Biochemisches Praktikum II
Versuch 1C
Bestimmung der Bindungsaffinität (KD-Wert) und der Bindungskinetik
eines Peptids zu TAP
Christoph Baldauf
BC
-II P
rakt
ikum
WS
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Ver
such
1C
TAP1
N
ER Lumen
Zytosol
TAP2
N
C C
Peptidbindungs-region
1 2 3 4 5 6 6 5 4 3 2 1
core-DomäneN-Domäne
Membrantopologie des Peptidtransporters TAP
ATPATP
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1C
Peptid-Spezifität und SelektivitätB
C-II
Pra
ktik
um W
S 0
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1C
KNR R
WY
FLRY
position 1 2 3 4 5 6 7 8 9DE
P DEG
DENS
sele
ctiv
ity
favo
red
disf
avor
ed
Selektivität1. höchste Spezifität für
Peptide von 8-12 AS
2. essentiell sind die ersten
drei N-terminalen und C-terminale AS (Anker-AS)
3. sehr flexible Peptid-Bindungstasche;
Bindung von verzweigten Peptiden
und Peptiden mit großen Fluorophoren möglich
RRYCKSTEL (C4F-Peptid)
BindungsaffinitätB
C-II
Pra
ktik
um W
S 0
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1C
• Die Affinität ist ein Maß für die Bindungsstärke zwischen Bindungspartnern bei Protein-Ligand Wechselwirkungen
• Je höher die Affinität desto größer die Affinitätskonstante KA (M-1)
• Gängigerweise wird jedoch das reziproke Maß gebraucht, die Dissoziationskonstante KD (M)
• Je höher die Affinität eines Proteins zu seinem Liganden, desto niedriger die Dissoziationskonstante (KD) des Komplexes
Assoziationskonstante
Dissoziationskonstante
Bestimmung der Bindungsaffinität eines Peptidszu TAP
0 100 200 300 4000
5
10
15
C4F-Peptid (nM)
nM g
ebun
dene
s Pe
ptid
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fitten mittels‘one-site binding curve (hyperbole)‘
Y=Bmax*X/(KD+X)
Kd
Bmax
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1C
Pipettierschema
-> Kompetitorpeptid:
400facher Überschuss (mind. 1µl)
-> TAP in Mikrosomen
eingestellt auf 5 mg/ml; davon 7 µl
-> Endvolumen:
50 µl
X X X X
X X X