Aus dem Institut für Mikrobiologieund Tierseuchen
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Charakterisierung von Streptococcus suis:Beziehungen zwischen Herkunft, Expression potentieller
Virulenzfaktoren und Genotyp
INAUGURAL-DISSERTATIONzur Erlangung des Grades eines
DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAEdurch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt vonAchim Allgaieraus Haslach i. K.
Hannover 2000
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. P. Valentin-Weigand
Gutachter: Prof. Dr. P. Valentin-Weigand
Gutachter: Prof. Dr. H. Y. Naim
Tag der mündlichen Prüfung: 30. Mai 2000
Folgende Teile der Arbeit wurden bereits veröffentlicht:
Allgaier A., Goethe R., Wisselink H., Smith H., Schwarz S. and Valentin-Weigand, P.:
Comparison of Macrorestriction Patterns of Streptococcus Suis isolates with clinicalbackground and expression of potential virulance traits.
XIV Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases
Aukland, Neuseeland, 11.-15. Okt. 1999
meinen Eltern
Inhalt
1 Einleitung ............................................................................................................ 4
2 Schrifttum............................................................................................................ 6
2.1 Einleitende Beschreibung der Gattung Streptococcus .............................................. 6
2.2 Streptococcus ........................................................................................................... 6
2.3 Streptococcus suis.................................................................................................... 9
2.3.1 Morphologie und kulturelles Verhalten.............................................................. 102.3.2 Differenzierung ................................................................................................. 11
2.3.2.1 Biochemisches Verhalten und Differenzierung .............................................. 112.3.2.2 Antigenstruktur und serologische Differenzierung ......................................... 152.3.2.3 Genotypische Differenzierung ....................................................................... 17
2.3.2.3.1 Ribotypisierung......................................................................................... 172.3.2.3.2 Makrorestriktionsanalyse mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese ................... 19
2.3.3 Pathogene Bedeutung von Sc. suis.................................................................. 212.3.3.1 Epidemiologie................................................................................................ 212.3.3.2 Pathogenese................................................................................................. 22
2.3.3.2.1 Eintritt und Adhärenz................................................................................ 222.3.3.2.2 Phagozytose und intraphagosomales Überleben...................................... 232.3.3.2.3 Invasion und Ausbreitung ......................................................................... 23
2.3.4 Potentielle Virulenzfaktoren.............................................................................. 242.3.4.1 Adhäsine und Hämagglutinine....................................................................... 242.3.4.2 Kapsel ........................................................................................................... 252.3.4.3 Muramidase-Released-Protein...................................................................... 262.3.4.4 Extrazellulär-Faktor ....................................................................................... 272.3.4.5 Hämolysine ................................................................................................... 29
2.3.5 Therapie und Prophylaxe.................................................................................. 322.4 Problemstellung und Ziel der vorliegenden Arbeit ................................................... 35
3 Material und Methoden..................................................................................... 36
3.1 Bakterien ................................................................................................................ 36
3.2 Zellkulturen ............................................................................................................. 37
3.3 Medien, Pufferlösungen und Lösungen................................................................... 38
3.3.1 Medien für die Zellkultur ................................................................................... 383.3.2 Stammlösungen ............................................................................................... 383.3.3 Standardpuffer.................................................................................................. 39
Inhalt
3.3.4 Puffer und Lösungen für die Pulsfeld-Gelelektrophorese.................................. 393.3.5 Southern-Blotting.............................................................................................. 413.3.6 Sondenhybridisierung....................................................................................... 41
3.4 Kultivierung der Bakterien ....................................................................................... 43
3.5 Serotypisierung....................................................................................................... 43
3.6 Untersuchung auf die Expression von MRP/EF ...................................................... 43
3.7 Hämolysin-Nachweis .............................................................................................. 44
3.8 Adhärenz-Untersuchungen ..................................................................................... 46
3.8.1 Zellkultur........................................................................................................... 463.8.2 Vorbereitung der Zellen für den Adhärenzversuch............................................ 463.8.3 Vorbereitung der Bakterien für den Adhärenzversuch ...................................... 473.8.4 Adhärenzversuch ............................................................................................. 47
3.9 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE).......................................................................... 48
3.9.1 Präparation intakter Gesamt-DNA von Sc. suis ................................................ 483.9.2 Auftrennung der verdauten Gesamt–DNA von Sc. suis mittels PFGE .............. 503.9.3 Erstellung eines Größenmarkers für die PFGE................................................. 51
3.10 Herstellung der Hämolysin-Sonde........................................................................... 51
3.10.1 DNA-Extraktion................................................................................................. 513.10.2 Amplifikation der Sonde mittels PCR ................................................................ 53
3.10.2.1Auftrennung des PCR-Produktes mittels Gelelektrophorese ......................... 533.10.2.2Isolierung des PCR-Produktes aus dem Agarose-Gel ................................... 54
3.11 Southern-Hybridisierung ......................................................................................... 55
3.11.1 Southern-Blotting.............................................................................................. 553.11.2 Radioaktive Markierung der Sonde mit 32Phosphor .......................................... 553.11.3 Hybridisierung und Signaldetektion .................................................................. 56
3.12 Statistische Auswertung.......................................................................................... 57
3.12.1 Logistische Regression .................................................................................... 573.12.2 Odds Ratio ....................................................................................................... 573.12.3 Fragmentmuster und Dendrogramm-Erstellung................................................ 58
3.12.3.1Ähnlichkeitskalkulation zwischen möglichen Paaren der Isolate.................... 593.12.3.2Cluster-Analyse der Matrix ähnlicher Werte. ................................................. 59
4 Ergebnisse ........................................................................................................ 60
4.1 Phänotypische Charakterisierung ........................................................................... 60
4.1.1 Serotypisierung ................................................................................................ 60
Inhalt
4.1.2 Expression von MRP/EF................................................................................... 634.1.3 Expression von Hämolysin ............................................................................... 684.1.4 Adhärenz an Epithelzellen ................................................................................ 70
4.2 Genotypisierung...................................................................................................... 72
4.2.1 Makrorestriktions-Analyse ................................................................................ 724.2.2 Clusteranalyse.................................................................................................. 794.2.3 Genotypischer Nachweis des Hämolysins ........................................................ 82
4.3 Beziehungen zwischen Genotyp und Phänotyp ...................................................... 88
4.3.1 Beziehungen zwischen Genotyp und Herkunft der Isolate................................ 884.3.2 Beziehungen zwischen dem Genotyp und Serotyp........................................... 884.3.3 Beziehungen zwischen Genotyp und MRP/EF-Expression............................... 934.3.4 Beziehungen zwischen Genotyp und Hämolysin-Expression............................ 944.3.5 Beziehungen zwischen Genotyp und der Adhärenz an Epithelzellen................ 98
4.4 Clusterzuordnung der MRP+/EF+/Hämolysin+/Meningitis-Isolate ........................... 99
4.5 Statistische Auswertung........................................................................................ 100
4.5.1 Beziehung zwischen Serotyp und Herkunft der Isolate ................................... 1004.5.2 Beziehung zwischen Expression potentieller Virulenzfaktoren und Herkunft .. 1004.5.3 Beziehung zwischen Genotyp und Herkunft der Isolate.................................. 101
5 Diskussion....................................................................................................... 104
6 Zusammenfassung ......................................................................................... 111
7 Summary ......................................................................................................... 113
8 Literaturverzeichnis........................................................................................ 115
9 Anhang ............................................................................................................ 135
9.1 Chemikalien.......................................................................................................... 135
9.2 Verwendete Gerätschaften ................................................................................... 137
9.3 Verzeichnis der Isolate und deren Charakteritiken ................................................ 138
9.4 Tabellenverzeichnis .............................................................................................. 141
9.5 Abbildungsverzeichnis .......................................................................................... 142
Einleitung
4
1 EinleitungStreptococcus (Sc.) suis stellt in der intensiven Schweineproduktion eine der
Hauptursachen für wirtschaftliche Einbussen dar. Sc. suis wurde bis vor ca. 10
Jahren vor allem bei Infektionen mit zentralnervösem bzw. septikämischem Verlauf
isoliert; in jüngster Zeit wurde der Erreger jedoch immer häufiger auch in
Zusammenhang mit Pneumonien nachgewiesen. Beim Menschen kann Sc. suis
Meningitiden hervorrufen und gilt daher als Zoonose-Erreger.
Sc. suis wird gehäuft bei klinisch unauffälligen Tieren im Genitaltrakt und in den
Tonsillen gefunden, was auf eine stark variierende Erregervirulenz hinweist. Es stellt
sich somit die Frage nach Virulenzmerkmalen des Erregers. Bisher wurden mehrere
potentielle Virulenzfaktoren und virulenzbegleitende Faktoren identifiziert. Jedoch
konnten auch hochvirulente Stämme isoliert werden, bei denen die bislang
bekannten potentiellen Virulenzfaktoren nicht oder nur teilweise nachgewiesen
wurden. Zusammenfassend ist ein wesentliches Problem bei der Bekämpfung von
Sc. suis-Infektionen die hohe geno- und phänotypische Diversität des Erregers.
In der vorliegenden Arbeit wurde daher versucht, Isolate mit unterschiedlichem
klinischem Hintergrund eingehend phänotypisch und genotypisch zu
charakterisieren. Die Phänotypisierung umfasste alle bekannten potentiellen
Virulenzmarker. Die Genotypisierung erfolgte mit der Pulsfeld-Gelelektrophorese,
einer sehr hochauflösenden genotypischen Differenzierungsmethode. Ziel der
Untersuchungen war es, Hinweise auf Zusammenhänge zwischen klinischem
Hintergrund, dem Auftreten potentieller Virulenzfaktoren und dem genetischen
Hintergrund zu erhalten. Mit dieser Arbeit sollte erstmals auch ein detaillierteres Bild
der Sc. suis-Population im norddeutschen Raum erstellt werden.
Einleitung
5
Abkürzungsverzeichnis
A. bidest. Aqua bidestillata (zweifach destilliertes Wasser)ATCC American Type Culture Collectionbp Basenpaarebzw. beziehungsweisecDNA komplementäre DNA (engl.: complementary DNA,
copy DNA)dATP DesoxyadenosintriphosphatdCTP DesoxycytidintriphosphatdGTP DesoxyguanosintriphosphatDMSO DimethylsulfoxidDNA DesoxyribonukleinsäureDNase DesoxyribonukleasedNTP DesoxyribonukleosidtriphosphatdTTP DesoxythymidintriphosphatE. coli Escherichia coliERG Eppendorf-Reagenzgefäss (1,5 ml Reagenzgefäss)ELISA engl. enzyme-linked immunosorbent assay
(Enzym-gekoppelter Immunabsorptionstest)EDTA Ethylendiamin-tetraessigsäureEF Extrazellulär-Faktoret al. et aliGG GrossgruppenLsg. LösungMRP Muramidase-Released-ProteinOD Optische DichtePCR Polymerase-KettenreaktionRNA RibonukleinsäureRNase RibonukleaseSc. suis Streptococcus suisSDS Natriumdodecylsulfatsog. sogenanntST SerotypST-Zellen Schweinehoden-Zellen (engl. Swine-testis-Zellen)Stammlsg. StammlösungUV Ultraviolettv/v Volumen pro Volumenw/v Gewicht pro Volumenz. B. zum Beispiel
Schrifttum
6
2 Schrifttum
2.1 Einleitende Beschreibung der Gattung StreptococcusUnter die Gruppe der fakultativ anaeroben grampositiven Kokken wird neben den
Enterokokken und Laktokokken auch die Gattung Streptococcus gefasst
(SCHLEIFER 1986), innerhalb derer aufgrund unterschiedlicher Subtypen, Biotypen
und Serovare über 40 verschiedene Arten unterschieden werden (SCHLEIFER u.
KILPPER-BÄLZ 1987; BENTLEY et al. 1991). Da sich die Streptokokken nur in einer
Ebene teilen, sind sie in Paaren oder Ketten angeordnet. Ihr Durchmesser beträgt
etwa 0,6 – 1,2 µm. In ihrer Mehrzahl sind sie unbeweglich. Ihr Wachstumsoptimum
sowohl in flüssigen als auch auf festen Nährmedien liegt bei 37°C. Aufgrund der
unterschiedlichen Hämolysine, die von den verschiedenen Streptokokkenarten
produziert werden, wachsen sie auf bluthaltigen Nährböden mit einer vollständigen
Lysis der Erythrozyten (β-Hämolyse), einer unvollständigen Lysis (α-Hämolyse) oder
anhämolysierend (γ-Hämolyse). Im allgemeinen haben Streptokokken eine komplexe
Anforderung an Nährstoffen. Dabei fermentieren sie aus den unterschiedlichen
Kohlenhydraten als Endprodukt vorwiegend L(+)-Milchsäure.
Die Zellwand der Streptokokken enthält Polysaccharid- und Proteinantigene. Der C-
Polysaccharidanteil (C-Substanz), bestehend aus Rhamnose, Glukose und
Galaktose, dient dabei als Antigen für die serologische Gruppendifferenzierung nach
LANCEFIELD (1933). Bisher wurden 18 verschiedene Serotypen der Streptokokken
identifiziert, welche mit den Buchstaben A-V bezeichnet werden. Es wurden jedoch
auch Arten beschrieben, welche sich aufgrund dieser Gruppendifferenzierung nicht
einer Gruppe zuordnen lassen (SCHLEIFER u. KILPPER-BÄLZ 1987; BISPING u.
AMTSBERG 1988; LÄMMLER u. HAHN 1994).
2.2 StreptococcusIn der Gattung Streptococcus werden zahlreiche Arten zusammengefasst, welche
aufgrund biochemischer und molekularbiologischer Untersuchungen in den
vergangenen Jahren taxonomische Änderungen erfahren haben (SCHLEIFER u.
KILPPER-BÄLZ 1987; BENTLEY et al. 1991; LÄMMLER 1992). Mittels
molekularbiologischer, chemotaxonomischer und numerisch-taxonomischer
Methoden konnten phylogenetische Zusammenhänge der verschiedenen Arten
geklärt werden ( SCHLEIFER u. KILPPER-BÄLZ 1987).
Schrifttum
7
In der Gattung Streptococcus finden sich humanpathogene, tierpathogene sowie
saprophytische Spezies, die den Pyogen-Streptokokken, den Oral-Streptokokken
sowie einigen anderen Arten ohne besondere Gruppenzugehörigkeit zugeordnet
werden (HARDIE 1986; MUNDT 1986; ROTTA 1986).
Der Gruppe der Pyogen-Streptokokken werden die Arten Sc. pyogenes, Sc.
dysgalactiae, Sc. canis, Sc. equi, Sc.iniae, Sc. agalactiae, Sc. uberis, Sc. parauberis,
Sc. porcinus sowie bedingt auch Sc. hyointestinalis zugeordnet (BENTLEY et al.
1991).
Unter der Spezies Sc. dysgalactiae Subspecies dysgalactiae und Subspecies
equisimilis, werden die Serovar L und G sowie Streptokokken der Serogruppe C und
G des Menschen zusammengefasst, da taxonomische Studien zeigten, dass sich
diese Stämme sowohl biochemisch als auch genetisch sehr ähnlich verhalten
(FELTHAM 1979; FARROW u. COLLINS 1984; KILPPER-BÄLZ u. SCHLEIFER
1984).
Sc. canis schliesst die Streptokokken der Serogruppe G von Hund und Rind ein.
Dabei unterscheiden sich diese Spezies von den anderen Stämmen, welche mit dem
Antiserum der Gruppe G reagieren, dahingehend, dass sie eine β-Galaktosidase-
Aktivität aufweisen, jedoch keine Hyaluronidase-Aktivität (KILPPER-BÄLZ u.
SCHLEIFER 1984).
Als genetisch eng verwandt wurden Sc. equi und Sc. zooepidemicus erkannt
(FARROW u. COLLINS 1984; KILPPER-BÄLZ u. SCHLEIFER 1984), obwohl sie sich
phänotypisch voneinander differenzieren lassen (FELTHAM 1979). Daher wurden sie
zur Spezies Sc. equi mit den beiden Subspezies equi und zooepidemicus vereint
(FARROW u. COLLINS 1984).
Aufgrund der Ergebnisse von rRNA-Sequenzanalysen wurde Sc. agalactiae wegen
des hohen Grades an Homologie zu Sc. dysgalactiae zugerechnet (BENTLEY et al.
1991). Die enge Verwandtschaft zu Sc. dysgalactiae konnte jedoch von anderer
Seite nicht nachgewiesen werden (SCHLEIFER u KILPPER-BÄLZ 1987).
Sc. uberis weist mit seinen beiden biochemisch divergierenden Typen I und II keine
besondere Verwandtschaft zu anderen Streptokokken auf (GARVIE u. BRAMLEY
1979; KILPPER-BÄLZ et al. 1982; COLLINS et al. 1984a; SCHLEIFER u KILPPER-
BÄLZ 1987). Im Gegensatz dazu zeigten rRNA-Sequenzanalysen, dass Sc. uberis
und Sc. parauberis den Pyogen-Streptokokken zuzuordnen ist und dass eine
Schrifttum
8
genetische Beziehung zwischen Sc. parauberis und Sc. iniae besteht (BENTLEY et
al. 1991).
Oralstreptokokken können mittels der serologischen Methode nach Lancefield (1933)
nicht eingeordnet werden. Dabei bilden sie vier Untergruppen, die Oralis-, die
Anginosus-, die Salivarius- und die Mutans-Gruppe (SCHLEIFER u KILPPER-BÄLZ
1987). Die Oralis-Gruppe umfasst sieben Spezies, deren wichtigster Vertreter Sc.
pneumoniae darstellt. Dabei wurde eine enge genetische Verwandtschaft zu Sc.
oralis nachgewiesen (SCHLEIFER u KILPPER-BÄLZ 1987). Weitere Mitglieder
dieser Gruppierung sind Sc. oralis, Sc. sanguis, Sc. parasanguis, Sc. mitis, Sc. crista
und Sc. gordonii.
Die Spezies Sc. anginosus, Sc. constellatus und Sc. intermedius werden in der
Anginosus-Gruppe zusammengefasst. Sie werden von BENTLEY et al. (1991) als
drei separate Spezies dargestellt, während sie aufgrund von DNA-DNA-
Hybridisierungen von COYKENDAL et al.(1987) als eine Spezies (Sc. anginosus)
angesehen werden. In die Untergruppe der Salivarius-Gruppe werden aufgrund
enger verwandtschaftlicher Beziehungen (BENTLEY et al. 1991) die Spezies Sc.
salivarius, Sc. vestibularis und Sc. thermophilus zusammengefasst.
Die Mutans-Gruppe wird von Sc. mutans, Sc. downei, Sc. cricetus, Sc. macacae, Sc.
rattus und Sc. sorbrinus gebildet (BENTLEY et al. 1991). Diese Gruppe zeichnet sich
vor allem dadurch aus, dass sie ein Wachstum bei einer Temperatur von 45°C zeigt.
Sc. ferus wird ebenfalls dieser Gruppe zugerechnet (SCHLEIFER u KILPPER-BÄLZ
1987).
Zusätzlich wurden acht fakultativ anaerobe und drei obligat anaerobe Streptokokken-
Spezies beschrieben, die weder den Pyogen-Streptokokken noch den Oral-
Streptokokken zugerechnet werden (LÄMMLER, 1992). Zur ersten Gruppe werden
unter anderem die Spezies Sc. bovis, Sc. equinus und Sc. alactolyticus gezählt
(BENTLEY et al. 1991). Die enge geno- und phänotypische Übereinstimmung der
Spezies Sc. bovis und Sc. equinus führte dazu, dass vorgeschlagen wurde, die
beiden Spezies zu einer Spezies zusammenzuführen (FARROW et al. 1984). Jedoch
zeigten wiederum biochemische und DNA–Hybridisierungsuntersuchungen, dass
sich diese beiden Stämme voneinander unterscheiden (SCHLEIFER u KILPPER-
BÄLZ 1987). Eine genetische Beziehung zwischen Sc. alactolyticus und den Spezies
Sc. bovis und Sc. equinus wurde zwar nachgewiesen (BENTLEY et al. 1991), Sc.
alactolyticus wird aber dennoch als eigenständige Spezies angesehen.
Schrifttum
9
Für Sc. suis (Streptokokken der Serogruppen R, S, RS, und T) konnten
verwandtschaftliche Beziehungen zu anderen Spezies nicht nachgewiesen werden,
obwohl die Zellwandstrukturen Gemeinsamkeiten mit Sc. oralis aufweisen
(SCHLEIFER u KILPPER-BÄLZ 1987). Genetische Studien mittels DNA-
Hybridisierungen wiesen auf ein geringgradiges Verwandtschaftsverhältnis mit Sc.
bovis hin (HAREL et al. 1994).
Von den Pyogen- und Oral-Streptokokken unterscheidet sich Sc. intestinalis aufgrund
seines kulturellen und biochemischen Verhaltens (ROBINSON et al. 1988). Die
Spezies Sc. adjacens und Sc. defecticus sowie die anaeroben Spezies Sc. parvulus,
Sc. hansenii und Sc. pleomorphus lassen sich ebenfalls keiner bestimmten Gruppe
zuordnen (LÄMMLER 1992).
2.3 Streptococcus suis Sc. suis gilt als einer der bedeutendsten Krankheitserreger beim Schwein
(KILPPER-BÄLZ u. SCHLEIFER 1987; GOTTSCHALK et al. 1989, 1991). Der
Erreger wurde erstmals in England bei zwei bis sechs Wochen alten Ferkeln, welche
an Meningitis und Arthritis erkrankt waren, nachgewiesen. Dabei wurden
Streptokokken isoliert, welche sich keiner bis dato bekannten Serogruppe zuordnen
liessen (FIELD et al. 1954). Jedoch waren schon vorher Berichte aus den
Niederlanden über Meningo-Encephalitiden bei ein bis sechs Wochen alten
Saugferkeln bekannt, bei denen ebenfalls Streptokokken nachgewiesen wurden
(JANSEN u. VAN DORSSEN 1951).
Die Erreger, welche derartige Erkrankungen bei Saugferkeln verursachten, wurden
als Streptokokken der Serogruppe S bezeichnet; andere, welche diese Erkrankungen
bei Mastschweinen hervorriefen, als Streptokokken der Serogruppe R. Desweiteren
wurden Erreger aus solchen Krankheitsbildern in die Serogruppen R/S und T
zusammengefasst (DE MOOR 1963).
Die Isolierung von Streptokokken, welche offensichtlich mit denen von FIELD (1954)
identisch waren, gelang einige Jahre später (ELLIOTT 1966). Dabei wurde bei diesen
Erregern das Antigen der Serogruppe D nachgewiesen, und die Erreger wurden
aufgrund ihrer Kapselstrukturen als Sc. suis Serotyp 1 bezeichnet und der
Serogruppe D zugeordnet (ELLIOTT 1966). 1975 wurden gleichartige Erkrankungen,
wie sie bei Saugferkeln bekannt waren (ELLIOTT 1966), zum ersten Mal auch bei
Mastschweinen beobachtet. Die aus diesen Krankheitsgeschehen isolierten Erreger
Schrifttum
10
unterschieden sich jedoch in ihrer Kapselsubstanz von denen des Sc. suis Serotyps
1, so dass sie als Sc. suis Serotyp 2 der Serogruppe D eingeordnet wurden.
Aufgrund serologischer Kreuzreaktionen zwischen dem Serotyp 1 und der
Serogruppe S bzw. zwischen dem Serotyp 2 und der Serogruppe R wurden diese als
identisch angesehen (WINDSOR 1977). Offiziell wurde die Spezies Sc. suis 1987
beschrieben (KILPPER-BÄLZ u. SCHLEIFER 1987). Bis heute sind über 35
verschiedene Serotypen bekannt (PERCH et al.1983; GOTTSCHALK et al. 1989,
1991b; OKWUMABUA et al. 1995). Es lassen sich jedoch immer wieder Stämme
isolieren, welche sich keiner dieser Serogruppen zuordnen lassen.
2.3.1 Morphologie und kulturelles VerhaltenBei Sc. suis handelt es sich um ovoide, unbewegliche, grampositive Kokken, die mit
einem Durchmesser von ca. 1,0 µm einzeln, in Paaren oder selten in Kurzketten
auftreten (KILPPER-BÄLZ u. SCHLEIFER 1987). Abweichend davon können auch
ovoide oder pleomorphe Kokken in Diploform und in Kurzketten auftreten (CLIFTON-
HADLEY u. ALEXANDER 1988). Auch coryneforme bis lanzettförmige Diplokokken
wurden beschrieben (KAUFHOLD et al. 1988).
Sc. suis zeigt ein fakultativ anaerobes Wachstum (KILPPER-BALZ u. SCHLEIFER
1987). Aus dem Genitaltrakt von Sauen konnten allerdings auch Sc. suis -Stämme
isoliert werden, die kein Wachstum bei atmosphärischer CO2-Spannung zeigten
(DEVRIESE et al.1991; ESTOEPANGESTIE u. LÄMMLER 1993).
Auf Schafblut- und Rinderblut-Agar wächst Sc. suis unter Ausbildung einer α-
Hämolyse. Eine β-Hämolyse kann von einigen Sc. suis -Stämmen auf Pferdeblut-
Agar produziert werden (PERCH et al. 1983; KILPPER-BALZ u. SCHLEIFER 1987).
Der Koloniedurchmesser beträgt nach 24 Stunden Bebrütung auf Blutagar ca. 1-2
mm (SANDFORD u. HIGGINS 1992), die Kolonien sind grau und teilweise schleimig
(KAUFHOLD et al. 1988). In Bouillonkulturen wachsen Sc. suis -Stämme in der
Regel unter homogener Trübung. Jedoch zeigen CO2-abhängige ebenso wie β-
Glucuronidase-negative Stämme eine Bodensatz - Bildung mit klarem Überstand
(DEVRIESE et al. 1993) In Tabelle 1 sind die morphologischen und kulturellen
Charakteristika von Sc. suis zusammengefasst.
Schrifttum
11
Tabelle 1: Morphologie und kulturelles Verhalten von Sc. suis
UntersuchtesKriterium
Erscheinungsform UntersuchtesKriterium
Erscheinungsform
Grösse Bis ca. 1,2 µm Wachstum auf
Blutplatten
α - Hämolyse
Form
Ovoid bis pleomorph
Wachstum auf
Blutplatten bei CO2-
abhängigen
Stämmen
β - Hämolyse
Kolonieform Rund, glattrandig,
grau, teilweise
schleimig
Koloniedurchmesser 1 – 2 mm
Gramfärbung Grampositiv Wachstum in
Bouillon
Homogene
Trübung
Anordnung
zueinander
Diploform,
Kurzketten
Wachstum in
Bouillon bei CO2
Abhängigen
Stämmen
Bodensatzbildung
mit klarem
Überstand
2.3.2 Differenzierung
2.3.2.1 Biochemisches Verhalten und DifferenzierungDas biochemische Verhalten wurde bei der Speziesbeschreibung von KILPPER-
BÄLZ und SCHLEIFFER (1987), wie in Tabelle 2 beschrieben, dargestellt. Die
Reaktionen waren jedoch nicht bei allen Untersuchungen konstant, so dass die
biochemische Differenzierung von Sc. suis anhand unterschiedlicher
Reaktionsmuster festgelegt wurde (siehe Tabelle 3). So konnte bei einigen Stämmen
der Serotypen 3 und 4 die Hydrolyse von Hippurat festgestellt werden (PERCH et al.
1983). Ebenso konnte diese Eigenschaft bei CO2-abhängigen Stämmen aus dem
Genitaltrakt von Sauen (DEVRIESE et al. 1991) gefunden werden. Zudem konnten
Abweichungen hinsichtlich der alkalischen Phosphatase und der β-Glucuronidase
ebenso wie bei der Fermentierung von Mannit und Sorbit festgestellt werden
Schrifttum
12
(DEVRIESE et al. 1991; TARRADAS et al. 1994a). Hinsichtlich der Voges-
Proskauer-Reaktion wurden Sc. suis -Stämme isoliert, die abweichend eine positive
Reaktion zeigten (TARRADAS et al. 1994a).
Aufgrund der Unterschiede hinsichtlich des biochemischen Verhaltens einzelner Sc.
suis -Serotypen wurde gefolgert, dass zwar Unterschiede zwischen den einzelnen
Serotypen vorhanden sind, diese jedoch nicht ausreichen, die einzelnen Serotypen
biochemisch voneinander zu unterscheiden (TARRADAS et al. 1994a).
Tabelle 2: Biochemisches Verhalten von Sc. suis nach KILPPER-BÄLZ u.
SCHLEIFFER (1987)
Kriterium BiochemischesVerhalten
Kriterium BiochemischesVerhalten
D-Glukose + Arginin +
Saccharose + Äskulin +
Laktose + Salizin +
Maltose + Stärke +
Salizin + Glykogen +
Trehalose + Hippurat -
Inulin + VP-Reaktion -
L-Arabinose - Alk-Phosphatase -
D-Mannit - α-Galaktosidase +
D-Sorbit - β-Glukuronidase +
Glyzerin - Leucin-Arylamidase +
Melzitose - β-Galaktosidase d
D-Ribose - Optochin Resistent
Raffinose d 10°C bzw. 45°C -
Melibiose d 6,5% NaCl -
Hyaluronidase d 40% Galle -+ = positiv - = negativ d = variabel
10°C bis 45°C = Wachstum bei 10°C bzw. 45°C
6,5% NaCl, 40% Galle : Wachstum in Anwesenheit von 6,5% NaCl bzw. 40% Galle
VP = Voges-Proskauer Reaktion
Schrifttum
13
Tabelle 3: Unterschiedliche charakteristische biochemische Reaktionen zur Identifizierung von Sc. suis (WAACK 1996)
ERICKSON et al.(1984)
HOMMEZ et al.(1986) TOUIL et al. (1988) GOTTSCHALK etal.(1991) **
ESTEPONGESTIE u.LÄMMLER (1993)
Reaktionen n= 121 Reaktionen n= 188 Reaktionen n= 199 Reaktionen n = 46 Reaktionen n= 1226,5 % NaCl 0* 6,5 % NaCl 0 6,5 % NaCl 4 6,5 % NaCl 0 6,5 % NaCl 0
CAMP - Test 20 CAMP-Test d VP –Reaktion
2 VP -Reaktion
0 VP - Reaktion 0
Trehalose 93 Galle /Äskulin
d Trehalose 97 Trehalose 96 Trehalose 96
Laktose 98 Mc Conckey d Laktose 94 Laktose 100 Salizin 89Sorbit 0 Hippurat 0 Sorbit 1 Sorbit 0 Stärke 94Inulin 90 Lackmus-
Milch100 Salizin 93 Salizin 96
Raffinose 78 Methylen-blau
0 Inulin 91 Inulin 89
Äskulin 53 Äskulin d Glyzerin 1 Glyzerin 2Arginin 69 Arginin 20
Saccharose 98Stärke 100Mannit 0
N = Anzahl der absolut getesteten Stämmed = variabel* = Anzahl positiver Stämme in Prozent** = Angaben gelten für Sc. suis-Serotypen 23 - 28
Tabelle 3:
Sc. suis-Serotypen 23 - 28
n
Schrifttum
14
Das biochemische Verhalten variiert auch in Abhängigkeit von der Herkunft der
Isolate bzw. der Lokalisationen im Schwein. Aufgrund des unterschiedlichen
Verhaltens wurden verschiedene Biotypen festgelegt (DEVRIESE et al. 1991, Tabelle
4)
Tabelle 4: Sc. suis – Biotypen nach DEVRIESE et al. (1991)
Biotyp
Kriterium Mannit/Sorbitpositiv
Mannit/SorbitNegativ
ββββ-
Glukuronidasenegativ
CO2-abhängigeStämme
Homogenes
Wachstum in
Bouillon
+ + D +
Hämolysetyp
auf Schafblut
α α α β
Hippurat-
spaltung
- - - +
β-Glukuronidase
Aktivität
- + - +
Alkalische
Phosphatase
- - - +
Sorbit-
Verwertung
+ - - -
Mannit-
Verwertung
+ - - -
+ = positiv- = negativd = variabel
Neben der konventionellen biochemischen Differenzierung („Bunte Reihe“ in
Röhrchen) werden kommerzielle biochemische Testsysteme ( z. B. API 20 STREP,
Fa. Bio MERIEUX) verwendet, um Sc. suis von anderen Streptokokken
abzugrenzen. Das API 20 STREP–System ist aber zur Identifizierung von Sc. suis -
Schrifttum
15
Stämmen, insbesondere der Serotypen 9-28 nicht geeignet, da nur 54 % der Sc. suis
-Stämme als solche erkannt werden. So konnten aufgrund der fehlenden β-
Glucuronidase-Reaktion diese Isolate nicht als Sc. suis Isolate identifiziert werden,
sondern wurden als Sc. pneumoniae identifiziert (GOTTSCHALK et al.1991a,
WAACK 1996).
Bei der konventionellen Überprüfung wurde in früheren Untersuchungen fast das
gesamte biochemische Spektrum der R- und S-Streptokokken überprüft (KUNTER u.
WITTIG 1976). Spätere Untersuchungen reduzierten die biochemische Unter-
suchung auf die für Sc. suis charakteristischen Reaktionen. So wurde von allen
Untersuchenden das fehlende Wachstum bei 6,5% NaCl als Charakteristikum
angesehen. Auch die Verwertung von Trehalose wurde von den meisten
Untersuchern als eine charakteristische Fähigkeit von Sc. suis angesehen (weitere
Schlüsselreaktionen siehe Tabelle 3).
2.3.2.2 Antigenstruktur und serologische DifferenzierungDie ursprünglich beschriebenen Sc. suis -Stämme wurden in die Serogruppen R, S,
R/S, und T bzw. keiner Serogruppe zugeordnet (DE MOOR 1963; KILPPER-BÄLZ u.
SCHLEIFFER 1987). Dabei wurde bei den meisten Stämmen der Serogruppen R, S,
R/S ein unterschiedliches Peptidoglykan als Zellwand-charakteristikum
nachgewiesen. In Abhängigkeit von der Serogruppe zeichnet sich dieses
Peptidoglykan durch eine unterschiedliche Anordnung der Polysaccharid-
bestandteile Rhamnose, Glukose, Galaktose und Glukosamin aus.
Mittels spezifischer Antiseren konnte nachgewiesen werden, dass Sc. suis Serotyp 1
bzw. 2-Stämme den S- und R-Streptokoken entsprachen, jedoch der Untergruppe
der Serogruppe D zuzuordnen waren (ELLIOTT 1966; WINDSOR u. ELLIOTT 1975).
Als Gruppenantigen der Serogruppe D wurde ein Glukose-substituiertes Polymer aus
α-Glycerinphosphat, eine Teichonsäure, bezeichnet, wobei die Teichonsäure
vermutlich mit der Zellwand assoziiert ist. Je nach Extraktionsmethode konnte dabei
die Teichonsäure entweder als membrangebundene Lipoteichonsäure oder als
lipidfreie Form gewonnen werden, beide Formen reagierten mit spezifischen Anti-
Serotyp 2 Antikörpern (ELLIOTT et al. 1977). Jedoch konnte durch DNA-DNA-
Hybridisierungen keine signifikante genetische Übereinstimmung zwischen Sc. suis
und anderen Streptokokken der Serogruppe D nachgewiesen werden. So lag die
genetische Übereinstimmung (DNA-Sequenz-Homologie) zum Beispiel zwischen E.
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16
faecalis (Streptokokken der Serogruppe D) und Sc. suis unter 10% (KILPPER-BÄLZ
u. SCHLEIFFER 1987).
Die Kapselpolysaccharide der Serotypen 1 und 2 bestehen aus fünf verschiedenen
Zuckern. Das Kapselpolysaccharid von Serotyp 1 wird aus Galaktose, Glukose, N-
Acetyl-Glukosamin, N-Acetyl-Galaktosamin und Sialinsäure in einem molaren
Verhältnis von 2,42 : 1,0 : 1,0 : 1,13 : 1,39 gebildet. Es hat ein Molekulargewicht von
74 Da. Das Kapselpolysaccharid vom Serotyp 2 unterscheidet sich davon nur in
einem Zucker. So tritt an die Stelle des N-Acetyl-Galaktosamins Rhamnose. Dabei
verändert sich sowohl das molare Verhältnis (1,07 : 3,17 : 1,0 : 0,94 : 1,0) als auch
das Gewicht (185 Da), woraus geschlossen werden konnte, dass zwar bis auf den
Austausch der Rhamnose alle weiteren Bestandteile identisch waren, jedoch die
Anteile der einzelnen Bestandteile unterschiedlich waren (ELLIOTT u. TAI 1978).
Seit der Beschreibung der Sc. suis Serotypen 1 und 2 wurden ein Vielzahl weiterer
Serotypen isoliert, die durch Eisatz entsprechender Hyperimmunseren als Serotypen
3 – 8 beschrieben wurden (PERCH et al. 1983). In ähnlicher Art und Weise konnten
die Serotypen 9 – 22 (GOTTSCHALK et al. 1989) und die Serotypen 23 – 28
(GOTTSCHALK et al. 1991b) sowie 29 – 34 (OKWUMABUA et al. 1995) beschrieben
werden. Der Nachweis der Serogruppen (R, S, R/S und T) von Sc. suis wird im
Regelfall nicht durchgeführt, da bei der serologischen Differenzierung mittels der
Überprüfung der Kapselpolysaccharidantigene der Serotypen 1, 2, ½ und 15, auch
Serotypisierung genannt, die Serogruppen R, S, R/S und T miterfasst werden
(WINDSOR u. ELLIOTT 1975, GOTTSCHALK et al. 1989).
Für die Differenzierung werden spezifische Antiseren durch die Hyperimmunisierung
von Kaninchen (ESTEOPANGESTIE u. LÄMMLER 1993) aber auch von anderen
Tieren gewonnen und in verschiedene Verfahren eingesetzt. Neben der
Koagglutinationsreaktion (GOTTSCHALK et al. 1993) sind dies die
Mikrokapillarpräzipitation (LANCEFIELD 1933), die Kapselquellungsreaktion (PERCH
et al. 1983; GOTTSCHALK et al. 1989 ) und die Latex–Agglutination (VECHT et al.
1987).
Bei der polyvalenten Koaggulationsreaktion sind die antigenetischen Unterschiede
des Kapselmaterials, welches sich hauptsächlich aus Kohlenhydraten
zusammensetzt, die Grundlage für die Serotypisierung, bei der 99% der Sc. suis -
Stämme korrekt identifiziert werden können (GOTTSCHALK et al. 1993).
Schrifttum
17
Bei der Kapselquellungsreaktion reagieren Kapselpolysaccharide von Sc. suis mit
spezifischen Antiseren. Dadurch kommt es zu einer stärkeren Lichtbrechung,
wodurch die Kapsel deutlicher zu sehen ist, als die Kapsel von Stämmen, deren
Kapselpolysaccharide nicht mit den Antikörpern reagieren (PERCH et al. 1983;
GOTTSCHALK et al. 1989)
Bei der Mikrokapillarpräzipitation werden in einem Kapillarröhrchen Antiserum und
das zuvor extrahierte Antigen übereinandergeschichtet. Wenn es sich um ein zum
Antiserum passendes Antigen handeln, wird nach spätestens 15 Minuten eine
deutliche Präzipitationsbande zwischen dem Antigen und dem Antiserum erkennbar
(LANCEFIELD 1933).
Bei der Latex-Agglutination werden Polysaccharid-Antigene enzymatisch abgelöst
und dann mit spezifischen Antikörpern, die an farbige Latexpartikel gekoppelt sind,
inkubiert. Wenn es sich um passende Sc. suis -Antigene handelt, kommt es zu einer
deutlich sichtbaren Verklumpung der Latexpartikel.
2.3.2.3 Genotypische Differenzierung
2.3.2.3.1 RibotypisierungBei dieser Methode werden Bakterien-Genome, welche durch
Restriktionsendonukleasen geschnitten wurden, mittels elektrophoretischer
Separation aufgetrennt, mittels Southern-Blotting auf eine Nylonmembran
übertragen, mit entsprechenden Gensonden markiert, und dann wird ein
sogenannter „genetischer Fingerabdruck“ erstellt (Abb.1). Dieser Methode liegt
zugrunde, dass Stämme mit einem gemeinsamen Ursprung oft auch ein identisches
oder sehr ähnliches Genom aufweisen und somit auch eine gleiche Anzahl bzw.
gleiche Positionen von Erkennungssequenzen für die eingesetzten Gensonden
existiert (OLSEN et al. 1994).
Als Gensonde werden bei der Ribotypisierung Sonden zum Nachweis multipel im
Chromosom verteilter Gene eingesetzt, welche die ribosomale DNA (=rDNA)
kodieren. Hierbei können entweder homologe oder heterologe rRNA (GRIMONT u.
GRIMONT 1986; SMITH et al. 1997), Ausschnitte des 16S-23S-5S-rRNA Operons
von Escherichia coli (BROSIUS et al. 1981; BEAUDOIN et al. 1992) oder die 16S-
rRNA kodierende Region von Bacillus subtilis (IGLESIAS et al. 1983) als Gensonde
eingesetzt werden.
Schrifttum
18
Abb 1: Grafische Darstellung der Erstellung eines „genetischen Fingerabdrucks“
Schrifttum
19
Die Speziesdifferenzen, die zwischen der Herkunft der Sonden-DNA und den zu
untersuchenden Stämmen existieren, spielen dabei eine untergeordnete Bedeutung.
Bei Sc. suis ermöglicht die Ribotypisierung eine begrenzte Unterscheidung von
virulenten Sc. suis Serotyp 2 Stämmen von avirulenten Sc. suis Serotyp 2 Stämmen.
Jedoch waren zwischen den Stämmen die Unterschiede nur sehr gering, so dass es
nicht möglich war, alle Serotypen mit der Ribotypisierung anhand des
Bandenmusters zu differenzieren (OKWUMABUA et al. 1995).
2.3.2.3.2 Makrorestriktionsanalyse mittels Pulsfeld-GelelektrophoreseDie Gelelektrophorese ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur
Auftrennung von biologischen Molekülen (Proteine, DNA oder RNA) nach Ladung
und Grösse. Bei der herkömmlichen Elektrophorese sind jedoch Grenzen hinsichtlich
der Grösse gesetzt. Bei DNA-Molekülen liegt sie bei etwa 20 kBp. Mit der
Entwicklung der Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) wurde eine Möglichkeit
entwickelt, auch grössere Moleküle auftrennen zu können. Dabei ist der
grundlegende Unterschied zur herkömmlichen Elektrophorese ein periodisch
wechselndes Stromfeld, welches einen Winkel zwischen 90° und 180° einschliesst.
Mit dieser Methode können DNA-Moleküle im Grössenbereich von 0,1 kBp bis 20000
kBp aufgetrennt werden (SCHWARTZ u. CANTOR 1984). Angewendet wurde diese
Methode zunächst vor allem in der Humangenetik zur Identifizierung genetischer
Basisdefekte bei verschiedenen Erbkrankheiten. In der Mikrobiologie wird diese sog.
Makrorestriktionsanalyse zunehmend angewendet, um Genomanalysen von
Bakterien und niederen Eukaryonten vornehmen zu können und um
epidemiologische Ausbrüche analysieren zu können (SCHWARTZ u. CANTOR
1984).
Das intakte Bakterienchromosom wird mittels selten schneidender
Restriktionsenzyme in idealerweise ca. 20 Fragmente zerschnitten und
anschliessend in der PFGE aufgetrennt. Das so entstandene Fragmentlängenmuster
gibt den Genotyp eines Stammes wieder. Miteinander verwandte Stämme einer
Spezies können so anhand ihrer Ähnlichkeit im Fragmentlängenmuster miteinander
verglichen werden. Klone und klonale Varianten innerhalb einer Taxospezies können
mittels eines quantitativen Fragmentlängenmustervergleichs definiert werden. Diese
Art der Genom-Analyse ist eine sehr sensitive und spezifische Methode und erlaubt,
epidemiologische Fragestellungen näher klären zu können (RÖMLING et al. 1995).
Schrifttum
20
TENOVER et al. (1995) postulierten, dass zwei Stämme nur dann als ein Klon
bezeichnet werden sollten, wenn beim Vergleich der Fragmentlängenmuster keine
Unterschiede festzustellen sind. Bei Differenzen im Fragmentlängenmuster von zwei
bis drei Fragmenten sollten die Stämme als sehr eng verwandt bezeichnet werden.
Wenn vier bis sechs Banden differieren, wird vorgeschlagen, die Stämme in einem
weiter gefassten genetischen Verwandtschaftsgrad im Zusammenhang zu sehen. Bei
einem Unterschied von mehr als sieben Banden können die zu vergleichenden
Stämme nach TENOVER et al. (1995) nicht mehr in einen klonalen Zusammenhang
gesehen werden.
Neben vielen gramnegativen Bakterien wurden auch grampositive Bakterien mittels
PFGE analysiert. Aufgrund des bei Streptokokken relativ niedrigen G-C-Gehaltes der
DNA werden bevorzugt Restriktionsenzyme wie SmaI und ApaI verwendet, da sie
nur je eine G- und C-Erkennungssequenz besitzen und somit nur wenige DNA-
Fragmente entstehen (RUDOLPH et al. 1998). Erfolgreich eingesetzt wurde das
Verfahren z. B. bei Sc. pneumoniae, Sc pyogenes, Sc agalactiae und anderen
Streptokokken (RUDOLPH et al. 1998). So konnte bei der Untersuchung von Sc.
pneumoniae-Stämmen bei allen Stämmen ein unterschiedliches
Fragmentlängenmuster festgestellt werden, selbst bei Stämmen gleichen Serotyps.
Aufgrund dieser Untersuchung konnte ein sehr ausgeprägter Polymorphismus bei
dieser Spezies festgestellt werden (RUDOLPH et al. 1998). Mittels Makro-
restriktionsanalysen von Sc. pneumoniae-Stämmen aus den USA und speziell aus
Alaska konnte aufgrund der PFGE-Ergebnisse gezeigt werden, dass die Diversität
der Stämme aus Kanada viel geringer war, als bei den anderen Stämmen
(RUDOLPH et al. 1998). Der Differenzierungsgrad der PFGE ist aufgrund dieser
Ergebnisse auch bei grampositiven Bakterien als sehr hoch anzusehen (LEFEVRE et
al. 1993). Eine Differenzierung von Sc. suis mittels PFGE wurde bisher nicht
durchgeführt.
Schrifttum
21
2.3.3 Pathogene Bedeutung von Sc. suisSc. suis wird im Zusammenhang mit verschiedensten Erkrankungen des Schweines
isoliert. Der Erreger wird bei Pneumonien, Polyserositiden, Meningitiden,
Encephalitiden, Polyarthritiden, Endokarditiden, Rhinitiden, Vaginitiden und Aborten
des Schweines gefunden (WINDSOR u. ELLIOTT 1975; SANFORD u. TILKER 1982;
SIHVONEN et al. 1988; TOUIL et al. 1988). Dabei beziehen sich die meisten
Untersuchungen auf die Serotypen 2 und 1 (CLIFTON-HADLEY 1983; VECHT et
al.1992). Der Erreger konnte auch bei Meningitiden des Menschen isoliert werden
und gilt daher als Zoonose-Erreger (ARENDS et al. 1988).
2.3.3.1 EpidemiologieDie Übertragung von Sc. suis Serotyp 2 in einen nichtinfizierten Bestand wird
offenbar hauptsächlich durch den Zugang von klinisch gesunden Keimträgern
(Zuchtsauen, Ebern, Absatzferkeln) aus infizierten Beständen verursacht (CLIFTON-
HADLEY,1983). Dabei erkranken meist zuerst die Ferkel einer infizierten Sau, und
anschliessend wird der Erreger durch die überlebenden Tiere innerhalb des
Bestandes verbreitet.
Die oberen Atemwege werden als die hauptsächliche Infektionspforte für Sc. suis
angesehen, da durch oro-nasale Infektion mit Bouillonkulturen von Sc. suis -Serotyp
1 und 2 die Erkrankung bei Saugferkeln und Absatzferkeln reproduziert werden
konnte (ELLIOTT et al. 1966; WINDSOR u. ELLIOTT 1975). Auch die Infektion der
Saugferkel während der Geburt wird für möglich gehalten, da im Genitaltrakt klinisch
gesunder Muttertieren Sc. suis nachgewiesen wurde. Für diese Möglichkeit spricht
auch das frühe Auftreten von Sc. suis -Erkrankungen bei Saugferkeln von infizierten
Muttertieren (ROBERTSON u. BLACKMORE 1989).
Die Erkrankung mit Sc. suis tritt gehäuft bei vier bis acht Wochen alten Ferkeln auf,
jedoch konnte der Erreger sowohl bei wenige Tage alten Ferkeln als auch bei bis zu
sechs Monate alten Schweinen nachgewiesen werden (WINDSOR 1977; LAMONT
et al. 1980).
Unter experimentellen Bedingungen konnte eine Übertragung von Sc. suis innerhalb
von fünf Tagen nach Zusammenführung von infizierten und nichtinfizierten
Schweinen festgestellt werden. Dabei waren die Erreger noch 512 Tage nach der
Infektion nachweisbar (CLIFTON-HADLEY et al. 1984). Die Erreger persistieren
unabhängig von ihrer Virulenz in den Tonsillen. Selbst bei Tieren, welche
Schrifttum
22
opsonisierende Antikörper gebildet hatten oder denen mit Antibiotika vermischtes
Futter verabreicht wurde, konnte Sc. suis isoliert werden (CLIFTON-HADLEY u.
ALEXANDER 1980).
Als prädisponierende Faktoren für das Auftreten von Erkrankungen werden
ungenügende Belüftung mit daraus resultierenden erhöhten Schadgas-
konzentrationen, erhöhter Luftfeuchtigkeit, starke Temperaturschwankungen, sowie
Umgruppierungen und Altersdifferenzen von mehr als zwei Wochen angesehen
(TAYLOR 1989; CLIFTON-HADLEY 1983).
Die Infektiosität von Sc. suis bleibt unter experimentellen Bedingungen im Kot auch
bei Temperaturen von 0°C bis zu 104 Tagen und bei 22 – 25°C bis zu 8 Tagen
erhalten (PARKER 1978). Dadurch kann auch der Mensch, insbesondere der
behandelnde Tierarzt, als Vektor in Betracht gezogen werden, sei es durch eine
latente Infektion oder durch kontaminierte Arbeitskleidung oder Arbeitsutensilien
(DEE u. COREY 1993).
2.3.3.2 Pathogenese
2.3.3.2.1 Eintritt und AdhärenzDie Tonsillen spielen im Infektionsgeschehen von Sc. suis eine wichtige Rolle. So
konnte Sc. suis auch bei klinisch gesunden Schlachtschweinen, selbst bei Tieren, die
antibiotisch vorbehandelt wurden, aus dem Tonsillargewebe, subepithelialem
Gewebe und interfollikularen Gewebe isoliert werden (DAVIES et al. 1991). Dabei
konnte morphologisch kein Unterschied zwischen den Tonsillen von gesunden und
erkrankten Schweinen festgestellt werden, wobei der Erreger sich offenbar auf der
Oberfläche und seltener im Wandepithel der Tonsillarkrypten befindet (VECHT et al.
1989). Viele Streptokokkenarten sind in der Lage, an Epithelzellen zu adhärieren und
anschliessend ein invasives Verhalten in die Wirtszellen und das Gewebe zu zeigen
(LA PENTA et al. 1994). Auch bei Sc. suis konnte eine Adhärenz an Wirtsgewebe
festgestellt werden, womit ihre lange Persistenz im Wirtstier erklärt wurde. Bei
Adhärenz-Untersuchungen von Sc. suis Serotyp 2 Isolaten an porcinem
Lungengewebe konnte zudem festgestellt werden, dass Stämme, welche aus
erkrankten Tieren isoliert worden waren, eine deutlich höhere Adhärenz zeigten, als
solche, welche aus klinisch gesunden Tieren stammten (GOTTSCHALK et al.
1991c). Es wird angenommen, dass die Adhärenz, sowie die Fähigkeit, Wirtszellen
Schrifttum
23
zu lysieren, eine Rolle bei der Invasion in tiefere Gewebe und den Eintritt in den
Blutkreislauf spielt. Dabei wird vermutet, dass die von Sc. suis produzierten
Hämolysine bei diesem Vorgang eine wichtige Rolle spielen. Jedoch sind die
genauen Mechanismen, wie Sc. suis die Epithelschicht durchdringt, noch nicht
geklärt (NORTON et al. 1999; CHARLAND et al. 2000). Im Gegensatz zu den
Gruppe B-Streptokokken konnte keine Invasion in Epithelzellen festgestellt werden
(NORTON et al. 1999; CHARLAND et al. 2000).
2.3.3.2.2 Phagozytose und intraphagosomales ÜberlebenDie wichtigste Abwehrbarriere gegen Sc. suis stellt die Phagozytose dar. Aufgrund
des adhärenten und invasiven Verhalten löst Sc. suis entzündliche Reaktionen aus,
womit es zur Rekrutierung von Makrophagen kommt. Jedoch werden virulente
Stämme nur effektiv phagozytiert, wenn Serotyp-spezifische Antikörper und
Komplement vorhanden sind (WILLIAMS et al. 1990). Sind keine Serotyp-
spezifischen Antikörper vorhanden, so besitzen virulente Sc. suis Stämme die
Fähigkeit, nach der Phagozytose intraphagosomal zu überleben und sich zu
vermehren. Infizierte Makrophagen zeigen morphologische Veränderungen in Form
von Vergrösserungen von Vakuolen und Verblassen des Zytoplasma (WILLIAMS et
al. 1990). Aufgrund des intrazellulären Überleben könnte für Sc. suis die Möglichkeit
gegeben sein, mittels der Makrophagen als „Shuttle“ die Blut-Hirnschranke zu
überwinden (WILLIAMS et al. 1990). Auch die Fähigkeit virulenter Stämme, sich
innerhalb der Makrophagen zu vermehren und diese abzutöten, muss als wichtiger
Mechanismus für die Pathogenese von Sc. suis angesehen werden (NORTON et al.
1997)
Vergleichsstudien mit bekapselten und unbekapselten Sc. suis – Stämmen ergaben,
dass die Kapsel von Sc. suis in Abwesenheit von Antikörpern die
Phagozytoseabwehr durch die Makrophagen erschwerte, während unbekapselte
Stämme wesentlich effektiver von Makrophagen aufgenommen werden können
(SEGURA et al. 1998).
2.3.3.2.3 Invasion und AusbreitungBisher ist nur sehr wenig darüber bekannt, wie Sc. suis die Abwehrbarriere
überwindet und in tiefere Gewebe bzw. den Blutkreislauf gelangt (CHARLAND et al.
1996). Aufgrund der Polysacccharid-Kapsel ist Sc. suis offenbar in der Lage, sich in
Schrifttum
24
einem nicht immunen Wirt der Phagozytose durch Makrophagen zu entziehen und
somit in den Blutstrom zu gelangen und eine Bakteriämie auszulösen (CHARLAND
et al. 1996). Bei in vitro-Untersuchungen mit Sc. suis und mikrovaskulären humanen
Endothelzellen des ZNS konnte festgestellt werden, dass hochvirulente Sc. suis
Stämme in der Lage waren, an diese Zellen zu adhärieren und eine Zellschädigung
auszulösen. Möglicherweise können diese Stämme so die Blut-Hirnschranke
durchdringen. Dabei wird vermutet, dass die Zellschädigung durch das von Sc. suis
produzierte Suilysin verursacht wird (CHARLAND et al. 2000).
2.3.4 Potentielle Virulenzfaktoren
2.3.4.1 Adhäsine und HämagglutinineDie Adhärenz an Epithelzellen wird bei vielen Streptokokken als ein Virulenzfaktor
angesehen, da die Bakterien nur mittels spezifischer Adhäsine in der Lage sind, auf
den Oberflächen von Epithelzellen zu haften, um diese zu besiedeln (BEACHEY et
al. 1981). Über die Adhärenzeigenschaften von Sc. suis gibt es bisher nur sehr
wenige Studien (GOTTSCHALK et al. 1991). Bei einer Untersuchung der Adhärenz
von Sc. suis–Isolaten an Schweine-Lungen wurde beobachtet, dass Isolate von
Schweinen mit Meningitis oder Pneumonie deutlich besser adhärierten als Isolate
von klinisch gesunden Tieren (GOTTSCHALK et al. 1991). Bekannt ist auch, dass
virulente Sc. suis Stämme sowohl humane als auch porcine Erythrozyten
agglutinieren können, eine Fähigkeit, die bei manchen anderen bakteriellen Erregern
mit der Adhärenz an andere Wirtszellen korreliert (GOTTSCHALK et al. 1991; KURL
et al. 1989). Dabei beruht die Hämagglutination auf der Adhärenz von Sc. suis an
spezifische Zuckerreste der Erythrozyten und erfolgt wahrscheinlich über
Oberflächenproteine der Erythrozyten (GOTTSCHALK et al. 1990; KURL et al. 1989).
Sc. suis erkennt offenbar Sialinsäurereste an verschiedenen Glykoproteinen und –
lipiden der Erythrozytenmembranen. Diese Sialinsäurereste werden
interessanterweise auch von anderen schweinepathogenen Erregern wie E. coli K99
und Bordetella bronchiseptica erkannt (ISHIKAWA et al. 1987). Eine klare Korrelation
zwischen Adhärenzvermögen und Serotyp bei Sc. suis konnte dabei nicht festgestellt
werden (KURL et al.1989).
HAATAJA et al. (1994) konnten ein Adhäsin von Sc. suis isolieren. Dieses Adhäsin
bindet an die Disaccharide Gal α 1-4 Gal der P1 und PK -Blutgruppenantigene der
Schrifttum
25
Erythrozyten, konnte in allen untersuchten virulenten Sc. suis -Stämmen
nachgewiesen werden, und war bei Immunisierungsversuchen mit Mäusen
hochimmunogen (TIKKANEN et al. 1996). Jedoch zeigten experimentelle Infektionen,
dass die Ergebnisse, welche bei Versuchen mit Mäusen erlangt werden konnten,
nicht ohne weiteres auf das Schwein übertragbar sind (VECHT et al. 1997).
2.3.4.2 KapselDie von Sc. suis produzierte Polysaccharid-Kapsel spielt eine wichtige Rolle in der
Virulenz dieser Bakterien. So konnte von SMITH et al. (1999) in experimentellen
Infektionen mit Ferkeln nachgewiesen werden, dass unkapselte Deletionsmutanten
gegenüber hochvirulenten Wildstämmen ihre Virulenz verloren hatten. Welche
Aufgabe die einzelnen Bestandteile der Kapsel besitzen, und welche Rolle die
Kapsel, bzw. ihre einzelnen Bestandteile in der Pathogenese von Sc. suis spielen, ist
noch nicht genau geklärt. Es gibt aber Hinweise darauf, dass einzelne Bestandteile
eine Rolle in der Pathogenese von Sc. suis spielt, da bekapselte Stämme in in vivo-
Untersuchungen die Phagozytose durch Alveolarmakrophagen verhinderten,
während die unbekapselten Deletionsmutanten sehr effektiv phagozytiert (über 99 %)
und abgetötet wurden (SMITH et al. 1999).
Die Kapsel von Sc. suis ist aus den Komponenten Glukose, Galaktose, N-
Acetylglukosamin, Rhamnose und Sialinsäure in einem Verhältnis von 1:3:1:1:1
aufgebaut. Die genaue Struktur ist jedoch noch nicht geklärt. Die Kapsel-Gene
konnten kloniert und exprimiert werden. Die Gene hatten eine Gesamtgrösse von 16
kBp und es konnten 14 offene Leserahmen unterschiedlicher Grösse identifiziert
werden. Die Genprodukte von 11 dieser 14 offenen Leserahmen zeigen
Ähnlichkeiten mit Polysaccharid-Biosynthese-Proteinen anderer grampositiver
Mikroorganismen.
Basierend auf der Homologie einzelner Genabschnitte des Kapselgens mit Genen
anderer Bakterien wird vermutet, dass die Kapsel-Gene Glucosyl-, Galaktosyl-, N-
Acetylglukosaminyl- und Rhamnosyl -Transferase Aktivitäten kodieren (SMITH et al.
1999).
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26
2.3.4.3 Muramidase-Released-ProteinBei dem Muramidase-Released-Protein (MRP) handelt es sich um ein
zellwandständiges Protein von Sc. suis mit einem Molekulargewicht von 136 kDa,
welches vor allem bei virulenten Sc. suis - Stämmen und selten bei avirulenten
Stämmen auftritt. Daraus wurde gefolgert, dass das MRP ein Virulenzfaktor oder
zumindest ein virulenzbegleitender Faktor sein könnte (VECHT et al. 1991). Bei
Infektionsversuchen wurde dabei festgestellt, dass die Virulenz der untersuchten Sc.
suis Stämme abhängig von dem Vorhandensein des MRPs und nicht von der
Herkunft des Isolates war. Alle Tiere, welche mit einem MRP-positiven Stamm
infiziert wurden, zeigten klinische Symptome. Bei den Tieren, die mit einem MRP–
negativen Stamm infiziert wurden, waren keine klinischen Symptome zu finden
(VECHT et al. 1992). Allerdings wurde in späteren Infektionsversuchen mit einer
MRP-defizienten Sc. suis Serotyp 2-Mutante eine dem MRP-positiven Sc. suis -Wild-
Stamm vergleichbare Virulenz nachgewiesen. Dies zeigt, dass das MRP nicht direkt
an der Virulenz beteiligt ist, sondern vielmehr einen virulenzbegleitenden Faktor
darstellt (SMITH et al. 1996).
Das MRP wurde eingehend strukturell charakterisiert. Demnach steht das Protein in
Assoziation mit den Peptidoglykanen den Zellwand (VECHT et al. 1991), ähnlich wie
andere Peptidoglykan-assoziierte Proteine von Streptokokken, z. B. das M-Protein
von Sc. pyogenes (FISCHETTI 1989). Das MRP-Gen konnte kloniert und in E.coli
überexprimiert werden. Dabei wurde ein offener Leserahmen mit einer
Nukleotidsequenz von 3,786 kBp identifiziert und sequenziert, woraus eine
Polypeptidkette mit einer Länge von 1256 Aminosäuren und einem kalkuliertem
Molekulargewicht von 135,749 kDa abgeleitet wurde (SMITH et al. 1992).
Die molekulargenetische Charakterisierung ergab, dass das MRP die typischen
Merkmale von Oberflächenproteinen bei grampositiven Kokken aufweist (SMITH et
al. 1992). So sind die ersten 47 Aminosäuren des MRP-Proteins am N–terminalen
Ende ein typisches Signalpeptid. Das N-terminale Ende besteht aus positiv
geladenen Resten, gefolgt von einer hydrophoben Kette, bestehend aus 21
Aminosäuren und vermutlich einer Signal-Peptidase-Spaltungssequenz. Aufgrund
dieser Spaltung der Signal-Peptidase resultiert auch die unterschiedliche
Erscheinungsform des MRP hinsichtlich des Molekulargewichtes von 136 kDa und
131,094 kDa. Eine zweite hydrophobe Region konnte am C-terminalen Ende
identifiziert werden. Da dieser Bereich analog zu anderen Zellwand-assoziierten
Schrifttum
27
Proteinen grampositiver Bakterien ist, handelt es sich hierbei möglicherweise um
eine Zellmembranverankerung. Weitere Regionen aus der MRP-Sequenz wurden
identifiziert. So folgt der schon angesprochenen Aminosäurensequenz am N–
terminalen Ende eine Sequenz von 819 Aminosäuren. Darauf folgen eine
prolinreiche Sequenz von 86 Aminosäuren, sowie drei sich wiederholende Motive
aus je 54 Aminosäuren. Das erste des sich wiederholenden Motivs ist von dem
zweiten durch 77 Aminosäuren getrennt, während die zweite und dritte unmittelbar
aufeinander folgen. Diesen Sequenzen folgt die Zellmembran–Verankerungssequenz
am C–terminalen Ende. Bisher wurden keine auffallenden Homologien des MRPs mit
anderen Proteinen gefunden. Eine geringe Homologie (17,2% Übereinstimmung in
einer Sequenz von 377 Aminosäuren) besteht mit dem fibronektinbindenden Protein
von Staph. aureus, woraus geschlossen wurde, dass das MRP eine Bindung von Sc.
suis an Fibronektin vermitteln könnte (SMITH et al. 1992). Allerdings ist bisher eine
solche Bindung nicht beschrieben worden. Die genaue Funktion des MRP konnte
bisher nicht geklärt werden (SMITH et al. 1992).
2.3.4.4 Extrazellulär-FaktorBei der Untersuchung des Proteinprofiles von Sc. suis Serotyp 2 Isolaten konnte,
neben dem MRP (siehe oben), im Kulturüberstand ein Protein von 110 kDa gefunden
werden, welches als Extrazellulär-Faktor (EF) bezeichnet wurde (VECHT et al.
1991). Das Protein wurde hauptsächlich in Kulturüberständen von Stämmen
identifiziert, welche aus erkrankten Schweinen stammten. Bei 77 % der Stämme,
welche von erkrankten Schweinen stammten, wurde das EF-Protein isoliert. Jedoch
konnte bei nur 15 % der von Humanpatienten isolierten Stämme das EF
nachgewiesen werden. Resultierend aus diesen Beobachtungen wurde postuliert,
dass das EF stärker mit porcinen Stämmen als mit humanen Stämmen assoziiert ist
(VECHT et al. 1991).
Bei der Untersuchung der Proteinprofile der Kulturüberstände konnten auch mehrere
höhermolekulare Proteine ( >150 kDa) festgestellt werden. Beim Nachweis des EF-
Proteines mit monoklonalen Antikörpern wurden auch höhermolekulare Proteine
erkannt. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde gefolgert, dass diese Proteine sehr eng
mit dem EF verwandt sind. Offensichtlich existieren Längenvarianten des EFs bei
den verschiedenen Sc. suis -Stämmen. Alle EF-negativen Stämme (EF-) hatten das
verwandte EF mit der höheren Molekularmasse (EF*), während kein EF-positiver
Schrifttum
28
Stamm (EF+) das verwandte EF* phänotypisch ausprägte (siehe Tabelle 5).
Aufgrund dieser Zusammenhänge wurde gefolgert, dass nur das 110 kDa grosse EF
bei Sc. suis -Infektionen beim Schwein eine Rolle spielt (VECHT et al. 1991).
Bei der Klonierung und Sequenzierung von EF bzw. EF*-Genen verschiedener Sc.
suis Stämme des Serotyps 2 zeigte sich, dass das EF offenbar relativ stark
konserviert ist. Dabei liegt der für das EF kodierende Bereich im ersten offenen
Leserahmen (VECHT et al. 1993).
Tabelle 5: EF-Protein-Varianten bei Sc. suis (VECHT et al. 1993).
Typ MolekulargewichtEF 110 kDa
EF* Typ I 195 kDa
EF* Typ II 180 kDa
EF* TYP III 175 kDa
EF* Typ IV 160 kDa
EF* Typ V 155 kDa
Zwischen den Genen, welche das EF-Protein (epf) und denen, welche die EF*-
Proteine (epf*) kodieren, gibt es hohe Homologien. So sind die ersten 2499
Nukleotide sowohl bei epf und bei epf* nahezu identisch. Dieser Sequenz folgen
beim epf*-Typ I-Gen 2433 Basenpaare, von dem beim epf Gen nur 65 Basenpaare
gefunden werden konnten. Diesen Sequenzen folgen weitere Sequenzen die beim
epf*-Gen gefunden wurden, und die weitgehend mit den korrespondierenden
Regionen des epf-Gens übereinstimmen (SMITH et al. 1993)
Die Proteine, welche von den verschiedenen epf*-Genen kodiert werden,
unterscheiden sich vom EF in den Aminosäurenabschnitten in der Nähe des C-
terminalen Endes durch eine variierende Zahl von Wiederholungen. Es wird daher
vermutet, dass das epf-Gen aus einem epf*-Urspungsgen entstanden ist und dass
der Verlust der sich wiederholenden Sequenzen wichtig für die Virulenz sein könnte
(SMITH et al. 1993).
Die Bedeutung des EF steht offenbar in einem engen Zusammenhang mit dem MRP:
So wurde bei Untersuchungen zur Virulenz von Sc. suis mit unterschiedlichen
MRP/EF Phänotypen bei Schweinen festgestellt, dass die Virulenz sehr eng mit dem
MRP+/EF+ Phänotyp korrelierte (VECHT et al. 1992). Auch Stämme des Phänotyps
Schrifttum
29
MRP+/EF- verursachten klinische Symptome, welche jedoch milder waren, während
Schweine, welche mit Stämmen des Phänotyp MRP-/EF- infiziert worden waren,
keine klinischen Symptome zeigten. Aufgrund dieser Ergebnisse kann vermutet
werden, dass EF ein wichtiger Virulenzfaktor oder zumindest ein virulenz-
begleitender Faktor bei Schweinen ist. Eine mögliche Funktion des EF könnte sein,
dass er beim Überwinden der Schleimhautbarriere im Nasopharynx des Schweines
involviert ist, da nur EF-positive Stämme in der Lage waren, diese Barriere zu
überwinden (VECHT et al. 1992).
Bei Impfversuchen in Schweinen konnte jedoch festgestellt werden, dass eine
isogene MRP-negative EF-negative Mutante die volle Virulenz zeigte (SMITH et al.
1996). Auch konnte festgestellt werden, dass bei Impfungen mit Kultur-Überständen
von Sc. suis die das EFenthielten, die Tiere nach Infektion mit virulenten EF-positiven
Sc. suis-Stämmen, nicht effektiv geschützt wurden (JACOBS et al. 1996). Auch beim
EF ist also die Funktion und Bedeutung noch nicht geklärt (VECHT et al. 1991). Es
gilt aber als gesichert, dass EF in Verbindung mit MRP virulenzassoziiert ist.
2.3.4.5 HämolysineDie Eigenschaft von Bakterien, Erythrozyten zu lysieren (Hämolyse) wird bei
verschiedenen grampositiven und gramnegativen Bakterien in Verbindung mit
Virulenz und Pathogenität gesehen. Auch Sc. suis ist in der Lage, Hämolysine zu
exprimieren. Eine vergleichende Studie von Referenzstämmen zeigte, dass bei den
getesteten Stämmen nur 10 von 23 Serotypen eine hämolytische Aktivität zeigten,
welche je nach Serotyp und Umweltbedingung unterschiedlich stark ausgeprägt war
(siehe Tabelle Nr. 6). So konnte die höchste hämolytische Aktivität bei den
Referenzstämmen der Serotypen 1, 2, und ½ beobachtet werden.
Schrifttum
30
Tabelle 6: Übersicht über hämolytische Aktivitäten von Sc. suis -Referenzstämmen
(FEDER et al. 1994)
Serotyp* Herkunft HämolytischeEinheiten
½ Nordamerika 625
1 Nordamerika 666
2 Nordamerika 666
3 Nordamerika 0
4 Nordamerika 83
5 Nordamerika 17
6 Nordamerika 0
7 Nordamerika 0
8 Nordamerika 0
9 Nordamerika 0
10 Dänemark 0
11 Dänemark 0
12 Dänemark 0
13 Dänemark 0
14 Dänemark 100
15 Dänemark 111
16 Dänemark 0
17 Dänemark 20
18 Dänemark 0
19 Dänemark 50
20 Dänemark 20
21 Nordamerika 0
22 Nordamerika 0
Hämolytische Einheit: = grösste Verdünnung, des Überstandes, die benötigt wird, um in 1 ml50% der Schaf-Erythrozyten einer 1%igen Eryrthrozyten-Suspension zu lysieren.* = Getestet wurde von jedem Serotyp jeweils der Referenz-Stamm
Bei der Hämolysinproduktion spielen die Kultivierungsbedingungen eine grosse
Rolle. So konnte die höchste in vitro Hämolysinproduktion am Ende der
logarithmischen Wachstumsphase und die höchste Aktivität des Hämolysins bei
Schrifttum
31
40°C und 6% CO2 in THB-Medium gemessen werden (FEDER et al.1994). Zudem
konnte gezeigt werden, dass die Produktion der Hämolysine bei Stämmen, die aus
Krankheitsgeschehen wie Meningitis und Septikämie isoliert worden waren, höher
war als bei Stämmen, welche in Reinkultur aus Mischinfektionen aus
Krankheitsherden des Respirationstraktes stammten (SALA et al. 1996).
Die Empfindlichkeit von Erythrozyten unterschiedlicher Säugerarten gegenüber den
Sc. suis -Hämolysinen ist sehr verschieden. Am empfindlichsten reagieren
menschliche Erythrozyten, gefolgt von Pferde -, Schaf -, Rinder -, Schweine – und
Kaninchenerythrozyten (GOTTSCHALK et al. 1995). Bei den bisher beschriebenen
Hämolysinen handelt es sich ausnahmslos um extrazelluläre Proteine.
GOTTSCHALK et al. (1995) konnten ein Hämolysin mit einer molekularen Masse von
65 kDa nachweisen. Weitere Hämolysine mit einer Molekularmasse von 54 kDa
(JACOBS et al. 1994) und 52 kDa (OKWUMABUA et al. 1999) wurden beschrieben.
Homologie-Untersuchungen von OKWUMABUA et al. (1999) ergaben eine sehr hohe
Übereinstimmung des 52 kDa grossen Hämolysins mit dem Hämolysin von JACOBS
et al. (1994). Letzteres wurde von JACOBS (1994) als Suilysin bezeichnet und
gehört, ebenso wie das Hämolysin, welches von GOTTSCHALK et al. (1995)
identifiziert wurde, zur Familie der Thiol-aktivierten Toxine, welche eine antigene
Verwandtschaft mit Cholesterol–bindenden zytolytischen Toxinen aufweisen
(GOTTSCHALK et al. 1995). Das Suilysin verliert seine Aktivität, wenn es oxidiert
wird. Dies ist jedoch reversibel, denn es erlangt seine volle Aktivität unter Zugabe
eines reduzierenden Agens wieder (JACOBS et al. 1994). Der Vergleich der N-
terminalen Aminosäurensequenz des Suilysins ergab viele Gemeinsamkeiten mit
Teilen des N-terminalen Endes der Aminosäurensequenzen von Perfringolysin O,
Streptolysin O, Listeriolysin O, Alveolysin und Pneumolysin (JACOBS et al. 1994).
Das Suilysin-Gen wurde kloniert und sequenziert (SEGERS et al. 1998). Bei der
Überprüfung von 158 Feldstämmen unterschiedlichster Serotypen auf die
Anwesenheit des Suilysin-Genes mittels Polymerase-Kettenreaktion waren 100
positiv. Dabei waren alle Serotyp 1-Stämme und 95% der Serotyp 2-Stämme
Suilysin-positiv. Die Anwesenheit des Suilysin-Genes war jedoch nicht mit der
Expression gleichzusetzen (SEGERS et al. 1998). Welche Funktion den
Hämolysinen von Sc. suis zukommt, ist noch nicht vollständig geklärt. Jedoch konnte
bei in vitro-Versuchen eine zytotoxische Wirkung festgestellt werden. Daraus wurde
geschlossen, dass die Hämolysin-Expression im Zusammenhang mit der Lyse von
Schrifttum
32
Epithel- und Endothelzellen steht und somit für Sc. suis bei der Überwindung von
Zellbarrieren eine Bedeutung haben könnte (NORTON et al. 1999; CHARLAND et al.
2000).
Mit Hämolysin vakzinierte Schweine zeigten nach einer Infektion mit Hämolysin-
positiven Sc. suis–Stämmen nur sehr milde Krankheitssymptome und regenerierten
am schnellsten (JACOBS et al. 1996). Aufgrund dieses partiellen Impfschutzes kann
davon ausgegangen werden, dass die Hämolysine für die Virulenz von Sc. suis eine
Rolle spielen, obwohl auch virulente Hämolysin-negative Sc. suis-Stämme
nachgewiesen wurden (STAATS et al. 1998) Möglicherweise ist die Hämolysin-
Expression als Marker zur Identifikation von hochvirulenten Sc. suis-Isolaten
verwendbar (OKWUMABUA et al. 1999).
2.3.5 Therapie und ProphylaxeSc. suis -Infektionen werden in der Regel mit Penicillin behandelt (GOTTSCHALK et
al. 1991). Bei Saugferkeln wurde eine Behandlung durch parenterale Verabreichung
von Penicillin oder Trimethoprim-Sulfonamid getestet, wobei jedoch bei
fortgeschrittenem Krankheitsgeschehen die Behandlung nur noch wenig Erfolg hatte
(TAYLOR 1989). Bei Untersuchungen hinsichtlich Antibiotika-Resistenzen wurde
festgestellt, dass über 80% der getesteten Stämme resistent gegenüber Neomycin
waren. Eine Resistenz von über 50% der Stämme konnte bei den Antibiotika
Oxytetracyclin, Lincomycin, Erythromycin und Gentamicin beobachtet werden.
Gegenüber den getesteten Antibiotika Oxacillin und Penicillin G zeigten über 90%
der Stämme im Antibiogramm eine Empfindlichkeit. Nur bei Ampicillin wurde eine
Empfindlichkeit aller getesteten Stämme nachgewiesen (WAACK 1996). Bei
Resistenzuntersuchungen von Sc. suis -Isolaten aus Dänemark und Schweden
waren über 23% resistent gegen Makrolid-Antibiotika. Auch eine erhöhte Resistenz
gegen Sulfonamide und gegen Tetracycline konnte festgestellt werden
(AARESTRUP et al. 1998). Einen besseren klinischen Effekt durch die Kombination
von Antibiotika mit Kortikosteroiden, wie er aus der Humanmedizin bekannt ist,
konnte nicht nachgewiesen werden (SZANCER u. VECHT 1996).
Flankierende therapeutische Massnahmen neben einer frühzeitigen antibiotischen
Behandlung bestehen darin, festliegende Tiere aufzusetzen, erhitzte Körper-
oberflächen abzuduschen (CLIFTON-HADLEY 1983), im Verbringen in eine ruhige
Schrifttum
33
kühle Umgebung und die manuelle Zufuhr von Wasser und Elektrolyten (TAYLOR
1989).
Als Massnahmen zur Vorbeugung einer Infektion mit Sc. suis werden neben der
medikamentellen Vorbeugung verbessertes Haltungsmanagement, Tilgungsmass-
nahmen und die Impfprophylaxe angesehen.
Als medikamentelle Prophylaxe wird die Verabreichung von Tetracyclinen oder
Penicillin mit dem Futter angewendet, obwohl diese Methode keinen sicheren Schutz
bieten kann (WINDSOR 1977). So konnte trotz Metaphylaxe mit 300 mg Penicillin
pro Kilogramm Futter in einer Herde das Auftreten von Meningitiden festgestellt
werden (CLIFTON-HADLEY u. ALEXANDER 1980). Zudem muss bei
Futtermedikation berücksichtigt werden, dass Penicilline, als Fütterungsarzneimittel
eingesetzt, erheblichen Stabilitätsverlusten unterworfen sind (COOKE 1984). Bei der
Überprüfung von Antibiotika zur Elimination von Sc. suis aus den Tonsillen gesunder
Schweine musste festgestellt werden, dass weder eine unterschiedliche
Verabreichung von Penicillinen über mehrere Tage noch die Gabe von Ampicillin
oder Ceftiofur ausreichte, den tonsillären Trägerstatus der Tiere zu ändern und somit
immer eine Gefahr der Übertragung auch von klinisch gesunden Tieren ausgehen
kann (AMASS et al. 1996). Diese Ergebnisse stellen den Sinn und die Effektivität
einer Metaphylaxe über Futterarzneimittel in Frage, zumal durch eine solche
Massnahme die Gefahr einer erhöhten Resistenzbildung gegeben ist.
Aufgrund der hohen finanziellen Belastungen sind Eradikationsmassnahmen nur bei
einer sehr hohen Durchseuchung zu rechtfertigen (CLIFTON-HADLEY 1983). Auch
muss nach Schlachtung aller Tiere eines Betriebes auf die Desinfektion der
Stallungen ein besonderes Augenmerk gerichtet werden, um den Erreger auch in Kot
und Staub eliminieren zu können (CLIFTON-HADLEY u. ALEXANDER 1981).
Weiterhin sollten kontinuierliche Aufzuchtmethoden vermieden, bzw. das „Rein-Raus-
Verfahren“ vorgezogen werden. Die Tiere sollten möglichst keinen Kontakt zu
anderen Stallabteilungen haben und in möglichst trockenen, sauberen Buchten
gehalten werden, wobei auch der Kontakt zu Kot möglichst gering sein sollte
(TAYLOR 1989).
Bei Impfungen von Schweinen mit inaktivierten virulenten und avirulenten Sc. suis
Serotyp 2 Stämmen konnte eine belastbare, nicht stammspezifische Immunantwort
hervorgerufen werden, als die Tiere Booster-Injektionen erhielten (HOLT et al. 1988).
Jedoch entwickelten die Schweine, bei denen zur Immunisierung virulente Stämme
Schrifttum
34
verwendet wurden, zu Beginn der Behandlung Krankheitserscheinungen, welche
jedoch im Laufe der Booster-Injektionen abklangen. Es zeigte sich, dass spezifische
Antikörper zwar vor einer Erkrankung schützen können, die Ansiedlung des Erregers
in Tonsillen und Gelenken aber nicht verhindern. Das heisst, dass eine subklinische
Infektion nicht verhindert werden kann (HOLT et al. 1988). Bei Immunisierungs-
versuchen wurde festgestellt, dass mittels Formalin-inaktivierter Sc. suis - Stämme
im Gegenteil zu Hitze-inaktivierten Stämmen eine belastbare Immunität
hervorgerufen werden kann. Dabei spielte die Art der Kultivierung der Bakterien oder
die Verwendung eines Adjuvans keine Rolle. Die Tiere, welche mit Hitze-inaktivierten
Stämmen immunisiert wurden, erkrankten nach einer Belastungsinfektion, obwohl sie
opsonisierende Antikörper gebildet hatten und diese Antikörper bei in-vitro-
Versuchen die gleiche Wirkung zeigten wie die Antikörper der Formalin-inaktivierten
Stämme. Daraus wurde geschlossen, dass bei der Hitze-Inaktivierung
Oberflächenstrukturen zerstört wurden, gegen die im Versuchstier weitere Antikörper
gebildet werden (HOLT et al. 1990).
In einer weiteren Impfstudie konnte MADEC (1986) ebenfalls zeigen, dass bei
Immunisierungsversuchen mit Formalin-inaktivierten und mit Adjuvans versehenen
bestandsspezifischen Stämmen die Erkrankungen der Tiere nach einer
experimentellen Infektion reduziert werden konnte. Bei Untersuchungen der
geschlachteten Tiere zeigte es sich, dass auch vakzinierte Tiere von einer latenten
Sc. suis –Infektionen betroffen waren. Jedoch war der Durchseuchungsgrad dieser
Tiere mit Sc. suis deutlich niedriger als bei einer Kontrollgruppe (MADEC 1986).
Bei der Vakzinierung von Schweinen mit Suilysin wurde nur ein Teilschutz aufgebaut.
Die geimpften Tiere zeigten bei nachfolgender Infektion mit Sc. suis Krankheits-
symptome, die jedoch deutlich milder waren, als bei nicht vakzinierten Schweinen
(JACOBS et al. 1996).
Bei Infektionsversuchen mit Mäusen, welchen unterschiedliche Antikörperfraktionen
von immunisierten Schweinen verabreicht wurden, konnte festgestellt werden, dass
die Mäuse nicht geschützt waren, wenn aus den Schutzseren die Antikörper entfernt
worden waren, die gegen Oberflächenantigene von Sc. suis gerichtet waren. Durch
das komplette Serum waren die Mäuse jedoch geschützt (HOLT et al. 1989). Bei
Untersuchung der Seren mittels Immunoblot-Analyse wurden Antikörper gegen sechs
Sc. suis –Antigene nachgewiesen, welche Molekulargewichte von 44, 78, 86, 94, 130
bzw. 136 kDa hatten. In Verbindung mit Kapselmaterial von Sc. suis könnten diese
Schrifttum
35
Sc. suis –Antigene zur Entwicklung eines Impfstoffs verwendet werden (HOLT et al.
1989).
Bei Immunisierungsversuchen von Mäusen mit dem EF-Protein eines Sc. suis
Serotyp 2-Stammes waren die Tiere geschützt und zeigten nach einer
Belastungsinfektion mit virulenten Sc. suis Serotyp 2 – Stämmen im Gegensatz zur
Kontrollgruppe keine klinischen Symptome (QUESSY et al. 1994).
Ein serotypübergleifender Impfschutz konnte jedoch bisher nicht erreicht werden.
2.4 Problemstellung und Ziel der vorliegenden ArbeitZusammenfassend ist ein wesentliches Problem bei Sc. suis-Infektionen die hohe
geno- und phänotypische Diversität des Erregers und der geringe Kenntnisstand
über dessen Virulenzmerkmale. Daher sollten in der vorliegenden Arbeit Stämme mit
verschiedenem klinischem Hintergrund eingehend phänotypisch und genotypisch
charakterisiert und typisiert werden. Ziel war es, Hinweise auf Zusammenhänge
zwischen klinischem Hintergrund, dem Auftreten potentieller phänotypischer
Virulenzfaktoren und dem genetischen Hintergrund zu erhalten.
Material und Methoden
36
3 Material und Methoden
3.1 BakterienDie Mehrzahl der Isolate wurde von Probenmaterial aus dem diagnostischen Labor
des Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule
Hannover isoliert (Proben eingesandt von praktizierenden Tierärzten, der Klinik für
kleine Klauentiere sowie dem Institut für Pathologie). Die Tabelle 7 gibt Auskunft über
die Anzahl der Isolate und ihre Herkunft. Die Stämme wurden anhand ihrer
morphologischen und biochemischen Merkmale als Sc. suis identifiziert. Die
einzelne Bezeichnung der Isolate erfolgt im Anhang.
Tabelle 7: Herkunft von 92 Isolaten, die für diese Arbeit zur Verfügung gestellt
wurden
Anzahl der zur Verfügung gestellten Isolate vonHerkunft bzw. klinischerHintergrund A B I GMeningitis 10 3 7 11
Septikämie 4 0 1 0
Arthritis 5 1 1 0
Pneumonie 7 8 0 1
Pneumonie-Mischinfektion 7 17 0 0
Nasen-Tupfer 5 0 0 0
Zervix-Tupfer 3 1 0 0
Gesamt 41 30 9 12
A: Diagnostisches Labor des Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen derTierärztlichenHochschule HannoverB: Aussenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover in BakumI: IVD, Innovative Veterinär-Diagnostik (Aninstitut der Tierärztlichen Hochschule Hannover)G: Institut für Bakteriologie und Hygiene der Milch des Fachbereichs Veterinärmedizin derJustus–Liebig–Universität Giessen (Prof. Dr. C. Lämmler)
Material und Methoden
37
Des weiteren standen folgende, in Tab. 8 aufgeführten Referenzstämme zur
Verfügung.
Tabelle 8: Bezeichnung und Herkunft der untersuchten Referenzstämme
Bezeichnung Herkunft Zur Verfügung gestellt vonD 282 Meningitis Lelystad/Holland *
H 5631/2 Tonsillen Lelystad/Holland
H 6399 Meningitis Lelystad/Holland
DSM 9682 Meningitis DSM **
DSM 9683 Meningitis DSM
DSM 9684 Meningitis DSM
P 1/7 Meningitis Lelystad/Holland
T 15 Lunge Lelystad/Holland
Vecht 4005 Meningitis Lelystad/Holland*= ID-DLO Lelystad, Holland (Institute for Animal Science and Health, Lelystad)
**= Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkultur, Braunschweig
Zur Erstellung eines Grössenstandard für die Pulsfeld-Gelelektrophorese wurde der
Staphylococcus aureus Stamm DSM 1104 eingesetzt, der von der Deutschen
Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkultur (Braunschweig) erworben
wurde.
3.2 ZellkulturenFür die Adhärenzversuche wurden zwei Epithel-Zelllinien eingesetzt. Hierbei
handelte es sich zum einen um die humane Zelllinie HEp 2 (ATCC-Nr. CCL-23), die
aus dem oberen Atemtrakt stammt. Zum zweiten wurde die porcine Hoden-Zelllinie
ST verwendet, die von Prof. Dr. G. Herrler (Inst. für Virologie der TiHo) zur Verfügung
gestellt wurde.
Material und Methoden
38
3.3 Medien, Pufferlösungen und Lösungen
3.3.1 Medien für die ZellkulturDulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)
Es handelt es sich um ein steriles Fertigmedium der FA. GIBCO BRL
Als Zusätze wurden verwendet:
Fötales Kälberserum (FCS) 10 %
Penicillin–Streptomycin-Lösung 1 %
(Stock–Lösung: Penicillin 5000 IU/ml; Streptomycin 5000 µg/ml)
3.3.2 StammlösungenTris-HCl, 1 M (pH 7,2, bzw. pH 8,0)
Die pH-Wert-Einstellung erfolgte mittels Zugabe von HCl. Die Lösung wurde
anschliessend autoklaviert.
Na-EDTA, 0,5 M (pH 7,2, bzw. pH 8,0)
Die pH-Wert-Einstellung erfolgte mittels Zugabe von NaOH. Die Lösung wurde
anschliessend autoklaviert.
NaCl, 4 M
Die Lösung wurde autoklaviert.
SDS 20 % (w/v)
Die Lösung wurde mit autoklaviertem A. dest. hergestellt.
Na2HPO4 (pH 7,2), 1 M
Die pH-Wert-Einstellung erfolgte mit H2PO4.
Proteinase K, 20 mg/ml
Die Herstellung der Lösung erfolgte mit autoklaviertem A. dest.
Material und Methoden
39
3.3.3 StandardpufferTE-Puffer
Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM
Na-EDTA 1 mM
10 x TBE (pH 7,5)
Tris-HCl (pH 7,5) 0,9 M
Borsäure 0,9 M
EDTA 0,5 M
20 x SSC
NaCl 3 M
Natriumcitrat 0,3 M
PBS-Puffer (phosphatgepufferte Salzlösung)
NaCl 100 mM
NaH2PO4 x 2H20 100 mM
Na2HPO4 x 2H20 100 mM
3.3.4 Puffer und Lösungen für die Pulsfeld-GelelektrophoresePettIV-Puffer
1 M NaCl
10 mM Tris-HCl pH 8,0
10 mM Na-EDTA
Lyse-Puffer
1 M NaCl
10 mM Tris-HCl pH 8,0
200 mM Na-EDTA
0,5 % (w/v) N-Lauroylsarkosyl
0,2 % (w/v) Natriumdeoxycholat
Material und Methoden
40
Vor Gebrauch zuführen:
RNase 2 µg/ml
Lysozym 1 mg/ml
Mutanolysin 13 U/ml
Für die Lyse des Staphylokokken-Stammes DSM 1104 wurde an Stelle des
Mutanolysins Lysostaphin (1800 U/ml) eingesetzt.
ESP-Puffer
0,5 M Na-EDTA
1 % (w/v) N-Lauroylsarkosyl
kurz vor Gebrauch:
Proteinase K 1 mg/ml
TE-Puffer
10 mM Tris-HCl pH 8,0
1 mM Na-EDTA
TE-PMSF-Lösung
10 mM Tris-HCl pH 8,0
1 mM Na-EDTA
1,5 mM Phenylmethylsulfonsäurefluorid (PMSF)
PMSF wurde erst kurz vor Gebrauch zugeführt.
10 x TBE-Puffer
0,9 M Tris (ohne HCl)
0,9 M Borat
0,5 M EDTA (Na-frei)
0,5 x TBE-Puffer
0,45 M Tris (ohne HCl)
0,45 M Borat
1 mM EDTA (Na-frei)
Material und Methoden
41
Äquilibrierungspuffer
10 x Restriktionspuffer
(je nach eingesetztem Enzym) (Fa.Boehringer) 25,00 µl
Aqua dest 225,00 µl
Restriktionslösung
10 x Restriktionspuffer
(je nach eingesetztem Enzym) (Boehringer) 5,0 µl
Enzym 2,0 µl
Aqua dest 43,0 µl
3.3.5 Southern-BlottingDepurinationslösung
HCl 0,25 M
Die Lösung wurde autoklaviert.
Denaturierungslösung
NaCl 1,5 M
NaOH 0,5 M
Die Lösung wurde autoklaviert.
20 x SSC-Lösung
Natriumcitrat 300 mM
NaCl 3 M
Der Puffer wurde autoklaviert.
3.3.6 SondenhybridisierungHybridisierungs-Puffer
1,0 mM Na-EDTA
0,5 M Na2HPO4 (pH 7,2)
7,0 % Sodiumdodecylsulfat (SDS)
Material und Methoden
42
Waschlösung I
40 mM Na2HPO4 (pH 7,2)
1,0 mM Na-EDTA
5 % SDS
Waschlösung II
40 mM Na2HPO4 (pH 7,2)
1,0 mM Na-EDTA
1 % SDS
Material und Methoden
43
3.4 Kultivierung der BakterienDie verwendeten Bakterien-Stämme wurden auf Columbia-Blutplatten (Fa. OXOID)
über Nacht bei 37°C angezüchtet. Für die Kultivierung der Streptokokken wurde,
soweit nicht anders angegeben, Todd-Hewitt Broth (THB, Difco Laboratories, Detroit,
USA) zu 20 ml in 200 ml Erlenmeyerkolben verwandt. Die Kultivierung der
Staphylokokken wurde in Brain-Heart-Infusion (BHI, FA. Sigma) zu 20 ml in 200 ml
Erlenmeyerkolben durchgeführt.
3.5 SerotypisierungDie Serotypisierung wurde mit freundlicher Unterstützung durch Dr. H. Wisselink und
Dr. H. Smith ( ID-DLO Lelystad/Holland) durchgeführt.
Hierfür wurde die Objektträger–Latex-Agglutination durchgeführt, wie von VECHT et
al. (1985) beschrieben. Es standen Serotyp-spezifische Kaninchen-Antiseren gegen
die Sc. suis -Serotypen 1–28 zur Verfügung.
3.6 Untersuchung auf die Expression von MRP/EFDiese Arbeiten wurden mit freundlicher Unterstützung durch Dr. H. Wisselink und Dr.
H. Smith (ID-DLO Lelystad/Holland) durchgeführt. Hierfür wurde die
Natriumdodecylsulfat–Polyacrylamidgel–Elektrophorese (SDS-PAGE) nach
LAEMMLI (1970) im vertikalen Flachbett in einer Schichtdicke von 1,5 mm
durchgeführt. Als Positivkontrolle diente der Kulturüberstand des Sc. suis Stammes
Vecht 4005. Auf das Trenngel aus 6 % Polyacrylamid wurde das Probengel
bestehend aus 4 % Polyacrylamid mit 10 Geltaschen polymerisiert. Die
Probenauftragung erfolgte nach Mischung von 40 µl Probe mit 20 µl Probenpuffer
mittels einer Mikroliterspritze. Die Elektrophorese wurde 4 Stunden bei 5 mA/Gel
durchgeführt, bis die Lauffront ca. 1 cm über dem unteren Glasrand angelangt war.
Der Nachweis der Proteine erfolgte dann mittels Immunoblot-Analyse nach TOWBIN
et al. 1979. Hierbei wurden die im Polyacrylamidgel enthaltenen Proteine durch ein
elektrisches Feld auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Für den Transfer
wurde die Transfer-Zelle Multiphor II Nova Blot System (Pharmacia LKB, Uppsala,
Schweden) verwendet. Der Transfer erfolgte für 30 min. bei 10 V. Nach Ablauf dieser
Zeit wurde die Nitrozellulosemembran entnommen und über Nacht im Kühlschrank in
Blockpuffer gelegt. Am folgenden Tag wurde der Blockpuffer entfernt und die
Membran 3 x 10 min. unter leichtem Schwenken mit Waschpuffer gewaschen.
Material und Methoden
44
Anschliessend wurde der Blot mit einem monoklonalen Antikörper gegen MRP in
einer Verdünnung von 1 : 200 für 60 min inkubiert. Dann wurde der Blot mehrmals
mit Waschpuffer gewaschen, um überschüssige Antikörper zu entfernen.
Anschliessend wurden die Anti–Maus-Antikörper, die mit alkalischer Phosphatase
gekoppelt waren, in einer Verdünnung von 1 : 1000 zugegeben. Nach einer Stunde
wurde die Membran mehrmals mit Waschpuffer gewaschen und anschliessend
zweimal in Substratpuffer gewaschen. Es folgte die Zugabe des Substrates für die
Alkalische Phosphatase (Bromochloroindolylphosphat und Nitroblautetrazolium). Der
Blot wurde so lange entwickelt, bis der Hintergrund gerade noch nicht lila wurde.
Gestoppt wurde die Reaktion unter fliessendem Wasser. Nach Trocknung zwischen
zwei Filterpapieren wurde der Blot photografiert. Danach wurde der Blot in gleicher
Weise mit monoklonalen Antikörpern gegen das EF–Protein getestet und
anschliessend entwickelt und dokumentiert.
3.7 Hämolysin-NachweisHierfür wurde eine Modifikationen der Methode von FEDER et al. (1994) verwendet.
Dabei wurden die zu untersuchenden Sc. suis -Stämme wurden über Nacht auf
Trypsin-Soja-Agar bei 37°C kultiviert. Die Kolonien wurden mit eisgekühltem PBS-
Puffer abgeschwemmt, in eisgekühlte Eppendorfgefässe überführt und bei einer
Wellenlänge von 540 nm auf eine optische Dichte von 1,6 eingestellt. Nach
Inkubation der Bakteriensuspensionen für eine Stunde bei 40°C im Wasserbad
wurden die Bakterien-Suspensionen für 10 Minuten bei einer Temperatur von 4°C
abzentrifugiert (12000 x g). Der vorsichtig abgehobene Überstand wurde mittels
eines Nylonfilters mit einer Porenweite von 0,45 µm filtriert. Anschliessend wurde das
Filtrat bis zur Messung auf Eis aufbewahrt oder bei –70°C eingefroren.
Als Quelle für die zur Messung benötigten Erythrozyten wurde frisch gewonnenes
defibriniertes Hammelblut eingesetzt. Das Blut wurde bei 7°C und 3000 U/min
abzentrifugiert und so lange in 0,9 % kühler NaCl-Lösung resuspendiert, bis der
Überstand vollständig klar war. Anschliessend wurden die abzentrifugierten
Erythrozyten in einem Verhältnis von 1:100 mit 0,9 % kühler NaCl-Lösung verdünnt.
Anschliessend wurden je 100 µl der Erythrozytensupension pro Vertiefung einer 96-
well Rundboden-Mikrotiterplatte verteilt. Die verteilte Suspension wurde in einem
dreifachen Ansatz mit 100 µl des zuvor gewonnen Filtats versetzt und für zwei
Stunden bei 37°C und 6 % CO2 inkubiert. Anschliessend wurde die Mikrotiterplatte
Material und Methoden
45
für 10 Minuten mit dem Erythrozyten-Filtrat-Gemisch bei 4°C und 100xg zentrifugiert.
100 µl des Überstandes wurden in eine 96-well-Flachboden-Mikrotiterplatte
überführt. Anschliessend wurde mit PBS-Puffer eine geometrische Verdünnungsreihe
mit dem Faktor 2 in einem Volumen von 100 µl/Vertiefung hergestellt. Die
hämolytische Aktivität wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 410 nm
ermittelt (Dynatech ELISA-Reader). Als Referenzwert galt die hämolytische Aktivität
des Sc. suis-Hämolysin Referenz-Stammes P1/7 (T. Alexander, Universität
Cambridge, UK), aus dem das Suilysin-Gen isoliert und charakterisiert wurde
(SEGERS et al. 1998).
Mit Hilfe eines PC-gestützten ELISA-Programmes (erstellt von Herrn Dr. B. Franz,
Tierärztliche Hochschule Hannover) wurden aus den gemessenen Extinktionen
hämolytische Einheiten nach der Referenz-Standard-Methode berechnet.
Bei dieser Berechnung stellte die hämolytische Aktivität des Sc. suis –Hämolysin
Referenz-Stammes P1/7 den Referenzwert dar, welcher eine fiktive Aktivität von 100
hämolytischen Einheiten erhielt. Die Extinktion der hämolytischen Aktivität der zu
untersuchenden Stämme wurden mit der Extinktion des Referenzstammes verglichen
und damit eine zum Referenzstamm relative hämolytische Aktivität berechnet. Dabei
wurden zunächst von allen Werten einer Platte die Extinktionswerte des Leerwertes
subtrahiert. Anschliessend wurden die korrigierten Extinktionswerte sowie die
dazugehörigen Verdünnungsstufen des Überstandes dekadisch logarithmiert und die
Regressionsgerade berechnet. Aus dieser Regressionsgeraden wurde die Steigung
(as), der y-Achsenabschnitt (bs) und der Variationskoeffizient (VK) berechnet. Die
hämolytischen Einheiten der Überstände wurden in der jeweiligen Verdünnungsstufe
nach folgendem Algorithmus berechnet:
( )
−∗
∗=−
S
SP
P
abODlog
10
10VEinheitenheHämolytisc
Verdünnungp = Verdünnungsfaktor ProbeODp= Extinktion der Probebs= y-Achsenabschnitt der Referenzgeradenas= Steigung der Referenzgeraden
Der Mittelwert der errechneten hämolytischen Einheiten in den jeweiligen
Verdünnungsstufen aus dem linearen Bereich wurde als die hämolytische Aktivität
der entsprechenden Probe für die Auswertung verwendet. Dabei wurden die Stämme
mit weniger als 10 hämolytischen Einheiten als Hämolysin-negativ bezeichnet. Die
Material und Methoden
46
Stämme zwischen 10 und 80 hämolytische Einheiten wurden als zweifelhaft positiv,
Stämme mit über 80 hämolytischen Einheiten als Hämolysin-positiv bezeichnet.
3.8 Adhärenz-Untersuchungen
3.8.1 ZellkulturDie beiden verwendeten Zelllinien wurden in DMEM – Zellkultur-Medium bei 8% CO2
und 37 °C kultiviert. Die Epithelzellen wachsen adhärent auf der Oberfläche der
Kulturgefässe, so dass ein Wechsel des Zellkulturmediums leicht erfolgen kann. Alle
2-3 Tage wurde ein Mediumwechsel mit 10 – 15 ml DMEM pro Schale durchgeführt.
Nach Ausbildung eines Monolayer wurden die Zellen neu ausgesät. Dazu wurden die
Zellen nach Absaugen des Mediums mit 3 ml 37°C warmem Trypsin-EDTA für 5
Minuten bei 8% CO2 und 37°C inkubiert. Die Trypsin-EDTA-Lösung wurde durch
Zugabe von 10 ml DMEM ausverdünnt. Durch diese Behandlung war es möglich, die
Zellen mittels Kulturmedium von der Plastikoberfläche abzuspülen. Diese so
gewonnene Zellsuspension wurde auf mehrere neue Schalen mit frischem Medium
ausgesät und wie zuvor bei 8% CO2 und 37°C kultiviert.
Für die Konservierung wurden die Zellen, wie zuvor beschrieben, in Kultur
angezogen, bis sich ein Monolayer gebildet hatte. Anschliessend wurden sie mit
Trypsin geerntet (siehe oben) und für 5 Minuten bei 1000 x g abzentrifugiert. Das
entstandene Pellet wurde in eiskaltem Einfriermedium (Cell Culture Freezing
Medium, Fa. GIBCO) resuspendiert, umgehend in Cryoröhrchen aliquotiert und auf
4°C gekühlt. Nach Beendigung der Aliquotierung wurden die Zellen zunächst über
Nacht in einer geschlossenen Styropor-Box bei –80°C eingefroren und
anschliessend in flüssigen Stickstoff überführt.
3.8.2 Vorbereitung der Zellen für den AdhärenzversuchKurz vor der Ernte der Zellen wurden diese nach Entfernen des Mediums mit 3 ml
37°C warmem Trypsin-EDTA für 5 Minuten bei 8% CO2 und 37°C inkubiert. Nach
Ablösen der Zellen wurden die Zellen mit DMEM mit 10% FCS vorsichtig
resuspendiert und für 5 Minuten bei 1000 x g abzentrifugiert. Nach einer weiteren
Resuspendierung wurde die Zellzahl in einer Neubauer-Zählkammer ermittelt und die
Zellen anschliessend mittels warmem DMEM auf eine Konzentration von 2 x 105
Zellen/ml eingestellt.
Material und Methoden
47
Von dieser Suspension wurden in einer 24-well-Platte, in welcher zuvor je ein
Deckgläschen (Durchmesser = 10 mm) verbracht worden war, pro Vertiefung je 0,5
ml ausgesät und über Nacht bei 8% CO2 und 37°C bebrütet, bis sich ein konfluenter
Zellrasen gebildet hatte.
3.8.3 Vorbereitung der Bakterien für den AdhärenzversuchDie für den Adhärenz-Versuch ausgewählten Sc. suis -Stämme wurden über Nacht
auf Columbia-Blutplatten bei 37°C kultiviert. Anschliessend erfolgte jeweils eine
Anzüchtung mehrerer Einzelkolonien in 3 ml THB-Medium für 4 Stunden bei 37°C.
Diese Vorkultur wurde in einen Erlenmeyerkolben mit 30 ml THB-Medium überführt
und für 18 Stunden in einem Schüttel-Inkubator bei 37°C inkubiert. Diese
Bakteriensuspension wurde für 15 min. bei 3000 x g und 4°C abzentrifugiert, der
Überstand wurde abgekippt, sorgfältig in 5 ml eisgekühltem PBS-Puffer re-
suspendiert und erneut für 15 Minuten bei 3000 x g und 4°C abzentrifugiert. Dieser
Waschvorgang wurde ein weiteres Mal wiederholt. Nach einer weiteren
Resuspendierung des Pellets in PBS-Puffer wurde die Suspension auf eine
Transmission von 1,0 bei einer Wellenlänge von 660 nm verdünnt, was einer
Bakteriendichte von ca. 5 x 108 Bakterien/ml entsprach. Diese eingestellte
Bakteriensuspension wurde ein weiteres Mal für 15 Minuten bei 3000 x g und 4°C
abzentrifugiert, der Überstand wurde sorgfältig abpipettiert, das Bakterienpellet in 1,0
ml DMEM resuspendiert und bis zur Inkubation der Zellen auf Eis gehalten.
3.8.4 AdhärenzversuchDie vorbereiteten Epithelzellen wurden vor der Infektion zweimal mit DMEM ohne
jegliche Zusätze gewaschen. Dazu wurde zu Beginn das Medium abgesaugt und
durch 0,5 ml 37°C warmes DMEM ersetzt, vorsichtig geschwenkt und wieder
vollständig abgesaugt. Nach einer weiteren Waschung wurde das abgesaugte
Medium durch 0,5 ml der unmittelbar zuvor auf 37°C erwärmten Bakteriensuspension
ersetzt. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde bei 37°C und 8% CO2 wurden
die Vertiefungen dreimal mit je 1 ml PBS-Puffer gewaschen. Nach dem letzten
Waschschritt wurde der PBS-Puffer durch 1 ml 3,7% Formaldehyd in PBS-Puffer
ersetzt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die Zellen und die
adhärenten Bakterien zu fixieren. Nach Absaugen des Formaldehyd-Puffers wurden
die Zellen gefärbt. Als Färbelösung wurde Giemsa verwendet. Dabei wurde zuvor die
Material und Methoden
48
Giemsafarblösung mit PBS-Puffer in einem Verhältnis von 1:10 verdünnt. Dieser
verdünnte Farbstoff wurde auf die fixierten Zellen gegeben und für 30 Minuten auf
den Zellen belassen. Anschliessend wurde die Färbelösung abgesaugt und die
Vertiefung einmal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Glasplättchen wurden
vorsichtig aus den Vertiefungen entfernt und auf einen, mit einem Tropfen Moviol
(FA. MERCK) beschickten Objektträger mit der Zellschicht nach unten verbracht. Mit
leichtem Druck wurde das Moviol auf die ganze Fläche des Glasplättchen verteilt. Die
Ränder des Glasplättchen wurden dann mit durchsichtigem Nagellack versiegelt.
Die mikroskopische Untersuchung erfolgte in Hellfeld-Mikroskop (FA. LEICA) mit
einer 630 fachen Vergrösserung, die Dokumentation mit einer Digital-Kamera (FA.
LEICA).
3.9 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE)Bei dieser Methode wird intakte bakterielle Gesamt-DNA mit selten schneidenden
Enzymen in eine überschaubare und für eine epidemiologische Auswertung
genügende Anzahl von Fragmenten zerlegt, die dann in einer PFGE aufgetrennt
werden. Die so entstandenen Bandenmuster erlauben Verwandtschaftsvergleiche
zwischen den einzelnen Isolaten.
3.9.1 Präparation intakter Gesamt-DNA von Sc. suis
Die Präparation erfolgte mit Abweichungen den Angaben von OLSEN et al. (1984).
Die zur DNA-Extraktion ausgewählten Sc. suis-Stämme wurden auf Columbia-
Blutplatten über Nacht bei 37°C kultiviert. Anschliessend erfolgte jeweils eine
Anzüchtung mehrerer Einzelkolonien der Isolate in 3 ml THB-Medium für 4 Stunden
bei 37°C. Diese Vorkultur wurde in einen Erlenmeyerkolben mit 30 ml THB-Medium
überführt und für 18 Stunden in einem Schüttel-Inkubator bei 37°C inkubiert.
Danach wurden 5 ml der Bakterien-Suspension mit THB-Medium auf eine optische
Dichte von 0,3 (Wellenlänge von 576 nm) eingestellt. Diese Bakteriensuspension
wurde für 15 Minuten bei 3000 x g und 4°C abzentrifugiert, der Überstand abgekippt,
sorgfältig mit 5 ml eisgekühltem PettIV-Puffer resuspendiert und erneut für 15
Minuten bei 3000 x g und 4°C abzentrifugiert. Der Überstand wurde wiederum
dekantiert und die verbliebene Flüssigkeit sorgfältig mit der Pipette entfernt. Das
Bakterienpellet wurde in 0,5 ml PettIV-Puffer resuspendiert und im Wasserbad auf
37°C erwärmt. Zu dieser vorgewärmten Bakteriensuspension wurden 0,5 ml 1,2 %
Material und Methoden
49
Agarose (in H2O gelöst) hinzugegeben und gut vermischt. Dieses Bakterien-Agarose-
Gemisch wurde in Giessförmchen mit einem Volumen von 100 µl portioniert und bis
zum Erstarren der Blöckchen für 10 Minuten im Kühlschrank aufbewahrt.
In sterilen Polypropylenröhrchen wurden pro 5 Agaroseblöckchen jeweils 3 ml
Lyselösung (Lyse-Puffer + Lysozym, Mutanolysin und RNase) vorgelegt. Die
Blöckchen wurden für zwei Stunden bei 37°C in Schräglage in der Lyselösung
inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde die Lyselösung gegen 3 ml ESP-Lösung
ausgetauscht und über Nacht bei 56°C inkubiert.
Am folgenden Tag wurde die ESP-Lösung dekantiert, und die Blöckchen wurden mit
3 ml H2O für 15 Minuten bei Raumtemperatur sanft in der Waagerechten
geschwenkt. Nach Ersetzen des H2O durch je 2 ml TE-PMSF-Lösung schloss sich
eine 30minütige Inkubation bei Raumtemperatur mit konstantem sanftem
waagerechtem Schwenken an. Dieser Schritt wurde wiederholt, und im Anschluss
daran wurde statt der TE-PMSF-Lösung wieder H2O zugegeben und für 15 Minuten
bei Raumtemperatur und konstanten sanften waagerechten Schwenken gewaschen.
Zur Entfernung aller Zelltrümmer folgten drei jeweils 30minütige Waschschritte mit
3ml TE-Puffer, wobei die Röhrchen wiederum bei Raumtemperatur in der
Horizontalen geschwenkt wurden. Die nach diesen Spülungen mit jeweils 5 ml Te-
Puffer versetzten DNA-haltigen Agaroseblöckchen wurden über Nacht bei 4°C
gelagert.
Danach wurde jeweils ein dünnes Stückchen (ca. 0,5 mm dick) eines Agarose-
Blöckchens mit einem sterilen Skalpell abgeschnitten und mit einem Glashäkchen
zur Vorbereitung des Restriktionsverdaus in eine Äquilibrierungslösung, bestehend
aus 225 µl autoklaviertem bidestilierten Wasser und 25 µl zehnfach konzentriertem
Enzympuffer, verbracht. Die Äquilibrierungslösung wurde nach einstündiger In-
kubation bei Raumtemperatur abgesaugt, und auf jedes Gelstückchen wurden 50 µl
einer vorbereiteten Restriktionsenzym-Puffer-Lösung mit folgender
Zusammensetzung pipettiert:
Für den Restriktionsverdau mit SmaI:
5 µl 10 x Puffer A (Boehringer)
2 µl SmaI (10 U/µl) (Boehringer)
43 µl Aqua dest.
Material und Methoden
50
Für den Restriktionsverdau mit ApaI :
5 µl 10 x Puffer A (Boehringer)
2 µl ApaI (10 U/µl) (Boehringer)
43 µl Aqua dest.
Die Restriktionsverdaus wurden für je 4 Stunden bei 37°C durchgeführt.
3.9.2 Auftrennung der verdauten Gesamt–DNA von Sc. suis mittels PFGEDie Agaroseblöckchenstreifen, in denen die zuvor mittels Restriktionsverdau
geschnittene DNA fixiert war, wurden in die Geltaschen eines 0,8 % igen Agarose-
gels verbracht und die Geltaschen mit der gleichen Agarose, welche zum Giessen
der Blöckchen verwendet worden ist, luftblasenfrei verschlossen. Das Gel wurde in
die Elektrophorese-Kammer, die zuvor mit 3 l 0,5 x TBE-Puffer befüllt worden war,
gelegt und der Separierungsprozess nach vorher programmierten Bedingungen
gestartet. Die Temperatur, Spannung und der eingeschlossene Winkel wurden
folgendermassen gewählt:
Temperatur: 10°C
Spannung: 6 V/cm
Eingeschl. Winkel: 120°
Auftrennung von SmaI-Fragmenten: Pulsrahmen:
Block I: 2-5 Sekunden über 11 Stunden
Block II: 20-40 Sekunden über 13 Stunden
Auftrennung von ApaI-Fragmenten: Pulsrahmen:
Block I: 2-4 Sekunden für 8 Stunden
Block II: 7-12 Sekunden für 10 Stunden
Nach Beendigung des jeweiligen Elektrophoreselaufs wurde das Gel aus der
Kammer entfernt, drei Minuten in einer Ethidiumbromid-Lösung gefärbt und ca. 15
Minuten in Aqua bidest. entfernt. Danach wurde es unter UV-Beleuchtung
photografiert und mittels eines Geldokumentationssystems (BioRad MultiAnalyst)
dokumentiert.
Material und Methoden
51
3.9.3 Erstellung eines Größenmarkers für die PFGEAufgrund der ausgeprägten Grössenunterschiede der speziellen
Restriktionsfragmente, welche in der PFGE auftraten, waren kommerziell erhältliche
Standards als Grössenmarker nicht geeignet. Daher musste ein Grössenmarker
erstellt werden, mit welchem alle Fragmente, die in der PFGE bei Sc. suis auftraten,
bestimmt werden konnten. Dazu wurde die DNA des Staph. aureus-Stammes DSM
1104 wie bei der Präparation intakter Gesamt-DNA von Sc. suis für die Auftrennung
mittels der PFGE aufbereitet, wobei bei der Aufschliessung der Bakterienzellwand
statt des Mutanolysin Lysostaphin eingesetzt wurde. Anschliessend wurde die intakte
Staph. aureus-DNA mit dem Restriktionsenzym SmaI verdaut, und die entstandenen
Fragmente wurden mittels PFGE aufgetrennt. Als Grössenstandard zur Ermittlung
der Fragmentgrössen wurden eine λ-Phagen-„Ladder“ für den Bereich von 48,5 kBp
bis 776 kBp und ein 5-kBp-DNA-„Ladder“ für den Bereich von 5 kBp bis 40 kBp
verwendet.
Die Auftrennung der Fragmente erfolgte in einem 1 %igen Agarosegel
Temperatur: 10°C
Spannung: 6 V/cm
Eingeschl. Winkel: 12°
Auftrennung der SmaI-Fragmente: Pulsrahmen:
Block I: 2-5 Sekunden über 11 Stunden
Block II: 20-40 Sekunden über 13 Stunden
Nach Beendigung des Elektrophoreselaufs wurde das Gel aus der Kammer entfernt,
drei Minuten in einer Ethidiumbromid-Lösung gefärbt und ca. 15 Minuten in Aqua
bidest. gewaschen, ehe es unter UV-Beleuchtung fotografiert und mittels eines
Geldokumentationssystems (Bio-Rad MultiAnalyst) dokumentiert wurde.
3.10 Herstellung der Hämolysin-SondeDie Sonde wurde mittels PCR (Polymerasekettenreaktion) nach DNA-Isolierung
amplifiziert, isoliert und markiert.
3.10.1 DNA-ExtraktionDer zur DNA-Extraktion ausgewählte Sc. suis-Stamm (I9841/1 und D 282) wurde auf
Columbia-Blutplatten (FA. OXOID) über Nacht bei 37°C kultiviert. Aus dieser Platte
Material und Methoden
52
wurden mehrere Kolonien in 50 ml THB-Medium über Nacht bei 37°C kultiviert. Diese
Bakteriensuspension wurde mit THB-Medium 1:10 verdünnt. Die verdünnte
Suspension wurde bis zu einer optischen Dichte von 0,7 – 0,8 ( Wellenlänge: 660
nm) kultiviert. Zwei ml dieser Suspension wurden für 10 min. und 4°C bei 8000 x g
zentrifugiert, anschliessend dekantiert und getrocknet. Diese Pellets wurden in
4937,5 µl Muramidase-Puffer und 62,5 µl Mutanolysin (Stocklösung 13U/ml,1:80
Verdünnung) aufgenommen und für zwei Stunden bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert.
Danach wurde die Suspension wiederum für 10 min. und 4°C bei 8000 x g
zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet in 550 µl (275 µl
H2O und 275 µl 2xTEN – Lysozym-Lösung) für 30 Minuten bei 37°C im Wasserbad
resuspendiert.
Nach Zugabe von 15 µl 20 %igem SDS und 10 µl Proteinase K–Lösung
(Konzentration 20 mg/ml) wurde die Suspension vorsichtig mit der Hand gemischt,
um die intakten DNA-Stänge nicht durch Scherkräfte zu zerstören, und
anschliessend für eine Stunde bei 37°C im Wasserbad inkubiert.
Im Anschluss wurden 125 µl einer 4 M NaCl-Lösung zugegeben, vorsichtig gemischt
und danach 80 µl CTAB zugeführt. Dann wurde für 10 Minuten bei 65°C im
Wasserbad inkubiert. Nach der Zugabe von 780 µl Chloroform/ Isoamylalkohol (24:1)
wurde die Suspension vorsichtig gemischt, bis sie vollständig milchig-trüb erschien
und anschliessend für 5 Minuten bei Raumtemperatur bei 6000 x g zentrifugiert. Der
visköse Überstand wurde abgenommen und in ein neues Gefäss überführt. Dabei
musste darauf geachtet werden, dass keine Bestandteile aus der Interphase mit
überführt werden. Diesem Überstand wurden 780 µl eines Phenol/
Chlorophorm/Isoamylalkohol-Gemisch (25:24:1) zugeführt und vorsichtig gemischt.
Dieses Gemisch wurde vorsichtig in der Hand gekippt und anschliessend bei 6000 x
g für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde wiederum in ein neues Gefäss
überführt, 500 µl Isopropanol wurden zugeführt, vorsichtig gemischt, und
anschliessend wurde für 10 Minuten bei 6000 x g zentrifugiert.
Nach erneutem Abnehmen des Überstandes wurden 500 µl 80 % Ethanol zu-
gegeben, vorsichtig gemischt und anschliessend für 5 Minuten bei 6000 x g
zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand abpipettiert, verworfen
und das Pellet im Exikator getrocknet. Für die Aufbewahrung wurde das Pellet in 100
µl TE-Puffer gelöst und bei –20°C gelagert.
Material und Methoden
53
3.10.2 Amplifikation der Sonde mittels PCRBei einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) handelt es sich um eine Methode zur
Amplifizierung von spezifischen DNA-Fragmenten. Dadurch ist es möglich, selektiv
bestimmte DNA-Fragmente aus sehr geringen DNA-Mengen anzureichern (SAIKI et
al. 1985). Mit dieser Methode kann also schnell ein gezieltes DNA-Stück hergestellt
werden, welches später nach entsprechender Weiterverarbeitung zum Beispiel als
Gen-Sonde eingesetzt werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die PCR zur
Herstellung der Gensonde wie folgt durchgeführt:
Als Matrix-DNA diente die zuvor vom Sc suis Stamm I9841/1 extrahierte DNA. Es
wurden jeweils 50 µl-Ansätze gewählt und folgendermassen zusammengesetzt:
4 dNTPs je 10 nmol (f.c. 0,2 mM je dNTP)
10xPCR-Puffer 5 µl
Matrizen-DNA 5 µl (ca. 25 ng)
Primer I 50 pmol (f.c.1 µM)
Primer II 50 pmol (f.c.1 µM)
Taq-Polymerase 1 U (O,75 µl)
Aqua bidest ad 50 µl
Nach kurzem Anzentrifugieren wurde der Ansatz mit ca. 50 µl Mineralöl
überschichtet. Die Ansätze wurden in den Thermocycler gestellt und das folgende
Programm wurde gestartet:
1.) Initiale Denaturierung der DNA 2 min 94°C
2.) Amplifikationszyklen (insgesamt 35 Zyklen): 1 min 90°C
2 min 60°C
3 min 72°C
3.) Abschliessende Extension 8 min 72°C
Verwendete Primer:
Primer I: 5‘ – GGG AAT TCC ATA TGA GAA AAA GTT CGC ACT TGA TTT T - 3‘
Primer II: 5‘ – CGG GAT CCT TAC TCT ATC ACC TCA TCC GCA TAC T – 3‘
Nach Beendigung der Extension wurde das PCR-Produkt auf 4°C abgekühlt. Das
Ergebnis der Reaktion wurde auf Agarosegelen überprüft.
3.10.2.1 Auftrennung des PCR-Produktes mittels GelelektrophoreseZur Überprüfung des PCR-Produktes wurden diese mittels Gelelektrophorese
aufgetrennt und anschliessend angefärbt. Dazu wurde ein 0,8 %iges Agarosegel mit
Material und Methoden
54
0,5 % TBE-Puffer hergestellt. Hierzu wurden 0,24 g einer „Multi-Purpose-Agarose“
mit 30 ml 0,5 % TBE-Puffer kurz aufgekocht, bis sich die Agarose gelöst hatte.
Anschliessend wurde kurz vor Erhärten der Agarose diese mit 0,5 µg
Ethidiumbromid/ml Puffer versehen, gut gemischt, in den Gelschlitten der
Elektrophorese-Kammer gegossen und der Kamm zur Erstellung von Geltaschen in
die noch flüssige Agarose gesteckt. Nach Erkalten der Agarose wurde der Kamm
entfernt und die Kammer mit dem Laufpuffer beschickt, bis das Gel vollständig
bedeckt war. In die erste Tasche wurden als Grössen-Marker 5 µl mit Hind III
verdaute λ-DNA-„Ladder“ gegeben, in die restlichen Taschen das PCR-Produkt.
Sämtliche Proben inklusive des Markers wurden zuvor in einem Verhältnis von 5:1
mit einem Farbstoff (Bromphenolblau) versehen, welcher zur Beschwerung der
Proben und zur Sichtbarmachung der Lauffront der DNA im Gel benutzt wurde. Die
Lauffront des Farbstoffes entspricht etwa der Lauffront eines doppelsträngigen DNA-
Fragmentes von 0,5 kBp.
Der Lauf erfolgte unter einer anfänglichen Spannung von 25 Volt die auf 50 Volt
erhöht wurde, nachdem die Front des Probenfarbstoffes aus den Geltaschen ins Gel
gewandert war. Nach etwa 75 Minuten wurde die Auftrennung gestoppt, und die im
Gel aufgetrennten Fragmente wurden mit UV-Licht (254 nm) sichtbar gemacht und
mittels einer Polaroid-Kamera bzw. mit einem Geldokumentationssystem ( Bio-Rad
MultiAnalyst-System) photografiert.
3.10.2.2 Isolierung des PCR-Produktes aus dem Agarose-GelNach der elektrophoretischen Auftrennung der DNA-Fragmente, die zur Herstellung
der Hämolysinsonde verwendet werden sollten, wurden diese mittels GeneClean II
Kit aus dem Gel gereinigt. Dabei wurde mit einer sterilen Skalpell-Klinge das
Gelblöckchen mit dem zu isolierenden DNA-Fragment ausgeschnitten und in
viereinhalbfachem Volumen NaJ-Lösung und ½ Volumen „TBE-Modifier“ bei 55°C
geschmolzen. Nach der Zugabe von Glasmilch (5 µl je 5 µg DNA) erfolgte die
Bindung der DNA an die Glasmatrix für mindestens 5 Minuten bei leichten
Schwenkbewegungen. Die so gebundene DNA wurde anschliessend für 10 sec. bei
12000 x g sedimentiert und dreimal mit 500 µl eisgekühlter „New-Wash-Lösung“
gewaschen. Der Überstand wurde nach dem letzten Waschschritt sorgfältig
abpipettiert. Die DNA wurde mit 15-20 µl A. bidest von den Glaspartikeln abgelöst.
Nach Abzentrifugation der Glasfragmente wurde das die DNA-Fragmente
Material und Methoden
55
enthaltende Eluat in ein neues Eppendorf-Reagenzgefäss überführt und bis zur
weiteren Verwendung bei –20°C aufbewahrt.
3.11 Southern-Hybridisierung
3.11.1 Southern-BlottingDer DNA-Transfer aus Agarose-Gelen auf eine Nylonmembran erfolgte als
Kapillarblot. Zu Beginn wurde das Agarose-Gel mit zur Markierung aufgelegtem
Lineal unter UV-Licht photografiert, um nach der Hybridisierung die entstandenen
Markierungen den in der Elektrophorese entstandenen Banden zuordnen zu können.
Anschliessend wurde das Gel zweimal jeweils für 20 Minuten in 0,25 M HCl
gewaschen. Nach zweimaligem Spülen in A. bidest folgten zwei Waschungen für je
15 Minuten in einer Denaturierungs-Lösung, bestehend aus 1,5 M NaCl und 0,5 M
NaOH, um eine alkalische Denaturierung der DNA zu erreichen. Der Kapillarblot-
Aufbau wurde nach den Angaben von SAMBROOK et al. (1989) durchgeführt. Als
Transferpuffer diente 20 x SSC-Lösung. Die Übertragung der DNA erfolgt bei
Raumtemperatur über Nacht. Am darauffolgenden Tag wurden die linke obere Ecke
und die Probentaschen des Gels auf der Membran markiert. Nach der Trennung der
Membran von dem Gel wurde die Membran für 5 Minuten mit 0,5 M Tris-HCl (pH 7,0)
neutralisiert und anschliessend für 5 Minuten in 2 x SSC-Lösung entsalzt. Die auf die
Membran „geblottete“ DNA wurde schliesslich für zwei Stunden bei 80°C auf der
Membran fixiert.
3.11.2 Radioaktive Markierung der Sonde mit 32PhosphorDie radioaktive Markierung der Sonde erfolgte mittels einer Nick-Translation (Fa.
GIBCO Life Technologies, Karlsruhe). Etwa 1 µg der DNA wurden in 5 µl der Lösung
A2 des Nick-Translations-Kits (dNTP-dCTP), 5 µl α32P dCTP, 5 µl Polymerase des
Nick-Translations-Kit (DNA/Polymerase DNase I) aufgenommen und bis zu einem
Gesamtvolumen von 50 µl mit H2O aufgefüllt, gemischt und bei 15°C für 90 Minuten
inkubiert. Der Reaktionsstopp erfolgte mittels Zugabe von 2 µl 0,5 M EDTA pH 8,0.
Die entstandenen DNA-Stränge wurden mit 50 µl Phenol aus dem Reaktionsgemisch
extrahiert.
Material und Methoden
56
Um die freien Nukleotide abzutrennen, wurde der Ansatz anschliessend über eine
Sephadex G 50 Säule (NickTM Column, PHARMACIA) aufgereinigt. Zunächst wurde
die Säule mit 3 ml TE-Puffer äquilibriert, im Anschluss wurde die radioaktive Probe
aufgetragen. Nach einer Waschung mit 400 µl TE-Puffer erfolgte die Elution der
Sonde mit 450 µl TE-Puffer. Zur Überprüfung der erfolgten Nick-Translation wurde
die Intensität der Radioaktivität der Sonde durch die Messung von 2 µl-Sonde im β-
Szintillationszähler ermittelt.
3.11.3 Hybridisierung und SignaldetektionBei der Hybridisierung erfolgt über spezifische Basenpaarung die Ausbildung eines
Hybridmoleküls. Dieses besteht aus einer markierter Gensonde (in diesem Falle der
Hämolysin-Sonde) und dem nachzuweisenden Fragment der Ziel-DNA.
Zunächst wurde die Membran mit der Auftragungsseite nach oben in eine
Hybridisierungsflasche verbracht und anschliessend in einem Volumen von 1 ml
Hybridisierungspuffer pro 10 cm2 Filterfläche für 2-3 Stunden bei 65°C prähybridisiert.
Der Prähybridisierungpuffer wurde durch frischen Hybridisierungspuffer mit zuvor
denaturierter SS-DNA und denaturierter radioaktiv markierter Sonde (ca. 2,5–3 x 106
cpm/ml) ersetzt. Die SS-DNA und die DNA-Sonde wurden zuvor für 15 Minuten bei
95°C im Thermoblock denaturiert.
Die Hybridisierung erfolgte in einem Volumen von 0,3 ml des mit der Sonde
ergänzten Hybridisierungspuffers pro 10 cm2 Filterfläche über Nacht bei 65°C und
Rotation (ca. 10 x rpm). Nach der erfolgten Hybridisierung wurde der radioaktive
Puffer abgenommen und der Filter zur Entfernung der unspezifisch gebundener
DNA-Moleküle in 50 ml Waschlösung I für 15 Minuten bei 65°C gewaschen.
Anschliessend wurde der Filter dreimal mit je 50 ml Waschlösung II für jeweils 15
Minuten bei 65°C und einmal kurzzeitig mit 2 x SSC bei Raumtemperatur gewaschen
und nach Abtropfen in Frischhaltefolie eingewickelt.
Die Darstellung der hybridisierten Banden erfolgte mittels Autoradiografie auf einem
Röntgenfilm mit Verstärkerfolie bei –70°C.
Material und Methoden
57
3.12 Statistische Auswertung
3.12.1 Logistische RegressionRegressionsmodelle werden verwendet, um den Zusammenhang zwischen einer
Einflussvariablen und einer Zielvariablen in einer mathematischen Gleichung
darstellen zu können (KREIENBROCK u. SCHACH, 1997). Dieser Gleichungs-
zusammenhang sollte für die gesamte Population der Grundgesamtheit seine
Gültigkeit haben. Statistische Modelle zur Beschreibung einer Ursache-Wirkung-
Beziehung haben die allgemeine Form:
Y = Funktion (X(1),X(2),...,X(m))
Hierbei bezeichnet Y die Zielvariable, die durch m Einflussvariablen (X(1),X(2),...,X(m))
und einer spezifizierenden Funktion beeinflusst wird. Bei der Logistischen
Regression wird nicht mehr direkt die Zielvariable, sondern die Wahrscheinlichkeit,
dass die Zielvariable eine gewisse Ausprägung annimmt, modelliert. Da die
Wahrscheinlichkeit einen Wert zwischen Null und Eins darstellt, muss somit auch die
Funktion der Einflussvariablen zwischen Null und Eins beschränkt sein. Dies führt bei
der Logistischen Regression zu folgender Modellierung der Wahrscheinlichkeit unter
der Bedingung des Vorliegens der Einflussvariablen X(1),X(2),...,X(m)
( ) ( )( ) ( )( )
( ) ( )( )mm
11
mm
11
m1
bX...bXaexp1bX...bXaexp
)X,...,X1Y(P++++
+++==
Die in diesem Modell spezifizierten Parameter bi können in sogenannte Odds Ratios
überführt werden.
3.12.2 Odds RatioDas Odds Ratio ergibt sich aus dem Begriff der Chance (KREIENBROCK u.
SCHACH, 1997). Allgemein wird das Odds der Wahrscheinlichkeit P ausgedrückt als
( )P1
PPOdds−
=
Material und Methoden
58
d. h. als Wahrscheinlichkeit zur Gegenwahrscheinlichkeit. Dies wird im
Umgangssprachlichen auch als Chance bezeichnet. Betrachtet man nun das Odds
unter einer Bedingung, dass eine Einflussvariable auftritt bzw. nicht auftritt, so ergibt
sich hieraus als Chancenverhältnis das Odds Ratio (OR):
))0X1Y(P(Odds))1X1Y(P(Odds
OR====
=
Hierbei ist )1X1Y(P == die Wahrscheinlichkeit, dass ein Ereignis auftritt unter der
Bedingung, dass eine Einflussvariable x auftritt. Das Odds Ratio ist ein Parameter,
der Werte zwischen Null und ∞ annehmen kann. Ist OR = 1, so ist die Chance eines
Eintritts eines Ereignisses unter Einflussvariable und Nicht-Einflussvariable gleich,
und man unterstellt keinen Einfluss auf das Ereignis. Wird OR > 1, so ist die Chance
eines Eintritts eines Ereignisses unter der Einflussvariablen grösser als unter Nicht-
Einflussvariablen.
Das Odds Ratio wurde in dieser Arbeit dazu verwendet, die Chance auszudrücken,
wie gross die Wahrscheinlichkeit ist, hochvirulente Isolate in Hinblick auf
phänotypische und genotypische Eigenschaften zu erkennen.
3.12.3 Fragmentmuster und Dendrogramm-ErstellungDurch den Vergleich der Grösse und der Anzahl der bei der PFGE entstandenen
DNA-Fragmentmuster können genetische Ähnlichkeiten der verwendeten Isolate
abgeschätzt werden (RÖMLING et al. 1992).
Die Grössen der bei der PFGE entstandenen DNA-Fragmente wurden mittels eines
Computers und der Software MULTI ANALYST (BioRAD) ermittelt. Diese Daten
wurden mit dem Tabellenkalkulationsprogramm Microsoft Excel (FA. MICROSOFT)
grafisch dargestellt.
Um eine Schätzung vornehmen zu können, muss eine ausreichend grosse Anzahl
von sichtbaren Fragmenten vorhanden sein (EL-ADHAMI et al. 1991).
Durch die Standardisierung der Laufbedingungen, den Einsatz eines Längen-
standards sowie der dreimaligen Wiederholung wurde der Vergleich von Gelen
unterschiedlicher Läufe ermöglicht.
Um Fehler bei der Erfassung der Fragmente zu verhindern, wurden die Fragmente
unter Sicht ausgewertet und digital dargestellt. Die Dendrogramme zur Darstellung
von Ähnlichkeiten wurden mit der Software GEL-COMPAR (HEROLAB) erstellt.
Material und Methoden
59
Dabei beinhaltet die Dendrogramm-Erstellung (“Clustering“) zwei Schritte (siehe
Punkt 2.12.3.1 und 2.12.3.2).
3.12.3.1 Ähnlichkeitskalkulation zwischen möglichen Paaren der IsolateDie Kalkulation der Ähnlichkeitsmatrix basiert auf dem von DICE (1945)
beschriebenen Ähnlichkeitsmass Fxy:
yx
xyxy nn
n2F
+=
nxy = Anzahl der Banden bzw. Fragmente, die in beiden Mustern gleich istnx = Anzahl der Banden bzw. Fragmente in der Spur von Isolat xny = Anzahl der Banden bzw. Fragmente in der Spur von Isolat y
Hierbei werden Übereinstimmungen zwischen den Anordnungen der Werte kalkuliert.
Diese Ähnlichkeitsmatrix sowie die nachfolgende Clusteranalyse nach dem
Verfahren der „Avarage Linkage Between Groups-Methode“ wurden mit Hilfe eines
Computers und der Software Gel-Compar (HEROLAB) durchgeführt
3.12.3.2 Cluster-Analyse der Matrix ähnlicher Werte.Die Clusteranalyse wurde mittels des Verfahrens UPGMA („Unweighted Pair Group
Methode using Arithmetic Average“) durchgeführt. Dabei werden die arithmetischen
Mittelwerte der Ähnlichkeit eines neuen Stammes oder Clusters mit einem bereits
bestehenden Cluster verglichen, wobei alle Partner gleich gewichtet werden. Die
Clusterung erfolgt agglomerativ, hierarchisch und nicht überlappend
(HESSELBARTH u. SCHWARZ, 1995).
Ergebnisse
60
4 ErgebnisseIm folgenden Kapitel wurde eine Einteilung der Isolate hinsichtlich ihrer Herkunft,
potentieller Virulenzfaktoren und ihres Genotyps anhand der zuvor in Kapitel 3
beschriebenen Methoden durchgeführt.
Bei den Isolaten wurde aufgrund ihrer Herkunft eine Einteilung in 4 Gruppen
vorgenommen. So wurden die Meningitis- und Septikämie-Isolate, da sie als
hochvirulent anzusehen sind, in eine Gruppe zusammengefasst. Neben der Gruppe
der Pneumonieerrreger und der Gruppe mit Isolaten aus Pneumonie-
Mischinfektionen, wurde die Gruppe der „Sonstigen“ definiert, in der die Isolate,
welche aus gesunden Schweinen mittels Nasen- oder Zervixtupferprobe isoliert
werden konnten, zusammengefasst wurden.
Hinsichtlich der Serotypen wurden die Serotypen, die nur selten nachgewiesen
werden konnten oder Isolate, die keinem Serotyp zuzuordnen waren, in die Gruppe
der sonstigen Serotypen zusammengefasst.
Im folgenden werden Ergebnisse als signifikant eingestuft, wenn der P-Wert < 0,01
war. (siehe 4.8).
4.1 Phänotypische Charakterisierung
4.1.1 SerotypisierungDer Serotyp wurde mit der Latex-Agglutination nach VECHT et al. (1985) ermittelt.
Die Tabelle 9 führt detailliert die Serotypen der verwendeten Isolate auf. Es wurde
festgestellt, dass die Serotypen 2 und 9 am häufigsten auftraten (45 von 99 Isolaten).
Ein Grossteil der Isolate, welche aus septikämischen Krankheitsbildern (Meningitis,
Septikämie) stammten, konnte den Serotypen 2 und 9 zugeordnet werden (31 von 45
Isolaten). Die Abb. 2 zeigt eine Darstellung, in der die Beziehungen in Prozent
ausgedrückt sind. Dabei wird die Zuordnung der Serotypen 2 und 9 zu
Meningitiserregern deutlich. Auffallend war auch die Zuordnung der Serotypen ½, 3,
4, 5 und 7 zu den Gruppen der Pneumonie-Erreger und Pneumonie-
Mischinfektionen.
Ergebnisse
61
Tabelle 9: Beziehung zwischen Serotyp und Herkunft der Sc. suis Isolate.
HerkunftSerotyp
Meningitis Septikämie PneumoniePneumonie-
MischinfektionSonstige
1 3 1 0 0 1
½ 2 0 4 1 1
2 17 4 2 1 1
3 1 0 3 5 0
4 1 0 2 2 1
5 1 1 1 4 0
7 1 2 2 3 0
8 0 0 0 0 1
9 9 3 1 6 1
12 1 0 0 0 0
15 0 0 0 0 1
16 0 0 1 0 0
25 0 0 0 1 0
Poly 0 0 0 1 1
Auto 1 0 0 0 3
Gesamt 37 11 16 24 11
Poly = Polyagglutination (d.h. nicht typisierbar)Auto = Autoagglutination (d.h. nicht typisierbar)
Ergebnisse
ST = SerotypS = sonstige
Abb. 2: B
Grafikteil z
ST
S
e
e
S
62
enerotypen
ziehungen zwischen dem Serotyp und der Herkunft der Isolate. Der
igt die Werte in Prozent, der Tabellenteil die absoluten Zahlen.
Ergebnisse
63
4.1.2 Expression von MRP/EFDie Expression des Muramidase–Released-Proteins (MRP) und des Extrazellulär
Faktor–Proteins (EF) bei den Sc. suis–Isolaten wurde mittels SDS-Gelelektrophorese
und Immunoblot Analyse nachgewiesen. Diese Arbeiten wurden mit freundlicher
Unterstützung durch H. Wisselink und H. Smith in Lelystad/ Holland durchgeführt.
Der MRP-Nachweis wurde mit den Protoplasten-Überständen durchgeführt, der EF-
Nachweis mit den Kulturüberständen. Die Abb. 4 bis 9 auf den folgenden Seiten
zeigen repräsentative Blots von Protoplasten- und Kulturüberständen von Sc. suis.
Neben dem MRP und EF wurden dabei auch die unterschiedlichen Varianten dieser
beiden Proteine nachgewiesen. So konnte neben dem MRP mit 136 kDa das
höhermolekulare MRP* und das niedermolekulare MRPS nachgewiesen werden.
Beim EF mit 110 kDa konnte die höhermolekulare Variante EF* nachgewiesen
werden.
Das MRP bzw. dessen Varianten konnten bei 52 Isolaten nachgewiesen werden
(MRP+). Bei 32 Isolaten konnte kein MRP nachgewiesen werden (MRP-). Bei 15
Isolaten wurde das EF nachgewiesen (EF+), wobei alle EF+ Isolate auch das MRP
exprimierten (MRP+/EF+) (Tabelle 11).
Tabelle 11: Auftreten der verschiedenen MRP/EF Phänotypen bei den untersuchten
Sc. suis – Isolaten
Phänotyp AnzahlMRP+/EF+ 15 (15,2)
MRP+/EF- 52 (52,5)
MRP-/EF- 32 (32,3)
( ) = Angaben in Prozent
Ergebnisse
64
E
EF*
EF
MRPMRP*MRPS
MRPMRP*MRPS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Abb... : Nachweis von MRP und EF mittels Immunoblot
Western-Blot-Analyse mit monoklonalen Antikörpern gegen MRP und EF vonÜberständen von Sc-suis-Stämmen nach SDS-PAGE mit 6% Polyacrylamid. Diegebundenen Antikörper wurden mit Anti -Maus-Globulinen, gemacht. Als Kontroll -Stamm diente der Sc.suis-Serotyp 2 Stamm Vecht 4005 (Spur 4, 8) In den übrigen Spurenbefinden sich die Stämme A5141/1/96 (Spur1); A2155/2/97 (2); A3973/4/98 (3);A6165/2/97 (5); A2195/1/97(6); A3313/1/98 (7); A496/98 (9); A6169/1/96 (10)
Abb...::Nachweis von MRP mittels Immunoblooting
Western-Blot-Analyse mit monoklonalen Antikörpern gegen MRP von Überständen vonSc-suis-Stämmen nach SDS-PAGE. Die gebundenen Antikörper wurden mit Anti-Maus-Globulinen sichtbar gemacht. Als Kontroll -Stamm diente der Sc.suis- Serotyp 2 StammVecht 4005 (Spur 4,8) In den übrigen Spuren befinden sich die Stämme A5141/196 (Spur1); A2155/2/97 (2); A3973/4/98 (3); A6165/2/97 (5); A2195/1/97(6); A3313/1/98 (7);A496/98 (9); A6169/1/96 (10)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Abb 3: Nachweis von MRP mittels Immunoblot-AnalyseSc. suis -Isolate wurden fraktioniert und nach Auftrennung in der SDS-PAGE im Immunoblotmit mAk gegen MRP getestet. Als Kontrollstamm diente der Sc. suis -Serotyp 2 Stamm Vecht4005 (Spur 4,8). Der abgebildete Blot zeigt die Isolate A5141/1/96 (Spur 1), A2155/2/97 (2), A3973/4/98 (3), A 6165/1/97 (5), A2195/1/97 (6), A 3313/1/98 (7), A 496/98 (9), A6169/1/96(10). Neben dem MRP (136 kDa) wurden auch die höhermolekulare (MRP*) undniedermolekulare (MRPs) Variante des MRP markiert.
Abb 4: Nachweis von MRP und EF mittels Immunoblot-AnalyseSc. suis -Isolate wurden fraktioniert und nach Auftrennung in der SDS-PAGE im Immunoblotmit mAk gegen MRP und EF getestet. Als Kontrollstamm diente der Sc. suis -Serotyp 2Stamm Vecht 4005 (Spur 4,8). Der abgebildete Blot zeigt die Isolate A5141/1/96 (Spur 1),A2155/2/97 (2), A 3973/4/98 (3), A 6165/1/97 (5), A2195/1/97 (6), A 3313/1/98 (7), A 496/98(9), A6169/1/96 (10) Neben dem MRP (136 kDa) und dem EF(110 kDa) wurden auch diehöhermolekulare (MRP*) und niedermolekulare (MRPs) Varianten des MRP und diehöhermolekulare (EF*) Variante des EF markiert.
Ergebnisse
65
MRPSMRP MRP*
MRP*MRP MRPS
EF
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Abb 1: Western-Blot-Analyse mit monoklonalen Antikörpern gegen MRP vonÜberständen von Sc-suis-Stämmen nach SDS-PAGE mit 6% Polyacrylamid. Diegebundenen Antikörper wurden mit einer alkalischen Phosphatase, welche mit Anti-Maus-Globulinen konjugiert waren, in einer Verdünnung von 1:1000 sichtbar gemacht.Als Kontroll-Stamm diente der Sc.suis-Serotyp 2 Stamm Vecht 4005 (1,4,9) In denübrigen Bahnen befinden sich die Stämme I4627d (=2); I4627c (=3); A2321/1/97 (=5);A5505/93 (=6); A3863/6/97(=7); A5141/1/96 (=8); A5262/1/96 (=10)
Abb 2: Western-Blot-Analyse mit monoklonalen Antikörpern gegen MRP und EF vonÜberständen von Sc-suis-Stämmen nach SDS-PAGE mit 6% Polyacrylamid. Diegebundenen Antikörper wurden mit einer alkalischen Phosphatase, welche mit Anti-Maus-Globulinen konjugiert waren, in einer Verdünnung von 1:1000 sichtbar gemacht.Als Kontroll-Stamm diente der Sc.suis-Serotyp 2 Stamm Vecht 4005 (1,4,9) In denübrigen Bahnen befinden sich die Stämme I4627d (=2); I4627c (=3); A2321/1/97 (=5);A5505/93 (=6); A3863/6/97(=7); A5141/1/96 (=8); A5262/1/96 (=10)
Abb.5: Nachweis von MRP mittels Immunoblot-AnalyseSc. suis -Isolate wurden fraktioniert und nach Auftrennung in der SDS-PAGE im Immunoblotmit mAk gegen MRP getestet. Als Kontroll-Stamm diente der Sc. suis -Serotyp 2 StammVecht 4005 (Spuren 1,4,9). Der abgebildete Blot zeigt die Isolate I4627d (Spur 2), I4627c (3),A2321/1/97 (5), A5505/93 (6), A3863/6/97 (7), A5141/1/96 (8), A5262/1/96 (10). Neben demMRP (136 kDa) wurden auch die höhermolekulare (MRP*) und niedermolekulare (MRPs)Varianten des MRP markiert.
Abb.6: Nachweis von MRP und EF mittels Immunoblot-AnalyseSc. suis –Isolate wurden fraktioniert und nach Auftrennung in der SDS-PAGE im Immunoblotmit mAk gegen MRP und EF getestet. Als Kontroll-Stamm diente der Sc. suis -Serotyp 2Stamm Vecht 4005 (Spuren 1,4,9). Der abgebildete Blot zeigt die Isolate I4627d (Spur2),I4627c (3), A2321/1/97 (5), A5505/93 (6), A3863/6/97 (7), A5141/1/96 (8), A5262/1/96 (10).Neben dem MRP (136 kDa) wurden auch die höhermolekulare (MRP*) und niedermolekulare(MRPs) Varianten des MRP markiert.
Ergebnisse
Abb ..: Nachweis von EF mittels Immunoblotting
Western-Blot-Analyse mit monoklonalen Antikörpern gegen EF vonÜberständen von Sc-suis-Stämmen nach SDS-PAGE. Als Kontroll-Stammdient der Sc.suis-Serotyp 2 Stamm Vecht 4005 (2,8) In den übrigenBahnen befinden sich die Stämme A3313/3/98 (=1); A6/3/94 (=3);DSM9682 (=4); I9841/1 (=5); DSM9684 (=6); I9841/2 (=7); AA3551/1/97 (=9); A5439/2/96 (=10)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
EF
EF*
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
EF*
EF
MRPMRPS
Abb...:
Abb.2
Abb 7: Nachweis von EF mittels Immunoblot-AnalyseSc. suis -Isolate wurden fraktioniert und nach Auftrennung in der SDS-PAGE im Immunoblotmit mAk gegen EF getestet.. Als Kontroll-Stamm diente der Sc. suis -Serotyp 2 Stamm Vecht4005 (2,8). Der abgebildete Blot zeigt die Isolate A3313/3/98 (Spur1); A6/3/97 (3); DSM9682(4); I9841/1 (5); DSM9684 (6); I9841/2 (7); A3551/1/97 (9); A5439/2/96 (10). Neben dem EF(110 kDa) wurde auch die höhermolekulare (EF*) Variante des EF markiert.
Abb 2:Nachweis von MRP und EF mittels Immunoblotting
Western-Blot-Analyse mit monoklonalen Antikörpern gegen MRP und EFvon Überständen von Sc-suis-Stämmen nach SDS-PAGE. Als Kontroll-Stamm diente der Sc.suis-Serotyp 2 Stamm Vecht 4005 (2,8) In den übrigenBahnen befanden sich die Stämme A3313/3/98 (=1); A6/3/94 (=3);DSM9682 (=4); I9841/1 (=5); DSM9684 (=6); I9841/2 (=7); A A3551/1/97(=9); A5439/2/96 (=10)
Abb.8: Nachweis von MRP und EF mittels Immunoblot-AnalyseSc. suis -Isolate wurden fraktioniert und nach Auftrennung in der SDS-PAGE im Immunoblotmit mAk gegen MRP und EF getestet. Als Kontroll-Stamm diente der Sc. suis -Serotyp 2Stamm Vecht 4005 (2,8). Der abgebildete Blot zeigt die Isolate A3313/3/98 (Spur1), A6/3/97(3), DSM9682 (4), I9841/1 (5), DSM9684 (6), I9841/2 (7), A3551/1/97 (9), A5439/2/96 (10).Neben dem MRP (136 kDa) und dem EF (110 kDa) wurden auch die höhermolekulare(MRP*) und niedermolekulare (MRPs) Varianten des MRP und die höhermolekulare (EF*)Variante des EF markiert.
66
Ergebnisse
Der Vergleich der Expression von MRP und EF der Isolate mit deren Herkunft zeigte,
dass 80% der MRP+/EF+Isolate von Tieren mit Meningitis stammten, während kein
einziges MRP+/EF+ Isolat von Pneumonie-Mischinfektionen oder von klinisch
unauffälligen Tieren isoliert werden konnte. Der Vergleich der Expression der
MRP+/EF- Isolate hinsichtlich ihrer Herkunft zeigte, dass 50% der Pneumonie-
Erregern diesem Phänotyp an gehören. Bei den Isolaten aus Pneumonie-
Mischinfektionen waren 54 % phänotypisch MRP+/EF- (Abb.9).
Abb.9: Bezi
Die Ergebn
relativen An
im Vergleich
0%
20%
40%
60%
80%
100%
M e
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Ante
il in
% v
on N
N = 48
ehung zwische
isse wurden i
teile der unters
mit der Gesam
n i n g i t i s P n
MRP+ EF+
N = 16
n dem MRP/EF
n Prozent der
chiedlichen MR
tpopulation zu
e u m o n i e P n
MR
N = 24
67
-Phänotyp und
jeweiligen G
P/EF-Express
verdeutlichen.
e u . - M i s ch.
S
P+ EF-
N = 11
der Herkunft d
ruppe ausgedr
ion in der jewe
o n s t i g e
MRP- E
N = 99
er Isolate.
ückt, um die
iligen Gruppe
G e s a m t
F-
Ergebnisse
68
4.1.3 Expression von HämolysinDer Hämolysin-Nachweis wurde mit Modifikationen die Methode nach FEDER et al.
(1994) durchgeführt. Dabei wurden die ermittelten Werte im Verhältnis zum
Hämolysin-Referenzstamm P1/7 ausgedrückt.
Bei 50 Isolaten wurde keine hämolytische Aktivität nachgewiesen. 22 Isolaten
zeigten eine zweifelhafte Hämolysin-Expression, dass heisst, die gemessenen Werte
lagen im Bereich von 10 bis 80 hämolytischen Einheiten. Eine positive Hämolysin-
Expression mit über 80 hämolytischen Einheiten zeigten 27 Isolate (Tab.10).
Tabelle 10: Häufigkeit der Hämolysin-Expression bei den untersuchten Isolaten
Hämolysin-Expression Anzahl der Isolatenegativ 50 (50,5)
zweifelhaft 22 (22,2)
positiv 27 (27,3)
( ) = Angaben in Prozent
Bei dem Verteilung der Sc. suis–Isolate in Gruppen aufgrund ihrer Herkunft zeigte
sich, dass die Hämolysin-positiven Isolate vor allem zur Gruppe der Meningitis-
Isolate und die Hämolysin-negativen Isolate vor allem zur Gruppe der Pneumonie
und Pneumonie-Mischinfektionen gehörten (Abb. 10). So waren in der Gruppe der
hochvirulenten Isolate 87,5 % aller Hämolysin-positiver Isolate aufzufinden. Der
Anteil der Hämolysin-negativen Isolate in der Gruppe der Pneumonie-Erreger lag bei
68,7 %. In der Gruppe der Pneumonie-Mischinfektionen waren 58 % der zu dieser
Gruppierung gehörenden Isolate Hämolysin-negativ. Nur 6,3 % der Pneumonie-
Erreger und 4,2 % der Isolate aus Pneumonie-Mischinfektionen waren Hämolysin-
positiv (Abb. 10).
Ergebnisse
69
Abb 10: Beziehungen zwischen der Herkunft und der Hämoly
suis Isolate. Der Grafikteil zeigt die Werte in Prozent, der T
Zahlen.
= Hämolysin-positiv = Hämolysin-zweifelhaft
= Hämolysin-negativsin-Expression der Sc.
abellenteil in absoluten
Ergebnisse
70
4.1.4 Adhärenz an EpithelzellenFür die Untersuchungen wurden die beiden Zelllinien HEp 2 und ST verwendet. Die
Art der Adhärenz, die beobachtet werden konnte, war nicht auf spezielle Regionen
der Zelle beschränkt, sondern diffus über die gesamte Zelloberfläche verteilt
(Abb.11,12,13). Teilweise konnte auch eine unspezifische Adhärenz an der
Glasoberfläche festgestellt werden. Die Auswertung der Adhärenz wurde semi-
quantitativ durchgeführt. Dabei wurden jeweils 50 Zellen ausgezählt. Ein Isolat war
adhärent, wenn mehr als 100 Bakterien pro 50 ausgezählten Zellen vorgefunden
werden konnten. Bei 25 bis 100 Bakterien pro 50 Zellen wurde die Adhärenz als
zweifelhaft eingestuft. Waren weniger als 25 Bakterien pro 50 ausgezählten Zellen
vorhanden, so wurde die Adhärenz als negativ bezeichnet. Dabei wurde festgestellt,
dass bei den HEp 2 Zellen mehr als 80% der Streptokokken keine Adhärenz zeigten,
und bei den ST-Zellen über 70% der Sc. suis – Isolate keine Adhärenz zeigten (siehe
Abb.14). Einen Zusammenhang zwischen der Adhärenz der Sc. suis – Isolate mit
deren Herkunft konnte nicht festgestellt werden.
Abb.11: Adhärenz von Sc. suis an humane HEp 2–ZellenSc. suis-Isolat A 386/94 (nicht typisierbar, MRP-/EF-, Hämolysin-neg.) an humaneHEp 2–Zellen (Giemsa-gefärbter Ausstrich, Vergrösserung: 630fach, Ölimmersion)
Ergebnisse
71
Abb.12: Adhärenz von Sc. suis an porcine ST-ZellenSc. suis-Isolat A 386/94 (nicht typisierbar, MRP-/EF-, Hämolysin-neg.) an ST–Zellen(Giemsa-gefärbter Ausstrich, Vergrösserung: 630fach, Ölimmersion).
Abb.13:Adhärenz von Sc. suis an HEp2–ZellenSc. suis-Isolat A 5505/93 (nicht typisierbar, MRP-/EF-, Hämolysin-neg.) an HEp2–Zellen (Giemsa-gefärbter Ausstrich, Vergrösserung: 630fach, Öl-Immersion).
Ergebnisse
N = 81 N = 22 N = 99
HEp 2 = Humane LaryngotrST-Zellen = Schweine–Hod- = negative Adhärenz (wen+ = zweifelhaft positive Adh++ = positive Adhärenz (me
Abb. 14: Beziehungen zST– Zellen und ihrer HerkDie Ergebnisse wurden Anteile der unterschiedlicGesamtpopulation zu ver
4.2 Genotypisierung4.2.1 MakrorestriktionsBei der Makrorestriktion
Restriktionsenzymverdau
Pulsfeldgelelektrophorese
Für die exakte Grösse
Grössenmarker bestimm
0%
20%
40%
60%
80%
100%
HEp 2 - H
Ante
il in
% v
on N
Meningitis
Ante
il in
% v
on N
N = 14
acheal-Epithen–Zelleniger als 25 aärenz ( zwishr als 100 a
wischen deunft.in Prozenthe Adhäredeutlichen.
-Analyses-Analyse
mit ApaI b
(PFGE) a
nbestimmu
t werden.
Ep 2 + H
Pn
N = 4
72
elzellen
dhärente Bchen 25 unddhärente Ba
r Adhären
für die jenz in der je
wurde die
zw. SmaI
ufgetrennt.
ng der e
Zur Erste
Ep 2 ++
eumonie
N = 72
akterien pro 50 Zellen) 100 adhärente Bakterikterien pro 50 Zellen)
z der Sc. suis Isolate
weilige Gruppe ausgweiligen Gruppe im V
DNA aller Sc. suis
geschnitten und ans
ntstandenen Fragme
llung der Grössenma
ST - ST +
Pneu.-Misch.
N = 5
en pro 50 Zellen)
an HEp2– und
edrückt, um dieergleich mit der
-Isolate mittels
chließend in der
nte musste ein
rker diente der
ST ++ Gesamt
Sonstige
Ergebnisse
73
Staph. aureus DSM 1104. Dessen DNA wurde mit dem Restriktionsenzym SmaI
geschnitten und die Grösse der DNA–Fragmente in einer PFGE mittels zweier
mitgeführter Grössenstandards ( DNA-λ-Phagen-Leiter und eines 5 kBp DNA –
Leiter) ermittelt ( Abb15).
Abb.15: Erstellung eines spezifischen Grössenstandards für die PFGEDie Gesamt-DNA des Staph. aureus-Stammes DSM 1104 wurde nach Restriktionsverdaumit SmaI mittels PFGE aufgetrennt (Spur 1 u. 2). Die entstandenen Fragmente wurdeanhand zweier Grössenmarker bestimmt. Als Grössenmarker für den Bereich von 5-40 kBpwurde eine 5 kBp-DNA-Leiter (Fa. GIBCO BRL) (Spur 3) und für den Grössenbereich vonüber 48,5 kBp ein λ-DNA-Leiter (Fa. BioRad) (Spur 4) verwendet. Die Fragmentgrössen sindin kBp (kBp) angegeben.
Ergebnisse
74
Bei dem Restriktionsverdau mit ApaI entstanden Fragmentbandenmuster, welche
zwischen 15 und 23 Fragmente umfassten. Die Fragmentgrössen lagen im Bereich
von 7,5 kBp bis 340 kBp (Abb. 16 u. 19).
Bei dem Verdau mit SmaI entstanden Fragmentbandenmuster mit 6 bis 13
Fragmenten. Die Fragmentgrössen lagen im Bereich von 18 kBp bis 650 kBp (Abb
17 u.18).
Die Stabilität der erhaltenen Fragmentmuster wurde dadurch überprüft, dass mehrere
zufällig ausgewählte Stämme durch tägliches Überimpfen von Einzelkolonien je 50
mal auf Blutagar passagiert wurden. Anschliessend wurde eine
Makrorestriktionsanalyse der Isolate jeder zehnten Passage durchgeführt. Die
entstandenen Fragmentmuster zeigten auch nach der 50sten Passage keine
Veränderungen.
Durch die Makrorestriktionsanalyse war die Möglichkeit gegeben, alle Isolate anhand
ihrer Fragmentmuster zu differenzieren (Abb. 16-19). Eine Differenzierung war auch
möglich bei Isolaten aus einem Bestand wie z. B. die Stämme I4627c-g (Abb. 18 u.
19) oder aus einem Tier wie z. B. die Stämme I9841/1-3 (Abb. 16 u. 17).
Eine Auswertung der Restriktionsfragmentmuster mit dem Auge erlaubte zwar die
Feststellung, dass gewisse Bandenmuster auftraten, jedoch war eine genaue
Zuordnung in Cluster bei der Anzahl der zu untersuchten Isolate sehr schwierig, so
dass eine digitalisierte Auswertung vorgenommen wurde. Durch dreimaliges
Wiederholen der Auswertung dieser „Rohdaten“ wurden die Reproduzierbarkeit
überprüft und sichergestellt.
Dabei wurde bei den Serotyp 2-Stämmen ein in weiten Teilen sich gleichendes
Fragmentmuster identifiziert (Abb. 16 u. 17).
75
16Abb. 16: Makrorestriktionsanalyse von Sc. suAls Größenstandard diente der Stamm Staphin Kilobasenpaaren (kBp) angegeben. In dA6/3/97 (Spur 1), P1 (2), P202 (3), I4627c (4A123/1/97 (11), P203 (12), P204 (13), P24 (1DSM9682 (21), A2321/1/97 (22), D282 (23), A
Ergebnisse
5783011481401139574
56
352827
kBp
is-Serotyp 2 Stämme nach Restriktionsverdau mit ApaI. aureus DSM 1104 (Spur ST). Die Fragmentgrößen des Standards sind rechts
en übrigen Spuren wurde die DNA folgender Sc. suis -Stämme aufgetrennt:), SuisII (5), B2441/96 (6), Vecht 4005 (7), T15 (8), A2195/1/97 (9), A78/94 (10),4), P25 (15), DSM9684 (16), I9841/3 (17), I9841/2 (18), I9841/3 (19), P1/7 (20),6169/1/96 (24).
44
Ergebnisse
76
ST 1 2 3 4 5 ST 6 7 8 9 10 11 12 13 ST 14 15 16 17 18 19 ST 20 21 22 23 24 ST
Abb....: Auftrennung der DNA von Sc. suis - Serotyp 2 Stämmen nach Restriktionsverdau mit Sma I mittels PFGE
Als Größenstandart diente der Referenzstamm Staph. aureus DSM 1104 (= ST). In den übrigen Spuren wurde die DNAfolgender Sc. suis Stämme aufgetrennt: A6/3/97 (Spur 1), P1 (2), P202 (3), I4627c (4), SuisII (5), B2441/96 (6),Vecht4005 (7), T15 (8), A2195/1/97 (9), A78/94 (10), A123/1/97 (11), P203 (12), P204 (13), P24 (14), P25 (15),DSM9684 (16), I9841/3 (17), I9841/2 (18), I9841/1 (19), P 1/7 (20), DSM9682 (21), A2321/1/97 (22), D282 (23),A6169/1/96 (24)
578
3012531481401139574
56443529
kBp
17Abb. 17: Makrorestriktionsanalyse der Sc. suis-Serotyp 2 Stämme nach Restriktionsverdau mit SmaIAls Größenstandard diente der Stamm Staph. aureus DSM 1104 (Spur ST). Die Fragmentgrößen des Standardssind rechts in Kilobasenpaaren (kBp) angegeben. In den übrigen Spuren wurde die DNA folgender Sc. suis -Stämmeaufgetrennt: A6/3/97 (Spur 1), P1 (2), P202 (3), I4627c (4), SuisII (5), B2441/96 (6), Vecht 4005 (7), T15 (8),A2195/1/97 (9), A78/94 (10), A123/1/97 (11), P203 (12), P204 (13), P24 (14), P25 (15), DSM9684 (16), I9841/3 (17),I9841/2 (18), I9841/3 (19), P1/7 (20), DSM9682 (21), A2321/1/97 (22), D282 (23), A6169/1/96 (24).
Ergebnisse
77
ST 1 2 3 4 5 ST 6 7 8 9 10 ST 11 12 13 14 15 ST 16 17 18 19 20 ST 21 22 23 ST
Abb...: Makro-Restriktions-Analyse mittels Pulsfeldgelelektrophose von Sc.suis-Serotyp 9 Isolaten nach SmaIVerdau.Als Größenstandart dienet der Referenz-Stamm Staph.aureus DSM 1104 nach Apa I-Verdau..In den Spuren 1-23wurden folgende Isolate aufgetragen: B398/97 (Spur 1); B2647/96 (2); B2681/96 (3); A3286/94 (4); A1147/93 (5);B2663/96 (6); B2628/96 (7); B418/96 (8); A3973/4/98 (9); I4627d (10); A3313/1/98 (11); A3313/3/98 (12); A3863/6/97(13); B422/97 (14); B631/97 (15); I4627f (16); A5455/93 (17); A2062/2/97 (18); A5683/94 (19); I4627e (20); P 1/7(Suislysin-Referenzstamm Serotyp 2) (21); D282 (MRP-Referenz-Stamm Serotyp 2) (22); A2350/8/97 (23)
578
301253
14814011395
74
56
443528
kBp
Abb.18: Makrorestriktionsanalyse der Sc. suis-Serotyp 9 Stämme nach Restriktionsverdau mit SmaIAls Größenstandard diente der Stamm Staph. Aureus DSM 1104 (Spur ST). Die Fragmentgrößen des Standards sind rechts inKilobasenpaaren (kBp) angegeben In den übrigen Spuren wurde die DNA folgender Sc. suis -Stämme In den übrigen Spurenwurde die DNA folgender Sc. suis Stämmen aufgetrennt: B398/97 (Spur 1), B2647/96 (2), B2681/96 (3), A3286/94 (4),A1147/94 (5), B2663/96 (6), B2628/96 (7), B418/97 (8), A3973/4/98 (9), I4627d (10), A3313/1/98 (11), A3313/3/98 (12),A3863/6/97 (13), B422/97 (14), B631/97 (15), I4627f (16), A5455/93 (17), A2062/2/97 (18), A5683/94 (19), I4627e (20),P1/7(ST 2) (21), D282 (ST 2) (22), A2350/8/96 (23).
78
19
Abb.18: Makrorestriktionsanalyse der Sc. Als Größenstandard diente der Stamm Ssind rechts in Kilobasenpaaren (kBp) ange. In den übrigen Spuren wurde die DNA foA5683/94 (3), A3286/94 (4), I4627d (5), B2628/96 (11), A5455/93 (12), B422/97 (B631/97 (18), B418/97 (19), D282 (ST 2) (
ST 1 2 3 4 5 ST 6 7 8 9 10 ST 11 12 13 14 15 ST 16 17 18 19 ST 20 21 22 23 ST
Ergebnisse
578301
14814011395
74
564435
kBp
suis-Serotyp 9 Stämme nach Restriktionsverdau mit ApaItaph. Aureus DSM 1104 (Spur ST). Die Fragmentgrößen des Standardsgeben. In den übrigen Spuren wurde die DNA folgender Sc. suis -Stämmelgender Sc. suis Stämmen aufgetrennt: A3973/4/98 (Spur 1), B398/97 (2)A2062/2/97 (6), I4627f (7), A1147/94 (8), B2663/96 (9), B2647/96 (10),13), A 3313/3/98 (14), A3313/1/98 (15), A3863/6/97 (16), B2681/96 (17),20), P1/7 (ST 2) (21), A2350/8/96 (22).
Ergebnisse
79
4.2.2 ClusteranalyseAnhand der bei der Makrorestriktion entstandenen Fragmentmuster wurde nach
digitaler Bearbeitung der Rohdaten (siehe 3.12.3) eine Clusteranalyse mittels
UPGMA durchgeführt und basierend auf dieser Analyse als grafische Darstellung in
Form sog. Dendrogramme dargestellt. Die Ähnlichkeiten, basierend auf dem DICE-
Koeffizienten, wurden in Prozent angegeben und konnten in dem jeweiligen
Dendrogramm anhand der Skalierung der x-Achse in Prozent abgelesen werden
(Abb. 20 u. 21).
In den der bei der Clusteranalyse mittels UPGMA entstandenen Dendrogramme
(Abb. 20 u. 21) konnten sowohl bei dem Restriktionsverdau mit ApaI (MR-ApaI) als
auch mit SmaI (MR-SmaI) vier Grossgruppen (GG) unterschieden werden (GG
A1SmaI,, GG A2SmaI,, GG B1SmaI,, GG B2SmaI,, bzw. GG A1ApaI,, GG A2ApaI,, GG B1ApaI,,
GG B2ApaI,). Jedoch war sowohl die Grösse, wie auch die Zusammensetzung der GG
verschieden. So waren nach der Clusteranalyse mit SmaI verdauter DNA in der GG
A1SmaI 26 Isolate , in der GG A2SmaI 22 Isolate, in der GG B1SmaI 32 Isolate und in der
GG B2SmaI 19 Isolate enthalten (Abb. 20). Nach der Clusteranalyse nach MR-ApaI
waren in der GG A1ApaI 20 Isolate , in der GG A2ApaI 36 Isolate, in der GG B1ApaI 15
Isolate und in der GG B2ApaI 28 Isolate gruppiert (Abb. 21). Die in den GG
zusammengefassten Isolate wurden in der Clusteranalyse UPGMA weiter
diskriminiert, so dass auch innerhalb einer GG die einzelnen Isolate unterschieden
werden konnten.
Ergebnisse
A1
A2
B1
B2
00ÄhNlic ke
Ähnlichkeit in
Abb 20DendrogApaI-vergroup m
Ähnlichkeit in Prozent
220
: Genotypische Vramm. Die Darstdauter DNA von ethod analyses“)
40
40erwandtschaft dellung basiert au99 Isolaten. Als verwendet.
6it 60
80
er verwendetenf der ClusteranaCluster-Methode
80
80Sc. suis-Stämlyse der Makro wurde UPGMA
100100
H 5631/2P 202A 370/2/97P 180P 204B 2663/96A 5263/93A 305/3/97B 114/97B 467/97H 6388B 416/97B 398/97B 2801/96Suis 1/2 P 219A 6/3/97A 2883/2/97B 415/97T 15DSM 9683B 422/97A 3313/3/98B 2680/96B 162/97A 3313/1/98A 3863/6/97
B 418/97A 41/2a/97A 425/1/97A 5262/1/97A 386/94A 496/98A 3551/1/97I 4627 fA 5505/93B 2618/96B 2441/96A 123/1/97A 2409/98P 203B 29/97B 423/97A 1147/94I 4627 gA 2195/1/97A 2321/2/97A 2155/2/97A 5455/93A 6462/1/96A 5140/3/96A 5141/1/96B 2795/96A 217/1/97Suis 1/2 P 45
B 2641/96A 5683/94B 631/97B 2681/96
A 896/98B 139/97B 2631/96A 6165/2/96A 10/94A 210/1/97I 4627 dA 5439/2/96Suis IB 2858/96Suis IIB 2622/96DSM 9684B 627a/97B 2628/96A 3973/4/98A 1881/1/97A 2350/8/97D 282P 1I 4627 cB 72/97A 6169/1/96P 25DSM 9682P 24A 2062/2/97Vecht 4005I 4627 eB 92/97B 2647/96B 2816/96A 1731/94
P 1/7
I 9841/1I 9841/3I 9841/2P 182B 649/97A 78/94
A 3286/94
me dargestellt alsrestriktionsanalyse („unweighted pair
A1
A2
B1
B2
Ergebnisse
81
B2
B1
A2
A1
Abb 21 Genotypische Verwandtschaft der verwendeten Sc. suis-StämmeDendrogramm. Die Darstellung basiert auf der Clusteranalyse der MakroresSmaI-verdauter DNA von 99 Isolaten. Als Cluster-Methode wurde UPGMA ( „group method analyses“) verwendet.
0
10 80 60 40 20Ähnlichkeit in Prozent
A 6165/2/97B 649/97P 25A 2321/1/97H 5631/2I 9841/1I 9841/3I 9841/2D 282
P 1P 24B 416/97A 6/3/97B 627a/97
P 1/7DSM 9682
Suis1/2 p45A 496/98I 4627 cSuis IIP 202H 6388A 5683/94A 896/98A 6462/1/96A 3286/94T 15Suis1/2 p219A 305/3/97A 2883/2/97A 2350/8/97A 5439/2/97A 3863/6/97A 5263/93A 5140/3/96A 5141/1/96B 422/97B 631/97B 29/97B 162/97A 1731/94B 2628/96B 418/97Vecht 4005B 2663/96B 467/97P 182A 1147/94A 78/94A 5505/93A 123/1/97A 5455/93B 2441/96A 2195/1/97DSM 9683A 386/94A 5262/1/96A 2409/98A 2155/2/97A 423/97A 3313/1/98A 3313/3/98B 2647/96B 2681/96I 4627 dA 210/1/97B 2641/96DSM 9684B 2816/96B 2801/96A 1881/1/97I 4627 eB 114/97P 180B 139/97B 2622/96P 203P 204B 2858/96A 41/2a/97B 2795/96I 4627 gB 72/97I 4627 fA 3973/4/97A 2062/2/97A 370/2/97A 10/94Suis IB 398/97A 217/1/97B 2680/96B 2618/96B 415/97A 425/1/97A 3551/1/97A 6169/1/96A 2631/96B 92/97
dargestellt alstriktionsanalyseunweighted pair
A1
A2
B1
B2
Ergebnisse
82
4.2.3 Genotypischer Nachweis des HämolysinsDie bei der Pulsfeld-Gelelektrophorese aufgetrennte DNA der Sc. suis –Isolate wurde
mittels Southernblotting auf eine Nylonmembran übertragen und mit einer radioaktiv
markierten Hämolysin–Sonde, die mittels PCR hergestellt wurde, hybridisiert (Abb.
1). Das Gen zur Herstellung der Sonde wurde aus dem Sc. suis Stamm I 9841/1
isoliert ( Abb. 22) und mit α32 Phosphor markiert. So wurden die zur Verfügung
stehenden Sc. suis–Stämme auf das Vorhandensein des Hämolysin-Gens überprüft.
Die Sonde hatte eine Grösse von 1,493 kBp und umfasste das gesamte Hämolysin-
Gen (Abb. 22).
Durch die Hybridisierung konnte sowohl das Vorhandensein als auch die
Konserviertheit des Hämolysin–Gens bei den Isolaten festgestellt werden.
Es zeigte sich, dass das Hämolysin-Gen bei den verschiedenen Serotypen auf
unterschiedlichen Fragmenten lokalisiert war. Innerhalb eines Serotyps war die
Lokalisation konserviert. So konnte das Hämolysin-Gen bei den Serotyp 9 Isolaten in
einem Fragmentgrössenbereich von 300 kBp nachgewiesen werden, während bei es
bei den Serotyp 2 Isolaten das Hämolysin-Gen auf Fragmenten von ca. 50 kBp
konserviert war (Abb. 23b u. 24b). Bei keinem der untersuchten Isolate war das Gen
auf mehrere Fragmente lokalisiert, d. h. es lag offensichtlich nur in einer Kopie im
Genom vor.
Ergebnisse
83
Abb.22: Größenbestimmung der Hämolysin-Sonde
Überprüfung des PCR-Produktes zur Erstellung einergelelektrophoretischer Auftrennung und Fragmentgröden Größenstandard („Low DNA Mass TM-Ladder“), SpHämolysinsonde eingesetzt wurde. Die GrößenangabErstellung der Hämolysin-Sonde diente der Sc. suis S
Bp Bp
1 2
1493
20001200
800
400
200
Hämolysin-Gen-Sonde mittels
ßenbestimmung. Spur 1 zeigtur 1 das PCR-Produkt, das alsen sind in Baasenpaaren. Zurerotyp 2 Stamm I 9841/1.
Ergebnisse
84
ST 1 2 3 4 5 6 ST 7 8 9 10 11 12 ST
Abb...: Auftrennung genomischer DNA von Sc. suis nach Restriktionsenzym-Verdau mittels PFGE
Als Größenstandart diente der Referenzstamm Staph aureus DSM 1104. In denübrigen Spuren wurde die DNA folgender Sc suis Stämme aufgetrennt: B418/97(Spur 1); B2663/96 (2); B2628/96 (3); A3863/6/97 (4); B2641/96 (5); B92/97 (6);B631/97 (7); B2631/96 (8); B2647/96 (9); B2681/96 (10); A1731/94 (11); H5631/2(12)
Abb. 23a: Auftrennung genomischer DNA von Sc. suis nachRestriktionsenzymverdau mittels PFGE.Die Pfeile kennzeichnen die bei der anschließenden Hybridisierung durch dieSonde gekennzeichneten Banden (Abb 23b).
95
10
1618
21 2327 28 3544
56
74
113
140
148301578
kBp
Ergebnisse
85
Abb...: Nachweis des Suilysin-Gens mittels Southern-Hybridisierung
Als Standart diente der Referenzstamm Staphylococcus aureus DSM 1104(=ST). In den übrigen Spuren wurden folgende Sc.suis-Stämme aufgetrennt:B418/97 (Spur 1); B2663/96 (2); B2628/96 (3); A3863/6/97 (4); B2641/96(5); B92/97 (6); B631/97 (7); B2631/96 (8); B2647/96 (9); B2681/96 (10);A1731/94 (11); H5631/2 (12)
ST 1 2 3 4 5 6 ST 7 8 9 10 11 12 ST
Abb. 23b: Repräsentativer Genotypnachweis des Hämolysins mittels SouthernHybridisierung mit einen spezifischen Gensonde für das Hämolysin-Gen. Als Standarddiente der Referenzstamm Staphylococcus aureus DSM 1104 (ST). In den übrigenSpuren wurden die Restriktionsverdaus folgender Sc. suis Stämme aufgetragen: B418/97 (Spur 1), B2663/96 (2); B 2628/96 (3); A 3863/6/97 (4); B2641/96 (5); B92/97(6): B 631/97 (7); B2631/96 (8); B2647/96 (9); B2681/96 (10); A1731/94 (11); H5631/2(12).
kBp
578
301148
140113
95
74
56
-
44
Ergebnisse
86
577,86300,97148,22140.45113,00
94,8974,24
55,6143,7134,6528,5223,6421,6018,5716,249,81
27,56
5783011481401139574
564435282421181610
Abb. 24a: Auftrennung der DNA-Fragmente von Sc. suis-Isolaten nach Restriktionsverdau mit ApaImittels PFGE
Ergebnisse
87
35
57830114814011395745644352824211816
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ST 11 12 13 14 15 16 17 18 19 ST 20 21 22 23 24 25 26
Abb. 24b: Repräsentativer Genotypnachweis des Hämolysins mittels Southern- Hybridisierung mit einerspezifischen α32P-markierten Gensonde für das Hämolysin-Gen. Als Standard diente der Staph. aureus StammDSM 1104 (ST). In den übrigen Spuren wurde die DNA folgender Sc. suis Stämme aufgetrennt: B2441/96(Spur 1), B2618/96 (2), B2628/96 (3), B2622/96 (4), B2631/96 (5), B2641/96 (6), B2647/96 (7), B2663/96 (8),B2680/96 (9), B2681/96 (19), B2795/96 (11), B2801/96 (12), B2816/96 (13), B2858/96 (14), P1 (15), P24 (16),P25 (17), P180 (18), P182 (19), P202 (20), P203 (21), P204 (22), H5631/2 (23), T15 (24), H6388 (25), P1/7(26).
kBp
Ergebnisse
88
4.3 Beziehungen zwischen Genotyp und PhänotypAufgrund der Genotypisierung konnte nach einer Clusteranalyse die Einteilung der
Isolate in Grossgruppen (GG) vorgenommen werden. Im Anschluss konnte eine
Zuordnung der GG zum untersuchten Phänotyp der Isolate vorgenommen werden.
4.3.1 Beziehungen zwischen Genotyp und Herkunft der IsolateIn der GG A1SmaI war mit 76,9% und in der GG B2ApaI mit 71,5% eine signifikante
Häufung von Isolaten aus Meningitis/Septikämie-Geschehnissen zu erkennen.
Ebenso war eine signifikante Häufung der Isolate aus pneumonischen
Geschehnissen vorhanden. So waren in der GG B2SmaI 57,9% und in der GG A2ApaI
52,8% der Isolate Pneumonie-Erreger (Abb. 25 u. 26). Bei den Isolaten, die aus
gesunden Tieren isoliert worden waren, war in der GG B2ApaI keines zu finden,
während sie sich in den übrigen GGApaI gleichmässig verteilten und keine Häufung
zeigten. In der GG A1SmaI war ein Isolat dieser potentiell avirulenten Isolate
vorzufinden, während die restlichen Isolate sich in den übrigen GGSmaI gleichmässig
verteilten und keine Häufung zeigten.
4.3.2 Beziehungen zwischen dem Genotyp und SerotypAuffallend war hier, dass 14 der 25 Sc. suis Serotyp 2 Isolate (56%) in der GG
A1SmaI gruppiert waren. Nach der MR-ApaI waren 14 der 25 Sc. suis Serotyp 2
Isolate (56%) in der GG B2ApaI wiederzufinden. Bei den Sc. suis Serotyp 9 Isolaten
waren von den 20 Isolaten nach der MR-SmaI jeweils 7 Isolate auf die GG A2SmaI
und GG B1SmaI verteilt. In der GG A2ApaI waren 12 Serotyp 9 Isolate (60%) gruppiert.
Die anderen in der Sammlung aufgetretenen Serotypen zeigten kein auffälliges
Verteilungsmuster (Abb. 25 u. 26).
Ergebnisse
89
A1, A2, B1, B2 = Grossgruppeneinteilung im Dendrogramm nach Makrorestriktionsanalyse
mit SmaI und nach Clusteranalyse mittels UPGMA.
Abb.25: Beziehungen zwischen der Herkunft der Isolate und deren Zuordnung zu
den Grossgruppen A1SmaI,, A2SmaI,, B1SmaI,, B2SmaI nach Clusteranalyse. Die Grafik
zeigt die Anteile der Isolate in Prozent der Gesamtzahl jeder Gruppe.
Herkunft:
Ergebnisse
A1,
A1, A2, B1, B2 =
mit ApaI und nach
Abb.26: Bezieh
den Grossgrupp
zeigt die Anteile
0%
20%
40%
60%
80%
100%An
teil
in %
von
N
Menin
8
Her
N = 20
Grossgruppene
Clusteranalyse
ungen zwische
en A1ApaI,, A2
der Isolate in P
A 1
gitis Pne=
=
==
kunft:
N = 36
90
inteilung im De
mittels UPGMA
n der Herkunf
ApaI,, B1ApaI,, B
rozent der Ge
A 2
umonie Sonstige
Pneumonie-M
Pneumonie Meningitis
N = 15
ndrogramm nac
.
t der Isolate u
2ApaI nach Clu
samtzahl jeder
B 1
Pneumonie-Misch
ischinfektion
N = 2
h Makrorestriktio
nd deren Zuor
steranalyse. D
Gruppe.
B 2
infektion
N = 99
nsanalyse
dnung zu
ie Grafik
Gesamt
Sonstige
Ergebnisse
A1, A2, B1, B2
mit SmaI und n
ST = Serotyp
Abb. 27: Bez
den Grossgru
zeigt die Ante
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Ante
il in
% v
on N
1ST
N = 26
= Grossgruppen
ach Clusteranalys
iehungen zwisch
ppen A1SmaI,, A
ile der Isolate in
A 1
1/2 2
N = 22
91
einteilung im Den
e mittels UPGMA.
en dem Serotyp
2SmaI,, B1SmaI,, B
Prozent der Ges
A 2
3 4
N = 32
drogramm nach M
der Isolate und
2SmaI nach Clust
amtzahl jeder Gr
B 1 B
5 7
N = 19
N=20 N=36 N=15 N=28akrorestrik
deren Zu
eranalyse
uppe.
2
9
N=99
tionsanalyse
ordnung zu
. Die Grafik
Gesamt
sonstige
Ergebnisse
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Ante
il in
% v
on N
1
A1, A2, B1, B2 =
mit ApaI und nac
ST = Serotyp
Abb. 28: Bezieden Grossgrup
zeigt die Anteile
ST
N = 20
A 1
2 1
Grossgruppen
h Clusteranalys
hungen zwischpen A1ApaI,, A
der Isolate in
N = 36
92
A 2
/2 3
einteilung im D
e mittels UPGM
en dem Herku2ApaI,, B1ApaI,,
Prozent der Ge
N = 15
B 1
4 5
endrogramm na
A.
nft der IsolateB2ApaI nach C
samtzahl jede
N = 28
B 2
7 9
ch Makrorestrik
und deren Zulusteranalyse
r Gruppe.
N = 99
Gesamt
Sonstige
tionsanalyse
ordnung zu. Die Grafik
Ergebnisse
4.3.3 Beziehungen zwischen Genotyp und MRP/EF-Expression
Bei der Verteilung der MRP+/EF+ Isolate in den beiden Dendrogrammen waren inder GG A1SmaI mit 10 (66%) eine deutliche Häufung der 15 MRP+/EF+ Sc. suis
Isolate. In der GG B2ApaI war mit 53,4% eine deutliche Häufung MRP+/EF+ Sc. suis
Isolate. Von den 52 MRP+/EF- Isolaten waren in der GG B1SmaI,I 23 Isolate und in der
GG A2ApaI 24 Isolate gruppiert. Die Verteilung der MRP-/EF- Sc. suis Isolate zeigte
weder in den GGSmaI noch in den GGApaI eine Häufung (Abb.29 u. 30).
A1, A2, B1, B2 =
mit SmaI und nach
Abb.29: Beziehu
Zuordnung zu
Clusteranalyse. D
jeder Gruppe.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Ante
il in
% v
on N
M
N = 26
Grossgruppene
Clusteranalyse
ngen zwisch
den Grossg
ie Grafik zeig
A1
RP+/EF+
N = 22
93
inteilung im De
mittels UPGMA
en dem MRP
ruppen A1Sm
t die Anteile
A2
N = 32
ndrogramm nac
.
/EF-Phänotyp
aI,, A2SmaI,,
der Isolate in
B1
MRP+/EF-
N = 19
h Makrorestrikt
der Isolate
B1SmaI,, B2
Prozent der G
B2
N = 99
ionsanalyse
und deren
SmaI nach
esamtzahl
Gesamt
MRP-/EF-
Ergebnisse
A1, A2, B1, B2
mit ApaI und na
Abb. 30: Bez
Zuordnung zu
Die Grafik zeig
4.3.4 BeziehuBei der Zuor
Betrachtung di
Hämolysin-posfestgestellt we
Hämolysinprod
B1SmaI, mit 4 Is
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Ante
il in
% v
on N
N = 20
= Grossgruppe
ch Clusteranalys
iehungen zwis
den Grossgrup
t die Anteile de
ngen zwischednung der h
eser phänotyp
itiven Isolate rden. So zeigt
uktion (Abb. 3
olaten und GG
A1
MRP + / EF -
N = 36
94
neinteilung im D
e mittels UPGM
chen dem MR
pen A1ApaI,, A2
r Isolate in Pro
n Genotyp unämlysinproduz
ischen Eigensc
in jeweils een 16 von 26
1). In der GG
B2SmaI mit 3 Is
A2
MR
N = 15
endrogramm na
A.
P/EF-Phänoty
ApaI,, B1ApaI,, B
zent der Gesam
d Hämolysin-ierenden Isola
haft auch eine
iner GG derIsolaten (61,5
A2SmaI waren
olaten der Ante
B1
P + / EF +
N = 28
ch Makrorestrik
p der Isolate
2ApaI nach Clus
tzahl jeder Gr
Expressionte konnte be
signifikante H
beiden Den%) in der GG
mit 4 Isolaten,
il der Hämolys
B2
MRP -
N = 99
tionsanalyse
und deren
teranalyse.
uppe.
i isolierter
äufung der
drogrammeA1SmaI eine
in den GG
in-positiven
Gesamt
/ EF -
Ergebnisse
und Isolate unter 50 %. In der GG B2ApaI waren mit 12 von 28 Isolaten 42,9% der
Isolate Hämolysin-positiv. In der GG B1ApaI lag der Anteil der Hämolysin-positiven
ebenso wie in den GG A1ApaI, und GG A2ApaI deutlich niedriger (Abb. 32).
A1, A2, B1, B
mit SmaI und n
Abb.31: Bez
Zuordnung
Clusteranalys
jeder Gruppe
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Ante
il in
% v
on N
N = 99
N = 262 = Grossgruppen
ach Clusteranalys
iehungen zwisc
zu den Gros
e. Die Grafik ze
.
A1
Hämo= Hämolysin-z
N = 22
95
einteilung im Den
e mittels UPGMA
hen dem Hämo
sgruppen A1Sm
igt die Anteile d
A2
lysin negativweifelhaft/-negativ
N = 32
drogramm nach
.
lysin-Pänotyp d
aI,, A2SmaI,, B
er Isolate in Pr
B1
Häm
N = 19
Makrorestriktionsanalyse
er Isolate und deren
1SmaI,, B2SmaI nach
ozent der Gesamtzahl
B2 G e s a m t
olysin positiv
Ergebnisse
A1, A2, B1, B2 = Grossgr
mit ApaI und nach Clustera
Abb.32: Beziehungen z
Zuordnung zu den Gros
Die Grafik zeigt die Ante
0%
20%
40%
60%
80%
100%
A1
Ante
il in
% v
on N
H ä m o l y
N = 15N = 20
Hämolysin-zweif
N = 36
96
uppeneinteilung im Dendrogramm
nalyse mittels UPGMA.
wischen dem Hämolysin-Phäno
sgruppen A1ApaI,, A2ApaI,, B1ApaI,,
ile der Isolate in Prozent der Ges
A2 B1
s i n n e g a t i v H ä m oelhaft/negativ
N = 28
nach Makrorestrik
typ der Isolate
B2ApaI nach Clu
amtzahl jeder G
B2
l y s i n p o s i t i v
N = 99
tionsanalyse
und deren
steranalyse.
ruppe.
G e s a m t
Ergebnisse
97
Bei der Untersuchung der Sc. suis –Isolate mit einer positiven oder zweifelhaften
Hämolysin–Expression, konnte bei allen Isolaten das Hämolysin–Gen nachgewiesen
werden.
Bei den Isolaten, bei denen keine Hämolysinproduktion nachgewiesen werden
konnte, wurde bei ca. 50% der betroffenen Isolate das Hämolysin-Gen
nachgewiesen (siehe Abb.26 u. 27).
Tab.12: Auftreten des Hämolysin-Genotyps im Vergleich mit dem Hämolysin-
Phänotyp
GenotypPhänotyp positiv negativnegativ 25 (25,3) 25(25,3)
zweifelhaft 25(25,3) 0
positiv 24(24,2) 0
Summe 74(74,7) 25(25,3)
Phänotyp negativ = keine Hämolysin ExpressionPhänotyp positiv = positive Hämolysin ExpressionPhänotyp zweifelhaft = zweifelhafte Hämolysin ExpressionGenotyp positiv = Hämolysin-Gen konnte in der Southernblot-Hybridisierung
nachgewiesen werdenGenotyp negativ = Hämolysin-Gen konnte in der Southernblot-Hybridisierung nicht
nachgewiesen werden( ) = Angaben in Prozent
Ergebnisse
98
4.3.5 Beziehungen zwischen Genotyp und der Adhärenz an Epithelzellen
Eine Beziehung zwischen dem Genotyp und den Adhärenz-positiven und -zweifelhaft
positiven Isolaten war weder in den GGSmaI noch in den GGApaI zu erkennen, da nur
bei wenigen Isolaten eine Adhärenz nachgewiesen werden konnte und diese Isolate
gleichermassen auf die GG verteilt waren (Tabelle 14).
Tab.14: Beziehungen zwischen den Adhärenzeigenschaften der Isolate und deren
Zuordnung zu den Grossgruppen A1SmaI,, A2SmaI,, B1SmaI,, B2SmaI A1ApaI,, A2ApaI,,
B1ApaI,, B2ApaI nach Clusteranalyse. Die Tabelle zeigt die Anzahl der Isolate jeder
Gruppe.
Adhärenz-Phänotyp
GGSmaI HEp 2 + HEp 2 +/- HEp 2 - ST + ST +/- ST -
A1 1 2 23 1 3 22
A2 0 4 18 2 7 13
B1 2 5 25 2 7 23
B2 1 3 15 0 5 14
GGApaI HEp 2 + HEp 2 +/- HEp 2 - ST + ST +/- ST -A1 1 3 16 3 4 13
A2 2 5 29 1 7 28
B1 0 3 12 0 3 12
B2 1 3 24 1 8 19
Gesamt HEp 2 4 14 81
Gesamt ST 5 22 72
HEp 2, ST = verwendete Epithel-Zelllinien+ = Mehr als 100 adhärente Bakterien pro 50 ausgezählte Zellen+/- = Zwischen 25 und 100 adhärente Bakterien pro 50 ausgezählte Zellen- = Weniger als 25 adhärente Bakterien pro 50 ausgezählte Zellen
Ergebnisse
4.4 Clusterzuordnung der MRP+/EF+/Hämolysin+/Meningitis-IsolateAuffallend war bei der Phänotypisierung der Typ MRP+/EF+/Hämolysin+. Daher
wurde gesondert ein Vergleich des Genotyps dieser Isolate vorgenommen. 14 dieser
MRP+/EF+-Sc. suis -Isolate stammten aus Meningitis-Geschehnissen. Von diesen
wurden 13 Isolate als Serotyp 2 identifiziert. Ein Isolat hatte den Serotyp 1. Neun
dieser Isolate produzierten Hämolysine und ein Isolat war Hämolysin-Genotyp
negativ. Zehn dieser Isolate waren in der GG A1 SmaI, 1 Isolat in der GG A2 SmaI, 2
Isolate in der GG B1 SmaI und ein Isolat in der GG B2 SmaI. Drei dieser Isolate waren in
der GG A1 ApaI, 2 Isolate in der GG A2 ApaI, 2 Isolate in der GG B1 ApaI und 8 Isolate in
GG B2 ApaI verteilt (Abb.33).
Abb.33.: Zuordnung der
MRP+/EF+/Hämolysin+ zu den
B1ApaI,, B2ApaI. Die Grafik zeigt
Gruppe.
0
2
4
6
8
10
12
14
Sma I A 1 S m a I A 2 S
Serotyp 1 Serotyp 2
SmaI ApaI
N = 1
Ante
il in
% v
on N
80 %
60 %
40 %
20 %
100 %
N = 10
N = 8
N = 2
99
Isolate aus
Grossgruppen A1Sm
die Anteile der Iso
m a I B 1 S m a I B 2 A
N = 2
Meningitid
aI,, A2SmaI,,
late in P
p a I A 1 A
N =2
en mit
B1SmaI,, B
rozent de
p a I A 2 A
N = 2
N = 1
dem Phänotyp
2SmaI A1ApaI,, A2ApaI,,
r Gesamtzahl jeder
p a I B 1 A p a I B 2
Ergebnisse
100
4.5 Statistische Auswertung
Zur Absicherung der Ergebnisse der Beziehung zwischen dem Genotyp und dem
Phänotyp wurden die Daten einer statistischen Auswertung unterzogen. Eine
Übersicht über die durch die logistische Regression ermittelten Odds Ratio zeigt
Tabelle 14.
4.5.1 Beziehung zwischen Serotyp und Herkunft der IsolateAls Bezugswert wurde der Serotyp 2 und Meningitis genommen. Bezogen darauf fiel
vor allem auf, dass die Wahrscheinlichkeit, dass die Isolate mit den Serotypen 3 und
7 nicht aus einem Meningitis/Septikämie-Geschehen stammen, mit einer Odds Ratio
von 0,059 und einem P-Wert von 0,0003 um das 16,9-fache höher ist, als bei Serotyp
2. Bei den Isolaten mit den Serotypen 4 und 5 ist die Wahrscheinlichkeit, dass sie
nicht aus einem Meningitis/Septikämie-Geschehen stammen mit einer Odds Ratio
von 0,057 und einem P-Wert von 0,0008 um das 17,4-fache höher. Bei dem Serotyp
9 ist die Wahrscheinlichkeit, nicht aus einem Meningitis/Septikämie-Geschehen zu
stammen, mit einer Odds Ratio 0,286 und einem P-Wert von 0,0782 3,5fach höher
als beim Serotyp 2. Bei den sonstigen Serotypen ist mit einer Odds Ratio von 0,042
und einem P-Wert von 0,009 die Wahrscheinlichkeit, nicht aus einem
Meningitis/Septikämie-Geschehen zu stammen 23,8 fach höher als bei Serotyp 2.
4.5.2 Beziehung zwischen Expression potentieller Virulenzfaktoren undHerkunft
Als Bezugswert hinsichtlich der MRP-Expression wurde der MRP-negative Phänotyp
und Meningitis genommen. Dabei konnte festgestellt werden, dass mit einer Odds
Ratio von 3,714 und einem P-Wert von 0,0046, die MRP-positiven Isolate mit einer
3,7 fach höhere Wahrscheinlichkeit aus einem Meningitis/Septikämie-Geschehen
stammen.
Als Bezugswert hinsichtlich der EF-Expression wurde der EF-negative Phänotyp und
Meningitis genommen. Bezogen darauf fiel auf, dass die Isolate, welche bei den
Untersuchungen EF-positiv waren, mit einer Odds Ratio von 21,00 und einem P-Wert
von 0,0040, eine 21fach höhere Wahrscheinlichkeit haben, aus einem
Meningitis/Septikämie-Geschehen zu stammen.
Ergebnisse
101
Als Bezugswert hinsichtlich der Hämolysin-Expression wurde der Hämolysin-negative
Phänotyp und Meningitis genommen. Dabei ist bei den Hämolysin positiven Isolate
mit einer Odds Ratio von 4,429 und einem P-Wert von 0,0046 eine 4,4fach höhere
Wahrscheinlichkeit gegeben, aus einem Meningitis/-Septikämie-Geschehen zu
stammen.
Als Bezugswert hinsichtlich der Adhärenz wurde bei beiden verwendeten Zelllinien
der Adhärenz-negative Phänotyp und Meningitis genommen. Die Isolate, welche bei
den Untersuchungen mit der HEp 2 Zelllinie eine Adhärenz zeigten, haben mit einer
Odds Ratio von 0,0429 und einem P-Wert von 0,1175, in Bezug auf die Adhärenz-
negativen Isolate, eine 2,33fach höhere Wahrscheinlichkeit, nicht aus einem
Meningitis/Septikämie-Geschehen zu stammen.
Die Isolate, welche bei den Untersuchungen mit der ST-Zelllinie eine Adhärenz
zeigten, haben mit einer Odds Ratio von 1,118 und einem P-Wert von 0,8029, in
Bezug auf die Adhärenz-negativen Isolate, eine 1,12fach höhere Wahrscheinlichkeit,
nicht aus einem Meningitis/Septikämie-Geschehen zu stammen.
4.5.3 Beziehung zwischen Genotyp und Herkunft der IsolateAls Bezugswert wurde die Grossgruppe A1ApaI und Meningitis genommen. Im Bezug
darauf ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Isolate in der GG B2ApaI aus einem
Meningitis/Septikämie-Geschehen stammen, mit einer Odds Ratio von 1,773 und
einem P-Wert von 0,0054,um das 6,5fach höher, als in der GG B2ApaI. Hinsichtlich
der Wahrscheinlichkeit, dass die Isolate in der GG B1ApaI aus einem
Meningitis/Septikämie-Geschehen stammen, mit einer Odds Ratio von 2,311 und
einem P-Wert von 0,2422, um das 2,31fache höher, als in der GG A1ApaI. Mit einer
Odds Ratio von 6,5 und einem P-Wert von 0,3587ist die Wahrscheinlichkeit, dass die
Isolate in der GG A2ApaI aus einem Meningitis/Septikämie-Geschehen zu stammen,
1,77fache höher, als in der GG B2ApaI.
Als Bezugswert wurde die Grossgruppe A1SmaI und Meningitis genommen. Mit einer
Odds Ratio von 0,170 und einem P-Wert von 0,0075 ist die Wahrscheinlichkeit, dass
die Isolate in der GG B2SmaI nicht aus einem Meningitis/Septikämie-Geschehen
stammen, 5,88 fach höher Hinsichtlich der Wahrscheinlichkeit, dass die Isolate in der
GG B1SmaI nicht aus einem Meningitis/Septikämie-Geschehen stammen, ist mit einer
Odds Ratio von 0,271 und einem P-Wert von 0,0211, um das 3,7fache höher. Die
Wahrscheinlichkeit, dass die Isolate in der GG A2SmaI nicht aus einem
Ergebnisse
102
Meningitis/Septikämie-Geschehen stammen, mit einer Odds Ratio von 0,255 und
einem P-Wert von 0,0239, um das 3,9 fache höher.
Tabelle 14: Odds ratio und Wahrscheinlichkeitsüberschreitung der Phänotypischen
Merkmale im χ2–Test bezogen auf die Herkunft der Isolate.
Phänotyp HerkunftSerotyp Meningitis/
SeptikämiePneumonie/
Sonstige
Oddsratio P – Wert
½ + 1 6 8 0,143 0,01122 21 4 1,000 ------
3 + 7 4 13 0,059 0,00034 + 5 3 10 0,057 0,0008
Sonst. 2 9 0,042 0,00099 12 8 0,286 0,0782
MRP- 9 23 1,000 -----+ 39 28 3,714 0,0046
EF- 34 50 1,000 ----+ 14 1 21,000 0,0040
Haemolysin- 20 30 1,000 ----
+/- 8 14 0,886 0,8182+ 20 7 4,429 0,0046
Adhärenz HEp 2- 42 38 1,000 ----+ 6 13 0,429 0,1175
Adhärenz ST- 34 37 1,000 ----+ 14 14 1,118 0,8029
P – Wert = Überschreitungswahrscheinlichkeit des chi2-TestesMRP = Muramidase-Released-Protein EF = Extrazellulär-FaktorAdhärenz HEp 2 = Adhärenz von Sc. suis an HEp 2 ZellenAdhärenz ST = Adhärenz von Sc. suis an ST Zellen
Ergebnisse
103
Tabelle 15: Odds ratio und Wahrscheinlichkeitsüberschreitung des Genotyps im χ2–
Test bezogen auf die Herkunft der Isolate.
Genotyp HerkunftGrossgruppe Meningitis/
SeptikämiePneumonie/Sonstige
Oddsratio
P-Wert
A1 ApaI 7 13 1,000 ----A2 ApaI 14 22 1,773 0,3587B1 ApaI 7 8 2,311 0,2422B2 ApaI 20 8 6,500 0,0054A1 SmaI 20 6 1,000 ----A2 SmaI 9 13 0,255 0,0239B1 SmaI 13 19 0,271 0,0211B2 SmaI 6 13 0,170 0,0075
P – Wert = Überschreitungswahrscheinlichkeit des chi2-TestesA1 ApaI, A2 ApaI, B1ApaI, B2 ApaI = Bildung der Grossgruppen nach Restriktionsverdau mitApaI, Auftrennung mittels PFGE und Clusterung durch UPGMAA1 SmaI, A2 SmaI, B1SmaI, B2 SmaI = Bildung der Grossgruppen nach Restriktionsverdaumit SmaI, Auftrennung mittels PFGE und Clusterung durch UPGMA
Diskussion
104
5 Diskussion
Sc. suis hat eine grosse Bedeutung als Infektionserreger beim Schwein, vor allem in
der Intensivhaltung, woraus grosse wirtschaftliche Schäden, insbesondere durch die
verminderte Mastleistung, resultieren. Da sowohl bei gesunden wie bei erkrankten
Tieren Sc. suis isoliert werden kann, ist davon auszugehen, dass Sc. suis-Stämme
sehr unterschiedlicher Virulenz existieren. Unterschiede in der Virulenzausprägung
sind nicht nur zwischen den verschiedenen Serotypen sondern auch innerhalb eines
Serotyps zu beobachten. Sc. suis zeigt auch hinsichtlich des biochemischen und
serologischen Verhaltens eine sehr hohe Diversität. So konnten bis heute 35
verschiedene Serotypen identifiziert werden.
Aufgrund des sehr häufigen Auftretens von Sc. suis Serotyp 2 in Verbindung mit den
klinischen Symptomen Meningitis und Septikämie in Europa und Nordamerika wird
postuliert, dass klonale Verwandtschaften zwischen den virulenten Stämmen
existieren. So zeigten bei Ribotypisierungen virulente und avirulente Sc. suis Serotyp
2-Stämme charakteristische Bandenmuster (STAATS et al. 1998, OKWUMABUA et
al. 1995). Die bei der Ribotypisierung entstandenen Bandenmuster ergaben aber
dennoch eine sehr hohe Diversität sowohl zwischen den einzelnen Serotypen als
auch innerhalb eines Serotyps (SMITH et al. 1997). Über die Serotyp-Verteilung und
die Virulenz der Sc. suis-Isolate in Deutschland, insbesondere in Norddeutschland,
ist bisher nur wenig bekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher eine
detaillierte phänotypische und genotypische Charakterisierung bzw. Differenzierung
von Sc. suis-Isolaten, die aus verschiedenen Schweinebeständen der Region
stammten, um mögliche Beziehungen zwischen dem klinischen Hintergrund der
untersuchten Isolate und deren Eigenschaften zu ermitteln. Als Vergleich wurde eine
Reihe von Referenzstämmen miteinbezogen.
In Zusammenarbeit mit Dr. H. Wisselink und Dr. H. Smith, DLO-Institute of Animal
Science and Health, Lelystad, Holland, wurde zunächst eine Serotypisierung aller
Isolate durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass der Serotyp 2 mit 25,2 % am
häufigsten vertreten war, gefolgt vom Serotyp 9 mit 20,2 %, Serotyp 3 mit 9,1 %,
sowie den Serotypen ½ und 7 mit je 8 %. Der Anteil der Isolate, die keinem Serotyp
zugeordnet werden konnten, lag mit 6 % der Isolate im Vergleich zu anderen
Untersuchungen, bei denen bis zu 15 % nicht typisierbar waren (SALA et al. 1996),
auf einem niedrigen Niveau. Es ist bekannt, dass die Verteilung der Serotypen
Diskussion
105
geographisch stark varrieren kann. So tritt z. B. in Australien vor allem der Serotyp 15
(36,4 %) auf (HAMPTON et al. 1993). Bei Untersuchungen in Kanada war der
Serotyp 2 mit 24 % am häufigsten vertreten, gefolgt von Serotyp 3 (14 %) und ½ (12
%). In Norditalien wurde der Serotyp 2 mit 36 % der untersuchten Stämme am
häufigsten vorgefunden. (SALA et al. 1996).
Über die Korrelation zwischen Serotyp 2 und Virulenz gibt es ebenfalls
unterschiedliche Erkenntnisse. So konnten z. B. MOGOLLON et al. (1990) 28 von 40
Serotyp 2-Stämmen aus pneumonischen Geschehnissen isolieren und nur 8 Isolate
von Schweinen mit Meningitis oder Septikämie. Im Gegensatz dazu stammten von
den Isolaten, die für die vorliegende Arbeit verwendet wurden, 48 Stämme (48,5 %)
von Schweinen, die an einer Meningitis oder einer Septikämie erkrankt waren.
Hinsichtlich der Herkunft der Isolate war zudem auffällig, dass von den 25 Serotyp 2-
Isolaten 24 aus erkrankten Tieren stammen, wobei 21 Isolate aus
Meningitis/Septikämie-Geschehnissen isoliert wurden. Bei den Serotyp 9 Isolaten
stammen 19 von 20 Isolaten aus erkrankten Tieren, wobei jedoch nur 12 Isolate (60
%) aus Meningitis/Septikämie-Geschehnissen stammen. 7 Isolate (35 %) stammen
aus pneumonischen Herden. Bei den Sc. suis-Serotypen ½, 3, 4, 5 und 7 konnte
eine signifikante Häufung der Isolate aus pneumonischen Geschehnissen
beobachtet werden. Der Serotyp ist jedoch offenbar nicht ausreichend, um
hochvirulente Sc. suis-Isolate zu identifizieren, da auch Sc. suis Serotyp 2-Isolate
aus gesunden Tieren gefunden wurden.
Die vorliegenden Untersuchungen der Isolate zur Expression potentieller
Virulenzfaktoren bzw. virulenzassoziierter Faktoren ergaben, dass von den
untersuchten Sc. suis-Serotyp 2 Isolaten alle bis auf 3 das Protein MRP exprimierten
(MRP+). Von diesen 22 MRP+ Isolaten waren 13 Isolate zudem auch EF positiv
(EF+). Alle MRP+/EF+-Isolate konnten aus Schweinen mit Meningitis oder
Septikämie isoliert werden, was mit den Untersuchungen von GALINA et al. (1996)
und STAATS et al. (1999) übereinstimmt. Bei deren Untersuchungen konnte
ebenfalls eine starke Korrelation von hochvirulenten Sc. suis Serotyp 2-Isolaten mit
der Expression von MRP und EF festgestellt werden. Weitere Untersuchungen von
Serotyp 2 Feld-Isolaten aus Kanada ergaben jedoch, dass über 72 % der
untersuchten Isolate von erkrankten Tieren weder MRP (MRP-) noch EF (EF-)
exprimierten (GOTTSCHALK et al. 1998).
Diskussion
106
Bei den MRP+/EF- Serotyp 2-Isolaten stammten alle bis auf ein Isolat von
Schweinen mit Meningitis oder Septikämie, was ebenfalls mit den Beobachtungen
von STAATS et al. (1999) korreliert. Jedoch konnten auch beim Serotyp 9 fast alle
(19 von 20) Isolate dem MRP+/EF- Phänotyp zugeordnet werden. Keines der
Serotyp 9-Isolate exprimierte das EF. Dabei war die Korrelation dieses Phänotyps mit
Meningitis/Septikämie nicht so deutlich wie bei Serotyp 2 (12 der 20 Serotyp 9-Isolate
stammen aus einer Meningitis/Septikämie-Erkrankung). Auch bei anderen Serotypen
konnte im Gegensatz zu GALINA et al. (1996) der MRP+/EF- Phänotyp
nachgewiesen werden, jedoch stammten von den 24 dieser Isolate nur 6 aus einer
Meningitis/Septikämie-Erkrankung, während 13 aus dem Atemtrakt von erkrankten
Schweinen isoliert worden waren. Dies bedeutet, dass anderen Serotypen als 2 und
9 keine signifikante Korrelation mit der Virulenz von Sc. suis zu bestehen scheint.
Welche Funktionen MRP und EF haben, ist noch nicht geklärt. Untersuchungen mit
“Knockout-Mutanten” ergaben, dass beide Proteine nur als virulenzassoziierte
Faktoren angesehen werden können, da auch die MRP/EF-defizienten Stämme bei
Infektionsversuchen Erkrankungen auslösten (SMITH et al. 1996). Diese Aussage
steht hinsichtlich des MRP in Übereinstimmung mit den Ergebnissen dieser Arbeit,
da das MRP sowohl bei virulenten Stämmen als auch bei potentiell avirulenten
Stämmen nachgewiesen wurde. Auch die Tatsache, dass das MRP bei einigen
virulenten Stämmen nicht nachgewiesen wurde, steht im Einklang mit den
Beobachtungen von SMITH et al. (1996). Hinsichtlich des EF ist die
Wahrscheinlichkeit, das EF-Protein bei Isolaten aus Meningitis/Septikämie-
Geschehnissen isolieren zu können, 21-mal höher, als aus anderen Geschehnissen.
Der Umkehrschluss, dass mit der gleichen Wahrscheinlichkeit Isolate, die aus einem
Meningitis/Septikämie-Geschehen stammen, das EF-Protein exprimieren, konnte
jedoch nicht gemacht werden, da von 48 Meningitis-Isolaten 34 Isolate kein EF-
Protein produzierten. Auch konnte im Gegensatz zu anderen Untersuchungen
(GALINA et al. 1996) bei keinem der untersuchten Isolate das EF-Protein ohne das
MRP nachgewiesen werden. Das EF korrelierte zwar sehr stark mit der Virulenz von
Sc. suis, so dass das EF-Protein bei Vorhandensein zwar als ein Indiz für eine hohe
Virulenz gelten kann; da jedoch die Virulenz nicht von dem Vorhandensein des EF-
Proteins abhängt, muss EF ebenfalls als nur virulenzbegleitender Faktor angesehen
werden.
Diskussion
107
Bei der Untersuchung des potentiellen Virulenzfaktors Hämolysin konnte ein sehr
deutlicher Zusammenhang einer starken Expression von Hämolysinen mit dem
jeweiligen Serotyp festgestellt werden. So produzierten bis auf einen Stamm alle
MRP/EF-positiven Serotyp 2-Isolate auch sehr deutlich Hämolysine und stammten
aus Schweinen mit Meningitis/Septikämie. Diese Korrelation der Hämolysin-positiven
Sc. suis Serotyp 2-Isolate mit einer starken Virulenz konnte auch von STAATS et al.
(1999) festgestellt werden. Jedoch konnten auch Serotyp 2-Isolate ohne
Hämolysinexpression aus Schweinen mit Meningitis/Septikämie isoliert werden, so
dass eine starke Hämolysinexpression der Serotyp 2-Isolate auf einen hochvirulenten
Stamm hinweist, jedoch eine hohe Virulenz bei Serotyp 2-Isolaten mit
einhergehender geringer oder fehlender Hämolysinexpression nicht ausgeschlossen
werden kann.
JACOBS et al. (1995) stellten bei 81 % der Serotyp 9-Isolate eine
Hämolysinexpression fest. Im Gegensatz dazu wurden bei den in dieser Arbeit
untersuchten Serotyp 9-Isolaten nur 2 mit einer deutlichen Hämolysinexpression
identifiziert. Auffällig war jedoch, dass von den 12 Isolaten, die kein Hämolysin
produzierten, bei 9 Isolaten das Hämolysin-Gen nachgewiesen werden konnte. Es
wäre daher möglich, dass die Hämolysinexpression ein regulierter Prozess ist. Um
dies zu klären, müssten weitergehende Untersuchungen vorgenommen werden.
Bei den Serotyp ½-Isolaten stammten zwar 5 von 8 Isolaten aus pneumonischen
Geschehnissen, jedoch konnte nur bei einem Isolat eine Hämolysinexpression
nachgewiesen werden, obwohl von FEDER et al. (1994) dem Sc. suis Serotyp ½-
Referenzstamm eine deutliche Hämolysinexpression zugeschrieben wurde. Ob
Serotyp ½-Stämme tatsächlich Hämolysin-positiv oder –negativ sind, müsste durch
weitergehende Untersuchungen einer grösseren Anzahl überprüft werden. Bei den
Serotyp 3-Isolaten waren bis auf einen Stamm alle ursprünglich aus pneumonischen
Geschehnissen isoliert worden. Eine deutliche Hämolysinexpression konnte dabei
nur bei einem Stamm festgestellt werden. Eine ähnliche Konstellation fand sich bei
den Sc. suis Serotypen 4, 5 und 7. Bei keinem dieser Serotypen war eine deutliche
Hämolysinexpression festzustellen. Bei den Isolaten mit den Serotypen 4 bzw. 5
konnte zwar kein Isolat mit deutlicher Hämolysinexpression nachgewiesen werden,
jedoch konnte bis auf jeweils ein Isolat bei beiden Serotypen das Hämolysin-Gen
gefunden werden. Möglicherweise ist auch bei diesen Isolaten die Expression durch
noch nicht bekannte Faktoren reguliert. Für eine Einstufung der Hämolysine als
Diskussion
108
wichtigem Virulenzfaktor von Sc. suis spricht, dass in einer Studie die Immunisierung
mit dem Hämolysin Suilysin die Schweine teilweise vor einer von nachfolgenden
experimentellen Infektion mit Sc. suis schützte (JACOBS et al. 1996). Zwar wurde
bei vielen hochvirulenten Stämmen eine starke Hämolysinexpression nachgewiesen,
wie es auch von STAATS et al. (1999) und OKWUMABUA et al. (1999) postuliert
wird, jedoch ist es nicht möglich, aufgrund nicht nachgewiesener Hämolysine bei Sc.
suis von avirulenten Isolaten zu sprechen, da in der vorliegenden Arbeit 20 von 48
hochvirulenten Isolaten keine Hämolysine produzierten. Auch konnte bei 38 von 40
Isolaten aus pneumonischen Herden keine deutliche Hämolysin-Expression
nachgewiesen werden, obwohl aufgrund ihrer Herkunft auch diese Isolate als virulent
bezeichnet werden müssen. Von den Isolaten, die von gesunden Tieren
(Nasentupfer oder Vaginaltupfer) isoliert wurden, konnte bei 36,4 % ebenfalls eine
starke Hämolysinproduktion festgestellt werden. Ob diese Isolate avirulent sind oder
isoliert wurden, bevor sie eine Erkrankung hervorrufen konnten, ist nicht geklärt und
müsste durch weitergehende Untersuchungen wie z. B. anhand experimenteller
Infektionen geklärt werden. Möglicherweise besteht ein Zusammenhang zwischen
einer starken Hämolysinexpression und einer hohen Virulenz. Jedoch müsste diese
Korrelation erst durch weitergehende Untersuchungen gesichert werden.
Die Adhärenz gilt bei vielen Bakterien als erster Schritt, um eine Infektion zu
etablieren (ROSTAND et al. 1997). In den bisher relativ wenigen Untersuchungen zur
Adhärenz von Sc. suis wurde auch bei diesem Erreger ein Zusammenhang zwischen
Adhärenz und Virulenz gesehen (GOTTSCHALK et al. 1991; HAATAJA et al. 1994;
TIKKANEN et al. 1996). Daher wurde in der vorliegenden Arbeit das
Adhärenzverhalten der verwendeten Isolate mit zwei Epithelzelllinien getestet. Dabei
konnte keine Zuordnung des Adhärenzverhaltens zu einem bestimmten Serotyp oder
Krankheitsbild festgestellt werden, vor allem, da überraschenderweise nur sehr
wenige Stämme adhärent waren. Über 90 % der potentiell hochvirulenten Isolate
(aus Meningitis/Septikämie) zeigten keine Adhärenz. Dies lässt darauf schliessen,
dass das Adhärenzvermögen nicht geeignet ist, um Hinweise auf die Virulenz zu
erhalten. Möglicherweise wird auch das Adhärenzvermögen reguliert, so dass
weitere Untersuchungen nötig sind, um die Adhärenz als potentiellen Virulenzfaktor
einschätzen zu können.
Genotypische Untersuchungen wurden bei Sc. suis mit verschiedenen Methoden wie
Ribotypisierung (STAATS et al. 1998) oder Multilokal-Enzym-Elektrophorese
Diskussion
109
(HAMPSON et al. 1993) bereits durchgeführt. Meistens bezog sich jedoch die
Untersuchung nur auf den Serotyp 2, so dass eine Aussage hinsichtlich der Diversität
zwischen den Serotypen nicht möglich war. Zur Genotypisierung der in dieser Arbeit
untersuchten Isolate wurde die Makrorestriktionsanalyse mittels Pulsfeld-
Gelelektrophorese (PFGE) verwendet. Eine Untersuchung des Genoms von Sc. suis
mittels PFGE wurde bisher noch nicht beschrieben. Durch die Verwendung zweier
Restriktionsenzyme (ApaI und SmaI) konnten Isolate, die bei einem der beiden
Enzyme ein identisches Fragmentbandenmuster zeigten, anhand des zweiten
Bandenmusters unterschieden werden. Dabei wurde festgestellt, dass im Vergleich
mit Makrorestriktionsanalysen mittels PFGE bei anderen Streptokokken (LEFEVRE
et al. 1993, RUDOLPH et al. 1998) eine vergleichbar hohe Diskriminierung erreicht
wurde. So war es möglich, Isolate auch innerhalb des gleichen Serotyps voneinander
zu unterscheiden. Diese hohe Diskriminierung ermöglicht es daher, sehr genau
epidemiologische Fragestellungen klären zu können. Dies konnte in der vorliegenden
Arbeit dadurch gezeigt werden, dass auch Isolate innerhalb eines Bestandes bzw.
von einem Tier differenzierbar waren. Jedoch ist die Methode zur Klärung von
Fragestellungen der Taxonomie weniger gut geeignet. Hierzu sollten konserviertere
Bereiche des Genoms sequenziert und mittels Clusteranalyse in Zusammenhang
gebracht werden.
Um mögliche klonale Zusammenhänge der Isolate zu erkennen, wurde im Anschluß
an die Makrorestriktion eine Clusteranalyse mittels UPGMA durchgeführt. Basierend
auf Clusteranalysen der PFGE-Muster von ApaI und SmaI-verdauter DNA, die
grafisch in Dendrogrammen dargestellt wurden, ergaben sich jeweils 4
Grossgruppen. Hinsichtlich der Erstellung der Dendrogramme anhand der
Clusteranalyse nach UPGMA muss aber berücksichtigt werden, dass die
Dendrogramme leicht variieren können und daher eine Standardisierung sehr wichtig
ist. Einen Zusammenhang des genetischen Profils mit dem klinischen Hintergrund
konnte aufgrund der Grossgruppenbildung deutlich erkannt werden. Im Gegensatz
zu den Arbeiten von RASMUSSEN et al. (1999) und CHATELLIER et al. (1999), die
ein genetisches Profil mittels Ribotypisierung erstellt hatten, waren die hochvirulenten
Stämme jedoch nicht ausschließlich in einer Grossgruppe geclustert. Die
Ribotypisierung ist allerdings im Vergleich zur PFGE eine weniger hoch auflösende
Technik. Die in der vorliegenden Arbeit festgestellte hohe Diversität des Erregers
stimmt mit den Ergebnissen von HAMPSON et al. (1993) überein. Allerdings konnten
Diskussion
110
HAMPSON et al. (1993) mit der von ihnen durchgeführten Multilokal-Enzym-
Elektrophorese keine klonale Verwandtschaften bei den Isolaten mit gleichem
klinischen Hintergrund feststellen.
Bei dem Vergleich des Genotyps mit der Expression der potentiellen Virulenzmarker
konnte eine Clusterung hinsichtlich der Serotyp 2-, MRP+/EF+- und stark Hämolysin
exprimierenden Isolate festgestellt werden. Daher ist die Möglichkeit gegeben, dass
diese Erreger in enger klonale Beziehung zueinander stehen. Vergleichbare
Korrelationen des Genotyps mit den phänotypischen Merkmalen konnte auch von
SMITH et al. (1997), STAATS et al. (1998) und CHATELLIER et al. (1999)
festgestellt werden; jedoch beschränkten sich die Untersuchungen mittels
Ribotypisierung nur auf die Serotypen 2 bzw. 1. Die vorliegenden Ergebnisse führten
damit zu dem Schluss, dass die meisten hochvirulenten Isolate dem Serotyp 2
angehörten, die Proteine MRP und EF exprimierten, eine starke
Hämolysinexpression zeigten und nach Makrorestriktionsanalyse in einer
Hauptgruppe geclustert waren und somit offenbar in einem sehr engen genetischen
Verhältnis stehen.
Hinsichtlich des Nachweises virulenter Sc. suis-Stämme anhand genotypischer oder
phänotypischer Eigenschaften müssen noch weitere Untersuchungen zur Klärung
der Virulenz des Erregers folgen, um die klonalen Zusammenhänge, die in dieser
Arbeit aufgezeigt wurden, untermauern zu können.
Zusammenfassung
111
6 ZusammenfassungInfektionen mit Sc. suis können beim Schwein zu Meningitiden, Arthritiden,
Septikämien, Endokarditiden und Pneumonien führen und haben hohe wirtschaftliche
Schäden in der Intensivhaltung der Schweinemast zur Folge. Beim Menschen kann
Sc. suis Meningitiden auslösen und gilt daher als Zoonose-Erreger. Ein wesentliches
Problem ist jedoch offenbar, dass die Virulenz der verschiedenen Stämme sehr
unterschiedlich ist. Bisher konnten mehrere potentielle Virulenzfaktoren bzw.
virulenzbegleitende Faktoren von Sc. suis identifiziert werden. Die Rolle dieser
Faktoren in der Virulenz von Sc. suis ist jedoch noch nicht geklärt.
In der vorliegenden Arbeit wurden 99 Sc. suis-Isolate mit unterschiedlichem
klinischen Hintergrund phänotypisch und genotypisch charakterisiert. Ziel der
Untersuchungen war es, mögliche Beziehungen zwischen Genotyp, klinischem
Hintergrund und der Expression der bisher bekannten, potentiellen Virulenzmerkmale
(Polysaccharidkapsel, Muramidase-Released-Protein [MRP], Extrazellulär-Faktor
[EF], Hämolysin und Adhärenz) herauszuarbeiten.
Hinsichtlich der Serotypisierung auf der Grundlage der Kapselpolysaccharidantigene
wurde eine signifikante Häufung von Sc. suis -Isolaten der Serotypen 2 (25,3 %) und
9 (20,2 %) festgestellt. Von den Sc. suis Serotyp 2-Isolaten konnten 84 % als
hochvirulent eingestuft werden, da sie aus Tieren mit Meningitis oder Septikämie
isoliert wurden. Bei den Serotyp 9-Isolaten wurden 60 % der Isolate aufgrund ihrer
Herkunft als hochvirulent eingestuft. Mit 35 % der Serotyp 9-Isolate, die aus
Lungenerkrankungen isoliert wurden, war der Anteil der weniger virulenten Stämme
bei diesem Serotyp deutlich höher als bei den Sc. suis Serotyp 2-Isolaten. Bei den
übrigen Serotypen überwog der Anteil der schwach virulenten oder potentiell
avirulenten Isolate.
Bei der Analyse der virulenzbegleitenden Faktoren MRP und EF konnte gezeigt
werden, dass 14 von 15 Isolaten, bei denen sowohl MRP als auch EF nachgewiesen
wurde, hochvirulent waren. Dreizehn dieser hochvirulenten Isolate waren dem
Serotyp 2 zuzuordnen. Bei den 52 Isolaten, die nur MRP exprimierten, war der Anteil
der hochvirulenten Isolate mit 25 deutlich geringer. Hier war der Anteil der
schwachvirulenten Isolate mit 21 Isolaten und der potentiell avirulenten Isolaten mit 6
Isolaten hoch. Bei den Isolaten, die weder MRP noch EF exprimierten, war der Anteil
der hochvirulenten Isolate am geringsten.
Zusammenfassung
112
Hinsichtlich der Expression von Hämolysin konnte festgestellt werden, dass von den
27 Isolaten, welche eine starke Hämolysinexpression zeigten, 14 Isolate dem Sc.
suis Serotyp 2 angehörten. Insgesamt 22 Isolate zeigten eine schwache
Hämolysinexpression, jedoch konnte auch bei diesen das Hämolysin-Gen
nachgewiesen werden. Bei den Isolaten mit schwacher Hämolysinexpression war der
Anteil der schwach virulenten Isolate mit 14 Stämmen relativ hoch. Bei den 50
Isolaten ohne nachweisbare Hämolysinexpression konnte bei 50 % das Hämolysin-
Gen detektiert werden.
Die Untersuchung der Adhärenzeigenschaften von Sc. suis ergab nur bei sehr
wenigen Stämmen eine deutliche Adhärenz. Eine Zuordnung hinsichtlich der Virulenz
konnte daher nicht gemacht werden.
Die Genotypisierung mittels Makrorestriktionanalyse in der Pulsfeld-
Gelelektrophorese (PFGE) ermöglichte anhand des entsprechenden Restriktions-
fragmentmusters eine stammspezifische Differenzierung. Die mittels dieser
Restriktionsfragmentmuster erstellte Clusteranalyse ergab, dass die Isolate 4
Hauptgruppen zugeordnet werden konnten. Der Vergleich dieser Zuordnung
Zusammenhang mit den Ergebnissen der phänotypischen Untersuchungen ergab,
dass die meisten hochvirulenten Isolate dem Serotyp 2 angehören, die Proteine MRP
und EF exprimierten, eine starke Hämolysinexpression zeigten und nach
Makrorestriktionsanalyse in einer Hauptgruppe geclustert werden. Isolate mit einer
geringeren Virulenz sowie Isolate von gesunden Schweinen zeigten dagegen eine
wesentlich stärkere Heterogenität des phäno- und genotypischen Hintergrundes.
Die Ergebnisse dieser Arbeit repräsentieren die erste detaillierte Dokumentation des
geno- und phänotypischen Hintergrunds einer Sc. suis-Population aus dem
norddeutschen Raum und belegen darüber hinaus, dass bestimmte phänotypische
und genotypische Merkmale mit der Virulenz von Sc. suis korrelieren. Die genauen
klonalen Zusammenhänge, auf die die Ergebnisse dieser Arbeit hinweisen, müssen
in zukünftigen Studien geklärt werden, um damit einen Beitrag für die Entwicklung
besserer Bekämpfungsstrategien bei Sc. suis-Infektionen zu leisten.
Summary
113
7 Summary
Characterisation of Streptococcus suis:Relation of clinical background expression of potential virulence factors andgenotype
Achim Allgaier
Sc. suis is a pathogenic bacterial species that may cause meningitis, arthritis,
septicaemia, endocarditis and pneumonia in pigs and leads to high economical
losses in intensive pig fattening. In humans Sc. suis may cause meningitis and is,
therefore, classified as a causative agent of zoonosis. An essential problem seems to
be the difference between the virulence of the various strains. So far, some virulence
factors and virulence associated factors have been identified. However, their function
concerning the virulence of the pathogen is not yet understood.
In this study we characterised 99 isolates of Sc. suis according to their phenotypic
and genetic features. The aim of this study was to evaluate a possible relationship
between genotype, clinical background and expression of the known putative
virulence factors (polysaccharride capsule, muramidase released protein (MRP),
extracellular factor protein (EF), haemolysin and adherence).
Analysis of the serotype showed a significant accumulation of serotype 2 (25,3 %)
and 9 (20,2 %). In terms of virulence, 84 % of the serotype 2 strains were defined as
highly virulent because they were isolated from animals suffering either from
meningitis or septicaemia. Within the serotype 9 isolates, 60 % were classified as
highly virulent according to their clinical background. Since 35 % of the serotype 9
isolates were isolated from cases of lung diseases, the part of only weakly virulent
strains within this serotype was distinctly higher than in Sc. suis 2 isolates. In all other
serotypes that were used in this study the part of weakly virulent or potential non-
virulent isolates was even.
The study revealed a significant correlation between the clinical background and the
production of the MRP- and the EF-protein: 14 of 15 isolates that expressed MRP as
well as EF were highly virulent. Thirteen of these isolates belonged to serotype 2.
Within the 52 isolates expressing only MRP, the portion of highly virulent isolates was
distinctly lower (25 isolates). In this group the portion of weakly virulent (21) and
Summary
114
potential non-virulent (6) isolates was high. Within the isolates expressing neither
MRP nor EF the portion of highly virulent isolates was lowest.
Twenty-seven isolates showed a production of haemolysin. Of these isolates 14
isolates belonged to serotype 2. Twenty-one isolates showed a low production of
haemolysin although the gene of haemolysin was detected. Within these isolates the
portion of weakly virulent isolates was high (14 isolates). Within the group of 50
isolates without a provable synthesis of haemolysin the haemolysin gene was
detected in 50 % of the isolates.
The adherence showed no distinct correlation to the virulence of the strains. Only a
few number of isolates proved to be adherent.
By macrorestriction analysis using pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) it was
possible to discriminate between different strains via their restriction fragment
patterns. Cluster analysis of these data and the typifying investigation showed that
most of the high virulent strains belonged to serotype 2 and expressed MRP as well
as EF, showed a distinct production of haemolysin and were clustered in the same
main group after macrorestriction analysis. Weakly virulent isolates and isolates from
healthy pigs had a much more heterogeneous pheno- and genotypic background.
The results of this study represent the first detailed documentation of the pheno- and
genotypic background in a Sc. suis population in the northern part of Germany.
Furthermore, it has been proven, that certain phenotypic and genotypic features
correlate with the virulence in Sc. suis strains. To ensure the clonal context this study
already indicates, further investigations need to be done to make a contribution to
develop better control strategies in Sc. suis infections.
Anhang
115
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Description of 14 new capsular types of Streptococcus suis
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GOTTSCHALK, M., R. HIGGINS, M. JAQUES,(1991 a)
Isolation and characterisation of Streptococcus suis capsular types 9 - 22
J. Vet. Diagn. Invest. 3, 60 – 65
GOTTSCHALK, M., R. HIGGINS, M. JAQUES, M. BEAUDOIN u. J. HENRICHSEN
(1991 b)
Characterisation of six new capsular types ( 23 through 28 ) of Streptococcus suis
J. Clin. Microbiol. 29, 2633 – 2636
Anhang
121
GOTTSCHALK, M., S. PETITBOIS, R. HIGGINS, u. M. JAQUES, (1991 c)
Adhaerence of Streptococcus suis capsular type 2 to porcine lung sektions
Can. J. Vet. Res.55, 302 – 304
GOTTSCHALK, M., R. HIGGINS, u M. BOUDREAU (1993)
Use of polyvalent Coagglutination reagents for Serotyping of Streptococcus suis
J. Clin. Microbiol. 31, 2192 - 2194
GOTTSCHALK, M., S. LACOUTURE a. J. D. DUBREUIL (1995)
Characterization of Streptococcus suis capsular type 2 haemolysin
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Production of virulence-related proteins by Canadian strains of Streptococcus suis
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Genomic relatedness among reference strains of different Streptococcus suis
serotypes
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HAMPSON, D. J., D. J. TROTT, I. L. CLARKE, C. G. MWANIKI u. I. D. ROBERTSON
(1993)
Population structure of Australian Isolates of Streptococcus suis
J. Clin. Microbiol.31, 2895 - 2900
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Oligosaccharide-Receptor Interaction of the Galα1-4Gal binding adhesin of
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Plasmid transformation in Bacillus subtilis. Effekts of the insertion of Bacillus subtilis
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Identification, purification and characteization of a thiol – activated hemolysin
(Suilysin) of Streptococcus suis
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JACOBS, A. A. C., VAN DEN BERG, J. C. BAARS, B. NIELSEN u. L. W.
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Production of the suilysin, the thio-activated haemolysin of Streptococcus suis, by
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JACOBS, A. A. C., VAN DEN BERG, A. J. G. u. P. L. W. LOEFFEN (1996)
Protection of experimentally infected pigs by suilysin, the thiol – activated haemolysin
of Streptococcus suis
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JANSEN, J., u. C. A. VAN DORSSEN (1951)
Meningo – Encephalitis bij varkens door streptokokken
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Systemische Infektion durch Streptococcus suis
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Nucleic acid hybridization af group N and group D streptococci
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Hemagglutination activity of group B, C, D and G Streptococci: Demonstration of
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R - und S – Streptokokeninfektionen beim Schwein
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Epithelial invasion and cell lysis by virulent strains of Streptococcus suis is enhanced
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Hybridization analysis of the gene encoding a hemolysin (suilysin) of Streptococcus
suis type 2: evidence for the absence of the gene in some isolates
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Detektion of genomic heterogenity in Streptococcus suis isolates by DNA restriktion
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Molekular-Analysis by pulsed-field gel elektrophoresis and antibiogram of
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Enzymatic amplification of beta-globulin genomic sequences and restriction site
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Characterization of the gene encoding suilysin from Streptococcus suis and
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SEGURA, M., P. CLEROUX u. M. GOTTSCHALK (1998)
Streptococcus suis and group B Streptococcus differ in their interactions with murine
macrophages
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SIHVONEN, L., D. N. KURL u.J. HENRICHSE (1988)
Streptococcus suis isolated from pigs in Finnland
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Cloning and nucleotide sequence of the gene encoding the 136 – kilodalten surface
protein (Muramidase – released protein) of Streptococcus suis type 2
Infect. Immun. 60, 2361 – 2367
SMITH, E: H., F. H. REEK, U. VECHT, A. L. J. GIELKENS a. M. A. SMITS (1993)
Repeats in an extracellular protein of weakly phathogenic strains of Streptococcus
suis type 2 are absent in pathogenic strains
Infect. Immun 61,3318 - 3326
SMITH, E: H., U. VECHT, H. J. WISSELINK, N. STOCKHOFE-ZURWIEDEN, Y.
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Mutants of Streptococcus suis types 1 and 2 impaired in expression of Muramidase-
released protein an Extracellular protein induce disease in newborn germfree pigs
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Anhang
131
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Virulent strains of Streptococcus suis Serotype 2 and highly virulent Strains of
Streptococcus suis Serotyp 1 can be recognized by a unique ribotype profile
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SMITH, E: H., V. VEERBERGEN, J. van der VELDE. M. DAMMAN, J. WISSELINK,
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The cps genes of Streptococcus suis serotypes 1,2 and 9: development of rapid
serotype-specific PCR assays
J. Clin. Microbiol.37, 3146 - 3152
SMITH, E: H., M. DAMMAN . J. van der VELDE F. WAGENAAR, J. WISSELINK, U.
VECHT, N. STOCKHOFE-ZURWIEDEN , a. M. A. SMITS (1999)
Identification and characterization of the cps locus of Streptococcus suis serotyp 2:
the capsule protects against phagocytosis and is an important virulence factor
Infect. Immun. 67, 1750 – 1756
STAATS,J., B. L. PLATTNER, J. NIETFELD, S. DRITZ a. M. M. CHENGAPPA
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Use of ribotyping and hemolysin activity to identify highly virulent Streptococcus suis
type 2 Isolates
J. Clin. Microbiol. 36, 15 – 19
STAATS,J.C., B. L. PLATTNER, G. C. STEWART a. M. M. CHENGAPPA (1999)
Presence of the Streptococcus suis suilysin gene and expression of MRP and EF
correlates with high virulence in Streptococcus suis serotype 2 isolates
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SZANCER, J. u. U. VECHT (1996)
Evaluation of Penethamate for the treatment of experimentally induced
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TIKKANEN, K., J. HAYRINEN, S. PELKONEN u. J. FINNE (1995)
Immunoblot analysis of bacterial polysaccharides: application to the type-specific
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Isolation of Streptococcus from diseased pigs in Canada
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Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamid gels to nitrocellulose sheets:
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Streptococcus suis Infections in pigs in The Netherlands Part I
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VECHT, U., J. P. ARENDS, E. J. van der MOLEN u. L. A. M. G. van LEENGOED
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Differences in virulence between two strains of Streptococcus suis type 2 after
experimentally induced infection of newborn germ-free pigs
Am. J. Vet. Res. 50, 1037 - 1043
VECHT, U., H. J. WISSELINK, M. L. JELLEMA u. H. E. SMITH (1991)
Identifikation of two proteins associated with virulence of Streptococcus suis type 2
Infect. Immun. 59, 3156 - 3162
VECHT, U., H. J. WISSELINK, J. E. VAN DIJK u. H. E. SMITH (1992)
Virulence of Streptococcus suis type 2 strains in newborn germfree pigs depends on
phenotype
Infect. Immun., 60, 550 - 556
VECHT, U., N. STOCKHOFE-ZURWIEDEN, B. J. TETENBURG, H. J. WISSELINK
u. H. E. SMITH (1997)
Virulence of Streptococcus suis type 2 for mice and pigs appeared host-specific
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WAACK, T.,1996
Bakteriologische Untersuchungen zum Vorkommen von Streptococcus suis beim
Schwein
Diss. Vet. Med. TiHo Hannover
WILLIAMS, A. E. (1990)
Relationship between intracellular survival in macrophages and pathogenicity of
Streptococcus suis type 2 isolates
Microbiol. Pathogen. 8, 189 - 196
Anhang
134
WINDSOR, R. S., (1977)
Meningitis in pigs caused by Streptococcus sui type II
Vet. Rec. 101, 378 – 379
WINDSOR, R. S., u. S. D. ELLIOT (1975)
Streptococcal infection in young pigs IV. An outbreak of streptococcal meningitis in
weaned pigs
J. Hyg. Camb. 75, 69 – 78
Anhang
135
9 Anhang9.1 Chemikalien
A. bidest., RNase-frei SIGMA, Deisenhofen
Acrylamid SERVA, Heidelberg
BCIP (5-Bromo-4-chlor-3-indolyl-phosphat-p-Toluidin) SIGMA, Deisenhofen
Bisacrylamid SERVA, Heidelberg
Agarose GIBCO, Eggenstein
Borsäure SIGMA, Deisenhofen
Bromphenolblau SIGMA, Deisenhofen
Chloramphenicol SIGMA, Deisenhofen
CaCl2 (Kalziumchlorid) SIGMA, Deisenhofen
Coomassie Brilliant Blue SIGMA, Deisenhofen
dATP32 NEN, Boston, MA, USA
EDTA SIGMA, Deisenhofen
Essigsäure ROTH, Karlsruhe
Ethidiumbromid SIGMA, Deisenhofen
Ethanol, unvergällt ELCH-Apotheke, Hann.
Ethanol, vergällt ROTH, Karlsruhe
Glycin SIGMA, Deisenhofen
Glyzerin ROTH, Karlsruhe
HCl ROTH, Karlsruhe
H3PO4 (Phosphorsäure) ROTH, Karlsruhe
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosid) ROTH, Karlsruhe
Isopropanol ROTH, Karlsruhe
Laurylsulfat (SDS) SIGMA, Deisenhofen
Magnesiumchlorid (MgCl2) GIBCO, Eggenstein
Natriumacetat (Na-Acetat) SIGMA, Deisenhofen
Na2HPO4 SIGMA, Deisenhofen
Natriumzitrat SIGMA, Deisenhofen
NaCl SIGMA, Deisenhofen
NaOH SIGMA, Deisenhofen
Anhang
136
Natriumhydrogencarbonat SIGMA, Deisenhofen
Phenol (Roti -Phenol, TE-equilibriert) ROTH, Karlsruhe
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan SIGMA, Deisenhofen
Anhang
137
9.2 Verwendete GerätschaftenBioRad MultiAnalyst-System BioRad, München
PFGE-Gerät CHEF DR III BioRad, München
Power Supply, PowerPac 300 BioRad, München
Horizontal Elektrophorese-Kammer HORIZON 58 Gibco, Eggenstein
Filterpapier Gel-Blotting-Papier Schleicher und Schuell
Film Kodak X-OMAT AR Sigma, Deisenhofen
GeneClean II Kit Bio 101 Dianova, Hamburg
Mini Hybridisation Oven Appligene, Illkirch Frankreich
Multi-Block Heater Lab-Line Instr.,Illinois, USA
Nylonmembran Positive Membran Appligene, Illkirch Frankreich
Ofen Booskamp, Wuppertal
Parafilm American National Can, USA
Polaroid-Kamera Polaroid-System DS-34, Angewandte
gentechnologische Systeme GmbH, Heidelberg
Schütler Cello Shaker Variospeed BIOTEC-Fischer
Spektralphotometer Ultrospec III Pharmacia, Freiburg
UV-Transilluminator GE-TFX-20M,312nm Filter Angewandte
gentechnologische Systeme GmbH, Heidelberg
Vortex Genie 2 Bender und Hobein, Zürich,Schweiz
Wasserbad GFL, Burgwedel
Zentrifuge Hermle ZK 2400K Hermle,
Eppendorf Centrifuge 5415 C Eppendorf
-20°C Gefrierschrank Liebherr, Ochsenhausen
-70°C Gefriertruhe GFL, Burgwedel
CO2—Inkubationsschrank Cellstar NUNC
Anhang
138
9.3 Verzeichnis der Isolate und deren Charakteritiken
Anhang
139
Anhang
140
Anhang
141
9.4 TabellenverzeichnisTab 1: Morphologie und kulturelles Verhalten von Sc. suis 12
Tab 2: Biochemisches Verhalten von Sc. suis 13
Tab 3.: Unterschiedliche charakteristische biochemische Reaktionen zur
Identifizierung von Sc. suis 14
Tab 4: Sc. suis–Biotypen nach DEVRIESE et al. (1991) 15
Tab 5: EF-Protein-Varianten bei Sc. suis (Vecht et al. 1993). 30
Tab 6: Übersicht über hämolytische Aktivitäten von Sc. suis-
Referenzstämmen (FEDER et al. 1994) 32
Tab 7: Herkunft von 92 Isolaten, die für diese Arbeit zur Verfügung gestellt
wurden 38
Tab 8: Bezeichnung und Herkunft der untersuchten Referenzstämme 39
Tab 9: Beziehung zwischen Serotyp und Herkunft der Sc. suis Isolate. 64
Tab 10: Häufigkeit der Hämolysin-Expression bei den untersuchten Isolaten 65
Tab 11: Auftreten der verschiedenen MRP/EF Phänotypen bei den
untersuchten Sc. suis – Isolaten 67
Tab.12 : Häufigkeit und Ausprägung des Hämolysin-Genotyp und –Phänotyp 85
Tab.13: Beziehungen zwischen den Adhärenzeigenschaften und deren
Zuordnung zu den Grossgruppen 99
Tab 14: Odds ratio und Wahrscheinlichkeitsüberschreitung der
phänotypischen Merkmale im χ2–Test bezogen auf die Herkunft der
Isolate. 102
Tab 15: Odds ratio und Wahrscheinlichkeitsüberschreitung des Genotyps
im χ2–Test bezogen auf die Herkunft der Isolate. 103
9.5 AbbildAbb. 1: Gra
„gene
Abb. 2: Bez
Abb. 3-8: NAbb. 9: Bez
Isolat
Abb. 10: Be
Isolat
Abb. 11-13:Abb. 14: Be
der S
Abb. 15: Er
Abb. 16: Ma
nach
Abb. 17: Ma
nach
Abb. 18: Ma
nach
Abb. 19: Ma
nach
Abb. 20: Ge
Stäm
Abb. 21: Ge
Stäm
Abb. 22: Gr
Abb. 23a: Anach
Abb. 23b.: ch
Abb. 24a: Anach
Abb. 24b.: chrom
Anhang
142
ungsverzeichnisfische Darstellung der Erstellung eines
tischen Fingerabdruck“ 18
iehungen zwischen dem Serotyp und der Herkunft der Isolate 62
achweis von MRP mittels Immunoblot-Analyse 64-66
iehung zwischen dem MRP/EF-Phänotyp und der Herkunft der
e in Prozent 67
ziehungen zwischen der Hämolysin-Expression der Sc. suis
e mit deren Herkunft 69
Adhärenz von Sc. suis an humane HEp 2–Zellen 70-71
ziehungen zwischen der Adhärenz an HEp2– und ST– Zellen
c. suis Isolate und ihrer Herkunft 72
stellung eines spezifischen Grössenstandards für die PFGE 73
krorestriktionsanalyse von Sc. suis-Serotyp 2 Stämmen
Restriktionsverdau mit ApaI 75
krorestriktionsanalyse der Sc. suis-Serotyp 2 Stämme
Restriktionsverdau mit SmaI 76
krorestriktionsanalyse der Sc. suis-Serotyp 9 Stämme
Restriktionsverdau mit SmaI 77
krorestriktionsanalyse von Sc. suis-Serotyp 9 Stämmen
Restriktionsverdau mit ApaI 78
notypische Verwandtschaft der verwendeten Sc. suis
me dargestellt als Dendrogramm (ApaI) 80
notypische Verwandtschaft der verwendeten Sc. suis
me dargestellt als Dendrogramm (SmaI) 81
össenbestimmung der Hämolysin-Sonde 83
uftrennung genomischer DNA von Sc. suis
Restriktionsenzymverdau mittels PFGE 84
Repräsentative Hybridisierung von Makrorestriktionen
romosomaler DNA von Sc. suis-Isolaten 85
uftrennung der DNA-Fragmente von Sc. suis Isolaten
Restriktionsverdau mit ApaI mittels PFGE 86
Repräsentative Hybridisierung von Makrorestriktionen
osomaler DNA von Sc. suis-Isolaten 87
Anhang
143
Abb. 25: Beziehungen zwischen der Herkunft der Isolate und deren
Zuordnung zu den Grossgruppen A1SmaI,, A2SmaI,, B1SmaI,, B2SmaI 89
Abb. 26: Beziehungen zwischen der Herkunft der Isolate und deren
Zuordnung zu den Grossgruppen A1ApaI,, A2ApaI,, B1ApaI,, B2ApaI 90
Abb. 27: Beziehungen zwischen dem Serotyp der Isolate und deren
Zuordnung zu den Grossgruppen A1SmaI,, A2SmaI,, B1SmaI,, B2SmaI 91
Abb. 28: Beziehungen zwischen dem Serotyp der Isolate und deren
Zuordnung zu den Grossgruppen A1ApaI,, A2ApaI,, B1ApaI,, B2ApaI 92
Abb. 29: Beziehungen zwischen dem MRP/EF-Phänotyp der Isolate und
deren Zuordnung zu den Grossgruppen A1SmaI,, A2SmaI,, B1SmaI,, B2SmaI 93
Abb. 30: Beziehungen zwischen dem MRP/EF-Phänotyp Herkunft der
Isolate und deren Zuordnung zu den Grossgruppen A1ApaI,, A2ApaI,,
B1ApaI,, B2ApaI 94
Abb. 31: Beziehungen zwischen der Hämolysinproduktion der Isolate und
deren Zuordnung zu den Grossgruppen A1SmaI,, A2SmaI,, B1SmaI,, B2SmaI 95
Abb. 32: Beziehungen zwischen der Hämolysinproduktion der Isolate und und
deren Zuordnung zu den Grossgruppen A1ApaI,, A2ApaI,, B1ApaI,, B2ApaI 96
Abb. 33: Beziehungen zwischen MRP+/EF+ und Hämolysin+ Isolate und und
deren Zuordnung zu den Grossgruppen 98
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. P. VALENTIN-WEIGAND für die Überlassung desThemas und die jederzeit gewährte Hilfs- und Diskussionsbereitschaft sowie Unterstützungbei der Durchführung dieser Arbeit.
Herrn Prof. Dr. L. KREIENBROCK und Herrn Dr.R. MEYER aus dem Institut fürBometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der TiHo Hannover möchteich herzlich für ihre große Unterstützung bei Lösung und Durchführung desDatenverarbeitungsproblemes danken.
Frau Dr. H. SMITH und Herrn Dr. H. WISSELINK aus dem Institute for Animal Science andHealth, Lelystad (ID-DLO Lelystad, Holland) möchte ich danken für ihre großeHilfsbereitschaft bei der Durchführung der Serotypisierung und Ermittlung des MRP/EF-Status.
Herrn Prof. Dr. S. SCHWARZ am Institut für Kleintierforschung Celle/Merbitz der FALBraunschweig-Völkerode gilt mein Dank für seine Unterstützung und seinen Rat beiDurchführung und Auswertung der PFGE.
Herrn Prof. Dr. AMTSBERG möchte ich danken für das Sammeln und Überlassen derunzähligen Isolate.
Bei Herrn Dr. R. GOETHE möchte ich mich für seine immense Geduld bedanken, die eraufbrachte, um mich in die Welt der „molekularbiologischen Forschung“ einzuweihen.
Dank an J. Matusch für seine Bemühungen, mich mit den tiefen Mysterien der Götter „EDV“,„Grafik“ und „Layout“ vertraut zu machen. Ohne Erfolg!
Bei B. Schümann und M. Kühnel für die verzweifelten Versuche, die Rechtschreibung in einevertretbare Form zu bringen.
Ferner möchte ich mich bei allen Mit-Doktoranden und Institutsangehörigen,insbesondere S. Jeckstadt, N. Winterhoff, P. Grüning, S. Herbst, R. Schmidt, S.Thiede, T. Rehm, C. Winterhoff, B. Strommenger, N. Baltes, M. Homuth, K.Strutzberg und besonders bei Fr. Dr. G. Kirpal für die moralische und tatkräftigeUntersützung und für das sehr gute Arbeitsklima von Anfang bis Ende dieser Arbeitbedanken.