Aus der Medizinischen Universitätsklinik,
Abteilung Innere Medizin II,
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br .
Molekulare und klinische Charakteristika
neuroendokriner Karzinome des Kolon
INAUGURAL-DISSERTATION zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität zu Freiburg i. Br.
vorgelegt 2008
von Iris Christine Scharf
geboren in Berlin
ii
iii
Dekan: Prof. Dr. Christoph Peters
Erster Gutachter: PD Dr. Christian N. Arnold
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Oliver G. Opitz
Jahr der Promotion: 2008
iv
v
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG ......................................................................................................................................................... 1
1.1 DEFINITION DER GEP-NET ...................................................................................................................................... 1 1.2 GESCHICHTLICHER HINTERGRUND ........................................................................................................................... 1 1.3 KLASSIFIKATION UND TERMINOLOGIE...................................................................................................................... 2 1.4 EPIDEMIOLOGIE ........................................................................................................................................................ 2 1.5 PROGNOSE................................................................................................................................................................ 3 1.6 SPEKTRUM UND CHARAKTERISTIKA ......................................................................................................................... 3
1.6.1 Charakteristika von Hindgut-NET ................................................................................................................... 4 1.6.2 Charakteristika von niedrig differenzierten neuroendokrinen Karzinomen (PDEC)....................................... 5
1.7 KOLOREKTALES KARZINOM (CRC) .......................................................................................................................... 5 1.8 KARZINOGENESE....................................................................................................................................................... 7
1.8.1 Two-hit modell nach Knudson.......................................................................................................................... 7 1.8.2 Genomische Instabilität.................................................................................................................................... 8 1.8.3 Chromosomale Instabilität (CIN)..................................................................................................................... 8 1.8.4 CIMP................................................................................................................................................................ 8 1.8.5 Mikrosatelliteninstabilität (MSI) ...................................................................................................................... 8 1.8.6 Epigenetik......................................................................................................................................................... 9
1.9 KI-67-MARKER....................................................................................................................................................... 12 1.10 AKTUELLER STAND DER FORSCHUNG................................................................................................................... 13
2 ZIELSETZUNG .................................................................................................................................................... 15
3 MATERIALIEN.................................................................................................................................................... 17
3.1 GERÄTE .................................................................................................................................................................. 17 3.2 CHEMIKALIEN UND ENZYME ................................................................................................................................... 18 3.3 ANTIKÖRPER........................................................................................................................................................... 19 3.4 KITS........................................................................................................................................................................ 19 3.5 VERBRAUCHSMATERIALIEN.................................................................................................................................... 19 3.6 PUFFER UND LÖSUNGEN: ........................................................................................................................................ 20 3.7 HERSTELLUNG EINER POSITIV–KONTROLLE: .......................................................................................................... 21 3.8 PATIENTEN.............................................................................................................................................................. 22
3.8.1 Kolon-NET ..................................................................................................................................................... 22 3.8.2 Fore-und Midgut-NET.................................................................................................................................... 22 3.8.3 CRC................................................................................................................................................................ 23
4 METHODEN......................................................................................................................................................... 23
4.1 METHYLIERUNGSSPEZIFISCHE PCR (MSP)-METHODE........................................................................................... 23 4.1.1 Prinzip der MSP............................................................................................................................................. 23 4.1.2 Mikrodissektion:............................................................................................................................................. 24 4.1.3 DNA-Extraktion für MSP-Analyse: ................................................................................................................ 24 4.1.4 Bisulfitbehandlung ......................................................................................................................................... 24 4.1.5 PCR ................................................................................................................................................................ 25 4.1.6 Gelelektrophorese: ......................................................................................................................................... 28
4.2 MSI- UND LOH-ANALYSE ...................................................................................................................................... 29 4.2.1 DNA-Extraktion für die MSI- und LOH-Analyse: .......................................................................................... 29 4.2.2 Endlabeln eines Primers ................................................................................................................................ 29 4.2.3 Endlabeln des Elektrophoresemarkers........................................................................................................... 29 4.2.4 PCR ................................................................................................................................................................ 30 4.2.5 Polyacrylamid-Gelelektrophorese: ................................................................................................................ 33
4.3 KI-67 FÄRBUNG...................................................................................................................................................... 33 4.4 STATISTISCHE METHODEN...................................................................................................................................... 34
5 ERGEBNISSE ....................................................................................................................................................... 37
5.1 MSI-ANALYSE........................................................................................................................................................ 37 5.2 LOH- ANALYSE ...................................................................................................................................................... 37 5.3 MSP-ANALYSE ....................................................................................................................................................... 39 5.4 CIMP...................................................................................................................................................................... 41 5.5 GENMETHYLIERUNG ............................................................................................................................................... 42 5.6 KI-67-ANALYSE...................................................................................................................................................... 42
vi
5.7 VERGLEICH DER TUMORGRUPPEN........................................................................................................................... 43 5.7.2 MSI ................................................................................................................................................................. 44 5.7.3 LOH................................................................................................................................................................ 44 5.7.4 CIMP.............................................................................................................................................................. 45 5.7.5 Genmethylierung ............................................................................................................................................ 47 5.7.6 Ki-67............................................................................................................................................................... 48
5.8 ÜBERLEBEN............................................................................................................................................................ 48 5.8.1 Überleben nach Tumorgruppen ..................................................................................................................... 48 5.8.2 Überleben nach LOH-Status ..........................................................................................................................49 5.8.3 Überleben nach CIMP-Status ........................................................................................................................ 50 5.8.4 Überleben nach Ki-67-Index.......................................................................................................................... 50 5.8.5 Prognose (multivariate Analyse)....................................................................................................................52
5.9 KORRELATION CIMP-POSITIVER STATUS UND K I-67-INDEX BEI KOLON-NET UND FORE- UND M IDGUT-NET ..... 52
6 DISKUSSION ........................................................................................................................................................ 55
7 ZUSAMMENFASSUNG ...................................................................................................................................... 61
8 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................................................. 63
9 ANHANG............................................................................................................................................................... 77
10 PUBLIKATION .................................................................................................................................................. 112
11 DANKSAGUNG.................................................................................................................................................. 113
12 LEBENSLAUF .................................................................................................................................................... 115
vii
Abkürzungsverzeichnis Abb.
Aqua bidest.
Aqua dest.
CIMP
CIN
CRC
Abbildung
Aqua bidestillata
Aqua destillata
CpG-Insel-Methylator-Phänotyp
Chromosomale Instabilität
Kolorektales Karzinom
CpG
DNA
dNTP
GEP
h
Cytidine phosphate guanosine
Desoxyribonukleinsäure
Desoxynukleosidtriphosphat
Gastroenteropankreatisch
Stunde
HE
HNPCC
IHC
kb
LOH
M
min
MMR
MSI
MSI-H
MSI-L
MSP
MSS
n
NCBI
NET
PCR
PDEC
Hämatoxylin-Eosin
Hereditäres-nicht-polypöses Kolonkarzinom
Immunhistochemie
Kilobase
Loss of Heterozygosity
Molar (mol/l)
Minute
Mismatch Repair
Mikrosatelliteninstabilität
MSI-High
MSI-Low
Methylierungsspezifische PCR
Mikrosatelliten-stabil
Anzahl
National Center for Biotechnical Information
Neuroendokriner Tumor
Polymerasekettenreaktion
Poorly differentiated endocrine carcinoma
PET Pancreatic endocrine tumor
RER
Rpm
Replication error
Umdrehungen pro minute
s Sekunde
viii
TSG Tumorsuppressorgen
WDEC well differentiated endocrine carcinoma
WDET well differentiated endocrine tumor
WDHA- Syndrom watery diarrhea, hypokalemia, achlorhydria-
Syndrom
Gen-Abkürzungen
APC Adenomatosis polyposis coli Tumorsuppressorgen
HIC 1 Hypermethylated in cancer 1 Tumorsuppressorgen
hMLH1 Human mutL homolog 1 MMR-System/DNA-Reparatur
MEN 1 Multiple endocrine neoplasia type 1 Tumorsuppressorgen
MGMT O-6-Methylguanine-DNA-
Methyltransferase
DNA-Reparaturenzym
p16 Cyclin- dependent kinase inhibitor
2A, (CDKN2A)
Cyclin-abhängiger Kinaseinhibitor,
Zellzyklusregulation
RASSF1A Ras Association domain Family 1A Zellzyklusregulation, Apoptose
TIMP 3 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase Tumorsuppressorgen
Sonstige:
BAX Bcl-2 associated X-Protein (19q13) Apoptose- Regulation
Bcl2 B-cell lymphoma protein 2 Apoptose-Regulation
BRAF B-raf proto- oncogene
seron/threonine proteinkinase (p94);
Braf transforming
BRCA1 Breast Cancer 1 Onkogen
c-myc Myelocytomatosis oncogene Proto-onkogen
COX2 Cyclooxygenase 2 Prostaglandinsynthese-Enzym
DAP-
Kinase
Death associated protein kinase Enzym
DCC Deleted in colorectal carcinoma
(18q21)
Kolorektales Tumorsuppressorgen
ER Östrogen-Rezeptor Zellwachstum
hMSH3 Human mutS/homolog3 MMR/DNA-Reparatur
ix
hMSH6 Human mutS/homolog6
IGF2R Insulin-like growth factor 2
Receptor
Wachstumsfaktor-Rezeptor
k-ras Ki rat sarcoma viral oncogene
homolog
Proto-oncogen
MBD Methyl binding domain Komplex nahe bei Promotorregionen
MLH1 MutL homolog 1 MMR-System/DNA-Reparatur
MINT1,2,31 Methylated in Tumor Methylierte CpG-Inseln in CRC
PTEN phosphatase and tensin homolog
deleted on chromosome 10
Tumorsuppressorgen
RARβ Retinoic acid receptor β Embryonalentwicklung,Apoptose-
Induktion, Sehfunktion
Rb Retinoblastom-Gen Tumorsuppressorgen
SMAD2 SMAD4
Kolorektales Tumorsuppressorgen
TGFβRII Transforming growth factor β
Rezeptor II
Hemmung von Zellwachstum
THBS1 Thrombospondin1 Angiogenese-Inhibitor
TP53
Tumorprotein p53
Tumorsuppressorgen:Apoptose-
Regulation
x
1
1 Einleitung
1.1 Definition der GEP-NET
Neuroendokrine Tumoren (NET) sind seltene Neoplasien des diffusen neuroendokrinen
Zellsystems, die sich durch heterogenes biologisches Verhalten und ein breites Spektrum
unterschiedlich differenzierter Tumoren auszeichnen [142]. NET können an allen Lokalisationen
auftreten, an denen es endokrine Vorläuferzellen gibt [15]. Diese befinden sich am häufigsten
verstreut in der Mukosa des Magen-Darm-Trakts (gastroenteropankreatisches System (GEP))
[93,101], aber auch in anderen Geweben, die sich aus dem embryonalen Darmkanal herleiten, wie
der Lunge [142]. Darüber hinaus können sich neuroendokrine Merkmale auch erst während der
Onkogenese entwickeln [171].
Die Begriffe Fore-, Mid-und Hindgut -NET werden heute nur zur Bestimmung der Lokalisation
verwendet [142]: Foregut-NET (Vorderdarm) befinden sich im Respirationstrakt, Magen,
Duodenum, proximalen Jejunum und Pankreas; Midgut-NET (Mitteldarm) schließen distales
Jejunum, Ileum, Appendix und proximale 2/3 des Kolon ein; Hindgut-NET (Enddarm) liegen im
distalen Kolon und Rektum [173].
Die meisten NET sind funktionell inaktiv [15,39]. Im Falle der Produktion von bioaktiven
Substanzen, wie Peptidhormonen, biogenen Aminen, Wachstumsfaktoren und -rezeptoren [135],
spiegeln sie das Verteilungsmuster endokriner Zelltypen im Normalgewebe wider, z.B. Gastrin in
Duodenal-NET [142], s. auch Tab.1. Meist dominiert die Produktion einer Substanz [93,157]. Dies
kann klinisch als Hypersekretionssyndrom bzw. als klassisches Karzinoidsyndrom, mit Flush,
Diarrhoe und kardialen Symptomen, auffallen; entsprechend sind die NET dann bereits in die Leber
metastasiert [115].
NET exprimieren in ihrer phänotypischen Verwandtschaft zu neuronalen Zellen molekulare
Differenzierungsmarker wie Chromogranin A, Synaptophysin [91] und viele andere [142], die eine
spezifische immunzytochemische Erkennung ermöglichen. Die meisten NET sind maligne [12].
1.2 Geschichtlicher Hintergrund
Als erste Beschreibung gastrointestinaler endokriner Tumoren gilt eine Veröffentlichung von
Merling aus dem Jahre 1838 [94]. Langerhans beschrieb 1869 nestförmig gelagerte Zellen
(Inselzellen) im Pankreas [142].
Lubarsch [104] (1888) und Ranson [134] (1890) beschrieben ähnliche Tumoren und auch deren
klinische Manifestation mit Flush und Diarrhoe, waren sich aber noch nicht deren endokriner
Eigenschaften bewusst. Oberndorfer bezeichnete 1907 [116] erstmals diese intestinalen Tumoren
als „Karzinoide“, da sie sich durch ein indolenteres Verhalten als Adenokarzinome des Darms
2
auszeichneten, also nur „karzinomähnlich“ waren. Ihr endokriner Charakter wurde erstmals 1906
von Ciaccio [35] und von Gosset und Masson [65] 1914 vorgeschlagen, die sie auch wegen ihrer
Anfärbbarkeit mit Silber „Argentaffinome“ nannten. Feyrter fasste die topographisch disseminierten
Zellen 1938 als „diffuses neuroendokrines System“ zusammen [53]. Stout fand Hinweise auf eine
Herkunft rektaler Karzinoide von neuroendokrinen Zellen des Rektums, sog. Erspamer-Zellen [52].
Pearse prägte 1964 den Begriff der APUD- Zellen („Amin precursor uptake and decarboxylation“)
[120] und postulierte eine gemeinsame embryonale Herkunft der APUD–Zellen von der
Neuralleiste, die aber durch Le Douarin und Teillet widerlegt wurde [1,97]. Jedoch konnte Pearse
auf den gemeinsamen, neuroendokrinen Charakter der NET hinweisen, denn mittlerweile wird
vermutet, dass endokrine Tumoren aus gemeinsamen „Stammzellen” entstehen [155] bzw. sich von
endodermalen Zellen des Vorder-, Mittel- und Enddarms herleiten, die das APUD-Programm
zusammen mit der Expression eines neuroendokrinen Phänotyps angenommen haben [5,171]. Im
Jahr 2000 sorgte die WHO –Klassifikation für begriffliche Klarheit und übernahm den von Pearse
eingeführten Begriff des „neuroendokrinen Tumors“ (NET) [149].
1.3 Klassifikation und Terminologie
1980 brachte eine WHO-Klassifikation zum ersten Mal Licht in die uneinheitliche Terminologie der
Karzinoide, APUDome, Endokrinen Tumoren und Karzinome [15]. Sie verwendete für die meisten
NET den Begriff „Karzinoid“ [174]. Jedoch wurde sie der morphologischen und biologischen
Heterogenität der NET nicht gerecht, so dass im Jahr 2000 eine weitere WHO-Klassifikation folgte,
die auch klinisch und prognostisch nützlich war [15,149]. Ebenso wurde „NET“ als Oberbegriff
festgelegt [27,149]. Der Terminus „Karzinoid“ sollte nur noch für hochdifferenzierte
extrapankreatische GEP-NET verwendet werden [142].
Entsprechend werden NET in hoch differenzierte endokrine Tumoren (benignes Verhalten, sehr
gute Prognose), hoch differenzierte endokrine Karzinome (malignes Verhalten, günstige Prognose)
und niedrig differenzierte endokrine Karzinome (meist kleinzellig, hochmaligne mit schlechter
Prognose) unterteilt. Weitere, selten verwendete, Kategorien sind gemischt exokrin-endokrine
Neoplasien und tumorähnliche Läsionen [149]. Zudem wird heute auch intensiv die Möglichkeit
einer molekularen Charakterisierung der GEP-NET erforscht [91].
1.4 Epidemiologie
NET sind sehr seltene Neoplasien mit einer Inzidenz von 1-2 /100.000 pro Jahr [91,152], die im
höheren Lebensalter auftreten [93]. Männer und Frauen sind gleich häufig betroffen, wenn NET des
Appendix nicht einbezogen werden [93,133]. Die meisten NET treten sporadisch auf und ihre
3
Ätiologie ist größtenteils unbekannt [91,142], während nur ca. 1% [152] der NET mit einer
Erbkrankheit wie dem MEN1–Syndrom (Wermer-Syndrom), der von-Hippel-Lindau- Erkrankung
(VHL) und der Neurofibromatose Typ 1 assoziiert sind [142].
1.5 Prognose
Grundlage einer prognostischen Einteilung ist die Klassifikation [142]. Hierbei werden vor allem
folgende Kriterien berücksichtigt: Primärtumorlokalisation, Tumorgröße und histologische
Differenzierung [15]. Eine präzisere Aussage ist durch Parameter wie funktionelle Aktivität,
Angioinvasion, lokale Ausbreitung, Metastasenstatus und Ki-67-Index möglich [142]. Derzeit
werden prognostische Marker wie Ki-67, p53, Onkogene, Tumorsuppressorgene und
Adhäsionsmoleküle untersucht, ob sie bezüglich der Prognose von NET aussagekräftig sind. Davon
hat sich bisher Ki-67 als prognostisch signifikant hervorgehoben [14]. Allgemein ist die Prognose
von GEP-NET günstiger als die der Adenokarzinome des Gastrointestinaltrakts [15].
1.6 Spektrum und Charakteristika
NET befinden sich hauptsächlich im gastroenteropankreatischen System und in der Lunge
[152,164], wobei GEP-NET am häufigsten im Dünndarm, Appendix und Rektum [164]
vorkommen. NET können auch in Thymus, Nieren, Ovar, Prostata, Brust und Haut gefunden
werden [15]. Patienten mit NET haben ein erhöhtes Risiko an synchronen und metachronen, nicht-
endokrinen Tumoren zu erkranken. Diese Sekundärtumoren entstehen dann vor allem in Kolon und
Rektum [15,57,111,152,156].
GEP-NET wachsen langsam, verglichen mit Adenokarzinomen des Gastrointestinaltrakts [15], sind
jedoch meistens maligne [12]. Die meisten NET sind funktionell inaktiv. Funktionelle NET, die
gehäuft im Pankreas entstehen, äußern sich, je nach ursprünglicher hormoneller Differenzierung der
Tumorzelle, durch spezifische Symptome (s. Tab.1) [15]. Allgemein gilt, dass Foregut-NET durch
ein Hypersekretionssyndrom, Midgut-NET durch das Karzinoid-Syndrom klinisch auffallen.
Hindgut-Tumoren sind generell funktionell inaktiv [15].
NET Sekretionsprodukt Syndrom/Symptome
Insulinom Insulin Hypoglykämie, Verwirrtheit
Gastrinom Gastrin Zollinger-Ellison-Syndrom: peptische
Ulcera, Diarrhoe, Refluxkrankheit
VIPom Vasoaktives intestinales Polypeptid
Diarrhoe, Hypokaliämie, Hypo-oder
Achlorhydrie (WDHA/Verner-Morrison
–Syndrom)
4
NET Sekretionsprodukt Syndrom/Symptome
Somatostatinom Somatostatin Diabetes, Steatorrhoe, Gallensteine
GHRHom Growth-hormone-releasing-
hormone Akromegalie
ACTHom Adrenocorticotropes Hormon Cushing–Syndrom
Karzinoide Serotonin, Tachykinine,
Prostaglandine
Flush, Diarrhoe, Bronchokonstriktion,
Endokardfibrose im rechten Herz
Glukagonom Glukagon Erythema necrolyticans migrans,
Diabetes mellitus, Gewichtsverlust
Tab.1
1.6.1 Charakteristika von Hindgut-NET
Kolon- und Rektum-NET sind selten, sie unterscheiden sich deutlich, sowohl von anderen NET, als
auch vom CRC in Symptomen, diagnostischem und therapeutischem Management und der
Prognose [164]: Hindgut-NET sind immer nicht-funktionell [15] und zeigen Deletionen des
Chromosom 18q (DCC-Gen) [135,160], wohingegen MEN1-Gen-Alterationen (Chromosom 11q)
kaum vorkommen [135].
1.6.1.1 NET des Kolon
Kolon-NET sind seltene (8-12% der GEP-NET [110]), histologisch meist niedrig differenzierte
neuroendokrine Karzinome und in 50-60% der Fälle bei Diagnosestellung bereits metastasiert mit
entsprechend schlechter Prognose [68,93]. Häufig werden sie mit undifferenzierten
Adenokarzinomen verwechselt [164]. Immunzytochemisch sind sie an ihrem Synaptophysingehalt
zu erkennen und können verstreut serotonin-und somatostatinpositive Zellen enthalten [91], wobei
die Expression von Chromogranin A in malignen NET herunterreguliert sein kann [142]. Häufige
Lokalisation der Kolon-NET ist das proximale Kolon aufgrund der erhöhten Anzahl
neuroendokriner Zellen in der Mukosa.
Bei einem Durchschnittsalter der Patienten von 65 Jahren, das geringer ist als das der Patienten mit
kolorektalem Karzinom (70 Jahre), sind Männer etwas häufiger betroffen.
Da gut differenzierte NET des Kolon selten sind, ähneln sich die 5-Jahres-Überlebenszeiten von
NET und Adenokarzinomen oder sind geringfügig schlechter für die malignen Kolon-NET [164].
Synchrone und metachrone Tumoren, z.B. Adenokarzinome, können auch bei Patienten mit Kolon-
NET gefunden werden (13% der Fälle) [110].
1.6.1.2 NET des Rektum
Rektum-NET machen ungefähr 10-20% der GEP-NET aus [28,91,93,164], sind häufiger und haben
eine bessere Prognose als Kolon-NET [91] und Adenokarzinome gleicher Lokalisation [164], wobei
5
die Tumorgröße der wichtigste Prognosefaktor ist. Rektum-NET, die größer als 2cm sind, neigen zu
Metastasierung. Viele Rektum-NET sind jedoch klein und asymptomatisch und werden frühzeitig in
der Endoskopie entdeckt. Außerdem sind im Rektum gering differenzierte neuroendokrine
Karzinome die Ausnahme [91]. Hier ist das Durchschnittsalter der Erkrankung das 52. bis
60.Lebensjahr, folglich sind jüngere Patienten als bei Adenokarzinomen betroffen [164].
1.6.1.3 Gemeinsamkeiten von Adenokarzinomen und NET des Kolorektums
Es wurden neuroendokrine Tumorzellen beschrieben, die in Adenokarzinomen des Kolorektums
vorkommen und mit einer schlechteren Prognose verbunden sind [83]. Ebenso gibt es auch
Adenome in NET, sog. Kollisionstumore. Die Tumorkomponente mit dem jeweils höheren Grading
bestimmt den Verlauf [164].
1.6.2 Charakteristika von niedrig differenzierten n euroendokrinen Karzinomen (PDEC)
Sogenannte PDEC finden sich vor allem im Magen, der Papilla Vateri und im Kolon [91,93]. Eine
schlechte Prognose haben kolorektale PDEC vom kleinzelligen oder intermediären Typ [93].
Chromosomale Instabilität (CIN) ist eine typische Eigenschaft von PDEC, oft ist das p53-Gen
involviert. Nur wenige Studien konzentrierten sich bisher auf PDEC [135], die in dieser Arbeit
untersucht werden.
1.7 Kolorektales Karzinom (CRC)
Das CRC ist die dritthäufigste krebsassoziierte Todesursache bei Männern und Frauen in
Industrienationen. Die meisten CRC treten sporadisch auf, 3-4% gehen auf eine familiäres Syndrom
zurück wie die FAP (Familiäre Adenomatöse Polyposis) und das Lynch-Syndrom (HNPCC=
hereditary non polyposis colorectal cancer) [9]. Im Rahmen der Adenom-Karzinom-Sequenz lässt
sich eine Akkumulation von Veränderungen verschiedener wachstumsregulierender Gene
beobachten (s. Abb.1).
Das Kolonkarzinom gehört zu den am besten erforschten Tumoren, an ihm zeigt sich am
deutlichsten das Ineinandergreifen verschiedener Alterationen, die zu genomischer Instabilität
beitragen und bei der Tumorentstehung beteiligt sind wie CIN, MSI und CIMP [8].
6
Abb.1 Adenom-Karzinom-Sequenz CIN leichte schwere Dysplasie Dysplasie MSI- CRC : ,
CIMP-CRC: Hypermethylierung von und anderen Tumorsuppressorgenen: * Quelle: Christian N. Arnold: Vorlesung Gastroenterologie 11.01.2007 durch LOH oder Mutation inaktivierte Gene durch Insertion/Deletion veränderte Gene, ausgelöst durch hMLH1- Mutation oder Methylierung Mutationen in Genen, ausgelöst durch Hypermethylierung von hMLH1 u.a. u Hypermethylierte Gene, s.Abkürzungsverzeichnis
MSI-Adenom
MSI-Karzinom
Karzinom Mittelschwere
Dysplasie Normales
Kolonepithel
Normales Kolonepithel
K-ras-Mutation
p53-Mutation
APC, bcl-2, c-myc, COX2
SMAD2/ SMAD4/
DCC (18q)
MLH1, MSH2, MSH6, MSH3
Hyper- Methylierung (von hMLH1)
BAX, MBD4,
TGFβRII, IGFIIR
hMLH1
Rb, p16, MGMT, BRCA1,PTEN, DAP-Kinase, E-cadherin, APC,TIMP3, RASSF1A [8]
APC, bcl-2, c-myc, COX2,
SMAD2/ SMAD4/
DCC (18q)
MLH1, MSH2, MSH6, MSH3
Bax, MBD4,
TGFβRII, IGFIIR
Rb, p16, MGMT, BRCA1,PTEN, DAP-Kinase, E-cadherin, APC,TIMP3, RASSF1A [8]
Hypo- methylation
7
1.8 Karzinogenese
Tumoren resultieren aus der Akkumulation von Veränderungen in den Genen, die direkt
Zellentstehung und Zelltod kontrollieren [100]. Dominante Onkogene transformieren bei ihrer
Aktivierung die Zelle zur Tumorzelle, eine Inaktivierung rezessiver Onkogene bzw. der
Tumorsuppressorgene (TSG) geht der Tumorentstehung voraus [101]. Diese genomische Instabilität
fördert durch den unkontrollierten Zellzyklus das Wachstum der Zelle und begünstigt ihre klonale
Expansion zum Tumor [100].
1.8.1 Two-hit modell nach Knudson
Für Tumorsuppressorgene (TSG) entwickelte Knudson anhand des Retinoblastoms im Jahr 1971
die Hypothese, dass bereits zwei Mutationsereignisse („hits“) beider Allele ausreichen, um ein TSG
auszuschalten und damit möglicherweise die Zelle in eine Tumorzelle zu transformieren [95]. Bei
hereditären Tumoren findet ein solches Ereignis bereits in der Keimbahn statt, das notwendige
zweite in einer somatischen Zelle. Bei sporadischen Tumoren erfolgt beides in einer somatischen
Zelle. Manche Tumoren können aber auch drei bis sieben Mutationsereignisse aufweisen, bis der
Tumor entsteht [16].
Abb.2 erläutert einen möglichen Ablauf:
*Quelle: A. Sosnowski: Inaugural-Dissertation (2005): Die Bedeutung genetischer und epigenetischer Mechanismen für die Patho-genese neuroendokriner Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems
Abb.2: Two- hit modell nach Knudson Der erste “hit” erfolgt sowohl bei sporadischen als auch bei hereditären Tumoren durch Mutation, bei sporadischen auch durch Stilllegung des Gens durch aberrante Promotorhypermethylierung [42,82,101]. Beim zweiten Allel ist sowohl Methylierung als auch ein Allelverlust (LOH) möglich [99,101]. Dass zwei Mutationen in einer Zelle zur Tumorentstehung führen, ist selten, jedoch kann eine Methylierung beider Allele durchaus vorkommen [42,82,74].
8
1.8.2 Genomische Instabilität
Unter dem Begriff „genomische Instabilität“ werden Instabilitäten auf Nukleotidebene,
chromosomale Instabilitäten, z.B. LOH oder Translokationen, Mikrosatelliteninstabilitäten und der
CpG-Insel-Methylatorphänotyp (CIMP) aus dem Bereich der Epigenetik zusammengefasst
[100,161].
1.8.3 Chromosomale Instabilität (CIN)
Die meisten Tumore zeigen genomische Instabilitäten auf chromosomaler Ebene mit häufigen
Verlusten und Gewinnen chromosomaler Abschnitte [108].
Diese erhöhte Rate nennt man CIN, die zur Aneuploidie oder Polyploidie der Zelle führt. Der
Verlust eines Allels eines Gens wird als „loss of heterozygosity“(LOH) bezeichnet [100].
1.8.4 CIMP
CIMP beschreibt eine weitere molekulare Instabilität, die durch Methylierung und damit
Inaktivierung von TSG Tumorentstehung und -wachstum fördert [162]. Diese Instabilität interagiert
auch mit anderen Wegen der Tumorentstehung wie MSI [162]. Beim CRC gibt es zwei Arten der
Methylierung, die mit der Tumorprogression einhergehen und auch für die NET des Hindgut
wichtig sein könnten: Die Typ A-Methylierung, die altersassoziiert ist, und die Typ C-
Methylierung, die „carcinomspezifisch“ im Rahmen von CIMP vorkommt [162].
So ist der CpG-Insel-Methylator-Phänotyp (CIMP) durch die Methylierung multipler CpG-Inseln
(s.1.8.6) charakterisiert [161] und wird durch eine bestimmte Anzahl von Methylierungen in
verschiedenen Genen eines Tumors festgelegt [62].
1.8.5 Mikrosatelliteninstabilität (MSI)
Mikrosatelliten-DNA besteht aus 10-50 Kopien von Folgen aus 1-5 Basenpaaren, die mehrmals
wiederholt werden, z.B. (A)13 [31], und überall im Genom verteilt sind. Sie findet sich in Introns
sowie in Exons (z.B. in Coding region des BAX- Gens oder TGFßRII-Gens) [31].
Mikrosatelliten sind hochpolymorph, d.h. in der Bevölkerung bestehen große Unterschiede
bezüglich der Anzahl der Wiederholungen [96]. Diese Unterschiede sind stabil und erblich und
eignen sich daher gut als Marker für die Forensik (genetisches Fingerprinting), die Untersuchung
von genetischen Deletionen (LOH) und das Auffinden von krankheitsverursachenden Genen durch
„Linkage –Untersuchungen“ mit diesen Markern [31].
MSI liegt vor, wenn sich das ursprüngliche Keimbahn-Mikrosatellitenallel durch Insertion oder
Deletion verändert hat. Daraus folgt eine somatische Änderung der Länge eines Gens, also eine
9
Leserastermutation, welches sich aber nur bei klonaler Expansion einer solchen Zelle zeigt [31].
Diese Zellen wurden als Mutator- oder Replikationsfehler-Phänotyp (englisch: RER-phenotype für
„replication error“ [25]) bezeichnet und später in „mikrosatelliteninstabil“ umbenannt [31].
Im hereditären nicht-polypösen kolorektalen Karzinomsyndrom (HNPCC oder Lynch-Syndrom)
wurden zahlreiche Mikrosatelliteninstabilitäten zuerst entdeckt. Dort liegt eine Keimbahnmutation
der DNA-Mismatch-Repair-Gene (MMR) hMLH1 und hMSH2 vor [31,60]. Sie gehören zum
Reparatursystem der DNA, das Fehlpaarungen nach der Replikation korrigiert, und begünstigen bei
Schädigung ihrer Funktion auch weitere Mutationen in anderen Genen [31,100].
DNA-MMR-Defekte können auch durch Mutationen [54] oder Promotorhypermethylierung [76],
z.B. bei sporadischen Tumoren, verursacht werden. So finden sich beim sporadischen CRC ca. 15%
der Tumoren mit Alterationen im MMR-System. Hier führt eine Promotorhypermethylierung von
hMLH1 zur Stilllegung der Transkription und damit zu einem Defekt im MMR-System [40].
Ähnliche Häufigkeiten für MSI finden sich in sporadischen Endometrium- und Magen-Karzinomen
[44,128,148,151]. Karzinome mit MSI unterscheiden sich von stabilen Tumoren häufig in Klinik,
pathologischen und molekularen Eigenschaften, z.B. haben sie oft eine bessere Prognose als
Tumoren mit CIN [7].
1.8.6 Epigenetik
Epigenetik ist als erbliche Modifikation der genetischen Aktivität definiert, die nicht mit der
Änderung der DNA-Sequenz einhergeht. Dies geschieht durch Methylierung von vor allem Cytosin
in CpG-Dinukleotidreichen Regionen der DNA (CpG- Inseln) zu 5’Methylcytosin.
CpG-Inseln sind ca.0.5-4kb große Abschnitte der DNA, die eine hohe Anzahl von Cytosin-
Guanosin-Dinukleotiden enthalten (cytosine phosphate guanosine) und zumeist in transkriptions-
regulierenden Promotorregionen der Hälfte der menschlichen Gene beobachtet werden [74]. Sie
sind normalerweise vor Methylierung geschützt. Die meisten CpG-Dinukleotide außerhalb der
CpG-Inseln sind methyliert [74]. Erfolgt eine Methylierung innerhalb einer CpG-Insel einer
Promotorregion, so wird das Gen nicht transkribiert („transcriptional silencing“) [6,74].
Dies kommt sowohl in der normalen Zelle als auch der Tumorzelle vor. Im Normalfall hat die
Stilllegung von Genen in menschlicher und Säugetier-DNA den Sinn, schädigende Anteile des
Genoms, wie ‚repeat’ Elemente, Transposons und eingebaute Viren–Genome an deren
Transkription zu hindern [22,23]. Auch ist dies ein wichtiger Regulationsmechanismus der
differenzierten Inaktivierung von Genen während der Embryonalentwicklung, der X-
chromosomalen Inaktivierung und des Imprintings, dem differenzierten Ausschalten eines
elterlichen Allels während der Gametogenese [6,74]. Zudem steigt der Anteil methylierter DNA im
Genom mit zunehmendem Alter an [3,165].
10
In Tumorzellen wurde zuerst eine globale Hypomethylation des Genoms beobachtet [36]. Diese
kann eine verminderte Repression stillgelegter Genabschnitte, z.B. Aktivierung eines Virus-
Genoms, zur Folge haben. Außerdem löst ein Wegfall von Repression eine Instabilität von
Chromosomen aus [21,50,51,63]. Desweiteren fanden sich in Tumorzellen regionale Promotor-
hypermethylierungen von meist Tumorsuppressorgenen und damit eine Inaktivierung derselben
[73,84,85]. Insgesamt wird vermutet, dass mehr Gene durch epigenetische Modifikationen ihre
Funktion verlieren als durch genetische Defekte [21,72,74,107].
Auf Proteinebene sind die Folgen von Methylierung bzw. Mutation ähnlich [73,84,85]: Das Protein
wird nicht translatiert.
An epigenetischen Modifikationen sind viele Mechanismen beteiligt (s. Abb.3). Hauptsächlich sind
hier die DNA-Methyltransferasen (DNMT1, 3a, 3b), die methylbindenden Proteine (MBP, MBD,
MeCP2) und die Interaktion von Histondeacetylasen (HDAC), Histonacetylasen (HAT) und der
Chromatinstruktur zu nennen [6,74].
Epigenetische Veränderungen treten früh während der Tumorgenese auf [21,49], in sogenannten
Vorläuferläsionen (z.B. kolorektales Adenom), und können so Zellen auf bestimmte
Signaltransduktionswege festlegen und den Weg zur definitiv malignen Zelle ebnen. Diese
Festlegung lässt auch die Anreicherung genetischer Defekte zu. Das eröffnet der Zelle einen
Selektionsvorteil und trägt somit zur klonalen Expansion bei [169]. Ganze Netzwerke von Genen
können gleichzeitig von epigenetischer Modifikation betroffen sein [21], daher lässt sich
mittlerweile auch ein Hypermethylator-Phänotyp oder auch CIMP (CpG-Insel-
Methylierungsphänotyp) für einige Tumoren charakterisieren [81,161], wofür bereits 3 bis 4
methylierte Gene ausreichen [41].
Das Gebiet der Epigenetik ist derzeit intensiver Gegenstand der Forschung, da man sich ein
besseres Verständnis der Karzinogenese und neue Möglichkeiten in Prävention, Diagnostik und
Therapie erhofft: So sind epigenetische Modifikationen prinzipiell reversibel im Gegensatz zu
genetischen Mutationen. Hier könnten DNMT-Inhibitoren, wie 5`Azacytidin, z. T. in Kombination
mit Histondeacetylase-Inhibitoren zum Einsatz kommen [74,146]. Gene mit methylierten
Promotoren sind einfacher durch sensitive Methoden wie die MSP, die mit geringen DNA-Mengen
auskommt, zu erfassen und könnten präventiv und diagnostisch relevante Marker liefern [74].
Außerdem wird die DNA in Tumoren genomweit auf methylierte Abschnitte untersucht, um noch
unbekannte Tumorsuppressorgene zu finden [21].
11
Abb.3 Normale Zelle : In der normalen Zelle sind die CpG-Inseln des Promotorabschnitts um Exon1 nicht methyliert (leere Kreise): Transkriptionsfaktoren (TF), Histonacetylasen (HAT), die durch Acetylierung von Resten in Histon3 und Methylierung von Lysin4 in Histon3 die Chromatinstruktur für die RNA-Polymerase III (PolymIII) offen halten, und Ko-Aktivatoren (KA) können binden: das Gen wird transkribiert (Pfeil). Die DNA-Methylierungsmaschinerie (DNMT=DNA-Methyltransferasen) hat keinen Zugang zu den nicht-methylierten kodierenden Abschnitten. Im Genom liegen vereinzelt methylierte CpG-Inseln vor (schwarze Kreise). An sie binden methylbindende Proteine (MBD), an die wiederum Histondeacetylasen (HDAC) binden. HDAC halten Histone in einem deacetylierten Zustand, der die DNA für den o.g. Transkriptions-Aktivations-Komplex unzugänglich macht. Meist liegen diese CpG–Inseln in nicht-kodierenden Abschnitten und sind daher stark methyliert. Eine Aufhebung der Methylierung hätte in diesen Bereichen Non-sense-Transkriptionen und eine Instabilität des Chromosoms zur Folge [74].
Abb.4 Tumorzelle In der Krebszelle sind weite Teile des Genoms hypomethyliert (leere Kreise). In anderen Bereichen hat die DNA-Methylierungsmaschinerie in Form von DNA-Methyltransferasen (DNMT) durch einen noch nicht genau verstandenen Prozess Zugang zu den Promotor-Regionen kodierender Abschnitte erhalten und diese methyliert. Durch den Komplex aus MBD und HDAC wird dieser Zustand aufrechterhalten und der Transkriptionsaktivationskomplex (mit TF, KA und Polymerasen) an seiner Bindung an die Promotorregion gehindert, das Gen ist ausgeschaltet [74]. Aus beiden Abbildungen wird deutlich, dass DNA-Methylierung und Histondeacetylierung synergistisch arbeiten, eine reine DNA-Methylierung führt nicht zur Geninaktivierung [24,87].
Exon1 Exon2 Exon3
TF KA
HAT
MBD MBD
HDAC
HDAC
DNMT CR Polym
III
Exon1 Exon2 Exon3
MBD MBD
HDAC
DNMT
HDAC
HAT TF
KA Polym
III
DNMT
12
1.9 Ki-67-Marker
Das Ki-67-Antigen ist ein nukleäres Protein, das durch seine Reaktion mit dem monoklonalen
Antikörper des Ki-67-Klons definiert wird (z.B. MIB-1). Während der Interphase wird das Ki-67-
Antigen ausschließlich im Kern gefunden, wohingegen der größte Teil des Proteins sich während
der Mitose wieder auf den Chromosomen befindet. Das Ki-67-Antigen wird während der späten G1,
S-, M- und G2–Phase des Zellzyklus in allen proliferierenden Zellen exprimiert. In ruhenden Zellen
(G0-Phase) und nicht stimulierten normalen menschlichen Zellen wird das Ki-67-Antigen nicht
gefunden [143]. Die Menge des Ki-67-Antigens in der Zelle wird durch präzise Synthese-und
Degradationssysteme stark reguliert [26,143]. So ist der Ki-67-Antikörper ein spezifischer und
sensitiver Marker für proliferierende Zellen.
In vielen verschiedenen malignen Neoplasien, inklusive NET, konnte die immunhistochemische Ki-
67-Markierung mit dem klinischen Verlauf der Erkrankung in Zusammenhang gebracht werden,
u.a. GEP-NET [123,136,143]. D.h. ein erhöhter Ki-67-Index zeigt einen schnell wachsenden,
aggressiven Tumor mit einer folglich schlechten Prognose an [136].
Welche Funktion das Ki-67-Antigen jedoch genau hat, ist bis heute nicht vollständig geklärt.
Bekannt ist, dass es ohne Ki-67-Antigen keine Zellproliferation jeglicher Art gibt [26]. Bisher sind
nur wenige Studien veröffentlicht, die die Ki-67-Anfärbung in GEP-NET untersuchen und mit
deren Prognose in Zusammenhang bringen [26,112].
13
1.10 Aktueller Stand der Forschung
Das sporadische CRC entsteht auf zwei voneinander unabhängigen Wegen, CIN (~50%), und
CIMP (~35-40%) [20,61,85].
CIN ist durch eine ausgeprägte Aneuploidie gekennzeichnet, die u. a. aus sequenzieller
Inaktivierung des APC-Gens 5q (in bis zu 50% der CRC [48]), des DCC/SMAD2/SMAD4
Genlokus, des K-ras-Onkogens und des p53-Gens resultiert [8,99].
CIMP ist in einem bestimmten Subtyp von sporadischen CRC repräsentiert, der in Abwesenheit von
CIN auftritt und umgekehrt [62]. CRC, die durch CIMP entstehen, sind im proximalen Kolon
lokalisiert, betreffen häufiger weibliche und ältere Patienten, sind schlecht differenziert, weisen
Wildtyp-p53, mehr K-ras- und BRAF-Mutationen und häufig auch MSI auf [70,98,140,161,163].
CIMP ist ein frühes Ereignis während der Tumorgenese und hat das Potential mehrere
Tumorsuppressorgene gleichzeitig zu inaktivieren. Das wiederum beschleunigt den neoplastischen
Prozess [161].
Zudem spielt CIMP eine Rolle bei der Entstehung der in 15% der sporadischen CRC auftretenden
MSI, die durch Promotorhypermethylierung von hMLH1 verursacht wird [62,76,86], mit daraus
folgenden weiteren Mutationen in so genannten „target-Genen“ wie TGFβRII-Rezeptor [119],
IGF2-Rezeptor, BAX und den MMR-Genen hMSH3 und hMSH6 [8,61].
CIMP und MSI finden sich beide häufig im proximalen Kolon [161]. Ebenso haben
Kolonkarzinome mit MSI keine K-ras-und TP53-Mutationen und damit auch eine bessere Prognose
[141].
Bei den bisher untersuchten GEP-NET, also vor allem Fore-und Midgut NET, stach besonders der
Verlust der Tumorsuppressorgenfunktion durch Allelverlust oder somatische Mutation hervor
[101,124]. Allelverluste sind häufig in NET [58,154,160] und variieren je nach Lokalisation des
Tumors [101,160].
MSI scheint bei GEP-NET eine geringe Rolle zu spielen: In manchen Studien konnte kein MSI
nachgewiesen werden [13,58,89], in anderen wurde MSI zu 10% in Pankreastumoren gefunden
[79].
Die Promotorhypermethylierung weiterer tumorassoziierter Gene wurde in kleineren Studien an
NET beschrieben [30,144,172] und auch für eine größere Anzahl NET des Fore-und Midgut gezeigt
[13]. Letztere Studie ergab, dass CIMP eine wichtige Rolle bei der Entstehung von GEP-NET
spielt. Zudem zeigte sich, dass die Methylierung von HIC1, RASSF1A und APC sehr häufig war
(83.1%, 71.3 % und 54.1%) [13].
Obwohl die Rolle von HIC1 nicht vollkommen klar ist, ist bekannt, dass dieses Gen den
Tumorsuppressor p53 heraufreguliert [33] und damit z.B. eine Apoptose einleitet, in Tumoren wird
es hauptsächlich durch Promotorhypermethylierung inaktiviert [129]. Verschiedene Studien geben
14
Hinweise darauf, dass der Ras-Signalweg vor allem durch die Methylierung des RASSF1A-
Promotors an der Pathogenese von gut differenzierten GEP-NET beteiligt ist [13,36,80,102]. APC
ist als Teil des wnt-Signalweges in die Pathogenese von GEP-NET involviert [13,47], wie auch bei
anderen gastrointestinalen Tumoren [11].
Weniger häufig hypermethyliert waren das DNA-Reparaturgen O6-MGMT und das mit dem MEN1-
Syndrom assoziierte MEN1-Gen (16.1%, 14.3%) [13]. Das MEN1-Gen wird in sporadischen GEP-
NET vor allem durch Mutation inaktiviert [64], wobei hier vor allem Tumoren des Foregut
betroffen sind [135]. Promotorhypermethylierung scheint eine geringere Bedeutung zu haben.
MGMT ist ein DNA-Reparaturgen, das vor allem bei Kolonkarzinomen, Lungen-und Hirntumoren
methyliert vorgefunden wird. Bei GEP-NET scheint es geringere Bedeutung zu haben [13,43].
Keine Methylierung wiesen TIMP3, p16INK4a/CDKN2A und hMLH1 auf [13]. p16 scheint dennoch
wichtig zu sein, da die p16-Proteinexpression auf 58% der Tumoren beschränkt war [13].
Außerdem wurden in anderen Studien Promotorhypermethylierungen [30,80,144,147]
nachgewiesen, die ebenfalls mit einem Expressionsverlust assoziiert waren [30,105].
In weiteren Studien wurden auch Promotorhypermethylierungen bei folgenden Genen gezeigt: p19
[36], RARß bei endokrinen Pankreastumoren [80], p14, THBS1, COX 2, Östrogen-Rezeptor-Gen
(ER) bei pankreatischen NET und NET mit Karzinoidsyndrom [30]. Diese Untersuchungen wurden
aber nur an kleinen Fallzahlen vorgenommen.
An anderen Tumoren häufig beteiligte Onkogene wie k-ras und Tumorsuppressorgene wie Rb und
p53 haben bei gut differenzierten GEP-NET keine Bedeutung [19,34,114,168,175]. In schlecht
differenzierten NET werden jedoch häufig Veränderungen von p53 und Rb beobachtet [131].
Zu schlecht differenzierten NET (PDEC) ist bisher wenig bekannt: sie weisen häufig LOH am APC,
DCC, TP53–Lokus auf [56]. Laut einer Zusammenfassung von Rindi und Bordi [135] sei CIN eine
typische Eigenschaft von PDEC, unabhängig von der Lokalisation des Tumors. Oft sei das p53-Gen
involviert. Die Autoren legen aufgrund histologischer und molekularer Beobachtungen die
Vermutung nahe, dass gemeinsame genetische Ereignisse der Tumorentstehung von PDEC des
Hindgut und Adenokarzinomen zugrunde liegen [135]. Daher werden auch in dieser Arbeit PDEC
des Hindgut und CRC auf Ähnlichkeiten untersucht.
Nur der Proliferationsmarker Ki-67 und das Ausmaß des spontanen Tumorwachstums wurden
bisher als bedeutsam für die Prognose gefunden [14]. In einer Studie konnte gezeigt werden, dass
signifikant mehr Tumoren mit Ki-67–Index >10% CIMP-positiv waren als NET mit einem
niedrigeren Ki-67–Index. Zudem zeigten CIMP-negative NET ein besseres durchschnittliches
Überleben als CIMP-positive [13].
15
2 Zielsetzung
In der vorgelegten Arbeit wurden die sehr seltenen, schlecht differenzierten NET des Kolon und
Rektum (kurz: Kolon-NET) hinsichtlich der Beteiligung genetischer und epigenetischer Prozesse an
ihrer Pathogenese untersucht. Diese Tumorgruppe gehört zu den GEP-NET des Hindgut und nennt
sich auch „neuroendokrine Karzinome“.
Ziele dieser Arbeit waren die Analyse
• des Methylierungsstatus der Promotorregionen acht verschiedener Tumorsuppressorgene
(p16, APC, HIC1, RASSF1A, TIMP3, MGMT, MEN1, hMLH1) mittels MSP, und des CIMP-
Status,
• der genomischen Instabilität (MSI und LOH) der Tumoren mit Hilfe entsprechender Marker,
• des Ki-67-Index zur Feststellung einer Korrelation von Proliferationsrate und
Genmethylierung.
Zusätzlich wurden folgende Fragestellungen bearbeitet:
1. wie unterscheiden sich NET in unterschiedlichen Loci ?
2. wie unterscheiden sich schlecht differenzierte NET vom sporadischen CRC ?
Hierzu wurden Untersuchungsergebnisse aus sowohl der eigenen Arbeitsgruppe (gut differenzierte
Fore-und Midgut-NET) als auch aus dem Labor von Prof. Boland, Dallas, USA (CRC)
hinzugezogen, und folgende Vergleiche aufgestellt:
• MSI-Status bei Kolon-NET, CRC und Fore-und Midgut-NET
• LOH-Status bei Kolon-NET und Fore-und Midgut-NET
• CIMP-Status bei Kolon-NET, CRC und Fore-und Midgut-NET
• Methylierungsmarker von Kolon-NET und Fore-und Midgut NET
• Überlebenszeiten bei Kolon-NET und Fore-und Midgut-NET
Zusätzlich wurde
• eine multivariate Analyse der Überlebenszeiten auf prognostische Faktoren (Ki-67-Index,
CIMP-Status, LOH-Status, Tumorgruppe)
und
• eine Untersuchung der Korrelation von CIMP-Status und Ki-67-Index bei Kolon-NET und
Fore-und Midgut-NET
durchgeführt.
16
17
3 Materialien
3.1 Geräte
Autostainer DAKO Cytomation, Hamburg, Deutschland
Base Runner 200 inkl. Glasplatten, Spacer und Kamm International Biotechnologies Inc., New Haven, CT, USA
Biofuge Fresco Heraeus, Osterode, Deutschland
Elektrophoresekammern für Agarosegele inkl. Zubehör:
Wide Mini-Sub Cell GT System
Bio-Rad, München, Deutschland
Eismaschine AF20 Scotsman, Bettolino di Pogliano, Mailand, Italien
Filme BioMax MR(14650) Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA
Filmentwicklungsmaschine CP 1000 AGFA, Gevaert N.V:, Köln, Deutschland
Gel- Dokumentationssystem UVT-28 MP /ICU-1
(Transilluminator)
Herolab, Wiesloch, Deutschland
Gel Dryer Model 583 Bio-Rad, München, Deutschland
Heizblock“ Blockthermostat BT 200 „ Kleinfeld Labortechnik GmbH, Gehrden, Deutschland
Laboratory Vacuum Manifold( Vac-Man) Promega, Mannheim, Deutschland
Lichtmikroskop Zeiss, Oberkochem, Deutschland
Magnetrührer IKAMAG KMO-1 IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland
Membranpumpe Vacuubrand, Wertheim, Deutschland
Membranvakuumpumpe Vacuubrand, Wertheim, Deutschland
Mikrowellenherd Siemens, München, Deutschland
pH- Meter Knick, Berlin, Deutschland
2, 20, 100, 200, 1000 µl Pipetten ABIMED, Langenfeld, Gilson, Frankreich
Pipettierhilfe Pipettboy acu INTEGRA Biosciences, Fernwald, Deutschland
Plexiglaskammer “Clene Cab” Herolab, Wiesloch, Deutschland
Röntgenkassette 8x10 Siemens, München, Deutschland
Schutzschild aus Plexiglas ZITT-THOMA, Freiburg, Deutschland
Stromversorgungsgeräte:
Modell 3000 Xi (für Polyacrylamidgele) Bio-Rad München, Deutschland
PS305 (für Agarosegele) Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland
Thermocycler MultiCycler PTC 220 DYAD Biozym, Oldendorf, Deutschland
Tischzentrifuge QUALITRON, Korea
Ultrospec 3000 pro UV/Visible Spectrophotometer Pharmacia Biotech, Cambridge, England
Vortex Genie 2 Scientific Industries, Bohemia, NY, USA
Waagen:
PM 460 Mettler, Giessen, Deutschland
Präzisionswaage Sartorius, Göttingen, Deutschland
Wasserbad
JULABO SW U3
JULABO Labortechnik, Seelbach, Deutschland
18
3.2 Chemikalien und Enzyme
40% Acrylamid/ Bis Lösung ( 19:1) Bio-Rad, Hercules, CA, USA
Agarose Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland
Ammoniumacetat Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland
Ammoniumpersulfat (APS) Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland
Ammoniumsulfat Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland
[γ- 32P] ATP (10mCi/ml) Amersham Biosciences, Freiburg, Deutschland
β- Mercaptoethanol Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland
Borsäure Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland
Bromphenolblau/ Xylen Cyanol Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland
CpG Methylase inkl. 10x NEBuffer und S-
Adenosylmethionin
New England BioLabs Inc., Beverly, MA, USA
dNTPs 25 µM ( dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland
DAKO K5005 Detektionssystem für Autostainer DAKO Cytomation, Hamburg, Deutschland
EDTA Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland
Eisessig Merck, Darmstadt, Deutschland
Elektrophorese- Marker Φ X 174 RF DNA/HAE III
Fragments
Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland
Ethanol Merck, Darmstadt, Deutschland
Ethidiumbromid Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland
Formamid 98% Promega, Mannheim, Deutschland
GeneReleaser® BioVentures Inc., Murfreesboro, TN, USA
Gene Ruler 100bp DNA Leiter equimolar Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Glycerol Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland
Glykogen Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland
Harnstoff Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland
HotStarTaq DNA-Polymerase (containing 15mM MgCl2)
inkl. 10x PCR-Puffer
QIAGEN, Hilden, Deutschland
Hydrochinon Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland
Isopropanol Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Mineralöl Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland
NaOH (1M) Merck, Darmstadt, Deutschland
Natriumbisulfit Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland
Orange G Dye Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland
Proteinase K QIAGEN, Hilden, Deutschland
Salzsäure Merck, Darmstadt, Deutschland
Sigmacote (zur Imprägnation der Deckplatte für
Polyacrylamidgele)
Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland
T4 Polynukleotid Kinase (10 U/µl) inkl. 5x Forward
Reaction Puffer
Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland
19
Taq DNA Polymerase(5U/µl) inkl. 10x PCR Puffer und 50
mM MgCl2
TEMED
Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland
Merck, Darmstadt, Deutschland
Trizma Base Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland
Xylen Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland
3.3 Antikörper
Monoclonal Mouse Anti-HumanKi-67 Antigen
Clone MIB-1,Code-Nr. M 7240
DAKO Cytomation, Hamburg, Deutschland
3.4 Kits
Wizard DNA Clean-Up System Promega, Madison, WI, USA
QIAmp DNA Blood Mini Kit (50) QIAGEN, Hilden, Deutschland
DakoREAL™DetectionSystem, Alkaline Phosphatase RED
Rabbit/Mouse Code K5005
DAKO Cytomation, Hamburg, Deutschland
3.5 Verbrauchsmaterialien
KIMWIPES Lite 200 Laborwischtücher Kimberly-Clark, Forchheim, Deutschland
Parafilm Pechiney Plastic Packaging, Menasha, WI, USA
“96 well” PCR Plate Standard PEQLAB, Erlangen, Deutschland
PCR- Platten Omniplate 96 mit Deckel Hybaid, Ashford, Middlesex, England
Pipettenspitzen ohne Filter VWR International, Darmstadt, Deutschland
MµlTIFlex Flat.4mm Tips( Pipettenspitzen zum Beladen
von Polyacrylamidgelen)
Sorenson BioScience, Salt Lake City, UT, USA
Pipettenspitzen mit Filter:
10µl Nerbe plus, Winsen/Luhe, Deutschland
Universalfit Filter Tips 30µl Corning Inc., Corning, NY, USA
PEQGold SafeGuard Filter Tips (200µl) PEQLAB, Erlangen, Deutschland
Aeroject Tips( 1000µl) Ratiolab, Dreieich- Buchschlag, Deutschland
Reaktionsgefässe:
CellStar 50 ml Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland
1,5 ml Reaktionsgefässe Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland
0,5 ml PCR Tubes ultradünn Biozym, Oldendorf, Deutschland
Skalpelle Hammacher, Solingen, Deutschland
Stericup Filtereinheit Millipore, Schwalbach, Deutschland
Stripette 5ml Corning Inc., Corning, NY, USA
Wägepapier MN 266 Macherey-Nagel, Düren, Deutschland
Whatman Chromatografiepapier Whatman International, Maidstone, England
20
3.6 Puffer und Lösungen:
8% Acrylamidlösung
200ml 40 % Acrylamid/Bis Lösung (19:1)
450g Harnstoff (Endkonzentration 7.5M)
50ml 10x TBE-Puffer (Endkonzentrationen 45µM Trizma Base, 45µM Borsäure, 1mM EDTA)
wurden mit Aqua bidest. auf ein Volumen von 1l aufgefüllt, durch Stericup Filtereinheit filtriert und
bei Raumtemperatur lichtgeschützt aufbewahrt.
10% Ammoniumpersulfat (APS)
1g APS wurde in 10ml Aqua bidest. gelöst und als Aliquots zu 1ml bei -20°C aufbewahrt.
10mM dNTP
je 10µl 100mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP wurden gemischt und mit je 60µl Aqua bidest.
verdünnt.
0.5M EDTA, pH 8
93.05g EDTA wurden in etwa 400ml Aqua bidest. aufgelöst; Titrierung des pHs auf 8.0 mithilfe
1M NaOH-Lösung. Das Volumen wurde mit Aqua bidest auf 500ml aufgefüllt.
10mM Hydroquinone
55mg Hydroquinone (Sigma H9003) auf 50ml Aqua bidest., wurde jeweils neu hergestellt.
Loading dye für MSI/ LOH–Analyse (Sigma, B-3269) 9,5ml Formamid 98%
200µl 0.5M EDTA pH 8.0
300µl 1% Bromphenolblau/ Xylen Cyanol (1g BPB mit 1g XC auf 10ml Aqua bidest.)
Mischen
Loading dye wurde als Aliquots zu 1ml bei -20°C aufbewahrt.
Low TE Puffer, pH 7.4 5ml 1M Tris- HCl pH 7.4
100µl 0.5M EDTA pH 8.0
mit 400ml Aqua bidest. gemischt, Titrierung des pH auf 7.4, Auffüllung auf 500ml mit Aqua
bidest., anschließend wurde die Reaktionsmischung durch Stericup Filtereinheit gesaugt.
Low TE Puffer pH 7.4 /Proteinase K (24:1): Proteinase K(10mg/ml) wurde mit Low TE Puffer pH 7.4 im Verhältnis 1:24 verdünnt.
2M NaOH: 5.24ml NaOH (50 %) in 44.76ml Aqua bidest. verdünnt.
3M NaOH: 7.86ml NaOH (50%) in 42.214ml Aqua bidest. verdünnt.
10M NH4Ac: 38.54g in 50ml Aqua bidest. verdünnt.
21
Orange Dye: Für 25ml wurden benötigt:
12.5ml Glycerol
62.5mg Orange G Dye
12.5ml Aqua bidest.
3M Natrium Bisulfite: 1.88g Natrium-Bisulfit (Sigma S9000) pro 5ml Aqua bidest., auf pH 5.0 mit 1M NaOH titriert,
jeweils neu herzustellen.
50x TAE –Puffer
242g Trizma Base, 57.1ml Eisessigsäure und 100ml 0.5 EDTA pH 8.0 wurden mit Aqua bidest. auf
ein Volumen von 1l gebracht.
10x TBE –Puffer
109g Trizma Base (Endkonzentration 0.9M)
55.7g Borsäure (Endkonzentration 0.9M)
40ml 0.5M EDTA pH 8.0 (Endkonzentration 20 mM)
Diese Reagenzien wurden mit Aqua bidest. auf 1l aufgefüllt.
1M Tris-HCl pH 7.4 60.55g Trizma Base wurden in 400ml Aqua bidest. aufgelöst und der pH-Wert mit konzentrierter
HCl auf 7.4 titriert. Das Volumen wurde anschließend mit Aqua bidest auf insgesamt 500ml
gebracht und durch eine Stericup Filtereinheit gesaugt.
3.7 Herstellung einer Positiv–Kontrolle:
Zur Positivkontrolle wurde DNA aus venösem Blut extrahiert. Dies wurde mithilfe des QIAmp
DNA Mini Kit(50) nach Angaben des Herstellers bewerkstelligt. Die Konzentration der extrahierten
DNA wurde mit dem UV/Visible-Spektrophotometer bei 260nm OD bestimmt. Die Flüssigkeits-
menge, die demnach 2µg DNA enthielt, wurde nach folgender Formel berechnet und hergestellt:
abs.260nm * ext.coeff.(= 50 for DNA * 50 for dil factor)= x in µg/ml ; x/1000= µg/µl;
Beispiel: 260 O.D.= 0.018; DNA in µg/ml = 45; in µg/µl= 0.045; benötigte Fl.menge in µl: 2/
0.045= 44.4µl
Diese Menge wurde bis auf 50 µl mit Aqua. dest. aufgefüllt.
22
Methylierung der extrahierten DNA mit CpG-Methylase-Protokoll: Um eine Menge von 25µl methylierter DNA zu erhalten, wurden folgende Reagenzien
hinzupipettiert:
• 2µg genom. DNA 22.5 µl
• 4000U/ml Sss1 Methyltransferase 1.0µl (4U Endaktivität)
(CpG- Methylase)
• 10x NEB Puffer 2.5µl (1x)
• 200x SAM 0.125µl (160µM)
Anschließend wurde die Lösung für 1h bei 37°C und für 20 min bei 65°C inkubiert.
Die methylierte DNA konnte nun bis zu ihrer weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt werden.
3.8 Patienten
3.8.1 Kolon-NET
Das Untersuchungsgut bestand aus 34 niedrig differenzierten, kleinzelligen neuroendokrinen
Karzinomen des Hindgut, die 1984-2005 während der Operationen von 34 Patienten entnommen
wurden. Die Tumoren waren entsprechend ihrer Lokalisation nicht-funktionelle NET.
Die Tumoren wurden für die PCR in 10µm bzw. für die immunhistochemische Untersuchung in
4µm dicken Paraffinschnitten auf Objektträger fixiert. Zudem wurden, zur Unterscheidung von
Tumor- und Normalgewebe bei der Mikrodissektion, noch HE-(Hämatoxlin/Eosin),
ChromograninA- und Synaptophysin-Färbungen mitgeliefert (s. Tab.A und VII im Anhang).
3.8.2 Fore-und Midgut-NET
Diese wurden bereits zuvor in der Arbeitsgruppe (AG Arnold, Universitätsklinikum Freiburg)
molekularbiologisch analysiert und konnten so zum Vergleich herangezogen werden.
Die Fore-und Midgut-NET waren alle gut differenziert und traten sporadisch auf, wie eine
eingängige Prüfung der Familien- und Patientengeschichte, die familiäre Syndrome ausschloss,
feststellte. Sie wurden auch aus Pankreas und Metastasen in der Leber, in Lymphknoten und in der
Niere entnommen. Sie sind in Tab.B im Anhang mit Methylierungsprofil, LOH-und MSI-Analyse
aufgelistet.
23
3.8.3 CRC
Zum Vergleich mit den Kolon-NET wurden die molekularbiologischen Daten von 150 sporadischen
CRC aus dem Labor von Prof. Boland (Dallas, USA) zur Verfügung gestellt.
Diese waren aufgrund ihres MSI-Status ausgesucht worden und stellen somit eine nicht
randomisierte Gruppe dar. Sie werden in Tab.C im Anhang mit CIMP-und MSI-Status aufgeführt.
4 Methoden
4.1 Methylierungsspezifische PCR (MSP)-Methode
4.1.1 Prinzip der MSP
Die MSP ist eine spezifische PCR-Methode zur Detektion methylierter DNA. In den
Promotorregionen methylierter Gene liegen methylierte Cytosingruppen der CpG-Inseln vor (s.
Kap.1.8.6), die Promotorregionen unmethylierter Gene weisen Cytosine ohne Methylgruppe auf.
Letztere werden durch die Bisulfitbehandlung mittels Sulfonierung und Desaminierung in Uracil
umgewandelt. Methyliertes Cytosin wird durch eine Bisulfitbehandlung nicht verändert. Durch die
Konstruktion unterschiedlicher Primer (s. Abb.5) für dasselbe Gen können somit in PCR und
Gelelektrophorese methylierte Gene von unmethylierten spezifisch unterschieden werden.
Probe 1: nicht methylierte DNA Probe 2: methylierte DNA CH3 CH3 CH3
l l l 5’-...CGAATACGACGT-...3’ 5’-...CGAATACGACGT-...3’
Bisulfitbehandlung
CH3 CH3 CH3 l l l
5’-...UGAATAUGAUGT-... 3’ 5’-...CGAATACGACGT-...3’
PCR mit spezifischen Primern PCR mit spezifischen Primern spezifisches PCR-Produkt ▼ ▼
Abb.5: Prinzip der MSP *Quelle: A. Sosnowski: Inaugural-Dissertation (2005): Die Bedeutung genetischer und epigenetischer Mechanismen für die Patho-genese neuroendokriner Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems
24
4.1.2 Mikrodissektion:
Das in Paraffin eingebettete Gewebe, aus dem die DNA extrahiert wurde, wurde mittels sterilem
Skalpell unter dem Lichtmikroskop vom Objektträger mikrodisseziert. Hierzu wurden die 10µm
Schnitte des Tumors verwendet. Zur Unterscheidung von Tumor-und Normalgewebe bediente man
sich mitgelieferter HE-, ChromograninA- und Synaptophysin-gefärbter Schnitte.
Das mikrodissezierte Gewebe wurde für 15min in je 150µl Xylen bei Raumtemperatur inkubiert.
Danach wurden 350µl –20°C kaltes 100% Ethanol zu jeder Probe hinzugefügt und bei 4°C für
20min bei 13.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und den Pellets erneut 50µl
Xylen und 500µl -20°C kaltes 100% Ethanol hinzugefügt. Es folgte eine weitere Zentrifugation
unter den gleichen Bedingungen. Anschließend wurde der Überstand abgenommen und die Pellets
bei Raumtemperatur oder im Heizblock bei 37°C getrocknet. Diese stehen nun zur Weiter-
verarbeitung, entweder für die MSP-Analyse oder die MSI-Analyse zur Verfügung.
4.1.3 DNA-Extraktion für MSP-Analyse:
Zu den unter 4.1.2 genannten Pellets wurde je 30µl TE/Proteinase K (24:1) hinzugefügt, mit einer
Mineralölschicht bedeckt und für 24 Stunden bei 55°C inkubiert. Am darauf folgenden Tag wurden
weitere 30µl TE/Proteinase K (24:1) hinzugefügt und für 24 Stunden bei 37°C inkubiert.
Im Anschluss daran wurde die Mineralölschicht abpipettiert und die DNA mithilfe des Wizard
Clean Up System (Promega Extraction Kit) nach Angaben des Herstellers gereinigt und war nun für
die Bisulfitbehandlung gebrauchsfertig.
4.1.4 Bisulfitbehandlung
Für jede Behandlung mussten folgende Lösungen frisch zubereitet werden:
• 10mM Hydroquinon
• 3M Natriumbisulfitlösung, einzusehen im Abschnitt 3.6: „Puffer und Lösungen“.
Um Einzelstrang-DNA zu erhalten, wurden zu jeder DNA-Probe 5,5µl 2M NaOH hinzugefügt und
dies bei 37°C für 10min inkubiert. Anschließend wurden 30µl 10mM Hydroquinon und 520µl 3M
Natriumbisulfit hinzugefügt, um zuerst Cytosin zu Cytosinbisulfit zu sulfonieren und es dann in
Reaktion mit Wasser zu Uracilbisulfit zu desaminieren. Die Probe wurde mit Mineralöl bedeckt und
für maximal 16-18 Stunden bei 50°C inkubiert. Darauf wurden die Proben mithilfe des DNA-
Wizard Clean Up-Systems gereinigt, um danach die DNA (50µl) mit je 5,5µl 3M NaOH für 5min
bei Raumtemperatur zu desulfonieren. Als Träger wurde 1µl Glykogen hinzugegeben. Zur
Neutralisierung erfolgte eine Gabe von 33µl 10M Ammoniumacetat und zur DNA-Fällung eine
Gabe von 300µl 100% Ethanol.
25
Die Präzipitation der DNA erfolgte entweder über Nacht bei -20°C oder für 1.5h bei -80°C. Daran
schloss sich eine 30minütige Zentrifugation bei 4°C an mit Entfernung des Überstands. Wieder
wurden 300µl 100% Ethanol zum Waschen hinzugefügt und für 30min bei 4°C zentrifugiert. Der
Überstand wurde abgenommen und die Pellets bei Raumtemperatur getrocknet. Es folgte eine
Resuspension in, je nach DNA-Menge, 20-30µl 65°C heißem Aqua bidest.
4.1.5 PCR
4.1.5.1 MSP-PCR- Protokoll unter Verwendung von HotStarTaqPolymerase (Quiagen)
Jede DNA-Probe wurde mit spezifischen Primern einmal für das methylierte und einmal für das
unmethylierte Gen untersucht. Daher wurde ein zweifacher Mastermix angelegt, in folgender
Zusammenstellung, wie für das Kit empfohlen:
Mastermix: (unmethyliert/ methyliert)
für eine Probe:
2.5µl 10x PCR-Puffer (15mM MgCl2)
0.8µl Forward-Primer (10pmol/µl)
0.8µl Backward-Primer (10pmol/µl)
0.5µl dNTPs (10mM)
19µl Aqua bidest
0.25µl HotStarTaqPolymerase (5U/µl)
Je Well wurden 2.5µl DNA und 22.5µl Mastermix zusammenpipettiert und mit Mineralöl bedeckt.
Die Leerprobe war reiner Mastermix. Anschließend wurde das entsprechende Programm
durchlaufen, wie es die unten in Tabellen aufgeführten Bedingungen zeigen (Tab.2).
4.1.5.2 Primer
Die meisten Primersequenzen (p16, HIC 1, APC, hMLH1, RASSF1A, TIMP3, MGMT) für die MSP
waren bekannt oder wurden aus geeigneten Literaturstellen entnommen. Die MEN1-Primer
(Men1Exon, Men1 Promotor) wurden bereits zuvor von der Arbeitsgruppe entworfen (s. 4.3).
Die Primersequenzen für die MSI-und LOH-Marker sind in der NCBI-Datenbank erfasst
(„UniSTS“). Die Primer wurden von der Firma Hermann GbR, Freiburg, synthetisiert.
26
Tabelle 2: Gene, Primer und PCR-Bedingungen für die MSP- Analyse
GEN APC Promotor 1A
Unmethyliert Methyliert
PRIMER [38] sense 5'-AATTTGTTGGATGTGGATTAGGGT-3' 5'-CGTTGGATGCGGATTAGGGC-3'
antisense 5'-AACCTCATATCAATCACATACA-3' 5'-CCTCATATCGATCACGTACG-3'
Größe 89 bp 84 bp
PCR-Bedingungen Temperatur Inkubationsdauer Temperatur Inkubationsdauer
Initiale Denaturierung 95 °C 15 min 95 °C 15 min
Denaturierung 92 °C 30 s 92 °C 30 s
Annealing 56 °C 45 s 58 °C 45 s
Elongation 72 °C 45 s 72 °C 45 s
Anzahl der Zyklen 50 50
Abschließende Elongation 72 °C 10 min 72 °C 10 min
GEN p16
Unmethyliert methyliert
PRIMER [75] sense 5'-TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3' 5'-TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3'
antisense 5'-CAACCCCAAACCACAACCATAA-3' 5'-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3'
Größe 151 bp 150 bp
PCR-Bedingungen Temperatur Inkubationsdauer Temperatur Inkubationsdauer
Initiale Denaturierung 95 °C 5 min 95 °C 5 min
Denaturierung 92 °C 30 s 92 °C 30 s
Annealing 60 °C 30 s 62 °C 30 s
Elongation 72 °C 30 s 72 °C 30 s
Anzahl der Zyklen 60 60
Abschließende Elongation 72 °C 10 min 72 °C 10 min
GEN RASSF1A
Unmethyliert methyliert
PRIMER [103] sense 5'-TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG-3' 5'-GTGTTAACGCGTTGCGTATC-3'
antisense 5'-CAAACCCCACAAACTAAAAACAA-3' 5'-AACCCCGCGAACTAAAAACGA-3'
Größe 105 bp 93 bp
PCR-Bedingungen Temperatur Inkubationsdauer Temperatur Inkubationsdauer
Initiale Denaturierung 94 °C 5 min wie unmethyliert
Denaturierung 94 °C 30 s wie unmethyliert
Annealing 60 °C 30 s wie unmethyliert
Elongation 72 °C 30 s wie unmethyliert
Anzahl der Zyklen 60 wie unmethyliert
Abschließende Elongation 72 °C 10 min wie unmethyliert
27
GEN hMLH1 Region A
Unmethyliert Methyliert
PRIMER [10] sense 5'-TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT-3' 5'-ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC-3'
antisense 5'-ACCACCTCATCATAACTACCCACA-3' 5'-CCTCATCGTAACTACCCGCG-3'
Größe 124 bp 115 bp
PCR-Bedingungen Temperatur Inkubationsdauer Temperatur Inkubationsdauer
Initiale Denaturierung 95 °C 5 min 95 °C 5 min
Denaturierung 95 °C 30 s 95 °C 30 s
Annealing 58 °C 30 s 62 °C 30 s
Elongation 72 °C 30 s 72 °C 30 s
Anzahl der Zyklen 70 70
Abschließende Elongation 72 °C 10 min 72 °C 10 min
GEN HIC-1
unmethyliert Methyliert
PRIMER [10] sense 5'-TTGGGTTTGGTTTTTGTGTTTTG-3' 5'-TCGGTTTTCGCGTTTTGTTCGT-3'
antisense 5'-CACCCTAACACCACCCTAAC-3' 5'-AACCGAAAACTATCAACCCTCG-3'
Größe 116 bp 97 bp
PCR-Bedingungen Temperatur Inkubationsdauer Temperatur Inkubationsdauer
Initiale Denaturierung 94 °C 15 min wie unmethyliert
Denaturierung 94 °C 30 s wie unmethyliert
Annealing 62 °C 30 s wie unmethyliert
Elongation 72 °C 30 s wie unmethyliert
Anzahl der Zyklen 70 wie unmethyliert
Abschließende Elongation 72 °C 10 min wie unmethyliert
GEN TIMP-3
unmethyliert Methyliert
PRIMER [17] sense 5'-TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT-3' 5'-CGTTTCGTTATTTTTTGTTTTCGGTTTC-3'
antisense 5'-CCCCCAAAAACCCCACCTCA-3' 5'-CCGAAAACCCCGCCTCG-3'
Größe 122 bp 116 bp
PCR-Bedingungen Temperatur Inkubationsdauer Temperatur Inkubationsdauer
Initiale Denaturierung 95 °C 20 min wie unmethyliert
Denaturierung 94 °C 45 s wie unmethyliert
Annealing 59 °C 1 min 58°C 45 s
Elongation 72 °C 1 min wie unmethyliert
Anzahl der Zyklen 60 wie unmethyliert
Abschließende Elongation 72 °C 10 min wie unmethyliert
GEN MEN1 Exon 2
Unmethyliert Methyliert
PRIMER sense 5'-TTGGTTTGTTTTGTAGGTTGTTGT-3' 5'-GGTTTGTTTTGTAGGTCGTCGT-3'
antisense 5'-ACTCCTCTCAACCCAACTCAAC-3' 5'-ACTCCTCTCGACCCAACTCGAC-3'
Größe 133 bp 131 bp
PCR-Bedingungen Temperatur Inkubationsdauer Temperatur Inkubationsdauer
Initiale Denaturierung 95 °C 15 min wie unmethyliert
Denaturierung 94 °C 45 s wie unmethyliert
Annealing 62 °C 45 s wie unmethyliert
Elongation 72 °C 45 s wie unmethyliert
Anzahl der Zyklen 70 wie unmethyliert
Abschließende Elongation 72 °C 10 min wie unmethyliert
28
GEN MEN1 Promotor
Unmethyliert Methyliert
PRIMER sense 5'-AGAAGTTTGGTGATTTTTTATTTTG-3' 5'-GTTCGGCGATTTTTTATTTCGA-3'
antisense 5'-TAACCCTTCCCTTCAAACCAAC-3' 5'-TAACCCTTCCCTTCAAACCGAC-3'
Größe 111 bp 107 bp
PCR-Bedingungen Temperatur Inkubationsdauer Temperatur Inkubationsdauer
Initiale Denaturierung 94 °C 5 min wie unmehtyliert
Denaturierung 94 °C 30 s wie unmehtyliert
Annealing 60 °C 30 s wie unmehtyliert
Elongation 72 °C 30 s wie unmehtyliert
Anzahl der Zyklen 70 wie unmehtyliert
Abschließende Elongation 72 °C 10 min wie unmehtyliert
GEN MGMT
unmethyliert Methyliert
PRIMER [43] sense 5'-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3' 5'-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3'
antisense 5'-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA-3' 5'-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3'
Größe 93 bp 81 bp
PCR-Bedingungen Temperatur Inkubationsdauer Temperatur Inkubationsdauer
Initiale Denaturierung 94 °C 15 min wie unmethyliert
Denaturierung 94 °C 45 s 94 °C 30s
Annealing 57 °C 45 s 56 °C 30s
Elongation 72 °C 45 s 72 °C 30s
Anzahl der Zyklen 60 wie unmethyliert
Abschließende Elongation 72 °C 10 min wie unmethyliert
4.1.5.3 MEN1 Primerdesign
Die MEN1-Primer wurden bereits zuvor von der Arbeitsgruppe entworfen: Die Basensequenz von
MEN1 wurde der NCBI GenBank (Zugangsnummer U93237) auf der Internetseite
„www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=1945388“ entnommen. Die ersten
2.500 Basen wurden in ein Programm zum Entwerfen methylierungsspezifischer Primer eingegeben
(www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi). Von den auf diese Weise ermittelten
Primern wurde ein Set ausgewählt, das einen Abschnitt kurz vor Exon1 amplifiziert (1550 bis
1656), an dem der MEN1-Promotor vermutet wird [176]. Es wurde ein weiteres Set ausgesucht, das
eine Sequenz in Exon2 (2250 bis 2381), das reich an CpG-Dinukleotiden ist, amplifiziert, da Exon1
nicht transkribiert wird.
(www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Genes/MEN1ID148.html).
4.1.6 Gelelektrophorese:
Zur Auftrennung der amplifizierten DNA wurde ein 2,5% Agarosegel, das mit dem unter UV-Licht
fluoreszierenden Farbstoff Ethidiumbromid vermischt war, gegossen. Ethidiumbromid besitzt die
Eigenschaft mit doppelsträngiger DNA zu interkalieren und kann unter UV-Transillumination
sichtbar gemacht werden.
29
4.2 MSI- und LOH-Analyse
4.2.1 DNA-Extraktion für die MSI- und LOH-Analyse:
Zu den unter 4.1.2 genannten Pellets wurden je 30µl GeneReleaser hinzugefügt, und unter
folgendem Programm im Thermocycler inkubiert:
Schritt Zeit Temperatur
1 30 s 65 ° C
2 30 s 8 ° C
3 90 s 65 ° C
4 3min 97 ° C
5 1min 8 ° C
6 3min 65 ° C
7 1min 97 ° C
8 1min 65 ° C
Im Anschluss daran wurden je 25µl TE/ Proteinase K (24:1) hinzupipettiert, mit Mineralöl bedeckt
und wie folgt inkubiert:
Schritt Zeit Temperatur
1 54 h 55 ° C
2 15min 95 ° C
Die DNA ist gebrauchsfertig und kann bis zu ihrer weiteren Verwendung bei -20°C gelagert
werden.
4.2.2 Endlabeln eines Primers
Anfänglich wurde jeweils ein Primer durch Phosphorylierung mit 32P radioaktiv markiert:
1µl 5x Forward Reaction Puffer
1µl Forward Primer (10pmol/µl)
1µl T4 Polynukleotid Kinase (10U/µl)
Nach Vortexen und Herunterzentrifugieren wurden 2µl [γ-32P] ATP (10µCi/ml) hinzugefügt und
die Mischung, nach Vortexen und Herunterzentrifugieren, für 1h bei 37°C inkubiert und
anschließend für 15min bei 95°C denaturiert.
4.2.3 Endlabeln des Elektrophoresemarkers
Als Elektrophoresemarker diente Φ X174 RF DNA/HAE III Fragments. Sein Endlabeling erfolgte
folgendermaßen:
1µl Forward Reaction Puffer
3µl Marker (Φ X174)
1µl T4 Polynukleotid Kinase (10U/µl)
30
Nach Vortexen und Zentrifugieren wurden 1µl [γ- 32 P] ATP (10mCi/ml) hinzupipettiert, vermischt
und für 1h bei 37°C inkubiert und für 15min bei 95°C denaturiert. Dann wurden 5µl Aqua bidest.
sowie 10µl MSI- Loading dye hinzugegeben.
4.2.4 PCR
Herstellung des Mastermixes (pro Marker)
Volumina Konzentration in der PCR
12µl MgCl2 (50mM) 1.5µM
40µl 10x PCR Puffer 1x
8µl 10mM dNTPs 200µM
94µl Aqua bidest.
Diese insgesamt 154µl sowie 1µl Backwardprimer (0.025µM) wurden zu dem bereits radioaktiv
markierten Primer pipettiert. Nach abschließendem Vortexen und Zentrifugieren konnte der
Mastermix bei -20°C ca. eine Woche gelagert werden.
Für die PCR wurden pro 2µl DNA-Probe 2.4µl Mastermix und 0.06µl Taq DNA-Polymerase
(5U/µl) geladen.
4.2.4.1 PCR-Bedingungen
Es wurden folgende Marker verwendet:
Marker Lokalisation im Bereich von
BAT25 Intron von c-kit [Chr. 4q12]
BAT26 Intron5 von hMSH2 [Chr. 2p16]
D2S123 hMSH2 [Chr. 2p16]
D5S346 APC
D11S913 MEN1
D17S250 p53 [Chr. 17p13]
RH94067 APC
BAT25 und BAT26 sind Mononukleotidmarker, d.h. sie sind in der Regel monomorph. Sie setzen
sich aus Poly(A)- Sequenzen zusammen, die nur geringen Längenvariationen unterliegen
[77,90,178].
Alle anderen Marker sind polymorph, so dass pro Tumor auch immer die korrespondierende
Normal-DNA zum Vergleich untersucht werden musste. D2S123 setzt sich aus einer Wiederholung
der Basen (AC)13AT(AC)15 zusammen und D17S250 aus (AC)25.
31
Um den MSI-Status von Tumoren entsprechend der Richtlinien des National Cancer Institutes zu
bestimmen, wurden folgende 5 Marker verwendet [25]: BAT25, BAT26, D2S123, D5S346,
D17S250. An allen Markern, außer BAT25 und BAT26, ließen sich zudem auch Allelverluste
(LOH) untersuchen.
Tab.3: MSI Marker BAT 25[119]
Primer sense antisense
5’- TCG CCT CCA AGA ATG TAA GT -3’ 5’- TCT GCA TTT TAA CTA TGG CTC- 3’
Größe des PCR-Produktes 90 bp PCR-Bedingungen Initiale Denaturierung Denaturierung Annealing Elongation Anzahl der Zyklen Abschließende Elongation
Temperatur Inkubationsdauer 95 ° C 3 min
95 ° C 30 s
50 ° C 1 min
72 ° C 1 min
35 *
72 ° C 10 min
Marker BAT 26[119]
Primer sense antisense
5’ - TGA CTA CTT TTG ACT TCA GCC- 3’ 5’ - AAC CAT TCA ACA TTT TTA ACC C-3’
Größe des PCR-Produktes 86 – 100 bp
PCR-Bedingungen Initiale Denaturierung Denaturierung Annealing Elongation Anzahl der Zyklen Abschließende Elongation
Temperatur Inkubationsdauer wie BAT 25
wie BAT 25
wie BAT25
wie BAT 25
wie BAT25*
wie BAT25
* am 9.11.06 wurde die Zyklenzahl auf 50 erhöht, dies betrifft nur Tumore 8cc, 20- 26cc
Marker D2S123( UniSTS-Nr.888)
Primer sense antisense
5’ – AAACAGGATGCCTGCCTTTA- 3’ 5’- GGACTTTCCACCTATGGGAC-3’
Größe des PCR-Produktes 197- 227 bp PCR-Bedingungen Initiale Denaturierung Denaturierung Annealing Elongation Anzahl der Zyklen Abschließende Elongation
Temperatur Inkubationsdauer 94 ° C 3 min 94 ° C 40 s 50 ° C 2 min 72 ° C 2 min 40 72 ° C 10 min
32
Marker D5S346(UniSTS-Nr.146926)
Primer sense antisense
5’ – ACTCACTCTAGTGATAAATCGGG-3’ 5’ – AGCAGATAAGACAGTATTACTAGTT- 3’
Größe des PCR-Produktes 96 bp
PCR-Bedingungen Initiale Denaturierung Denaturierung Annealing Elongation Anzahl der Zyklen Abschließende Elongation
Temperatur Inkubationsdauer 94 °C 3 min 94 ° C 1 min 55 ° C 2 min 72 ° C 2 min 35 72 ° C 10 min
Marker D17S250[abgewandeltes Primerset]
Primer sense antisense
5’ – AAGAGCTGAGACTCCATCTC- 3’ 5’ –ACAGCTCCTTTAATGGCAGG- 3’
Größe des PCR-Produktes 150 bp
PCR-Bedingungen Initiale Denaturierung Denaturierung Annealing Elongation Anzahl der Zyklen Abschließende Elongation
Temperatur Inkubationsdauer 94 ° C 3 min 94 ° C 30 s 50 ° C 1 min 72 ° C 1 min 40 72 ° C 10 min
Tab.4: LOH
Marker D11S913( UniSTS-Nr. 2112)
Primer sense antisense
5’- AAATGGAAGAAACAAAAGCC-3’ 5’- CCTGGTTAATCTCTCATTAATCC-3'
Größe des PCR-Produktes 104 bp
PCR-Bedingungen Initiale Denaturierung Denaturierung Annealing Elongation Anzahl der Zyklen Abschließende Elongation
Temperatur Inkubationsdauer 94 ° C 3 min 94 ° C 30s 50 ° C 30s 72 ° C 30s 50 72 ° C 10 min
Marker RH94067(UniSTS-Nr.85831)
Primer sense antisense
5’- ATGCATGTATCATCAGTCACCC-3’ 5’- GTCCCCTTATACAGTGGAGGG-3’
Größe des PCR-Produktes 135 bp
PCR-Bedingungen Initiale Denaturierung Denaturierung Annealing Elongation Anzahl der Zyklen Abschließende Elongation
Temperatur Inkubationsdauer 94 ° C 3 min 95 ° C 45s 52 ° C 45s 72 ° C 45s 50 72 ° C 10 min
33
4.2.5 Polyacrylamid-Gelelektrophorese:
Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte auf einem denaturierendem 8% Polyacrylamidgel, das
aus 25ml 8% Acrylamidgellösung, 19µl TEMED zur Quervernetzung und 125µl APS zum Starten
der Reaktion hergestellt wurde. Im Anschluss an die PCR wurden die DNA-Proben zur Spaltung
der Doppelstränge mit jeweils 3µl LOH/MSI-Loading Dye für 10min bei 95°C erhitzt und dann auf
Eis gekühlt, um die Denaturierung aufrechtzuerhalten. Es erfolgte die Auftragung von je 2µl PCR-
Produkt und 4µl des Elektrophoresemarkers Φ X174 RF DNA/HAE III Fragments als Größenleiter
auf das Gel mithilfe der Spezialpipetten MµlTIFlex Flat.4mm Tips.
Die Elektrophorese wurde bei 30W je Glasplatte bei maximaler Spannung von 1000V und
maximaler Stromstärke von 100mA im BaseRunner200 durchgeführt. Je nach Größe der PCR-
Produkte wurde sie beendet. Nach der Trocknung wurde das Gel mit einem unbelichteten Film in
einer Röntgenkassette für mehrere Stunden autoradiografiert.
MSI wurde bestätigt, wenn sich eine Bandenverschiebung gegenüber der Normalgewebe- DNA
zeigte. LOH wurde bestätigt, wenn die Intensität eines Tumorallels um 50% reduziert war im
Vergleich zu Normalgewebe- DNA.
4.3 Ki-67 Färbung
Zur Ermittlung des Proliferationsgrades der GEP-NET wurde der Proliferationsmarker Ki-67
mittels Immunhistochemie (IHC) bestimmt. Dazu wurde der monoklonale Antikörper MIB-1 zur
Erkennung des im Nukleus lokalisierten Proteins Ki-67 verwendet (s. 1.9). Es wurde das DAKO
M7240 Kit und das DAKO K5005 Detektionssystem für Autostainer angewandt:
Die Paraffinschnitte wurden entsprechend Herstellerangaben für die hitzeinduzierte
Epitopdemaskierung (HIER) bei pH 6 im Dampfgarer vorbereitet. Durch die Demaskierung sollten
die durch die Fixierung für den primären Antikörper unkenntlich gemachten Epitope offengelegt
werden. Nun wurde der MIB-1-Antikörper in 2000facher Verdünnung dazugegeben. Es kam ein
indirektes Streptavidin-Biotin-Verfahren zur Anwendung, bei dem der sekundäre Antikörper über
Streptavidin mit zugegebener alkalischer Phosphatase in Verbindung tritt. Diese löst bei
Anwesenheit von Chromogen RED eine rote Farbreaktion der betroffenen Zellkerne aus.
Zur Gegenfärbung der normalen Zellkerne wurde eine HE-Färbung (Hämalaun nach Mayer)
durchgeführt (blaues Endprodukt). Die Zahl der für Ki-67 angefärbten Zellkerne wurde unter dem
Lichtmikroskop in mehreren Gesichtsfeldern mit 25facher Vergrößerung betrachtet und
ausgewertet.
34
4.4 Statistische Methoden
Wurden zwei Gruppen bezüglich eines Merkmals verglichen, kam der χ2-Vierfeldertest mit
Stetigkeitskorrektur zur Anwendung. Wurden drei Gruppen bezüglich eines Merkmals verglichen,
wurde der χ2-Test für Kontingenztafeln verwendet.
Der Fisher`s Exact Test wurde zur Kontrolle der ermittelten p-Werte angewendet, wenn die
Gesamtzahl der verglichenen Tumoren kleiner als 40 bzw. wenn die erwartete Häufigkeit innerhalb
einer Vierfeldertafel kleiner als 5 war.
Für die Berechnung des Zusammenhangs zwischen der Methylierung bestimmter Gene und dem
Status des Tumors wurde der ‚Binary logit–Test’ und der ‚Cumulative logit-Test’ angewandt (s.
5.7.5.2). Der Mantel-Haenszel-Test diente der Berechnung von Signifikanzen bezüglich linearer
Trends (s. 5.7.6). Bei allen Tests wurde ein p-Wert <0.05 als statistisch signifikant betrachtet.
Als ‚Nachbeobachtungszeit’ war in dieser Studie die Zeit definiert, die zwischen Erstdiagnose des
Tumors und Tod bzw. Ausscheiden des Patienten aus der Beobachtung verstrich. Als definitives
Ende der Nachbeobachtung wurde bei den Kolon-NET der Zeitpunkt August 2006 gesetzt.
Entsprechend wurde der Status der Patienten zu diesem Zeitpunkt in die Berechnungen
aufgenommen (lebend oder verstorben). Als ‚Überlebenszeit’ wurde die Zeit definiert, die zwischen
Erstdiagnose und Tod des Patienten verstrich.
Zur Berechnung der Überlebenszeiten wurde die Kaplan-Meier-Methode angewandt. Der
anschließende Logranktest verglich zwei oder mehr nach der Kaplan-Meier-Methode berechnete
Überlebenskurven auf signifikante Unterschiede. Die berechneten Überlebenszeiten wurden durch
untere und, wenn vorhanden, obere Grenzen des 95% Konfidenzintervalls (KI) umgeben.
Manchmal konnte keine obere Grenze des 95% KI gebildet werden, da einige Patienten über den
Beobachtungszeitraum hinaus überlebten. Auch konnte insgesamt keine mittlere Überlebenszeit
gebildet werden, wenn mehr als 50% der Patienten über den Beobachtungszeitraum hinaus lebten.
Nicht berechenbare oder nicht erhobene Daten werden nicht nochmals explizit als fehlend im
Ergebnisteil erwähnt. Die mediane Überlebenszeit zeigt die Zeit auf, innerhalb der die Hälfte der
Patienten (in absoluten Zahlen) verstorben ist. Diese Angabe ist natürlich nicht möglich bei
Gruppen, deren Patienten zu mehr als die Hälfte über den Beobachtungszeitraum überleben.
Die Überlebenszeit-Analysen waren univariat (Cox-Regression), wenn zwei Überlebenskurven
bezüglich eines Merkmals, z.B. CIMP-Status, Tumorgruppe oder Ki-67-Index, im Logranktest
verglichen wurden (z.B. 5.8.3). Eine multivariate Analyse wurde zur Feststellung eines
prognostischen Faktors für das Überleben durchgeführt. Hierbei wurden alle vier möglichen
Prädiktoren (Tumorgruppe, LOH-Status, CIMP-Status, Ki-67-Index) verglichen. Durch
schrittweises Ausschließen (logistische-Regression) einzelner Faktoren konnte ein statistisch
35
signifikanter (p<0.05 likelihood ratio) prognostischer Faktor für das Überleben ermittelt werden (s.
5.8.5).
Als Datenanalyseprogramm diente SAS 9.1. Alle statistischen Auswertungen dieser Studie wurden
freundlicherweise von Herrn Prof. Dr. Schulte-Mönting vom Institut für Biometrie und
Medizinische Informatik, Freiburg, durchgeführt.
36
37
5 Ergebnisse
5.1 MSI-Analyse
Von 34 Tumoren konnten 25 auf MSI untersucht werden. Es werden mikrosatellitenstabile (MSS),
geringgradig mikrosatelliteninstabile (MSI-L) und hochgradig mikrosatelliteninstabile (MSI-H)
Tumoren unterschieden. Tumoren mit einem instabilen Marker werden als MSI-L eingestuft,
Tumoren mit zwei oder mehr instabilen Markern als MSI-H [25]. Bei den untersuchten Tumoren
war einer MSI-H (4%, 1/25) und 5 MSI-L (20%, 5/25). MSS waren 76% der Tumoren (19/25). Eine
Übersicht über MSI gibt Abb.6:
76%
20%
4%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Pro
zent
MSS MSI-L MSI-H
MSI bei Kolon-NET
Abb.6 Eine MSI war mindestens einmal an jedem der genannten fünf Marker des NCI vorhanden.
5.2 LOH- Analyse
Von allen Kolon-NET ließen sich 27 auf Allelverluste untersuchen. Davon konnte bei 10 Tumoren
LOH mindestens an einem Marker festgestellt werden (10/27, 37%). Ein Tumor (Nr.12cc) wies 3
Allelverluste an D2S123, PYGM und RH94067 auf. Ein weiterer Tumor (Nr.13cc) wies LOH an
D17S250 und PYGM auf, ein anderer (14T) zeigte Allelverluste an D5S346 und D11S913.
Die Häufigkeit der einzelnen Allelverluste ist in Tab.5 und 6 wiedergegeben.
Marker LOH In Prozent
D2S123 1/27 4%
D5S346 1/27 4%
D17S250 3/27 11%
D11S913 5/27 19%
PYGM 2/27 7%
RH94067 2/27 7%
Gen LOH In Prozent
hMSH2 1/27 4%
APC 3/27 11%
p53 3/27 11%
MEN1 7/27 26%
38
Am häufigsten wurden Allelverluste am oder in der Nähe des MEN-1-Lokus gefunden (26%,
D11S913 und PYGM), gefolgt von p53 und APC (jeweils 11%) und hMSH2 (4%).
Eine graphische Übersicht geben Abb.7 und Abb.8:
0%5%
10%15%20%25%
30%35%40%
Häu
figke
it vo
n LO
H
D2S123D5S346D17S250D11S913PYGMRH94067 alleMarker
Marker
LOH
Abb.7 Allelverluste pro Marker
4%
11% 11%
26%
37%
0%5%
10%15%20%25%30%35%40%
Häu
figke
it vo
n LO
H
hMSH2 APC p53 MEN1 alleMarker
Markerlokalisation
LOH
Abb.8 Allelverluste je Genlokalisation N T
7cc
D17S250
Abb.9 zeigt ein Beispiel eines LOH-Ergebnisses. Der Pfeil zeigt die fehlende Bande im Tumorgewebe (T) an und markiert damit den Allelverlust gegenüber dem Normalgewebe (N) am Marker D17S250.
39
5.3 MSP-Analyse
Bei der MSP ließen sich alle 34 untersuchten Tumoren amplifizieren. Keines der 8 untersuchten
Gene war ausschließlich unmethyliert. Am häufigsten waren die Promotoren von HIC1, MEN1 und
APC mit 59% (16/27), 48% (15/31) und 46% (15/33) methyliert, wobei der MEN1-Promotor zu
50% (14/28), Exon2 des MEN1-Gens zu 7% (2/29) methyliert war. Die geringste
Methylierungshäufigkeit fand sich bei TIMP3 mit 9% (3/32). Tab.7 weist die
Methylierungshäufigkeit aller 8 Gene auf:
Gen Methyliert In Prozent
TIMP3 3/32 9%
hMLH1 4/32 13%
p16 8/30 27%
MGMT 13/31 42%
RASSF1A 13/29 45%
APC 15/33 46%
MEN-1 15/31 48%
HIC-1 16/27 59%
Tab.7
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
3/32 4/32 8/30 13/31 13/29 15/33 15/31 16/27
TIMP3 hMLH1 p16 MGMTRASSF1A APC MEN 1 HIC 1
Häufigkeit der Genmethylierung
Methylierungsprofil der Kolon-NET
Abb.10 zeigt die Methylierungshäufigkeit der verschiedenen Gene.
40
U M U M U
12 cc 13cc 14cc
Abb.6.1 APC-Gen
M
Abb.6.2 Positivkontrolle Nr.2
U M U M
6T 7T
Abb.6.3 HIC1-Gen
U M
Abb.6.4 Positivkontrolle Nr.1
U M U M
8cc 10cc
Abb.6.5 hMLH1-Gen
U M U M
Nr.1 Nr.2
Abb.6.6 Positivkontrolle
U U U M
7T 8T Nr 1
Abb.6.7 MEN1 Exon2 und
Positivkontrolle Nr.1
s. Abb.6.7
U M U
5cc 6cc
Abb.6.9 MEN1 Promotor
U M
Nr.1
Abb.6.10 Positivkontrolle
41
U M U M M
18cc 19cc Nr.2
Abb.6.11 MGMT-Gen und
Positivkontrolle Nr.2
s.Abb.6.11
U U M
9cc 10cc
Abb.6.13 p16 -Gen
M
Abb.6.14 Positivkontrolle Nr.1
U U M
20cc 25cc
Abb.6.15 RASSF1A-Gen
U M
Abb.6.16 Positivkontrolle Nr.3
U U M
1cc 2cc
Abb.6.17 TIMP3-Gen
U M
Abb.6.18 Positivkontrolle Nr.2
Abb.11 zeigt Beispiele von PCR-Produkten der MSP-Analyse. Die Größen der PCR-Produkte sind in Kap.4, Tab.2 aufgelistet. Als Positivkontrolle diente nach dem Sss1-Protokoll methylierte DNA aus venösem Blut, als Negativprobe wurde H2O verwendet (Kap.3.7).
5.4 CIMP
Da die Mindestzahl methylierter Gene für CIMP nicht einheitlich definiert ist, galt in dieser
Untersuchung ein Tumor als CIMP-positiv, wenn ≥3 von 8 Genen methyliert waren. Beim CRC
bestand CIMP, wenn 2 von 6 untersuchten Genen methyliert waren [62].
Diesen Phänotyp wiesen 65% (20/31) der Kolon-NET auf. Bei 3 von 34 untersuchten Tumoren
gelang die Analyse des CIMP-Status nicht (s. Anhang Tab.A1: Tumoren 18T, 23cc, 24cc).
42
5.5 Genmethylierung
Es zeigte sich, dass jeweils 29% (9/31) der Tumoren an 3 oder 4 Genen methyliert waren und in 2
Fällen (6.5%) eine aberrante Genmethylierung, bei der 6 oder mehr Gene betroffen waren, bestand.
Bei 13% (4/31) bestand keine Methylierung. Zur Übersicht Tab. 8:
Anzahl der
methylierten
Gene
n
%
0 4/31 13%
1 4/31 13%
2 3/31 10%
3 9/31 29%
4 9/31 29%
5 0/31 0%
6 1/31 3%
7 1/31 3%
Tab.8
5.6 Ki-67-Analyse
Nach Auswertung der Ki-67-Färbungen, konnten die Tumoren entsprechend der WHO-
Klassifikation von 2000 [93,144] den 3 Kategorien des Ki-67-Indexes zugeordnet werden: Tumoren
mit Ki-67-Anfärbung der Zellkerne < 2%, 2-29% und >29%. Bei den Kolon-NET hatten 6% (2/34)
der Tumoren einen Ki-67-Index von <2%, 9% (3/34) einen Ki-67-Index von 2-29% und 85%
(29/34) waren zu >29% Ki-67-positiv (Tab.9):
Ki-67-Index Ki-67 <2% Ki-67 2- 29 % Ki-67 <29%
% der Kolon-NET 6% (2/34) 9% (3/34) 85% (29/34)
Tab.9
6% 9%
85%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Häu
figke
it de
r K
i67-
Kat
egor
ie
Ki67<2% Ki67>2-29% Ki67> 29%
Ki67-Kategorie
Ki67-Proliferationsindex
Abb.12 Ki-67-Index-Verteilung bei Kolon-NET
43
5.7 Vergleich der Tumorgruppen
5.7.1.1 Fore- und Midgut-NET
Alle 38 Tumoren waren auswertbar. Sämtliche Fore-und Midgut-NET (34/38) waren MSS. 12.5%
(3/24) der Tumoren zeigten LOH an denselben Markern wie bei den Kolon-NET. Es wurden
dieselben Gene auf Methylierung wie bei den Kolon-NET untersucht: p16, hMLH1, APC,
RASSF1A, MGMT, TIMP3, HIC1, MEN1 (Exon2 und Promotor). Es galten die gleichen
Bedingungen zur Festlegung von CIMP wie bei den Kolon-NET (s.5.4). Es zeigte sich, dass 47%
(18/38) CIMP-positiv waren.
Die Ki-67-Analyse ergab folgende Verteilung:
Ki-67- Index <2% 2-29% >29%
% der Fore- und Midgut-NET 63.2% (24/38) 36.8% (14/38) 0% (0/38)
Tab.10
63%
37%
0%
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
Häu
figke
it
Ki67<2% Ki67 2-29% Ki67 > 29%
Ki67-Index
Ki67-Index bei Fore- und Midgut NET
Abb.13 Ki-67-Index-Verteilung bei Fore- und Midgut-NET
5.7.1.2 Kolorektale Karzinome (CRC)
Von den Tumoren waren 63% (94/150) MSS, 29% (43/150) MSI-L und 9% (13/150) MSI-H. Die
CRC waren zuvor nach ihrem MSI-Status ausgewählt worden, insofern handelt es sich hier nicht
um eine repräsentative Darstellung des MSI-Status. In dieser Gruppe wurden die Gene p14, p16,
MLH1, MINT1, MINT2, MINT31 auf Methylierung untersucht. Hierbei galt ein Tumor als CIMP-
positiv bei Methylierung von 2 von 6 Genen. Dies kam in 29% (44/150) der Fälle vor.
44
5.7.2 MSI
Die Häufigkeiten des MSI-Status waren je nach Tumorlokalisation folgendermaßen verteilt:
MSS/ MSI-L MSI- H
Kolon- NET 96% (24/25) 4% (1/25)
Fore- und Midgut-NET 100% 0%
Tab.11
96%
4%
100%
0%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Häu
figke
it in
%
Kolon-NET Fore- und Midgut-NET
Tumorlokalisation
MSI Status nach Tumorlokalisation
MSS/MSI-L
MSI-H
Abb.14
Im Vergleich unterscheiden sich Fore-und Midgut-NET und Kolon-NET nicht signifikant bezüglich
MSI (p=0.8317). Die CRC waren nicht repräsentativ, da es sich um eine Vorauswahl nach MSI-
Status handelte.
5.7.3 LOH
Bei den Kolon-NET fanden bei 37% (10/27) der Tumoren, bei Fore-und Midgut-NET bei 12.5%
(3/24) Allelverluste statt. Dabei konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den
Tumorlokalisationen für die Häufigkeit von Allelverlusten festgestellt werden (p=0.1669).
0,37
0,13
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
Pro
zent
Kolon-NET Fore- und Midgut-NET
Tumorlokalisation
LOH-Status
LOH
Abb.15
45
5.7.4 CIMP
Die Häufigkeiten des CIMP-Status waren in Bezug auf den MSI-Status in den verschiedenen
Tumorlokalisationen folgendermaßen verteilt (mit Berücksichtigung der Grundgesamtheit):
CIMP-positive
Tumoren
CIMP- negative
Tumoren
Kolon- NET/ MSS 52% (13/25) 16% (4*/25)
Kolon- NET/ MSI-L 12% (3/25) 8% (2/25)
Kolon- NET/ MSI-H 0% 4% (1/25)
CRC/ MSS 16% (24/150) 47% (70/150)
CRC/MSI-L 7% (10/150) 22% (33/150)
CRC/MSI-H 7% (10/150) 2% (3/150)
Fore- und Midgut-NET/ MSS 47% (18/38) 53% (20/38)
Tab.12 * 2 Tumoren konnten bezüglich ihres CIMP-Status nicht gewertet werden (18T,23cc), wohl aber bzgl. der MSI-
Auswertung
0,0%
10,0%
20,0%
30,0%
40,0%
50,0%
60,0%
Häu
figke
it in
%
Kolon-NET/M SS
Ko lon-NET/ M SI-L
Ko lon-NET/ M SI-H
CRC/M SS
CRC/ M SI-L
CRC/ M SI-H
Fore-undM idgut-
NET/M SS
Tumorlokalisation/MSI-Status
Zusammenhang CIMP und MSI-Status verschiedener Tumo rlokalisationen
CIMP pos
CIMPneg
Abb.16 Im direkten Vergleich zwischen CRC und Kolon-NET war die Häufigkeit des CIMP-positiven
Status in Bezug auf den MSI-Status folgendermaßen verteilt:
CIMP-positiv Kolon-NET CRC
MSS 76% (13/17) 26% (24/94)
MSI-L 60% (3/5) 23% (10/43)
MSI-H 0% (0/1) 77% (10/13)
Tab. 13 MSS und MSI-L Kolon-NET waren signifikant öfter CIMP-positiv als sporadische CRC
(p=0.0272). Der einzige MSI-H-NET des Kolon war CIMP-negativ.
46
Die Häufigkeiten des CIMP-Status waren in den verschiedenen Tumorlokalisationen
folgendermaßen verteilt:
CIMP positiv CIMP negativ
CRC 29% (44/150) 71% (106/150)
Kolon- NET 64.5% (20/31) 35.5% (11/31)
Fore- und Midgut- NET 47% (18/38) 53% (20/38)
Tab.14
71%
29% 35%
65%53% 47%
0%10%20%30%40%50%60%70%80%
Häu
figke
it in
%
CRC KolonNET Fore undMidgutNET
TumorlokalisationCIMPneg CIMP pos
Abb.17
Bei Betrachtung aller 3 Tumorentitäten war die Anzahl der CIMP-positiven Tumoren für Kolon-
NET signifikant erhöht (p=0.0004).
Im Einzelvergleich zwischen den Kolon-NET und den Fore-und Midgut-NET konnte kein
signifikanter Unterschied bezüglich des CIMP-Status gefunden werden (p=0.2376).
Beim Einzelvergleich von Kolon-NET und CRC konnte jedoch ein für Kolon-NET signifikanter
Unterschied bezüglich des CIMP-Status gefunden werden (p=0.0004).
47
5.7.5 Genmethylierung
5.7.5.1 Vergleich der Genmethylierung der verschiedenen NET
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Haü
figke
it in
%
HIC1 MEN1 APC RASSF1A MGMT p16 hMLH1 TIMP3
Gen
Methylierungsprofil der Kolon-NET und Fore-und Midg ut-NET
Fore-und Midgut-NET Kolon-NET
Abb.18 Für die Kolon-NET waren folgende Gene signifikant häufiger methyliert als für Fore-und Midgut-
NET: p16 (p=0.0090) und MEN1 (p=0.0430).
Die Gene MGMT und TIMP3 waren zwar häufiger methyliert als bei Fore-und Midgut-NET, es
bestand jedoch kein signifikanter Unterschied.
HIC1, APC, hMLH1, RASSF1A waren in dieser Untersuchung häufiger bei den Fore-und Midgut-
NET methyliert, wobei sich nur für hMLH1 ein signifikanter Unterschied ergab (p=0.046).
Methylierung
Gene Fore und MidgutNET Kolon-NET
p-Werte
χ2-Vierfeldertest mit
Stetigkeitskorrektur
HIC1 21/25 84% 16/27 59.3% 0.0967 n.s./grenzwertig
MEN1 7/33 21.2% 15/31 48.4% 0.0430 signifikant
APC 23/36 63.9% 15/33 45.5% 0.1951 n.s.
RASSF1A 20/30 66.6% 13/29 44.8% 0.1536 n.s.
MGMT 8/30 26.7% 13/31 41.9% 0.3245 n.s.*
p16 0/29 0% 8/30 26.7% 0.0090 signifikant
hMLH1 17/36 47.2% 4/32 12.5% 0.0046 signifikant
TIMP3 0/33 0% 3/32 9.4% 0.2264 n.s.
Tab.15 5.7.5.2 Aussagekraft der Methylierung bestimmter Gene
Die Methylierung der Gene APC und hMLH1 machte eine Voraussage der Tumorgruppe möglich.
Sie waren vor allem bei Fore-und Midgut-NET methyliert (APC: p=0.0377; hMLH1: p=0.0014).
Ebenso zeigte sich, dass die Methylierung von MEN1 (p=0.0056) und RASSF1A (p=0.0159) mit
CIMP-positiven Tumoren korreliert war. Zuletzt ergab sich, dass bei Methylierung von hMLH1 ein
signifikant niedrigerer Ki-67-Index bestand (p=0.0084).
48
5.7.6 Ki-67
Bei Kolon-NET gab es signifikant häufiger einen erhöhten Proliferationsindex (>29% bei n=29/34)
im Gegensatz zu den Fore-und Midgut-NET (>29% bei n= 0/38) (p<0.0001) (s.Abb.12 und 13). Bei
den Kolon-NET lag für das ordinale Merkmal Ki-67 (<2%, 2-29%,<29%) ein linearer Trend für die
höheren Ki-67-Werte (>29%) vor (p<0.0001). Fore-und Midgut-NET wiesen eher niedrige Ki-67-
Werte auf.
5.8 Überleben
Überlebenszeiten lagen für Fore-und Midgut-NET und Kolon-NET vor.
5.8.1 Überleben nach Tumorgruppen
5.8.1.1 Kolon-NET
Kolon- NET
Vorhandene Überlebensdaten 23 (34)
Mediane Überlebenszeit 19 Monate
Untere Grenze des 95% KI 8 Monate
Mittlere Nachbeobachtungszeit 25 Monate
Überlebende am Ende der Beobachtung 39.1% (9/23)
Tab.16
Aus den Daten ging hervor, dass ca. 45% (11/23) der Patienten noch innerhalb eines 2-Jahres-
Zeitraums nach Diagnosestellung lebten.
5.8.1.2 Fore- und Midgut-NET
Fore-und Midgut- NET
Vorhandene Überlebensdaten 38 (38)
Mediane Überlebenszeit Nicht bestimmbar (nb)
Untere Grenze des 95% KI 36 Monate
Mittlere Nachbeobachtungszeit 67 Monate
Überlebende am Ende der Beobachtung 60.5% (23/38)
Tab.17
5.8.1.3 Vergleich
In der Kaplan-Meier Kurve (Abb.19) wurden die Überlebenszeiten von Kolon-NET und Fore-und
Midgut-NET gegenübergestellt. Kolon-NET zeigten ein signifikant schlechteres Überleben
(p=0.0061).
49
Abb.19 Kaplan-Meier-Kurve
5.8.2 Überleben nach LOH-Status
Abb.20 Kaplan- Meier-Kurve Ein Patient verstarb nach 57 Monaten in der LOH-positiven Gruppe.
LOH- positiv LOH- negativ
34 (43) 9 (34) 25 (34)
Mediane Überlebenszeit 46 Monate nb
95% KI 19-57 Monate 13 Monate- x
Mittlere Nachbeobachtungszeit 27 Monate 56 Monate
Überlebende am Ende der Beobachtung 33.3% (3/9) 54.9% (~14/25)
Tab.18
Es zeigte sich, dass das Überleben vom LOH-Status nicht abhängig ist (p=0.2773).
50
5.8.3 Überleben nach CIMP-Status
Abb.21 Kaplan- Meier-Kurve CIMP-positiv CIMP- negativ
58 (72) 32 (58) 26 (58)
Mediane Überlebenszeit 36 Monate nb
95% KI 14 Monate-x 36 Monate- x
Mittlere Nachbeobachtungszeit 45 Monate 59 Monate
Überlebende am Ende der Beobachtung 39.9% (~14/32) 60.9%(~16/26)
Tab.19
Im Logranktest bestand kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen für das Überleben
(univariate Analyse p=0.1839).
5.8.4 Überleben nach Ki-67-Index
5.8.4.1
Abb.22 Kaplan-Meier-Kurve: Überleben nach Ki-67-Status
51
Der Ki-67-Index wurde bei insgesamt 72 NET erhoben.
Ki-67<2 % Ki-67 =2-29% Ki-67>29%
72 25 (26) 16 (17) 20 (29)
Mediane Überlebenszeit nb 36 Monate 16.5 Monate
95% KI nb 12 Monate - x 8-57 Monate
Mittl. Nachbeobachtungszeit 82 Monate 33 Monate 26.5 Monate
Überlebende am Ende der Beobachtung 76% (19/25) 30 % (~6/16) 35 % (7/20)
Tab.20
Im Logrank-Test (p=0.0024) konnte gezeigt werden, dass zwischen o.g. 3 Gruppen ein signifikanter
Unterschied bezüglich des Überlebens bestand. Dies zeigte sich z.B. an unterschiedlich langen
Nachbeobachtungszeiten.
5.8.4.2
Abb.23 Kaplan-Meier-Kurve
Tab.21
Die Gruppen Ki-67=2-29% und Ki-67> 29% mit ähnlichen Nachbeobachtungszeiten wurden in
einer Gruppe (36 Patienten) zusammengefasst und gegen die verbleibende Gruppe mit Ki-67 <2%
(25 Patienten) verglichen. Im Logrank-Test konnte gezeigt werden, dass zwischen diesen beiden
Ki-67<2 % Ki-67> 2%
72 25 (26) 36 (46)
Mediane Überlebenszeit nb 36 Monate
95% KI nb 13-57 Monate
Mittl. Nachbeobachtungszeit 82 Monate 29 Monate
Überlebende am Ende der Beobachtung 76% (19/25) 36% (13/36)
52
Gruppen ein signifikanter Unterschied bestand (p=0.0008). Dies bedeutet ein signifikant
schlechteres Überleben für Patienten mit Tumoren mit einem Ki-67-Index von > 2%.
5.8.4.3
Ob das schlechte Überleben von Patienten mit Kolon-NET mit ihrem erhöhten Ki-67-Index in
Zusammenhang gebracht werden kann, ließ sich statistisch nicht bestätigen, da Kolon-NET
hauptsächlich Tumoren in Gruppe 3 (Ki-67 >29%) aufwiesen (p=0.1500).
5.8.5 Prognose (multivariate Analyse)
Die unter 5.8.1 bis 5.8.4 untersuchten Faktoren für das Überleben von Patienten mit NET wurden
nun unter der Fragestellung verglichen, welcher von ihnen mit dem Überleben der Patienten
signifikant korrelierte. Es zeigte sich, dass der Ki-67-Index am zuverlässigsten das Überleben bei
NET voraussagen konnte (Cox- Regression, Likelihood ratio: p=0.0004). Die Hazard Ratio mit 2.3
für den Ki-67-Index zeigte zusätzlich, dass Patienten mit Tumoren aus der höheren Ki-67-Index-
Gruppe (>29%) nach 1 Jahr Überleben eine deutlich schlechtere Prognose haben.
5.9 Korrelation CIMP-positiver Status und Ki-67-Ind ex bei Kolon-NET und Fore- und
Midgut-NET
0,00
0,50
1,00
0,43
0,65
0,00
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
CIM
P+
in P
roze
nt
Ki67<2% 2%<Ki67< 29% Ki67> 29 %
Ki67 Kategorie
Korrelation CIMP/Ki67
Kolon NET CIMP+ Fore/Midgut NET CIMP+
Abb.24 CIMP positiv bei: Ki-67<2% Ki-67=2-29% Ki-67>29%
Kolon-NET 0% (0/2) 100% (3/3) 65% (17/26)
F/MidgutNET 50% (12/24) 43% (6/14) 0% (0/0)
Tab.22 Es zeigte sich, dass in der zusammengefassten Gruppe der NET keine signifikante Korrelation
zwischen CIMP-und Ki-67-Status bestand (Mantel-Haenszel-Test p=0.1664 und Cochran-Mantel-
Haenszel-Test p=0.6764). Einzeln betrachtet ergab sich weder für die Kolon-NET noch für die
53
Fore-und Midgut-NET eine Korrelation zwischen dem CIMP-Status und Ki-67-Index. Bei den
Fore-und Midgut-NET bestand ein Trend dahingehend, dass bei niedrigerem Ki-67-Index vermehrt
CIMP-positive Tumoren vorhanden waren (s.Tab.22). Dies konnte aber aufgrund des Fehlens von
Fore-und Midgut-NET mit einem Ki-67-Index >29% nicht auf Signifikanz untersucht werden.
Betrachtete man nur die Gruppe der CIMP-positiven Kolon-NET, so ließ sich ein Trend
beschreiben, der vor allem CIMP-positive Tumoren bei Ki-67-Index >29% aufwies (85%, 17/20):
Ki-67 <2% Ki-67=2-29% Ki-67>29% Gesamt
CIMP-positiv 0% (0/20) 15% (3/20) 85% (17/20) 100%(20)
Tab.23
54
55
6 Diskussion
In einer vorangegangenen Studie wurde an gut differenzierten Fore-und Midgut-NET die
Beteiligung von genetischen und epigenetischen Veränderungen an der molekularen Pathogenese
untersucht [13]. Dort wurde gezeigt, dass die Promotormethylierung ein häufiges Ereignis ist, und
für GEP-NET wurde ein bestimmtes Methylierungsprofil beschrieben. Bemerkenswert war, dass es
keine signifikanten Unterschiede zwischen den Methylierungsprofilen verschiedener
Tumorsubgruppen gab. Neben genetischen Veränderungen schien CIMP eine wichtige Rolle in der
Tumorpathogenese dieser Fore-und Midgut-NET zu spielen. Dies führte zu der Annahme, dass
CIMP auch bei der Pathogenese der Kolon-NET beteiligt ist, so wie es bereits für sporadische CRC
gezeigt wurde.
In dieser Untersuchung wurden charakteristische molekulare Veränderungen von gut und schlecht
differenzierten NET in unterschiedlicher anatomischer Lage direkt miteinander verglichen. Es
konnten bezüglich der molekularen Veränderungen Unterschiede zwischen sporadischen CRC, gut
differenzierten NET des Fore-und Midgut und schlecht differenzierten NET des Kolon gezeigt
werden, die die Wachstumscharakteristika und Proliferationsraten in beiden Tumorarten (CRC und
NET) beeinflussen könnten. Außerdem wurde der Einfluss von verschiedenen Prädiktoren auf das
Überleben von gut und schlecht differenzierten Tumoren gezeigt.
Das histologische Grading hat nur eine begrenzte Aussagekraft für das Metastasierungsverhalten
eines Tumors und das Überleben der Patienten [112]. Der Ki-67-Index ist schon seit längerem
bekannt dafür, dies als zuverlässiger Prädiktor für das Überleben bei verschiedenen malignen
Neoplasien zu ergänzen [26,112,123,142,143], wobei er bei aggressiven, proliferierenden und
metastasierenden Tumoren erhöht ist. Bisher sind nur wenige Überlebens-Studien für NET
durchgeführt worden. Die meisten fanden den Ki-67-Proliferationsindex als den vorrangigen
Prädiktor für das Überleben [4,14,137,145]. Verschiedene molekulare Ereignisse sind in NET
beschrieben worden, dazu gehören die genetischen und epigenetischen Veränderungen von p53,
BAX, p16INK4a/CDKN2A, BRAF, bcl-2, PTEN, DPC4/Smad4, p27 [4,13,67,69,105,112,124,144,
153,154,160,125-127,172], Allelverluste [56] oder die unterschiedliche Expression von Nuclear
Survivin und anderen Proteinen [66,68]. Die meisten dieser Ereignisse standen nicht im
Zusammenhang mit dem Überleben der Patienten oder der Aggressivität der Tumoren. Die
Survival-Analyse dieser Studie ergab, dass Patienten mit NET mit einem Ki-67-Index > 2% ein
signifikant schlechteres Überleben zeigten (p=0.0008). Bei den hier untersuchten Kolon-NET war
ein eindeutiger Trend zu den höheren Ki-67-Werten (Ki-67>29%) zu verzeichnen, wobei
umgekehrt die gut differenzierten Fore-und Midgut-NET eher niedrige Ki-67-Werte aufwiesen (Ki-
67<2%) (p<0.0001; 5.7.6). Abschließend zeigte sich in der multivariaten Analyse (5.8.5), dass sich
56
der Ki-67-Index als prognostischer Faktor für NET hervorheben konnte. Hingegen ließ sich das
schlechte Überleben von Patienten mit Kolon-NET nicht direkt mit ihrem erhöhten Ki-67-Index in
Zusammenhang bringen, aber die Anzahl schlecht differenzierter Hindgut-Tumoren mit einem
niedrigen Ki-67-Index war gering. Dies müsste an einer größeren Anzahl von Kolon-NET nochmals
überprüft werden.
Eine aktuelle Studie belegte [Grabowski 2008, zur Publikation eingereicht], dass auch die
Aufrechterhaltung einer p27-Expression ein Prädiktor für längeres Überleben bei manchen
Patienten [78] war. Hier spielte der Verlust des Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitors p27 eine
entscheidende Rolle für die Aggressivität von GEP-NET. Das wird dadurch erklärt, dass in diesen
Tumoren durch den Mangel an Inhibition des Cyclin E eine erhöhte Progression des Zellzyklus und
eine verstärkte Proliferation stattfindet. Patienten, bei denen weiterhin p27 exprimiert wurde, hatten
ein signifikant besseres Überleben in dieser Studie. Weitere Prädiktoren für das Überleben sind die
histologische Differenzierung und das Vorliegen von Malignität (Infiltration des Tumors in das
umliegende Gewebe) [92]. Die Aggressivität der Kolon-NET könnte mit der schlechten
Differenzierung der Tumoren aufgrund des Verlusts der p27-Expression und des häufigen
Allelverlusts [137,124,56,78] zusammenhängen.
Tumoren mit häufigen Allelverlusten weisen ein aggressiveres Wachstum auf, sind schlechter
differenziert [56,100,160], korrelieren mit einem höheren Proliferationsindex und schlechterem
Überleben [160,137,56,109]. LOH kommt oft bei GEP-NET vor [99,154,160]. Die im Vergleich
recht häufigen (nicht signifikanten) Allelverluste bei Kolon-NET (37%, 10/27) gegenüber den gut
differenzierten Fore-und Midgut-NET (12.5%, 3/24) deuten auf das instabile Genom und das
aggressivere Verhalten dieser Tumorgruppe hin [56,150]. Jedoch wiesen die Kolon-NET keine
hohen LOH-Raten wie andere Tumoren des Hindgut (CRC) auf (50% [99]), und LOH war kein
Prädiktor für schlechteres Überleben trotz kürzerer Nachbeobachtungszeiten (27 Monate vs. 56
Monate) für Patienten mit LOH-positiven Tumoren. Bei Kolon-NET kamen vor allem hohe
Allelverluste am MEN1-Gen vor.
Die noch relativ häufigen Allelverluste am APC und p53-Lokus mit jeweils 11% (3/27) wiesen auf
die Herkunft der Kolon-NET aus dem Hindgut hin, da diese Gene auch beim CRC durch
Allelverlust ausgeschaltet sind [9]. Der Allelverlust von hMSH2 mit 4% (1/27) bestätigt den
geringen Einfluss, den die MSI auf die Pathogenese von Kolon-NET hat. Auch war kein LOH-
Tumor MSI-H.
Die Bedeutung der Inaktivierung des MEN1-Gens ist ungeklärt. Früher wurden Alterationen an
MEN1 vor allem im Foregut [124,135,136] und vorzugsweise durch Mutation beschrieben [64,158].
Bei den Kolon-NET wies der MEN1-Lokus die häufigsten Allelverluste auf (26%, 7/27) und war
signifikant häufiger als in den Fore-und Midgut-NET methyliert (48%, 15/31 vs. 21%, 7/33;
57
p= 0.0430). Auch korrelierte eine MEN1-Methylierung mit CIMP-positiven NET (p=0.0056). In
vorangegangenen Studien an gut differenzierten Fore-und Midgut-NET war eine MEN1-
Methylierung kaum [13] oder gar nicht [30] aufgefallen, zudem zeigte sich kein Zusammenhang
zwischen Promotormethylierung und Expressionsverlust [13]. Das bedeutet zum einen, dass die
Stilllegung des MEN1-Gens allgemein für die Pathogenese von GEP-NET wichtig ist, wie in [64]
bereits berichtet, zum anderen, dass seine genaue Funktion in der Pathogenese von NET
unterschiedlicher Lokalisation noch erforscht werden muss.
Trotz unterschiedlicher Methylierungsraten der untersuchten Gene beeinflussten diese nicht das
Überleben in den zugehörigen Tumorgruppen:
Das Tumorsuppressorgen HIC1 ist dem Tumorsuppressor p53 direkt vorgeschaltet, der für die
Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität der Zelle verantwortlich ist, und erhöht dessen
Aktivität [33]. Entsprechend geht eine Inaktivierung von HIC1 mit maligner Progression eines
Tumors [71] und einem schlechteren Überleben [33] einher. HIC1 wird in verschiedenen Tumoren
häufig methyliert vorgefunden [129] wie auch in Fore-und Midgut-NET ([13] und in dieser Arbeit:
84%, 21/25) und den hier untersuchten Kolon-NET (59%, 16/27). Das methylierte HIC1-Gen
scheint eine zentrale Rolle bei den schlecht differenzierten Kolon-NET einzunehmen.
TIMP3, ein Tumorsuppressorgen, das im Rahmen von Tumorausbreitung und Metastasierung
[2,18,29,172] methyliert vorliegt, war bei den bisher untersuchten gut differenzierten GEP-NET
nicht inaktiviert ([13], hier untersuchte Fore-und Midgut-NET 0/33). Bei den Kolon-NET zeigte
sich erstmals eine geringfügige Methylierung (9%, 3/32), die sich in das Bild der schlecht
differenzierten Kolon-NET einfügt, die meist schon metastasiert sind.
Der cyclinabhängige Kinase-Inhibitor p16 ist ein bedeutendes Tumorsuppressorgen in GEP-NET,
von dem eine hohe Inaktivierung bekannt ist, sei es durch Methylierung in NET (30%[30],
52%[159], PET: 10%[30], 40%[80]), sei es durch Allelverlust [105,113,147]. Die hier gefundene
Methylierung bei den Kolon-NET von 27% (8/30) wiederum zeugt von einer Ausschaltung von p16
gerade in schlechter differenzierten Tumoren [147], die gegenüber den hier untersuchten Fore-und
Midgut-NET signifikant war (0%; p=0.0090). Zudem ist von der p16-Methylierung bekannt, dass
sie mit schlechteren Patientenüberleben korreliert [80] und vor allem in CIMP-positiven CRC
auftritt [161], ähnlich wie hier bei den Kolon-NET, so dass größere Studien nötig sind, um die Rolle
von p16 in NET gründlich aufzuklären.
Eine so häufige Methylierung des DNA-Reparaturgens MGMT, das mutagene oder zytotoxische
Alkyl-Gruppen von der O6- Position des Guanins entfernt [121], wie bei den Kolon-NET (42%,
13/31) war bisher nicht in GEP-NET bekannt ([13], hier untersuchte Fore-und Midgut-NET: 27%),
sondern schien eher bei Kolonkarzinomen, Lungen-und Hirntumoren von Bedeutung zu sein
[13,43]. Dass es in Geweben mit MGMT-Methylierung häufig zu p53- und k-ras-Mutationen (G:C
58
zu A:T-Transitionen) [45,46,118,177] kommt und dass Tumoren mit MGMT-Methylierung eine
schlechtere Prognose haben, da sie häufig Chemotherapeutika-resistent sind [106,122], passt zum
malignen Verhalten der Kolon-NET.
Dass das APC-Gen als dritthäufigstes in Kolon-NET methyliert war (46%, 15/33), bestätigt seine
Rolle bei der Entstehung gastrointestinaler Tumoren [11,47] und GEP-NET [13,55]. Unter der
Annahme, dass die Methylierung von APC gerade im Hindgut höher ausfallen müsste, bedingt
durch eine zentrale Inaktivierung von APC wie bei den CRC [48,135], bleibt es unklar, warum die
Methylierung des APC-Gens bei den Fore-und Midgut-NET häufiger auftrat (64%, 23/36), und
müsste weiter erforscht werden.
Das RASSF1A-Gen, das häufig in verschiedenen Neoplasien [37] wie auch in Fore-und Midgut-
NET [13,80,102,36] durch epigenetische Inaktivierung ausgeschaltet ist, zeigte eine relativ häufige
Methylierung bei den Kolon-NET (45%, 13/29) und korrelierte mit einem CIMP-positiven Status
des Tumors (p=0.0159). Bisher war das Vorkommen einer RASSF1A-Methylierung im Hindgut
[130] fraglich. Da auch die Fore-und Midgut-NET dieser Arbeit (67%, 20/30, p=0.1536) eine hohe
Methylierung aufwiesen, konnte die Bedeutung des Ras-Signalwegs in der Pathogenese von GEP-
NET wiederum gezeigt werden,
MSI und hMLH1-Methylierung sind kaum in NET bekannt [13,89,58]. Dies bestätigten die
geringen Funde von MSI (4% bzw. 0%) und hMLH1-Methylierung (12.5% bzw. 47%, p= 0.0046)
sowohl bei den Kolon-NET als auch bei den Fore-und Midgut-NET. Die hohe hMLH1-
Methylierung bei Fore-und Midgut-NET scheint jedoch keine MSI zu verursachen. Patienten mit
MSI–Tumoren weisen ein besseres Überleben auf, beide Eigenschaften treffen nicht für Kolon-NET
zu [88,132,166,167,170]. Inwieweit die hohen Methylierungsraten von hMLH1 bei den gut
differenzierten Fore-und Midgut-NET mit einer besseren Prognose zusammenhängen, wie in [79]
und 5.7.5.2 gefunden, konnte nicht eindeutig geklärt werden, zumal die Fore-und Midgut-NET
keine MSI aufwiesen. Die hMLH1-Methylierung ohne darauffolgende MSI bei Kolon-NET könnte
im Zuge der höheren allgemeinen Methylierung bei schlechterer Differenzierung erklärt werden
[117]. Es bleibt weiter zu erforschen, wie alle diese Gene das Tumorwachstum und/oder die
Tumorprogression in sporadischen NET beeinflussen.
Kürzlich wurde eine neue TNM-Klassifikation für GEP-NET vorgeschlagen [138,139]. Weitere
Studien werden klären, ob diese Klassifikation einen neuen Überlebens-Prädiktor präsentiert, und
werden die bekannten Prädiktoren ergänzen.
Die hohe Anzahl CIMP-positiver Tumoren bei den Kolon-NET (64.5%, 20/31) zeigte, dass CIMP
auch bei GEP-NET des Hindgut von Bedeutung für die Pathogenese ist, wie dies in einer
vorangegangenen Studie für gut differenzierte GEP-NET des Fore-und Midgut gefunden wurde
(73% [13]). Die hohe Anzahl CIMP-positiver Kolon-NET mag auch Ausdruck der schlechteren
59
Differenzierung sein, da mit Tumorprogression auch die Methylierung von Genen zunimmt (z.B.
bei Magen-Karzinom)[117].
In der vorangegangenen Studie an gut differenzierten Fore-und Midgut hatten CIMP-negative
Tumoren ein besseres Überleben als CIMP-positive Tumoren [13]. Es wurde dort kein anderer
prognostischer Marker gefunden. In der aktuellen Untersuchung beeinflusste CIMP trotz längerer
Nachbeobachtungszeiten für CIMP-negative Tumoren (59 Monate vs. 45 Monate) und mehr
überlebenden Patienten am Ende der Nachbeobachtungszeit (61% vs. 40%) das Überleben weder in
gut noch in schlecht differenzierten NET. Diese gegensätzlichen Aussagen müssen in Zukunft
geklärt werden und könnten aufgrund der geringen Anzahl der untersuchten Tumoren zustande
gekommen sein. Jedoch bestand der Trend CIMP-positiver Kolon-NET zu hohen Ki-67-Werten
(>29%), aber es zeigte sich keine signifikante Korrelation zwischen CIMP-positiven NET und
höheren Ki-67-Werten, wie in [13] (Ki-67>10%) festgestellt.
Abgesehen von dem seltenen Vorkommen schlecht differenzierter Kolon-NET gegenüber
sporadischen CRC, scheint die molekulare Pathogenese beider Tumorarten unterschiedlich zu sein,
obwohl sie bezüglich ihres Wachstums einige Ähnlichkeiten zeigen. Anders als bei den CRC
kommt MSI bei schlecht differenzierten Kolon-NET selten vor. MSI war auch ein seltenes Ereignis
bei den NET unterschiedlicher Lokalisationen [13,59,89].
Kolon-NET, die MSS waren, waren am häufigsten CIMP-positiv (76%, 13/17) und unterschieden
sich zusammen mit den MSI-L-Kolon-NET signifikant von den MSS-CRC (26%, 24/94) bezüglich
des CIMP-Status (p=0.0272). Umgekehrt waren hochgradig mikrosatelliteninstabile CRC sehr stark
CIMP-positiv (77%, 10/13). Schlecht differenzierte GEP-NET des Hindgut werden also,wenn
überhaupt, nicht durch einen Methylierungsphänotyp mikrosatelliteninstabil, wie dies bei den CRC
durch die Methylierung von hMLH1 bekannt ist [62,161,162].
CIMP kam häufig vor, sowohl bei sporadischen CRC als auch bei schlecht differenzierten Kolon-
NET, aber entsprechend der unterschiedlichen molekularen Pathogenese sind entscheidende Gene
unterschiedlich methyliert [13,30,61,62,81]. Diese Arbeit zeigte erstmals den Methylierungsstatus
von tumorassoziierten Genen an einer relevanten Anzahl von schlecht differenzierten Kolon-NET.
Sporadische CRC und schlecht differenzierte NET des Kolon und Rektum unterscheiden sich also
in ihrer Tumorpathogenese trotz des Auftretens von CIMP bei beiden. Bis nicht weitere Studien
durchgeführt werden, die direkt die Methylierungsmuster von Kolon-NET mit denen des
sporadischen CRC vergleichen, bleibt es unsicher, ob CIMP ein erworbener Defekt mit primärer
Ätiologie ist oder ob dieses abnormale Muster der Promotormethylierung ein zufälliger Prozess ist,
nach dem Tumorzellen selektiert werden. MSI kommt normalerweise nur in sporadischen CRC vor
und zeigte sich nicht in GEP-NET unterschiedlicher Lokalisation und Differenzierung.
Entsprechend ihrer schlechten Differenzierung hatten Kolon-NET ein schlechteres Überleben als
60
gut differenzierte Fore-und Midgut-NET. Prädiktor eines schlechten Überlebens war in dieser
Arbeit ein hoher Ki-67-Proliferationsindex.
61
7 Zusammenfassung
Kolon-NET sind seltene und bisher wenig erforschte Neoplasien, die sich durch schnelles
Tumorwachstum und schlechte Differenzierung auszeichnen. Hier wurden sie erstmals in einer
relevanten Anzahl auf ihre genetischen und epigenetischen Charakteristika untersucht und mit
vorliegenden Daten aus CRC und gut differenzierten Fore-und Midgut-NET verglichen. Zudem
wurde eine Survival-Analyse für NET erstellt. MSI schien trotz der Lokalisation im Kolon und
einer relativ häufigen hMLH1-Methylierung nur eine geringfügige Rolle in der Pathogenese von
Kolon-NET zu spielen. Die LOH-Analyse an MEN1, APC, p53 und hMSH2 ergab, dass LOH in der
Pathogenese von Kolon-NET von größerer Bedeutung ist als in Fore-und Midgut- NET, was
entweder mit ihrer schlechten Differenzierung oder der Lokalisation im Hindgut zusammenhing.
Vor allem das MEN1-Gen hob sich durch häufige Allelverluste hervor (26%). Alle mittels MSP
untersuchten Gene waren methyliert und zeigten im Fall von MEN1 und p16 eine signifikant
häufigere Methylierung bei Kolon-NET, so wie HIC1 und hMLH1 eine signifikant häufigere
Methylierung bei Fore-und Midgut-NET aufwiesen. Insgesamt waren HIC1, MEN1 und APC am
häufigsten bei Kolon-NET methyliert, bei Fore-und Midgut-NET waren es HIC1, RASSF1A und
APC. Über die p16-Inaktivierung bestehen uneinheitliche Voruntersuchungen: das in Kolon-NET
gehäufte Auftreten spiegelte sich in dem schlechten Überleben der Tumorgruppe wieder. Der
häufige Ausfall des MEN1-Gens gerade im Hindgut, sowohl durch LOH als auch durch
Methylierung, zeigte dessen allgemeine Bedeutung für die Pathogenese von GEP-NET. Zudem gab
es eine Korrelation zwischen MEN1-Methylierung und CIMP. CIMP wurde insgesamt zu 65% bei
Kolon-NET festgestellt und trat besonders bei den MSS-Kolon-NET (76%) auf, worin sie sich von
den MSS-CRC (26%) signifikant unterschieden. MSI-CRC (77%) wiesen häufig CIMP auf, was
den bereits bekannten Zusammenhang zwischen Methylierung von hMLH1 und MSI bestätigte.
Diesen gab es anscheinend für Kolon-NET nicht in einer relevanten Größe. Letztlich konnte CIMP
doch nicht als prognostischer Faktor für NET dienen, wie früher erwiesen. Diese Position nahm der
hier ebenfalls untersuchte Proliferationsindex Ki-67 ein: ein Wert >2% korrelierte signifikant mit
schlechterem Überleben in der Gesamtgruppe der NET, für Kolon-NET konnte aufgrund der
geringen Tumorzahl nur ein Trend beschrieben werden, der bei Tumoren mit hohen Ki-67-Werten
ein schlechteres Überleben vermuten ließ. Kolon-NET sind also durch schwerwiegende
Pathomechanismen wie häufige LOH-Ereignisse und Methylierungen (CIMP), hohe Ki-67-Werte
und eine schlechte Prognose charakterisiert. Sie unterscheiden sich deutlich von den CRC trotz des
Auftretens von CIMP in beiden Entitäten. In Bezug auf die Fore-und Midgut-NET unterscheiden sie
sich durch hohe Ki-67-Werte und unterschiedliche Methylierungsmuster. Letztere müssten in
weiteren Studien für Kolon-NET untersucht werden, um systematische Veränderungen zu erkennen.
62
63
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76
77
9 Anhang
Tab. A Kolon-NET A1
Nummer Jr.Nummer p16 HIC 1 APC hMLH1 RASSF1A MEN 1 TIMP3 MGMT CIMP No of Met.Loc 1 cc 1 1 0 0 0 1 0 0 1 CIMP 3 2 cc 2 - 1 1 0 1 0 1 0 CIMP 4 3 cc 3 0 0 0 0 0 0 0 0 N 0 4 cc 4 0 - 1 0 - 0 0 - low 1 5 cc 5 0 1 0 0 0 1 0 1 CIMP 3 6 cc 6 0 0 0 0 0 0 0 0 N 0 7 cc 7 - - 0 0 0 0 0 0 N 0 8 cc SG 6954 - 1 1 1 0 0 0 0 CIMP 3 9 cc K 130/05 0 1 1 0 1 0 0 0 CIMP 3
10 cc K 13/05 1 0 1 0 0 0 0 1 CIMP 3
11 cc K 8/05 0 0 1 0 1 0 0 0 low 2
12 cc K 47/04 0 1 1 0 0 1 0 1 CIMP 4
13 cc K 46/04 1 1 1 0 0 1 0 0 CIMP 4
14 cc K 135/03 0 1 0 0 1 1 0 0 CIMP 3
15 cc K 121/03 0 0 0 0 1 1 0 1 CIMP 3
16 cc K 19/02 0 1 0 0 0 1 0 1 CIMP 3
18 cc K 168/85 0 - 0 0 - 1 0 0 low 1
19 cc K 135/84 1 1 0 0 0 1 0 1 CIMP 4 20 cc 03 16982 A-C 0 0 0 0 0 1 0 0 low 1 12T 6079/88 0 1 0 0 1 0 0 0 low 2 13T 6800/91 0 1 1 0 1 1 0 0 CIMP 4 14T 7012/85 0 0 1 0 1 1 0 1 CIMP 4 15T 10793/88 0 0 1 0 0 1 0 1 CIMP 3 16T 12596/94 0 1 1 0 1 1 1 1 CIMP 6
78
Nummer Jr.Nummer p16 HIC 1 APC hMLH1 RASSF1A MEN 1 TIMP3 MGMT CIMP No of Met.Loc 17T S 298/86 1 1 0 1 1 0 0 0 CIMP 4 18T 8000/95 0 - 1 0 - - - - na 1 19T 11197/93 1 1 0 0 1 1 0 0 CIMP 4 20T 5389/96 undiff 1 0 0 0 0 0 0 0 low 1 21 cc SG 10292/96 1 1 1 0 0 0 0 1 CIMP 4 22 cc SG 1338/98 0 - 0 0 0 - 0 0 N 0 23 cc SG 28624/00 - - 0 - - - 0 0 na 0 24 cc SG 18231/01 0 - - - - 0 - - na 0 25 cc SG 23036/01 0 1 1 1 1 1 1 1 CIMP 7 26 cc SG 29098/03 0 0 0 1 0 0 0 1 low 2
Tab. A1: MSP-Analyse der Kolon-NET
79
A2
Nummer Jr.Nummer MSI LOH Ki-67 (%) follow-up (months) Gender Age Location Histologie 1 cc 1 low 0 65 - - - - schlecht differenziert 2 cc 2 stable 0 70 - - - - schlecht differenziert 3 cc 3 - - 85 - - - - schlecht differenziert 4 cc 4 - - 90 - - - - schlecht differenziert 5 cc 5 - 0 50 - - - - schlecht differenziert 6 cc 6 - 0 60 - - - - schlecht differenziert 7 cc 7 low LOH 80 - - - - schlecht differenziert 8 cc SG 6954 stable 0 60 99 m 74 C.asc. schlecht differenziert 9 cc K 130/05 - LOH 50 - - - - schlecht differenziert
10 cc K 13/05 - 0 50 15 m 71 - schlecht differenziert
11 cc K 8/05 low 0 40 18 m 67 - schlecht differenziert
12 cc K 47/04 stable LOH 5 27 w 77 - schlecht differenziert
13 cc K 46/04 low LOH 50 8 w 54 - schlecht differenziert
14 cc K 135/03 low LOH 3 8 w 62 - schlecht differenziert
15 cc K 121/03 stable MSI 80 2 m 53 - schlecht differenziert
16 cc K 19/02 stable 0 50 - w 57 - schlecht differenziert
18 cc K 168/85 high 0 <2 - w 70 - schlecht differenziert
19 cc K 135/84 stable LOH 20 - m 70 - schlecht differenziert 20 cc 03 16982 A-C stable 0 50 40 w 60 - schlecht differenziert 12T 6079/88 stable LOH 90 8 w 81 - schlecht differenziert 13T 6800/91 stable 0 50 13 m 69 - schlecht differenziert 14T 7012/85 stable LOH 90 57 m 49 - schlecht differenziert 15T 10793/88 stable LOH 30 19 m 32 - schlecht differenziert 16T 12596/94 stable 0 50 13 m 29 - schlecht differenziert 17T S 298/86 stable 0 60 0 w 63 - schlecht differenziert 18T 8000/95 stable 0 50 7 m 57 - schlecht differenziert 19T 11197/93 stable 0 50 14 m 32 - schlecht differenziert 20T 5389/96 undiff stable 0 <2 6 m 55 - schlecht differenziert
80
Nummer Jr.Nummer MSI LOH Ki-67 (%) follow-up (months) Gender Age Location Histologie 21 cc SG 10292/96 stable - 75 2 m 64 Colon schlecht differenziert 22 cc SG 1338/98 stable - 75 1 w 92 Colon schlecht differenziert 23 cc SG 28624/00 stable - 85 68 w 58 Colon schlecht differenziert 24 cc SG 18231/01 - - 45 62 m 54 Colon schlecht differenziert 25 cc SG 23036/01 - LOH 45 46 w 85 Colon schlecht differenziert 26 cc SG 29098/03 - - 65 38 m 56 Rektumpolyp schlecht differenziert
Tab. A2: MSI- und LOH-Analyse, Ki67-Marker und Patientendaten Tab. B Fore- und Midgut-NET B1
Jr. Nummer Organ diagnosis CIMP behavior ki-67 follow up (years) cause of death BAT25 BAT26 D2S123 D5S346
26/2001 Pankreas glucagonoma + malignant >20 <1 tu - - - -
9020/2000 Lebermetastase Vipoma - malignant 2-10 >4 survived - - - -
7078/1998 Magen gastrinoma - benign 2-10 >4 survived - - LOH -
7008/1998 Pankreas non functional + benign 2-10 >6 survived - na
6107/1997 Niere non functional + benign <2 >7 survived - -
6015/1997 Leber gastrinoma + malignant <2 <1 tu MSI -
5084/1996 Papille non functional - malignant >20 <1 tu - - - -
7029/1998 LK, Lebermet. insulinoma + malignant <2 1 tu - - - -
1088/1992 Pankreas non functional - malignant >10 1 tu - -
348/1991 Duodenum non functional - malignant <2 1 tu MSI na
10132/1990 Dünndarm non functional - malignant >20 1 tu na -
10079/1990 Pankreas gastrinoma - benign 2-10 3 tu - -
10072/1990 Dünndarm non functional + benign <2 3 tu - - - -
16939/88 Pankreas-schwanz insulinoma - benign <2 16 survived - - - -
2761/88 Lig hepduod Gastrinom Met. - benign <2 16 survived - - - -
9056/95 Pankreas insulinoma + benign <2 >5 survived - - - -
3976/96 Pankreas-schwanz Vipoma + benign 10-20 >8 survived - - - -
894/97 Leber gastrinoma - benign <2 >5 survived - - - -
2899/98 Pankreas insulinoma + malignant 2-10 1 tu - - - -
7069/1998 LK non functional + malignant <10% 3 tu - - - LOH
81
Jr. Nummer Organ diagnosis CIMP behavior ki-67 follow up (years) cause of death BAT25 BAT26 D2S123 D5S346 6128/1997 Ileum non functional - benign <2% 7 survived - - 6135/1997 LK non functional + benign <2% 7 survived - na 6109/1997 Ileum carcinoid syndrome - benign <2% 7 survived - - - - 5008/1996 Ileum carcinoid syndrome + benign <2% 6 survived - - - - 2105/1993 Duodenum carcinoid syndrome - benign <2% 6 survived - na - - 2047/1993 Duodenum non functional - benign <2% 7 survived - - - - 1153/1992 Appendix non functional + benign <2% 10 survived - - na - 348/1991 Duodenum non functional + benign <2% 8 survived - - - -
10132/1990 Dünndarm non functional - malignant 2-30% 3 tu MSI na 10083/1990 Dünndarm non functional - malignant 2-30% 3 tu na - 10082/1990 Dünndarm non functional + malignant 2-30% 2 tu - - - - 10076/1990 Ileum carcinoid syndrome + benign <2% 10 survived - - - - 10075/1990 Ileum carcinoid syndrome + benign <2% 10 survived - - - - 10072/1990 Dünndarm non functional - benign <2% 9 survived - MSI 9988/1990 Lebermet. carcinoid syndrome + benign <2% 3 tu - - - - 9534/1990 Lebermet. carcinoid syndrome - benign <2% 5 survived - - 9525/1990 Lebermet. non functional - benign <2% 8 survived - - na - 9479/1990 Ileum carcinoid syndrome - benign <2% 12 survived - -
Tab. B1: Fore-und Midgut-NET Überlebensdaten, Ki67-Marker, MSI-Marker
82
B2 Jr. Nummer Organ diagnosis D17S250 MSS MSI-L MSI-H D11S956 D11S913 PYGM
26/2001 Pankreas glucagonoma - + na na N
9020/2000 Lebermetastase Vipoma - + N N N
7078/1998 Magen gastrinoma - + N N N
7008/1998 Pankreas non functional +
6107/1997 Niere non functional +
6015/1997 Leber gastrinoma +
5084/1996 Papille non functional + na N N
7029/1998 LK, Lebermet. insulinoma - +
1088/1992 Pankreas non functional +
348/1991 Duodenum non functional +
10132/1990 Dünndarm non functional +
10079/1990 Pankreas gastrinoma +
10072/1990 Dünndarm non functional - + N N N
16939/88 Pankreasschwanz insulinoma - + N N N
2761/88 Lig hepduod Gastrinom Met. - + N N N
9056/95 Pankreas insulinoma - + N N N
3976/96 Pankreasschwanz Vipoma - + N N N
894/97 Leber gastrinoma - + N N N
2899/98 Pankreas insulinoma - + N N N
7069/1998 LK non functional LOH + na na na
6128/1997 Ileum non functional + 6135/1997 LK non functional + 6109/1997 Ileum carcinoid syndrome - + na na na
5008/1996 Ileum carcinoid syndrome - + na na na
2105/1993 Duodenum carcinoid syndrome + na na na
2047/1993 Duodenum non functional - + N N N 1153/1992 Appendix non functional - + na N N 348/1991 Duodenum non functional - + N N N
10132/1990 Dünndarm non functional + 10083/1990 Dünndarm non functional +
83
Jr. Nummer Organ diagnosis D17S250 MSS MSI-L MSI-H D11S956 D11S913 PYGM
10082/1990 Dünndarm non functional LOH + na na na
10076/1990 Ileum carcinoid syndrome - + na N na
10075/1990 Ileum carcinoid syndrome - + N N na
10072/1990 Dünndarm non functional + 9988/1990 Lebermet. carcinoid syndrome - + N N N 9534/1990 Lebermet. carcinoid syndrome + 9525/1990 Lebermet. non functional _ + na na
9479/1990 Ileum carcinoid syndrome + Tab.B2: Fore-und Midgut-NET MSI- und LOH-Marker
84
B3 Jr. Nummer Organ diagnosis hMLH1 Region C p16 APC MGMT MEN1 Prom. MEN1 Exon2 HIC1 RASSF1a TIMP3 CIMP
26/2001 Pankreas glucagonoma u u m u u u u/m u/m u 3
9020/2000 Lebermetastase Vipoma u u m u u u na na u 1
7078/1998 Magen gastrinoma u u m u u u na u u 1
7008/1998 Pankreas non functional m u m u na u m u u 3
6107/1997 Niere non functional u u m u u u m u/m u 3
6015/1997 Leber gastrinoma m u u na u u m m u 3
5084/1996 Papille non functional u u m u na u na m na 2
7029/1998 LK,Lebermet. insulinoma m u u m u u na m u 3
1088/1992 Pankreas non functional u u u u u u m u/m u 2
348/1991 Duodenum non functional m u u u u u m u u 2
10132/1990 Dünndarm non functional u na 2x m na na na m na u 2
10079/1990 Pankreas gastrinoma m na 2x u u u na na m u 2
10072/1990 Dünndarm non functional m u m m m u m u/m u 6
16939/88 Pankreas-schwanz insulinoma u na 2x m na na na na u u 1
2761/88 Lig hepduod Gastrinom Met. u na na 2x na na na na na na 0
9056/95 Pankreas insulinoma m u m m u u u/m u/m u 5
3976/96 Pankreas-schwanz Vipoma m u m m u m m m u 6
894/97 Leber gastrinoma na 2x u u na u na na na na 0
2899/98 Pankreas insulinoma m na u m u u u u/m u 3
7069/1998 LK non functional u u m m u u m m u 4 6128/1997 Ileum non functional u u u u u u m u/m u 2 6135/1997 LK non functional u u m u m m u u/m u 4 6109/1997 Ileum carcinoid syndrome u u m u u u u u u 1 5008/1996 Ileum carcinoid syndrome u u m m u u m u/m u 4 2105/1993 Duodenum carcinoid syndrome u u u u u u m m u 2 2047/1993 Duodenum non functional u u m u u u u/m na u 2 1153/1992 Appendix non functional u u m u u m na m u 3 348/1991 Duodenum non functional m u m u u u m u/m u 4
10132/1990 Dünndarm non functional m u u u u u m u u 2 10083/1990 Dünndarm non functional u na 2x m na na na m na u 2
85
Jr. Nummer Organ diagnosis hMLH1 region C p16 APC MGMT MEN1 Prom. MEN1 Exon2 HIC1 RASSF1a TIMP3 CIMP
10082/1990 Dünndarm non functional m u m u u u m u u 3 10076/1990 Ileum carcinoid syndrome m u m na u m u u u 3 10075/1990 Ileum carcinoid syndr m u u u u u m m u 3 10072/1990 Dünndarm non functional m u u u u u na na u 1 9988/1990 Lebermet. carcinoid syndrome m u m m m u m u/m u 6 9534/1990 Lebermet. carcinoid syndrome m na 2x u u u u na u u 1 9525/1990 Lebermet. non functional u na m u u m na u na 2 9479/1990 Ileum carcinoid syndrome na 2x na m na 2x na na na na na 1
Tab.B3: Fore- und Midgut-NET : MSP-Analyse und Häufigkeit der Methylierung (CIMP)
86
Tab. C: CRC
ID No MLH1 P16 P14 MINT1 MINT2 MINT31 CIMP or N No of Met Loci MSI Gender Age Location Histology Dukes Stage 1 1 1 1 1 1 1 CIMP 6 H F 76 P muc or poor B 2 1 1 1 1 1 1 CIMP 6 H . 3 0 1 1 1 1 1 CIMP 5 L F 67 P wel B 4 1 1 0 1 1 1 CIMP 5 H . 5 1 1 0 1 1 1 CIMP 5 H . 6 0 1 1 1 0 1 CIMP 4 S M 35 7 0 1 1 1 1 0 CIMP 4 L M 78 D mod C 8 0 1 1 0 1 1 CIMP 4 L F 65 P mod A 9 1 1 0 0 1 1 CIMP 4 H . 10 0 1 0 1 1 1 CIMP 4 L M 67 D mod B 11 0 0 1 1 1 1 CIMP 4 S F 45 P mod A 12 0 1 0 1 1 1 CIMP 4 H . 13 0 0 1 1 1 0 CIMP 3 S F 63 P mod C 14 0 0 1 1 0 1 CIMP 3 H M 65 D mod B 15 0 1 0 1 1 0 CIMP 3 L M 70 P wel A 16 0 1 0 1 1 0 CIMP 3 S M 81 P wel D 17 0 1 0 0 1 1 CIMP 3 S M 59 D muc or poor C 18 0 1 0 0 1 1 CIMP 3 S M 64 P mod B 19 0 0 1 1 1 0 CIMP 3 L F 61 D mod C 20 0 1 0 1 1 0 CIMP 3 S F 69 D mod C 21 0 0 0 1 1 1 CIMP 3 S M 74 P wel B 22 1 0 1 0 1 0 CIMP 3 H . 23 0 1 0 1 1 0 CIMP 3 S F 59 D muc or poor D 24 0 0 1 0 1 0 CIMP 2 L F 60 D wel D 25 0 1 0 0 1 0 CIMP 2 S M 23 D mod B 26 0 0 1 0 1 0 CIMP 2 S F 52 D mod C 27 0 0 0 0 1 1 CIMP 2 S M 60 D mod B 28 0 1 0 1 0 0 CIMP 2 S F 75 P muc or poor D 29 0 0 0 0 1 1 CIMP 2 S F 74 D muc or poor D
87
ID No MLH1 P16 P14 MINT1 MINT2 MINT31 CIMP or N No of Met Loci MSI Gender Age Location Histology Dukes Stage 30 0 1 0 0 1 0 CIMP 2 S M 68 P mod D 31 0 1 0 0 0 1 CIMP 2 S M 64 D mod D 32 0 1 0 1 0 0 CIMP 2 S M 79 P mod D 33 0 1 0 0 1 0 CIMP 2 L F 74 D wel C 34 0 1 1 0 0 0 CIMP 2 S F 60 P mod C 35 0 0 1 1 0 0 CIMP 2 L F 65 P wel A 36 0 0 0 1 1 0 CIMP 2 S M 69 P wel C 37 0 0 0 1 1 0 CIMP 2 L M 75 D wel C 38 0 1 0 0 1 0 CIMP 2 S F 88 P muc or poor C 39 0 0 0 0 1 1 CIMP 2 S . 40 0 1 0 0 1 0 CIMP 2 S . 41 1 1 0 0 0 0 CIMP 2 H . 42 0 0 0 0 1 1 CIMP 2 S . 43 0 0 0 0 1 1 CIMP 2 S M 64 D wel C 44 0 0 0 0 1 1 CIMP 2 H . 45 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 54 D muc or poor D 46 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 69 D mod C 47 0 1 0 0 0 0 N 1 S M 58 D mod D 48 0 0 0 0 0 1 N 1 S F 63 D mod C 49 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 64 D mod C 50 0 1 0 0 0 0 N 1 S M 48 D mod D 51 0 0 0 0 0 1 N 1 L M 65 P mod B 52 0 0 0 0 0 1 N 1 L M 65 P mod B 53 0 0 0 0 0 1 N 1 L M 53 D mod C 54 0 0 0 0 0 1 N 1 L F 58 D mod D 55 0 1 0 0 0 0 N 1 S M 63 D mod B 56 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 65 D mod A 57 0 0 0 0 0 1 N 1 L F 73 D mod B 58 0 0 0 1 0 0 N 1 S M 55 D mod B 59 0 0 0 0 0 1 N 1 L M 25 D mod B
88
ID No MLH1 P16 P14 MINT1 MINT2 MINT31 CIMP or N No of Met Loci MSI Gender Age Location Histology Dukes Stage 60 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 53 D mod B 61 0 0 0 0 0 1 N 1 S F 45 D mod D 62 0 0 0 0 0 1 N 1 H M 47 P mod D 63 0 1 0 0 0 0 N 1 S M 64 P mod C 64 0 0 0 0 1 0 N 1 S M 63 D mod B 65 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 69 D mod C 66 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 51 D mod C 67 0 0 0 0 1 0 N 1 S F 48 D mod D 68 0 0 0 0 1 0 N 1 L M 74 D mod D 69 0 0 0 0 1 0 N 1 S F 75 D mod C 70 0 0 0 1 0 0 N 1 L F 74 P mod A 71 0 0 1 0 0 0 N 1 S F 75 D wel A 72 0 1 0 0 0 0 N 1 S F 86 P mod C 73 0 0 0 0 1 0 N 1 S M 67 D mod B 74 0 0 0 0 0 1 N 1 S F 58 P mod D 75 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 59 P mod D 76 0 1 0 0 0 0 N 1 S M 72 D mod A 77 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 73 P mod A 78 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 54 D mod B 79 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 64 D mod C 80 0 0 0 1 0 0 N 1 L F 81 D muc or poor C 81 0 0 1 0 0 0 N 1 L F 76 P mod C 82 0 1 0 0 0 0 N 1 S M 57 D mod A 83 0 1 0 0 0 0 N 1 S F 74 P mod C 84 0 0 0 0 0 1 N 1 L M 45 D mod C 85 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 64 P mod B 86 0 0 0 0 1 0 N 1 S M 77 D wel C 87 0 0 0 0 0 1 N 1 L F 82 P wel A 88 0 0 0 0 0 1 N 1 H M 37 P mod B 89 0 0 0 0 0 1 N 1 H M 56 D mod A
89
ID No MLH1 P16 P14 MINT1 MINT2 MINT31 CIMP or N No of Met Loci MSI Gender Age Location Histology Dukes Stage 90 0 0 1 0 0 0 N 1 L F 76 P mod D 91 0 0 0 0 1 0 N 1 S F 79 D mod B 92 0 0 1 0 0 0 N 1 S M 69 P mod C 93 0 0 1 0 0 0 N 1 L F 56 P wel A 94 0 0 0 0 1 0 N 1 S M 85 D mod C 95 0 1 0 0 0 0 N 1 S M 70 P mod B 96 0 0 0 0 0 1 N 1 L M 67 D wel D 97 0 1 0 0 0 0 N 1 S F 57 D wel C 98 0 0 0 0 0 1 N 1 L F 60 P mod D 99 0 0 0 0 1 0 N 1 L M 67 P mod A
100 0 1 0 0 0 0 N 1 S F 69 D wel B 101 0 0 0 0 0 0 N 0 L M 61 D mod D 102 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 60 D wel B 103 0 0 0 0 0 0 N 0 L M 46 D mod B 104 0 0 0 0 0 0 N 0 L M 70 D mod C 105 0 0 0 0 0 0 N 0 L F 73 D wel A 106 0 0 0 0 0 0 N 0 L F 57 D mod D 107 0 0 0 0 0 0 N 0 L F 67 P muc or poor D 108 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 70 D mod B 109 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 63 P mod C 110 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 56 D mod C 111 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 62 P mod A 112 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 62 D mod D 113 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 34 D wel A 114 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 47 D mod D 115 0 0 0 0 0 0 N 0 L F 52 P mod B 116 0 0 0 0 0 0 N 0 S F 59 D mod D 117 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 63 D mod B 118 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 69 P mod D 119 0 0 0 0 0 0 N 0 L F 81 D mod A
90
ID No MLH1 P16 P14 MINT1 MINT2 MINT31 CIMP or N No of Met Loci MSI Gender Age Location Histology Dukes Stage 120 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 65 D wel A 121 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 41 D mod D 122 0 0 0 0 0 0 N 0 L M 67 D mod B 123 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 73 P mod D 124 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 73 D mod C 125 0 0 0 0 0 0 N 0 S F 55 D mod B 126 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 59 D mod B 127 0 0 0 0 0 0 N 0 S F 77 D mod B 128 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 42 D mod C 129 0 0 0 0 0 0 N 0 L M 44 D wel A 130 0 0 0 0 0 0 N 0 L M 82 D mod C 131 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 53 D mod D 132 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 42 D mod C 133 0 0 0 0 0 0 N 0 L M 44 P mod C 134 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 45 D mod C 135 0 0 0 0 0 0 N 0 S F 65 D mod A
Tab. C: Kolorektale Karzinome: MSP-Analyse, CIMP-Status, MSI-Status, Patientendaten,Histologie und Dukes Stage
91
ID No MLH1 P16 P14 MINT1 MINT2 MINT31 CIMP or N No of Met Loci MSI Gender Age Location Histology Dukes Stage 136 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 62 D mod D 137 0 0 0 0 0 0 N 0 S F 56 D mod B 138 0 0 0 0 0 0 N 0 L F 60 D mod C 139 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 68 D mod B 140 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 71 D mod C 141 0 0 0 0 0 0 N 0 S F 70 P mod C 142 0 0 0 0 0 0 N 0 L M 66 D wel A 143 0 0 0 0 0 0 N 0 S F 61 D mod C 144 0 0 0 0 0 0 N 0 S F 85 D mod C 145 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 43 P muc or poor C 146 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 72 D mod B 147 0 0 0 0 0 0 N 0 L M 55 D mod C 148 0 0 0 0 0 0 N 0 L F 54 P muc or poor C 149 0 0 0 0 0 0 N 0 S F 63 D mod C 150 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 73 D mod B
Tab. C: Kolorektale Karzinome: MSP-Analyse, CIMP-Status, MSI-Status, Patientendaten,Histologie und Dukes Stage
92
Tab.I Kolon-NET
Überlebensmonate
(surv)
% der Überlebenden
(survival)
% der Verstorbenen
(failure)
Survival Standard Error Number Failed Number Left
0.000 1.0000 0 0 0 23
0.000 0.9565 0.0435 0.0425 1 22
1.000 0.9130 0.0870 0.0588 2 21
2.000 * * * 3 20
2.000 0.8261 0.1739 0.0790 4 19
6.000 0.7826 0.2174 0.0860 5 18
7.000 0.7391 0.2609 0.0916 6 17
8.000 * * * 7 16
8.000 0.6522 0.3478 0.0993 8 15
8.000 * * * 8 14
13.000 * * * 9 13
13.000 0.5590 0.4410 0.1047 10 12
14.000 0.5124 0.4876 0.1058 11 11
15.000 * * * 11 10
18.000 * * * 11 9
19.000 0.4555 0.5445 0.1083 12 8
27.000 * * * 12 7
38.000 * * * 12 6
40.000 * * * 12 5
46.000 0.3644 0.6356 0.1189 13 4
57.000 0.2733 0.7267 0.1191 14 3
62.000 * * * 14 2
68.000 * * * 14 1
99.000 * * * 14 0
93
Fore- und Midgut-NET Überlebensmonate (surv) % der Überlebenden (survival) % der Verstorbenen (failure) Survival Standard Error Number failed Number left
0.000 1.000 0 0 0 38
12.000 * * * 1 37
12.000 * * * 2 36
12.000 * * * 3 35
12.000 * * * 4 34
12.000 * * * 5 33
12.000 * * * 6 32
12.000 * * * 7 31
12.000 0.7895 0.2105 0.0661 8 30
24.000 0.7632 0.2368 0.0690 9 29
36.000 * * * 10 28
36.000 * * * 11 27
36.000 * * * 12 26
36.000 * * * 13 25
36.000 * * * 14 24
36.000 0.6053 0.3947 0.0793 15 23
48.000 * * * 15 22
48.000 * * * 15 21
60.000 * * * 15 20
60.000 * * * 15 19
60.000 * * * 15 18
72.000 * * * 15 17
72.000 * * * 15 16
72.000 * * * 15 15
84.000 * * * 15 14
84.000 * * * 15 13
84.000 * * * 15 12
94
Überlebensmonate
(surv)
% der Überlebenden
(survival)
% der Verstorbenen
(failure)
Survival Standard Error Number failed Number left
84.000 * * * 15 11
84.000 * * * 15 10
96.000 * * * 15 9
96.000 * * * 15 8
96.000 * * * 15 7
108.000 * * * 15 6
120.000 * * * 15 5
120.000 * * * 15 4
120.000 * * * 15 3
144.000 * * * 15 2
192.000 * * * 15 1
192.000 * * * 15 0
Tab.I Fore- und Midgut-NET Tab.II LOH-negative Tumoren
Überlebensmonate
(surv)
% der Überlebenden (survival) % der Verstorbenen
(failure)
Survival Standard Error Number Failed Number Left
0.000 1.0000 0 0 0 25
0.000 0.9600 0.0400 0.0392 1 24
2.000 0.9200 0.0800 0.0543 2 23
6.000 0.8800 0.1200 0.0650 3 22
7.000 0.8400 0.1600 0.0733 4 21
12.000 * * * 5 20
12.000 0.7600 0.2400 0.0854 6 19
13.000 * * * 7 18
13.000 0.6800 0.3200 0.0933 8 17
95
Überlebensmonate
(surv)
% der Überlebenden (survival) % der Verstorbenen
(failure)
Survival Standard Error Number Failed Number Left
14.000 0.6400 0.3600 0.0960 9 16
15.000 * * * 9 15
18.000 * * * 9 14
36.000 * * * 10 13
36.000 0.5486 0.4514 0.1018 11 12
40.000 * * * 11 11
48.000 * * * 11 10
60.000 * * * 11 9
60.000 * * * 11 8
84.000 * * * 11 7
96.000 * * * 11 6
96.000 * * * 11 5
99.000 * * * 11 4
120.000 * * * 11 3
120.000 * * * 11 2
192.000 * * * 11 1
192.000 * * * 11 0
Tab.II LOH-negative Tumoren
96
Tab.II LOH-positive Tumoren
Überlebensmonate (surv) % der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen (Failure) Survival Standard Error Number failed Number left
0.000 1.0000 0 0 0 9
8.000 * * * 1 8
8.000 0.7778 0.2222 0.1386 2 7
8.000 * * * 2 6
19.000 0.6481 0.3519 0.1653 3 5
24.000 0.5185 0.4815 0.1759 4 4
27.000 * * * 4 3
46.000 0.3457 0.6543 0.1835 5 2
48.000 * * * 5 1
57.000 0 1.0000 0 6 0
Tab. III CIMP- negative Tumoren
Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen
(Failure)
Survival Standard Error Number failed Number left
0.000 1.0000 0 0 0 26
1.000 0.9615 0.0385 0.0377 1 25
6.000 0.9231 0.0769 0.0523 2 24
8.000 0.8846 0.1154 0.0627 3 23
12.000 * * * 4 22
12.000 * * * 5 21
12.000 * * * 6 20
12.000 0.7308 0.2692 0.0870 7 19
18.000 * * * 7 18
36.000 * * * 8 17
36.000 * * * 9 16
36.000 0.6090 0.3910 0.0968 10 15
97
Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen
(Failure)
Survival Standard Error Number failed Number left
38.000 * * * 10 14
40.000 * * * 10 13
48.000 * * * 10 12
48.000 * * * 10 11
60.000 * * * 10 10
60.000 * * * 10 9
72.000 * * * 10 8
84.000 * * * 10 7
84.000 * * * 10 6
84.000 * * * 10 5
96.000 * * * 10 4
108.000 * * * 10 3
144.000 * * * 10 2
192.000 * * * 10 1
192.000 * * * 10 0
CIMP-negative Tumoren Tab.III CIMP-positive Tumoren
Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen (Failure) Survival Standard Error Number Failed Number Left
0.000 1.000 0 0 0 32
0.000 0.9688 0.0313 0.0308 1 31
2.000 * * * 2 30
2.000 0.9063 0.0938 0.0515 3 29
8.000 0.8750 0.1250 0.0585 4 28
8.000 * * * 4 27
12.000 * * * 5 26
12.000 * * * 6 25
98
Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen
(Failure)
Survival Standard Error Number Failed Number Left
12.000 * * * 7 24
12.000 0.7454 0.2546 0.0778 8 23
13.000 * * * 9 22
13.000 0.6806 0.3194 0.0835 10 21
14.000 0.6481 0.3519 0.0856 11 20
15.000 * * * 11 19
19.000 0.6140 0.3860 0.0876 12 18
24.000 0.5799 0.4201 0.0891 13 17
27.000 * * * 13 16
36.000 * * * 14 15
36.000 * * * 15 14
36.000 0.4712 0.5288 0.0919 16 13
46.000 0.4349 0.5651 0.0917 17 12
57.000 0.3987 0.6013 0.0909 18 11
60.000 * * * 18 10
72.000 * * * 18 9
72.000 * * * 18 8
84.000 * * * 18 7
84.000 * * * 18 6
96.000 * * * 18 5
96.000 * * * 18 4
99.000 * * * 18 3
120.000 * * * 18 2
120.000 * * * 18 1
120.000 * * * 18 0
Tab.III CIMP-positive Tumoren
99
Tab IV: Überleben nach Ki-67-Index (3 Gruppen) Ki-67<2%
Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen (Failure) Survival Standard Error Number Failed Number Left
0.000 1.0000 0 0 0 25
6.000 0.9600 0.0400 0.0392 1 24
12.000 * * * 2 23
12.000 * * * 3 22
12.000 0.8400 0.1600 0.0733 4 21
36.000 * * * 5 20
36.000 0.7600 0.2400 0.0854 6 19
60.000 * * * 6 18
60.000 * * * 6 17
60.000 * * * 6 16
72.000 * * * 6 15
72.000 * * * 6 14
84.000 * * * 6 13
84.000 * * * 6 12
84.000 * * * 6 11
84.000 * * * 6 10
84.000 * * * 6 9
96.000 * * * 6 8
96.000 * * * 6 7
108.000 * * * 6 6
120.000 * * * 6 5
120.000 * * * 6 4
120.000 * * * 6 3
144.000 * * * 6 2
192.000 * * * 6 1
192.000 * * * 6 0
100
Ki-67=2-29 % Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen
(Failure)
Survival Standard Error Number Failed Number Left
0.000 1.000 0 0 0 16
8.000 * * * 0 15
12.000 * * * 1 14
12.000 * * * 2 13
12.000 * * * 3 12
12.000 * * * 4 11
12.000 0.6667 0.3333 0.1217 5 10
24.000 0.6000 0.4000 0.1265 6 9
27.000 * * * 6 8
36.000 * * * 7 7
36.000 * * * 8 6
36.000 * * * 9 5
36.000 0.3000 0.7000 0.1235 10 4
48.000 * * * 10 3
48.000 * * * 10 2
72.000 * * * 10 1
96.000 * * * 10 0
101
Ki-67 >29% Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen
(Failure)
Survival Standard Error Number Failed Number Left
0.000 1.000 0 0 0 20
0.000 0.9500 0.0500 0.0487 1 19
1.000 0.9000 0.1000 0.0671 2 18
2.000 * * * 3 17
2.000 0.8000 0.2000 0.0894 4 16
7.000 0.7500 0.2500 0.0968 5 15
8.000 * * * 6 14
8.000 0.6500 0.3500 0.1067 7 13
13.000 * * * 8 12
13.000 0.5500 0.4500 0.1112 9 11
14.000 0.5000 0.5000 0.1118 10 10
15.000 * * * 10 9
18.000 * * * 10 8
19.000 0.4375 0.5625 0.1140 11 7
38.000 * * * 11 6
40.000 * * * 11 5
46.000 0.3500 0.6500 0.1202 12 4
57.000 0.2625 0.7375 0.1177 13 3
62.000 * * * 13 2
68.000 * * * 13 1
99.000 * * * 13 0
102
Tab.V Überleben Kolon-NET und Ki-67<2%
Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen
(Failure)
Survival Standard Error Number Failed Number Left
0.000 1.000 0 0 0 1
6.000 0 1.0000 0 1 0
Überleben Kolon-NET und Ki-67=2-29%
Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen
(Failure)
Survival Standard Error Number Failed Number Left
0.000 1.000 0 0 0 2
8.000 * * * 0 1
27.000 * * * 0 0
Überleben Kolon-NET und Ki-67>29%
Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen
(Failure)
Survival Standard Error Number Failed Number Left
0.000 1.000 0 0 0 20
0.000 0.9500 0.0500 0.0487 1 19
1.000 0.9000 0.1000 0.0671 2 18
2.000 * * * 3 17
2.000 0.8000 0.2000 0.0894 4 16
7.000 0.7500 0.2500 0.0968 5 15
8.000 * * * 6 14
8.000 0.6500 0.3500 0.1067 7 13
13.000 * * * 8 12
13.000 0.5500 0.4500 0.1112 9 11
14.000 0.5000 0.5000 0.1118 10 10
15.000 * * * 10 9
18.000 * * * 10 8
103
Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen
(Failure)
Survival Standard Error Number Failed Number Left
19.000 0.4375 0.5625 0.1140 11 7
38.000 * * * 11 6
40.000 * * * 11 5
46.000 0.3500 0.6500 0.1202 12 4
57.000 0.2625 0.7375 0.1177 13 3
62.000 * * * 13 2
68.000 * * * 13 1
99.000 * * * 13 0
Überleben Kolon-NET und Ki-67>29% Überleben Fore-und Midgut-NET und Ki-67<2%
Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen (Failure) Survival Standard Error Number Failed Number Left
0.000 1.000 0 0 0 24
12.000 * * * 1 23
12.000 * * * 2 22
12.000 0.8750 0.1250 0.0675 3 21
36.000 * * * 4 20
36.000 0.7917 0.2083 0.0829 5 19
60.000 * * * 5 18
60.000 * * * 5 17
60.000 * * * 5 16
72.000 * * * 5 15
72.000 * * * 5 14
84.000 * * * 5 13
84.000 * * * 5 12
84.000 * * * 5 11
84.000 * * * 5 10
104
Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen
(Failure)
Survival Standard Error Number Failed Number Left
84.000 * * * 5 9
96.000 * * * 5 8
96.000 * * * 5 7
108.000 * * * 5 6
120.000 * * * 5 5
120.000 * * * 5 4
120.000 * * * 5 3
144.000 * * * 5 2
192.000 * * * 5 1
192.000 * * * 5 0
Überleben Fore-und Midgut-NET und Ki-67<2%
105
Überleben Fore-und Midgut-NET und Ki-67=2-29% Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen
(Failure)
Survival Standard Error Number Failed Number Left
0.000 1.0000 0 0 0 14
12.000 * * * 1 13
12.000 * * * 2 12
12.000 * * * 3 11
12.000 * * * 4 10
12.000 0.6429 0.3571 0.1281 5 9
24.000 0.5714 0.4286 0.1323 6 8
36.000 * * * 7 7
36.000 * * * 8 6
36.000 * * * 9 5
36.000 0.2857 0.7143 0.1207 10 4
48.000 * * * 10 3
48.000 * * * 10 2
72.000 * * * 10 1
96.000 * * * 10 0
Es gab keine Fore-und Midgut-Tumoren mit Ki67-Index >29%.
106
Tab.VI: Überleben nach Ki-67-Index (2 Gruppen) Ki-67<2%
Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen (Failure) Survival Standard Error Number Failed Number Left
0.000 1.0000 0 0 0 25
6.000 0.9600 0.0400 0.0392 1 24
12.000 * * * 2 23
12.000 * * * 3 22
12.000 0.8400 0.1600 0.0733 4 21
36.000 * * * 5 20
36.000 0.7600 0.2400 0.0854 6 19
60.000 * * * 6 18
60.000 * * * 6 17
60.000 * * * 6 16
72.000 * * * 6 15
72.000 * * * 6 14
84.000 * * * 6 13
84.000 * * * 6 12
84.000 * * * 6 11
84.000 * * * 6 10
84.000 * * * 6 9
96.000 * * * 6 8
96.000 * * * 6 7
108.000 * * * 6 6
120.000 * * * 6 5
120.000 * * * 6 4
120.000 * * * 6 3
144.000 * * * 6 2
192.000 * * * 6 1
192.000 * * * 6 0
107
Ki-67>2% Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen (Failure) Survival Standard Error Number Failed Number Left
0.000 1.000 0 0 0 36
0.000 0.9722 0.0278 0.0274 1 35
1.000 0.9444 0.0556 0.0382 2 34
2.000 * * * 3 33
2.000 0.8889 0.1111 0.0524 4 32
7.000 0.8611 0.1389 0.0576 5 31
8.000 * * * 6 30
8.000 0.8056 0.1944 0.0660 7 29
8.000 * * * 7 28
12.000 * * * 8 27
12.000 * * * 9 26
12.000 * * * 10 25
12.000 * * * 11 24
12.000 0.6617 0.3383 0.0796 12 23
13.000 * * * 13 22
13.000 0.6042 0.3958 0.0824 14 21
14.000 0.5754 0.4246 0.0834 15 20
15.000 * * * 15 19
18.000 * * * 15 18
19.000 0.5434 0.4566 0.0846 16 17
24.000 0.5115 0.4885 0.0855 17 16
27.000 * * * 17 15
36.000 * * * 18 14
36.000 * * * 19 13
36.000 * * * 20 12
36.000 0.3751 0.6249 0.0857 21 11
38.000 * * * 21 10
108
Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen
(Failure)
Survival Standard Error Number Failed Number Left
40.000 * * * 21 9
46.000 0.3334 0.6666 0.0857 22 8
48.000 * * * 22 7
48.000 * * * 22 6
57.000 0.2778 0.7222 0.0876 23 5
62.000 * * * 23 4
68.000 * * * 23 3
72.000 * * * 23 2
96.000 * * * 23 1
99.000 * * * 23 0
Ki-67 >2%
109
Tab.VII: Klinische Daten der Hindgut- NET Lauf-
nummer Geschlecht Alter
Überlebens
Zeit (m)
Status
Lokalisation Histologie Metastasen
Tumor-
größe CIMP
Todes-
ursache
Sekretion/
Marker
Ki 67-
Index
Tumor-
grading
1cc - - - - Kolon kleinzellig - - + - - 65% Schlecht diff.
2cc - - - - Kolon kleinzellig - - + - - 70% Schlecht diff.
3cc - - - Kolon kleinzellig - - - - - 85% Schlecht diff.
4cc - - - - Kolon kleinzellig - - - - - 90% Schlecht diff.
5cc - - - - Kolon kleinzellig - - + - - 50% Schlecht diff.
6cc - - - - Kolon kleinzellig - - - - - 60% Schlecht diff.
7cc - - - - Kolon kleinzellig - - - - - 80% Schlecht diff.
8cc m 74 99 lebt Kolon
ascendens kleinzellig
Leber, LK
retroperitoneal faustgroß + - Syn+ 60% Schlecht diff.
9cc -- - - - Kolon kleinzellig --- -- + -- -- 50% Schlecht diff.
10cc m 71 15 lebt Rektum kleinzellig -- 1.6cm + - Syn+,CG+ 50% Schlecht diff.
11cc m 67 18 lebt
Jun06
Sigmoid
Kolon kleinzellig
Knochen,
Leber,
Milz,
Oberbauch,
axillär, iliacal,
paraaortale LK
3cm - - Syn+, Sero+, 40% Schlecht diff.,
G2
12cc w 77 27 lebt Kolon kleinzellig --- 0.6x
0.5cm + -
Syn+, CG+,
Sero+ 2-5%
Schlecht diff.;
wdNEC
13cc w 54 8 tot Kolon kleinzellig Leber, LK --- + Tumortoxischer
Kollaps Syn+, CG+, >50%
Schlecht diff.,
G3
14cc w 62 8 lebt
Kolon(
terminales
Ileum)
kleinzellig LK 1.3x0.8cm + -- CG+,
Sero++ 3%
Schlecht diff.
wdNEC,G1
15cc m 53 2 tot Kolon kleinzellig Leber -- + Tumor Syn+, 80%
Schlecht diff.,low
grade anaplastic
large cell NEC
110
Lauf-
nummer Geschlecht Alter
Überlebens
Zeit (m)
Status
Lokalisation Histologie Metastasen
Tumor-
größe CIMP
Todes-
ursache
Sekretion/
Marker
Ki 67-
Index
Tumor-
grading
16cc w 57 - -- Kolon
(Caecum) kleinzellig LK 1.2cm + --
Syn+,
CG+,Sero+ 50%
Schlecht diff.,
wdNEC
18cc w 70 - -- Kolon kleinzellig -- -- - - NSE+, Glu+,
PPfocal++ <2%
Schlecht
diff.,trabecular
growth pattern
19cc m 70 - -- Kolon kleinzellig - -- + -- NSE+, 20% Schlecht diff.
20cc w 60 40 lebt Kolon kleinzellig -- -- - -- -- 50% Schlecht diff.
Legende: CIMP Sonstiges:
- = keine Daten verfügbar Sero+= Serotonin + = 3/ 8 Gene waren methyliert Syn+= Tumor anfärbbar für Synaptophysin NSE+= Neuronenspezifische Enolase - = <3/8 Gene waren methyliert CG+ = Tumor anffärbbar für Chromogranin A Glu+ = Glukagon; na: nicht (genügend) Tumoren für CIMP-Status- PP+ = pankreatisches Polypeptid Bestimmung amplifiziert Status: Stand August 2006
111
Lauf-nummer Geschlecht Alter Überlebens
Zeit(m)
Status
Lokalisation Histologie Metastasen
Tumor-
größe CIMP
Todes-
ursache
Sekretion/
Marker Ki 67- Index
Tumor-
grading
12T w 81 8 Tot Rektum
Undifferen
ziertes CA Leber -- - -- -- 90% Schlecht diff.
13T m 69 13 tot Kolon transversum Undifferen
ziertes CA Leber (solitär) -- + -- -- 50% Schlecht diff.
14T m 49 57 tot Sigma Undifferen
ziertes CA Leber (diffus) -- + -- -- 90% Schlecht diff.
15T m 32 19 tot Kolon ascendens Undifferen
ziertes CA 0 -- + -- -- 30% Schlecht diff.
16T m 29 13 tot Rektum Undifferen
ziertes CA Leber, Peritoneum -- + -- -- 50% Schlecht diff.
17T w 63 0 tot Kolonflexur
rechts
Undifferen
ziertes CA Lunge, Leber, -- + k.A. -- 60% Schlecht diff.
18T m 57 7 tot Rektum Undifferen
ziertes CA Leber (diffus) -- na -- -- 50% Schlecht diff.
19T m 32 14 tot Sigma Undifferen
ziertes CA Leber, Hirn -- + -- -- 50% Schlecht diff.
20T m 55 6 tot Rectum Undifferen
ziertes CA LK A. mesenterica inferior -- - -- -- <2% Schlecht diff.
21cc m 64 2 tot Kolon kleinzellig Leber, M an 11 meso-kolischenLK 6,5cm + Tumor Syn+ 75% Schlecht diff.
22cc w 92 1 tot Kolon kleinzellig - -- - Tumor -- 75% Schlecht diff.
23cc w 58 68 lebt Kolon kleinzellig Leber-M. -- na -- -- 85% Schlecht diff.
24cc m 54 62 lebt Kolon kleinzellig - -- na -- -- 45% Schlecht diff.
25cc w 85 46 tot Kolon kleinzellig - -- + k.A. -- 45% Schlecht diff.
26cc m 56 38 lebt Rektumpolyp kleinzellig - -- - -- -- 65% Schlecht diff.
112
10 Publikation
Arnold CN, Nagasaka T, Goel A, Scharf I, Grabowski P, Sosnowski A, Schmitt-Gräff A, Boland
CR, Arnold R, Blum HE (2008). Molecular characteristics and predictors of survival in patients
with malignant neuroendocrine tumors. Int J Cancer 2008 Oct 1; 123 (7): 1556-64.
113
11 Danksagung
Herrn Prof. Dr. Drs. h.c. H.E. Blum möchte ich sehr für die Möglichkeit danken, in seiner
Abteilung meine Dissertation über dieses interessante Thema schreiben zu dürfen, sowie Frau
Prof. Dr. Annette Schmitt-Gräff für ihr Interesse an dieser Arbeit und die Bereitstellung einiger
Tumorpräparate.
Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater und Betreuer PD Dr. med. Christian Arnold für die
Überlassung des Themas, die sorgfältige Einarbeitung in die Methodik, sowie seine geduldige und
kontinuierliche Unterstützung während der Durchführung und Niederschrift der Arbeit. Auch danke
ich ihm für seine konstruktive Kritik und seinen Rat in schwierigen Phasen der Dissertation. Ebenso
verdanke ich ihm die Möglichkeit, an einer Publikation beteiligt zu sein. Ohne ihn wäre diese
Arbeit nicht zu Stande gekommen.
Herrn Prof. Dr. Oliver Opitz danke ich herzlich für seine Bereitschaft das Zweitgutachten zu
erstellen.
Des weiteren möchte ich auch meiner Vorgängerin in derselben Arbeitsgruppe, Dr. med. Andrea
Sosnowski gerne danken: zum einen für die Überlassung einiger Abbildungen im Einleitungsteil
und Tabellen im Methodenteil, zum anderen auch für hilfreiche Tipps während der experimentellen
Phase, sowie für ihre allgemeine Bereitschaft, mich zu unterstützen.
Den Mitarbeitern des B5-Labors der Medizinischen Klinik Freiburg, insbesondere Wolfgang
Mössner, Angela Queisser und Eva Egenter danke ich sehr für alle technische Unterstützung, die
herzliche Arbeitsatmosphäre und die freundschaftliche Verbundenheit.
Außerdem möchte ich mich auch bei allen Mitarbeitern der B-Labore bedanken, die mir gerne mit
ihrer Erfahrung und Hilfsbereitschaft zur Seite gestanden sind.
Ebenso danke ich den Mitarbeitern des Pathologischen Institutes, insbesondere Frau Bärbel
Weinhold, für die Durchführung der Ki-67-Färbungen.
Herrn Prof. Dr. Schulte-Mönting vom Institut für Biometrie und Medizinische Informatik Freiburg
danke ich für die Beratung in statistischen Fragen und die Durchführung großer Teile der
statistischen Auswertung.
114
Abschließend möchte ich mich bei all denen bedanken, die mich in den letzten Jahren auf diesem
Weg begleitet und unterstützt haben. Da sind besonders Freunde von „Studenten für Christus“
Freiburg, Studienkollegen und vor allem meine Familie zu nennen, ohne deren Ermutigung ich
sicherlich nicht so weit gekommen wäre.
115
12 Lebenslauf
PERSÖNLICHE DATEN Name Iris Christine Scharf
Geburtsdatum 06.06.1982
Geburtsort Berlin
Familienstand ledig
Staatsangehörigkeit deutsch
Eltern Hanns-Peter Scharf, Doktorand der Theologie,
verstorben 1987
Sabine Scharf, geb. Zimmer, Diplom-Theologin
Geschwister Andreas (1984)
SCHULBILDUNG 1988-1992 Grundschule Masseldorn, Mosbach
1992- 2001 Nikolaus- Kistner- Gymnasium, Mosbach
2001 Abitur
HOCHSCHULBILDUNG Seit 10/2001 Medizinstudium an der Albert-Ludwigs-
Universität Freiburg
9/2003 Physikum
Seit 10/2005 Dissertation bei PD Dr. med. Arnold und
Prof. Dr. Drs. h. c. H.E.Blum
FAMULATUREN 2/2004- 4/2004 Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe,
Kreiskrankenhaus Mosbach
8/2004- 10/2004 Dawe Langano Rural Clinic, Äthiopien
9/2005– 10/2005 Abteilung Innere Medizin, Lorettokrankenhaus
Freiburg
PRAKTISCHES JAHR 02/2007- 12/2007 Ev. Diakonissenkrankenhaus Karlsruhe- Rüppurr
STUDIENABSCHLUSS
5/2008- 12/2008 Kolloquium und Abschluss des Promotionsverfahrens
10/2008- 11/2008 Staatsexamen- 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
116