dna- rekombinationstechnik...
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1
DNA- Rekombinationstechnik
Gentechnik
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2
Verwendung von Plasmiden in der Gentechnik
Campbell 19.1
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3
Transformation
(Plasmid)
Die wichtigsten Schritte bei der DNA-Klonierung
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4
Durch Klonierung kann man DNA-Fragmente in reiner Form isolieren
Vektoren
DNA-Fragmente
Konstruktion rekombinanter Moleküle
Jede Kolonie enthält zahlreiche Kopien eineseinzigen rekombinantenDNA-Moleküls
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Das Handwerkszeug der Molekularbiologen
•Restriktionsenzyme (Restriktionsendonukleasen)•Ligasen•DNA-Vektoren (leiten sich von Plasmiden ab)•Wirtsorganismen
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6
Restriktionsendonukleasen: Enzyme, die DNA schneiden
Bakterien bekämpfen eindringende Viren (Fremd-DNA)mit Restriktionsendonukleasen
Purves et al. 16.1
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7
Restriktionsendonukleasen erkennen bestimmte Abfolgen von Sequenzen auf der DNA-> Restriktionsschnittstellen
Enzym EcoRI (aus Escherichia coli Stamm R)
erkennt
5‘-GAATTC-3‘3‘-CTTAAG-5‘
Diese Sequenz ist ein Palindrom:
z. B. Otto oder Anna Wörter, die von vorn und hinten gelesen gleich lauten
und schneidet versetzt5‘-G3‘-CTTAA
AATTC-3‘G-5‘
Janning & Knust 19.2b
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8
5‘-G3‘-CTTAA
AATTC-3‘G-5‘
EcoRI erzeugt kohäsive (klebrige, engl. sticky) Enden
Die kurzen einzelsträngigen Enden sind komplementär
PvuI aus (Proteus vulgaris) erzeugt glatte (engl. blunt) Enden
5‘-CGATCG-3‘3‘-GCTAGC-5‘
5‘-CGA TCG-3‘3‘-GTC AGC-5‘
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9Janning & Knust 19.2
Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme
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Die gleichen klebrigen Enden erzeugt von verschiedenen Restriktionsendonukleasen
Die Enden sind kompatibel !
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Auftrennung der DNA durch Gelelektrophorese
Sichtbarmachen der DNA Fragmente durchEthidiumbromid und UV-Licht
kürzere Fragmentewandern schneller alslängere
DNA negativ geladenwandert zum positiven Pol
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Die Erkennungssequenz von EcoRI GAATTC kommt statistischin einem prokaryotischen Genomca. alle 4000 Bp vor
Ein prokaryotisches Genom von 4.000.000 bp (4 Mbp) würde inca. 1000 Fragmente zerlegt werden
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14Purves et al. 16.4
Analyse von DNA Fragmenten durch den Southern-BlotDenaturierung inEinzelstränge
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stabile Hybride erlauben die Detektionkomplementärer Sequenzen
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Autoradigram
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RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
ForensikGenetischer Fingerabdruck
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18
Zerschneiden und Verknüpfen von DNA Molekülen
Purves et al. 16.4
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Ligasen verknüpfen DNA Moleküle(DNA Replikation)
in der Gentechnologie T4 DNA-Ligase: Cofaktor ATP
aus dem Phagen T4glatte Enden + überhängende Enden : sehr ineffektiv
glatte Enden + glatte Enden : annehmbare Ausbeuten
zwei passende überhängende Enden: sehr effektiv
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allgemeine Eigenschaften von Vektoren
- Befähigung zur autonomen Replikation (ori)
- relativ geringe Größe (< 10 kb) mit singulären Schnittstellen (Polylinker) in nicht essentiellen Bereichen
- hohe Kopienzahl
- selektionierbarer Marker (Antibiotika Resistenz)
Multiple Klonierungssetlle (Polylinker)
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Antibiotika
Stoffe die Mikroorganismen am Wachstum hindern (bakteriostatisch) oder abtöten (bakteriocid); z. Zt. mehr als 7000 bekannt
wichtige Klassen:
Penicilline (aus Pilzen): Hemmung der bakteriellen Zellwandsynthese (z.B. Ampicillin)
Streptomycin, Chloramphenicol, Tetracyclin (aus Bakterien) Hemmung der Proteinsynthese
Resistenzgene wirken verschiedenartig: z.B.
amp (β-Lactamase): Spaltung des Penicillin-Ringes
CAT (Chloramphenicol-Acetyl-Transferase)
tet: Hemmung der Aufnahme von Tetracyclin in Bakterien
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Klonierung mit pBR322
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Plasmide mit dem lacZ‘ Gen
Plasmid University of California
α
α-Kompementation
PlasmidBakterielles DNA-Molekül
α-Fragment Rest der β-Galaktosidase
aktive β-Galaktosidase
lacZ mit Deletion
(inaktiv)(inaktiv)
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Blau-Weiß-Selektion in E. coli
Protein Synthese
DNA wird in multipleKlonierungsstellekloniert
Protein Synthese
β−Galaktosidase aktiv
β−Galaktosidase inaktiv
lacZ Gen mit Deletion
α-Fragmentkomplett
α-Fragmentdefekt
ΔM15
AS11-41 fehlenAS1-146
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H2O
ß1->4
Künstlicher InduktorKünstliches Substrat
Indigo-Farbstoff
lacZ
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26
Blau-Weiß-Selektion in E. coli
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27
Klonierung eines menschlichen Gens in ein bakterielles Plasmid
Campbell19.3
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28
Wie findet man ein bestimmtes Gen?
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29
Herstellung einer Gen-Bibliothek
Menschliches Genom3 200 000 000 bp3 200 Mbp
Plasmide können ca. 10 000 bpFremder DNA aufnehmen
mindestens 320.000 Klone!Tatsächlich > 500.000
Purves et al. 16.7
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30
Problem: Introns
•Eukaryotsiche Gene sind sehr groß und durch Introns unterbrochen
•Prokaryotische Organismen haben keine Introns, können eukaryotsiche Gene nicht exprimieren
Lösung: cDNA = komplementäre DNA
Campbell 19.5
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31
Poly(A)Schwanz
Isolierung vonmRNA durch Oligo(dT) Zellulose
Reverse Transkription der poly(A)mRNAdurch Reverse Transkriptase
Janning & Knust 19.8Purves et al. 16.8
mRNA
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32
Identifizierung des Klons,der das gewünschte Gen trägtmit einer Koloniefilter-Hybridisierung
Campbell 19.6
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33
Sequenzierung: Kettenabbruchverfahren nach Sanger
Autoradiogramm
Janning & Knust 19.16
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34
Automatische DNA-Sequenzierung
4 Reaktionen mit Fluoreszenz-Markierung
Janning & Knust 19.16, verändert
4 Spuren auf dem Gel
Fluoreszenz-Markierung
Jeder Base ist ein Farbe zugeordnet
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35
Die Polymerasekettenreaktion PCR: (engl. polymerase chain reaction)Jedes beliebige Molekül kann in vitro amplifiziert werden
Purves et al. 11.120
ca. 50 °C 72°C
94°C
94°C
94°C
72°C
ca. 50 °C
ca. 50 °C
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36
Jeder PCR-Zyklus hat 3 Schritte:
Denatureierung der DNA (94°C)Hybridisierung der Primer (annealing 45-65°C)Synthese der neuen DNA-Stränge durch Taq-Polymerase (72°C)
Exponentieller Vorgang
1 Molekül DNA nach Zyklus 1: 2 Molekülenach Zyklus 2: 4nach Zyklus 3: 8nach Zyklus 4: 16nach Zyklus 5: 32nach Zyklus 6: 64nach Zyklus 7: 128nach Zyklus 8: 256nach Zyklus 9: 512nach Zyklus 10: 1024
Nach Zyklus 20:524288
Taq-Polymerase aus Thermus aquaticusaus heißen Quellen des Yellowstone-National-Park USA
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37
Ein Expressionsvektor ermöglicht die Expression eines fremden Gens in E. coli
Purves et al 16.13
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Medizinisch wirksame Produkte in der Biotechnologie
Löst nach Herzinfarkten und Schlaganfällen Blutgerinnsel auf
Gewebeplasminogen-aktivator
Für Menschen mit DiabetesInsulin
Ersetzt das Hormon bei Menschen mit geringem Wuchs
Wachstumshormon
Ersetzt den fehlenden Blutgerinnungsfaktor bei Patienten mit Hämophilie A
Faktor VIII
AnwendungProdukt
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39Purves et al.16.14
Synthese des TPA-Proteins(Gewebeplasminogenaktivator)in E. colizur Behandlung von Schlaganfallpatienten
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40
Hey, this bug makes wine, beer and bread! Why work with anything else?
Saccharomyces cerevisiae
(Bäckerhefe)
Sprossung
Synthese von Proteinen in der Bäckerhefe
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Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe)
Wichtigster „domestizierter“ Pilz (>6000 Jahre bekannt)Wein-, Back- oder BrauhefeSetzen in Abwesenheit von Sauerstoff Zucker zu Alkohohl (Ethanol) und CO2 um
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Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe)
Wichtigster „domestizierter“ Pilz (>6000 Jahre bekannt)Wein-, Back- oder BrauhefeEinzelliger Eukaryot -> eukaryotische Genexpression!Kurze Generationszeit (ca. 2h) Kann sowohl als Haplont als auch als Diplont existieren
Vorteile
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Klonierung von Hefegenen durch Komplementation von E. coli -Mutanten
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Integrierendes Hefeplasmid
YIp
Selektierbarer Hefemarker (z.B. LEU2)
klonierte Region von Interesse
Selektierbarerbakterieller Marker(z. B. AmpR)
BakteriellerReplikationsursprung(„origin of replication“)
Yeast integrating plasmid
Kopiezahl: 1 bis wenige,nicht autonom replizierbar
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Gezielter Einbau von DNA mit Hilfe homologer Rekombination
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Gen-Austausch durch homologe Rekombination
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Das 2μm-Plasmid von S. cerevisiae
in fast allen S. cerevisiae Stämmen (im Kern)(cir+-Stämme, cir0-Stämme)biologische Funktion unbekannt6318 bp = 2 μm50-100 Kopien, 2-3 % der Gesamt-DNA4 ORFs
Replikationsursprung
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Hefeplasmid
klonierte Region von Interessez.B. Gen des Menschen
Selektierbarerbakterieller Marker(z. B. AmpR)
Selektierbarer Hefemarker (z.B. LEU2)
2μm Plasmid DNAoder Replikationsursprungdes 2μm Plasmids
ReplikationsursprungS. cerevisiae
BakteriellerReplikationsursprung(„origin of replication“)
Kopiezahl: ca. 50 („multicopy“),autonom replizierbar
Schaukel-Vektor („Shuttle-Vector“) Vektor, der in verschiedenen Wirtssystemen vermehrt werden kann
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künstliches Hefechromosome (YAC)
YAC (Yeast artificial Chromosome )
Telomer TelomerSlektionsmarke
S.cKlonierte RegionCentromerARSSelektion
E.c
Kopiezahl: 1,autonom replizierbarKlonierung großer DNA Fragmente
Aufnahme von 50 kb bis zu 1000 kbReplikationsursprung
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Arabidopsis thaliana = Ackerschmalwand
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Protoplasten-Transformation
PEG; Ca2+ + DNA
Regeneration
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Erzeugung transgener Pflanzen mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens
Wurzelhalsgalle
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Prinzip des Gentransfers von Agrobakterienin Pflanzenzellen
Seyffert Abb D-9
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Erzeugung transgener Pflanzen mit Hilfe des Ti-Plasmids
Janning & Knust 2004; 20.6
Ti-Plasmid
T-DNA (23 kb)
Ti (Tumor induzeirendes) PlasmidT (transferred) DNA
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Druckkammer
Träger für Partikel
AuffanggitterDNA-beschichtetePartikel
Petrischale mit Pflanze
Biolistische Transformation von Pflanzen
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Transgener Goldreis enthält einen hohen Anteil an β−Carotin
Einbringung von drei artfremden Genen:zwei Gene der Osterglocke und eins von aus dem Bakterium Erwinia uredovora.Durch diese Veränderung kommt es zur Bildung von ß-Carotin (Provitamin A) im Endosperm der Reiskörner, die deshalb (gold-)gelb / orange gefärbt sind. Wird der Reis in Verbindung mit Fetten verspeist kann das Provitamin aufgenommen werden und wird dann im Körper zu Vitamin A umgewandelt.
Warum?Mittel gegen Vitamin A-Mangel(in Entwicklungsländern Asiens häufig Ursache für Erblindung)
Goldreis
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Viel Erfolg im weiteren Studium!!