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Klinische Mikrobiologie
AKH Wien
> Wiener Intensivmedizinische Tage 2006 <
Neues aus der Sepsis-Diagnostik
Petra Apfalter
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Kennen Sie dieses Szenario?
Fiebernder, vortherapierter ICU-Patient
Infektion?Sepsis = SIRS durch Infektion
Wenn ja, welche?
Gefragt wäre rasch ein relevanter Befund Erreger, Empfindlichkeitsprofil
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Warum ist Sepsis-diagnostik wichtig?
Haupttodesursache auf nichtkardiologischen ICU
Direkte Behandlungskosten in D: 1,1 bis 2,45 Milliarden Euro/Jahr
Therapie oft empirisch 11% - 46% ICU Patienten initial falsch therapiert 1, 2, 3
Zeitfaktor essentiell für Outcome
Letalität hoch (40%)1 Kollef M, Chest, 1999
2 Garnacho-Montero J, CCM, 2003 3 Byl B, CID, 1999
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Von welchen Infektionen geht eine Sepsis am häufigsten aus? Lunge 44.0% Harnwege 9.1% Bauchorgane 8.6% Wunden und Weichteile 6.6% Katheter 2.2% ZNS 0.8% Herzklappen 0.6% Andere (z.B. Sinus) 10.8%
Bakterien im Blut (positive Blutkultur)17.3%
(Angus DC, Crit Care Med 2001; 29:1303-1310)
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Anteil positiver Blutkulturen AKH Wien 2005
n=15.636
88%
12%
Butkulturen ohne Wachstum Positive Blutkulturen
Krankenhaushygiene, AKH Wien
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Worum es heute geht Konventionelle Diagnostik
Blutkultur (BK)
Diagnostik - NeuPNA-FISH aus BKLight Cycler®SeptiFAST aus EDTA-BlutrDNA-Sequenzanalyse
Diagnostik - In Entwicklung
Chip-Techniken
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Alt, aber gut: die BK
Blutmenge ist DER entscheidende Faktor!
Bakteriämie: Erwachsene <1-10 KBE/ml Kinder 10->100 KBE/ml
Gesamtvolumen: 15-20 ml (Kinder 1-5 ml)
Standard: 1 aer. + 1anaer. Fl. od. 2 aer. Flaschen
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Wann BK abnehmen?
Möglichst früh bei Symptomen, die auf eine Sepsis hinweisen
Vor Behandlungsbeginn, ansonsten am Ende eines Antibiotika – DI
2-3 Kulturen in rascher Folge
Bei negativem Ergebnis nach 24h WH!
Keine „Überwachungs-BK“
Keine „follow-up“ BK nach Diagnosestellung
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Diagnostischer Zeitrahmen BK
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7Tag 28
PILZE
Blutkultur
GramID + AB
Empirische AB-Therapie
Anpassen – De-Eskalieren
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Worum es heute geht Konventionelle Diagnostik
Blutkultur (BK)
NeuPNA-FISH aus BKLight Cycler® SeptiFAST aus EDTA-BlutrDNA-Sequenzanalyse
In Entwicklung
Chip-Techniken
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PNA-FISH
Peptide Nucleic Acid Fluorescence In Situ Hybridization
Fluoreszierende PNA Sonde hybridisiert mit ribosomaler RNA
Blut-Kultur Identifikation in 2.5 h
Für in vitro Diagnostik
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Diagnostischer Zeitrahmen PNA-FISH vs. BK: - 1d
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7Tag
28 -> PILZE
Blutkultur
GramID + AB
Empirische AB-TherapieAnpassen – De-Eskalieren
!
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PNA-FISH: Target rRNA
Hoch konserviert103-105 Kopien/Zelle (natürliche Amplifikation)
rRNA Sequenzen = taxonomische Referenz
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Schnell-ID positiver BK
S. aureus PNA FISH
Yeast
GPCC
Gram Gram Fbg.Fbg.
GPCPC
C. albicans PNA FISH
E. faecalis PNA FISH
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Light Cycler® SeptiFAST aus EDTA-Blut
Multiplex Real-time PCR am Light Cycler 2.0 (Roche)
Dia
gn
osti
cs
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The LightCycler SeptiFast Test Hypothesis: DNA in human blood?
KulturPCR
human DNA
freie DNA
lebende Bakterien/Pilze
tote Bakterien/Pilze
phagozytierte Bakterien/Pilze
lebende Bakterien/Pilze
lebende, phagozytierte Bakterien/Pilze (?)
Dia
gn
osti
cs
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Single Copy Genes• No enhancement• Less investigated
Spacer Region (ITS*) • Multiple copies• Well investigated• Especially suited for
Species testingRibosomal Genes• Multiple copies• Well investigated• Especially suited for
Group testing* ITS = internal transcribed spacer
The LightCycler SeptiFast Test Target Region – Internal Transcribed Spacer
Multiple specific HybProbe probes
Multiple specific HybProbe probes D
iag
nosti
cs
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Das HybProbe Prinzip 2 Sonden = benachbart
hybridisierendes Oligopaar
Signal (FRET) nur wenn beide nebeneinander binden
Sequenz-spezifische Detektion +
Mutationsanalyse in der Hybprobe-Targetsequenz durch Schmelzkurvenanalyse möglich!
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The LightCycler SeptiFast Test Negative Control / Internal Control
- MagNA Lyser Instrument
- Sample Preparation
Lig
htC
ycl
er
In
str
um
en
t
Sample or Negative Control
Purified NA
Internal Control
Lysis
Extraction
The LightCycler SeptiFast
Kit
50 µl eluate each
Gram (-)
Gram (+)
Fungi
Dia
gn
osti
cs
![Page 20: Klinische Mikrobiologie AKH Wien > Wiener Intensivmedizinische Tage 2006 < Neues aus der Sepsis-Diagnostik Petra Apfalter](https://reader036.vdokument.com/reader036/viewer/2022062303/55204d8049795902118d2a1c/html5/thumbnails/20.jpg)
The LightCycler SeptiFast Test
Channel distribution Gram (+)
t [°C]
CoNS from SML
Staphylococcus aureus
S. spp from SML (670)
Streptococcus pneumoniae
S.pneu
S.aureus
S.spp
S. spp. from SML (610)
CoNS
S.spp
Internal ControlEnterococcus faeciumEnterococcus faecalis
IC E.fum E.fis
Channel 610
Channel 640
Channel 670
Channel 705
Dia
gn
osti
cs
![Page 21: Klinische Mikrobiologie AKH Wien > Wiener Intensivmedizinische Tage 2006 < Neues aus der Sepsis-Diagnostik Petra Apfalter](https://reader036.vdokument.com/reader036/viewer/2022062303/55204d8049795902118d2a1c/html5/thumbnails/21.jpg)
Gram (-)
•Enterobacter (cloacae / aerog.)
•Klebsiella (pneumoniae/oxytoca)
•Escherichia coli
•Serratia marcescens
•Proteus mirabilis•Pseudomonas aeruginosa
•Acinetobacter baumannii 3
•Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) Fungi•Candida albicans
•Candida tropicalis
•Candida parapsilosis
•Candida glabrata
•Candida krusei
•Aspergillus fumigatus
•Streptococcus spp. 2
•Enterococcus faecium•Enterococcus faecalis
• Each bullet point represents a specific melting point, species in brackets are not differentiated
•Staphylococcus aureus•CoNS 1
•Strep. pneumoniae
SeptiFast Master List
1 Coagulase Negative Staphylococci (Species which represent the group are listed in the PI).
2 Species which represent the group Streptococcus spp. are listed in the
PI.
3 Species referred as A. calcoaceticus- A.baumannii are not detected.
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Keimspektrum AKH Wien 2005Sepi 25%Sau 12%
46
21
6 6 4 52
05
101520253035404550
Staphylo
kokken
Entero
bakterie
n
Streptoko
kken
Enteroko
kken
Pseudomonas
Candida
Andere
E. coli 9%Klebsiella 5%Enterobacter 3%
%
Krankenhaushygiene, AKH Wien
![Page 23: Klinische Mikrobiologie AKH Wien > Wiener Intensivmedizinische Tage 2006 < Neues aus der Sepsis-Diagnostik Petra Apfalter](https://reader036.vdokument.com/reader036/viewer/2022062303/55204d8049795902118d2a1c/html5/thumbnails/23.jpg)
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7Tag
28 -> PILZE
Blutkultur
GramID + AB
Empirische AB-Therapie
Anpassen – De-Eskalieren
!
6 h
SeptiFAST
![Page 24: Klinische Mikrobiologie AKH Wien > Wiener Intensivmedizinische Tage 2006 < Neues aus der Sepsis-Diagnostik Petra Apfalter](https://reader036.vdokument.com/reader036/viewer/2022062303/55204d8049795902118d2a1c/html5/thumbnails/24.jpg)
rDNA-Sequenzanalyse
Real-time PCR + Sequenzierung
![Page 25: Klinische Mikrobiologie AKH Wien > Wiener Intensivmedizinische Tage 2006 < Neues aus der Sepsis-Diagnostik Petra Apfalter](https://reader036.vdokument.com/reader036/viewer/2022062303/55204d8049795902118d2a1c/html5/thumbnails/25.jpg)
rDNA-Sequenzanalyse
16S rDNA für Bakterien
18S, 28S rDNA & ITS1 & 2 Region für Pilze
Direkt von Patientenprobe
Amplifikation mit universellen Primern
Sequenzieren der Amplicons
Alignment mit Datenbank
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Real-time PCR-Amplifikation 16S rDNA
Universelle Primer
5S16S tRNA tRNA 23SrDNA Operon:
1. Amplifikation eines Pools von 16S rDNA Fragmenten mittels 16S rDNA-spezifischen Primern
341f
518r 907r
3. Reamplifikation mittels 16S rDNA-spezifischen Primern
341fGC
518r
907r
GC-clamp
341f
25%
55%
Figur 1: Experimentelle Schritte in der Identifizierung einer bakteriellen Gemeinschaft
16S rDNA insert
341f
907r
plasmid
SP6
T7518r
plasmid
2. Klonierung der 16S rDNA Fragmente und Amplifikation der Inserts mitels Plasmid-spezifischen
Primern
3. Screenen nach verschiedenen Klonen und 4. Analyse der bakteriellen Gemeinschaften
mittels DGGE3. 4.
rDNA Operon
16S rDNA = universelles bakterielles Gen
Konservierte Regionen … Primertarget
Hypervariable Regionen (zB V3) … Phylogenetische Analyse
Zielgene
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Sequenzreaktion & Aufreinigung
MicroSeq KomponentendRhodamine dye Terminatoren, cycle sequencing
G
A
C T
dR110
dR6G
dTAMRA dROX
Überblick Sequenzreaktion
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Editieren der Sequenz
Analyse der Daten
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TechnikAnfordern:
Besuchen Sie uns!http://www.meduniwien.ac.at/akh/
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Worum es heute geht Konventionelle Diagnostik
Blutkultur (BK)
NeuPNA-FISH aus BKSeptiFAST aus EDTA-BlutrDNA-Sequenzanalyse
In Entwicklung
Chip-Techniken
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Microarrays
Detektion hunderter Mikroorganismen simultan (100.000e Gene)
Detektion wichtiger Resistenzgene Bestimmung von verschiedenen Genotypen,
Mutationen Quantifikation möglich
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Oligo-shotgun-ChipAustrian Research Center Seibersdorf
genomic 16S rRNA gene- fragments
Cloning of interesting genes in
E.coli ( plasmids) Amplicons(oligos) of all gene fragments spotted onto chip = probes
DNA* extraction from specimen (*incl. unknown bacterial DNA)
-> PCR (whole bacterial DNA tagged with Cy3)
Hybridization
Patterns of green spots identify
species + resistence present in sample
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Diagnostischer Peptidchip Anwendung in
Körperflüssigkeiten
Simultane Detektion verschiedener Erreger & Resistenzen:
Protein/Epitop am Chip detektiert spezifische Immunantwort
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Peptidchip - Strategie
Funded by: Co-Operate ViennaWiener Wirtschaftförderungsfond
Collection of Sera Sera from patients (with
bacterial infections) Sera from healthy persons
Prediction of Bacterial Antigens in silico
Whole genome B cell epitopes
Bacterial Epitope Identification Peptide Synthesis Peptide ELISA with Sera
Validation of Antigens Peptide ELISA Peptide Chip
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