnisses der eingesetzten Menge an PEG-2000-Phosphat zur
Menge an Eisenoxid-Nanopartikeln. Mit abhehmender Menge an Polymer kommt es zunächst
zur Bildung von Nanopartikel-Ketten (b). Bei weiterer Reduktion bilden sich große mizellare
Aggregate aus (a). Dieser Trend korreliert mit den mittels DLS bestimmten
hydrodynamischen Durchmessern.
Der Trend einer zunehmenden Neigung zur Aggregat-Bildung spiegelt sich auch in den
mittels DLS gemessenen hydrodynamischen Durchmessern wieder. Ähnliche Resultate
wurden für PEGylierte CdSe/CdS Kern/Schale-Nanopartikel erhalten[91].
Auch die in 4.2.2 beschriebenen Carbonsäure-funktionalisierten PEG-Moleküle wurden in
Ligandenaustauschreaktionen eingesetzt, um homogen dispergierte Teilchen ohne
Aggregation zu erhalten. Abb. 4.18 zeigt repräsentative TEM-Übersichtsaufnahmen von
Proben aus 4 nm großen Fe3O4-Nanopartikeln mit PEG-1000-MSA- und PEG-1000-MPA-
Liganden.
4 Ergebnisse und Diskussion
56
a b
Abb. 4.18: 4 nm große Fe3O4-Nanopartikel, die mit PEG-1000-MSA (zwei Carboxylgruppen,
(a)) und PEG-1000-MPA (eine Carboxylgruppe, (b)) beschichtet sind.
Es ist deutlich erkennbar, dass die PEG-1000-MSA umhüllten Teilchen gleichmäßig auf dem
Probenträger verteilt sind, wohingegen die PEG-1000-MPA beschichteten eine erhebliche
Neigung zur Aggregation und Kettenbildung zeigen. Dieser Trend wird durch die Messungen
der hydrodynamischen Durchmesser bestätigt (Abb. 4.19).
1 10 100 1000
Vol
umen
ante
il
dhyd
/ nm
Abb. 4.19: Hydrodynamische Durchmesser 4 nm großer Fe3O4-Nanopartikel vor dem
Ligandenaustausch in Chloroform (schwarz) und nach dem Ligandenaustausch mit PEG-
1000-MSA (blau) und PEG-1000-MPA (rot).
Es sind deutliche Unterschiede in den hydrodynamischen Durchmessern zwischen beiden
Proben zu erkennen. Während der hydrodynamische Durchmesser der Teilchen bei
Verwendung von PEG-1000-MSA mit ∼10 nm nur geringfügig gegenüber den hydrophoben
4 Ergebnisse und Diskussion
57
Teilchen in Chloroform angestiegen ist, führt der Ligandenaustausch mit PEG-1000-MPA zu
erheblich größeren hydrodynamischen Durchmessern (∼30 nm). Der Grund hierfür ist in der
deutlich unterschiedlich dicht belegten Oberfläche der Nanopartikel zu sehen. PEG-1000-
MSA verfügt über zwei chelatisierende Carboxylgruppen, die deutlich fester an die
Teilchenoberfläche binden als die Verwendung einer Carboxylgruppe im PEG 1100-MPA.
Ähnliche Resultate wurden auch für Polyethylenglykol-polyethylenimin-copolymere erhalten,
die über bis zu sieben Amingruppen verfügen, um auf der Teilchenoberfläche zu binden.
Auch hier gelang es nicht, Partikel mit einem hydrodynamischen Durchmesser von weniger
als 30 nm zu synthetisieren.
Es wurde gezeigt, dass durch Ligandenaustausch kleine homogendispergierte Eisenoxid-
Nanopartikel in wässriger Lösung erhalten werden können. Diese verfügen über dünne,
wasserdurchlässige PEG-Hüllen. Allerdings sind nur solche PEG-basierte Liganden geeignet,
die robuste Ankergruppen besitzen. Durch Einsatz der PEG-Phosphate einer minimalen PEG-
Molmasse von ∼500 g/mol gelang es, Aggregation vollständig zu verhindern und eine enge
Teilchengrößenverteilung zu erzeugen. Die Bindungsaffinität weniger starker Ankergruppen
wie Carboxylate kann durch Chelatisierung verstärkt werden. Der Einsatz von PEG-MSA-
Polymeren mit zwei Craboxyl-Gruppen erfordert eine minimale PEG-Molmasse von
∼1000 g/mol, um Aggregation vollständig zu verhindern. Für die in den nächsten Abschnitten
beschriebene systematische Entwicklung von positiven und negativen Kontrastmitteln werden
verschiedene Strategien verwendet. Die hier dargestellten homogendispergierten Partikel
werden auf ihre Eignung als T1-Kontrastmittel untersucht. Sowohl zur Entwicklung von T2-
als auch von T2*-Kontrastmitteln wird eine kontrollierte Aggregation der Teilchen in
Mizellen ohne Ligandenaustausch verfolgt.
4 Ergebnisse und Diskussion
58
4.3 Entwicklung positiver MR-Kontrastmittel unter Verwendung
nicht-aggregierter Eisenoxid-Nanopartikel
In 2.2.4 wurde ausgeführt, dass positive Kontrastmittel eingesetzt werden, um die intrinsische
longitudinale Relaxationszeit T1 eines Gewebes oder des Blutes zu reduzieren und somit
einen verbesserten Kontrast zu den umliegenden Geweben zu ermöglichen. Grundsätzlich
sind positive Kontrastmittel gegenüber den negativen weniger artefaktbehaftet und
ermöglichen somit eine höhere Auflösung[92-94]. Da die longitudinalen Relaxivitäten aber
gering im Vergleich zu den transversalen Relaxivitäten typischer Negativ-Kontrastmittel sind,
müssen, um eine hinreichende Signalveränderung im zu untersuchenden Bereich zu erzielen,
größere Injektionsdosen eingesetzt werden. Neben den bereits erwähnten konventionellen
Gadolinium-Komplexen sind in den vergangenen Jahren auch Kontrastmittel auf Basis
paramagnetischer Nanopartikel entwickelt worden. So wurden beispielsweise Gd(PO4)-
Nanopartikel untersucht, welche sich insbesondere durch ein geringes r2/r1-Verhältnis
auszeichnen[95]. Gadolinium-basierte Kontrastmittel haben sich unter toxikologischen
Gesichtspunkten allerdings als kritisch herausgestellt und können Patienten mit
eingeschränkter Nieren-Funktion nicht mehr verabreicht werden[96, 97]. Es werden daher
gegenwärtig zahlreiche weitere Materialien getestet[98]. So wurden unter anderem
antiferromagnetische MnO-Nanopartikel unterschiedlicher Größe getestet und gezeigt, dass
die r1-Relaxivität stark vom Oberflächenanteil abhängt und somit für kleinere Partikel größer
ist[99]. Insgesamt sind die MnO-basierten T1-Kontrastmittel aber durch geringe Relaxivitäten
gekennzeichnet. Auch Eisenoxid-Nanopartikel sehr kleiner Größe, sogenannte USPIO,
werden für die T1-gewichtete Bildgebung verwendet und durch weitere Arbeiten optimiert[93].
Sie stellen wegen ihrer hohen Biokompatibilität eine wichtige Alternative zu den Gd-basierten
T1-Kontrastmitteln dar[100]. Sie besitzen eine Hülle aus Citrat und sind daher unter
Stabilitätkriterien nur sehr limitiert einsetzbar. Generell ist Eisenoxid für die T1-gewichtete
Bildgebung nur unter bestimmten Voraussetzungen geeignet. In Abb. 4.20 ist schematisch das
Anwendungsspektrum heutiger klinischer Eisenoxid-Kontrastmittel dargestellt.
4 Ergebnisse und Diskussion
59
dhyd
[nm]
5.5 15 20 40 60 300
Lymph- Leberknoten Milz
MRT des RES
Blood pool DarmKontrastmittel
MR Angiographie Orale Aufnahme
Spezifische MRT
BiofunktionalisierungMolekulare/Zelluläre Bildgebung
Intravenöse Injektion
RES Aufnahme
r2/r1 zunehmend
Abb. 4.20: Klassifizierung der Eisenoxid-MR-Kontrastmittel nach deren hydrodynamischen
Durchmesser. Je größer die Teilchen sind, desto höher ist deren r2/r1-Verhältnis und desto
besser die Eignung als negatives Kontrastmittel.
Da mit ansteigendem hydrodynamischem Durchmesser infolge der zunehmenden Neigung zur
Aggregation das r2/r1-Verhältnis größer wird, sind nur kleine Partikel prädestiniert. Die
typischen klinischen Vertreter zur MRT des Retikuloendothelialen Systems (RES) weisen
große Aggregate und hydrodynamische Durchmesser auf und sind daher die typischen
Vertreter negativer Kontrastmittel. Das RES ist ein Teil des Immunsystems und dient der
Abwehr und Beseitigung von Fremdpartikeln und Krankheitserregern[101]. Generell besitzen
Eisenoxid-Nanopartikel hohe r1-Relaxivitäten. Die Einschränkung ihrer Anwendung liegt eher
in der zu hohen r2-Relaxivität. Diese wird nach Gl. 2.21 begrenzt, indem Aggregation
verhindert wird und die Sättigungsmagnetisierung sowie der Langevin-Term L(x) minimiert
werden. Die in 4.2 beschriebenen 4 nm großen Fe3O4-Nanopartikel erfüllen diese
Bedingungen und werden im Folgenden für die T1-gewichtete Bildgebung verwendet.
4.3.1 Stabilitätsuntersuchungen an PEGylierten Eisenoxid-Nanopartikeln
Der Grund für den Einsatz von Polyethylenglykol als Ligand für die superparamagnetischen
Nanopartikel ist nicht nur die Biokompatibilität dieses Moleküls sondern hauptsächlich die
erwartete kolloidale Stabilität der Teilchen unter physiologischen Bedingungen. Die Teilchen
müssen über einen gewissen pH-Bereich, insbesondere zwischen pH=5 und pH=9 stabil sein.
Darüber hinaus darf die im Blutserum gegebene ionische Stärke (ca. 150 mM NaCl) zu keiner
Aggregation der Teilchen führen. Der schwierigste Aspekt im Hinblick auf Stabilität liegt
jedoch in der unspezifischen Adsorption von Proteinen aus dem Blutplasma, welche eine
4 Ergebnisse und Diskussion
60
unkontrollierte Phagozytose des Kontrastmittels durch Makrophagen des Retikulo
Endothelialen Systems (RES) zur Folge haben könnte und außerdem eine
adsorptionsinduzierte Aggregation der Teilchen bewirken kann.
Alle Stabilitätsuntersuchungen fanden bei physiologischer Temperatur (37 °C) statt. Um die
Parameter pH und ionische Stärke zu untersuchen, wurden die Partikel in Puffer-Lösungen
über bestimmte Zeiträume inkubiert und der hydrodynamische Durchmesser der Partikel
mittels DLS gemessen, um eine mögliche Aggregation festzustellen. Abb. 4.21 zeigt die
Inkubation 4 nm großer Fe3O4-Nanopartikel (PEG-1100-Phosphat) in Tris-NaCl-Puffer
(pH=7.4, 150 mM NaCl) über 24 h. Der hydrodynamische Durchmesser der Partikel verbleibt
bei ∼8 nm.
0 5 10 15 20 250
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
d hyd /
nm
Zeit / h
Abb. 4.21: Zeitlicher Verlauf des hydrodynamischen Durchmessers in 0.1 M Tris-HCl Puffer
(150 mM NaCl) bei einer Inkubationstemperatur von 37°C.
Allgemein wurde beobachtet, dass Eisenoxid-Nanopartikel mit Phosphat-PEG-Liganden
sowohl über einen breiten pH-Bereich, als auch bei ionischen Stärken von bis zu 2 M NaCl
stabil sind. Bei 4 M NaCl ist nach Stunden eine vollständige Aggregation zu beobachten.
Dieses Ergebnis wurde durch andere Untersuchungen mit optimierten PEGylierten Eisenoxid-
Systemen bestätigt[102]. Da unter physiologischen Bedingungen von einer ionischen Stärke
von etwa 0.15 M NaCl auszugehen ist, ist für biomedizinische Anwendungen eine
hinreichend hohe Stabilität gegeben.
Wichtiger als die bislang diskutierten Parameter pH und ionische Stärke hingegen ist die
Stabilitätsuntersuchung in Gegenwart von Proteinen aus dem Blutserum. Die Partikel wurden
dazu in Fötalem Kälber Serum (FCS) über einen Zeitraum von 2 h bei 37 °C inkubiert. Auch
4 Ergebnisse und Diskussion
61
hier wurde die Änderung des hydrodynamischen Durchmessers der Partikel untersucht, weil
eine Adsorption von Serum-Proteinen auf den Teilchenoberfläche zu einer entsprechenden
Vergrößerung im Teilchendurchmesser führen oder sogar eine Aggregation induzieren kann.
Verwendet wurde hier aber die Größenausschluss-Chromatographie (GFC), da die Messung
der dynamischen Lichtstreuung wegen des intensiven Streuverhaltens der Plasmaproteine
nicht möglich ist. Für die Entwicklung eines T1-Kontrastmittels ist diese Untersuchung sehr
wichtig, da bereits kleinste Aggregat-Mengen die transversale Relaxationszeit verkürzen, was
den Einsatz als T1-Kontrastmittel unmöglich macht. Abb. 4.22 zeigt die erhaltenen GFC-
Kurven für 4 nm große Eisenoxid-Nanopartikel mit PEG-Phosphaten unterschiedlicher
Kettenlänge. Die Proben wurden in Tris-NaCl-Puffer sowie FCS inkubiert und anschließend
säulenchromatographisch aufgetrennt. Der Eisennachweis in den Fraktionen erfolgte
photometrisch mit Bathophenanthrolin. Aus Abb. 4.22 (a) geht hervor, dass der
hydrodynamische Durchmesser von PEG-1000-umhüllten Teilchen in Serum zunimmt im
Vergleich zu einer entsprechenden Probe, die unter identischen Bedingungen in einer
Tris/NaCl-Pufferlösung inkubiert wurde. Dieser Anstieg ist auf die Adsorption von Proteinen
auf der Teilchenoberfläche zurückzuführen. Abb. 4.22 (b) zeigt darüber hinaus, dass in
Abhängigkeit vom verwendeten PEG deutliche Unterschiede im Ausmaß dieses Anstiegs zu
erkennen sind.
4 Ergebnisse und Diskussion
62
0 10 20 30 40iro
n co
ncen
trat
ion
/ a.u
.
fraction
A B C D
M=2000
M=1100
M=550
M=350
a b
0 10 20 30 40
iron
con
cent
ratio
n / a
.u.
fraction
A B C D
buffer
FCS
1 10 100 10000
5
10
15
20
25
Vol
ume
/ %
dhyd
/ nm
1 10 100 10000
5
10
15
20
Vol
um
e /
%
dhyd
/ nm
F18 F12
12.8 nm 19.3 nm
c d
Abb. 4.22: GFC von PEG-beschichteten Fe3O4-Nanopartikeln: a) GFC-Kurven von PEG-
1100-umhüllten Nanopartikeln in Tris/NaCl-Puffer(schwarz) und Serum (grün) (2h, 37 °C).
b) Stabilitätsvergleich verschiedener PEG-Kettenlängen unter gleichen Bedingungen (2h,
37 °C). MW-Standards A (Thyroglobulin, 669 kDa), B (Apoferritin, 443 kDa), C (Amylase,
200 kDa), D (Albumin, 66 kDa) sind durch Pfeile gekennzeichnet. DLS Messungen der GFC-
Fraktionen F18 (c) und F12 (d) bestätigen eine leichte Zunahme des hydrodynamischen
Durchmessers.
Die größten Durchmesser wurden für die PEG-350- und PEG-2000-umhüllten Teilchen
bestimmt. Ein erheblicher Anteil der eingesetzten Teilchen findet sich hier in den Fraktionen
4 Ergebnisse und Diskussion
63
F5 und F6, die dem Ausschlussvolumen der Säule zuzuordnen sind. Bei diesen Proben ist es
sogar zur einer Protein-induzierten Aggregation gekommen. Das PEG-550-Polymer zeigt eine
höhere Stabilität, aber auch hier ist noch ein Anteil im Ausschlussvolumen der Säule zu
finden. Die höchste Stabilität wurde für die PEG-1100-umhüllten Partikel festgestellt, die nur
einen geringen Anstieg im hydrodynamischen Durchmesser aufweisen und somit die höchste
Resistenz gegen die Adsorption von Serum-Proteinen zeigen. Es ist auf Grundlage dieser
Untersuchungen bislang möglich, die Adsorption einzuschränken aber nicht vollständig zu
verhindern. Bislang existieren nur wenige weitere systematische Untersuchungen zur
unspezifischen Adsorption von Serum-Proteinen an Nanopartikel. So gelang es lediglich im
Falle von CdSe/ZnS-Nanokristallen durch Thiol-funktionalisierte PEG-Moleküle oder durch
das Zwitterion Cystein, eine Adsorption zu verhindern[103].
Da auch das PEG-1000-MSA zu homogendispergierten Teilchen führte, wurde dieses
Polymer verwendet, um bei gleicher PEG-Kettenlänge das Adsorptionsverhalten bei zwei
chelatisierenden Carboxyl-Ankergruppen zu untersuchen. Abb. 4.23 zeigt die Ergebnisse
dieses Experiments. Auch hier wurde unter identischen Bedingungen in Tris/NaCl-Puffer
inkubiert. Zum Vergleich ist das PEG-1000-Phosphat-System dargestellt.
0 10 20 30 40
iron
con
cent
ratio
n / a
.u.
fraction
O
O
O
H3C
n
P
OH
OH
O
HO
O
O
O
nS
COOH
COOH
HO
O
O
O
nS
COOH
COOH
O
O
O
H3C
n
P
OH
OH
O
Abb. 4.23: Vergleich der GFC-Profile verschiedener Poylmere gleicher Kettenlänge
(PEG-1000), aber unterschiedlicher Ankergruppen. Inkubiert wurde für 2 h bei 37 °C in
Tris/NaCl-Puffer (schwarz) und FCS (rot).
4 Ergebnisse und Diskussion
64
Wie aus Abb. 4.23 hervorgeht, weisen diese Teilchen bereits in der Puffer-Inkubation einen
größeren hydrodynamischen Durchmesser sowie eine breitere Teilchengrößenverteilung auf.
Dieses Ergebnis deckt sich mit den DLS-Messungen, in denen ein hydrodynmischer
Durchmesser von ∼12 nm bestimmt wurde. In Gegenwart von Plasma-Proteinen kommt es
auch bei diesem Polymer zur Adsorption, wobei der hydrodynamische Durchmesser größer ist
als bei vergleichbarer Inkubation mit dem Phosphat-Polymer gleicher Molmasse. Die
Phosphat-Ankergruppe bindet offensichtlich sehr stark an die Teilchenoberfläche, wodurch
eine dichte Belegung durch PEG-Moleküle bewirkt wird. Wie bereits diskutiert wurde, führt
der Einsatz zweier chelatisierender Carboxyl-Funktionen zu weniger Aggregation während
des Ligandenaustauschs als bei Polymeren mit nur einer Carboxyl-Funktion. Die
Oberflächendichte ermöglicht aber trotzdem eine Protein-Adsoption. Da die PEG-Ketten in
Wasser quellen, ist außerdem erkennbar, dass ein PEG-Molekül mit einer Molmasse von
∼1000 g/mol (entspricht etwa 20 Ethylenoxid-Einheiten) zu einer optimalen Stabilität der
Partikel führt. Es ist davon auszugehen, dass hier der Raum jenseits der Teilchenoberfläche
minimiert wird, wodurch die Proteine sterisch an einer Adsorption gehindert werden.
Eingehende Untersuchungen belegen, dass die Oberflächendichte und die damit verbundene
Konformation von PEG-Molekülen entscheidenden Einfluss auf die Oberflächenadsorption
von Plasma-Proteinen wie Albumin haben[104]. Röcker et al. beobachteten die Bildung von
3.3 nm dicken Albumin-Monolagen um negativ geladene FePt- und CdSe/ZnS-
Nanopartikel[105].
4.3.2 Untersuchungen zur Kontrastgebung
Zur Untersuchung der kontrastgebenden Eigenschaften für die T1-gewichtete Bildgebung
müssen verschiedene Parameter getestet werden. Einerseits muss die Relaxivität r1 maximiert
werden, um die Sensitivität des Kontrastmittels zu erhöhen und um die Injektionsdosen
möglichst gering zu halten. Die andere Aufgabe besteht in der Minimierung des Verhältnisses
der transversalen Relaxivität r2 zur longitudinalen Relaxivität r1, damit das Kontrastmittel
überhaupt für die positive MR-Bildgebung eingesetzt werden kann. Insofern ist auch der
Einfluss von Parametern, die zu einer Erhöhung von r2 führen, zu untersuchen. Alle hier
durchgeführten Untersuchungen wurden mit einem minispec mq-60 NMR Relaxometer bei
1.41 T durchgeführt. Die Messung der T1-Relaxationszeiten erfolgte mit einer Inversion-
Recovery-Sequenz unter Verwendung von 20 Inversionszeiten. Die in Abb. 4.24 a gezeigte
Kurve beschreibt die zeitabhängige Rückkehr der longitudinalen Magnetisierung Mz vom
Wert –Mz,0 unmittelbar nach dem 180°-Inversionspuls zur thermischen Gleichgewichtslage.
4 Ergebnisse und Diskussion
65
T2 wurde durch eine Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)-Spinecho-Sequenz bestimmt. In
Abb. 4.24 b ist der ermittelte Verlust der transversalen Magnetisierung Mxy in Abhängigkeit
von der Zeit dargestellt.
Zur Bestimmung der Relaxivitäten r1 und r2 wurden die inversen Relaxationszeiten der
Konzentrationsreihe einer wässrigen Nanopartikel-Disperion gegen die analytische Eisen-
Konzentration aufgetragen. Die Steigung der ermittelten Ausgleichsgerade entspricht der
konzentrationsunabhängigen Relaxivität.
0 100 200 300 400-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
MZ /
%
TI / ms
MZ=M
0(1-e-TI/T
1)
0 20 40 60 80 100 120
0
20
40
60
80
100
Mxy
/ %
TE / ms
Mxy
=M0e-TE/T
2
a) b)
Abb. 4.24: Verlauf der z-Magnetisierung in Abhängigkeit von der Inversionszeit TI in der
Inversion Recovery-Sequenz zur Bestimmung von T1 (a). Verlauf der xy-Magnetisierung als
Funktion der Echozeit TE im Spinecho-Experiment zur Messung von T2 (b).
Wie in 2.2.4 erläutert wurde, ist die Gesamtrelaxivität ri immer als Summe eines inner-sphere
und eines outer-sphere Beitrages gegeben. Der inner-sphere Beitrag, welcher die direkte
Dipol-Dipol-Wechselwirkung zwischen den Protonen und dem magnetischen Dipol des
Kontrastmittels beinhaltet, ist für ein T1-Kontrastmittel ein sehr wichtiger Beitrag. Er
beschreibt die Relaxation aller Protonen, die direkt an das Kontrastmittel gebunden sind. Die
Sättigungsmagnetisierung der Partikel trägt ebenfalls zur T1-Relaxation bei. Dieser Einfluss
ist im Vergleich zur T2-Relaxation aber geringer. Daher sollten Nanopartikel, wie die in 4.2.2
beschriebenen Fe3O4-Nanoteilchen mit dünnen wasserdurchlässigen Hüllen und großer
Oberfläche für diese Anwendung besonders geeignet sein. Um das r2/r1-Verhältnis zu
minimieren, muss die r2-Relaxivität gleichzeitig minimiert werden. Die r2-Relaxivität wird
maßgeblich durch den outer-sphere-Beitrag bestimmt. Dieser zeigt eine starke Abhängigkeit
vom magnetischen Moment eines Partikels, von der Zahl der Partikel in einem möglichen
4 Ergebnisse und Diskussion
66
Aggregat sowie vom Grad der magnetischen Sättigung (Gl. 2.21). Da sich die PEG-Phosphate
als besonders geeignet herausgestellt haben und unter physiologischen Bedingungen
aggregationsstabile homogendispergierte kolloidale Systeme darstellen, wurden für die
üblichen PEG-Kettenlängen (PEG-350 bis PEG-2000) die Relaxivitäten r1 und r2 bei einer
klinisch relevanten Feldstärke von 1.41 T (60 MHz) bestimmt (Abb. 4.25).
PEG 350 PEG 550 PEG 1100 PEG 20000
10
20
30
40
rela
xivi
ty /
mM
-1s-1
r1
r2
a b
5 10 15 20 25 30 35
2
4
6
8
r 2/r1
dhyd
/ nm
PEG 1100
PEG 550PEG 2000
PEG 350
Abb. 4.25: a) Longitudinale und transversale Relaxivität der mit PEG-Molekülen
unterschiedlicher Kettenlänge beschichteten Nanopartikel. b) Das r2/r1-Verhältnis korreliert
direkt mit dem hydrodynmischen Durchmesser der Partikel.
Es ist deutlich erkennbar, dass die r1-Relaxivitäten in einem Bereich von 5.9 mM-1s-1 für das
PEG-350-Molekül bis zu einem Wert von 7.3 mM-1s-1 für das PEG-1100 ansteigen. Für die
PEG-2000-beschichteten Teilchen ist die Relaxivität wieder geringer. Die r2-Relaxivitäten
zeigen einen umgekehrten Trend (r2=39 mM-1s-1 für PEG-350 und 17 mM-1s-1 für PEG-1100).
In Abb. 4.25 b sind die für die jeweiligen Proben bestimmten r2/r1-Verhältnisse gegen den
mittels DLS bestimmten hydrodynamischen Durchmesser aufgetragen. Es ist deutlich
erkennbar, dass das r2/r1-Verhältnis mit dem hydrodynamischen Durchmesser, also der
Neigung zur Aggregation korreliert. Die Verwendung des PEG-1100-Polymers führt zum
niedrigsten hyrodynamischen Durchmesser bei einem r2/r1-Verhältnis von 2.4. Dieses
Ergebnis zeigt, dass diese Probe eine maximale Sensitivität (hohen r1-Koeffizienten) und
gleichzeitig einen niedrigen r2/r1-Wert aufweist, was sie für den Einsatz in der positiven MR-
Bildgebung (etwa in der MR-Angiographie) bei einer klinisch relevanten Feldstärke
prädestiniert.
4 Ergebnisse und Diskussion
67
Zum Vergleich wurden als Standards typische klinisch eingesetzte Kontrastmittel unter
identischen Bedingungen vermessen (Abb. 4.26).
Gd-DTPA Fe3O4-PEG1100 Resovist0
20
40
60
80
100
120
r1 r2
rela
xivi
ty [m
M-1s-1
]
Abb. 4.26: Longitudinale und transversale Relaxivitäten der PEG-1100-beschichteten 4 nm
großen Fe3O4-Nanopartikel im Vergleich zu denen von Magnevist (Gd-DTPA) und
Resovist.
Einerseits wurde Magnevist als ein typisches Gd-basiertes T1-Kontrastmittel vermessen
(Gd-DTPA). Dabei ergab sich eine r1-Relaxivität von 3.6 mM-1s-1, die etwa einen Faktor zwei
unter dem optimierten Eisenoxid-System liegt. Das r2/r1-Verhältnis liegt mit 1.2 in einem für
paramagnetische Komplexe typischen Bereich. Außerdem wurden die Relaxivitäten des
typischen T2-Kontrastmittels Resovist vermessen. Dieses besteht aus Dextran-umhüllten
Eisenoxid-Aggregaten und weist einen hydrodynamischen Durchmesser von ∼60 nm auf. Es
ergab sich für r1 ein Wert von 11 mM-1s-1, während r2 130 mM-1s-1 betrug. Während r1 also
vergleichbar hoch ist, konnte beim optimierten PEG-1100-Eisenoxidsystem die transversale
Relaxivität deutlich limitiert werden. Gleichzeitig stellt es bezogen auf die analytische ionale
Konzentration ein effektiveres positives Kontrastmittel als Magnevist dar. Auch Taupitz et
al. entwickelten ein positives Kontrastmittel auf Basis sehr kleiner Eisenoxid-Partikel
(hydrodynamischer Durchmesser ∼7 nm)[106]. Das bestimmte r2/r1-Verhältnis beträgt ebenfalls
2.4 bei 1.41 T[107]. Die Teilchen besitzen allerdings eine Hülle aus Citrat, wodurch die
biologische Stabilität der Teilchen geringer sein sollte.
Da das PEG-1100-Phosphat-Polymer im Falle der 4 nm großen Fe3O4-Nanopartikel die
günstigsten relaxometrischen Eigenschaften bewirkte, wurde dieses Polymer verwendet, um
4 Ergebnisse und Diskussion
68
6 nm große Fe3O4-Partikel zu beschichten und somit den Einfluss der Kerngröße auf die
Relaxivitäten zu untersuchen. Auch bei den PEGylierten 6 nm großen Teilchen wurde ein
hydrodynamischer Durchmesser von ∼10 nm gemessen.
3 4 5 6 70
10
20
30
40
rela
xivi
ty /
mM
-1s-1
d / nm
r1
r2
r2/r1=2.4
r2/r1=3.2
Abb. 4.27: Vergleich der r1- und r2-Relaxivitäten für 4 und 6 nm große Fe3O4-Nanokristalle.
Sowohl die Relaxivitäten als auch das r2/r1-Verhältnis steigen mit zunehmender
Teilchengröße.
Wie aus Abb. 4.27 hervorgeht, nehmen mit steigendem Teilchendurchmesser bei
vergleichbarem hydrodynamischem Durchmesser sowohl r1 als auch r2 zu. Für 6 nm große
Magnetitpartikel ergab sich r1 zu 13 mM-1s-1 und r2 zu 42 mM-1s-1. Dadurch erhöht sich auch
das r2/r1-Verhältnis auf einen Wert von 3.2. Es kann demnach geschlussfolgert werden, dass
die Kristallgröße auf ∼5 nm begrenzt werden muss, um das System für die T1-gewichtete
Bildgebung einzusetzen. In diesem Fall liegt der Grund aber nicht in der durch Aggregation
bewirkten Abnahme der Oberfläche, sondern im Anstieg der Sättigungsmagnetisierung bei
Größenzunahme, welche direkt proportional zur Relaxationsrate R2 ist.
Um zu untersuchen, ob die Teilchen unter physiologischen Bedingungen ihre
relaxometrischen Eigenschaften behalten, wurden die Relaxationszeiten in Serum über einen
Zeitraum von 24 h bei 37 °C gemessen. Es zeigte sich, dass die in 4.3.1 beschriebene
Adsorption von Serum-Proteinen keinen messbaren Einfluss auf die Relaxationszeiten T1 und
T2 hat. Auch wenn es dadurch zu einer leichten Zunahme des hydrodynamischen
Durchmessers kommt, behalten die Partikel ihre kontrastgebenden Eigenschaften vollständig
bei.
4 Ergebnisse und Diskussion
69
4.3.3 Untersuchungen zur Toxizität
Bisher wurden im Rahmen der systematischen Entwicklung eines positiven MR-
Kontrastmittels kleine PEGylierte Eisenoxid-Nanopartikel im Hinblick auf Stabilität und
Kontrastgebung untersucht. Im Folgenden sollen die biologischen Eigenschaften dieser
Kontrastmittel erforscht werden. Dabei geht es einerseits um eine mögliche akute Toxizität
der Teilchen und andererseits um die quantitative Aufnahme der Nanopartikel durch
bestimmte Zellen, insbesondere der phagozytisch aktiven Makrophagen in Leber, Milz und
Knochenmark. Für die Toxizitätsuntersuchungen wurden ebenfalls diese Zellen verwendet.
Die Untersuchungen wurden am Universitätskrankenhaus Hamburg-Eppendorf im Institut für
Molekulare Zellbiologie von Prof. Dr. Ulrike Beisiegel in Kooperation mit Dr. Oliver Bruns
durchgeführt. Außerdem wurden humane Zellen aus Lunge (A549), Darm (CaCo-2) und Haut
(Fibroblasten) ausgewählt, um die typischen Aufnahmewege abzudecken. Diese Tests wurden
im Centrum für Angewandte Nanotechnologie unter der Leitung von Dr. Tatjana Achenbach
und Dr. Andrea Salcher durchgeführt.
Abb. 4.28 zeigt das Ergebnis eines MTT-Zellviabilitätstests für murine Makrophagen der
Tumorlinie J774, welche 24 h lang mit den PEG-beschichteten Fe3O4-Nanopartikeln inkubiert
wurden. Makrophagen sind ein biologisch relevantes System, da sie als Teil des RES
anorganische Partikel aus dem Blut durch Phagozytose aufnehmen, sofern diese nicht klein
genug für eine renale Ausscheidung sind[108] oder eine biologische Spezifität anderer Art
besitzen.
4 Ergebnisse und Diskussion
70
1 10 1000
20
40
60
80
100
120
Resovist PEG 2000 PEG 1100 PEG 350
cell
viab
ility
/ %
[Fe] / µg/ml
Abb. 4.28: MTT-Toxizitätstest für murine J774-Makrophagen mit PEGylierten Eisenoxid-
Nanopartikeln (Inkubationszeit: 24 h). Bei einer biologisch relevanten Konzentration von
200 µg Fe/ml ist nur für die PEG-2000-umhüllten Teilchen eine reduzierte Zellviabilität zu
beobachten.
Als Referenz wurde auch in diesem Test das klinisch zugelassene Resovist verwendet. Die
angegebenen Viabilitäten wurden durch Achtfach-Bestimmungen ermittelt. Wie in Abb. 4.28
dargestellt, zeigen die Proben mit Ausnahme der PEG-2000-umhüllten Nanopartikel über den
gesamten Konzentrationsbereich keine reduzierte Zellviabilität und liegen somit im Bereich
von Resovist. Bei einer Eisenkonzentration von 200 µg/ml ist die Zellviabilität der PEG-
2000-beschichteten Teilchen signifikant geringer. Diese Konzentration ist als biologisch
relevant angenommen worden, wobei typische Injektionsdosen für ein in vivo
Mausexperiment zu Grunde gelegt wurden (0.2 ml Injektionsvolumen, 2 mg Fe/ml
Injektionskonzentration, 2 ml Gesamtblutvolumen). Die reduzierte Zellviabilität ist
möglicherweise auf die weniger dicht belegte Teilchenoberfläche zurückzuführen. Andere
Untersuchungen belegen, dass die Zelltoxizität von Fe3O4-Nanopartikeln stark von der
Oberflächenbeschaffenheit der Teilchen abhängt[109]. So bewirken unbeschichtete Eisenoxid-
Partikel eine erhebliche Reduktion der Zellviabilität[110].
Die Untersuchungen der anderen Zellsysteme wurden in Kooperation mit dem Centrum für
Angewandte Nanotechnologie (CAN) durchgeführt. Auch hier wurden Standard-Zelltests
verwendet. So wurde die akute Toxizität für diese Zellinien sowohl über Wst-8 als auch über
das dazu komplementäre LDH-Verfahren untersucht. Der WST-8-Zelltest basiert auf der
4 Ergebnisse und Diskussion
71
Fähigkeit physiologisch aktiver Zellen, das Tetrazolium-Salz WST-8 zu reduzieren. Gebildet
wird dabei der Farbstoff Formazan. Dieser Vorgang wird durch die mitochondriale
Dehydrogenase, ein Enzym, katalysiert. Da nur physiologisch aktive Mitochondrien dieses
Enzym enthalten, ist die Menge an gebildetem Formazan proportional zur Zahl lebender
Zellen, welcher als Zellvitalität ausgedrückt wird. Messbar wird das Formazan direkt in den
Zellen. Der Lactat-Dehydrogenase (LDH)-Zelltest beruht ebenfalls auf der Detektion von
Formazan. Allderings findet die Messung hier im Überstand statt. Im Falle von Cytotoxizität
kann die Zellmembran lysiert werden, wodurch das Enzym LDH aus dem Zellinneren
freigesetzt werden kann. Anschließend kann es die Bildung von Formazan katalysieren.
Abb. 4.29 zeigt exemplarisch das Ergebnis der Wst-8- und LDH-Zelltests für PEG-1100-
Phosphat-beschichtete 4 nm große Fe3O4-Nanoteilchen für A549-Zellen.
1E-4 1E-3 0,01 0,1 10
20
40
60
80
100
Zel
lvita
lität
/ %
Eisenkonzentration / mg/ml
1E-4 1E-3 0,01 0,1
0
20
40
60
80
100
LDH
-Fre
iset
zung
/ %
Eisenkonzentration / mg/ml
a) b)
Abb. 4.29: a) Der Wst-8-Zelltest PEG-1100-Phosphat-umhüllter Fe3O4-Nanopartikel (Zellinie
A 549) zeigt auch in der höchsten Inkubationskonzentration keine reduzierte Zellvitalität. b)
Das LDH-Verfahren bestätigt den intakten Zellstoffwechsel, da kein LDH in den Überstand
freigesetzt wird.
Abb. 4.29 a zeigt, dass auch bei Inkubationskonzentrationen von 200 µg Fe/ml eine
Zellvitalität von 100 % bestehen bleibt, also keine akute Toxizität besteht. Die in Abb. 4.29 b
dargestellte Lactat-Freisetzung bestätigt die intakte Funktionsweise der Zellen. Vergleichbare
Ergebnisse wurden für die Zellinien CaCo-2 sowie die humanen Fibroblasten erhalten.
Die bisher diskutierten Tests indizieren einen apoptotischen oder nekrotischen Zelltod. Als
ein erstes Anzeichen für Toxizität kann die Bildung der Reaktiven Sauerstoff Spezies (ROS)
angesehen werden. ROS wird im Cytoplasma und in Zellorganellen wie den Mitochondrien
4 Ergebnisse und Diskussion
72
gebildet. Es handelt sich dabei um oxidativen Stress der Zelle, welcher reversibel ist. ROS
führt somit nicht zwangsläufig zum Zelltod und kann vollständig wieder abgebaut werden.
Abb. 4.30 zeigt einen Inkubationsversuch von A 549-Zellen mit verschiedenen
Konzentrationen der PEG-1100-Phosphat-beschichteten Fe3O4-Nanopartikel. Als Referenz
wurde Eisen(III)chlorid gemessen, welches in den bereits diskutierten Tests zu keiner
reduzierten Zellvitalität führte und ungiftig ist.
0 100 200 300 4000
2000
4000
6000
FeCl3 300 µg/ml
FeCl3 30 µg/ml
Fe3O
4 300 µg/ml
Fe3O
4 30 µg/ml
Flu
ores
zenz
(ex
.485
nm/e
m 5
30nm
- n
c)
Zeit / min
Abb. 4.30: ROS-Produktion von A 549-Zellen für PEGylierte Fe3O4-Nanopartikel und
Eisen(III)chlorid bei verschiedenen Inkubationskonzentrationen in Abhängigkeit von der Zeit.
Zunächst zeigt sich erwartungsgemäß eine deutliche Konzentrationsabhängigkeit der
produzierten ROS-Menge sowohl für die Eisen(III)chlorid-Referenz als auch für die
Nanopartikel. Andererseits nimmt der Stress der Zellen erst im Konzentrationsbereich
zwischen 30 µg Fe/ml und 300 µg Fe/ml drastisch zu, wobei die PEGylierten Fe3O4-
Nanopartikel eine deutlich schwächere Stressantwort auslösen als Eisen(III)chlorid.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass der verwendetete Ligand einen
entscheidenden Einfluss auf die Toxizität der Nanopartikel hat. Das PEG-1100-Phosphat-
System, welches bereits im Hinblick auf Stabilität und Relaxivität die für die T1-gewichtete
Bildgebung günstigsten Ergebnisse lieferte, zeigte für keine der untersuchten Zellinien im
Tagesbereich eine Toxizität und löst auch in hohen Konzentrationen nur geringe oxidative
Stressantworten aus.
4 Ergebnisse und Diskussion
73
4.3.4 Aufnahme der Nanopartikel in Zellen
Neben den bereits beschriebenen Untersuchungen zur Toxizität der PEGylierten Eisenoxid-
Nanopartikel ist die Untersuchung der Phagozytose durch Makrophagen im in vitro Zelltest
wichtig, da hierüber Rückschlüsse auf die Bluthalbwertszeiten des Kontrastmittels gezogen
werden können. Auch die Zellaufnahme sollte dabei mit den Eigenschaften der Liganden wie
beispielsweise der PEG-Kettenlänge verknüpft sein. Außerdem sollte untersucht werden,
inwiefern die im MTT-Zelltest beobachtete Toxizität mit dem Ausmaß der Phagozytose
korreliert. Es wurden auch hier murine Makrophagen der Linie J774 verwendet und diese mit
den PEGylierten Eisenoxid-Nanopartikeln in verschiedenen Konzentrationen über einen
Zeitraum von 24 h inkubiert. Um das Eisen intrazellulär nachzuweisen, wurde eine
Zellfärbung mit Berliner Blau durchgeführt. Abb. 4.31 zeigt Mikroskopie-Aufnahmen der
Zellen, welche mit Nanopartikel unterschiedlicher PEG-Kettenlängen sowie dem klinischen
Standard Resovist inkubiert wurden.
4 Ergebnisse und Diskussion
74
a b
c d
Abb. 4.31: Berliner Blau-Zellfärbung der J774-Makrophagen bei einer Eisenkonzentration
von 200 µg Fe/ml nach 24 h Inkubation. Beschichtet wurden die Nanopartikel mit PEG-350
(a), PEG-1100 (b) und PEG-2000 (c). Als Referenz wurde der klinische Standard Resovist
verwendet. Unterschiedliche Mengen der Eisenaufnahme sind deutlich erkennbar.
Es ist deutlich erkennbar, dass alle hier eingesetzten PEG-Moleküle im Vergleich zum
klinisch applizierten Resovist zu einer deutlichen Reduktion der unspezifischen Partikel-
Aufnahme führen. Außerdem wurden in Abhängigkeit von der Kettenlänge deutliche
Unterschiede in der Aufnahme festgestellt. Die PEG-1100-beschichteten Partikel zeigten das
geringste Ausmaß an Phagozytose. Kürzere (PEG-350) und längere (PEG-2000) Ketten
bewirkten eine höhere Aufnahme. Diese Beobachtungen stimmen mit dem beobachteten
Trend der Stabilitäten (Kap. 4.3.1) überein. Die beobachtete Toxizität der PEG-2000-
4 Ergebnisse und Diskussion
75
umhüllten Teilchen ist vermutlich auf die im Vergleich zu den kürzeren PEG-Ketten weniger
dicht belegte Oberfläche zurückzuführen.
Auf Grundlage der in diesem Kapitel gezeigten Ergebnisse gelang die Entwicklung eines
positiven MR-Kontrastmittels auf der Basis von nicht-toxischem Eisenoxid. Diese Ergebnisse
wurden publiziert[111]. Neben der stabilen Phosphat-Ankergruppe erwies sich eine PEG-
Kettenlänge von ∼1000 g/mol als besonders günstig. Die so dargestellten Teilchen
repräsentieren ein optimiertes System, welches hohe Stabilität, günstige relaxometrische
Eigenschaften sowie niedrige Toxizität und unspezifische Phagozytose vereinigt.
4.3.5 Funktionalisierung von Eisenoxid-Nanopartikeln zur Kopplung an
Biomoleküle
Bisher wurden PEGylierte Eisenoxid-Nanopartikel als neuartige T1-Kontrastmittel vorgestellt.
Um ihr Anwendungsspektrum aber nicht auf die Angiographie zu beschränken, müssen die
PEG-Liganden an ihrem zum Lösungsmittel weisenden Ende über funktionelle Gruppen
verfügen, die eine Kopplung an Biomoleküle erlauben. In einem ersten Schritt wurden dazu
Polyethylenglykol-monoacrylate am OH-terminalen Ende phosphoryliert, um die robuste
Phosphat-Ankergruppe einzuführen. Die Phosphorylierung mit POCl3 musste in diesem Fall
in Gegenwart stöchiometrischer Mengen Triethylamin durchgeführt werden, um
säurekatalysierte Umlagerungsreaktionen am Acrylterminus zu verhindern. Ansonsten
verläuft die Reaktion analog der in 4.2.1 beschriebenen PEG-Phosphorylierungen. Mittels 1H-
NMR-Spektroskopie wurde nach der Reaktion die Intaktheit der Acrylat-Funktion
nachgewiesen. Diese bifunktionellen Liganden konnten nun in Ligandenaustauschreaktion auf
die Oberfläche von Eisenoxid-Nanopartikeln gebunden werden. Das Polymer bindet über die
Phosphat-Gruppe auf der Teilchenoberfläche. Die Acrylat-Gruppe steht als reaktive Einheit
für weitere Reaktionen zur Verfügung. Über DLS konnte auch hier nachgewiesen werden,
dass es sich in Lösung um nicht-aggregierte Partikel handelt. Die Acrylat funktionalisierten
Teilchen können nun in Michael-Additionsreaktionen z.B. mit 3-Merkaptopropionsäure
umgesetzt werden, um eine biofunktionalisierbare Carboxylgruppe einzuführen. Alternativ
kann die Acrylat-Funktion auch mit anderen Thiolen umgesetzt werden (Abb. 4.32).
4 Ergebnisse und Diskussion
76
HO
P
O
O
O
OH
O
n
OH
O
HS
HS
OH
HO
P
O
O
O
OH
O
n
S OH
O
HO
P
O
O
O
OH
O
n
S
OH
SH
NH2
HO
P
O
O
O
OH
O
n
S
NH2
@Fe3O4
Abb. 4.32: Strategien zur Funktionalisierung von Fe3O4-Nanopartikeln. Der Acrylat-
Terminus kann in Michael-Additionen weiter umgesetzt werden.
Der Nachweis der Umsetzung erfolgt IR-spektroskopisch über die Verfolgung der
symmetrischen Acrylat-Streckschwingung bei 812 cm-1 (Abb. 4.33). Nach quantitativer
Umsetzung ist die Bande nicht mehr vorhanden. Überschüssiges Polymer wurde vor der
Reaktion durch mehrmaliges Waschen der Teilchen entfernt.
4 Ergebnisse und Diskussion
77
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Wellenzahl / cm -1
840 830 820 810 800
PEA8PO4_B PEA8PO4UT1_B UT123O4PPEG_B
Wellenzahl / cm -1
Abb. 4.33: IR-Spektren des Phosphat-PEG-1000-Acrylats vor (schwarz) und nach (rot) dem
Ligandenaustausch an 4 nm großen Fe3O4-Nanopartikeln. Nach erfolgter Michael-Addition
mit 3-Merkaptopropionsäure (MPA) ist keine symmetrische Acrylat-Schwingung mehr
erkennbar (grün).
Die in diesem Kapitel beschriebene Funktionalisierung der Acrylat-Funktion nach dem
Ligandenaustausch resultiert in keiner Aggregation der Teilchen, wie durch Lichtstreuung
nachgewiesen werden konnte. Wird der Ligand mit Carboxylat-Funktion vollständig
synthetisiert und erst dann zum Ligandenaustausch eingesetzt, entstehen wasserunlösliche
Aggregate. In diesem Fall kann auch die Carboxylgruppe auf einer nicht abgeschirmten
Teilchenoberfläche binden und somit individuelle Teilchen verbrücken, was zu großen
Aggregaten führt. Die hier verwendete Variante sieht hingegen zunächst eine dichte Belegung
der Teilchenoberfläche durch Phosphat-Ankergruppen vor.
4 Ergebnisse und Diskussion
78
4.4 Entwicklung negativer MR-Kontrastmittel
Dieser Teil der Arbeit befasst sich mit der systematischen Entwicklung negativer
Kontrastmittel und ihrer Anwendung in der dynamischen Verfolgung des
Lipoproteinstoffwechsels mittels MRT. Die Untersuchungen erstreckten sich sowohl auf T2-
gewichtete Spinecho-Sequenzen als auch auf T2*-gewichtete Gradientenecho-Sequenzen. Die
wesentlichen Ergebnisse dieses Abschnitts wurden bereits publiziert[68, 112]. Die Arbeiten
entstanden in enger Zusammenarbeit mit dem Institut für Molekulare Zellbiologie von Prof.
Dr. Ulrike Beisiegel sowie der Klinik für Diagnostische und Interventionelle Radiologie von
Prof. Dr. Gerhard Adam am Universitätskrankenhaus Hamburg-Eppendorf.
4.4.1 Oberflächeneffekte auf die transversalen Relaxivitäten
Die Entwicklung von sensitiven negativen Kontrastmitteln stellt noch immer eine große
Herausforderung dar. Die klinisch applizierten Vertreter bestehen aus polydispersen und
aggregierten Eisenoxid-Partikeln (SPIO). Durch zahlreiche Untersuchungen wurde bereits
gezeigt, dass die transversale Relaxivität, welche die Sensitivität des Kontrastmittels
bestimmt, maßgeblich durch Teilchengröße, Oberflächenbeschaffenheit und Aggregation
beeinflusst wird[47, 113-115]. Es wurde im Rahmen dieser Arbeit zunächst versucht, die
verschiedenen Parameter und ihren Einfluss auf die transversalen Relaxivitäten r2 und r2* zu
untersuchen und voneinander abzugrenzen. Dazu wurden monodisperse Proben von
MnFe2O4-Nanopartikeln in einem Größenbereich von 3-18 nm durch organometallische
Hochtemperatursynthese[37, 41] hergestellt und den in 4.2 dargestellten
Oberflächenmodifikationen unterzogen. Anschließend wurden die tranversalen Relaxivitäten
r2 und r2* bestimmt und verglichen. Die Untersuchung wurde mit MnFe2O4-Nanopartikeln
durchgeführt, da Mn2+ mit einem magnetischen Moment von 5 µB eine höhere
Sättigungsmagnetisierung von MnFe2O4 im Vergleich zu Magnetit (Fe3O4) bewirkt.
Zur Oberflächenmodifikation wurde zunächst ein Ligandenaustausch mit einem Poly(ethylen
imin)-poly(ethylenglykol)-Copolymer durchgeführt. Dieses Polymer besitzt das
Poly(ethylenimin) als Grundgerüst (400 g/mol) an welches zwei PEG-Ketten (5000 g/mol)
gekoppelt sind[75]. Der zweite Ansatz bestand in der Einkapselung einzelner Nanopartikel in
einem amphiphilen Polymer (Poly(maleinsäureanhydrid-alt-1-tetradecen)) welches durch
Bis(6-aminohexyl)amin quervernetzt wurde[67]. Auch die dritte Variante des Phasentransfers
bestand in der Einbettung der hydrophoben Nanopartikel. Allerdings wurden hier biologische
4 Ergebnisse und Diskussion
79
Lipide als Mizellenbildner verwendet. Die Lipide wurden aus humanen Lipoproteinen
extrahiert und werden im Folgenden als SPIO-Nanosomen bezeichnen. Es entstanden
Nanosomen mit einem hydrodynamischen Durchmesser von ∼250 nm (DLS). Die Beladung
der SPIO-Nanosomen mit Nanopartikeln konnte in einem gewissen Bereich gesteuert werden.
Hingegen wurden über die ersten beiden Methoden einzelne homogen dispergierte Teilchen
erhalten, was mittels DLS und GFC überprüft wurde. Exemplarisch sind in Abb. 4.34 dazu
TEM-Aufnahmen der einzeln verkapselten Teilchen (a) und der SPIO-Nanosomen (b)
gezeigt. Die Aufnahmen der SPIO-Nanosomen enstanden im Heinrich-Pette Institut unter der
Leitung von Dr. Heinrich Hohenberg.
a) b)
Abb. 4.34: TEM-Aufnahmen von nicht aggregierten MnFe2O4-Nanopartikeln in amphiphiler
Polymerhülle (a). SPIO-Nanosomen mit physiologischer Lipidkomposition (b).
Nach der Einkapselung im amphiphilen Polymer sind die Teilchen auf dem TEM-
Probenträger zufällig verteilt und zeigen keine Aggregation. Die TEM-Aufnahme der SPIO-
Nanosomen bestätigt die Einbettung der hydrophoben Nanopartikel im Lipid-Kern der
Mizelle. Ferner bestätigt Abb. 4.35, dass die Teilchen im Lipid-Kern in Abwesenheit eines
externen magnetischen Feldes nicht aggregiert, sondern dispergiert vorliegen.
4 Ergebnisse und Diskussion
80
Abb. 4.35: Die TEM-Aufnahme der Nanosomen bestätigt, dass die Teilchen im Lipid-Kern
nicht aggregiert sind.
Die Untersuchung der magnetischen Eigenschaften zeigt, dass die hier angewandten
postpräparativen Oberflächenmodifikationen keinen Einfluss auf den Magnetismus der
Partikel, insbesondere deren Suszeptibilitäten haben. Exemplarisch sind in Abb. 4.36 die
reduzierten Magnetisierungskurven 6 nm großer Magnetit-Nanopartikel vor und nach der
Einbringung in den Lipid-Kern der Nanosomen gezeigt.
4 Ergebnisse und Diskussion
81
0
1
0.25 0.50 0.75 1.00 1.25
H / kOe
M/M
s
SPIO beladene Nanosomen
SPIO
Abb. 4.36: Reduzierte Magnetisierungskurven superparamagnetischer Fe3O4-Nanopartikel
vor und nach dem Einbringen in die Nanosomen. Durch die Einbettung kommt es zu keiner
Veränderung der Suszeptibilitäten. Beide Proben zeigen superparamagnetisches Verhalten.
Es ist deutlich erkennbar, dass beide Proben superparamagnetisch auf ein äußeres Magnetfeld
reagieren. Da aber beide Kurven identisch verlaufen, ist davon auszugehen, dass sich die
magnetischen Eigenschaften der Probe durch den Phasentransfer nicht ändern. Auch die
absoluten Sättigungsmagnetisierungen MS sind im Rahmen der analytischen Genauigkeit der
Eisenbestimmung gleich. Gegen eine Änderung der magnetischen Eigenschaften spricht auch,
dass die Teilchen in den Nanosomen, wie bereits diskutiert, nicht aggregiert vorliegen.
Andere Arbeiten zeigen eine deutliche Abhängigkeit der Suszeptibilitäten von einer
Aggregation der Partikel in Mizellen[82].
Die Untersuchung der kontrastgebenden Eigenschaften erfolgte an einem klinischen
Ganzkörper-Magnetresonanztomographen bei einer Feldstärke von 3 T und Raumtemperatur
in der Klinik für Diagnostische und Interventionelle Radiologie unter der Leitung von Prof.
Dr. Gerhard Adam. Zur Messung der Relaxationszeiten T2 und T2* wurden typische Multe-
Spinecho bzw. Multi-Gradientenecho-Sequenzen verwendet. Die resultierenden Relaxivitäten
wurden auch hier mit Resovist verglichen. Es wurden MnFe2O4-Nanopartikel im
Größenbereich von 3-18 nm verwendet und den drei beschriebenen
Oberflächenmodifikationen unterzogen. Abb. 4.37 a zeigt die Relaxivitäten dieser Proben als
Funktion des Teilchendurchmessers.
4 Ergebnisse und Diskussion
82
2 4 6 8 10 12 14 16 18 200
100
200
300
400
500
600
700
800
900
r2 Austausch
r2* Mizellen
r2 Mizellen
r2* Austausch
r2* Einkapselung
r2 Einkapselung
r2* Resovist
r2 Resovist
Rel
axiv
ität /
mM
-1s-1
d / nm0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
0
200
400
600
800
Rel
axiv
ität /
mM
-1s-1
mg Eisenoxid / mg Lipid
a) b)
Abb. 4.37: r2- und r2*-Relaxivitäten der drei Oberflächenmodifikationen der MnFe2O4-
Nanopartikel (a). Einfluss der Mizellen-Beladung auf die Relaxivitäten für 6 nm große Fe3O4-
Nanopartikel (b).
Für die polymerumhüllten Proben ist ersichtlich, dass die transversalen Relaxivitäten r2 und
r2* mit steigender Teilchengröße zunehmen. Für eine betrachtete Probe sind die Werte für r2
und r2* außerdem gleich. Für die großen mizellaren Nanosomen sind die Relaxivitäten
deutlich höher. Außerdem unterscheiden sich hier die Werte für r2 und r2* um bis zu eine
Größenordnung. Der starke Abfall in r2* für die 9 nm großen Partikel entspricht nicht den
Erwartungen und ist wahrscheinlich auf eine niedrigere Beladung der Mizellen
zurückzuführen. Um den Einfluss der Beladung genauer zu überprüfen, wurde ein
Kontrollexperiment mit 6 nm großen Fe3O4-Nanopartikeln durchgeführt. Abb. 4.37 b zeigt,
dass sich r2 und r2* deutlich verändern, wenn in der Nanosomen-Präparation der Anteil an
Nanopartikeln von 0.025 auf 0.05 mg Fe3O4 pro 1 mg Lipid erhöht wird. Mit zunehmender
Beladung steigt r2* deutlich an, wohingegen r2 leicht abnimmt. Daher kann der Schluss
gezogen werden, dass die sehr hohen Relaxivitäten vor allem durch die hohe Partikeldichte im
Inneren der Nanosomen verursacht werden. Teilchengrößeneffekte sind dagegen nicht so
entscheidend. Das starke äußere Magnetfeld kann zudem eine Aggregation von Partikeln
innerhalb der Nanosomen bewirken und somit zu starken Magnetfeldgradienten in der
Umgebung der Nanosomen führen.
Es ist unter Zugrundelegung der in 2.2.4 eingeführten Theorien zur Kontrastverstärkung
(Motional Averaging Regime (MAR), Static Dephasing Regime (SDR) und Echo-Limiting
(EL)) davon auszugehen, dass die polymerumhüllten homogendispergierten Teilchen die
4 Ergebnisse und Diskussion
83
Bedingungen des MAR erfüllen[116, 117]. r2 und r2* sind gleich und steigen mit zunehmender
Teilchengröße an. Der transversale Signalverlust wird hier durch Diffusion bewirkt und ist
irreversibel. Der hydrodynamische Durchmesser der polymerumhüllten Teilchen ist zudem
kleiner als der von Resovist (dhyd ∼60 nm), welches ebenfalls den Bedingungen des MAR
genügt (r2=r2*). Die großen Nanosomen befinden sich im Bereich des EL, da hier große
Unterschiede zwischen r2 und r2* zu beobachten sind. r2* ist also für das betrachtete System
maximal groß. Mit zunehmender Beladung der Nanosomen steigt r2*, wie durch die SDR
Theorie vorhergesagt, da r2* proportional zur Magnetisierung der Nanosomen, der so
genannten lokalen magnetischen Dosis (LMD) ist[118]. r2 ist in Folge der echobedingten
Refokussierung deutlich geringer als r2*.
Es wird festegestellt, dass zur Konstruktion eines negativen Kontrastmittels eine Aggregation
von Partikeln beispielsweise in Mizellen zu hohen transversalen Relaxivitäten führt. Die hier
verwendeten SPIO-Nanosomen zeigen extrem hohe r2*-Werte und sind somit das ideale
Kontrastmittel für T2*-gewichtete Gradientenecho-Sequenzen. Ihre r2*-Relaxivität ist um
einen Faktor drei höher als die des klinischen Standards Resovist und ist die höchste bislang
publizierte r2*-Relaxivität bezogen auf die analytische Eisen-Konzentration. Da die
Nanosomen aber auf Grund ihrer Größe geringere r2-Relaxivitäten besitzen, ist es zur
Entwicklung eines T2-Kontrastmittels für Spinecho-Sequenzen sinnvoll, kleinere Mizellen mit
optimierter Größe und somit maximaler r2 Relaxivität zu verwenden. Die Entwicklung eines
solchen Kontrastmittels wird im folgenden Kapitel beschrieben. Die hier verwendeten
Nanosomen eignen sich dagegen hervorragend, um Stoffwechselvorgänge dynamisch zu
verfolgen und zu quantifizieren. Dazu werden sie in 4.4.3 biofunktionalisiert.
4.4.2 Synthese eines T2-Kontrastmittels unter Verwendung von
Triblockcopolymeren
Der Verlauf der transversalen Relaxivitäten r2 und r2* in Abhängigkeit von der Größe einer
magnetischen Sphäre wie einer Mizelle oder einer Zelle zeigt deutlich unterschiedliche
Verläufe. r2 steigt im Bereich des MAR zunächst an, durchläuft ein Maximum und fällt dann
echozeitabhängig wieder ab. Um ein T2-Kontrastmittel maximaler Sensitivität herzustellen,
sollten Mizellen hergestellt werden, deren Größe im Bereich dieser durch das SDR gegebenen
maximalen Relaxivität liegen.
Es wurden dazu 10 nm große Fe3O4-Nanopartikel hergestellt und in den hydrophoben Kern
von Mizellen variabler Größe verpackt. Als Mizellenbildner wurden
4 Ergebnisse und Diskussion
84
Polyethylenglykol-polycaprolacton-polyethylenimin (PEG-PCL-PEI)-Triblockcopolymere
verwendet (Abb. 4.38). Es ähnelt den in 4.4.1 verwendeten PEG-PEI-Copolymeren, die
beiden Teile sind hier aber durch einen hydrophoben PCL-Block verbunden.
OO
OO
ONH
N
O
N
N
R
RR
NH2
O
OCH3
CH3
CH3n-1 m
Abb. 4.38:Allgemeine Strukturformel der PEG-PCL-PEI-Triblockcopolymere.
Wie durch Pöselt et al. gezeigt wurde, zeichnet sich dieses Polymer dadurch aus, dass die
Mizellengröße über einen großen Bereich durch Veränderung der Präparationsparameter
variiert werden kann[119]. Durch Verwendung der 10 nm großen Fe3O4-Nanopartikel war es so
möglich, Mizellen in einem hydrodynamischen Größenbereich zwischen 80 und 180 nm
herzustellen (Abb. 4.39).
100 1000 10000
Inte
nsitä
t / a
.u.
dhyd
/ nm
83 nm 86 nm 115 nm 134 nm 137 nm 159 nm 182 nm
Abb. 4.39: Hydrodynamische Durchmesser der PEG-PCL-PEI-Triblockcopolymer-Mizellen.
Es wurden bei Verwendung von 10 nm großen Fe3O4-Nanopartikeln Mizellen in einem
Größenbereich von 80 bis 180 nm hergestellt.
Die sieben erhaltenen Proben zeichnen sich durch identische Partikel- und
Oberflächeneigenschaften aus. Sie wurden im Folgenden hinsichtlich ihrer transversalen
Relaxivität r2 bei einer Feldstärke von 1.41 T untersucht. Außerdem wurde in der zur
4 Ergebnisse und Diskussion
85
Messung der Relaxationszeit verwendeten Spinecho-Sequenz die Echozeit variiert, um
etwaige Abhängigkeiten im Bereich des EL zu detektieren. In Abb. 4.40 ist der Verlauf von r2
gegen den hydrodynamischen Durchmesser für verschiedene Echozeiten aufgetragen.
80 100 120 140 160 180 200
350
400
450
500
550
600
650
700
τ=1,0 ms τ=0,3 ms τ=0,1 ms τ=0,05 ms
Rel
axiv
ität /
mM
-1s-1
dhyd
/ nm
Abb. 4.40: Verlauf der transversalen Relaxivität r2 als Funktion des hydrodynamischen
Durchmessers der PEG-PCL-PEI-Mizellen für verschiedene Echozeiten (TE=2τ) bei 1.41 T.
Es zeigt sich für die kleineren Mizellen (84 und 86 nm) ein Anstieg von r2. Bei ∼100 nm ist
ein Plateau erreicht. Anschließend findet ab etwa 140 nm Durchmesser ein Abfall der r2-
Relaxivitäten statt. Die in Abb. 4.40 gezeigten Werte beschreiben also genau den erwarteten
Verlauf und wurden in ähnlicher Weise für eine induzierte Aggregation in Lösung
beobachtet[120]. Auch Monte Carlo Simulationen ergaben diesen Verlauf, auch wenn das
Relaxivitätsmaximum bei einer Clustergröße von ∼50 nm errechnet wurde[121]. Das durch das
SDR beschriebene Plateau liegt also bei hydrodynamischen Durchmessern von ca. 100 bis
160 nm. Mizellen dieser Größe zeigen maximale r2-Relaxivitäten von ∼650 mM-1s-1. Dieser
Wert beträgt etwa das Fünffache der Relaxivität des klinischen Standards Resovist und stellt
die maximal erreichbare Sensitivität für T2-gewichtete Spinecho-Sequenzen bei 1.41 T dar.
Gleichzeitig liegt r2 deutlich über dem eines optimierten MnFe2O4-Systems[114] und ist
vergleichbar hoch wie für 7 nm große FeCo-Nanopartikel extrem hoher
Sättigungsmagnetisierung[122].
Eine weitere Bestätigung für die Gültigkeit der Theorien zeigt die Echozeitabhängigkeit der
transversalen Relaxivität. Während für die durch das MAR beschriebenen Proben keine
Unterschiede in den Relaxivitäten für verschiedene Echozeiten erkennbar sind, ergibt sich für
4 Ergebnisse und Diskussion
86
die größeren Mizellen eine deutliche Echozeitabhängigkeit. Mit zunehmender Verkürzung der
Echozeit sinkt die Relaxivität ab, da die 180°-Pulse einen größeren Anteil der Spins
rephasieren, wodurch die Echoamplituden höher werden.
4.4.3 Synthese eines Negativ-Kontrastmittels auf Basis biologischer
Mizellen – Nanosomen
Beim Vergleich der verschiedenen Oberflächenmodifikationen hinsichtlich der transversalen
Relaxivitäten in 4.4.1 wurde festgestellt, dass große Lipid-Mizellen durch das EL beschrieben
werden und über sehr hohe r2*-Relaxivitäten verfügen. Dadurch sind diese Nanosomen
hervorragend für die T2*-gewichtete Bildgebung geeignet. Daraufhin wurde dieses System
dazu ausgewählt, den Lipoprotein-Stoffwechsel mittels MRT nicht-invasiv dynamisch zu
verfolgen. Diese Untersuchung wurde durch Dr. Oliver Bruns aus der Gruppe von Prof. Dr.
Ulrike Beisiegel (Institut für Molekulare Zellbiologie) geleitet und entstand in
Zusammenarbeit mit der Klinik für Diagnostische und Interventionelle Radiologie von Prof.
Dr. Gerhard Adam und dem Heinrich-Pette-Institut von Dr. Heinrich Hohenberg.
Lipoproteine sind Mizellen, welche für den Transport von Lipiden und anderen hydrophoben
Substanzen wie Vitaminen im Blut verantwortlich sind. Sie sind mit bestimmten Proteinen,
den so genannten Apolipoproteinen assoziiert. Diese bedingen die strukturelle Integrität der
Lipoproteine und dienen als Liganden für die Lipoproteinrezeptoren, wodurch die
Bluthalbwertszeit der Lipoproteine maßgeblich beeinflusst wird. Die Lipoproteine lassen sich
nach Größe und Dichte in die High Density Lipoproteine (HDL), Low Density Lipoproteine
(LDL) sowie die Triglyceridreichen Lipoproteine (TRL), zu welchen die Very low density
Lipoproteine (VLDL) und die Chylomikronen (CM) gehören, unterscheiden. Zur
Visualisierung des Lipoproteinstoffwechsels mittels MRT wurden bislang LDL- und HDL-
ähnliche Mizellen entwickelt und mit Gd-Chelaten zur positiven MR-Bildgebung markiert[123-
127]. Aufgrund der Toxizität und der geringen Relaxivität von Gd-Kontrastmitteln, sollten
Eisenoxid-basierte Kontrastmittel auch hier geeigneter sein, um weitergehende
Untersuchungen durchzuführen.
Während LDL und HDL Bluthalbwertszeiten von Stunden oder Tagen haben, zeigen die
postprandialen TRL Halbwertszeiten von wenigen Minuten. Um die mit der Lipolyse der
postprandialen TRL verbundenen Stoffwechselvorgänge dynamisch zu verfolgen, wurde hier
ein Modell für TRL entwickelt und eingesetzt, dass den in 4.4.1 diskutierten Nanosomen
entspricht und ihre relaxometrischen Eigenschaften besitzt, zur spezifischen Bildgebung aber
4 Ergebnisse und Diskussion
87
weiter funktionalisiert wurde. Die für diese Untersuchungen verwendeten Nanosomen sind
schematisch in Abb. 4.41 dargestellt.
HO
OH
HO
OH
HO
O H
SPIO-Nanosomen
HO
OH
HO
OH
HO
O H
Radioaktivmarkierte SPIO-Nanosomen
HO
OH
HO
OH
HO
O H
Funktionalisierte, radioaktivmarkierte SPIO-Nanosomen
Lipoprotein LipaseApolipoprotein E
Phospholipide Triglyceride Cholesterol CholesterolesterHO
3H-cholesterololeylether
SPIO
Abb. 4.41: Schematische Darstellung der Nanosomen und ihrer Funktionalisierung mit
Apolipoprotein E und Apolipoprotein Lipase. Die zur Bildung der Nanosomen verwendeten
Lipide wurden aus humanen Lipoproteinen extrahiert.
Die Nanosomen, deren hydrophober Kern die superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikel
enthält, wurden aus biologischen Lipiden gebildet. Diese wurden aus humanen Lipoproteinen
extrahiert. Die Nanosomen weisen also eine physiologische Lipid-Zusammensetzung auf. Für
die weiter unten beschriebenen Quantifizierungsexperimente wurden die Nanosomen
zusätzlich mit 3H-cholesteryl-oleyl-ether radioaktiv markiert. Um dem Lipoprotein möglichst
nahe zu kommen, wurden die Nanosomen mit den entsprechenden Liganden für die
Lipoproteinrezeptoren assoziert. Die dafür verwendeten Proteine waren das Apolipoprotein E
(Apo E) sowie die Lipoprotein Lipase (LpL).
4 Ergebnisse und Diskussion
88
Im Folgenden sollte nachgewiesen werden, dass die Funktionalisierung der Nanosomen mit
Apo E und LpL eine spezifische Erkennung durch die hepatischen Lipoproteinrezeptoren
muriner Leberzellen (primäre Hepatocyten) ermöglicht. Außerdem wurden
Inhibitionsexperimente durchgeführt, um zu verifizieren, dass die funktionalen Eigenschaften
der Nanosomen durch deren Beladung mit Nanopartikeln nicht verändert oder beeinträchtigt
werden. Zunächst wurden dazu die radioaktiv markierten SPIO-Nanosomen für 60 min mit
den Zellen inkubiert. Anschließend wurden die Nanosomen, welche mit Apo E und solche,
die mit Apo E und LpL funktionalisiert waren, mit den Zellen unter identischen Bedingungen
inkubiert. Dabei wurde festgestellt, dass sie mit Apo E-funktionalisierten Nanosomen eine
1.4-fach erhöhte Aufnahme und die mit Apo E und LpL sogar eine 1.7-fach erhöhte
Nanosomen Internalisierung bewirken (Abb. 4.42 a).
50 µm 50 µm 50 µm 50 µm
a b
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
ohne 10-fach 25-fach 50-fach 100-fach
* ***
SPIO-freie, Apolipoprotein E funktionalisierte Mizellen
radi
omar
kier
te S
PIO
-Nan
osom
enA
ufna
hme
[cpm
/mg
Zel
l Pro
tein
]
Inhibition der radioaktiven SPIO-Nanosomen Aufnahme
0
10000
20000
30000
40000
50000
radi
omar
kier
te S
PIO
-Nan
osom
enA
ufna
hme
[cpm
/mg
Zel
l Pro
tein
]
***
***
**
Aufnahme der radioaktiven SPIO-Nanosomen
+-+-Lipoprotein Lipase
++--Apolipoprotein E
Abb. 4.42: Spezifische Aufnahme in Hepatozyten (a) und Inhibition (b) von 3H-
Cholesteryloleylether radiomarkierten SPIO Nanosomen.
Die rezeptorinduzierte Endozytose der funktionalisierten Nanosomen im Vergleich zu den
nicht-funktionalisierten konnte also durch diese Steigerung nachgewiesen werden. Im
Inhibitionsexperiment (Abb. 4.42 b) konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme der radioaktiv
markierten SPIO-Nanosomen (Apo E funktionalisiert) durch die Zugabe von SPIO-freien Apo
E-funktionalisierten Nanosomen in Abhängigkeit von der Dosis reduziert wird. Daher ist
davon auszugehen, dass die Einbettung von superparamagnetischen Nanopartikeln auch die
biologische Funktion der Mizellen nicht verändert.
Zur dynmamischen Verfolgung des Lipoprotein-Stoffwechsels wurden die SPIO-Nanosomen
intravenös in Wildtyp-Mäuse injiziert. In den T2*-gewichteten Bildern der Leber, welche
4 Ergebnisse und Diskussion
89
hauptverantwortlich für Verstoffwechselung der TRL ist, zeigt sich anschließend ein starker
Signallabfall (Abb. 4.43 a). Um die Zell-Aufnahme der Nanosomen genauer zu verfolgen,
wurde die Leber ex vivo untersucht und Cryo-Schnitte angefertigt. Die Schnitte wurden
mittels TEM untersucht (Abb. 4.43 b).
vena portaevena cavaaorta
liverstomach
a
v
n
n
v
b
0.5 µm2.5 µm
Abb. 4.43: T2*-gewichtetes Bild der Leber vor und 60 min nach der intravenösen Injektion
der SPIO-Nanosomen (a). TEM-Aufnahme eines Hepatozyten, in dessen Lipid droplets sich
die Nanopartikel befinden (n: Zellkerne, v: intrahepatische Blutgefäße).
In der TEM-Aufnahme ist erkennbar, dass sich Eisenoxid-Nanopartikel in den Hepatozyten in
der Peripherie der sogenannten Lipid droplets befinden. Die SPIO-Nanosomen werden in der
Leber also genau wie die TRL hauptsächlich von den Hepatozyten aufgenommen und nicht
von den phagozytisch aktiven Kupffer-Zellen. Diese Makrophagen nehmen hingegen die
klinisch verabreichten Kontrastmittel wie Resovist auf. Möglicherweise wird der
hydrophobe Kern der TRL dem Lipid-Speicher zugeführt.
4 Ergebnisse und Diskussion
90
Um die Organverteilung der SPIO-Nanosomen in vivo quantitativ abzuschätzen und die
daraus resultierende Eisenkonzentration in der Leber zu berechnen, wurden die radioaktiv
markierten SPIO-Nanosomen den Wildtyp Mäuse intravenös injiziert. Die hier gewählte 3H-
Markierung wird intrazellulär gespeichert und nicht wieder freigegeben, so dass die messbare
Aktivität tatsächlich mit der SPIO-Konzentration in der Leber korreliert. Abb. 4.44 a zeigt,
dass 20 min nach der Injektion etwa 50 % der injizierten Dosis in die Leber aufgenommen
wurden. Andere Organe wie Fettgewebe (6.7 %), Milz (2.4 %), Muskeln (1.8 %), Herz
(0.9 %) und Nieren (0.4 %) zeigten nur geringe Aktivitäten.
0
10
20
30
40
50
60
Lebe
r
Fettg
eweb
e
Milz
Mus
kel
Herz
Nieren
% d
er in
jizie
rten
Dos
is
0
20
40
60
80
0 0.025 0.05 0.075 0.1
Eisenkonzentration / mmol/l
∆R
2* [
1/S]
a b
Abb. 4.44: Organverteilung der radioaktiv markierten SPIO-Nanosomen 20 min nach der
intravenösen Injektion (a). Zur Bestimmung der Relaxivität r2* in vivo wurde die Änderung
der Relaxationrate ∆R2* vor und 20 min nach der Injektion ansteigender Dosen gemessen.
Die Relaxivität wurde in 2.2.4 als Maß für die Änderung der Relaxationsrate (hier: ∆R2*) in
Abhängigkeit von der Konzentration des Kontrastmittels (der analytischen
Eisenkonzentration) eingeführt. Um die Relaxivität r2* in vivo zu bestimmen, wurde die
Änderung der Relaxationsrate ∆R2* vor und 20 min nach der Injektion mit der SPIO-
bezogenen Eisenkonzentration korreliert. Eine direkte Messung der Eisenkonzentration in der
Leber ist wegen des hohen biologischen Hintergrundes nicht möglich. Die hepatische SPIO-
Konzentration wurde daher über die Bestimmung der Eisenkonzentration der Nanosomen und
der Organverteilung abgeschätzt. Daher wurden verschiedene Nanosomen-Konzentrationen
injiziert und die jeweils gemessene Änderung ∆R2* gegen die so ermittelte Konzentration
aufgetragen (Abb. 4.44 b). Es wurde eine lineare Abhängigkeit beobachtet, welche es
ermöglichte, die Relaxivität der SPIO-Nanosomen in der Leber zu ∼850 mM-1s-1
4 Ergebnisse und Diskussion
91
abzuschätzen (Feldstärke 3 T). Die in vitro Relaxometrie derselben Probe ergab für die
longitudinale Relaxivität einen Wert von r1=2.5±0.3 mM-1s-1. Für die transversalen
Relaxivitäten wurden Werte von r2=410±46 mM-1s-1 und r2*=800±64 mM-1s-1 gemessen. Wie
schon in der genauen relaxometrischen Analyse der Nanosomen in 4.4.1 diskutiert, zeigt der
große Unterschied zwischen r2 und r2*, dass die effektive transversale Relaxivität r2*
maximiert ist und durch das Static Dephasing Regime (SDR) beschrieben wird. Darüber
hinaus zeigt der Vergleich der in vitro Relaxivität (r2*= 800 mM-1s-1) mit der in vivo
bestimmten (r2*∼850 mM-1s-1) eine sehr gute Übereinstimmung. Da die r2*-Relaxivität bereits
vor der Injektion maximal ist, ändert sie sich durch physiologische Prozesse wie die
Kompartmentibilisierung der Nanosomen in Zellen nicht und erlaubt daher im Gegensatz zu
anderen Eisenoxid-basierten Kontrastmitteln die Quantifizierung und dynamische Verfolgung
der den TRL zugrunde liegenden Stoffwechselprozesse. Außerdem zeigt der Vergleich mit
anderen Arbeiten, dass die Relaxivitäten deutlich höher als alle klinisch applizierten
Kontrastmittel sind und auch über denen liegen, die kürzlich für optimierte MnFe2O4-
Nanopartikel zur molekularen Bildgebung[114] oder für Eisenoxid-Mikropartikel berichtet
worden sind[128].
Um die Kinetik des TRL-Stoffwechsels in der lebenden Maus zu quantifizieren, wurden
dynamische MR-Messungen durchgeführt. Dazu wurden T2*-gewichtete Bilder von Leber,
Magen und wichtigen Blutgefäßen (Aorta, große Hohlvene) alle 5.5 s aufgenommen
(Abb. 4.45 a). Die Plasmakonzentration der TRL nach der Injektion (100 mg/dl) entspricht
der typischen Triglycerid-Konzentration nach der Einnahme einer Mahlzeit. Unmittelbar nach
der Injektion kam es durch das Kontrastmittel zu einem starken Signalabfall in der vena cava
(5.5 s, dargestellt durch Pfeile). Anschließend wurden die Hauptblutgefäße der Leber schwarz
(11 s), gefolgt von einem kontinuierlichen Signalabfall in der Leber (16.5 s). Nach 38.5 s stieg
das MR-Signal in den Blutgefäßen wieder an, wobei die Leber schwarz blieb. Dieser Prozess
charakterisiert die Aufnahme der SPIO-Nanosomen aus dem Blut in die Leber. Diese nicht-
invasive Verfolgung der hepatischen Lipoprotein-Aufnahme wurde für vier individuelle
Wildtyp-Mäuse durchgeführt (Abb. 4.45 b) und zeigt eine hohe Reproduzierbarkeit. Die
Aufnahme erfolgt sehr schnell (80 % in den ersten zwei Minuten) und folgt einer
biexponentiellen Kinetik, wie auch für radioaktiv markierte Lipoproteine gezeigt wurde[129].
Durch die Nicht-Invasivität der Methode konnten in dieser Untersuchung 150 Datenpunkte
innerhalb von 15 Minuten mit einem Tier gewonnen werden. Konventionelle, auf dem Einsatz
von Radioisotopen basierte Studien hätten für jeden Punkt eine Maus benötigt.
4 Ergebnisse und Diskussion
92
0 sec
5.5 sec
11.0 sec
22.0 sec
16.5 sec
38.5 sec
60.5 sec
82.5 sec
126.5 sec
104.5 sec
a
Zeit [min]
-ln
(S(t
) /
S0)
-4 -2 2 4 6 8 10 12 14
0.5
1.0
1.5
2.0
Zeit [min]
-ln
(S(t
) / S
0)
-4 -2 2 4 6 8 10 12 14
0.25
0.50
wildtype
LDL receptor deficient
b
c
d-4 -2 2 4 6 8 10 12 14
0.5
1.0
1.5
2.0
wildtype
apolipoprotein E deficient
Zeit [min]
-ln
(S(t
) / S
0)
Abb. 4.45: Quantitative MR-Echtzeit-Verfolgung (T2*-gewichtet). Die SPIO-Nanosomen
reduzieren zunächst das Signal im Blut und später in der Leber (16.5 s) (a). Kinetik der
hepatischen SPIO-Nanosomen-Aufnahme für Wildtyp-Mäuse (n=4) (b). Vergleich der
mittleren Werte für Wildtyp-Mäuse mit Apo E-defizienten Mäusen (c) und LDL-Rezeptor-
defizienten Mäusen (d).
Es wurde außerdem getestet, inwiefern quantitative Unterschiede in der hepatischen
Aufnahme der SPIO-Nanosomen detektierbar sind. Dazu wurden die Kinetiken für Wildttyp-
Mäuse, Apo E-defiziente Mäuse sowie LDL-Rezeptor-defiziente Mäuese verglichen. Durch
das Fehlen des LDL-Rezeptors oder dessen Ligand Apo E zeigen defiziente Mäuse eine
reduzierte hepatische Aufnahme von TRL gegenüber Wilttyp-Mäusen. Der Vergleich der
4 Ergebnisse und Diskussion
93
SPIO-Nanosomen Aufnahme zeigt tatsächlich eine reduzierte Verstoffwechselung für die
defizienten Mäuse (Abb. 4.45 c,d). Daher ist davon auszugehen, dass die SPIO-Nanosomen
Apo E-abhängig aufgenommen werden.
Es wurde hier ein Kontrastmittel zur Visualisierung und Quantifizierung der hepatischen
Aufnahme von Lipoproteinen in Echtzeit entwickelt. Die relaxometrischen Eigenschaften
wurden im Hinblick auf die T2*-gewichtete Bildgebung optimiert und erlauben erstmals eine
direkte Korrelation des räumlichen MR-Signals mit einem Stoffwechselprozess. Zur
Konstruktion der SPIO-Nanosomen sind keine aufwendigen Oberflächenmodifizierungen der
Nanopartikel nötig, weshalb ihre magnetischen Eigenschaften vollständig erhalten bleiben. Da
die Nanosomen ein Modell der TRL darstellen, ist es entscheidend, dass die Nanopartikel in
den hydrophoben Kern der Mizelle eingebracht werden und daher die biologisch relevante
Nanosomen-Oberfläche unverändert bleibt. Die hohe räumliche und zeitliche Auflösung der
MRT wurde durch keine andere Technik zur Untersuchung des Lipoprotein-Stoffwechsels
erreicht. Die maximale effektive transversale Relaxivität r2* der SPIO-Nansomen verleiht
dem Kontrastmittel optimale Sensitivität im MRT. Gleichzeitig ermöglicht die hohe
Elektronendichte der superparamagnetischen Nanopartikel die Verfolgung der zellulären
Prozessierung der SPIO-Nanosomen mittels Elektronenmikroskopie.
5 Zusammenfassung
94
5 Zusammenfassung
In dieser Arbeit wurden neuartige Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie auf
Basis von Ferrit-Nanopartikeln entwickelt. Die Nanopartikel wurden durch nasschemische
organometallische Hochtemperatursynthesen mit enger Größenverteilung hergestellt. Die
Größe konnte über einen weiten Bereich von 3 bis 30 nm variiert werden. Durch Wahl der
Reaktionsbedingungen war es außerdem möglich, die chemische Zusammensetzung der
Teilchen zwischen reinem Magnetit (Fe3O4) und Manganferrit (MnFe2O4) zu steuern.
Die Teilchen wurden nach verschiedenen Strategien in wässrige Lösung transferiert. Ein
Ligandenaustausch des aus der Synthese stammenden Stabilisators Ölsäure gegen
Polyethylenglykol (PEG)-basierte Liganden bewirkte homogendispergierte Teilchen mit
dichter PEG-Hülle. Zur Bindung auf der Teilchenoberfläche erwies sich dabei eine Phosphat-
Ankergruppe als besonders stabil. Zur Entwicklung eines T1-Kontrastmittels zeigte sich ein
System aus 4 nm großen Fe3O4-Nanopartikeln als besonders geeignet. Der Einfluss der PEG-
Kettenlänge wurde systematisch untersucht. Eine Molmasse von 1100 g/mol führte zu
Teilchen, die eine extrem hohe Stabilität gegen die Adsorption von Serum-Proteinen zeigen.
Dieses System hatte außerdem eine longitudinale Relaxivität von r1=7.3 mM-1s-1 und ein
Relaxivitätsverhältnis r2/r1 von 2.4. Sein r1-Koeffizient ist damit um einen Faktor zwei höher
als der Gadolinium-basierte klinische Standard Magnevist (Gd-DTPA). Der r2-Koeffizient des
Kontrastmittels hingegen ist deutlich geringer als der des typischen T2-Kontrastmittels
Resovist (r2=130 mM-1s-1). Diese Tatsache ist der Beleg dafür, dass eine Aggregation der
Partikel vollständig verhindert werden konnte. Das Kontrastmittel behält seine
relaxometrischen Eigenschaften unter physiologischen Bedingungen. Das PEG-1100-System
zeigte außerdem im Tagesbereich in biologisch relevanter Konzentration keine akute
Zytotoxizität und ein sehr geringes Maß an unspezifischer Phagozytose durch murine
Makrophagen. Es ist daher ein optimiertes positives MR-Kontrastmittel, welches hohe
Stabilität, extrem günstige relaxometrische Eigenschaften sowie geringe Zytotoxizität und
niedrige Phagotytoseraten vereinigt (Tromsdorf et al., Nano Letters 2009, 9, 4344).
Neben dem Ligandenaustausch wurde die Verkapselung der Nanopartikel in Mizellen unter
Verwendung von biologischen oder synthetischen Polymeren angewandt, um einen
Phasentransfer in wässrige Lösung zu ermöglichen. Durch diese Oberflächenmodifizierungen
gelang es, negative Kontrastmittel sowohl für die T2-gewichtete Spinecho- als auch für die
T2*-gewichtete Gradientenecho-MR-Bildgebung zu synthetisieren. Zunächst ergab eine
5 Zusammenfassung
95
systematische Untersuchung der verschiedenen Oberflächenmodifizierungen im Hinblick auf
deren Einfluss auf die Relaxivitäten r2 und r2*, dass eine kontrollierte
Kompartmentibilisierung der Nanoteilchen in Mizellen sowohl r2 als auch r2* erhöht
(Tromsdorf et al., Nano Letters 2007, 7, 2422). Große Lipid-Mizellen, sogenannte
Nanosomen, besitzen maximale r2*-Relaxivitäten und stellen ein Modell für Triglyceridreiche
Lipoproteine (TRL) dar. Sie ermöglichten erstmals die quantitative MR-Echtzeit-Verfolgung
eines Stoffwechselprozesses. Ihre r2*-Relaxivität beträgt ∼850 mM-1s-1 und ist ca. dreimal
höher als die des klinischen Eisenoxid-Standards Resovist. Es konnte weiter gezeigt werden,
dass die r2*-Relaxivität sich während der Aufnahme in hepatische Zellen in der Leber nicht
ändert. Das T2*-Kontrastmittel erlaubte daher die Detektion quantitativer Unterschiede in der
hepatischen Aufnahme der Nanosomen für unterschiedliche Maus-Modelle (Bruns et al.,
Nature Nanotechnology 2009, 4, 193.).
Die Verwendung von Mizellen-bildenden synthetischen Triblockcopolymeren ermöglichte die
Bestimmung der Mizellengröße maximaler r2-Relaxivität für T2-gewichtete Spinecho-
Sequenzen. Die erreichten Relaxivitäten (∼650 mM-1s-1 bei 1.41 T) sind die höchsten bisher
berichteten für Eisenoxid und vergleichbar denen optimierter FeCo-Nanopartikel extrem
hoher Sättigungsmagnetisierung (Tromsdorf et al., Manuskript in Vorbereitung).
Im Rahmen dieser Arbeit war es möglich, sensitive und optimierte MR-Kontrastmittel für die
T1-, T2- und T2* gewichtete Bildgebung zu entwickeln.
6 Summary
96
6 Summary
The scope of this thesis was the development of sophisticated contrast agents for Magnetic
Resonance Imaging (MRI) based on ferrite nanoparticles. The nanoparticles were synthesized
via organometallic high temperature syntheses and appeared with narrow size distribution. By
carefully choosing the reaction conditions it was possible to vary the crystal size between 3
and 30 nm and, moreover, to precisely tune the chemical composition between magnetite
(Fe3O4) and manganese ferrite (MnFe2O4).
The particles were transferred to aqueous environment using three different strategies. First, a
ligand exchange of the native capping agent oleic acid against poly(ethylene glycol) (PEG)
based ligands led to the formation of homogeneously dispersed particles with a dense coating.
It turned out that a phosphate anchor group provides a stable binding to the particle surface.
Therefore, a T1 contrast agent consisting of a 4 nm iron oxide core and an optimal PEG chain
length of 1000 g/mol was designed. The use of this polymer together with the phosphate
group provided high stability against the adsorption of plasma proteins and a r1 relaxivity of
7.3 mM-1s-1 which is two times higher compared to that of Magnevist, a typical clinically
applied T1 agent. The relaxivity ratio r2/r1 was 2.4 and the lowest one so far for PEGylated
iron oxide particles. In addition, this novel contrast agent did not show any toxic effect after
24 h of incubation with relevant cells and at biologically reasonable concentrations together
with very low levels of unspecific uptake into murine macrophages (Tromsdorf et al., Nano
Letters 2009, 9, 4434).
Besides ligand exchange reactions, encapsulations of nanoparticles within micelles formed by
synthetic or biological polymers were performed in order to transfer the particles to aqueous
solution. Therefore, it was possible to develop a T2 contrast agent for spin echo sequences as
well as a T2* contrast agent for gradient echo sequences. A comprehensive comparison
concerning the various surface modifications in terms of negative contrast enhancement
confirmed that a controlled compartmentalisation of particles within micelles dramatically
increases both r2 and r2* (Tromsdorf et al., Nano Letters 2007, 7, 2422). Large lipid micelles,
referred to as nanosomes, which act as a model for triglyceride rich lipoproteins (TRL)
exhibited maximized r2* relaxivities and allowed, for the first time, quantitave MR imaging of
a metabolic process, namely the metabolism of TRL in this case. The r2* relaxivity of the
nanosomes is more than three times higher than that of Resovist, a clinical negative contrast
agent. Moreover, it was possible to demonstrate that during the process of nanosome uptake
6 Summary
97
into hepatic cells in the liver the r2* relaxivity coefficient did not change. As a result, the as
prepared T2* contrast agent allowed distinction between different levels of TRL uptake into
the liver via MRI (Bruns et al., Nature Nanotechnology 2009, 4, 193).
The use of micelle forming tailored triblock-copolymers enabled us to determine the size of
maximal relaxivity for T2 weighted spin echo imaging. The obtained r2 relaxivities of these
particle loaded micelles are the highest ever reported ones for iron oxide based negative
contrast agents and are comparable to optimized FeCo alloy nanoparticles of extremely high
saturation magenetization (Tromsdorf et al., manuscript in preparation) .
In conclusion, it was possible to develop highly sensitive and optimized MR contrast agents
for T1, T2 as well as T2* weighted imaging.
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8 Anhang
105
8 Anhang
8.1 Abkürzungsverzeichnis
AAS Atomabsorptionsspektroskopie
Abb. Abbildung
B Magnetische Flussdichte
DLS Dynamische Lichtstreuung
emu electromagnetic unit
EL Echo-Limiting
Gl. Gleichung
H Magnetische Feldstärke
HDL High density Lipoprotein
LpL Lipoprotein Lipase
M Magnetisierung
MAR Motional Averaging Regime
MRT Magnetresonanztomographie
MS Sättigungsmagnetisierung
Mxy Transversale Magnetisierung
Mz Longitudinale Magnetisierung
NMR Nuclear magnetic resonance
Oe Oersted
PEG Polyethylenglykol
SDR Static Dephasing Regime
SPIO Superparamagnetic iron oxide
TC Curie-Temperatur
TE Echozeit
8 Anhang
106
TEM Transmissionselektronenmikroskopie
TR Wiederholzeit
TRL Triglyceridreiches Lipoprotein
T1 Longitudinale Relaxationszeit
T2 Transversale Relaxationszeit
T2* Effektive transversale Relaxationszeit
USPIO Ultrasmall superparamagnetic iron oxide
XRD Röntgendiffraktometrie
8 Anhang
107
8.2 Chemikalien
Chemikalien Gefahrensymbol R-Sätze S-Sätze
Aceton F, Xi 11-36-66-67 9-16-26
Chloroform Xn 22-38-40-48/20/22 36/37
Dibenzylether Xi 36/37/38 24/25
Dichlormethan Xn 40 23-24/25-36/37
Dioctylether 24/25
Diphenylether N 51/53 61
Eisenpentacarbonyl T+, F 11-24-26/28 9-16-29-36/37/39-45
Eisen-
trisacetylacetonat
Xn 22-36/37/38 26-37/39
Ethanol F 11 7-16
1,2-Hexadekandiol 22-24/25
n-Hexan F, Xn, N 11-38-48/20-51/53-62-
65-67
9-16-29-33-36/37-61-
62
Methanol F, T 11-23/24/25-
39/23/24/25
7-16-36/37-45
1-Octadecen 62
Oleylamin C, Xn 22-34 24/25-26
Ölsäure Xi 36/37/38 26-37/39
Phosphorylchlorid T+, C 14-22-26-35-48/23 1/2-7/8-26-36/37/39-45
Tetrahydrofuran F, Xi 11-19-36/37 16-29-33
Triethylamin F, C 11-20/21/22-35 1/2-3-16-26-29-
36/37/39-45
Trimethylamin-N-oxid Xi 36/37/38
8 Anhang
108
8.3 Gefahrenhinweise und Sicherheitsratschläge
8.3.1 Gefahrensymbole
E explosionsgefährlich F+ hochentzündlich F leichtentzündlich O brandfördernd T+ sehr giftig T giftig Xn gesundheitsschädlich Xi reizend C ätzend N umweltgefährlich
8.3.2 Hinweise auf besondere Gefahren (R-Sätze)
R 1 In trockenem Zustand explosionsgefährlich. R 2 Durch Schlag, Reibung, Feuer oder andere Zündquellen explosionsgefährlich. R 3 Durch Schlag, Reibung, Feuer oder andere Zündquellen besonders explosionsgefährlich. R 4 Bildet hochempfindliche explosionsgefährliche Metallverbindungen. R 5 Erwärmung kann Explosion verursachen. R 6 Mit und ohne Luft explosionsfähig. R 7 Kann Brand verursachen. R 8 Feuergefahr bei Berührung mit brennbaren Stoffen. R 9 Explosionsgefahr bei Mischung mit brennbaren Stoffen. R 10 Entzündlich. R 11 Leichtentzündlich. R 12 Hochentzündlich. R 14 Reagiert heftig mit Wasser. R 15 Reagiert mit Wasser unter Bildung hochentzündlicher Gase. R 16 Explosionsgefährlich in Mischung mit brandfördernden Stoffen. R 17 Selbstentzündlich an der Luft. R 18 Bei Gebrauch Bildung explosiver/leicht entzündlicher Dampf-Luftgemische möglich. R 19 Kann explosionsfähige Peroxide bilden. R 20 Gesundheitsschädlich beim Einatmen. R 21 Gesundheitsschädlich bei Hautkontakt. R 22 Gesundheitsschädlich bei Verschlucken. R 23 Giftig beim Einatmen. R 24 Giftig bei Hautkontakt. R 25 Giftig bei Verschlucken. R 26 Sehr giftig beim Einatmen. R 27 Sehr giftig bei Berührung mit der Haut. R 28 Sehr giftig beim Verschlucken. R 29 Entwickelt bei Berührung mit Wasser giftige Gase. R 30 Kann bei Verwendung leicht entzündbar werden. R 31 Entwickelt bei Berührung mit Säure giftige Gase. R 32 Entwickelt bei Berührung mit Säure sehr giftige Gase. R 33 Gefahr kumulativer Wirkungen. R 34 Verursacht Verätzungen. R 35 Verursacht schwere Verätzungen. R 36 Reizt die Augen. R 37 Reizt die Atmungsorgane. R 38 Reizt die Haut. R 39 Ernste Gefahr irreversiblen Schadens.
8 Anhang
109
R 40 Verdacht auf krebserzeugende Wirkung. R 41 Gefahr ernster Augenschäden. R 42 Sensibilisierung durch Einatmen möglich. R 43 Sensibilisierung durch Hautkontakt möglich. R 44 Explosionsgefahr bei Erhitzen unter Einschluss. R 45 Kann Krebs erzeugen. R 46 Kann vererbbare Schäden verursachen. R 48 Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei längerer Exposition. R 49 Kann Krebs erzeugen beim Einatmen. R 50 Sehr giftig für Wasserorganismen. R 51 Giftig für Wasserorganismen. R 52 Schädlich für Wasserorganismen. R 53 Kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen haben. R 54 Giftig für Pflanzen. R 55 Giftig für Tiere. R 56 Giftig für Bodenorganismen. R 57 Giftig für Bienen. R 58 Kann längerfristig schädliche Wirkungen auf die Umwelt haben. R 59 Gefährlich für die Ozonschicht. R 60 Kann die Fortpflanzungsfähigkeit beeinträchtigen. R 61 Kann das Kind im Mutterleib schädigen. R 62 Kann möglicherweise die Fortpflanzungsfähigkeit beeinträchtigen. R 63 Kann das Kind im Mutterleib möglicherweise schädigen. R 64 Kann Säuglinge über die Muttermilch schädigen. R 65 Gesundheitsschädlich: Kann beim Verschlucken Lungenschäden verursachen. R 66 Wiederholter Kontakt kann zu spröder oder rissiger Haut führen. R 67 Dämpfe können Schläfrigkeit und Benommenheit verursachen. R 68 Irreversibler Schaden möglich.
8.3.3 Kombination der R-Sätze
R 14/15 Reagiert heftig mit Wasser unter Bildung hochentzündlicher Gase. R 15/29 Reagiert mit Wasser unter Bildung giftiger und hochentzündlicher Gase. R 20/21 Gesundheitsschädlich beim Einatmen und bei Berührung mit der Haut. R 20/21/22 Gesundheitsschädlich beim Einatmen, Verschlucken und Berührung mit der Haut. R 20/22
Gesundheitsschädlich beim Einatmen und Verschlucken. R 21/22 Gesundheitsschädlich bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. R 23/24 Giftig beim Einatmen und bei Berührung mit der Haut. R 23/24/25 Giftig beim Einatmen, Verschlucken und Berührung mit der Haut. R 23/25 Giftig beim Einatmen und Verschlucken. R 24/25 Giftig bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. R 26/27 Sehr giftig beim Einatmen und bei Berührung mit der Haut. R 26/27/28 Sehr giftig beim Einatmen, Verschlucken und Berührung mit der Haut. R 26/28 Sehr giftig beim Einatmen und Verschlucken. R 27/28 Sehr giftig bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. R 36/37 Reizt die Augen und die Atmungsorgane. R 36/37/38 Reizt die Augen, Atmungsorgane und die Haut. R 36/38 Reizt die Augen und die Haut. R 37/38 Reizt die Atmungsorgane und die Haut. R 39/23 Giftig: ernste Gefahr irreversiblen Schadens durch Einatmen. R 39/23/24 Giftig: ernste Gefahr irreversiblen Schadens durch Einatmen und bei Berührung mit der Haut. R 39/23/24/25 Giftig: ernste Gefahr irreversiblen Schadens durch Einatmen, Berührung mit der Haut und
durch Verschlucken. R 39/23/25 Giftig: ernste Gefahr irreversiblen Schadens durch Einatmen und durch Verschlucken. R 39/24 Giftig: ernste Gefahr irreversiblen Schadens bei Berührung mit der Haut. R 39/24/25 Giftig: ernste Gefahr irreversiblen Schadens bei Berührung mit der Haut und durch
Verschlucken. R 39/25 Giftig: ernste Gefahr irreversiblen Schadens durch Verschlucken. R 39/26 Sehr giftig: ernste Gefahr irreversiblen Schadens durch Einatmen.
8 Anhang
110
R 39/26/27 Sehr giftig: ernste Gefahr irreversiblen Schadens durch Einatmen und bei Berührung mit der Haut.
R 39/26/27/28 Sehr giftig: ernste Gefahr irreversiblen Schadens durch Einatmen, Berührung mit der Haut und durch Verschlucken.
R 39/26/28 Sehr giftig: ernste Gefahr irreversiblen Schadens durch Einatmen und durch Verschlucken. R 39/27 Sehr giftig: ernste Gefahr irreversiblen Schadens bei Berührung mit der Haut. R 39/27/28 Sehr giftig: ernste Gefahr irreversiblen Schadens bei Berührung mit der Haut und durch
Verschlucken. R 39/28 Sehr giftig: ernste Gefahr irreversiblen Schadens durch Verschlucken. R 42/43 Sensibilisierung durch Einatmen und Hautkontakt möglich. R 48/20 Gesundheitsschädlich: Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei längerer Exposition durch
Einatmen. R 48/20/21 Gesundheitsschädlich: Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei längerer Exposition durch
Einatmen und durch Berührung mit der Haut. R 48/20/21/22 Gesundheitsschädlich: Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei längerer Exposition durch
Einatmen, Berührung mit der Haut und durch Verschlucken. R 48/20/22 Gesundheitsschädlich: Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei längerer Exposition durch
Einatmen und durch Verschlucken. R 48/21 Gesundheitsschädlich: Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei längerer Exposition durch
Berührung mit der Haut. R 48/21/22 Gesundheitsschädlich: Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei längerer Exposition durch
Berührung mit der Haut und durch Verschlucken. R 48/22 Gesundheitsschädlich: Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei längerer Exposition durch
Verschlucken. R 48/23 Giftig: Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei längerer Exposition durch Einatmen. R 48/23/24 Giftig: Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei längerer Exposition durch Einatmen und durch
Berührung mit der Haut. R 48/23/24/25 Giftig: Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei längerer Exposition durch Einatmen, Berührung
mit der Haut und durch Verschlucken. R 48/23/25 Giftig: Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei längerer Exposition durch Einatmen und durch
Verschlucken. R 48/24 Giftig: Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei längerer Exposition durch Berührung mit der
Haut. R 48/24/25 Giftig: Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei längerer Exposition durch Berührung mit der
Haut und durch Verschlucken. R 48/25 Giftig: Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei längerer Exposition durch Verschlucken. R 50/53 Sehr giftig für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen
haben. R 51/53 Giftig für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen haben. R 52/53 Schädlich für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen
haben. R 68/20 Gesundheitsschädlich: Möglichkeit irreversiblen Schadens durch Einatmen. R 68/20/21 Gesundheitsschädlich: Möglichkeit irreversiblen Schadens durch Einatmen und bei Berührung
mit der Haut. R 68/20/21/22 Gesundheitsschädlich: Möglichkeit irreversiblen Schadens durch Einatmen, Berührung mit der
Haut und durch Verschlucken. R 68/20/22 Gesundheitsschädlich: Möglichkeit irreversiblen Schadens durch Einatmen und durch
Verschlucken. R 68/21 Gesundheitsschädlich: Möglichkeit irreversiblen Schadens bei Berührung mit der Haut. R 68/21/22 Gesundheitsschädlich: Möglichkeit irreversiblen Schadens bei Berührung mit der Haut und
durch Verschlucken. R 68/22 Gesundheitsschädlich: Möglichkeit irreversiblen Schadens durch Verschlucken.
8.3.4 Sicherheitsratschläge
S 1 Unter Verschluss aufbewahren. S 2 Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen. S 3 Kühl aufbewahren. S 4 Von Wohnplätzen fernhalten. S 5 Unter ... aufbewahren (geeignete Flüssigkeit vom Hersteller anzugeben).
8 Anhang
111
S 5.1 Unter Wasser aufbewahren. S 5.2 Unter Petroleum aufbewahren. S 5.3 Unter Paraffinöl aufbewahren. S 6 Unter ... aufbewahren (inertes Gas vom Hersteller anzugeben). S 6.1 Unter Stickstoff aufbewahren. S 6.2 Unter Argon aufbewahren. S 6.3 Unter Schutzgas aufbewahren. S 7 Behälter dicht verschlossen halten. S 8 Behälter trocken halten. S 9 Behälter an einem gut gelüfteten Ort aufbewahren. S 12 Behälter nicht gasdicht verschließen. S 13 Von Nahrungsmitteln, Getränken und Futtermitteln fernhalten. S 14 Von ... fernhalten (inkompatible Substanzen vom Hersteller anzugeben). S 14.1 Von Reduktionsmitteln, Schwermetallverbindungen, Säuren und Alkalien fernhalten. S 14.10 Von Säuren, Reduktionsmitteln und brennbaren Materialien fernhalten. S 14.11 Von brennbaren Stoffen fernhalten. S 14.12 Von Alkalien und basischen Substanzen fernhalten. S 14.2 Von oxidierenden und sauren Stoffen sowie von Schwermetallverbindungen fernhalten. S 14.3 Von Eisen fernhalten. S 14.4 Von Wasser und Laugen fernhalten. S 14.5 Von Säuren fernhalten. S 14.6 Von Laugen fernhalten. S 14.7 Von Metallen fernhalten. S 14.8 Von oxidierenden und sauren Stoffen fernhalten. S 14.9 Von brennbaren organischen Substanzen fernhalten. S 15 Vor Hitze schützen. S 16 Von Zündquellen fernhalten - Nicht rauchen. S 17 Von brennbaren Stoffen fernhalten. S 18 Behälter mit Vorsicht öffnen und handhaben. S 20 Bei der Arbeit nicht essen und trinken. S 21 Bei der Arbeit nicht rauchen. S 22 Staub nicht einatmen. S 23 Gas/Rauch/Dampf/Aerosol nicht einatmen (Bezeichnung ist vom Hersteller anzugeben). S 23.1 Gas nicht einatmen. S 23.2 Dampf nicht einatmen. S 23.3 Aerosol nicht einatmen. S 23.4 Rauch nicht einatmen. S 23.5 Dampf/Aerosol nicht einatmen. S 24 Berührung mit der Haut vermeiden. S 25 Berührung mit den Augen vermeiden. S 26 Bei Berührung mit den Augen sofort gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren. S 27 Beschmutzte, getränkte Kleidung sofort ausziehen. S 28 Bei Berührung mit der Haut sofort abwaschen mit viel ... (vom Hersteller anzugeben). S 28.1 Bei Berührung mit der Haut sofort abwaschen mit viel Wasser. S 28.2 Bei Berührung mit der Haut sofort abwaschen mit viel Wasser und Seife. S 28.3 Bei Berührung mit der Haut sofort abwaschen mit viel Wasser und Seife, möglichst auch mit
Polyethylenglycol 400. S 28.4 Bei Berührung mit der Haut sofort abwaschen mit viel Polyethylenglykol 300 und Ethanol
(2:1) und anschließend mit viel Wasser und Seife. S 28.5 Bei Berührung mit der Haut sofort abwaschen mit viel Polyethylenglykol 400. S 28.6 Bei Berührung mit der Haut sofort abwaschen mit viel Polyethylenglykol 400 und
anschließend Reinigung mit viel Wasser. S 28.7 Bei Berührung mit der Haut sofort abwaschen mit viel Wasser und saurer Seife. S 29 Nicht in die Kanalisation gelangen lassen. S 30 Niemals Wasser hinzugießen. S 33 Maßnahmen gegen elektrostatische Aufladungen treffen. S 35 Abfälle und Behälter müssen in gesicherter Weise beseitigt werden. S 36 Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung tragen. S 37 Geeignete Schutzhandschuhe tragen. S 38 Bei unzureichender Belüftung Atemschutzgerät anlegen. S 39 Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. S 40 Fußboden und verunreinigte Gegenstände mit ... reinigen (vom Hersteller anzugeben).
8 Anhang
112
S 40.1 Fußboden und verunreinigte Gegenstände mit viel Wasser reinigen. S 41 Explosions- und Brandgase nicht einatmen. S 42 Beim Räuchern/Versprühen geeignetes Atemschutzgerät anlegen (Bezeichnung vom Hersteller
anzugeben). S 43 Bei einem Feuer ... verwenden (die genaue Art der Brandbekämpfungsausrüstung angeben)
Unter keinen Umständen Wasser verwenden. S 43.1 Zum Löschen Wasser verwenden. S 43.2 Zum Löschen Wasser oder Pulverlöschmittel verwenden. S 43.3 Zum Löschen Pulverlöschmittel verwenden - kein Wasser verwenden. S 43.4 Zum Löschen Kohlendioxid - kein Wasser verwenden. S 43.6 Zum Löschen Sand - kein Wasser verwenden. S 43.7 Zum Löschen Metallbrandpulver - kein Wasser verwenden. S 43.8 Zum Löschen Sand, Kohlendioxid oder Pulverlöschmittel verwenden - kein Wasser
verwenden. S 45 Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen (wenn möglich, dieses Etikett vorzeigen). S 46 Bei Verschlucken sofort ärztlichen Rat einholen und Verpackung oder Etikett vorzeigen. S 47
Bei einer Temperatur von maximal ... °C aufbewahren (vom Hersteller anzugeben). S 47.1 Nicht bei Temperaturen über 25°C aufbewahren.
S 48 Feucht halten mit ... (vom Hersteller anzugeben). S 48.1 Feucht halten mit Wasser. S 49 Nur im Originalbehälter aufbewahren. S 50 Nicht mischen mit ... (vom Hersteller anzugeben). S 50.1 Nicht mischen mit Säuren. S 50.2 Nicht mischen mit Laugen. S 50.3 Nicht mischen mit starken Säuren, starken Basen, Buntmetallen und deren Salzen. S 51 Nur in gut gelüfteten Bereichen verwenden. S 52 Nicht großflächig für Wohn- und Aufenthaltsräume zu verwenden. S 53 Exposition vermeiden - vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen. S 56 Dieses Produkt und seinen Behälter der Problemabfallentsorgung zuführen. S 57 Zur Vermeidung einer Kontamination der Umwelt geeigneten Behälter verwenden. S 59 Informationen zur Wiederverwendung/Wiederverwertung beim Hersteller/Lieferanten
erfragen. S 60 Dieser Stoff und/oder sein Behälter sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen. S 61 Freisetzung in die Umwelt vermeiden. Besondere Anweisungen einholen/Sicherheitsdatenblatt
zu Rate ziehen. S 62 Bei Verschlucken kein Erbrechen herbeiführen. Sofort ärztlichen Rat einholen und Verpackung
oder dieses Etikett vorzeigen. S 63 Bei Unfall durch Einatmen: Verunfallten an die frische Luft bringen und ruhigstellen. S 64 Bei Verschlucken Mund mit Wasser ausspülen (nur wenn Verunfallter bei Bewusstsein ist).
8.3.5 Kombination der S-Sätze
S 1/2 Unter Verschluss aufbewahren. S 3/7 Behälter dicht geschlossen halten und an einem kühlen Ort aufbewahren. S 3/9/14 An einem kühlen, gut gelüfteten Ort, entfernt von ... aufbewahren (inkompatible Substanzen
sind vom Hersteller anzugeben). S 3/9/14.1 An einem kühlen, gut gelüfteten Ort, entfernt von Reduktionsmitteln,
Schwermetallverbindungen, Säuren und Alkalien aufbewahren. S 3/9/14.1/49 Nur im Originalbehälter an einem kühlen, gut gelüfteten Ort, entfernt von Reduktionsmitteln,
Schwermetallverbindungen, Säuren und Alkalien aufbewahren. S 3/9/14.2 An einem kühlen, gut gelüfteten Ort, entfernt von oxidierenden und sauren Stoffen sowie von
Schwermetallverbindungen aufbewahren. S 3/9/14.2/49 Nur im Originalbehälter an einem kühlen, gut gelüfteten Ort, entfernt von oxidierenden und
sauren Stoffen sowie Schwermetallverbindungen aufbewahren. S 3/9/14.3 An einem kühlen, gut gelüfteten Ort, entfernt von Eisen aufbewahren. S 3/9/14.3/49 Nur im Originalbehälter an einem kühlen, gut gelüfteten Ort, entfernt von Eisen aufbewahren S 3/9/14.4 An einem kühlen, gut gelüfteten Ort, entfernt von Wasser und Laugen aufbewahren. S 3/9/14.4/49 Nur im Originalbehälter an einem kühlen, gut gelüfteten Ort, entfernt von Wasser und Laugen
aufbewahren. S 3/9/14.5 An einem kühlen, gut gelüfteten Ort, entfernt von Säuren aufbewahren.
8 Anhang
113
S 3/9/14.5/49 Nur im Originalbehälter an einem kühlen, gut gelüfteten Ort, entfernt von Säuren aufbewahren. S 3/9/14.6 An einem kühlen, gut gelüfteten Ort, entfernt von Laugen aufbewahren. S 3/9/14.6/49 Nur im Originalbehälter an einem kühlen, gut gelüfteten Ort, entfernt von Laugen
aufbewahren. S 3/9/14.7 An einem kühlen, gut gelüfteten Ort, entfernt von Metallen aufbewahren. S 3/9/14.7/49 Nur im Originalbehälter an einem kühlen, gut gelüfteten Ort, entfernt von Metallen
aufbewahren. S 3/9/14.8 An einem kühlen, gut gelüfteten Ort, entfernt von oxidierenden und sauren Stoffen
aufbewahren. S 3/9/14.8/49 Nur im Originalbehälter an einem kühlen, gut gelüfteten Ort, entfernt von oxidierenden und
sauren Stoffen aufbewahren. S 3/9/14/49 Nur im Originalbehälter an einem kühlen, gut gelüfteten Ort, entfernt von° ... aufbewahren
(inkompatible Substanzen sind vom Hersteller anzugeben). S 3/9/49 Nur im Originalbehälter an einem kühlen, gut gelüfteten Ort aufbewahren. S 3/14 An einem kühlen, von ... entfernten Ort aufbewahren (inkompatible Substanzen sind vom
Hersteller anzugeben). S 3/14.1 An einem kühlen, von Reduktionsmitteln, Schwermetallverbindungen, Säuren und Alkalien
entfernten Ort aufbewahren. S 3/14.2 An einem kühlen, von oxidierenden und sauren Stoffen sowie von Schwermetallverbindungen
entfernten Ort aufbewahren. S 3/14.3 An einem kühlen, von Eisen entfernten Ort aufbewahren. S 3/14.4 An einem kühlen, von Wasser und Laugen entfernten Ort aufbewahren. S 3/14.5 An einem kühlen, von Säuren entfernten Ort aufbewahren. S 3/14.6 An einem kühlen, von Laugen entfernten Ort aufbewahren. S 3/14.7 An einem kühlen, von Metallen entfernten Ort aufbewahren. S 3/14.8 An einem kühlen, von oxidierenden und sauren Stoffen entfernten Ort aufbewahren. S 7/8
Behälter trocken und dicht geschlossen halten. S 7/9 Behälter dicht geschlossen an einem gut gelüfteten Ort aufbewahren. S 7/47 Behälter dicht geschlossen und nicht bei Temperaturen über ... °C aufbewahren (vom
Hersteller anzugeben). S 20/21 Bei der Arbeit nicht essen, trinken, rauchen. S 24/25 Berührung mit den Augen und der Haut vermeiden. S 27/28 Bei Berührung mit der Haut beschmutzte, getränkte Kleidung sofort ausziehen und Haut sofort
abwaschen mit viel ..... (vom Hersteller anzugeben). S 29/35 Nicht in die Kanalisation gelangen lassen; Abfälle und Behälter müssen in gesicherter Weise
beseitigt werden. S 29/56 Nicht in die Kanalisation gelangen lassen und diesen Stoff und seinen Behälter der
Problemabfallentsorgung zuführen. S 36/37 Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung tragen. S 36/37/39 Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz
tragen. S 36/39 Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. S 37/39 Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. S 47/49 Nur im Originalbehälter bei einer Temperatur von nicht über ... °C aufbewahren (vom
Hersteller anzugeben).
8 Anhang
114
8.4 Danksagungen
Zunächst danke ich Herrn Prof. Dr. Horst Weller für die Aufnahme in den Arbeitskreis, die
gute Betreuung während der Doktorarbeit sowie die große Freiheit für das Einbringen eigener
Ideen in das Forschungsthema.
Herrn Prof. Dr. Stephan Förster danke ich für die Übernahme der Aufgabe des
Zweitgutachters.
Frau Prof. Dr. Dr. Ulrike Beisiegel und PD Dr. Jörg Heeren danke ich für die gemeinsamen
Projekte sowie die Bereitstellung zahlreicher Gerätschaften und Materialien in ihrer
Arbeitsgruppe.
Herrn Prof. Dr. Gerhard Adam und Dr. Heinrich Hohenberg danke ich für die Kooperation.
Die Anfertigung meiner Doktorarbeit wäre ohne folgende Personen nicht möglich gewesen
und ihnen gilt mein besonderer Dank:
Dr. Oliver Bruns für die freundschaftliche und erfolgreiche Kooperation.
Michael Kaul für die Zusammenarbeit und den gegenseitigen fachlichen Austausch
sowie die Messungen am MRT.
Elmar Pöselt für die Kooperation bezüglich der Triblockcopolymere.
Dr. Tobias Vossmeyer für viele fruchtbare Dikussionen und Anregungen zu meinem
Thema.
Andreas Kornowski, Almut Barck und Sylvia Bartholdi-Nawrath für die Messungen
am TEM und XRD.
Meinen Forschungs- und Schwerpunktpraktikanten (Robert, Reentje, Emine, Kathrin,
Sunhild, Christoph) für ihre Hilfe.
Dr. Tatjana Achenbach und Dr. Andrea Salcher für die Durchführung der Tox-Tests
im CAN.
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Dem AK Weller danke ich für die gute Atmosphäre und viele heitere Stunden außerhalb der
täglichen Arbeit. Meiner Kollegin und Kommilitonin Andjana Panicker danke ich für die
freundschaftliche Atmosphäre in unserem gemeinsamen Büro.
Ich danke meiner Freundin Sabine und meinen Eltern für die große Unterstützung und das
Vertrauen in meine Fähigkeiten.
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8.5 Lebenslauf
Persönliche Daten
Name: Ulrich Ingmar Tromsdorf
Adresse: Suhrenkamp 20 22335 Hamburg
Geburtsdatum: 04.05.1981 in Hamburg
Telefon: 040/48400655
E-Mail: [email protected]
Familienstand: ledig
Nationalität: deutsch
Religion: evangelisch-lutherisch
Ausbildung
08.1987-07.1991 Grundschule Müssenredder
08.1991-07.2000 Gymnasium Harksheider Straße Abschluss: Abitur 09.2000-07.2001 Zivildienst in der häuslichen Alten- und Krankenpflege in Hamburg
10.2001-07.2003 Grundstudium der Chemie an der Universität Hamburg Abschluss: Vordiplom
08.2003-02.2006 Hauptstudium der Chemie an der Universität Hamburg 03.2006-09.2006 Diplomarbeit am Institut für Physikalische Chemie der Universität
Hamburg in der Gruppe von Prof. Dr. Weller zum Thema „Untersuchungen an superparamagnetischen Manganferrit-Nanopartikeln im Hinblick auf ihre Eignung als Kontrastmittel in der Magnetresonanztomographie“
20.09.2006 Abschluss: Diplom 10.2006-09.2009 Promotion im Institut für Physikalische Chemie der Universität
Hamburg in der Gruppe von Prof. Dr. Weller zum Thema „Superparamagnetische Ferrit-Nanopartikel als Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie“
Ehrungen und Preise
07.2007 Auszeichnung des Diploms als bestes Diplom des Departments Chemie
im Jahr 2006 durch den Freundes- und Förderverein Chemie der Universität Hamburg
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Publikationen in Fachzeitschriften und Jahresberichten
U.I. Tromsdorf, N.C. Bigall, M.G. Kaul, O.T. Bruns, M.S. Nikolic, B. Mollwitz, R.A. Sperling, R. Reimer, H. Hohenberg, W.J. Parak, S. Förster, U. Beisiegel, G. Adam, H. Weller Nano Letters 2007, 7, 2422-2427. S. Fischer, A. Frömsdorf, S.S. Funari, U. Tromsdorf, H. Weller, S. Förster HASYLAB Annual Report I 2007, 583. S. Fischer, A. Frömsdorf, S.S. Funari, U. Tromsdorf, H. Weller, S. Förster HASYLAB Annual Report I 2007, 769. O.T. Bruns, H. Ittrich, K. Peldschus, M.G. Kaul, U.I. Tromsdorf, J. Lauterwasser, M.S. Nikolic, B. Mollwitz, M. Merkel, N.C. Bigall, S. Sapra, R. Reimer, H. Hohenberg, H. Weller, A. Eychmüller, G. Adam, U. Beisiegel, J. Heeren Nature Nanotechnology 2009, 4, 193-201. U.I. Tromsdorf, O.T. Bruns, S.C. Salmen, U. Beisiegel, H. Weller Nano Letters 2009, 9, 4434-4440. U.I. Tromsdorf, E.Pöselt, C. Hahn, H. Weller, An optimized iron oxide based negative MR contrast agent for T2 weighting spin echo imaging, Manuskript in Vorbereitung.
Buchbeiträge
G. Krylova, M.I. Bodnarchuk, U.I. Tromsdorf, E.V. Shevchenko, D.V. Talapin, H. Weller Synthesis, properties and applications of magnetic nanoparticles (in: Nanoparticles – From Theory to Application, Editor: G. Schmid, 2. ed., 2009).
Vorträge auf Kongressen
MnFe2O4 nanocrystals for MRI: The influence of particle size and coating on contrast enhancement, 15. Mai 2007, 27. Blankenese Konferenz, Hamburg Superparamagnetic Ferrite nanoparticles: Potential applications for T1 and T2 weighted imaging, 2. Mai 2008, Bunsentagung 2008, Saarbrücken Superparamagnetic Nanoparticles for MRI: Optimized Contrast Agents for T1 and T2 weighted imaging, 29. Januar 2010, GKSS Workshop, Geesthacht
Patente
U.I. Tromsdorf, O.T. Bruns, H. Weller, Metal Oxide Particles Coated with Polyethylene Glycol And Their Synthesis, submitted to the UK Intelectual Property Office, 0913803.3
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8.6 Erklärung
Hiermit versichere ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig verfasst und
alle verwendeten Quellen und Hilfsmittel als solche gekennzeichnet habe.
Diese Arbeit ist zuvor in gleicher oder ähnlicher Form keiner anderen Prüfungsbehörde zur
Erlangung des Doktorgrades vorgelegt worden.
Hamburg, den 22.12.2009
Ulrich Tromsdorf