BIOTECHNOLOGIE
Der Schlüssel zum 21. Jahrhundert?
Katja Otto, ETHZ, Institut für Biotechnologie21. Januar 2004
Was ist Biotechnologie?…the application of scientific and engineering principles to the processing of materials by biological agents
(Definition OECD)
Katja Otto, ETHZ, Institut für Biotechnologie21. Januar 2004
BiologieChemie
Technik
Biotechnologie
Katja Otto, ETHZ, Institut für Biotechnologie21. Januar 2004
Biotechnologie heute
ROTE BT
BLAUE BT
WEISSE BT
GRÜNE BT
Awendungen als Alternative zur chemischen IndustrieBiotechnologie im Agrarsektor
Grundlagenforschung Identifizierung von
Meeresorganismen mit biotechnologischem Anwendungs-
potenzial
Anwendungen im Gesundheitswesen
Industrielle Prozesse, basierend auf biologischen Systemen,
zum Beispiel....
isolierten Enzymen
WEISSE
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BIOTECHNOLOGI
ganzen ZellenPilze
BakterienHefen
nachwachsendenRohstoffenZellulose
Stärke
Pflanzliche Öle
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Parameter für biotechnologische Prozesse
B.Hauer, BASF
Produktionsvol. [t a-1]Raum-Zeit Ausbeute [Mol Produkt L-1 d-1] Produkt Konzentrationen
Biokatalysator Kosten / kg P
Prozess
> 1000 100-10000.03-0.330-30000
1-10%>10%
< 0.5 4-5
kontinuierlich batch
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Chemikalien Bulk Fein
AUSWIRKUNG AUF DIE CHEMISCHE INDUSTRIE IN 2010
McKinsey Analyse: Auswirkungen der Biotechnologie auf die chemische Industrie
10%
20%
2010Zeit2000
Abhängig von...• Technologie Entwicklung• Welweite Nachfrage• Rohstoffpreise• Politische Rahmenbedingungen
2004
Katja Otto, ETHZ, Institut für Biotechnologie21. Januar 2004
Welche Enzyme werden als Biokatalysatoren genutzt?
Straathof, A., Panke S., Schmid A. (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13, 548-556Faber, K. (2000) Biotransf. in Org. Synthesis, Springer 4th ed.
Oxidoreduktasen
Transferasen
Lyasen
Isomerasen
~ 5% 11%
Hydrolasen65% 45%
~ 5% 12%
25% 28%
~ 1% 4%
Ganze ZellenReduktion
Oxidation
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Produkte
Straathof, A., Panke S., Schmid A. (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13, 548-556
Kohlenhydrate
FettsäurenSteroide
Amino-säuren
sec-AlkoholeNucleotide
chirale
achirale
Peptide /-lactam Antibiotika
Andere:
Nachhaltige Bioprozesse in der chemischen Industrie
Produkt Katalysator Unternehmen
SO42- Entfernung Sulfat-reduzierende
Mikrobe BudelZink
7-ACA D-Amino acid OxidaseGlutaryl Amidase
Biochemie
H2O2 Entfernung aus Textilien
Katalase Windel
Vitamin B2 Hefe BASF
Indigo Naphthalin Dioxygenase Gencore
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Production von 7-ACA
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BIOTECHNOLOGI
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7 – Amino – Cephalosporanic Acid
NH2
N
S
OO
OCOOH
Fakten
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Prozessentwicklung von Hoechst, später gekauft und optimiert von Biochemie, NovartisGenericsGrund: Zusätzliche Steuer auf Sondermüll (Verbrennung)7-ACA spielt eine zentrale Rolle in der Synthese von semi-synthetischen CephalosporinenNachfrage: 2000 t pro Jahr
Synthese von 7-ACANH
N
S
ONH2
HOOC
OO
OCOOH
NH2
N
S
OO
OCOOH
NH
N
S
OO
O
OCOOH
HN SI
O
OSI
NH
N
S
OO
O
OCOOH
HOOC
NH
N
S
OO
HOOC
OO
OCOOH
D-AAO
spontan
Glutaryl amidase
N
Cl
HN
N
S
O
OCOOHO
SI
O
OSI
(ZnCPC)
TMSCI
T< 0oC PCl5
T< 0oCHydrolyse
7-ACA Prozess im Überblick
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Enzymproduktion E. Coli; Trijonopsis variabilis
Enzym reinigung
Immobilisierung(Eupergit)
Batch Reaktor(10000L)
Produktkristallisation 2000 t a-1
Chemisches VerfahrenGebrauch von N,N–dimethylanilin, (CH3)3SiCl, PCl5 GIFTIGSchutzgasatmosphäreNiedrige Temperaturen <0oC hoher EnergieaufwandAufwendige AbluftreinigungAufwendige AbwasserreinigungSchwermetal Entsorgung (Verwendung von Zn-Salzen)
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Biotechnologischer Prozess
Keine giftigen ChemikalienKeine Lösungsmittel (I)RaumtemperaturKeine zusätzliche Abwasser ReinigungStark reduzierte Abluftemissionen
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Vergleich
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Chemisch BT
Sondermüll (Verbrennung) 100 0.7Abwasser 100 90
Zinkabfall 100 0
Lösungsmittel (1) 0100 Lösungsmittel (2)
2.5100
Energie
80100
OECD 2001
Indigo
Indigofera tinctoria
Pseudomonas putida
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Traditionell
Indigofera tinctoria
Indigofera Blätter
Fermentation (Gärung) Indoxyl
„Schlagen” der Fermentationsbrühe
Oxidation zum Indigo
Wasserunlösliche Paste
Reduktion imFärbesud = Küpe
Trocknen = Rück-oxidation zum Indigo Färben
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Chemisch
Früher Gewinnung von N-Phenylglycin aus Anilin u. Chloressigsäureheute durch Hydrolyse von Anilinoacetonitril
NH CH2 COOH
180-200oCKOH - NaOH
+NaNH2 Na+
+O2 Indigo
A. Baeyer 1878 (BASF)Heumannsches Verfahren (seit 1890)
NH
OH
Prozessentwicklung (I)Ensley, Ratzkin, Osslund, Simon, Wackett, Gibson; 1983, Science, 222:167-169
NH
COOH
NH2 NHTryptophanase
Naphthalen Dioxygenase
spontanNH
OH
NH
ONH
O
Luft
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In rekombinatem E. Coli
NH
OH
OH
Prozessentwicklung (II)Niedrige Naphthalen Dioxygenase AktivitätIndol Konzentrationen >400mg L-1 sind toxisch durch Inaktivierung des Ferredoxin SystemsHohe Indirubin Konzentration Farbstoff zu rotIndol und Tryptophan als Ausgangsmaterial sind zu teuer
PROBLEME
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ProzessentwicklungKonstruktion von besseren Plasmiden mit starken Promotorsequenzen Höhere Oxygenaseaktivität in E. coli.Klonierung der Ferredoxingene Höhere Konzentration in der ZelleSite Directed Mutagenesis der Ferredoxingene stabileres FerredoxinEinführen einer Isatin Hydrolase reduzierter Indirubin GehaltMetabolic Engeneering Glukose als Ausgangsmaterial billig
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LÖSUNG
Indigo via moderner Biotechnologie
Bialy, Nat. Biotech. (1997) 15: 110
ERGEBNIS
GlukoseNH
COOH
NH2 NHTryptophanase
Naphthalen Dioxygenase
spontanNH
OH
NH
ONH
O
Luft
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NH
OH
OH
Ergebniss
Genencor, USA
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Biotechnologische Prozesse für den Umweltschutz
Indikatorsysteme, basierend auf enzym-katalysierten Reaktionen
Reinigung von kontaminierten Böden Wässern Luft durch Mikroorganismen
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BIOTECHNOLOGI
Haut PigmentierungBlackfoot Krankheit
Äussere Symptome der Arsenicosis
Katja Otto, ETHZ, Institut für Biotechnologie21. Januar 2004
Quelle: Alexander J.B. Zehnder & Jan Roelof van der Meer, EAWAGZusammenarbeit mit Sylvia Daunert, Universität von Kentucky
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Verbreitung von Arsenbelastetem Grundwasser
Pakistan
3.6 n 11 Mio.?Vietnam
Nepal
LaosKambodia
ThailandSumatra
n naturala anthropogenicm mineral wastesmg L-1
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Arsenresistenz in Prokaryonten
arsA
As(III)
ArsC
As(V)
ArsAB
As(III)
Bakterienzelle
As(III)
arsR arsD arsB arsC
Quelle: Prof. Alexander J.B. Zehnder, EAWAG
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BIOTECHNOLOGI
ArsRAs(III)
Reportergen lacZ kodiert ß-Galaktosidase
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Stammt aus dem lac-Operon von E.coliß-Galaktosidase spaltet X-Gal blaue Farbe
O
O
OH
OH
CH2OH
NH
Cl Br
OH
NH
Cl Br
OH
NH
NH
ClBr
ClBr
O
O
O
OH
OH
OH
CH2OH
OH
ß-Galactosidase
spontan
+
Entwicklung eines Arsenit Indikators
arsR lacZ
ArsR
LacZArsR
Aufgrund des Expressionsmechanismus der ars Gene, kommt es immer zu einer Hintergrundreaktion
0
12
24
62 µgL-1
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Quelle: Prof. Alexander J.B. Zehnder, EAWAG
arsR lacZArsR ArsR
arsR lacZ
ArsR ArsRAs(III) As(III)
LacZ
LacZLacZ
LacZ
‚AUS‘
‚AN‘
Reduktion der Hintergrundreaktion
Katja Otto, ETHZ, Institut für Biotechnologie21. Januar 2004 Katja Otto, ETHZ, Institut für Biotechnologie21. Januar 2004
Quelle: Prof. Alexander J.B. Zehnder, EAWAG
80 µgL-1
60 µgL-1
40 µgL-1
30 µgL-1
15 µgL-1
8 µgL-1
4 µgL-1
0 µgL-1
Fertiges Produkt
Einfach zu verwendenEinfach aufzubewahrenSehr empfindlich
Inkubations Temperatur: 30 oC Inkubationszeit: 30 min Farbentwicklung: 30 min
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Quelle: Prof. Alexander J.B. Zehnder, EAWAG
Lyophilisierte E. coli werden zusammen mit einer x-Gal Lösung auf die Testplättchen aufgebracht
Biologische Abluftreinigung (B-ALR)
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Prof. Engesser, Uni Stuttgart
Ca. 15 bis 20 % aller industrieller Emissionen können durch biologische Verfahren gereinigt werden
CnHn+2: n-Hexan, n-HeptanEster: Ethylacetat, 1-Propylacetat, 2-PropylacetatEther: Methoxypropanol, EthoxypropanolKetone: Aceton, 2-ButanonAlkohole: Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1-Butanol,
2-Butanol
Beispiel: Druckereiabluft
Der BiowäscherDer „klassische“ Biowäscher besteht aus der
Kombination zweier Verfahren:
Absorption von gasförmigenAbluftstoffen in einem Wäscher
Biologischer Abbau dieser Stoffe in einem Belebungstank
+
Katja Otto, ETHZ, Institut für Biotechnologie21. Januar 2004
Prof. Engesser, Uni Stuttgart
Funktionsschaubild
Belebungsbecken
Abluft
Reinluft
Prof. Engesser, Uni Stuttgart
Prof. Engesser, Uni Stuttgart
Think Big….
Sammlung Abluft
Belebungsbecken
BIOLOGISCHE
ABLUFTREINIGUNG
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Füllkörper der Wascheinheit
Ein Aufwuchs von Mikroorganismen ist nicht beabsichtigt!
Polystyrolringe zur Oberflächenvergrösserung besserer Übergang der gasförmigen Abluftinhaltsstoffe in die Waschflüssigkeit
Prof. Engesser, Uni Stuttgart
Katja Otto, ETHZ, Institut für Biotechnologie21. Januar 2004
1010 bis 1011 Zellen pro ml (OD546 > 60)hohe morphologische Diversität
Pilzdichte: 107 bis 108 KBEvor allem Hefen und hyphenbildende Pilze
Prof. Engesser, Uni Stuttgart
Katja Otto, ETHZ, Institut für Biotechnologie21. Januar 2004
Abbau durch MOs im Belebungsbecken
Biotech E suuberi Sach?!
Verstopfung des Gitterrosts
Clogging der Packung
Prof. Engesser, Uni Stuttgart
Katja Otto, ETHZ, Institut für Biotechnologie21. Januar 2004
Voraussetzungen und Nachteile der BIO-ALR
Voraussetzungen:Abluft muss richtige Temperatur habenAbluft muss richtige Feuchte habenAbluft muss frei von Fetten und Stäuben sein
Nachteile / Probleme:Schlechtes Übergangsverhalten gas / flüssig bei einigen StoffenKeine Konvektion im Biofilm, nur DiffusionAufzucht stabiler BiozönosenClogging
Prof. Engesser, Uni Stuttgart
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VorteileHoher Wirkungsgrad bzgl. der erforderlichen Geruchsminderung.Dynamisches SystemGeringe BetriebskostenDurch den biologischen Abbau der Schadstoffe wird das Problem nicht von der Abluft in andere Kompartimente verlagertEs entstehen keine Sekundäremissionen
Prof. Engesser, Uni Stuttgart
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Grüne Biotechnologie
transgene Pflanzen mit Schädlings- oder Herbizidtoleranztransgene Pflanzen mit höheren ErträgenFunctional FoodNutraceuticals
N
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BIOTECHNOLOGI
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Alle Anwendungen von Biotechno-logie im Agrarsektor
Weltweiter Anbau von GenTechPflanzen
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BIOTECHNOLOGI
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1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003
18 Länder ges.
0
70
60
5040
30
20
10
Mio
. Hek
t ar
Zunahme um 15% zw 2002 und 2003
IndustriestaatenEntwicklungsländer
ISAAA
Transgene Nutzpflanzen—ein kontroverses Thema
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BIOTECHNOLOGI
Pro
Signifikante Ertragssteigerung Einsparungen von Anbaufläche
Schädlingsresistenzen Weniger Pestizide
National Center for Food & Agricultural Policy
Lösung des Ernährungsproblem der Dritten Welt
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Medizinischer Nutzen
Unkontrollierten Ausbreitung Rückgang der genetischen VielfaltNegative Auswirkungen auf das Ökosystem
Contra
Angst vor negativen Auswirkungen auf den Menschen (z.B. Allergien)
Deklarierungsproblematik
Unkontrollierter Gentransfer Entstehug von resistenten Schädlingen
Mangelnde Akzeptanz beim Endverbraucher
Transgene Nutzpflanzen—ein kontroverses Thema
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BIOTECHNOLOGI
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Goldener Reis
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BIOTECHNOLOGI
Prof. Dr. Ingo Potrykus (re)Prof. Dr. Peter Beyer (li)
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Ye, X., Al-Babili, S., Kloti, A., Zhang, J., Lucca, P., Beyer, P., Potrykus, I. (2000), Science, 287, 303
Motivation
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BIOTECHNOLOGI
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Vitamin A Mangel
Xerophthalmie
Nachtblindheit
Wachstumsstörung
erhöhte Infektions
anfälligkeit
½ Mio Kindererblinden jährlich
1-2 Mio Kindersterben jährlich
500 000 MillionenMenschen sind weltweit betroffen
Vitamin A & Reis — keine Liebesbeziehung
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BIOTECHNOLOGI
Grundnahrungsmittel für 2 Milliarden Menschen
Kein Vitamin A im Endosperm
Hoher Fettsäure- gehalt in der Schale, wenig Vit. A
GGPP im Endosperm
Synthese von Vitamin A
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BIOTECHNOLOGI
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-Carotin (C40)
GGPP (C20)Phytoen Synthase
Phytoen (C40)Phytoen Desaturase
-Carotin DesaturaseLycopen (C40) ß-Carotin
Lycopen Cyclase
Methode
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+
psy & lyc Narcissus pseudonarcissus+ crtI Erwinia uredova
Golden rice 1.6 g g-1 -Carotin
Japonica Taipei 302
Status Quo (2001)
Konstruktion einer tropischen Golden Rice Sorte mit Hilfe der gleichen TechnologieErhöhung der -Carotin Produktion durch klassische SelektionSondierung sinnvoller Anbaugebiete Erhöhung der Akzeptanz in der Öffentlichkeit
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BIOTECHNOLOGI
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Biotechnologie
Schlüssel
21. Jahrhundert?
Der
zum
Quellennachweishttp://www.europabio.orghttp://www.isaaa.orghttp://www.transgen.dehttp://www.degussa-foodingredients.dehttp://www.cato.com/biotech
A. Liese, K. Seelbach, C.Wandrey, (2000) Industrial biotransformations, Wiley-VCH, WeinheimThe Application of Biotechnology to Industrial Sustainability (2001), OECD
http://www.ncfap.orghttp://www.oecd.orghttp://www.uni-stuttgart.de/siwa/alrhttp://www.eawag.ch