Aus der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie
der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. S. G. Gatermann
Untersuchung einer MALDI-TOF MS-basierten
Speziesidentifizierung von Koagulase-negativen
Staphylokokken im Vergleich zu molekularen
Referenzmethoden und Entwicklung neuer Spezies-
spezifischer Score-„cutoff“-Werte
Publikationsbasierte
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
Der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Cindy Richter
Luckau
2013
Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla
Referent: PD Dr. med. Florian Szabados
Korreferent: PD Dr. med. Wolfgang Cullmann
Tag der mündlichen Prüfung: 05.06.2014
Abstract:
Cindy Richter
Untersuchung einer MALDI-TOF MS-basierten Speziesidentifizierung von Koagulase-negativen
Staphylokokken im Vergleich zu molekularen Referenzmethoden und Entwicklung Spezies-
spezifischer Score-„cutoff“-Werte
Problem: Vor einigen Jahren wurde Matrix-assisted laser desorption / ionization time of flight mass
spectrometry (MALDI-TOF MS) als Alternative zu herkömmlichen Verfahren für eine bakterielle
Spezies-Identifizierung vorgestellt. Wenige vorangegangene Publikationen beschrieben diese als
schnelle Methode für die bakterielle Identifizierung. Zu diesem Zeitpunkt gab es nur gering
publizierte Erfahrungswerte zur Identifizierungsgüte des Verfahrens im Allgemeinen. Insbesondere
die Identifizierung von Staphylokokken im Vergleich zu molekularen Referenzmethoden war bislang
noch nicht untersucht. Um dieses Ziel zu erreichen, sollte die Genauigkeit der MALDI Biotyper
Datenbank für die Identifizierung von Staphylokokken im Vergleich zu molekularen
Referenzmethoden evaluiert werden. Besonders der Score-Wert als Instrument zur Beurteilung der
Identifizierungsqualität sollte näher untersucht werden.
Methode:
Insgesamt wurden 697 in der Routinediagnostik isolierte Staphylokokken und 13 Referenzstämme
in diese Arbeit eingeschlossen. Als Referenz dienten molekulare Methoden. Die
Probenvorbereitung erfolgte mittels Ethanol/Ameisensäure-Extraktionsverfahren. Alle Isolate
wurden im Doppelansatz gemessen.
Ergebnis: Die Identifizierung auf dem Spezieslevel ergab eine Genauigkeit von 97,3% (1382/1420): 220 der
Doppelmessungen (15.49%) erreichten einen Score größer oder gleich 2,3; 968 (68,17%) zwischen
2,0 und 2,299; 194 (13,66%) kleiner als 2,0 und 30 Messungen (2,11%) generierten ein „no peaks
found“-Ergebnis. Das MALDI-TOF MS fehlidentifizierte 6 Messungen (0,42%), obwohl die zweite
der Doppelmessungen richtig identifiziert wurde. Bei der Verwendung des 20. Perzentils der Score-
Werte konnten Spezies-spezifische Score-Unterschiede festgestellt werden, sodass neue Score-
„cutoff“-Werte für die Identifizierung einzelner Spezies erarbeitet wurden.
Diskussion:
Die Staphylokokken-Identifizierung ist bei der Verwendung der MALDI Biotyper Datenbank im
Vergleich zu molekularen Referenzmethoden sehr genau. Um die Identifizierungsgüte des
Verfahrens weiter zu verbessern, wurden Spezies-spezifische Score-„cutoff“-Werte für
Staphylokokken definiert und evaluiert. Diese waren dem herkömmlichen
Identifizierungsalgorithmus in der Identifizierungsgenauigkeit, ohne vermehrt Fehlidentifizierungen
zuzulassen, überlegen.
Meiner Familie in Dankbarkeit gewidmet.
1
INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung ............................................................................................... 3
1.1 Das Genus Staphylococcus ................................................................ 3
1.1.1 Koagulase-negative Staphylokokken .................................................. 3
1.1.2 Staphylococcus saprophyticus und Staphylococcus lugdunensis ...... 4
1.1.3 Bedeutung der Speziesidentifizierung ............................................. 6
1.1.4 Herkömmliche Identifizierung Koagulase negativer Staphylokokken . 7
1.2 Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization Time-of Flight
Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) ............................................ 9
1.2.1 Identifizierung von Bakterien mittels MALDI-TOF MS ...................... 11
1.2.2 Von der Idee zur klinischen Anwendung .......................................... 12
2 Zielsetzung .......................................................................................... 15
3 Ergebnisse ........................................................................................... 16
3.1 Studie zur MALDI-TOF MS-basierten Spezies-Identifizierung von
Staphylokokken ................................................................................ 16
3.2 Studie zu Spezies-spezifischen Score-„cutoff“-Werten bei der
Identifizierung von Staphylokokken .................................................. 17
4 Diskussion ........................................................................................... 22
5 Literaturverzeichnis ............................................................................. 28
Danksagung
Lebenslauf
2
Abkürzungsverzeichnis
Aas Hämagglutinin-Autolysin-Adhäsin
ClfA Clumping-factor A
DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
ESI Elektrospray Ionisierung
Fbl Fibrinogen-bindendes Adhäsin
GP grampositiv
KoNS Koagulase-negative Staphylokokken
KoPS Koagulase-positive Staphylokokken
MALDI-TOF MS Matrix-assisted laser desorption / ionization time-of
-flight mass spectrometry
MRSA Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus
min. Minute(n)
Nr. Nummer
PCR Polymerase-Kettenreaktion
PCR-RFLP PCR-Restriktionslängen-Polymorphismus
PSM Phenol-lösliches Modulin
rDNA ribosomale Desoxyribonukleinsäure
rRNA ribosomale Ribonukleinsäure
SdrI Kollagen-bindendes Protein
SLUSH Staphylococcus lugdunensis synergistisches
Hämolysin
Ssp Oberflächen-assoziierte Lipase
ssp. Subspezies
Std. Stunden
UafA Urothel-Adhäsions-Faktor A
UafB Urothel-Adhäsions-Faktor B
z.B. zum Beispiel
3
1 Einleitung
1.1 Das Genus Staphylococcus
Die Gattung Staphylococcus wird zusammen mit den Gattungen Gemella,
Jeotgilgalicoccus, Macrococcus und Salinicoccus zur Familie der
Staphylococcaceae gezählt. Sie umfasst mindestens 49 wissenschaftlich
untersuchte Spezies [16, 57, 77, 101], von denen sich wiederum 10 in 21
Subspezies unterteilen lassen [56, 83]. Staphylokokken werden als
grampositive, nicht sporenbildende Kokken beschrieben, die eine positive
Katalasereaktion und einen fakultativ anaeroben Stoffwechsel aufweisen.
Traditionell wurde Staphylococcus aureus als potenziell humanpathogener
Keim mittels der Plasmakoagulase von den anscheinend weniger
pathogenen Koagulase-negativen Staphylokokken (KoNS) abgegrenzt.
Neben S. aureus können auch Staphylococcus delphini, Staphylococcus
intermedius, Staphylococcus lutrae, Staphylococcus pseudintermedius
und Staphylococcus schleiferi eine Koagulase positive Reaktion zeigen.
S. pseudintermedius wurde lange Zeit fehlidentifiziert und erst vor kurzem
von S. intermedius abgegrenzt [109]. Beide Spezies sind als Enterotoxin
produzierende Krankheitserreger bei Hunden und Katzen beschrieben
[58].
1.1.1 Koagulase-negative Staphylokokken
Die Gruppe der KoNS wurde lange Zeit als nicht humanpathogene
Kommensalen der Haut und Mukosa beschrieben. Zunehmend stellten
sich diese Erreger jedoch als ernst zunehmende Krankheitserreger heraus
[48]. KoNS sind die wichtigsten Pathogene bei nosokomialen Infektionen
der Blutbahn auf Intensivstationen und bei Knochenmarktransplantationen
[106], sowie bei Infektionen mit vaskulären Kathetern und
Kunststoffprothesen [83]. Wurden die „late-onset“ Sepsis und nosokomiale
Infektionen bei Neugeborenen vor 1980 im Wesentlichen durch S. aureus
und Enterobacteriaceae verursacht, so wurden in den letzten Jahrzehnten
vorwiegend KoNS nachgewiesen [40]. Unter den KoNS sind insbesondere
4
Staphylococcus epidermidis [24, 76, 99], Staphylococcus haemolyticus
[69], Staphylococcus lugdunensis [29, 83] und Staphylococcus
saprophyticus als humanpathogene Infektionserreger beschrieben [33, 43,
88]. Als opportunistische Krankheitserreger wurden
Staphylococcus capitis [80], Staphylococcus cohnii [26],
Staphylococcus hominis [45], Staphylococcus saccharolyticus [107],
Staphylococcus simulans [65], Staphylococcus warneri [62] und
Staphylococcus xylosus [15] gewertet.
Viele KoNS produzieren mögliche Pathogenitätsfaktoren wie die DNAse,
Lipase und Esterase, sowie Toxine wie das α-und δ-Hämolysin [55, 93].
Vasconcelos et al. [102] beschrieb 2011 erstmals die Produktion der
Enterotoxine E, G, H und I in S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis,
S. simulans, S. lugdunensis und S. warneri.
1.1.2 Staphylococcus saprophyticus und Staphylococcus lugdunensis
Nachfolgend werden Vorkommen und Pathogenitätsfaktoren zu den
Spezies S. saprophyticus und S. lugdunensis, als häufige
humanpathogene Krankheitserreger, näher beschrieben.
Staphylococcus saprophyticus Torres Periera berichtete 1962 erstmals die Isolation eines KoNS bei
einem akuten Harnwegsinfekt einer Frau, der später als S. saprophyticus
neu klassifiziert wurde [97]. S. saprophyticus kann nach Escherichia coli
die zweithäufigste Ursache eines ambulant erworbenen Harnwegsinfekts
im Kollektiv junger Frauen sein [43]. Andere Studien bestätigen diese
hohe Prävalenz in dieser Altersgruppe nicht [23, 47]. Besonders junge
sexuell aktive Frauen sind durch eine häufig perianale Besiedlung
betroffen [84]. Fast jede dritte Frau leidet bis zu ihrem 25. Lebensjahr an
einem klinisch diagnostizierten Harnwegsinfekt und mindestens die Hälfte
aller Frauen ist ein Mal im Leben von einem Harnwegsinfekt betroffen,
was enorme Kosten für das Gesundheitssystem erzeugt [28]. Durch
S. saprophyticus werden in der Regel unkomplizierte Harnwegsinfektionen
5
verursacht, gelegentlich treten auch Komplikationen wie eine akute
Pyelonephritis [33] und Nephrolithiasis [27] auf. Es sind sogar Fälle von
schweren septischen Verläufen [33] und Endokarditis [88] beschrieben.
Die Pathogenität dieses Organismus kann durch eine Vielzahl von
Virulenzfaktoren erklärt werden. Die Urease führt zu einer effizienten
Besiedlung mit Entzündungsreaktion von Blase und Nieren [31]. Des
Weiteren wurde für S. saprophyticus eine Oberflächen-assoziierte Lipase
(Ssp) beschrieben [85], deren Bedeutung bis heute nicht klar erwiesen ist.
Jedoch weiß man, dass Lipasen im S. aureus als Pathogenitätsfaktor
eine wichtige Rolle bei lokalen Infektionen wie Abszessen und Furunkeln
besitzen [38]. Darüber hinaus konnte die Produktion von Lipasen bei
Entzündungsreaktionen in einem Mausmodell für S. aureus bewiesen
werden [64]. Kline et al. [51] zeigten darüber hinaus mit einem
Mausmodell, dass Ssp und das Kollagen-bindende Protein SdrI für die
Persistenz des S. saprophyticus während einer Harnwegsinfektion
ursächlich sein könnten. Dieses Bakterium besitzt eine Reihe von
oberflächen- und zellwandassoziierter möglicher Pathogenitätsfaktoren,
die an Matrixproteine wie Fibronektin und Kollagen binden, wodurch die
Adhärenz und die Invasion des Erregers in epitheliale Zellen ermöglicht
werden. Hierzu zählen Aas, ein zellwandgebundenes Hämagglutinin-
Autolysin-Adhäsin [39] und SdrI [70], sowie die zellwandständigen
Proteine Urothel-Adhäsions-Faktor A (UafA) mit positiver
Hämagglutination [53] und der Urothel-Adhäsions-Faktor B (UafB) [50].
Staphylococcus lugdunensis S. lugdunensis wurde erstmals 1988 in Lyon charakterisiert [30]. In den
letzten zwei Jahrzehnten wurde er als Erreger von Haut- und
Weichteilinfektionen, sowie potentiell tödlich verlaufenden Endokarditiden
beschrieben [29, 78]. Diese sind in der Schwere mit einer S. aureus
Infektion zu vergleichen. Als mögliche Virulenzfaktoren wurden bislang in
wenigen Studien Adhäsine, wie das Fibrinogen-bindende Adhäsin (Fbl)
[66, 74] und das von-Willebrand-Faktor-bindende Protein [75], untersucht.
Diese Pathogenitätsfaktoren weisen eine große Homologie zum
Fibrinogen-bindenden Clumping factor A (ClfA) [32] und Protein A [36] des
6
S. aureus auf. So verwundert es nicht, dass viele Infektionen für
S. lugdunensis beobachtet werden, die denen von S. aureus gleichen, wie
Osteomyelitis [95], Protheseninfektionen [91], Sepsis [13], komplizierte
Infektionen der Haut und Weichteilgewebe besonders nach chirurgischen
Eingriffen [100], akute nekrotisierende Sinusitis [68] und Infektionen des
zentralen Nervensystems [29]. Erst durch verbesserte
Identifizierungsstrategien wurde gezeigt, dass S. lugdunensis in der
Vergangenheit oft nicht richtig identifiziert werden konnte.
Mögliche Pathogenitätsfaktoren wie Lipasen [55] und Hämolysine [18]
konnten ebenfalls nachgewiesen werden. Bestimmte Hämolysin-(SLUSH)-
Proteine des S. lugdunensis, die zur Gruppe der Phenol-lösliche Moduline
(PSM) gehören, besitzen eine immunmodulatorische Wirkung und zeigen
in 32% eine Homologie zu einem Teil der Hauptdomäne des SipB
Invasionsproteins von Salmonella enterica [81]. Woraus sich eine
mögliche Funktion der PSM als Invasine ableiten lässt.
1.1.3 Bedeutung der Speziesidentifizierung
Staphylokokken sind ein physiologischer Bestandteil der Hautflora, ferner
verursachen Sie aber als opportunistische und invasive Pathogene die
verschiedensten Infektionen des Menschen. Um bei besonders
gefährdeten Patienten wie Neugeborenen, Menschen mit
Protheseninfektionen, intravaskulären Kathetern, Wundinfektionen und
Immunsupprimierten wirksame Therapien anzuwenden, ist eine
Speziesdifferenzierung aus verschiedenen Probenmaterialen sinnvoll.
Kann aus verschiedenen Untersuchungsmaterialen die gleiche Spezies
nachgewiesen werden, so ist eine Infektion durch diesen Erreger sehr
wahrscheinlich und die Therapie kann mit Bedacht der natürlichen
Antibiotikaresistenzen zeitnah gezielt angepasst werden [72]. Dagegen
weist der Nachweis unterschiedlicher Staphylokokkenspezies häufig auf
eine Kontaminierung der Proben durch Bakterien der Hautflora hin. Aus
der Gruppe der KoNS sind beispielsweise S. saprophyticus und
S. lugdunensis eher selten resistent. Akute unkomplizierte
Harnwegsinfekte werden aus diesem Grund häufig mit Co-trimoxazol,
7
Trimethoprim und Chinolonen behandelt. S. haemolyticus hingegen ist
häufig multiresistent. In Studien der Paul-Ehrlich-Gesellschaft aus dem
Jahr 2001 waren die untersuchten Isolate zu mehr als 70% resistent
gegen ß-Lactam-Antibiotika, Makrolide und Chinolone. Sicher wirksame
Chemotherapeutika waren hingegen Vancomycin, Linezolid und die
Streptogramin-Kombination Quinupristin/Dalfopristin.
1.1.4 Herkömmliche Identifizierung Koagulase negativer Staphylokokken
Die kulturelle Anzucht der Erreger auf zum Beispiel Blutagarplatten ist
eine wichtige Voraussetzung für eine Bakterienidentifizierung. Aufgrund
der Koloniemorphologie und dem Ergebnis einfacher Untersuchungen wie
der Katalase-, Oxidase- und Koagulase-Reaktion kann das Genus als
wahrscheinlich angenommen werden. Daraufhin wird anschließend eine
vereinfachte Staphylokokken-Differenzierung vorgenommen. Die
Staphylokokken-Differenzierung nach Kloos und Schleifer [52] basiert auf
folgenden 13 Schlüsselreaktionen: Koagulase-Reaktion, Hämolyse,
Nitratabbau, anaerobe Säureproduktion aus Fructose, Xylose, Arabinose,
Ribose, Maltose, Lactose, Sucrose, Trehalose, Mannitol und Xylitol
(Abb. 1). Nach Kloos und Schleifer wird zuerst in Koagulase-positive
Staphylokokken (KoPS), meist S. aureus, und Koagulase-negative
Staphylokokken (KoNS) unterschieden. Die Differenzierung der KoNS
erfolgt durch eine Reihe weiterer biochemischer Reaktionen, welche in
Abbildung 1 ersichtlich sind. Eine besonders starke Hämolyse-Aktivität
auf Blutagar von Rind oder Mensch ist beispielsweise charakteristisch für
S. haemolyticus. Eine Hämolyse mit einem geringeren Hämolysehof weist
hingegen auf das Vorliegen der Spezies S. simulans, S. epidermidis oder
S. capitis hin. Mit der vereinfachten Staphylokokkenidentifizierung nach
Kloos und Schleifer von 1975 können die KoNS-Spezies S. capitis,
S. haemolyticus, S. cohnii, S. epidermidis, S. hominis, S. saprophyticus,
S. simulans und S. xylosus unterschieden werden.
8
Abbildung 1: Vereinfachte Staphylokokkenidentifizierung nach Kloos & Schleifer 1975 (+ = Reaktion positiv, +/- = variables Reaktionsergebnis, - = Reaktion negativ)
Diese Differenzierungsmethode wurde inzwischen in den Laboren durch
kommerzielle meist automatisierte Identifizierungssysteme wie das API
STAPH (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankreich) oder das VITEK-2
(bioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankreich) abgelöst. Diese Systeme testen je
nach Hersteller eine unterschiedliche Anzahl biochemischer Reaktionen
wie Enzymausstattung und Substratverstoffwechselung. Diese Reaktionen
benötigen jedoch Zeit, bis sie zu einem verwertbaren Ergebnis führen. Die
durchschnittliche Identifizierungszeit für das API STAPH liegt bei 12-
24 Std. und für das VITEK-2 bei 5-12 Std. für die aktuelle Identifizierungs-
Karte, abhängig vom Reaktionsprofil der Spezies. Zudem werden von
mindestens 49 Staphylokokkenspezies nur 21 durch das API STAPH und
26 (davon zwei Subspezies) durch das VITEK-2 (bioMérieux, GP-
Produktinformationen 2008) erkannt [7], sodass deren Genauigkeit stark
9
von der zu identifizierenden Spezies abhängt [60, 63]. Keine oder
Fehlidentifizierungen von selteneren Spezies sind somit keine Seltenheit
[4, 8, 71]. Molekularbiologische Methoden wie die Spezies-spezifische-
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) [67] können ebenfalls eingesetzt
werden und sind als Referenzmethode etabliert. Der PCR-
Restriktionslängen-Polymorphismus (PCR-RFLP) nach Hauschild et al.
[37] ist ebenfalls eine molekulare Referenzmethode zur
Speziesidentifizierung. Hierbei werden PCR-Produkte des gleichen
Primers mit Restriktionsenzymen versetzt, die je nach Spezies
unterschiedliche Produkte liefern. Die höchste Güte weisen die
Amplifikation und Sequenzierung der 16S rDNA [82] oder anderer Gene
wie sodA [79] und rpoB [19] auf. Eine speziesspezifische PCR ist mit
einem Zeitaufwand von ca. 3-4 Std. deutlich schneller als automatisierte
Identifizierungssysteme, deren Vorteil dagegen in einem wesentlich
geringeren Preis liegt. Für den RFLP verlängert sich die Diagnostik nach
der speziesunspezifischen PCR um noch einmal 3-4 Std. Sequenzbasierte
Methoden werden hingegen in der Routinediagnostik aufgrund eines
zeitlichen Aufwand von 3 bis 5 Tagen kaum eingesetzt. Sie gelten aber als
akzeptierte Referenzmethode.
Wo herkömmliche Identifizierungsmethoden an ihre Grenzen stoßen, sind
neue und innovative Methoden wie das MALDI-TOF MS gefragt. Eine
Vielzahl von Anwendungsstudien bestätigen die schnellere und
kostengünstigere mikrobiologische Identifizierung durch das MALDI-
TOF MS gegenüber herkömmlichen biochemischen und molekularen
Referenzmethoden [10, 73, 87].
1.2 Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization Time-of Flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS)
Die Geschichte der Massenspektrometrie beginnt im Jahr 1899, in dem
J. Thomson die ersten Experimente zur Massenspektrometrie
veröffentlichte [96]. Durch die Einführung und Etablierung von
Ionisierungstechniken wie der Elektrospray Ionisierung (ESI) und der
Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) wurde die
10
Massenspektrometrie zum Ende der 1980er Jahre zur wichtigsten
Analysemethode in der Proteomforschung.
In Abbildung 2 ist ein schematischer Aufbau des MALDI-TOF MS
abgebildet. MALDI bedeutet, dass die in Matrix eingebettete
Analysenprobe durch Laserbeschuss angeregt wird. Anschließend gehen
die Proben- und Matrixmoleküle durch eine Art lokale Mikroexplosion in
die Gasphase über. Eine an den Probenteller angelegt Spannung und
Stoßprozesse in der sich entwickelnden Gaswolke bewirken die
Ionisierung eines Teils der Moleküle. Durch eine
Beschleunigungsspannung, welche nach dem Laserimpuls angeschaltet
wird, werden die Ionen in einer Röhre in Richtung des Detektors
beschleunigt. Diese Ergänzung der Anordnung wird als
Massenanalysegerät (Time-of-Flight = TOF) bezeichnet, welche die
Auftrennung der Teilchen entsprechend ihrer individuellen
Masse/Ladungs-Verhältnisse (m/z) ermöglicht. Die kinetische Energie aller
Ionen mit gleicher Ladung ist nach der Beschleunigung gleich, sodass ihre
Geschwindigkeit nur von ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) abhängt.
Wobei das Verhältnis von Molekülmasse und Ladung proportional zu dem
Quadrat der Flugzeit ist [25]. Ein Detektor erstellt anschließend ein
Massenspektrum (MS), welches mit einer Datenbank abgeglichen wird
und zur Identifizierung der Probe führt. Durch diese Technik kann sehr
genau die Masse von großen und labilen Molekülen bestimmt werden.
Abbildung 2: Funktionsweise des MALDI-TOF MS (mit Genehmigung von Bruker Daltonics)
11
1.2.1 Identifizierung von Bakterien mittels MALDI-TOF MS
Das MALDI-TOF MS zur mikrobiologischen Identifizierung arbeitet mit
extrahierten Proteinlysaten intakter Bakterien. Um diese zu gewinnen,
müssen Bakterienkolonien ebenfalls auf Blutagarplatten über Nacht
angezüchtet werden. Anschließend werden die Proben der Bakterien nach
einem Ethanol/Ameisensäure-Extraktionsprotokoll aufgeschlossen
(Extraktionsverfahren) oder mit einem Holzspatel direkt auf das Target
aufgetragen (Direktauftrag). Die 96 Analysefelder des Targets werden,
nachdem die Bakterienproben getrocknet sind, mit einer Matrix
überzogen. Anschließend kann die Messung im MALDI-TOF MS erfolgen.
In einem Vakuum erfolgt die Verdampfung der Matrix durch
Laserbeschuss der Analysefelder, wobei ebenfalls Proteine der zu
untersuchenden Isolate ionisiert werden (Abb. 2). Diese Ionen werden in
einem elektrischen Feld mit einer Spannung von ca. 20 kV beschleunigt.
Aus der Flugzeit und dem Ionisierungsgrad errechnet das Flexcontrol 3.0
Masse und Geschwindigkeit der einzelnen Teilchen. Durch das
Zusammenfügen von allen berechneten Teilchenmassen entsteht ein
Gesamtmassenspektrum, welches bei einem Masse-Ladungs-Verhältnis
(m/z) von 3.000 – 15.000 Da für die Identifizierung der Mikroorganismen
verwendet wird. Jede Bakterienspezies besitzt ein spezifisches Spektrum,
welches aus 25 wiederholt gemessenen Spektren als Summenspektrum
errechnet wird. Dieses Summenspektrum wird mit der Biotyper 2.0
Datenbank (Bruker Daltonics) abgeglichen und führt zur Identifizierung
des Isolats (Abb. 3) [7].
Abbildung 3: Peakprofil eines Staphylococcus lugdunensis
Der Score-Wert beschreibt die Übereinstimmung des Peakprofils in der
MALDI Biotyper 2.0 Datenbank mit dem ermittelten Profil des Isolats. Die
Scores 0 – 3 wurden aus dem 10er Logarithmus der Werte 1 – 1 000
errechnet. Jedoch ist der Algorithmus, nach dem die Software diese Werte
ermittelt, nicht bekannt.
12
Die Scores wurden nach dem Hersteller Bruker Daltonics in ihrer
Wertigkeit folgendermaßen klassifiziert:
3,000 – 2,300 = sehr hohe Wahrscheinlichkeit der Speziesidentifizierung
2,299 – 2,000 = sichere Genus- und wahrscheinliche Speziesidentifizierung
1,999 – 1,700 = wahrscheinliche Genusidentifizierung
1,699 – 0 = keine zuverlässige Speziesidentifizierung
1.2.2 Von der Idee zur klinischen Anwendung
1975 beschrieb Anhalt et al. erstmals die Identifizierung von Bakterien
mittels Massenspektrometrie [3]. Diese Versuche litten jedoch unter
mangelnder Reproduzierbarkeit der Spektren aufgrund der Varianz bei
Wachstumsbedingungen und Medien. Mit der Entwicklung des MALDI-
TOF MS in den 1980er Jahren wurde die Analyse vergleichsweise großer
Biomoleküle, ribosomale Proteine eingeschlossen, möglich [41]. Weitere
Studien zu diesem Thema folgten jedoch erst im Jahr 1996 [14, 42]. Die
Schwierigkeit bestand vor allem darin, dass nicht alle Proteine
gleichermaßen Energie und Ladung von der Matrix übernehmen und somit
das Peakprofil nur einen kleinen Teil des Proteoms des Bakteriums
abbildet. Viele der ursprünglich gewählten Massenbereiche waren in
erheblichem Maße von Umgebungsbedingungen abhängig [5], somit
ließen sich Peakprofile nicht immer reproduzieren und führten zu
diskrepanten Ergebnissen. Ebenso galt es, besonders kleine und leicht zu
ionisierende Proteine als Fehlerquellen zu umgehen. Die Austestung
unterschiedlicher Substanzen als Matrix und ein Massenbereich von 3.000
– 15.000 Da ermöglichten schließlich die Ionisierung von vorwiegend
ribosomalen Proteinen. Diese unterliegen im Gegensatz zu
Oberflächenproteinen weniger den äußeren Einflüssen und verbesserten
die Reproduzierbarkeit erheblich [90]. Ein weiterer Ansatz war die
Modifizierung der Probenvorbereitung. Um Proteinlysate für die
Messungen zu gewinnen stehen mittlerweile zwei evaluierte Verfahren zur
Auswahl: das Extraktionsverfahren und der Direktauftrag [1]. Des
Weiteren wurden drei unterschiedliche Typen von Targets entwickelt:
„polished steel“, „ground steel“ und AnchorChip® Targets. In der
13
klinischen Routine am häufigsten verwendet wird das konventionelle
„polished steel“ Target. Für das „ground steel“ Target wird ein verstärktes
Schmierphänomen beschrieben [6]. Durch den geringen Abstand der
Messfelder auf den Targets können die Proben der Felder sich mischen,
wenn zu viel Probenmaterial oder Matrix aufgetragen wird. AnchorChip®
Targets haben durch den hydrophilen Anker in einer hydrophoben
Umgebung ein deutlich vermindertes Schmierphänomen, wodurch
Kreuzkontaminationen besser verhindert werden können als bei
konventionellen Targets. Diese sind aber kostenintensiver [34].
Von den ersten Studien bis zum Einsatz in den Laboren der klinischen
Mikrobiologie vergingen letztendlich Jahre [6, 87], was mitunter den
vergleichsweise teuren Anschaffungskosten geschuldet war. Um diese
Technik für die klinische Anwendung nutzbar zu machen, wurden wenige
kommerzielle und nicht-kommerzielle Datenbanken mit Referenzspektren
relevanter Mikroorganismen erstellt [9, 87]. Die wesentlichen Unterschiede
dieser Datenbanken bestanden im Massenbereich der Datenbankeinträge
und der Anzahl der Referenzspektren pro Spezies. Die ersten Firmen, die
Komplettsysteme für die medizinisch-mikrobiologische Diagnostik
anboten, waren AnagnosTec und Bruker Daltonics. Diese Systeme
unterscheiden sich in der zugehörigen Software und den entsprechenden
Datenbanken. Von der Firma BioMérieux wird die Software Saramis
(ursprünglich AnagnosTec) und von Bruker Daltonics der MALDI Biotyper
2.0 (aktuell 3.0) vertrieben. Als Maß für die Qualität der Identifizierung mit
der Biotyper-Datenbank wurde ein Score-Wert festgelegt, welcher unter
1.2.1 genauer beschrieben ist. Bis zum heutigen Zeitpunkt ist nicht
eindeutig offengelegt, wie dieser Score-Wert von der Software des MALDI
Biotyper berechnet wird. Um diese Technik weiterhin zu verbessern, sind
Evaluationsstudien unverzichtbar. Die MALDI Biotyper 2.0 Datenbank
wurde in vorherigen Veröffentlichungen als sehr genau beschrieben [6, 35,
73, 87]. Viele der vorangegangene Studien variierten jedoch in der
Probenvorbereitung, den verwendeten Targettypen, der Anzahl der
getesteten Isolate, den verwendeten Spektren um ein Summenspektrum
zu erzeugen und den durchgeführten Wiederholungen. Insbesondere die
14
Grenzwerte der Scores, welche von besonderer Bedeutung für die
Genauigkeit der Speziesidentifizierung sind, wurden nicht immer nach den
Empfehlungen des Herstellers angewendet [6, 11, 20, 35, 73]. Bei allen
vorhergehenden Studien legte man dennoch die gleichen Score-„cutoff“-
Werte für alle untersuchten Spezies an. Nur Szabados et al.
veröffentlichte 2012 eine Studie, in der Spezies-spezifische
Scoreunterschiede für klinisch relevante Bakterien, darunter auch eine
geringe Anzahl von Staphylokokken, beschrieben wurden [94]. Hier setzt
unsere Studie mit der Evaluation des MALDI Biotyper 2.0 und der
zugehörige Datenbank V2.0.4.0 von Bruker Daltonics zu Spezies-
spezifischen Score-„cutoff“-Werten bei der Identifizierung von
Staphylokokken an.
15
2 Zielsetzung
Die bisherigen Veröffentlichungen beschreiben das MALDI-TOF MS bei
der Verwendung der MALDI Biotyper Datenbank als eine schnelle und
kostengünstige Methode in der Mikrobiologischen Diagnostik. Um die
Genauigkeit des MALDI Biotyper 2.0 in der Speziesidentifizierung von
KoNS zu testen, sollte im ersten Schritt die Identifizierungsgüte im
Vergleich zu anerkannten molekularen Referenzmethoden bei KoNS
ermittelt werden. Um Limitationen des Verfahrens aufzuzeigen, sollte
weiterführend die Reproduzierbarkeit der Messungen anhand von
Referenzisolaten zu den Datenbankeinträgen getestet werden. Um die
Identifizierung von Staphylokokken zu verbessern, sollten Spezies-
spezifischen Score-Werte untersucht und Spezies-spezifische Score-
„cutoff“-Werte festgelegt werden.
16
3 Ergebnisse
3.1 Studie zur MALDI-TOF MS-basierten Spezies-Identifizierung von Staphylokokken
Nachfolgend wird die Publikation „Identification of molecularly defined
Staphylococcus aureus strains using matrix-assisted laser
desorption/ionization time of flight mass spectrometry and the Biotyper 2.0
database” (A2) für die Identifizierung von KoNS zusammengefasst. Die
Fragestellung der S. aureus Identifizierung wurde von Herrn Jaroslaw
Woloszyn bearbeitet und zählt nicht zu meiner Dissertation.
Um den MALDI Biotyper 2.0 in der täglichen Diagnostik einzusetzen,
führten wir eine der größten Evaluationsstudien mit 1014 molekular
charakterisierte Staphylokokken-Stämme, davon 602 S. aureus und 412
KoNS, durch. Drei vorausgegangene Studien, welche sich mit der
Identifizierung von Staphylokokken Isolaten mittels MALDI-TOF MS
beschäftigten, divergierten im Studiendesign stark. So wurde der Eindruck
erweckt, dass die Genauigkeit des MALDI-TOF MS von der verwendeten
Datenbank, sowie von dem für die Identifizierung verwendeten
Algorithmus abhängt. Das für den Peak-Abgleich ausgewählte Masse-
Ladungs-Verhältnis zwischen Datenbank und gemessenem
Gesamtspektrum variierte ebenfalls. Um die Genauigkeit des MALDI
Biotyper 2.0 für die Identifizierung von Staphylokokken zu evaluieren, war
eine neue Studie unter klar definierten Bedingungen erforderlich.
Alle Stämme der Koagulase-negativen Staphylokokken wurden primär
durch das Vitek-2-System (bioMérieux) identifiziert und nachfolgend bei
diskrepanten Ergebnissen molekularbiologisch mittels Spezies-
spezifischer PCR, PCR-Restriktionslängen-Polymorphismus, sodA oder
rpoB Sequenzierung getestet. Für die Identifizierung mit dem MALDI-TOF
MS erfolgte die Probenvorbereitung nach dem Ethanol/Ameisensäure-
Extraktionsverfahren. Alle Isolate wurden in Doppelmessungen
charakterisiert. Für den Abgleich der Peakprofile wurde ein Masse-
17
Ladungs-Verhältnis von 3.000 – 15.000 Da ausgewählt, welches
hauptsächlich ribosomale Proteinpeaks abbilden sollte. Zur Auswertung
wurde jeweils der höchste Score-Wert verwendet. Die Grenzwerte für die
ermittelten Scores zur Beurteilung der Identifizierungsgüte wurden nach
den Vorschriften des Herstellers angelegt.
Für 412 eingeschlossene KoNS Isolate wurde eine Genauigkeit von 100%
auf dem Spezieslevel bei der MALDI-TOF MS basierten Identifizierung
erreicht. Mit einer durchschnittlichen Arbeitszeit von 22 min. war das
MALDI-TOF MS deutlich schneller als die Referenzmethoden.
3.2 Studie zu Spezies-spezifischen Score-„cutoff“-Werten bei der Identifizierung von Staphylokokken
Es folgt eine Zusammenfassung meiner Veröffentlichung „Evaluation of
species-specific score cut-off values for various Staphylococcus species
using a MALDI Biotyper-based identification“ (A1) für KoNS. Die
Evaluation der Identifizierung von S. aureus Isolaten wurde ebenfalls
durch Herrn Jaroslaw Woloszyn durchgeführt und wird hier nicht
beschrieben.
Diese Studie war die erste, die Spezies-spezifische Scoreunterschiede für
Staphylokokken bei der Anwendung des Biotyper 2.0 untersucht hat.
Vorangegangene Studien zeigten, dass für die Grenzwerte des Herstellers
nicht alle Spezies gleich gut identifiziert werden konnten [9, 87]. Doch
legten alle vorhergehenden Studien die gleichen Grenzwerte für alle
untersuchten Spezies an. Nur Szabados et al. [94] veröffentlichte 2012
eine Studie, in der Spezies-spezifische Scoreunterschiede für klinisch
relevante Bakterien, darunter auch eine geringe Anzahl von
Staphylokokken, beschrieben wurden.
Es wurden insgesamt 710 Staphylokokken-Isolate, darunter 592 KoNS,
105 S. aureus und 13 Referenzstämme, nach dem
Ethanol/Ameisensäure-Extraktionsverfahren aufgereinigt und mit dem
Biotyper 2.0 des MALDI-TOF MS identifiziert. Jedes Isolat wurde in
18
Doppelmessungen aus dem selben Extraktionsmaterial bestimmt. Um
neue Score-„cutoff“-Werte zu implementieren, wurden alle richtig
identifizierten Messungen in die Studie einbezogen, auch wenn der Score-
Wert unter 1,7 lag. Wurde eine der Doppelmessungen falsch identifiziert,
wurde diese als Fehlmessung und die andere als richtige Identifizierung
gewertet. Die Evaluation der MALDI-TOF MS-basierten KoNS-
Identifizierung erfolgte ebenfalls im Vergleich zum Vitek-2-System und zu
molekularen Referenzmethoden, wie unter 2.1 beschrieben.
Weiterführend wurde die Reproduzierbarkeit der Messungen anhand von
Referenzisolaten der Datenbank getestet. Die Spezies-spezifischen
Score-„cutoff“-Werte wurden mit Hilfe des 20. Perzentils festgelegt,
sodass 80% der ermittelten Score-Werte über dem Grenzwert lagen.
Mit einer Genauigkeit von 97,68 % (1387/1420) auf dem Genuslevel und
97,32 % (1382/1420) auf dem Spezieslevel bei der Identifizierung von 710
Staphylokokken-Isolaten, in Doppelmessungen (n=1420), erreichten nach
den Herstellerkriterien 220 Messungen (15,49 %) einen Score ≥ 2,3; 968
(68,17 %) Messungen einen Score ≥ 2,0 und < 2,3; und 194 Messungen
(13,66 %) blieben < 2,0. Bei 2,25 % der Messungen (32/1420) konnten
keine Peaks gefunden werden, obwohl die zweite Messung aus dem
gleichen Extraktionsmaterial richtig identifiziert worden war. Eine der
Doppelmessungen lieferte in 0,42 % (6/1420) eine falsche Identifizierung,
obwohl die zweite Messung eine richtige Identifizierung ergab. Die
Fehlidentifizierungen betrafen vier Isolate des S. saprophyticus, welche
als Staphylococcus equorum (Score: 1,687), Staphylococcus
piscifermentans (2,040), S. xylosus (1,842) und Pseudomonas balearica
(1,318) fehlidentifiziert wurden. Das einzige Isolat des
Staphylococcus carnosus wurde ein Mal als S. piscifermentans (1,767)
und ein Isolat des S. cohnii als S. xylosus (1,842) fehlidentifiziert. Eine
Zusammenfassung der Ergebnisse ist in Tabelle 1 ersichtlich.
19
Tabelle 1: MALDI-TOF MS basierte Identifizierung von Staphylokokken im Vergleich zu biochemischen und molekularen Referenzmethoden
Anzahl Referenz-
identifizierung MALDI-TOF MS in Doppelmessungen
Stap
hylo
cocc
us s
peci
es
Rou
tinei
sola
te
Ref
eren
zsta
mm
Spez
iess
pezi
fisch
e PC
R,
RFL
P, s
od A
, rpo
B
Vite
k2/ V
itek/
A
piSt
aph
Ric
htig
im G
enus
Ric
htig
in d
er S
pezi
es
No
peak
s fo
und
Erge
bnis
der
Feh
l-id
entif
izie
rung
Scor
e
S. arlettae 1 0 1 1 2/2 2/2 0
S. aureus 105 0 105 105 209/210 209/210 1
S. capitis 22 0 1 22 40/44 40/44 4
S. caprae 3 1 0 3 7/8 7/8 1
S. carnosus 1 0 1 1 2/2 1/2 0 S. piscifermentans 1,767
S. chromogenes 2 0 0 2 3/4 3/4 1
S. cohnii 7 1 1 7 16/16 15/16 0 S. xylosus 1,509
S. epidermidis 59 1 5 59 116/120 116/120 4
S. haemolyticus 41 1 41 41 82/84 82/84 2
S. hominis 37 1 16 37 75/76 75/76 1
S. hyicus 0 1 0 0 2/2 2/2 0
S. intermedius 2 1 0 2 5/6 5/6 1
S. lugdunensis 107 1 107 107 216/1216 216/216 0
S. pasteuri 1 0 0 1 2/2 2/2 0
S. saprophyticus 281 1 281 281/281 548/564 545/564 15
Pseudomanas
balearica,
S. equorum,
S. piscifermentans,
S. xylosus
1,318
1,687
2,04
1,842
S. schleiferi 6 1 2 6 14/14 14/14 0
S. scuiri 4 0 1 4 8/8 8/8 0
S. simulans 5 1 0 5 12/12 12/12 0
S. succinus 4 0 4 4 8/8 8/8 0
S. warneri 9 1 3 9 20/20 20/20 2
S. xylosus 0 1 0 0 2/2 2/2 0
Gesamt 697 13 569 714 1387/1420 1382/1420 32 6
Legt man hingegen die Identifizierungskriterien des Herstellers an, so
wurden nur 15,49 % mit einer „sehr hohen Wahrscheinlichkeit auf dem
Spezieslevel“ und nur 68,17% als „sicher im Genus und wahrscheinlich in
der Spezies“ identifiziert. Die Score-Verteilung ist für jede Spezies in
Abbildung 4 zusammengefasst.
20
Abbildung 4: Score-Verteilung der getesteten Staphylokokken-Isolate und Vorschlag neuer Score-„cutoff“-Werte anhand des 20. Perzentils (rot = Mittelwert, blau = Score-„cut-off“-Werte des Herstellers, * = aufgrund zu geringer Anzahl keine Berechnung)
Um neue Spezies-spezifische Score-„cutoff“-Werte zu finden, haben wir
willkürlich das 20. Perzentil von allen getesteten Spezies bestimmt, die
mehr als drei Isolate hatten. Ausgeschlossen und mit Sternchen
gekennzeichnet wurden die Spezies Staphylococcus arlettae, S. carnosus,
S. chromogenes, S. hyicus, S. pasteuri und S. xylosus. Sieben von 15
Spezies (S. caprae, S. intermedius, S. warneri, S. sciuri, S. schleiferi,
S. succinus und S. epidermidis) hatten einen errechneten Grenzwert < 2,0
und die Spezies S. cohnii sogar < 1,7. Der höchste errechnete Grenzwert
lag bei 2,170 für S. lugdunensis. Alle Spezies, ausgenommen S. xylosus
(99,8%), wurden zu 100% nicht als Ergebnis einer Fehlidentifizierung
angeben. Um die Genauigkeit des MALDI-TOF MS auf dem Level der
Isolat-Erkennung zu testen wurden 13 Referenzstämme der MALDI
Biotyper 2.0 Datenbank vergleichend gemessen. Im Idealfall sollte der
identische DSM-Datenbankeintrag als höchstes Score-Ergebnis dem
getesteten DSM-Stamm zugeordnet werden. Obwohl die Stämme
identisch mit denen der Datenbankeinträge waren, wurden keine Scores
21
von 3.0 erreicht. Der höchste Score-Wert lag bei 2,290 für S. lugdunensis
(DSM 20260). Nur eine Messung des S. epidermidis DSM 1798 lieferte
keine Peaks zur Identifizierung, alle anderen Messungen (96,15%)
ergaben richtige Ergebnisse auf dem Spezieslevel. Für sieben
Referenzstämme (DSM 4804, DSM 20229, DSM 20322, DSM 20328,
DSM 20373, DSM 20459 und DSM 20608) ergaben die
Doppelmessungen in beiden Fällen die höchste Übereinstimmung mit dem
richtigen DSM-Datenbankeintrag (53,85 %). Bei zwei Referenzisolaten
(DSM 20267, DSM 20316) ergab nur eine der beiden Doppelmessungen
die richtige DSM-Übereinstimmung (15,38 %). Die DSM-Identifizierung
scheiterte bei beiden Messungen (30,77%) für vier Referenzstämme
(DSM 1798, DSM 4807, DSM 20260 und DSM 20263).
22
4 Diskussion
Um konkurrenzfähig zu sein, stehen mikrobiologische Labore zunehmend
unter dem Druck einen zuverlässigen und kostengünstigen Service mit
hohem Durchlauf anzubieten. Alle herkömmlichen
Identifizierungsmethoden und antimikrobielle Testungen basieren auf
einer vorhergehenden Bakterienkultivierung und phänotypischen
Klassifizierung, die mit einer Dauer von 24 Std. zeit- und arbeitsaufwändig
ist. Automatisierte Identifizierungssysteme sind vergleichsweise
preisgünstig mit einem geringen Arbeitsaufwand, benötigen aber auch
mehrere Stunden und sind nicht für alle Speziesidentifizierungen reliabel.
Molekularbiologische PCR-basierte Verfahren hingegen sind dazu
geeignet, die Durchlaufzeiten zu verbessern und ein zuverlässiges
Ergebnis zu liefern. Trotzdem werden sie nur selten in der Routine
eingesetzt, da sie mit hohen Kosten verbunden und nicht universell
einsetzbar sind. Bei weitem nicht für alle Spezies sind bereits spezifische
Primer beschrieben worden. Extrem zeitaufwändige sequenzbasierte
Methoden gelten als sehr genau. Die kostenintensive Real-time-PCR
bleibt ebenso nur bestimmten Fragestellungen wie dem schnellen
Nachweis von Pathogenen im Liquor oder dem Direktnachweis aus
positiven Blutkulturen vorbehalten [46].
Besonders Staphylokokken haben in den letzten Jahren an Bedeutung bei
nosokomialen Infektionen zugenommen. Insbesondere ist an die
Zunahme der Antibiotikaresistenzen bei Methicillin-resistenten S. aureus
(MRSA) und den KoNS als Erreger bei kunststoffassoziierten und
Protheseninfektionen zu denken [91, 104]. Eine schnelle Identifizierung
von Bakterien und deren Resistenzen kann einen wesentlichen Einfluss
auf die Erkrankungsverläufe haben, indem durch gezielten Gebrauch von
Antibiotika multiresistente Erreger weniger erzeugt und die Letalität
gesenkt wird. Das MALDI-TOF MS, eine neue Identifizierungsmethode,
wurde in vorhergehenden Veröffentlichungen als schnell und effizient
beschrieben [44, 87]. Diese Aussage konnte in der Verwendung der
Biotyper 2.0 Datenbank mit einer Genauigkeit von 97,3% für
Staphylokokken auf dem Spezieslevel in der vorliegenden Arbeit bestätigt
23
werden. Dagegen unterliegen automatisierte Identifizierungssysteme wie
das VITEK-2 mit 86,3% [22] - 87,5% [49], das BD Phoenix mit 76,9% [22],
das MicroScan mit 82,5% [49] und das Crystal GP mit 67,5% [49] in der
Genauigkeit für Staphylokokken auf dem Spezieslevel deutlich. Ein
entscheidender Vorteil in der Identifizierung neu entdeckter Organismen
ist eine schnelle Ergänzung und Weiterentwicklung der Datenbank [17,
105]. Updates werden alle 3-6 Monate realisiert [59].
Das Besondere dieser Studie ist die Auswertung der Doppelmessungen,
wodurch es möglich ist auch „no peaks found“-Ergebnisse (32/1420) als
Fehlidentifizierungen zu werten, wenn das zweite Feld ein richtiges
Ergebnis liefert. Dieses Vorgehen ermöglicht eine interne Kontrolle. Der
erzielten Fehlmessung liegt auf diese Weise nicht ein Fehler in der
Probenvorbereitung, sondern im Auftrag der Proben oder der Messung im
MALDI-TOF MS selbst, zugrunde. Im Umkehrschluss sollte jedoch
erwähnt werden, dass durch Doppelmessungen die statistische
Gewichtung der Ergebnisse verändert wird.
Insbesondere die Probenvorbereitung für grampositiven Bakterien und
Pilze wird kontrovers diskutiert [1, 6, 94]. Der Direktauftrag wird als
einfacher und schneller angesehen [86], jedoch werden beim
Ethanol/Ameisensäure-Extraktionsverfahren die Organismen abgetötet.
Dies vermindert das Risiko von Labor-assoziierten Infektionen durch
pathogene Bakterien. Des weiteren wird die Qualität der erzeugten
Spektren für grampositive Bakterien und Pilze beim Extraktionsverfahren
als hochwertiger im Vergleich zum Direktauftrag beschrieben [2, 12],
sodass insgesamt höhere Score-Werte erzielt werden können [1, 86]. Die
zu evaluierenden Score-„cutoff“-Werte des Herstellers Bruker Daltonics
wurden für das Ethanol/Ameisensäure-Extraktionsverfahren festgelegt.
Nach den Empfehlungen des Herstellers steht ein Score ≥ 2,3 für eine
sehr wahrscheinlich Speziesidentifizierung. In vorausgegangenen Studien
wurde diese Grenze bereits auf ≥ 1,7 und < 2,0 herabgesetzt [6, 20, 35,
73]. Noch geringere Score-„cutoff“-Werte wurden für die direkte
Identifizierung von Bakterien aus Blutkulturflaschen vorgeschlagen [54,
24
89, 92], was die Forderung nach neuen Grenzwerten aufkommen lässt
[73].
Um die Genauigkeit des MALDI-TOF MS auf dem Spezieslevel zu
verbessern, wurden Spezies-spezifische Score-„cutoff“-Werte mit Hilfe des
20. Perzentils berechnet. Diese Werte können auf jede Spezies einzeln
oder in einem vereinfachten Identifizierungsschema auf übereinstimmende
Gruppen angewandt werden. Das 20. Perzentil wurde ausgewählt, weil die
meisten Fehlidentifizierungen sich unter dieser Grenze befanden. Ein
Score ≥ 2,0 ist für eine sichere Speziesidentifizierung bei S. aureus,
S. capitis, S. epidermidis, S. hominis, S. lugdunensis, S. saprophyticus,
S. simulans und S. xylosus anzulegen. Ein Score ≥ 1,7 ist ausreichend für
S. caprae, S. intermedius, S. schleiferi, S. sciuri, S. succinus und
S. warneri. Für die Spezies S. cohnii ist sogar ein Score ≥ 1,6 genügend.
In Anbetracht dieser Spezies-spezifischen Scoreunterschiede ist eine
Implementierung von festgesetzten Spezies-spezifischen Variablen in das
Klassifizierungssystem des Herstellers wünschenswert. Ein geringer
Score-Mittelwert zeigt, für welche Spezies die Datenbank verbessert
werden sollte. Dennoch wurde durch diese und vorhergehende Studien
aufgezeigt, dass das MALDI-TOF MS auf dem Spezieslevel für
Staphylokokken sehr genau ist [21, 87, 94]. Mit Ausnahme von S. xylosus
wurden alle getesteten Spezies nicht als falsch positives Ergebnis einer
Fehlidentifizierung angegeben, was die Anwendung niedriger Score-
„cutoff“-Werte befürwortet. Schon in vorausgegangenen Studien wurden
S. equorum, S. piscifermentans [21] und S. saprophyticus [20] mit initialen
Fehlidentifizierungen im MALDI-TOF MS beschrieben. In einem
Phylogramm [56] basierend auf der 16S rRNA und den dnaJ-
Genfragmenten sind sowohl S. xylosus als auch S. equorum sehr nahe
verwandt mit S. saprophyticus, wodurch die Ergebnisse der
Fehlidentifizierungen erklärt werden können. Dies trifft ebenso für die
Fehlidentifizierung von S. carnosus als S. piscifermentans zu.
Wohingegen ein Pseudomonas balearica eine sehr entfernte
phylogenetische Verwandtschaft mit S. saprophyticus aufweist.
25
S. piscifermentans ist dem S. saprophyticus phylogenetisch ebenfalls weit
entfernt, doch stimmt bei dieser Fehlidentifizierung das Genus.
Hohe Score-Werte bis 2,04 bei Fehlidentifizierung weisen ebenso darauf
hin, dass Verbraucher mehr auf kritische Spezies wie S. equorum,
S. piscifermentans und S. xylosus achten sollten, wohinter sich
S. saprophyticus, S. carnosus oder S. cohnii verbergen können.
Vorwiegend ist dabei auf die Herkunft der Proben und den
Untersuchungskontext zu achten. S. carnosus, S. equorum und
S. piscifermentans treten mit Lebensmitteln assoziiert auf. Bei der Suche
nach einem humanpathogenen Keim, sollte bei diesen
Identifizierungsergebnissen die erneute Prüfung auf eine S. saprophyticus
oder S. cohnii-Infektion bedacht werden. S. xylosus ist als
opportunistischer Krankheitserreger des Menschen zu werten, wird aber
auch als traditionelle Starterkultur bei Fleischerzeugnissen verwendet.
In der gegenwärtigen Studie fällt ebenfalls auf, dass der höchste erzielte
Score-Wert bei 2,580 lag, obwohl 3,0 als höchstmöglicher Score vom
Hersteller angeben wird. Es ist davon auszugehen, dass
Referenzstämme, die in der Datenbank gespeichert wurden, diesen
Höchstwert erreichen sollten, wenn der identische Stamm gemessen wird.
Dies wurde auch durch Harris et al. [35] nachgewiesen. Dennoch blieben
die Score-Werte der Referenzstämme dieser Arbeit weit unter dem
Höchstwert und erreichten noch nicht einmal den Grenzwert für eine „sehr
wahrscheinliche Speziesidentifizierung“. Ebenso ist anzumerken, dass
trotz richtiger Spezieserkennung für nur 53,85% der getesteten DSM-
Referenzisolate eine Zuordnung des identischen DSM-
Datenbankeintrages gelang. Die Proteinexpression scheint von
Umgebungsfaktoren wie den Kultivierungsbedingungen, darin inbegriffen
die verschiedenen Wachstumsphasen, Agarplatten, pH-Werte und
Temperaturen abhängig zu sein [98, 108]. Um ein wirklich repräsentatives
Peakprofil einer Spezies zu erhalten, sollte eine große Anzahl von
identischen Stämmen unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen
analysiert werden. Niedrige Score-Werte sowohl bei Routineisolaten als
auch bei Referenzstämmen lassen vermuten, dass es noch viele
26
unbekannte Faktoren in der Präparation, bei den Messinstrumenten und
Umgebungsfaktoren gibt, durch welche die Messungen beeinflusst
werden. Diese Faktoren sollten in nachfolgenden Studien untersucht
werden, um deren Bedeutung für die tägliche Diagnostik zu verstehen. Ein
Einsatz des MALDI-TOF MS in der Epidemiologie sollte erst erwogen
werden, wenn eine Zuordnung identischer Isolate unabhängig von
äußeren Umgebungsfaktoren möglich ist.
Das MALDI-TOF MS hat durch seine deutliche Zeitreduktion den Ablauf in
den diagnostischen Laboratorien verändert. Es lässt sich feststellen, dass
die MALDI Biotyper Datenbank für eine hochpräzise und schnelle
Identifizierung von Staphylokokken geeignet ist [61]. Der Score-„cutoff“-
Wert ist ohne eine Spezies-spezifische Korrektur nur eingeschränkt zur
Beurteilung der Identifizierungsqualität zu verwenden. In der Gruppe der
KoNS variierten die mittleren Score-Werte stark. Niedrige Score-Werte
können bei bestimmten Spezies durchaus für eine sichere Identifizierung
verwendet werden. Durch einen hohen Score-Wert kann nicht
ausgeschlossen werden, dass eine Fehlidentifizierung vorliegt. Zur
Verbesserung der Identifizierungsgüte können Spezies-spezifische Score-
„cutoff“-Werte, ohne dadurch einen erhöhten Anteil an
Fehlidentifizierungen zuzulassen, eingeführt werden. Diese Arbeit zeigt,
dass Datenbanken, die bereits kommerziell zur Identifizierung von
Mikroorganismen vertrieben werden, dennoch regelmäßig auf ihre
Genauigkeit untersucht werden sollten. Diese neue Technik ermöglicht
eine Beschleunigung der Befundbereitstellung in der medizinischen
Diagnostik um mindestens 12-24 Stunden. Durch eine deutlich frühere
Kenntnis der Spezies kann die Antibiotikatherapie frühzeitig an typische
Empfindlichkeiten angepasst und eine unwirksame Therapie zeitnah
beendet werden [103]. Durch das MALDI-TOF MS ist es ebenfalls
möglich, S. aureus Isolate mit untypischen Reaktionsmustern sicher zu
identifizieren, woran herkömmliche biochemische Methoden häufig
scheiterten. Auf diese Weise können nicht nur unnötige Kosten für
unwirksame Therapien gespart, sondern auch schwere
27
Infektionskrankheiten frühzeitig bekämpft und die Letalität gesenkt
werden.
28
5 Literaturverzeichnis
[1] Alatoom, A.A., Cunningham, S.A., Ihde, S.M., Mandrekar, J., Patel, R. (2011). Comparison of direct colony method versus extraction method for identification of gram-positive cocci by use of Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 49, 2868-2873
[2] Anderson, N.W., Buchan, B.W., Riebe, K.M., Parsons, L.N., Gnacinski, S., Ledeboer, N.A. (2012). Effects of solid-medium type on routine identification of bacterial isolates by use of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 50, 1008-1013
[3] Anhalt, F.C. (1975). Identification of bacteria using mass-spectrometry. Anal Chem 47, 219-225
[4] Ben-Ami, R., Navon-Venezia, S., Schwartz, D., Schlezinger, Y., Mekuzas, Y., Carmeli, Y. (2005). Erroneous reporting of coagulase-negative Staphylococci as Kocuria spp. by the Vitek 2 system. J Clin Microbiol 43, 1448-1450
[5] Bernardo, K., Pakulat, N., Macht, M., Krut, O., Seifert, H., Fleer, S., Hunger, F., Kronke, M. (2002). Identification and discrimination of Staphylococcus aureus strains using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry. Proteomics 2, 747-753
[6] Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G., Prod'hom, G. (2010). Performance of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for identification of bacterial strains routinely isolated in a clinical microbiology laboratory. J Clin Microbiol 48, 1549-1554
[7] Burkhardt, F. (2009). Mikrobiologische Diagnostik. Thieme
[8] Calvo, J., Hernandez, J.L., Farinas, M.C., Garcia-Palomo, D., Aguero, J. (2000). Osteomyelitis caused by Staphylococcus schleiferi and evidence of misidentification of this Staphylococcus species by an automated bacterial identification system. J Clin Microbiol 38, 3887-3889
29
[9] Carbonnelle, E., Beretti, J.L., Cottyn, S., Quesne, G., Berche, P., Nassif, X., Ferroni, A. (2007). Rapid identification of Staphylococci isolated in clinical microbiology laboratories by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 45, 2156-2161
[10] Carpaij, N., Willems, R.J., Bonten, M.J., Fluit, A.C. (2011). Comparison of the identification of coagulase-negative staphylococci by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and tuf sequencing. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 30, 1169-1172
[11] Cherkaoui, A., Emonet, S., Fernandez, J., Schorderet, D., Schrenzel, J. (2011). Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for rapid identification of Beta-hemolytic streptococci. J Clin Microbiol 49, 3004-3005
[12] Cherkaoui, A., Hibbs, J., Emonet, S., Tangomo, M., Girard, M., Francois, P., Schrenzel, J. (2010). Comparison of two matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry methods with conventional phenotypic identification for routine identification of bacteria to the species level. J Clin Microbiol 48, 1169-1175
[13] Choi, S.H., Chung, J.W., Lee, E.J., Kim, T.H., Lee, M.S., Kang, J.M., Song, E.H., Jun, J.B., Kim, M.N., Kim, Y.S., Woo, J.H. (2010). Incidence, characteristics, and outcomes of Staphylococcus lugdunensis bacteremia. J Clin Microbiol 48, 3346-3349
[14] Claydon, M.A., Davey, S.N., Edwards-Jones, V., Gordon, D.B. (1996). The rapid identification of intact microorganisms using mass spectrometry. Nat Biotechnol 14, 1584-1586
[15] Conrad, S.A., West, B.C. (1984). Endocarditis caused by Staphylococcus xylosus associated with intravenous drug abuse. J Infect Dis 149, 826-827
[16] De Bel, A., Van Hoorde, K., Wybo, I., Vandoorslaer, K., Echahidi, F., De Brandt, E., Schumann, P., Ieven, M., Soetens, O., Pierard, D., Vandamme, P. (2013). Staphylococcus jettensis sp. nov., a novel coagulase-negative staphylococcal species isolated from human clinical specimens. Int J Syst Evol Microbiol, (epub ahead of print)
30
[17] Djelouadji, Z., Roux, V., Raoult, D., Kodjo, A., Drancourt, M. (2012). Rapid MALDI-TOF mass spectrometry identification of Leptospira organisms. Vet Microbiol 159, 544
[18] Donvito, B., Etienne, J., Denoroy, L., Greenland, T., Benito, Y., Vandenesch, F. (1997). Synergistic hemolytic activity of Staphylococcus lugdunensis is mediated by three peptides encoded by a non-agr genetic locus. Infect Immun 65, 95-100
[19] Drancourt, M., Raoult, D. (2002). rpoB gene sequence-based identification of Staphylococcus species. J Clin Microbiol 40, 1333-1338
[20] Dubois, D., Leyssene, D., Chacornac, J.P., Kostrzewa, M., Schmit, P.O., Talon, R., Bonnet, R., Delmas, J. (2010). Identification of a variety of Staphylococcus species by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 48, 941-945
[21] Dupont, C., Sivadon-Tardy, V., Bille, E., Dauphin, B., Beretti, J.L., Alvarez, A.S., Degand, N., Ferroni, A., Rottman, M., Herrmann, J.L., Nassif, X., Ronco, E., Carbonnelle, E. (2010). Identification of clinical coagulase-negative Staphylococci, isolated in microbiology laboratories, by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry and two automated systems. Clin Microbiol Infect 16, 998-1004
[22] El-Bouri, K., Johnston, S., Rees, E., Thomas, I., Bome-Mannathoko, N., Jones, C., Reid, M., Ben-Ismaeil, B., Davies, A.R., Harris, L.G., Mack, D. (2012). Comparison of bacterial identification by MALDI-TOF mass spectrometry and conventional diagnostic microbiology methods: agreement, speed and cost implications. Br J Biomed Sci 69, 47-55
[23] Eriksson, A., Giske, C.G., Ternhag, A. (2013). The relative importance of Staphylococcus saprophyticus as a urinary tract pathogen: distribution of bacteria among urinary samples analysed during 1 year at a major Swedish laboratory. APMIS 121, 72-78
31
[24] Falcone, M., Micozzi, A., Pompeo, M.E., Baiocchi, P., Fabi, F., Penni, A., Martino, P., Venditti, M. (2004). Methicillin-resistant staphylococcal bacteremia in patients with hematologic malignancies: clinical and microbiological retrospective comparative analysis of Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus. J Chemother 16, 540-548
[25] Fenselau, C. (1997). MALDI MS and strategies for protein analysis. Anal Chem 69, 661A-665A
[26] Fernandes, A.P., Perl, T.M., Herwaldt, L.A. (1996). Staphylococcus cohnii: a case report on an unusual pathogen. Clin Perform Qual Health Care 4, 107-109
[27] Fowler, J.E., Jr. (1985). Staphylococcus saprophyticus as the cause of infected urinary calculus. Ann Intern Med 102, 342-343
[28] Foxman, B., Barlow, R., D'Arcy, H., Gillespie, B., Sobel, J.D. (2000). Urinary tract infection: self-reported incidence and associated costs. Ann Epidemiol 10, 509-515
[29] Frank, K.L., Del Pozo, J.L., Patel, R. (2008). From clinical microbiology to infection pathogenesis: how daring to be different works for Staphylococcus lugdunensis. Clin Microbiol Rev 21, 111-133
[30] Freney, J., Brun, Y., Bes, M., Meugnier, H., Grimont, F., Grimont, P. A. D., Nervi, C. & Fleurette, J. (1988). Staphylococcus lugdunensis sp. nov. and Staphylococcus schleiferi sp. nov., two new species from human clinical specimens. Int J Syst Bacteriol 38, 168-172
[31] Gatermann, S., John, J., Marre, R. (1989). Staphylococcus saprophyticus urease: characterization and contribution to uropathogenicity in unobstructed urinary tract infection of rats. Infect Immun 57, 110-116
[32] Geoghegan, J.A., Ganesh, V.K., Smeds, E., Liang, X., Hook, M., Foster, T.J. (2010). Molecular characterization of the interaction of staphylococcal microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules (MSCRAMM) ClfA and Fbl with fibrinogen. J Biol Chem 285, 6208-6216
32
[33] Glimaker, M., Granert, C., Krook, A. (1988). Septicemia caused by Staphylococcus saprophyticus. Scand J Infect Dis 20, 347-348
[34] Gobom, J., Schuerenberg, M., Mueller, M., Theiss, D., Lehrach, H., Nordhoff, E. (2001). Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics. Anal Chem 73, 434-438
[35] Harris, L.G., El-Bouri, K., Johnston, S., Rees, E., Frommelt, L., Siemssen, N., Christner, M., Davies, A.P., Rohde, H., Mack, D. (2010). Rapid identification of Staphylococci from prosthetic joint infections using MALDI-TOF mass-spectrometry. Int J Artif Organs 33, 568-574
[36] Hartleib, J., Kohler, N., Dickinson, R.B., Chhatwal, G.S., Sixma, J.J., Hartford, O.M., Foster, T.J., Peters, G., Kehrel, B.E., Herrmann, M. (2000). Protein A is the von Willebrand factor binding protein on Staphylococcus aureus. Blood 96, 2149-2156
[37] Hauschild, T., Stepanovic, S. (2008). Identification of Staphylococcus spp. by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of dnaJ gene. J Clin Microbiol 46, 3875-3879
[38] Hedstrom, S.A., Nilsson-Ehle, P. (1983). Trioleoylglycerol lipolysis by Staphylococcus aureus strains from recurrent furunculosis, pyomyositis, impetigo and osteomyelitis. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand B 91, 169-173
[39] Hell, W., Meyer, H.G., Gatermann, S.G. (1998). Cloning of aas, a gene encoding a Staphylococcus saprophyticus surface protein with adhesive and autolytic properties. Mol Microbiol 29, 871-881
[40] Hemels, M.A., Nijman, J., Leemans, A., van Kooij, B.J., van den Hoogen, A., Benders, M.J., Koopman-Esseboom, C., van Haastert, I.C., de Vries, L.S., Krediet, T.G., Groenendaal, F. (2012). Cerebral white matter and neurodevelopment of preterm infants after coagulase-negative staphylococcal sepsis. Pediatr Crit Care Med 13, 678-684
[41] Hillenkamp, F., Karas, M. (1990). Mass spectrometry of peptides
and proteins by matrix-assisted ultraviolet laser desorption/ionization. Methods Enzymol 193, 280-295
33
[42] Holland, R.D., Wilkes, J.G., Rafii, F., Sutherland, J.B., Persons, C.C., Voorhees, K.J., Lay, J.O., Jr. (1996). Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 10, 1227-1232
[43] Hooton, T.M., Stamm, W.E. (1997). Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am 11, 551-581
[44] Hsieh, S.Y., Tseng, C.L., Lee, Y.S., Kuo, A.J., Sun, C.F., Lin, Y.H., Chen, J.K. (2008). Highly efficient classification and identification of human pathogenic bacteria by MALDI-TOF MS. Mol Cell Proteomics 7, 448-456
[45] Jiang, S., Zheng, B., Ding, W., Lv, L., Ji, J., Zhang, H., Xiao, Y., Li, L. (2012). Whole-genome sequence of Staphylococcus hominis, an opportunistic pathogen. J Bacteriol 194, 4761-4762
[46] Jukes, L., Mikhail, J., Bome-Mannathoko, N., Hadfield, S.J., Harris, L.G., El-Bouri, K., Davies, A.P., Mack, D. (2010). Rapid differentiation of Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and other coagulase-negative Staphylococci and meticillin susceptibility testing directly from growth-positive blood cultures by multiplex real-time PCR. J Med Microbiol 59, 1456-1461
[47] Kashef, N., Djavid, G.E., Shahbazi, S. (2010). Antimicrobial susceptibility patterns of community-acquired uropathogens in Tehran, Iran. J Infect Dev Ctries 4, 202-206
[48] Kernodle, D.S., Barg, N.L., Kaiser, A.B. (1988). Low-level colonization of hospitalized patients with methicillin-resistant coagulase-negative Staphylococci and emergence of the organisms during surgical antimicrobial prophylaxis. Antimicrob Agents Chemother 32, 202-208
[49] Kim, M., Heo, S.R., Choi, S.H., Kwon, H., Park, J.S., Seong, M.W., Lee, D.H., Park, K.U., Song, J., Kim, E.C. (2008). Comparison of the MicroScan, VITEK 2, and Crystal GP with 16S rRNA sequencing and MicroSeq 500 v2.0 analysis for coagulase-negative Staphylococci. BMC Microbiol 8, 233
34
[50] King, N.P., Beatson, S.A., Totsika, M., Ulett, G.C., Alm, R.A., Manning, P.A., Schembri, M.A. (2011). UafB is a serine-rich repeat adhesin of Staphylococcus saprophyticus that mediates binding to fibronectin, fibrinogen and human uroepithelial cells. Microbiology 157, 1161-1175
[51] Kline, K.A., Ingersoll, M.A., Nielsen, H.V., Sakinc, T., Henriques-Normark, B., Gatermann, S., Caparon, M.G., Hultgren, S.J. (2010). Characterization of a novel murine model of Staphylococcus saprophyticus urinary tract infection reveals roles for Ssp and SdrI in virulence. Infect Immun 78, 1943-1951
[52] Kloos, W.E., Schleifer, K.H. (1975). Simplified scheme for routine identification of human Staphylococcus species. J Clin Microbiol 1, 82-88
[53] Kuroda, M., Yamashita, A., Hirakawa, H., Kumano, M., Morikawa, K., Higashide, M., Maruyama, A., Inose, Y., Matoba, K., Toh, H., Kuhara, S., Hattori, M., Ohta, T. (2005). Whole genome sequence of Staphylococcus saprophyticus reveals the pathogenesis of uncomplicated urinary tract infection. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 13272-13277
[54] La Scola, B., Raoult, D. (2009). Direct identification of bacteria in positive blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry. PloS one 4, e8041
[55] Lambe, D.W., Jr., Ferguson, K.P., Keplinger, J.L., Gemmell, C.G., Kalbfleisch, J.H. (1990). Pathogenicity of Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus schleiferi, and three other coagulase-negative Staphylococci in a mouse model and possible virulence factors. Can J Microbiol 36, 455-463
[56] Lamers, R.P., Muthukrishnan, G., Castoe, T.A., Tafur, S., Cole, A.M., Parkinson, C.L. (2012). Phylogenetic relationships among Staphylococcus species and refinement of cluster groups based on multilocus data. BMC Evol Biol 12, 171
[57] Landeta, G., Curiel, J.A., Carrascosa, A.V., Munoz, R., de las Rivas, B. (2013). Characterization of coagulase-negative Staphylococci isolated from Spanish dry cured meat products. Meat Sci 93, 387-396
35
[58] Lautz, S., Kanbar, T., Alber, J., Lammler, C., Weiss, R., Prenger-Berninghoff, E., Zschock, M. (2006). Dissemination of the gene encoding exfoliative toxin of Staphylococcus intermedius among strains isolated from dogs during routine microbiological diagnostics. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 53, 434-438
[59] Lavigne, J.P., Espinal, P., Dunyach-Remy, C., Messad, N., Pantel, A., Sotto, A. (2012). Mass spectrometry: a revolution in clinical microbiology? Clin Chem Lab Med 0, 1-14
[60] Layer, F., Ghebremedhin, B., Moder, K.A., Konig, W., Konig, B. (2006). Comparative study using various methods for identification of Staphylococcus species in clinical specimens. J Clin Microbiol 44, 2824-2830
[61] Lee, T.F., Lee, H., Chen, C.M., Du, S.H., Cheng, Y.C., Hsu, C.C., Chung, M.Y., Teng, S.H., Teng, L.J., Hsueh, P.R. (2013). Comparison of the Accuracy of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry with That of Other Commercial Identification Systems for Identifying Staphylococcus saprophyticus in Urine. J Clin Microbiol 51, 1563-1566
[62] Legius, B., Landuyt, K.V., Verschueren, P., Westhovens, R. (2012). Septic arthritis due to Staphylococcus warneri: a diagnostic challenge. Open Rheumatol J 6, 310-311
[63] Ligozzi, M., Bernini, C., Bonora, M.G., De Fatima, M., Zuliani, J., Fontana, R. (2002). Evaluation of the VITEK 2 system for identification and antimicrobial susceptibility testing of medically relevant gram-positive cocci. J Clin Microbiol 40, 1681-1686
[64] Lowe, A.M., Beattie, D.T., Deresiewicz, R.L. (1998). Identification of novel staphylococcal virulence genes by in vivo expression technology. Mol Microbiol 27, 967-976
[65] Mallet, M., Loiez, C., Melliez, H., Yazdanpanah, Y., Senneville, E., Lemaire, X. (2011). Staphylococcus simulans as an authentic pathogenic agent of osteoarticular infections. Infection 39, 473-476
[66] Marlinghaus, L., Becker, K., Korte, M., Neumann, S., Gatermann,
S.G., Szabados, F. (2012). Construction and characterization of three knockout mutants of the fbl gene in Staphylococcus lugdunensis. APMIS 120, 108-116
36
[67] Martineau, F., Picard, F.J., Menard, C., Roy, P.H., Ouellette, M., Bergeron, M.G. (2000). Development of a rapid PCR assay specific for Staphylococcus saprophyticus and application to direct detection from urine samples. J Clin Microbiol 38, 3280-3284
[68] Matthews, P.C., Lazarus, R., Protheroe, A., Milford, C., Bowler, I.C. (2011). Acute necrotizing sinusitis caused by Staphylococcus lugdunensis. J Clin Microbiol 49, 2740-2742
[69] Mazzariol, A., Lo Cascio, G., Kocsis, E., Maccacaro, L., Fontana, R., Cornaglia, G. (2012). Outbreak of linezolid-resistant Staphylococcus haemolyticus in an Italian intensive care unit. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 31, 523-527
[70] Meyer, H.G., Wengler-Becker, U., Gatermann, S.G. (1996). The hemagglutinin of Staphylococcus saprophyticus is a major adhesin for uroepithelial cells. Infect Immun 64, 3893-3896
[71] Morfin-Otero, R., Martinez-Vazquez, M.A., Lopez, D., Rodriguez-Noriega, E., Garza-Gonzalez, E. (2012). Isolation of rare coagulase-negative isolates in immunocompromised patients: Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus pettenkoferi and Staphylococcus pasteuri. Ann Clin Lab Sci 42, 182-185
[72] Natoli, S., Fontana, C., Favaro, M., Bergamini, A., Testore, G.P., Minelli, S., Bossa, M.C., Casapulla, M., Broglio, G., Beltrame, A., Cudillo, L., Cerretti, R., Leonardis, F. (2009). Characterization of coagulase-negative staphylococcal isolates from blood with reduced susceptibility to glycopeptides and therapeutic options. BMC Infect Dis 9, 83
[73] Neville, S.A., Lecordier, A., Ziochos, H., Chater, M.J., Gosbell, I.B., Maley, M.W., van Hal, S.J. (2011). Utility of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry following Introduction for Routine Laboratory Bacterial Identification. J Clin Microbiol 49, 2980-2984
[74] Nilsson, M., Bjerketorp, J., Guss, B., Frykberg, L. (2004). A fibrinogen-binding protein of Staphylococcus lugdunensis. FEMS Microbiol Lett 241, 87-93
37
[75] Nilsson, M., Bjerketorp, J., Wiebensjo, A., Ljungh, A., Frykberg, L., Guss, B. (2004). A von Willebrand factor-binding protein from Staphylococcus lugdunensis. FEMS Microbiol Lett 234, 155-161
[76] Otto, M. (2013). Coagulase-negative Staphylococci as reservoirs of genes facilitating MRSA infection: Staphylococcal commensal species such as Staphylococcus epidermidis are being recognized as important sources of genes promoting MRSA colonization and virulence. Bioessays 35, 4-11
[77] Pantucek, R., Svec, P., Dajcs, J.J., Machova, I., Cernohlavkova, J., Sedo, O., Gelbicova, T., Maslanova, I., Doskar, J., Zdrahal, Z., Ruzickova, V., Sedlacek, I. (2013). Staphylococcus petrasii sp. nov. including S. petrasii subsp. petrasii subsp. nov. and S. petrasii subsp. croceilyticus subsp. nov., isolated from human clinical specimens and human ear infections. Syst Appl Microbiol 36, 90-95
[78] Patil, R., Patil, T., Hussain, K.M. (2011). Staphylococcus lugdunensis native tricuspid valve endocarditis: a case report and review of literature. J Gen Intern Med 26, 1209-1211
[79] Poyart, C., Quesne, G., Boumaila, C., Trieu-Cuot, P. (2001). Rapid and accurate species-level identification of coagulase-negative Staphylococci by using the sodA gene as a target. J Clin Microbiol 39, 4296-4301
[80] Rasigade, J.P., Raulin, O., Picaud, J.C., Tellini, C., Bes, M., Grando, J., Ben Said, M., Claris, O., Etienne, J., Tigaud, S., Laurent, F. (2012). Methicillin-resistant Staphylococcus capitis with reduced vancomycin susceptibility causes late-onset sepsis in intensive care neonates. PloS One 7, e31548
[81] Rautenberg, M., Joo, H.S., Otto, M., Peschel, A. (2011). Neutrophil responses to staphylococcal pathogens and commensals via the formyl peptide receptor 2 relates to phenol-soluble modulin release and virulence. FASEB J 25, 1254-1263
[82] Relman, D.A. (1993). The identification of uncultured microbial pathogens. J Infect Dis 168, 1-8
[83] Rogers, K.L., Fey, P.D., Rupp, M.E. (2009). Coagulase-negative
staphylococcal infections. Infect Dis Clin North Am 23, 73-98
38
[84] Rupp, M.E., Soper, D.E., Archer, G.L. (1992). Colonization of the female genital tract with Staphylococcus saprophyticus. J Clin Microbiol 30, 2975-2979
[85] Sakinc, T., Woznowski, M., Ebsen, M., Gatermann, S.G. (2005). The surface-associated protein of Staphylococcus saprophyticus is a lipase. Infect Immun 73, 6419-6428
[86] Schulthess, B., Brodner, K., Bloemberg, G.V., Zbinden, R., Bottger, E.C., Hombach, M. (2013). Identification of Gram-positive cocci by use of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry: comparison of different preparation methods and implementation of a practical algorithm for routine diagnostics. Journal of clinical microbiology 51, 1834-1840
[87] Seng, P., Drancourt, M., Gouriet, F., La Scola, B., Fournier, P.E., Rolain, J.M., Raoult, D. (2009). Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis 49, 543-551
[88] Singh, V.R., Raad, I. (1990). Fatal Staphylococcus saprophyticus native valve endocarditis in an intravenous drug addict. J Infect Dis 162, 783-784
[89] Stevenson, L.G., Drake, S.K., Murray, P.R. (2010). Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 48, 444-447
[90] Suh, M.J., Limbach, P.A. (2004). Investigation of methods suitable for the matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of proteins from ribonucleoprotein complexes. Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng) 10, 89-99
[91] Szabados, F., Anders, A., Kaase, M., Marlinghaus, L., Gatermann,
S.G., Teske, W., Lichtinger, T. (2011). Late Periprosthetic Joint Infection due to Staphylococcus lugdunensis identified by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight Mass Spectrometry: A Case Report and Review of the Literature. Case Report Med 2011, 608919
39
[92] Szabados, F., Michels, M., Kaase, M., Gatermann, S. (2011). The sensitivity of direct identification from positive BacT/ALERT (bioMerieux) blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry is low. Clin Microbiol Infect 17, 192-195
[93] Szabados, F., Nowotny, Y., Marlinghaus, L., Korte, M., Neumann, S., Kaase, M., Gatermann, S.G. (2011). Occurrence of genes of putative fibrinogen binding proteins and hemolysins, as well as of their phenotypic correlates in isolates of Staphylococcus lugdunensis of different origins. BMC Res Notes 4, 113
[94] Szabados, F., Tix, H., Anders, A., Kaase, M., Gatermann, S.G., Geis, G. (2012). Evaluation of species-specific score cutoff values of routinely isolated clinically relevant bacteria using a direct smear preparation for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry-based bacterial identification. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 31, 1109-1119
[95] Thomas, S., Hoy, C., Capper, R. (2006). Osteomyelitis of the ear canal caused by Staphylococcus lugdunensis. J Infect 53, 227-229
[96] Thomson, J.J. (1899). On the Masses of the Ions in Gases at Low Pressures. Phil Mag 48, 547-567
[97] Torres Pereira, A. (1962). Coagulase-negative strains of Staphylococcus possessing antigen 51 as agents of urinary infection. J Clin Pathol 15, 252-253
[98] Valentine, N., Wunschel, S., Wunschel, D., Petersen, C., Wahl, K. (2005). Effect of culture conditions on microorganism identification by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Appl Environ Microbiol 71, 58-64
[99] Van Mellaert, L., Shahrooei, M., Hofmans, D., Eldere, J.V. (2012). Immunoprophylaxis and immunotherapy of Staphylococcus epidermidis infections: challenges and prospects. Expert Rev Vaccines 11, 319-334
[100] Vandenesch, F., Eykyn, S.J., Etienne, J., Lemozy, J. (1995). Skin and post-surgical wound infections due to Staphylococcus lugdunensis. Clin Microbiol Infect 1, 73-74
40
[101] Vandzurova, A., Backor, P., Javorsky, P., Pristas, P. (2013). Staphylococcus nepalensis in the guano of bats (Mammalia). Vet Microbiol 164, 116-121
[102] Vasconcelos, N.G., Pereira, V.C., Araujo Junior, J.P., da Cunha Mde, L. (2011). Molecular detection of enterotoxins E, G, H and I in Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococci isolated from clinical samples of newborns in Brazil. J Appl Microbiol 111, 749-762
[103] Vlek, A.L., Bonten, M.J., Boel, C.H. (2012). Direct matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry improves appropriateness of antibiotic treatment of bacteremia. PloS one 7, e32589
[104] von Eiff, C., Arciola, C. R., Montanaro, L., Becker, K. & Campoccia, D. (2006). Emerging Staphylococcus species as new pathogens in implant infections. Int J Artif Organs 29, 360-367
[105] Wang, J., Chen, W.F., Li, Q.X. (2012). Rapid identification and classification of Mycobacterium spp. using whole-cell protein barcodes with matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry in comparison with multigene phylogenetic analysis. Anal Chim Acta 716, 133-137
[106] Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S.M., Seifert, H., Wenzel, R.P., Edmond, M.B. (2004). Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis 39, 309-317
[107] Wu, X., Yu, C., Wang, X. (2009). A case of Staphylococcus saccharolyticus pneumonia. Int J Infect Dis 13, e43-46
[108] Wunschel, S.C., Jarman, K.H., Petersen, C.E., Valentine, N.B., Wahl, K.L., Schauki, D., Jackman, J., Nelson, C.P., White, E.t. (2005). Bacterial analysis by MALDI-TOF mass spectrometry: an inter-laboratory comparison. J Am Soc Mass Spectrom 16, 456-462
[109] Yoo, J.H., Yoon, J.W., Lee, S.Y., Park, H.M. (2010). High prevalence of Fluoroquinolone- and Methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius isolates from canine pyoderma and otitis externa in veterinary teaching hospital. J Microbiol Biotechnol 20, 798-802
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt …
… Herrn Professor Dr. med. Sören G. Gatermann, meinem
Doktorvater, für seine Förderung, kritische Diskussionen und
wegweisende Kommentare.
… Herrn Dr. med. Florian Szabados, meinem Betreuer der
Dissertation, für die Bereitstellung des Themas und seine
uneingeschränkte Unterstützung.
… Frau Susanne Friedrich für die ausgezeichnete und
persönliche Betreuung im Labor.
… allen Mitgliedern des Instituts der Medizinischen
Mikrobiologie für ihre Hilfsbereitschaft und das freundliche
Arbeitsklima.
… von Herzen meiner Familie für die Förderung meiner
Interessen und die liebevolle Unterstützung.
Lebenslauf
Persönliche Daten Name: Cindy Richter
Geboren: 25.11.1985 in Luckau
Berufliche Tätigkeiten Seit 05/2013 Assistenzärztin in der Klinik für Neurologie,
Prof. Dr. Schlegel, Universitätsklinikum
Knappschaftskrankenhaus Bochum
01/2013 – 03/2013 Assistenzärztin in der Klinik für Neurochirurgie,
Prof. Dr. Scholz, Klinikum Duisburg
Studium
2006 – 2012 Studium der Medizin, Ruhr-Universität Bochum
Herbst 2012 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Sommer 2008 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Stipendium 2013 – 2015 mQuadrat@RUB
2010 – 2011 Bronnbacher Stipendium (Programm zur
Förderung der kulturellen Kompetenz künftiger
Führungskräfte)
Schulische Ausbildung 0971999 – 07/2005 Bohnstedt Gymnasium Luckau
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
Richter C, Hollstein S, Woloszyn J, Kaase M, Gatermann S, Szabados F.
„Evaluation of species-specific score cut-off values of various staphylococci
species using a Biotyper-based identification“
J Med Microbiol. 2012 Oct;61(Pt 10):1409-16.Epub 2012 Jun 28
Szabados F, Woloszyn J, Richter C, Kaase M, Gatermann S.
„Identification of molecularly defined Staphylococcus aureus strains using matrix-
assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry and the
Biotyper 2.0 database”
J Med Microbiol. 2010 Jul;59(Pt 7):787-90. Epub 2010 Apr 1