Kultivierung von E. coli HisN-GatDH und Rhodobacter sphaeroides D
im Fermenter zur Produktion von Galaktitol-Dehydrogenase
http://www.denniskunkel.com/ http://www.joachim-
czichos.de/
- 2 -
Einleitung:
Die Synthese optisch aktiver Alkohole gewinnt auf Grund der spezifischen, chiralen Eigenschaften dieser
Alkohole zunehmend an Bedeutung. Verwendet werden können sie als Ausgangssubstanzen (chiral building
blocks) für Synthesen von Pharmazeutika, Pheromonen und Pestiziden. Die biologische Aktivität solcher
Verbindungen hängt von ihrer Konfiguration ab, weshalb die richtige chirale Verbindung als Ausgangssubstrat
zur Synthese von entscheidender Bedeutung ist.
Rhodobacter sphaeroides D bildet neben anderen Dehydrogenasen auch Galaktitol-Dehydrogenase (GatDH), ein
Enzym mit breiter Subtratspezifität, das neben der Galaktitol-Oxidation auch eine Reihe von Hydroxyketonen zu
weitgehend enantiomerenreinen zweiwertigen Alkoholen reduziert.
Im Versuch soll die Herstellung von 1,2-Propandiol aus 1-Hydroxy-2-Propanon durchgeführt werden. Dabei wird NADH2 zu NAD oxidiert. Als Regenerationssystem verwendet man die Formiatdehydrogenase, die aus
Formiat unter NAD-Reduktion CO2 bildet. Das Regenerationssystem hat drei Vorteile: a) Formiat ist billig, b)
FDH ist preiswert und c) das CO2 verschwindet als Gas aus der Lösung und vermeidet so eine
Endprodukthemmung der Reaktion.
Für die Bereitstellung der GatDH zu Produktionszwecken werden Enzympräparationen aus Fermenter-Kulturen
von Rhodobacter sphaeroides D und E. coli HisN-GatDH hergestellt. In den E. coli Stamm BL21(DE3)Gold
wurde ein GatDH-Gen mit einem N-terminalen His6-Tag einkloniert, um eine höhere Enzymproduktion bei
erleichterter Reinigung zu erzielen.
NAD NADH2O
HOHO
OH
OH
OH
OHHOHO
OH
OH
OH
Galaktitol L-Tagatose
Galaktitol-DH
OHC
CC
HOH
OHC
CC
O
NADH + H+ NAD +
1-Hydroxy-2-Propanon (Hydroxyaceton)
1,2-(S)-Propandiol
GatDH
pH 6,5
- 3 -
Exponentielles Wachstum einer Kultur
Das Wachstum einer Bakterien- oder Hefekultur verläuft nicht linear, sondern die Anzahl und Biomasse der
Mikroorganismen nehmen exponentiell zu, nämlich mit jeder Generation um den Faktor zwei (21, 22,...). Dabei
entstehen innerhalb von 10 Generationen aus einer Zelle etwa 1000 (210 = 1024) Nachkommen, innerhalb von 20
Generationen etwa 1 Million usw. Tatsächlich wird das Wachstum fast immer und schnell durch Mangel an
Nährstoffen begrenzt. Normalerweise teilen sich die Zellen in einer Kultur nicht synchron. Das heißt, die
Zellzahl nimmt nicht ruckartig entsprechend den Zweierpotenzen zu, sondern kontinuierlich.
Ganz sicher gilt dieses für den Zuwachs an Biomasse (meist als Trockenmasse bestimmt), Protein oder gebildete
Produkte, denn die Zellen wachsen, bevor sie sich teilen. Neugebildete Enzyme erhöhen sofort die
Stoffwechselaktivität und damit den zweiten Zuwachs. Bei unendlich kurzen Zeitabständen würde als
Zuwachsfaktor die natürliche Zahl e = 2.718... erreicht, die zur Beschreibung von exponentiellen
Wachstumsprozessen oft benötigt wird (oft in Form des natürlichen Logarithmus zur Basis e: loge = ln, wobei
gilt: ln e = 1).
Die mathematische Beschreibung von Wachstumsprozessen ist einfach. Der momentane Zuwachs an x
(Biomasse, Protein etc.) zu einem Zeitpunkt t wird geschrieben als dx/dt und hängt ab von der aktuellen
vorhandenen Menge an x und der Wachstumsrate µ. Er wird beschrieben durch:
dx/dt = µ x [1] Integriert über einen größeren Zeitraum von t0 bis t (Kontostand nach einiger Zeit) ergibt sich unter Verwendung des natürlichen Logarithmus: ln(xt) = ln(x0) + µ (t-t0) [2] bzw. In exponentieller Schreibweise : xt = x0
. e µ(t-t0) [3]
- 4 -
Abbildung 2: Wachstumskurve einer Batch-Kultur
Will man aus einem gemessenen Zuwachs die Wachstumsrate bestimmen, kann die logarithmische Form der Gleichung folgendermaßen umgeformt werden: ln(xt/x0) ln(xt) – ln (x0) µ = _____________ = ___________________ t – t0 t – t0 [4] Für die Verdopplungszeit td (die Zeit t – t0, für die xt/x0 = 2 ist) ergibt sich einfach: ln 2 µ = __________
td [5] bzw. ln 2 td = __________
µ [6]
Wachstumskurve
Zeitachse (linear)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Mes
swer
te (
loga
rith
mis
ch)
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
2
3
4
5
6
7
8
9
0.1
1
10
xt
x0
t0 t
µ =ln xt - ln x0
t - t0
Anlauf- (lag)
Phase
logarithmische (log)
Phase
stationäre
Phase
Absterbe-
Phase
- 5 -
Als Ertrag kann die Biomasse, die Produktmenge oder in diesem Fall die Gesamtunits an GatDH aus dieser Fermentation angegeben werden.
Der Ertragskoeffizient ergibt sich dann aus erhaltenem Produkt pro eingesetztem Substrat, d.h. Units GatDH
pro g verbrauchtem Malat.
Aufgabe:
In einem Fermenter wird Rhodobacter sphaeroides D kultiviert und dabei die Wachstumsrate, die
Verdopplungszeit und die Gesamtaktivität (Ausbeute/Ertrag) bestimmt. Daneben werden die Substratabnahme,
die Bakterienmasse und die Entwicklung der Galaktitol-Dehydrogenase-Aktivität gemessen und in der
Auswertung die Wachstumsrate, die Verdopplungszeit und der Ertragskoeffizient bestimmt. Die Galaktitol-
Dehydrogenase wird im Rohektrakt für die Produktion von 1,2-(S)-Propandiol eingesetzt.
Vorbereitung:
Die Praktikanten sollen sich anhand der angegebenen Literatur über das Funktionsprinzip von Fermentern, das
bakterielle Wachstum und die Galaktitol-Dehydrogenase informieren.
Literatur:
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Stahl, D.A., Clark, D.P. (2013) Brock Mikrobiologie, Pearson, San
Francisco, CA, USA
Fuchs, G. (Hrsg.) („Schlegel“) (2007) Allgemeine Mikrobiologie, Thieme Verlag, Stuttgart
Cypionka, H. (2010) Grundlagen der Mikrobiologie, Springer Verlag, Berlin
Fiechter, A. (1981) Batch and continuous culture of microbial, plant and animal cells. in: Rehm, H.J., Reed, G.
(Hrsg.): Biotechnology, Vol 1, pp. 453-505, Verlag Chemie, Weinheim F1 35.1
Clark, D.P., Pazdernik, N.J. (2009) Molekulare Biotechnologie, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg
Rennberg, R., (2010) Biotechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg
Antranikian, G. (Hrsg.) (2006), Angewandte Mikrobiologie, Springer Verlag, Berlin
Hass, V.C., Pörtner, R. (2009), Praxis der Bioprozesstechnik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg
Czichos, J. (2004) What's so funny about microbiology, http://www.joachim-czichos.de/
Schneider, K.H., Jäkel, G., Hoffmann, F. und Giffhorn, F. (1995) Enzyme evolution in Rhodobacter
sphaeroides: selection of a mutant expressing a new galactitol dehydrogenase and biochemical characterization
of the enzyme. Microbiology, 141, 1865-1873.
Huwig, A., S. Emmel, G. Jakel, and F. Giffhorn. (1997) Enzymatic synthesis of L-tagatose from galactitol
with galactitol dehydrogenase from Rhodobacter sphaeroides D. Carbohydrate Research 305, 337-339.
Kohring, G.-W., P. Wiehr, M. Jeworski, and F. Giffhorn. (2003). Stereoselective oxidation of aliphatic diols
and reduction of hydroxy-ketones with galactitol dehydrogenase from Rhodobacter sphaeroides D. Commun
Agric Appl Biol Sci. 68, 309-312.
Carius, Y., Christian, H., Faust, A., Zander, U., Klink, B.J., Kornberger, P., Kohring, G.W., Giffhorn, F.,
Scheidig, A.J. (2010) Insight into substrate differentiation of the sugar metabolising enzyme galactitol
dehydrogenase from Rhodobacter sphaeroides D based on the crystal structures of free and substrate bound
enzyme, J. Biol. Chem. 285, 20006-20014
Schmidt, F.R. (2005) Optimization and scale up of industrial fermentation processes. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 68, 425–435.
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Durchführung Vorbereitung:
Der Bioreaktor wird zusammengebaut, mit 1500 ml Nährmedium befüllt und 45 min bei 121°C autoklaviert.
Desweiteren müssen autoklaviert werden:
- ein in Alufolie eingewickelter Trichter zum Animpfen
- drei 500 ml Erlenmeyerkolben zur Probennahme für die Trockengewichts-, Protein-
und GatDH-Bestimmung
Vorkultur:
Die Vorkultur wurde mit einer Einzelkolonie des jeweiligen Stammes beimpft und 24 h auf dem Schüttler
inkubiert. Sie wird im Praktikum von den Betreuern zur Verfügung gestellt.
Kultivierung im Chemostaten (1. Woche E. coli, 2. Woche Rhodobacter):
Kultivierungsbedingungen: Temperatur: E. coli: 28°C,
Rhodobacter: 28°C
Rührerdrehzahl: E. coli: 800 Upm
Rhodobacter: 600 Upm
Belüftung: 2 vvm (Einstellung „3“ am Rotameter bei 1,5 l Volumen)
(vvm: Volumen Luft x Volumen Flüssigkeit-1 x Minute-1)
pH-Kontrolle
(Antischaum-Kontrolle)
Der Fermenter wird nach dem Zeitplan angeimpft und entsprechende Proben gezogen. Isopropylthiogalactosid
(IPTG) nach Zeitplan zur Induktion der GatDH-Bildung in E. coli zugeben. Für die Trockengewichts-
bestimmung werden zunächst 30 ml Kultur und später, wenn die Kultur dicht gewachsen ist, entsprechend
weniger Volumen über einen Filter abgesaugt. Für die O.D.- und Malatbestimmung (Rhodobacter) werden 2 ml
gebraucht: 1 ml zur Extinktionsmessung und 1 ml wird in Reaktionsgefäßen abzentrifugiert. Der Überstand wird
wie beschrieben behandelt und für die spätere Malatbestimmung (Rhodobacter) eingefroren. Eine Probe von 50
ml wird für die GatDH-Aktivitätsuntersuchung genommen, abzentrifugiert und das Pellet eingefroren. Nach 24 h
wird der Fermenter abgeerntet und das gewaschene Pellet aufgeschlossen oder eingefroren. (Das Volumen für
den Aufschluss wird vom Betreuer angegeben.)
Die eingefrorenen Pellets aus der Wachstumskurve werden aufgeschlossen und anschließend die GatDH-
Aktivität und der Proteingehalt für die Entwicklung der Volumen- und spezifischen Aktivität bestimmt. Die
geernteten Zellen nach Abschluss der Fermentation werden aufgeschlossen und die GatDH gereinigt. Mit der
Enzympräparation wird die Reduktion von Hydroxyaceton und/oder 1-Hydroxy-2-Butanon durchgeführt.
Auswertung Das Protokoll sollte im Stil von Veröffentlichungen in FEMS Microbiol. Lett. (jedoch in
deutscher Sprache) geschrieben werden und folgende Daten enthalten: - Wachstumskurve, bei der die OD650, das Trockengewicht, die Malatkonzentration (Rhodobacter) und die
GatDH Volumenaktivität halblogarithmisch gegen die Zeit aufgetragen werden
- Alle Meßwerte und die daraus berechneten Ergebnisse, wie Wachstumsrate, Verdopplungszeit, Ertrag,
Ertragskoeffizient (für Bakterienmasse und GatDH-Aktivität)
- Grafik der Fermentationswerte aus der Iris-Datei
- GatDH-Aufreinigungstabelle und SDS-Gel für Reinheitskontrolle
- HPLC- und GC-Daten der 1-Hydroxy-2-Propanon Reduktion.
Abstract = Zusammenfassung der Ergebnisse, Einleitung = Theoretischer Hintergrund mit Literaturzitaten,
Material und Methoden: nur Änderungen gegenüber dem Script, Ergebnisse: Text, Tabellen und Grafiken,
Diskussion = Würdigung der Ergebnisse vor dem Hintergrund der Literatur mit Zitaten, Literaturverzeichnis)
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Methoden
Nährmedium (Rhodobacter Fermentation):
Malat 9.0 g KH2PO4 1.0 g
NH4Cl 1.0 g
MgSO4*7H2O 0.4 g
NaCl 0.4 g CaCl2*2H2O (autoklavierte Stammlösung) 0.05 g
Spurenelementlösung SL4 1.0 ml
Vitaminlösung 1.0 ml H2O dest ad 1000.0 ml pH 6.8
Antischaum wird zu titriert (poly-1,2-Propandiol in Ethanol, 1:50)
Spurenelementlösung SL 4 (PFENNIG und LIPPERT, 1966; 10-fach konzentriert)
EDTA 5,0 g FeSO4 x 7 H2Odeion 2,0 g
ZnSO4 x 7 H2Odeion 0,1 g
MnCl2 x 4 H2Odeion 0,03 g
H3BO3 0,3 g
CoCl2 x 6 H2Odeion 0,2 g
CuCl2 x 2 H2Odeion 0,01 g
NiCl2 x 5 H2Odeion 0,02 g
Na2MoO4 x 2 H2Odeion 0,03 g
Vitaminlösung (SCHLEGEL, 1985; 10-fach konzentriert)
Biotin 2 mg
Nicotinsäure 20 mg
Thiamin 10 mg
4-Aminobenzoesäure 10 mg
Pantothenat 5 mg
Pyridoxamin 50 mg
Cyanocobalamin 20 mg H2Odeion ad 100 ml
Die Vitaminlösung wird unmittelbar nach der Herstellung sterilfiltriert und anschließend bei 4° C aufbewahrt.
Messung der Bakterienmasse: Die Entwicklung der Bakterienmasse im Bioreaktor wird durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm (E.
coli) oder bei 650 nm (Rhodobacter) verfolgt (1 ml Proben). Die Messung erfolgt gegen steriles Medium. Die
Bakteriensuspension muss gegebenenfalls soweit verdünnt werden, dass die optische Dichte unter 0.3 liegt.
Trockengewichtsbestimmung:
Membranfilter (Porengröße: 0.45 µm) werden über Nacht im Trockenschrank getrocknet und anschließend
ausgewogen. Die Filter werden in die Filtrierapparatur montiert und 30 ml (bei gut gewachsener Kultur
10-5 ml) Bakteriensuspension filtriert. Es wird mit ca 20 ml dest. Wasser gewaschen, ein erkennbares Filtrat
muss vorhanden sein. Anschließend werden die Filter über Nacht im Trockenschrank getrocknet und danach
ausgewogen. Kontrolle: 20 ml dest. Wasser filtrieren.
- 8 -
Bestimmung der Malatkonzentration:
Zur Bestimmung der Malatkonzentration werden 1 ml Proben aus dem Bioreaktor bei 13000 x g in
Reaktionsgefäßen abzentrifugiert und anschließend durch eine Membran mit einer Ausschlussgröße von 10.000
Dalton zentrifugiert, um die Proteine weitgehend abzutrennen. Die gereinigte Probe kann eingefroren oder sofort
mit der HPLC (siehe unten) analysiert werden.
Zellaufschluss für geerntetes Pellet:
Zellaufschluss E. coli:
- Geerntete Zellen 2 x waschen:
- Pellets in 100 ml 20 mM BisTris-Puffer, 25 mM Imidazol (pH 6,5) resuspendieren
15 min bei 5500 x g und 4°C abzentrifugieren
- Pellets in 30 ml 20 mM BisTris-Puffer, 25 mM Imidazol (pH 6,5) resuspendieren,
gelöstes Pellet in 50 ml Falcon geben.
15 min bei 5000 x g, 4°C zentrifugieren
- Pellets wiegen und in 5 ml/g feuchte Zellen 20 mM BisTris-Puffer, 25 mM Imidazol
(pH 6,5) erneut resuspendieren, 1 Spatelspitze DNase zugeben.
- Zellen im Ultraschall (6 x 15 s, 22 Micron mit Zwischenkühlung) aufschließen.
- Zelltrümmer durch 10 minütige Zentrifugation bei 4°C, 13.000 x g abtrennen.
- Rohextrakt abnehmen und erneute 10 min bei 13.000 x g und 4°C in Eppis zentrifugieren.
Gesamtvolumen bestimmen, 100 µl vom Rohextrakt für Aktivitätstest + SDS entnehmen,
Pellet-Probe aufheben
Zellaufschluss Rhodobacter:
Die geernteten Zellen werden zweimal mit 0,02 M Bis-Tris-Puffer, pH 6,5; 1 mM MgCl2 gewaschen und danach
in diesem (3 ml/g feuchte Zellen) resuspendiert. Die Zellen werden in einer vorgekühlten French-Presse (Fa.
SLM Insuments, Inc., Urbana, USA) bei 1100 N/cm2 im zweifachen Durchlauf oder im Ultraschall (6 x 1 min,
22 Micron, mit Zwischenkühlung) aufgeschlossen. Die Zelltrümmer aus den GatDH-Proben der
Wachstumskurve werden bei 13.000 x g in Reaktionsgefäßen abzentrifugiert (10 min bei 4 °C; Biofuge, Fa.
Heraeus sepatech, Osterode). Der Rohextrakt aus der Fermenterernte wird in Falconröhrchen mit 9.000 x g
abzentrifugiert (10 min bei 4°C, Sorvall Evolution RC).
3.3.2.8 SDS-PAGE
Gelelektrophoretische Untersuchungen können zur Reinheitskontrolle des aufgereinigten Enzyms durchgeführt
werden. Die Anzahl der Banden im Gel gibt Aufschluss über den erzielten Reinheitsgrad während des
Reinigungsverfahrens. Von den Proben aller wesentlichen Aufreinigungsschritte sollen die Proteine
elektrophoretisch aufgetrennt und mit Serva Blau angefärbt werden. Das Gel zeigt das Verschwinden von
Fremdproteinen im Laufe der Aufreinigung.
Folgende Stammlösungen werden angesetzt:
Lösung A: Acrylamidstammlösung (zur Verfügung gestellt)
Acrylamid 40,0 g
N,N'-Methylen-Bisacrylamid 0,6 g H2Odeionisiert ad 100 ml
Lösung B: Trenngelpuffer (entgasen)
Tris 18,2 g
SDS 0,4 g H2Odeionisiert ad 100 ml
pH8,7
- 9 -
Lösung C: Sammelgelpuffer (entgasen)
Tris 3,0 g
SDS 0,2 g H2Odeionisiert ad 100 ml
pH6,8
Lösung D (immer frisch ansetzen)
Ammoniumpersulfat 0,1 g H2Odeionisiert ad 1,0 ml
Lösung E: Elektrodenpuffer
Laufpuffer
Tris 3 g
Glycin 14,4g
SDS 1 g H2Odeionisiert ad 1000 ml
Lösung F: H2Odeionisiert 3,55 ml
Tris-HCl 0,5 M, pH6,8 1,25 ml
SDS 10% 2,0 ml
Glycerin 2,5 ml
Bromphenolblau 0,5% 0,2 ml
In einer MiniproteanTM-Plattenelektrophoreseapparatur mit einem Plattengel-Gießstand (Fa. Bio-Rad) werden
zwei Gele der Dimension 10 cm * 7 cm * 1 mm (Volumen für das Trenngel beträgt 4 ml) gleichzeitig gegossen
(unter Anleitung). Nach dem Polymerisieren werden diese Gele jeweils mit einem Sammelgel überschichtet, in
das der Kamm eingesetzt wird.
Trenngelzusammensetzung (10%):
Lösung A 2,5 ml
Lösung B 2,5 ml
H2O 5,0 ml
Lösung D 50 µl
TEMED 5,0 µl
Sammelgelzusammensetzung (5%):
Lösung A 1,25 ml
Lösung C 2,5 ml
H2O 6,25 ml
Lösung D 50 µl
TEMED 10 µl
Das Trenngel wird gegossen und vorsichtig mit Isopropanol überschichtet. Nach dem Erstarren (ca. 45 min) wird
das Isopropanol abgegossen und das Sammelgel auf das Trenngel gegossen. Den Kamm einsetzen und erstarren
lassen (ca. 25 min).
Nachdem das Gel in die Elektrophorese-Apparatur eingespannt wurde, und der Puffer eingefüllt wurde, kann der
Kamm vorsichtig entfernt werden.
- 10 -
950 µl Lösung F + 50 µl ß-Mercaptoethanol mischen. Die aufzutragende Proteinlösung (5 -25 µl) wird mit der
doppelten Menge dieser Mischung versetzt und 10 min im Thermoblock gekocht. Anschließend werden die
Proben und gleich behandelte Eichproteine in die Geltaschen gefüllt und die Elektrophorese gestartet (10
mA/Gel). Wenn die Bromphenolblaubande das Gelende erreicht hat, ist die Elektrophorese beendet. Die Platten
vorsichtig auseinander genommen, das Sammelgel entfernen und das Trenngel an einer Ecke markieren, damit
nach dem Färben eine eindeutige Zuordnung der Banden möglich ist.
Färbung der Proteinbanden in den Gelen durch die Ein-Schritt-Coomassie-Färbung:
Für diese Färbemethode müssen in jeder aufgetragenen Probe 20 µg Protein enthalten sein. Das Protein im Gel
wird gleichzeitig fixiert und gefärbt.
Benötigte Lösungen:
Fixierer: Methanol 300 ml
Essigsäure 75 ml H2Odest. 625 ml
Färbelösung: Coomassie Brillant Blue R-250 1% in H2Odest.
Durchführung: Die Coomassie-Lösung wird bis zu einer Endkonzentration von 0.0004 - 0,0008% zum Fixierer
hinzugegeben. Die Färbung der Proteinbanden erfolgt in dieser Lösung durch eine zweistündige Inkubation des
Gels in dieser Lösung, oder durch Behandlung in der Mikrowelle (3 x 30 sec mit 30 sec Intervallen). Danach
wird die Hintergrundfärbung im Fixierbad über Nacht ausgewaschen.
Galaktitol-Dehydrogenase-(GatDH) Aktivität:
Eine Probe von 50 ml wird für die GatDH-Aktivitätsuntersuchung genommen, abzentrifugiert und das Pellet
eingefroren. Nach Auftauen und Zellaufschluss erfolgt die Messung in Kunststoffküvetten mit 1 cm
Schichtdicke im Photometer bei 340 nm. Es wird die Extinktionzunahme durch NADH-Bildung gemessen, die
bei der Rückreaktion durch Oxidation des Diols entsteht.
Reaktionsansatz (1 ml) für Oxidationsreaktion:
Puffer (200 mM Bis-Tris, pH 9.0, 1mM MgCl2) 500 µl
NAD+-Lösung (90 mM Stammlösung in H2O) 20 µl
Rohextrakt 100 µl
H2O 280 µl
(R,S)-1,2Hexandiol (1 M Stammlösung) 100 µl
Katalytische Aktivität SI-Einheit: Katal (früher: Unit)
1 Katal ist als die Enzymmenge definiert, die einen Umsatz von 1 mol pro Sekunde katalysiert.
1 Unit entspricht der Enzymmenge, die einen Umsatz von 1 µmol pro Minute katalysiert.
Spezifische katalytische Aktivität
Einheit: Katal/g (Unit/mg)
Die spezifische Aktivität entspricht der auf den Proteingehalt bezogenen katalytischen Aktivität. Sie ist ein Maß
für die Reinheit der Enzympräparation.
- 11 -
Die Volumenaktivität U/ml wird nach folgender Formel berechnet:
E * VKüvette
U/ml = ______t_____________ E * Vk
* VProbe * d * t * Vp * d
E t-1: Extinktionsänderung min-1; : Extinktionskoeffizient; VKüvette: Gesamtvolumen der Küvette: 1 ml;
VProbe: Probevolumen: 0,1 ml; d: Schichtdicke der Küvette: 1 cm; NADH (340 nm) = 6,3 ml * µmol-1 * cm-1
Die spezifische Aktivität ist die Volumenaktivität dividiert durch den Proteingehalt [U/mg].
1-Hydroxy-2-Propanon oder 1-Hydroxy-2-Butanon Reduktionsaktivität der GatDH:
Die Reaktion wird im 5 ml-Ansatz bei 37°C auf einem Schüttler durchgeführt. Zu Beginn und am Ende der
Reaktion werden 100 µl Proben entnommen, zentrifugiert und mit der HPLC bestimmt. Nach 24 h wird der
Umsatz abzentrifugiert und anschließend ein Aliquot durch eine Membran mit einer Ausschlussgrösse von
10.000 Dalton zentrifugiert, um die Proteine weitgehend abzutrennen. Die gereinigte Probe kann mit der HPLC
analysiert werden.
Reaktionsansatz (5 ml):
1-Hydroxy-2-Propanon (Hydroxy-Aceton) 100 mM
(oder 1-Hydroxy-2-Butanon 100 mM)
Ammonium-Formiat 100 mM
FDH 4 U/ml
NAD 2 mM
NADH 0,1 mM Bistris-HCl, 1mM MgCl2, pH 6.5 100 mM
GatDH-Lösung nach Entsalzung 1 ml
(oder RE von R. sphaeroides mit Proteaseinhibitor 2 ml)
HPLC-Bestimmung:
Die Analytik von 1-Hydroxy-2-ketonen und 1,2-Diolen wird mit einer Ionen-Verteilungs-Chromatographie mit
H2O als Eluent durchgeführt. Die Säule (Nucleogel Sugar 810 Ca, 300 x 7,8 mm, Fa. Macherey & Nagel) wird
bei einer Temperatur von 80 °C gehalten und die Elution erfolgt bei einer Flußrate von 0,7 ml/min. Die
Detektion wird mit einem Brechungsindexdetektor (Wissenschaftlicher Gerätebau Dr. Ing. Knauer, Berlin)
durchgeführt, an den ein Integrator (Chromatopac C-R6, Fa. Shimadzu, Koyoto, Japan) angeschlossen ist.
Malat wird mit einer Protonenaustausch-Säule bestimmt (Eluent H2Odest + 5 mM H2SO4, Flußrate 0,5 ml/min).
Die Identifizierung der Substanzen erfolgt durch den Vergleich der Retentionszeiten und Konzentrationen
können nach Kalibrierung der HPLC bestimmt werden. Für Malat wird eine Kalibrierungskurve (1, 7, 15mg/ml)
aufgenommen, die Hydroxyketone und Diole werden qualitativ nach Retentionszeiten bestimmt.
Proteinbestimmung: Der Proteingehalt wird nach der Lowry-Methode bestimmt.
Reagenz A: 3 % Na2CO3 in 0,1 N NaOH 50,0 ml
1 % CuSO4 x 5 H20 1,0 ml
2 % K-Na-Tartrat 1,0 ml
Die Bestandteile werden kurz vor Gebrauch gemischt.
Reagenz B: 1 Teil Folin-Ciocalteus-Phenolreagenz mit 2 Teilen H2O mischen
=
- 12 -
Das Probevolumen (der Verdünnungen 1:10, 1:50) von 0,5 ml wird mit 2,5 ml Reagenz A versetzt. Nach 10 min
wird 0,25 ml Reagenz B hinzu gegeben und weitere 20 min inkubiert (jeweils gut mischen). Die Extinktion wird
bei 546 nm gegen den Leerwert gemessen, und eine Eichkurve wird im Bereich von 10 - 200 ug BSA/ml
aufgenommen (10, 25, 50, 100, 150, 200 µg/ml aus einer 1 mg/ml Stammlösung).
Aktivitätsberechnungen:
50 mL Probe, zentrifugieren+ 4 mL Aufschlußpuffer→ 4 mL Rohextrakt
Aktivitätsbestimmung U/mL0.1 mL RE/ KüvetteU/mL * 10 (* Verdünnung ) U/mL RE* 4 U pro 50 mL Kultur * 20 = U/L Kultur (Gesamtaktivität)
ProteinbestimmungVerdünnung 10x, 50x, 100x, 200xWenn 100x in der Eichkurve liegt:Bestimmte mg/mL * 100mg/ml RE
Spezifische Aktivität: U/mL RE
mg/mL RE= U/mg
- 13 -
Gesamtaktivität am Ende der Fermentation:
Ca. 1000 mL Probe, zentrifugieren+ 50mL Aufschlußpuffer→ 50mL Rohextrakt
Aktivitätsbestimmung U/mL0.1 ml RE/ KüvetteU/mL * 10 (* Verdünnung ) U/ml RE* 50 U pro 1000 mL Kultur (Gesamtaktivität)
ProteinbestimmungVerdünnung 10x, 50x, 100x, 200xWenn 100x in der Eichkurve liegt:Bestimmte mg/mL * 100mg/ml RE
Malat: 9 g/L ( 9 mg/mL); Ertrag: U/L pro verbrauchtem Malat g/L U/g Malat
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Zeitplan
1. Woche 2. Woche
Mo
Zusammenbau des Fermenters Medium herstellen Autoklavieren Lsg herstellen:
Lsg für GatDH-Test Lsg. für Ketonumsatz
Filterpapiere in TS Eichung Malat (2 Gruppen)
Mo
Zusammenbau des Fermenters Medium herstellen Autoklavieren Lsg herstellen:
Lsg für GatDH-Test Lsg. für Ketonumsatz
Filterpapiere in TS Eichung Malat (2 Gruppen)
Di
Filter wiegen
9°° Ferm. animpfen mit Rhodobacter (ohne O2-Regelung) [OD, Malat, GatDH, TG] 12°° [OD] 14°° [OD, Malat, GatDH] 1630 [OD, TG, GatDH, Malat, pH]
Eichung Malat (weitere Gruppe) TG Filter in TS
Di
Filter wiegen
9°° Ferm. animpfen mit Rhodobacter (ohne O2-Regelung) [OD, Malat, GatDH, TG] 12°° [OD] 14°° [OD, Malat, GatDH] 1630 [OD, TG, GatDH, Malat, pH]
Eichung Malat (weitere Gruppe) TG Filter in TS
Mi
10°° [OD, TG] 13°° [OD, Malat, TG, GatDH, pH]
Fermenter-Ernte, Aufschluß der Zellen Aktivitätsbestimmung HPLC-Messung Malatproben TG Filter in TS
Mi
10°° [OD, TG] 13°° [OD, Malat, TG, GatDH, pH]
Fermenter-Ernte, Aufschluß der Zellen Aktivitätsbestimmung HPLC-Messung Malatproben TG Filter in TS
Do
TG Filter wiegen Eichung für Keton Umsatz Ansatz für Keton Umsatz mit GatDH
und RE (mit Proteaseinhibitor) Proteineichgerade Proteinbestimmung
Do
TG Filter wiegen Eichung für Keton Umsatz Ansatz für Keton Umsatz mit GatDH
und RE (mit Proteaseinhibitor) Proteineichgerade Proteinbestimmung
Fr
Ernte Ketonumsatz HPLC Keton, Diol Gelelektrophorese
Fr
Ernte Ketonumsatz HPLC Keton, Diol Gelelektrophorese
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Wachstum
OD (Zunahme)
Trockengewicht (Zunahme)
Malat-Konzentration (Abnahme)
GatDH-Aktivität (Oxidation von 1,2-Hexandiol) (Zunahme) Volumenaktivität (auf 1,5 l beziehen)
Proteinbestimmung spezifischen Aktivität
Ertragsbestimmung
Vergleich O2-Regelung
Fermenterernte und Zellaufschluss
Reinigung der GatDH (Aufreinigungstabelle und SDS-Gel) Hydroxyketonumsatz (Reduktion von 1-Hydroxy-2-Propanon zu S-1,2-Propandiol) Nachweis mit HPLC
GatDH-Produktion und Aktivität
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Minifors Fermenter
Zuluft
Abluft
pO2-Elektrode
pH-Elektrode
Rotameter
Rührer
Pumpenköpfe
Vorrats- Flaschen
Probe- nahme
Temperaturfühler
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Kurzanleitung Minifors (im Zweifelsfall Manual/Betreuer befragen!)
Zusammen- oder Abbau:
- Kabelverbindungen dürfen beim Schrauben nicht verdrillt oder geknickt werden (Zerstörung der Isolierung Crazy Data!)
- Pumpenköpfe vorsichtig aufsetzen und abnehmen (Einrasthebel zusammendrücken)
- Verbindung zum Antrieb hochklappen
- Schrauben am Heizblech lösen und Blech abnehmen
- Bei abgenommenen Kabeln, Pumpenköpfen, Luftleitungen und Wasserleitungen kann die Platte mit Fermenter und Vorratsflaschen nach oben von der Konsole genommen werden (der Einraststift am hinteren Blech muss aus der Verankerung gehoben werden)
- Drei Handschrauben am Deckel lösen und abnehmen
- Der Fermenterdeckel muss immer so auf dem Tisch liegen, dass die Rührwelle in die Luft zeigt!
- Gefäß kann entnommen, gereinigt oder mit Medium gefüllt werden
- Deckel wieder aufsetzen
- Alle Verbindungen nur mit der Hand anziehen (keine Werkzeuge!)
- Unter den Blindstopfen muss eine Dichtung sein
- pH Elektrode eichen und einbauen (siehe Seite 5)
- Antischaum Sonde (mit innen liegender Zudosierung), mit mindestens 1 cm Abstand zum oberen oder unteren Anschlag einbauen (sonst Kurzschluss und permanente Zudosierung)
- O2 Elektrode einbauen
- Vorratsflaschen füllen
- Probennehmer anbauen
- Zum Autoklavieren
- Zuluftschlauch mit kräftiger Metallklemme verschließen
- Alle Verbindungen zu Vorratsflaschen und Probennehmer verschließen
- Abluftleitung verschließen
- !!!!!! Einen Blindstopfen zum Druckausgleich öffnen !!!!!!!
- Rührwellenkopf mit neuer Alufolie abdecken (es darf keine Feuchtigkeit eindringen)
- Elektrodenanschüsse mit neuer Alufolie abdecken (es darf keine Feuchtigkeit eindringen)
- Oliven/Filter bei Gasver- und Entsorgung, an den Vorratsflaschen und am Probennehmer mit Alufolie abdecken
- Autoklavieren (2 l mindestens 40 min)
- 19 -
Nach dem Autoklavieren
- gelösten Blindstopfen sofort nach Öffnen des Autoklaven aufschrauben
- Platte mit Fermenter in die Konsole einbauen (der Einraststift am hinteren Blech muss in den Verankerungschlitz greifen)
- Verbindung zum Antrieb herunterklappen und Heizblech anschrauben
- Verschluss an der Entlüftung öffnen
- Wasseranschlüsse an den Kühler der Entlüftung anbringen und Wasser aufdrehen
- Belüftung an der Konsole auf niedrigen Wert stellen, Verbindung zum Fermenter herstellen und erst dann die Metallklemme lösen (sonst kann Medium zurücksteigen!)
- Pumpenköpfe auf den entsprechenden Pumpen einrasten und Klemmen zu Vorratsflaschen öffnen, Schläuche füllen (siehe Seite 5)
- Verbindungen zu Messelektroden aufschrauben (Kabel nicht verdrillen oder knicken)
- Anschlüsse für Antischaum am Deckel und dem Messfühler einstecken
- Temperaturfühler bis ganz unten in die entsprechende Hülse stecken
- O2-Elektrode eichen (siehe Seite 6)
- Laptop anschließen
- Fermentationsparameter über Konsole oder Laptop einstellen
- Getrennt autoklavierte Lösungen zugeben
- Animpfen und Fermentation starten
Nach dem Ernten
- Wasser und Luft abstellen
- Alle Verbindungen lösen
- Platte mit Fermenter ausbauen
- Elektroden ausbauen, waschen und wie vorgeschrieben aufbewahren
- Fermenter auseinanderbauen (der Fermenterdeckel muss immer so auf dem Tisch liegen, dass die Rührwelle in die Luft zeigt)
- Alles vorsichtig aber gründlich waschen
- Die Schläuche der Pumpen mit Wasser durchspülen
- Trocknen lassen und wieder zusammenbauen
Die Gleitringdichtung des Rührers muss einmal monatlich mit Glycerin geschmiert werden (siehe Manual!)
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Manuelle Einstellungen
F-Taste wählt Funktionen:
RPM (Drehzahl), °C, pH, pO2, AF (Antischaum), Pumpen
RPM (Drehzahl)
- Mit Drehzahl (Sollwert) einstellen
- Mit An/Aus stellen (Rührer)
Blättern
- Cas (Cascade) wird verwendet für pO2 gesteuerte Fermentation.
- cHi ist der schnellste Rührwert, mit einstellen
- cLo ist der langsamste Rührwert, mit einstellen
- OUT Reglerausgang 0-100%
- (für O2-Zufütterung muss eine Flasche angeschlossen sein und o2 im Pumpenmenu auf AUT gestellt sein)
°C (Temperatur)
- Mit Temperatur (Sollwert) einstellen
- Mit An/Aus stellen (Temperaturegelung)
Blättern
- OUT Reglerausgang 0-100%
- 21 -
pH
- Mit gewünschten pH-Wert (Sollwert) einstellen
- Mit An/Aus stellen (Pumpensteuerung)
Blättern
- OUT Reglerausgang 0-100%
- CAL
- +,+ 2 Punkt Eichung
- Elektrode in 1. Referenzpuffer, warten bis die Anzeige stabil ist, Wert mit einstellen
- Enter mit
- Elektrode in 1. Referenzpuffer, warten bis die Anzeige stabil ist, Wert mit einstellen
- Enter mit
- PF Proportionalfaktor (wird nicht verstellt)
- iF Integralfaktor (wird nicht verstellt)
- dEb deadband ≙ Fenster ohne pH-Regelung; gewünschter pH-Wert
hier eingestelltem Wert
- aLr Alarmgrenzen in Parameter Einheiten (pH oder pO2)
Während der Kalibrierung muss der Temperaturfühler in die pH-Standardlösung eingetaucht sein.
Die Elektrode nach Gebrauch abspülen, mit der Silkonkappe (mit 3 M KCl gefüllt) verschließen und in der Schachtel aufbewahren.
Pumpen
Blättern
- Aci Säurepumpe
- bas Basepumpe
- AF Antischaumpumpe
- FEd Fütterungspumpe
- Pumpzeiten mit einstellen; mit An/Aus wird die Pumpe gestartet (AUT) und die Schläuche können gefüllt werden (mit +)
- o2 in AUT-Stellung heißt: O2-Zugabe, wenn Flasche angeschlossen
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pO2
- Mit gewünschten pO2-Wert einstellen
- Mit An/Aus stellen (Belüftung über Rührergeschw./O2-Ventil steuern)
Blättern
- OUT Reglerausgang 0-100%
- CAL Kalibrierung kann erst erfolgen, wenn die Elektrode im Medium 4-6 Stunden lang bei eingeschalteter Konsole polarisiert/inkubiert wurde
- +,+ 2 Punkt Eichung
- Medium mit N2 begasen, warten bis Anzeige stabil ist, 0% Wert einstellen
- Enter mit
- Medium mit O2 (oder Luft) begasen, warten bis die Anzeige stabil ist, 100% Wert einstellen
- Enter mit
Oder:
- + 1 Punkt Eichung
- Medium bei gewünschter Temperatur und höchster Drehzahl mit Luft (oder O2) begasen, warten bis die Anzeige stabil ist, 100% Wert einstellen
- Enter mit
- PF Proportionalfaktor (normal 1; Wert erhöhen, wenn der Rührer nicht schnell genug nachgeregelt wird, bis 5)
- iF Integralfaktor (normal 0; Wert erhöhen, wenn der Rührer nicht schnell genug nachgeregelt wird, Einfluss geringer als PF)
- dEb deadband ≙ Fenster ohne pO2-Regelung; gewünschter pO2-Wert
hier eingestelltem Wert
- aLr Alarmgrenzen in Parameter Einheiten (pH oder pO2)
Elektrode vorsichtig behandeln – die Silkonmembran darf nicht durch mechanische Einwirkung verletzt werden! Deshalb immer nach Ausbau sofort die grüne Kappe aufsetzen.
Elektrode in der Schachtel aufbewahren.
AF (Antischaum)
- Mit An/Aus stellen (Pumpensteuerung)
Blättern
- dT Wartezeit in sec. (etwa 5, um zu warten ob der Schaum zusammenfällt)
- Pt Pumpzeit in sec. (etwa 2, Pumpzeit zwischen den Warteintervallen)
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Datenbearbeitung
- Programm „History“ aufrufen und entsprechendes File laden
- „File“ und „Generate Report“ anklicken
- Gewünschte Parameter auswählen
- Weiter
- Weiter
- Gewünschten Datentakt angeben
- Fertigstellen
- Datenspalten markieren, kopieren und in gewünschtes spreadsheat einfügen
- In Sigmaplot Zeitachse generieren:
- „Transforms“ und „User-Defined“ anklicken
- col(x)=data(von,bis,Schritt) ≙ col(x)=data(0,Anzahl der Zeilen * Datentakt,Datentakt)
- Umrechnung auf Stunden z.B. col(x)=col(x)/60, wenn der Datentakt in Minuten angegeben war
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Manuelle Steuerung einer Fermentation am Computer (Seite 78)
- kann nur bei gestartetem Fermenter benutzt werden - Parameter müssen am Fermenter gestartet sein (nicht auf „OFF“) - Aktiven Parameter mit rechter Maustaste anklicken - Häckchen bei „Setpoint remote“ (Häckchen bei „Sensor data“ belassen) - Setpoint ändern, Apply und OK - → Parameter wird geändert
Steuerung einer Fermentation ohne Bedingungen (Seite 77)
- Im Startmenü unter Infors „Follow File Generator“ auswählen - Fermenter wählen - Parameter auswählen - Auf Tabellen-Taste drücken - Eingabe von Beginn (+ Wert) - Eingabe von Ende (+ Wert) - Nächster Parameter - Eingabe von Beginn (+ Wert) - Eingabe von Ende (+ Wert) - Etc. - Tabelle schließen - Über Taste „Hinzufügen“ können zusätzliche Punkte einfach erstellt werden - Über Taste „Punkte bearbeiten“ entsprechend geändert werden (drag) - Auf diese Art den Verlauf aller Parameter definieren - Methode abspeichern - Beim Start einer Fermentation Methode in „Follow File“ aufrufen
Steuerung einer Fermentation mit Bedingungen (Control sequence)
(kann nur bei gestartetem Fermenter geschrieben werden)
- Öffnen über „Edit“ „Control sequence“ und “Edit current” (meist leer) oder “Import” (Aufruf einer fertigen Sequenz, die geändert werden kann)
- Gewünschte Kontrollsequenz erstellen (IRIS NT ab Seite 79) - Wenn die Sequenz fertig ist, Fenster schließen und „apply“ wählen - Zurück im Standard Menü kann die Sequenz über „Edit“ „Control sequence“
und “Export” abgespeichert werden (Extention .seq) (Vielleicht auch über „save as“ Seite 80)
- Beim Start einer Fermentation Sequenz in „Control sequence“ aufrufen