Herbstsemester 2013
Analytische Chemie(für Biol. / Pharm. Wiss.)
Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophore se)
Dr. Martin Pabst
ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | [email protected]. ch
HCI D323
http://www.analytik.ethz.ch/
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Wiederholung der letzten Einheit: Auflösung
2
RS =α−1
α
k2
1+ k2
N
4
α: Trennfaktork: RetentionsfaktorN: Anzahl theoretischer Böden
Wie Selektiv?Wie unterschiedlich
sind die Gleichgewichts-einstellungen beiderAnalyten? (Kc1/Kc2)
Wie lange ist der Analyt in der Säule?Wie viel mehr Zeit braucht der
Analyt durch die Säule alsdie mobile Phase? (tr/tm)
Wie viele Gleichgewichts-einstellungen?
Wie breit sind meine Peaks?Höhe der theoretischen Böden
und Länge der Säule
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3
+
−=41
1
2
2 N
k
kRS α
α
k
k
1 + k
Nαααα
N
4
Erhöhung von k:
bessere Auflösung, aber höhere Retentionszeiten
� längere Analysenzeiten� breitere Peaks
Erhöhung von N:
geringere Peakbreite(Standardabweichung σσσσ)
� Bei Optimieung durch L/u: Veränderung tR
Erhöhung von α:
Grösserer Abstand der Peaks im Chromatogramm
���� Veränderung von tR von zumindest einem Peak
Auflösung
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MR ttk /'=
HLN /=längere Säule L
geringeres [u]
höheres [u]
WechselStationäre/Mobile
Phase
α = tR2 − tM
tR1− tM
= ′ t R2
′ t R1
= k2
k1
= KC 2
KC1
Peakbreiteverändert sich nicht
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Beschreibung der Effizienz der Chromatographie = Van Deemter Gleichung
H ���� wie breit werden die Peaks?U ���� proportional zur Retentionszeit
H = A + B
u+C u
A: Eddy-DiffusionB: LongitudinaldiffusionC: Massentransport-Effekteu: Lineare Flussgeschwindigkeit
Lineare Flussgeschwindigkeitder mobilen Phase ����
H
+
-
--
+
HLN /=
+ Optimum- Schlechter Bereich
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Quantitative Analyse mittels Chromatographie
Statistik und Kalibrierung
„Allein die Dosis macht das Gift“
Meist ist das „WIEVIEL?“ genauso wichtig wie das „WAS? “!
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Quantitative Analyse
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WAS? WIEVIEL?
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Ein kleiner Ausflug in die Statistik
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Statistische und systematische Fehler
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Genauigkeit =
Präzision + Richtigkeit
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Statistische und systematische Fehler
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Schüsse 1–3
Schuss 4 nach Korrektur der Zieloptik
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Mittelwert und Standardabweichung
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Häu
figke
it ei
nes
Mes
swer
tes
x
Mittelwert :
Standardabweichung σσσσ
relative Standardabweichung σσσσrel,x :
x
x = 1
nxi
i =1
n
∑
Messwerte xi
σx = 1
n −1xi − x ( )2
i =1
n
∑
σrel, x = σx
x
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Angabe eines Analysenergebnisses
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Häu
figke
it ei
nes
Mes
swer
tes
x
Messwerte xi
In einem Analysenbericht muss ein Messergebnisimmer mit einer Fehlerangabe versehen werden.
Messergebnis mit absolutem Fehler:
± σx z.B. 12.3 µg/L± 0.8 µg/L
Messergebnis mit relativem Fehler:
± σrel,x z.B. 12.3 µg/L± 7%x
x
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Kalibrierung
Das Detektorsignal ist im Idealfall proportional zur Analytenmenge
grössere Analytenmenge � mehr Peakfläche
Um das Detektorsignal in Mengenangaben umrechnen zu können (mg, mol, oder mg/ml….)
muss man eine Kalibrierung vornehmen
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Kalibrierung
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y-Achse: Detektorsignal z.B. in Volt oder Ampere(Peakfläche oder –höhe)AAnalyt
x-Achse: Probenkonzentration z.B. in mg/l, µg/l, mol/l, ...cAnalyt
AAnalyt = a + b cAnalyt
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Empfindlichkeit und Nachweisgrenze
Was gilt noch als Peak?
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Empfindlichkeit und Nachweisgrenze
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Empfindlichkeit:
b = Steigung der Kalibriergeraden = Empfindlichkeit = Responsefaktor
Nachweisgrenze NG (limit of detection = LOD):
Minimale Konzentration deren Signal sich gerade noch also solches erkennen lässt bzw. welches sich signifikant vom Grundrauschenunterscheidet.
σA0= Standardabweichung des Blindwerts
3σσσσ-Kriterium: Die NG ist die Konzentration, bei der eine Signalintensität erhalten wird, die 3 σA0
über dem Grundrauschen liegt.
Bestimmungsgrenze BG (limit of quantification = LOQ):
Minimale Konzentration, die sicher bestimmt (quantifiziert) werden kann.
Die BG lässt sich nach dem 6 σσσσ-Kriterium ermitteln. Das Signal bei der BGliegt also 6 σA0
über dem Grundrauschen.
Ab der BG überlappen die Gauss-Verteilungen von Signal und Rauschennicht mehr.
AAnalyt = a + b cAnalyt
NG =A0 + 3σA0( ) − a
b
BG =A0 + 6σA0
( ) − a
b
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Linearität des Detektors
b = Steigung der Kalibriergeraden = Empfindlichkeit
„unterer“ Bereich: LOD / LOQ , das Signal lässt sich vom Grundrauschen des Detektors nicht mehr unterscheiden
„oberer“ Bereich: Durch Überladung des Detektors kommt es zu keiner Signalzunahme mehr!
AAnalyt = a + b cAnalyt
http://www.chemgapedia.de
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Kalibrierung
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• Kalibrierung ohne internen Standard
• Kalibrierung mit internem Standard
• Kalibrierung mittels Standardaddition
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Kalibrierung ohne internem Standard (extern)
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AAnalyt = a + b cAnalyt
cAnalyt =AAnalyt − a
b
Bevorzugt eingesetzt, wenn:
• viele Proben mit ähnlicher Matrix gemessen werden sollen,• systematische Fehler wie Verflüchtigung, Filtrationsverluste, Eintrag,
Volumenfehler etc. vernachlässigbar klein sind.
Limitierungen:• Matrixeffekte und systematische Fehler
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Kalibrierung mit internem Standard
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Bei der Kalibrierung werden Standardlösungen bekannter Analytkonzentration hergestellt, denen eine bekannte Konzentration an internem Standard zugesetzt wird.
Allen Proben wird dieselbe Menge eines internen Standards hinzugefügt
Wird eingesetzt, wenn systematische Fehler z.B. während derProbenaufarbeitung nicht zu vernachlässigen sind (z.B. Aufkonzentrieren derProbe durch Verdunstung des Lösungsmittels, Verluste an Analytenmolekülen beider Filtration, ...).
internerStandard
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Kalibrierung mit internem Standard
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Ein interner Standard soll:
• dem Analyten ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften haben• nicht in der Probe vorkommen• neben dem Analyten in der Probe bestimmbar sein
Beispiel:
Analyt Interner Standard
Coffein Theophyllin
Ideal:
Stabilisotopen-markierte (z.B. D, 13C) Analytenmoleküle als interner Standard undMS-Detektion.
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Kalibrierung mit internem Standard
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AAnalyt
Ainterner Standard
= a + bcAnalyt
cinternerStandard
cAnalyt = cinterner Standard
AAnalyt
Ainterner Standard
− a
b
Bei der eigentlichen Analyse wird der Probe vor der Aufarbeitung eine bekannteKonzentration an internem Standard zugesetzt und bei der Messung das Verhältnis derPeakflächen bestimmt.
Vorteil: Der interne Standard durchläuft die gleiche Probe naufarbeitung wie der Analyt� Systematische Fehler können ausgeglichen werden.
Limitierung: Der interne Standard hat nicht die exakt gleichen Eigenschaften wie der Analyt.
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Kalibrierung mittels Standardaddition
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Für die Kalibrierung werden keine Standardlösungen hergestellt, die Kalibrierung erfolgt in der Probe selbst.
1) Messung der Probe
2) Messung der Probe nach Zugabe bekannter Analytenkonzentration (Standard)
cAnalyt
cStandard
=AAnalyt
AAnalyt+ Standard − AAnalyt
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Kalibrierung mittels Standardaddition
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AAnalyt+ Standard = a + b cStandard
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Zusammenfassung Kalibrierung:
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• Kalibrierung ohne internen Standard:• einfachstes Kalibrierverfahren• Fehler in der Aufarbeitung werden nicht berücksichtigt• Matrixeffekte werden nicht kompensiert
• Kalibrierung mit internem Standard:• Kompensation systematischer Fehler• Interner Standard hat nicht exakt die gleichen
Eigenschaften wie der Analyt• Matrixeffekte werden nicht kompensiert
• Kalibrierung mittels Standardaddition• Kalibrierung in der Probe mit dem Analyten als „Standard“• Matrixeffekte können kompensiert werden