Methoden zur Sequenzierung von DNA
Anne Röschenkemper
SS 2006
DNA-Sequenzierung
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Was ist DNA-Sequenzierung?
• Die Analyse der DNA-Struktur auf Nucleotid-Ebene
• Erst seit 1977 gibt es DNA-Sequenzierungstechniken• Gründe dafür:• Erst seit dieser Zeit gibt es Klonierungstechniken, durch
die DNA in ausreichender Menge erhalten werden kann• Auch Restriktionsendonucleasen kennt man erst seit
Mitte der 70er Jahre; nur durch Behandlung mit diesen Enzymen kann DNA in kleine Fragmente zerteilt werden (& auch rekonstruiert werden)
DNA-Sequenzierung
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Welche Methoden gibt es?
1) Sequenzierung durch chemische Spaltung Die Maxam-Gilbert-Methode
2) Sequenzierung durch Kettenabbruch Die Sanger-Methode
3) weitere Methoden: zB.
Pyrosequenzierung
Sequenzierung durch Hybridisierung
DNA-Sequenzierung
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Sequenzierungsstrategien
• Problem: nur ca. 1000 bp können mit dem Sanger-Verfahren sequenziert werden
• Lösung:
1) Spezifischer Abbau und Fraktionierung durch Restriktionsendonucleasen kleine, vollständig sequenzierbare Fragmente
2) Sequenzierung
3) Rekonstruktion der Fragmente (durch „overlap“)
Komplette Sequenz
RE 1
RE 2
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Sequenzierung durch chemische Spaltung:Die Maxam-Gilbert-Methode
• Von Allan Maxam und Walter Gilbert entwickelt; erste Veröffentlichung: Februar 1977 (PNAS)
Prinzip: basenspezifische Spaltung
spezifische Spaltung an einem einzigen Nucleotid-Typ durch bestimmte Reagenzien
Jedes DNA-Fragment wird im Durchschnitt nur einmal gespalten (zufällig an einer der chemisch sensiblen Bindungen)
radioaktive Markierung des 5` - Endes mit 32P
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Die Maxam-Gilbert-Methode
• Markierung des 5´-Endes mit 32P
•Wenn schon P an 5´ vorhanden:
•Im zweiten Schritt wird nun radioaktiv markiertes ATP benötigt (am γ-Phosphor-Atom)
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Die Maxam-Gilbert-Methode
Beispiel für eine basenspezifische Spaltung
32P- A T G T A G G T C A G A -3´- T
Spaltung an der 5´-Seite von G:
32P- A T G T A G G T C A
32P- A T G T A G
32P- A T G T A
32P- A T
Die 5´-markierten Fragmente können nun
detektiert werden
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Die Maxam-Gilbert-Methode Detektion der 5´-markierten Fragmente:• mittels PAGE Trennung nach Größe• Autoradiogramm:
A T G C
Laufrichtung Leserichtung
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Die Maxam-Gilbert-Methode
• Spezifische Spaltung an G:
• Reagenzien:
Dimethylsulfat
Piperidin
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Die Maxam-Gilbert-Methode
Spezifische Spaltung an A & G• ähnlich der „G-Spaltung“ • Reagenzien: Dimethylsulfat
Piperidin• Methylierung von A an N(3) und nicht an N(7)• Reaktion unter sauren Bedingungen (Spaltung von A unter
basischen Bedingungen: 5 mal langsamer als G-Spaltung) A & G werden in gleichen Anteilen gespalten
• Ermittlung der A-Positionen durch Vergleich von „G“ und „G&A“
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Die Maxam-Gilbert-Methode
Spezifische Spaltung an C & T
• Reagenzien: Hydrazin
Piperidin
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Die Maxam-Gilbert-Methode
Spezifische Spaltung an C
• Ähnlich der „C&T-Spaltung“• Reagenzien: Hydrazin
Piperidin• Zusätzlich: Lösung enthält NaCl• Dadurch findet die Spaltung fast nur an C statt
• Ermittlung der T-Positionen durch Vergleich von „C“ und „T&C“
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Die Maxam-Gilbert-Methode
Vorteile• Eine Sequenz kann allein mithilfe der Restriktionskarte entschlüsselt
werden• Die Sequenz kann fast vollständig ermittelt werden• Die Sequenz kann vom ursprünglichen DNA-Molekül stammen
(nicht von einer enzymatisch hergestellten Kopie) keine Kopierfehler
Nachteile• Nur relativ kurze Sequenzen können ermittelt werden• Relativ langsame und unzuverlässige Methode (im Vergleich zur
Sanger-Methode)• Gefährliche Chemikalien werden verwendet
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Sequenzierung durch Kettenabbruch:Die Sanger-Methode
Nach Frederick Sanger (et al.); erste Veröffentlichung: Dezember 1977
Prinzip: in-vitro-Synthetisierung mit Kettenabbruch• Zu einem denaturiertem DNA-Strang wird mithilfe von
DNA-Polymerase ein komplementärer Strang synthetisiert
• Die Reaktion wird an einer bestimmten Base gestoppt, indem ein Didesoxynucleotid in den Strang eingebaut wird
• Detektion: per Autoradiographie oder Fluorimetrie
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Didesoxynucleotide
die DNA wird in 3´-5´-Richtung verlängert der ddNTP fehlt in der 3´-Position die OH-Funktion, an der ein
weiteres Nucleotid andocken könnte wird ein ddNTP in den Strang eingebaut, stoppt die Synthese um genügend lange Sequenzen zu erfassen, darf der ddNTP -
Anteil nur gering sein (~ 1:200 ddNTP : dNTP) man macht vier Ansätze: ddATP, ddGTP ,ddCTP, ddTTP
Die Sanger-Methode
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Die Sanger-Methode
Benötigte Komponenten• DNA-Einzelstrang • Primer• DNA-Polymerase• dNTPs• ddNtp (pro Ansatz nur eine Sorte)• Markierung • Elektrophoresesystem
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Die Sanger-Methode
Die Kettenabbruchmethode im Überblick
vier Ansätze
zufällige Verteilung der ddNTPs
Nur die synthetisierten Stränge werden erfasst
Prinzip: kleine Moleküle wandern schneller!
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Die Sanger-Methode
• Fluoreszenzsequenzierung•Man kann Primer, ddNTPs oder dNTPs kovalent an Fluorophore knüpfen wenn man pro Reaktionsansatz ein anderes Fluorophor verwendet, benötigt man nur eine Gelelektrophorese-Laufspur
•Vorteil:
schneller als AutoradiographieUngefährliche Substanzenleicht automatisierbar (~10.000 Basen können pro Tag identifiziert werden; manuelle Methode: ~ 150 / d)
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Die Sanger-Methode
Zyklische Sequenzierung I• Problem der Standardkettenabbruchmethode:
Empfindlichkeit der Methode wird durch die Molarität der
DNA-Sequenz begrenzt • Lösung:
zyklische Sequenzierung
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Die Sanger-Methode
Zyklische Sequenzierung II
Vorteile:• wenig DNA wird benötigt• hohe T verhindert „Sequenzartefakte“• leicht automatisierbar
Nachteile:• Taq-Polymerase baut Fluoreszenz-ddNTPs recht
schlecht ein• Taq.Polymerase liest hochpolymere Basenfolgen
schlechter
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Die Sanger-Methode
Vorteile• Man kann längere Sequenzen als mit dem Maxam-
Gilbert-Verfahren sequenzieren• Schnelle & recht zuverlässige Methode; leicht
automatisierbar• Man kann radioaktive Reagenzien mit der Fluorimetrie
umgehen
Nachteile• Man benötigt einen Primer ein Teil der Sequenz muss bekannt sein
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Fazit
• Die Sanger-Methode ist besser als die Maxam-Gilbert-Methode!!!
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Alternative Methoden
• Sequenzierung durch Hybridisierung• Pyrosequenzierung
• Mikrokanal-Sequenzierung• Massenspektrometrie• Rastertunnelmikroskopie• Nanoporen
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Alternative MethodenSequenzierung durch Hybridisierung• gelfreie Sequenzierungsmethode micro arrays• Matrize von kurzen Oligonucleotiden, die sich auf einer Glas- oder
Siliciumoberfläche befinden• die zu sequenzierenden DNA-Fragmente werden markiert und auf
die Oligonucleotidmatrix gebracht, so dass komplementäre Strukturen hybridisieren
• aus den Hybridisierungsmustern (Position und Signalintensität) kann auf die Sequenz geschlossen werden
• Probleme: Fehlhybridisierungen repetitive Sequenzen sind schwer zu analysieren• Aber: kürzere Sequenzabschnitte oder Mutationen können mit dieser
Methode erkannt werden Medizinische Diagnostik (z.B. SNPs)
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Alternative MethodenSequenzierung durch Synthetisierung: Pyrosequenzierung I
• Methode ohne Gele und Marker• Prinzip: „Beobachten der Synthese“• zu der einzelsträngigen DNA werden Enzyme gegeben
und dann abwechselnd die verschiedenen Nucleotide• man benötigt vier Enzyme:
1) DNA-Polymerase Einbau der Nucleotide
2) Apyrase Abbau ungenutzter Nucleotide
3) Sulfurylase Erzeugung von Licht aus PPi
4) Luciferase „
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Alternative MethodenPyrosequenzierung II
•die Lichtemission wird aufgezeichnet und ist in einem Pyrogramm® als Peak erkennbar
•die Intensität des Lichts ist proportional zur Anzahl der in den Strang eingebauten Basen
•schnelle Methode
•ideal für die medizinische Diagnostik
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Bedeutung der DNA-Sequenzierung
Das Humangenomprojekt
• Sequenzierung der menschlichen DNA (3,2 Mrd. bp!!!)• Erkennung von codierenden Sequenzen (~30.000 –
40.000 Gene) für z.B. monogene Krankheiten wie Alzheimer, Brustkrebs,
Diabetes (jeweils die vererbbaren Formen) Enzymmutationen und damit verbundene
Medikamentenunverträglichkeiten (z.B. CYP-450-Enzyme)
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Bedeutung der DNA-Sequenzierung
DNA-Chips für CYP-450• bestimmte Enzyme dieser Familie sind an der Metabolisierung von
Arzneimitteln beteiligt• Fehlerhafte Gene führen zu veränderter Metabolisierung: z.B. das
CYP-2D6-GenVariante A: normale AktivitätVariante B: verstärkte Aktivität („ultraschneller Metabolisierer“)Variante C: inaktives Enzym („langsamer Metabolisierer“)• bei Prodrugs: B toxische Effekte C keine Effekte (z.B. wird Codein durch dieses Enzym zu Morphin metabolisiert)
• Lösung für diese Probleme:DNA-Chip, der fehlerhafte Varianten des Gens erkennt und dadurch eine verbesserte Therapie ermöglicht
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Bedeutung der DNA-Sequenzierung
Ausblick• durch die Verwendung von DNA-Chips in der medizinischen
Diagnostik können SNPs und andere genetische Veränderungen erkannt werden
• dies macht eine auf den „zugeschnittene“ Therapie, die nicht nur äußere Faktoren wie Gewicht und Geschlecht berücksichtigt, möglich
• Möglichkeit der Früherkennung genetisch bedingter Krankheiten• Methoden wie die von Sanger eignen sich eher zur Sequenzierung
des kompletten Genoms, sind für die medizinische Diagnostik meist zu langsam und kompliziert, dafür aber genauer
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Literatur• Voet, Voet – Biochemie• Luke Alphey – DNA-Sequenzierung, 1998 Spektrum
Akademischer Verlag• Müller-Esterl – Biochemie, 2004 Elsevier Verlag• Lottspeich, Zorbas – Bioanalytik, 1998 Spektrum
Akademischer Verlag• www.pyrosequencing.com• „Die Humangenomforschung in Deutschland“ – BMBF• Sanger et al.: „DNA-Sequencing with chain-terminating
inhibitors“ – Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 74 (1977), pp. 5463-5467
• Maxam, Gilbert: „A new method for Sequencing DNA“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 74 (1977), pp. 560-564