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DNA - Sequenzierstrategien
Von Theresa Köhler
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Was ist Sequenzieren?
Bestimmen der Basensequenz eines DNA - oder RNA -Strangs
Schlussfolgerung auf Aminosäuresequenz in einem Protein
Identifikation von Genen und kleinsten Veränderungen im Genom
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Wozu braucht man Strategien?
Genome sind zu groß, um in einem einzigen Schritt sequenziert werden zu können
eine Sequenzierungsreaktion (‚read'): ca. 600 Nukleotide
Genomgrößen:– Escherichia coli: 4,64 Mb– Saccharomyces cerevisiae: 12,1 Mb– Arabidopsis thaliana: 125 Mb– Homo sapiens: 3200 Mb– Triticum aestivum: 17000Mb
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Strategien
Shot-Gun-Methode Chromosome Walking Clone Fingerprinting Nested Deletion Delta-Restriktionsklonierung
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Shot-Gun-Methode Das Genom
wird nach Zufallsprinzip in kurze Fragmente (1,6 – 2,0 kb) zerbrochen (Restriktionsendonukleasen, Ultraschall)
Klonierung Sequenzierung Suche nach
Überlappungen
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Shot-Gun-Methode
Vorteil: – schnelle Analyse der Fragmente
Nachteile: – Ermittlung der Gesamtsequenz bedarf enormen
Computeraufwand, um anhand von Überlappungen die Gesamtsequenz zu erhalten
– Sich wiederholende Sequenzen im Genom können falsch eingeordnet werden oder völlig übergangen
– Lücken können auftreten
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Chromosome Walking Bekanntes DNA-Stück wird langsam mit Hilfe von
Hybridisierungssonden erweitert Wahl eines beliebigen Klons aus der Bibliothek Markierung Verwendung als Sonde für alle anderen Klone in
Bibliothek Suche nach Überlappungen erneute Markierung und Hybridisierung
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Chromosome Walking
Vorteile:– Position und Laufrichtung der Sequenz sind jederzeit
bekannt.– Redundanz von 2 durch die zusätzliche Anbringung
von Primern in Gegenrichtung, s.d. der komplementäre Sequenzstrang bestimmt werden kann
Nachteil: – Arbeitsaufwändig, da Sequenzdaten nur Schritt für
Schritt erhalten werden können (bis 200 kb)– Synthese eines neuen Primers für jede Reaktion
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Clone Fingerprinting
Nachweis von Sequenzelementen, die zwei Klonen gemeinsam sind
Behandlung mit Restriktionsendonukleasen Suche nach Fragmenten gleicher Größe Vorteile:
– schneller– Keine feste Ausgangsposition
Nachteile:– Hoher Arbeitsaufwand, Agarosegele nach
gleichgroßen Fragmenten zu untersuchen
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Clone Fingerprinting
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Nested Deletion
Behandlung mit Exonukleasen zur Verkürzung (Deletion)
Probenentnahme in regelmäßigen Abständen
Vorteil: – Nur ein Standard-Primer wird benötigt– Repetive Sequenzen werden nicht
übersehen
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Delta-Restriktionsklonierung Zerkleinerung des DNA - Fragment
und GelAnalyse Verkürzung des Klons durch
Kopplung mit bestimmten Enzymen
Lage der Verkürzungen weist unter Verwendung von Standardprimern auf die Sequenz hin
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Literatur
S.B.Primose – Genomanalyse T.Strachan – Das menschliche Genom T.A.Brown – Genomes 2nd Edition