1Roche Applied Science
21.09.049.00 – 12.30 Uhr
Schülerkongress GBM-Tagung in Münster
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Tagesablauf
1. Einführung 5. Elektrophorese 45 min
2. Gelvorbereitung 30 min 6. Färben der DNA im Agarose- Gel 40 min
3. Schneiden des Plasmids 45 min 7. Auswertung
4. Vorbereitung der Proben für die 8. Vorstellung weiterer Ergebnisse
Gelelektrophorese 20 min
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Pipettenbedienung
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Gelvorbereitung
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Schneiden des Plasmids
pUCD-lacZ mit BanII
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Elektrophoretische Trennung
der geschnittenen DNA
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Escherichia coli
Bewegliches StäbchenbakteriumNatürliches Habit: Intestinaltrakt von Warmblütlern (Darm)Wasserindikator für fäkale Verunreinigungen
Haustier der WissenschaftVerwendeter Stamm in Experimenten:Sicherheitsstamm K12 (JM109)
Außerhalb Labor nicht lebensfähig(bestimmte Eigenschaften fehlen)Kein genetisch veränderter Mikroorganismus(natürliches Vorkommen des lacZ-Gens)
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Weitere Bakterien
Vibrio cholerae
Leptospira ssp. Salmonella enteriditis
Desulfovibrio sp.
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Was ist DNA/DNS?
DesoxyriboNucleinSäureHelikaler Doppelstrang4 BasenAdenin, Thymin Guanin, CytosinGene: informationstragende Abschnittefür Proteinbiosynthese1 Codon aus 3 Nukleotiden entspricht1 Aminosäure
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Proteinbiosynthese:Vom Gen zum Protein
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Was sind Restriktionsenyzme?
Proteine (Eiweiße)Schneiden DNA an spezifischenErkennungssequenzen (oft Palindrome)
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Was sind Plasmide?
Schematische Karte des Plasmids pUCD-lacZAmpr: Ampicillinresistenz-GenOri: Replikationsursprung
Neben chromosomaler DNAoft zirkuläre DNA-Fragmente in Bakterien
Sicherheitsplasmide: Keine Weitergabe von Zelle zu Zelle
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Historie
1865 Mendel
1869 Miescher
1944 Entdeckung der DNA als Trägersubstanz des Erbguts (Avery)
1953 Entdeckung der doppelhelikalen Struktur der DNA (Watson und Crick)
1973 1. rekombinantes Bakterium von Boyer, Cohen und Chang
1977 Gentransfer eines humanen Gens auf ein Bakterium (Insulingen)
1982 Insulin als 1. gentechnisches Produkt auf Markt
1983 1. Gentransfer eines bakteriellen Gens auf eine Pflanze (Tabak)
1985 PCR (Mullis)
1988 Gründung von HUGO (Human Genome Project)
2000 Entschlüssung des humanen Genoms von Craig Venter
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Bedeutsamkeit
Rekombinante Proteine in therapeutischen und diagnostischen Anwendungsgebieten:
- RecHormon (Erythropoietin=blutbildendes Hormon)
-- Reteplase (tPA=Plasminogen Aktivator )
-- Insulin
-- Glucose Oxidase (Blutzuckermonitoring)
-- Teststreifen für Urin
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Analyse von DNA
Agarosegel (molekularer
Sieb):
kleinere Fragmente wandern
schneller als größere
Fragmente durch das
Agarosesieb.
Negative Ladung =>
Wanderung im
Spannungsfeld zur Anode (pos.
Pol)
Wanderungsgeschwindigkeit
linearer
doppelsträngiger DNA- Moleküle
umgekehrt proportional
zum Logarithmus ihrer Größe
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Auswertung
Vergleich mit bekanntem BandenmusterDNA- Fragmente (DNA-Molekulargewichtsstandard)
BanII schneidet 3x in Plasmid pUCD-lacZ (5669 bp)
3 Fragmente erwartetBerechnung der Größe anhand Plasmidkarte2504 bp, 2116 bp, 1049 bp
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erwartete Ergebnisse
21226
5480+4732+42683530
2027+190415841375
947831
564
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Weitere Experimente von Blue Genes (2. Teil)
Klonierung eines DNA-Fragments (= Einschleusung eines Gens in eine Bakterienzelle mit Hilfe eines Plasmids), Weitergabe an Nachkommen, 1 Klon entsteht:
1. Plasmidschneiden, Einfügen von Fragment, Ligation
2. Transformation in E.coli Sicherheitsstamm (nur 1 von 10 000 nimmt Plasmid auf), dessen lacZ-Gen defekt ist
3. Selektion über Antibiotikum Ampicillin (Plasmid enthalten)und über X-Gal (Spaltung zu blauem Farbstoff, Gen
erfolgreich eingeschleust)
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Klonierung vonDNA-Fragmenten
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Tipps und Tricks zur Versuchsplanung
Lagerungs- und Unterbrechungsmöglichkeiten:•Restriktionsansatz nach Inkubation bei 37 °C
mehrere Wochen bei – 20 °C •1x Elektrophoresepuffer mehrere Wochen bei RT •Nicht verwendetes Gel eingepackt in Folie
ca. 1 Woche im Kühlschrank•Nicht verwendetes Gel in Elektrophoresekammer
mit Puffer überschichtet 2 bis 3 Tage•Proben bereits mit Elektrophoresepuffer versetzt
mehrere Wochen bei – 20 °C•Elektrophoresekammer mit Puffer gefüllt 2 bis 3 Tage•Färbelösung in Flasche mit Alufolie verdunkelt
mehrere Woche bei RT•Gelaufenes Gel über Nacht in Wasser, ebenso gefärbtes (Achtung! Entfärbung!)