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Institut für Biophysikalische ChemieUniversität WienWien, 23.02.2011
„Kupfer - ein Spurenelement mit vielseitiger biologischer Bedeutung“ ?
AnnetteRompel
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Inhalt
Metalle in Lebensprozessen
Biologische Funktion von Kupfer
Korrespondenz von Eisen- und Kupferproteinen
Sauerstoffaktivierende Proteine
Tyrosinase
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Bioanorganische Chemie
Ein interdisziplinäres Forschungsgebiet
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Metalle in Lebensprozessen
Elemente, die für die Bioanorganische Chemie von Bedeutung sind, im Periodensystem
Natürlich vorkommende Elemente sind rot unterlegt,die als Sonden oder pharmazeutisch verwendeten grau.
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Elemente im menschlichen Körper
4550012600
700021001050
700175140105105
35
OCHNCaPSKClNaMg
SauerstoffKohlenstoffWasserstoffStickstoffCalciumPhosphorSchwefelKaliumChlorNatriumMagnesium
Masse (g)ElementsymbolElement
Durchschnittliche Werte (70 kg; nach Kieffer und Elmadfa, Leitzmann)
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Elemente im menschlichen Körper
a Nicht als essentiell bewertet. b Essentieller Charakter nicht eindeutig.
17. Jh.18961972
1931
1925
(1977)(1970)
4.22.31.41.10.80.30.20.140.110.100.080.070.030.03
FeZnSiRbFZrBrSrCuAlPbSbCdSn
EisenZinkSiliciumRubidiuma
FluorZirconiuma
Bromb
Strontiuma
KupferAluminiuma
Bleib
Antimona
Cadmiumb
Zinnb
Entdeckung als essentielles Element
Masse (g)Element-symbol
Element
Durchschnittliche Werte (70 kg; nach Kieffer und Elmadfa, Leitzmann)
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“Anorganische” Elemente
1. Strukturfunktion
2. Ladungsträger für sehr schnelle Informationsübertragung
3. Auf- und Abbau organischer Verbindungen (Lewis-Säure/Base-gestützte Katalyse unter Verwendung von Metallionen)
4. Transport und Speicherung von Elektronen für Energiehaushalt
5. Aktivierung kleiner, hochsymmetrischer Moleküle
6. “Metallorganische” Reaktivität (Cobalamin-Coenzyme)
Biologische Funktionen anorganischer Elemente
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Funktionen von Metallen in Enzymen
Magnesium Struktur; Hydrolase; IsomeraseCobalt AlkylgruppenübertragungNickel Hydrogenase; HydrolaseMangan Photosynthese; KatalaseEisen Transport und Speicherung von O2;
Elektronenübertragung;N2-Fixierung
Kupfer Oxidase; Transport von O2; Elektronenübertragung
Zink Struktur; Hydrolase
Biologische Funktion ausgewählter Metall-Ionen
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Medizinischer Aspekt
Kupfer wird in jeder Zelle präzise reguliert, da überschüssiges Kupfer im Zytoplasma toxisch ist.
Die moderne westliche Diät deckt tendentiell den Kupferbedarf nicht.
Der Kupferstatus lässt sich nur an einer Leberbiopsie zuverlässig ablesen.
Dass Kupfer Alzheimer oder andere neurodegenerative Krankheiten bewirkt, ist unbewiesen.
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Korrespondenz von Eisen- und Kupferproteinen
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Sauerstoffaktivierende Proteine
Aktive Zentren von
Hämoglobin,
Hämocyanin
undHämerythrin
Lippard/Berg, S.4
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Sauerstoffaktivierende Proteine
Hämoglobin Hämocyanin
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Catecholamin-Metabolismus
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Catecholamin-Metabolismus
Tyrosinase (Cu)
Dopa-Decarboxylase
Dopamine β-Mono-oxygenase(Cu)
Noradrenalin N-Methyl-transferase
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Spezifität Tyrosinase/Catecholoxidase
O2+
Tyrosinase oderCatecholoxidase
+ 2H2O22
O2+OH
R
+ + H2
H. S. Mason, W. B. Fowlks, E. W. Peterson, J. Am. Chem. Soc. 1955, 77, 2914
Tyrosinase
O
OR
• Im Gegensatz zu Hämocyanin zeigen Tyrosinase and Catecholoxidase enzymatische Aktivität:Cresolase-Aktivität
Catecholase-Aktivität
2H+2HOH
R OH
OH
ROH
O
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Typ 3: Dinukleare Kupferzentren
Funktion: Aufnahme und Aktivierung von SauerstoffStruktur: verbrücktes Kupfer-DimerKenndaten: ESR silent; Charakt. Absorption nach Bindung von O2:
λ = 350 nm; λ = 600 nm (ε = 20000; 1000 M-1cm-1)
N
N
N
N
CuI
N
N N
N
N
N
CuI
N
N
(His)
(His)
(His)(His)
(His) (His)
H
H
HH
HH
+ O2
- O2CuII
OCuII
O
N
N
N
N
NN
N
N
N
NN(His)
(His)
(His)
(His)
(His)
(His)
H
H
H
H
H
H
N -
-
K. A. Magnus, H. Ton-That, J. E. Carpenter, Chem. Rev. 1994, 94, 727
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Tyrosinase aus Agaricus bisporus (abTyr)
Champignons (Agaricus bisporus) als ideale Quelle für Tyrosinase: Sie enthalten das Protein in hohen Mengen, was eine Grundvoraus-
setzung für die Isolierung ausreichender Mengen ist. Sie sind eine kostengünstige Quelle und die im Handel befindlichen
Sorten des “Weißen Champignons” zeigen ein hohe Homologie. Gegenüber den bekannten-Tyrosinase-produzierenden Bakterien haben
Sie als Eukaryonten den Vorteil der besseren Vergleichbarkeit mit anderen interessanten Tyrosinasen aus Pflanzen und Tieren.
Tyrosinase E.C. 1.14.18.1.
Agaricus bisporus:Tetramer H2L2
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Motivation
Die Tyrosinase ist verantwortlich für die ungewünschteBräunungsreaktion in Obst und Gemüse, die durch Alterungoder Verletzung der Frucht stattfindet. Dies macht das Auffindeneines geeigneten Inhibitors äußerst wichtig.
Einige dermatologische Erkrankungen, wie Pigmentflecken undVertiligo, werden mit der Tyrosinase in Bezug gesetzt. Diekosmetische Industrie ist an der Depigmentation nach einemSonnenbrand interessiert.
Kürzlich wurde das Enzym Tyrosinase in Zusammenhang mitder Parkinson-Erkrankung und anderen neurodegenerativenErkrankungen gebracht. Die Erforschung dieser ist vonäußerster Wichtigkeit.
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Vorbereitung
Zuchtchampignon
Gefriertrocknung (Lyophile)
Zu feinem Pulver zermahlen
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Inhalt
+ PEG
Phasen-separatio
n(NH4)2SO4-
Fällung+ Triton X-114
Protein-Lösg. (latent)
Phasense-paration
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Proteinreinigung: Übersicht
Reinigung mittels FPLC (Äkta Purifier)
Folgende Säulen wurden verwendet:
RRRR
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Proteinreinigung: IEX (Q-Sepharose)
0 100 200 300 400 500 6000
100
200
300
400
500
Absorption 280 nm [mAU] Cresolase-Aktivität [U/ml] Leitfähigkeit (f=0,5) [mS/cm] Gradient [% Puffer B]
Volumen [ml]
Abso
rptio
n [m
AU]
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
Gra
dien
t [%
], σ
[mS/
cm] (
*f)
Aktiv
ität [
U/m
l]
0102030405060708090100
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Aktivitätstest
O2+
Tyrosinase oderCatecholoxidase
+ 2H2O22O
OR
OH
ROH
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CHARAKTERISIERUNG: SEC (Size-Exclusion-Chromatography)
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CHARAKTERISIERUNG: SEC (Size-Exclusion-Chromatography)
Protein Elution [mL]CA 16,25 0,53OA 15,09 0,46AB 13,90 0,38AD 12,87 0,32$A 11,99 0,26AH 10,58 0,17TB 7,99 0,01
Kav
ve = Elutionsvolumen der Substanzvc = Gesamtvolumen der Säulev0 = Totvolumen
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CHARAKTERISIERUNG: SEC (Size-Exclusion-Chromatography)
ve = Elutionsvolumen der Substanzvc = Gesamtvolumen der Säulev0 = Totvolumen
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CHARAKTERISIERUNG: SEC (Size-Exclusion-Chromatography
Iso1 Iso2
Elutionsvolumen 13,23 mL 13,18 mL
Die erhaltene Geradengleichung umformen und Messwerte des Proteins einsetzen =>
Iso-Form 1: 110 kDa113 kDaIso-Form 2:
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SDS PAGE
abTyr Marker
94.0
43.0
30.0
20.1
14.4
~92~76~72~60
~46
~16~15
~4867.0
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UV/Vis Spektrum von abTyr
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UV/Vis Spektrum von abTyr + H2O2
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Katalase Aktivität von abTyr
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Aureusidinsynthase
• Synthese einer anderen Klasse von pflanzlichen Pigmenten, den Auronen beteiligt
• Flavonoiden• Chalkone• 39kDa
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Aureusidinsynthase
OH
OH
OH
H
HO
OH O OHO
OH O
OH
OH
OHO
OH O
OH
OHOH
+ H2O
+ H2O2´,3,4,4´,6´-Pentahydroxychalkon
Bracteatin
Aureusidin
Aureusidinsynthase
½ O2
O2
Literatur: T. Nakayama, K. Yonekura-Sakakibara, T. Sato, S. Kikuchi, Y. Fukui, M. Fukuchi-Mizutani, T. Ueda, M. Nakao, Y. Tanaka, T. Kusumi, T. Nishino; Science 2000, 290, 1163-1166
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Inhalt
Metalle in Lebensprozessen
Biologische Funktion von Kupfer
Korrespondenz on Eisen- und Kupferproteinen
Sauerstoffaktivierende Proteine
Tyrosinase
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Danksagung
Dr. Klaudia Büldt-KarentzopoulosDr. Thorsten BartuselDipl.-Chem. Christian MolitorMag. Stephan Mauracher
CNRS-DFG bilaterales Projekt: