Module BioAnalyse
Les Protéines
Cécile ALBENNE
Maître de conférences en biochimie
Equipe Protéines pariétales et développement (E. Jamet)
Objectifs de la journée
Objectifs et plan du cours
Rappel des fondamentaux sur les protéines
Présentation des méthodes d’étude structurale des protéines
• Relations structure/fonction
• Analyse protéomique
Mise en application directe sous forme de TD
Organisation de la journéeMatinée : Relations structure / fonction
1h30 de Cours : Principes et méthodes2h de TD : Analyse de données structurales à l’aide de logiciels adaptés
Après-midi : Analyse protéomique1h30 de Cours : Stratégies et outils2h de TD : Analyse de données de masse à l’aide de logiciels adaptés
2ème partie
Analyse protéomiqueI- Définitions et généralités
II- Séparation des protéines et des peptides
IIIIII-- Identification et Identification et caractérisationcaractérisation des Protéines par Spectrométrie de des Protéines par Spectrométrie de
Masse (MS et Masse (MS et MS/MS)MS/MS)
IV- Etude des modifications post-traductionnelles
Plan du cours
Plan
I- Définitions et généralités
Protéome
• Protéines exprimées par le génome
• Post-génome
ProtéomeProtéome :: Le protéome représente l’ensemble des protéines présentes dans une cellule donnée à un temps donné ; la protéomique en est son étude (Marc Wilkins, 1994).
-- dynamique, spécifique du type et de l’état des cellulesdynamique, spécifique du type et de l’état des cellules
-- son étude permet de préciser la fonction des protéines (liée à son étude permet de préciser la fonction des protéines (liée à leurs propriétés leurs propriétés structurales telles que les modifications poststructurales telles que les modifications post--traductionnelles ou d’identifier des protéines clés traductionnelles ou d’identifier des protéines clés impliquées dans un processus biologiqueimpliquées dans un processus biologique
Le concept un gène-une protéine n'est plus d'actualité
Bactérie1 gène 1 à 2 protéines
Levure1 gène 3 protéines
~30.000 gènes ~ 300.000 transcripts ~ 3.000.000 protéinesHumain
L’étude du génome ne suffit pas à comprendre le comportement cellulaireLe protéome sert de lien entre la séquence du génome et le comportement cellulaire
I- Définitions et généralités
La complexité du protéome
Même génome…
Différents protéomes !!!
I- Définitions et généralités
La complexité du protéome
• Préparation de l’échantillon (extraction, concentration, …)
• Séparation des protéines ou des peptides => simplification de l’échantillon
pour l’analyse par SM
• Spectrométrie de masse pour l’identification, la caractérisation et/ou la
quantification des protéines
I- Définitions et généralités
Les étapes en protéomique
A l’heure actuelle, deux méthodes sont utilisées pour séparer les protéines ou peptides en amont d’une analyse protéomique :
1- L’électrophorèse (mono- ou bi-dimensionnelle
2- La chromatographie liquide mono- ou multi-dimensionnelle
II- Séparation des protéines ou peptides
Méthodes
pI
PM
Carte à 2 dimensions dans laquelle chaque protéine est séparée selon son point isoélectrique et sa taille moléculaire apparente.
Protéines pouvant être analysées par gel 2D
4.0 10.0
10
100
II- Séparation des protéines ou peptides
Séparation des protéines par électrophorèse 2D
D’après Wildburger et al.Electrophoresis 2000, 21, 2610-16
La grande majorité des protéines peuvent être analysées par gel 2DMais pb des protéines de pI extrêmes (surtout les protéines basiques de pI > 10), hydrophobes
(peu solubles – protéines membranaires) et de hauts PMDéveloppement de stratégies de séparation par association avec la chromatographie liquide
(mono ou multi dimensionnelle)
Protéines pouvant être analysées par
gel 2D
II- Séparation des protéines ou peptides
Séparation des protéines par électrophorèse 2D
a- Electrophorèse 2D
b- Chromatographie Liquide mono ou bi-dimensionnelle
• des protéines
• des peptides après hydrolyse enzymatique d’un mélangecomplexe de protéines
II- Séparation des protéines ou peptides
Méthodes
• Pour les séparer, on va combiner plusieurs séparations sur la base de propriétés physico-chimiques différentes (multiD-LC, 2D-LC) :
- Taille : filtration sur gel- Charge : échange ionique (anion, cation)- pI : chromatofocalisation- Polarité : phase normale- Hydrophobicité : phase inverse (C4, C8, C18)
Mélange de protéines Prot purifiée Peptides analyse MS et MSMS2D LC hydrolyseStratégie :
Identification / caractérisation
II- Séparation des protéines ou peptides
Séparation des protéines par chromatographie liquide 2D
II- Séparation des protéines ou peptides
Séparation des protéines par chromatographie liquide 2D
☺Les fractions éluées de la 1ère colonne sont automatiquement injectées dans la 2ème colonne puis les fractions issues de la 2ème colonne peuvent être déposées sur cible MALDI pour des analyses MS
évite la manipulation manuelle d’échantillons (pertes, contaminations…).
☺ Un détecteur (UV par ex.) permet d’avoir une idée de la quantité de protéines éluées dans chaque fraction à l’issue de la 1ère colonne puis de la 2ème
Obtention de carte bi-dimensionnelle
Protéine (ou mélange de protéines) dénaturé(es)
Digestion enzymatique (trypsine)
Peptides (qques centaines à plusieurs milliers)
Séparation chromatographique des peptides 1D (RPC) ou 2D (1- Echange d’ions 2- Phase inverse)
MS et MS/MS (Fragmentation des peptides) => listes de masses d’ions parents et fragments
Comparaison des listes de masses expérimentales avec les listes de masses générées par la digestion théorique des protéines contenues dans les bases de données (protéiques ou génomiques)
Technique très utilisée en
protéomique
II- Séparation des protéines ou peptides
Séparation des peptides par chromatographie liquide 2D
~ 20.000 protéines
II- Séparation des protéines ou peptides
Séparation des peptides par chromatographie liquide 2D : le proteome de levure
1. Les spectromètres de masse
2. Les cartographies massiques peptidiques en MS
3. L’interrogation des banques de données
4. Les fragmentations peptidiques en MS/MS
III- Identification et caractérisation des protéines
Source Analyseur DétecteurIntroduction
DirecteGC/MS
HPLC/MSCE/MS
BIA/MS
EICI
FABElectrospray (ESI)
Maldi
QuadripôleTrappe ionique
TOF (Time Of Flight)FT ICR
++
+ ++
En biologie, deux techniques d’ionisation douce sont généralement utilisées pour préserver l’intégrité des biomolécules :
- l’électrospray (ESI)- la désorption laser assistée par matrice (MALDI)
*
IonisationMise en phase gazeuse
Séparation des ions en fonction de m/z
III- Identification et caractérisation des protéines
1- Les spectromètres de masse
*III- Identification et caractérisation des protéines
1- Les spectromètres de masse : sources d’ionisation
• Présence d’une matrice • Echantillon solide (co-crystal avec la matrice) • Ions monochargés MH+
Effets de suppression☺ Dépôt automatisable
• Echantillon phase liquide• Ions multichargés M + nH+
Solubilité - Faible tolérance aux sels
☺ Couplage HPLC => analyse de mélanges complexes
☺ Fragmentation MS/MS
laser
ionsions
Approches complémentaires
Association avec un TOF :Cartographies massiques peptidiques
Identification de protéinesSensibilité : quelques fmol
Couplage HPLC ESI MSMS :Informations de séquences peptidiques
Caractérisation de MPTsSensibilité : quelques fmol….
MALDI ESI
*III- Identification et caractérisation des protéines
1- Les spectromètres de masse : sources d’ionisation
Un Nobel 2002 pour la Spectrométrie de Masseet la protéomique
John Fenn Koichi Tanaka
Electrospray Maldi
Analyseurs Résolution Gamme m/z
Quadripôle 3.000 < 4.000
Trappe ionique 5.000 < 6.000
Temps de vol (TOF) 20.000 < 500.000
Cyclotron à résonance 1.000.000 < 4.000des ions (FT-ICR)
Les analyseurs*III- Identification et caractérisation des protéines
1- Les spectromètres de masse les analyseurs
Résolution = m
Δm
III- Identification et caractérisation des protéines
2- Cartographie massique peptidique : stratégie
1 - Séparation de protéines sur gel d'électrophorèse 2D (ou 1D)
2 - Excision d'un spot protéique, décoloration
3 - Digestion enzymatique dans le gel (trypsine)
5 - Cartographie massique peptidique par MALDI TOF et interrogation des banques de données
4 - Extraction des peptides
6 - Nano électrospray MS/MS et interrogation des banques de données
microséquençage
Identification ?
Non
Oui
III- Identification et caractérisation des protéines
2- Cartographie massique peptidique : exemple (sous-unité du protéasome humain)
700.0 3000.0Mass (m/z)
% In
tens
ity
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100895.4543
2522.3050
2027.1385
1580.7607 2202.0977
2649.1113842.5305 1918.00211564.74432211.0977
822.2776 2050.14371754.92271007.50002632.1079
1516.7597 2358.20521203.3921 2090.1058 2707.4223
1478.7189
MassesMonoisotopiques
822.2776836.3775842.5305862.3546895.45431007.50001203.39211478.71891564.74431580.76071754.92271918.00212027.13852050.14372090.10582202.09772211.09772358.20522522.30502632.10792649.1132707.4223
III- Identification et caractérisation des protéines
3- Interrogation des banques de données
http://prospector.ucsf.edu/
III- Identification et caractérisation des protéines
3- Interrogation des banques de données
C’est le nombre minimum de peptides d’une même protéine qui doivent être identifiés pour que cette protéine apparaissent comme résultat (« hit »)
Plus ce nombre sera grand , plus la recherche sera sélective
MS-FITSearch mode
III- Identification et caractérisation des protéines
3- Interrogation des banques de données
MS-FITSearch mode
• Ecart de masse maximum toléré entre la masse du peptide expérimental et la masse du peptide qui « matche » dans la banque
• S’exprime en Da ou en ppm :1 ppm = 1 partie par million
=> 1 Da pour 106 Da => 0,001 Da pour peptide de 1000 Da
Plus la tolérance de masse sera faible , plus la recherche sera sélectiveLa tolérance de masse dépend de la qualité de la calibration
• Calibration par défaut = calibration de l’appareil (régulièrement contrôlé) :
=> tolérance de masse = 100 ppm
• Calibration interne:
– On utilise des peptides présents dans l’échantillon pour calibrer l’appareil (par ex. pics trypsiques)
⇒ tolérance de masse : 10-50 ppm
– Si la calibration échoue (moins de 2 pics identifiés), pas de liste de masse générée
• Calibration externe:
– On dépose les peptides standards à côté de l’échantillon à analyser (eg. close-external calibration). L’appareil est calibré à l’aide des standards.
=> tolérance de masse : 50-100 ppm
Tolérance de masse et CalibrationLa calibration de l’appareil est indispensable pour obtenir des résultats fiables
III- Identification et caractérisation des protéines
3- Calibration et tolérance de masse
Tolérance de masse et CalibrationLa calibration de l’appareil est indispensable pour obtenir des résultats fiables
III- Identification et caractérisation des protéines
3- Calibration et tolérance de masse : exemple
700.0 3000.0Mass (m/z)
% In
tens
ity
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100895.4543
2522.3050
2027.1385
1580.7607 2202.0977
2649.1113842.5305 1918.00211564.74432211.0977
822.2776 2050.14371754.92271007.50002632.1079
1516.7597 2358.20521203.3921 2090.1058 2707.4223
1046.5422
2466.1876
1478.7189
Calibration interne : 10-50 ppm
III- Identification et caractérisation des protéines
4- Fragmentations peptidiques : MS/MS dans l’espace
Mélange d’ions Sélection d’un ion Apport d’énergie Analyse des fragments
Source Analyseur 1 Analyseur 2Cellule decollision
Q
TOF
IT
Q
TOF
QqQ
QqTOFTOF-TOF
Q-TRAP
Association d’analyseurs(MS/MS dans l’espace)
III- Identification et caractérisation des protéines
4- Fragmentations peptidiques : MS/MS dans le temps
IT
FT-ICR
MSn
Associations d’analyseurs pour la MS/MS
MSn
dans le temps
Source Trappe d’ion1) Sélection d’un ion2) Fragmentation3) Analyse des fragments
III- Identification et caractérisation des protéines
4- Fragmentations peptidiques en MS/MS : principe
y1
b2 c2
z1
a2
x1
H
R1 O
CH C NH
R2 O
CH C NH
R3 O
CH C OHNH
b1
y2
R
CHH2N+
b) Ion immonium
c) Ions caractéristiques des chaînes latérales de certains acides aminés (d, v, w)
a) Ions y, b, z, a, c, x
-28 Da (CO)
-17 Da (NH3)
+ H +
III- Identification et caractérisation des protéines
4- Fragmentations peptidiques en MS/MS : principe
y1
b2 c2
z1
a2
x1
H
R1 O
CH C NH
R2 O
CH C NH
R3 O
CH C OHNH
b1
y2
Nature des fragments obtenus dépend de l’instrument utilisé :- fragmentation haute ou basse énergie- fragmentation de peptides mono- ou multi-chargés
a) Ions y, b, z, a, c, x
-28 Da (CO)
-17 Da (NH3)
+ H +
III- Identification et caractérisation des protéines
4- Fragmentations peptidiques en MS/MS : principe
• Sur le groupe –NH2 libre du N-ter• Sur les chaînes latérales des résidus basiques :
Arg > His > Lys• Un H+ peut se déplacer d’une liaison peptidique à l’autre et assister à la fragmentation
En mode positif, localisation de la charge :
La localisation de la charge sur la séquence peptidiqueinfluence les fragmentations MS/MS
III- Identification et caractérisation des protéines
4- Fragmentations peptidiques en MS/MS : interprétation
012345
y8y9y1y1y1y1y1y1
b7b6b5b4b3b2b1
y13 y14y12y11
y10
y9
1°) Fragmentation statistique des peptides
Différences de masse entre ions d’une même série
Série y
N-ter C-ter
2°) Déduction de la séquence d’un peptidepar analyse du spectre de fragmentation
III- Identification et caractérisation des protéines
4- Fragmentations peptidiques en MS/MS : exempleSpectre MS/MS acquis avec une trappe d’ion : ion parent monochargé [M+H]+ à m/z = 637.3
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
389.0249.0
593.2491.1220.9
276.1 619.3
258.1 344.0445.7 536.2463.1
473.0
362.0Leu/Ile Glu Lys
b2
b3
b4
Leu/Ile Phe Thr
y3
y4
y2a2
T F L E Ky4 y3 y2
b2 b3 b4
III- Identification et caractérisation des protéines
4- Fragmentations peptidiques en MS/MS : Leu ou Ile ?
Leucine
COOHCHNHR3
CO w2
CHCH
H ++H
COOHCHH3NR3+
y2NHCOCH
CHCH3H3C
CH2
Perte de 59
Isoleucine
COOHCHNHR3
CO w2a
CHCH
CH3++H
COOHCHH3NR3+
y2NHCOCHCH
CH2CH3H3C
+
COOHCHNHR3
CO w2b
CHCH
CH2CH3 +H
Perte de 45
Perte de 31
Masses identiques = 113,08406
Fragmentation de la chaîne latérale à haute-énergie : MALDI-TOF/TOF
Conclusion
Comprendre les fragmentations peptidiques en MS/MS peut aider à :
• Choisir les analyseurs les plus adaptés
• Valider les interprétations automatiques des logiciels• Interpréter un spectre en s’appuyant sur des ions
diagnostiques (MPT)• Utiliser des modes d’acquisition performants
Nombreux spectromètres de masse utilisés en protéomique
Choix en fonction de l’information recherchée et de la disponibilité !!!
III- Identification et caractérisation des protéines
Conclusion
ConclusionIV- Etude des modifications post-traductionnelles
Fonctions
Stabilité protéique, protection N-terminaleRégulation des interactions protéine-DNA (histones)
Régulation de l’expression des gènes (très courante sur les histones)
Ancre Glycosylphosphatidylinositol (GPI). Ancrage aux enzymes et récepteurs membanaires….
Régulation des interactions protéines/protéines -/ligandsModifications chimique artéfactuelle (attention !)
Stabilité protéique, blocage de l’extrémité N-terminale
Signal de dégradation
Nature des MPT
Acétylation
Méthylation
« Ancre » GPI
Déamidation
Acide Pyroglutamique
Ubiquitine
Δ Masse (Da)
+42
+14
> 1000
+1
-17
> 1000
Stabilité
Réversible, faible abondance, Activation/inactivation d’activités enzymatiques, Modulation des interactions moléculaires, Processus de signalisation
PhosphorylationpTyrpSer, pThr
+80+80
++++/++
+++
+++
Ancrage membranaire surtoutLocalisation cellulaire, signalisation,
Interactions protéines/protéines
Acylation, acides gras farnésylemyristoylepalmitoyle…etc
+204+210+238
+++++++/++
Excrétion des protéinesReconnaissance cellulaire/signalisationO-GlcNAc, réversible, régulation fonctionnelle
GlycosylationN-glycosylationO-glycosylation
> 800203, > 800
+/+++/++
++
Stabilité des protéines. Interactions protéines-ligandsHydroxyproline +16 +++
Modulation Interactions protéine/protéine, récepteur/ligandSulfatation (sTyr) +80 +
Stabilité protéique, crosslink intra et inter moléculairePont Disulfure -2 ++
+++
+++
+/++
Nitratration des Tyrosines +45 +/++ Oxydation / processus inflammatoire et dégénératifs
ConclusionIV- Etude des modifications post-traductionnelles
Schulenger B. et al JBC 2003; 278; 29; 27251-27255
Protéines mitochondrialesDétection Pro-Q-Diamond
Protéines mitochondrialesDétection SYPRO Ruby
Détection spécifique de MPT : ex. de phosphoprotéines
Phosphoprotéines
Protéines totales
ConclusionIV- Etude des modifications post-traductionnelles
Analyse des MPT par SM
Les modifications post-traductionnelles induisent un changement de masse qui peut-être mesuré par SM
La SM permet de :- détecter des peptides ou protéines modifiées- identifier la nature de la modification- localiser la modification sur l’axe polypeptidique
Différence de masse parfois insuffisante comme preuve (ex: 80 Da, phosphorylation ou sulfatation), besoin de vérifier par d’autres approches biochimiques (immuno-, enzymo-).
La spectrométrie de masse : un outil de choix pour l’analyse des MPTs
ConclusionIV- Etude des modifications post-traductionnelles
Analyse des MPT par SM
Nécessité de disposer de quantités importantes : beaucoup plus que pour une simple identification !
Nécessité de maximiser la couverture de séquence : difficile
Séparation préalable des protéines et surtout de leurs isoformes (pI, PM)
La spectrométrie de masse : un outil de choix pour l’analyse des MPTs
ConclusionIV- Etude des modifications post-traductionnelles
Analyse des MPT par SM : problèmes et solutionsLes peptides modifiés sont le plus souvent absents du spectre en raison de :
Phénomène de suppression de signaux (ex: phosphorylation apporte charge négative d’où faible ionisation)
Ions moléculaires portant les MPTs sont souvent instablesIons moléculaires de masses élevées (glycosylation (souvent > 800), ubiquitination (>
1000)…) donc plus difficilement ionisablesMPT n’est que partielle (ex: phosphorylation : seulement 10 à 20 % des protéines)
Solutions :Mise en évidence d’une modification post-traductionnelle
Enrichissement préalable : immunopurification (AC dirigés contre PhosphoTyr, lectinespour glycosylation) ou IMAC (phosphorylation)
Déphosphorylation (phosphatase alcaline) ou déglycosylation (enz. ou chim.) préalableAssociation d’analyseurs => détection d’ions diagnostics (Balayage des ions
précurseurs / recherche de perte de neutre)Détermination du poids moléculaire de la protéine
ConclusionIV- Etude des modifications post-traductionnelles
Analyse des MPT par SM : ex. d’enrichissement sur IMAC
Avec enrichissement
700 1060 1420 1780 2140 2500m/z0
20
40
60
80
100
Rel
ativ
e In
tens
ity (%
)
Trypsin
2211
.14
1959
.95
1751
.57
1735
.58
989.
4910
51.5
4763.
41
1655
.62
1671
.62
852.
39
80P
Peptides phosphorylés
700 1060 1420 1780 2140 25000
20
40
60
80
100
m/z
Rel
ativ
e In
tens
ity (%
)
Trypsin
842.
51 2211
.13
Trypsin
745.
4176
3.41
852.
38 1152
.61
1130
.56
1114
.56
1217
.66
1228
.70
1380
.76
1396
.76
1959
.93
1031
.53
1475
.77
Sans enrichissement
ConclusionIV- Etude des modifications post-traductionnelles
Analyse des MPT par SM : traitement à la phosphatase
Cartographie peptidique massique d’une protéine phosphorylée avant et après traitement à la phosphatase
Limites : Faible ionisation des phosphopeptides
Développemet possible : enrichissement préalable des phosphopeptides par IMAC
ConclusionIV- Etude des modifications post-traductionnelles
Analyse des MPT par SM : ex. de glycoprotéine (peroxydase végétale)
750.0 1400.2 2050.4 2700.6 3350.8Mass (m/z)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
Voyager Spec #1 MC[BP = 1362.6, 1521]
1362.6404
803.4354
959.5164
1604.8177
2575.26952212.1033
2663.12921364.6307
2866.2034842.5096
921.4671
1602.8357917.4506
799.4267 2573.28561606.8085 2868.20461346.6504 2226.11671106.5619
961.5180 1171.4930805.4390 1703.88731485.7684 2214.1167 3687.58371970.8586820.2775 986.4692 2661.17802517.12991618.8364 1770.8644 2864.23101186.5292 2198.07151391.6454 1948.0245 3689.61771587.8552 2384.9541 2594.1824 2870.2354
Peptide utilisés pour l’identification
P3 : NGNQTVLVDFDLR 1490.76 P4 : GLIQTDQELFSSPNATDTIPLVR 2515.30
P3 +
P4 +
P3 +
Analyse protéomique
TD : mise en application pratique du cours
Utilisation de Protein Prospector
http://prospector.ucsf.edu/
ConclusionIV- Etude des modifications post-traductionnelles
Analyse des MPT par SM : ex. de glycoprotéine (peroxydase végétale)
750 1400 2050 2700 3350 4000Mass (m/z)
0
4488.6
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
Voyager Spec #1 MC[BP = 941.5, 4489]
941.4915
842.5093
870.5423
2381.2597
2543.2955
1045.57651459.7883
2219.2123
943.4973856.5279 2212.0865
2383.2625844.5172 2705.34101179.6191 2545.30091461.7922877.0610 1136.6461
1606.6609 2488.22892226.09281365.66041047.5722 1791.7341 2707.3438858.5001 3802.85781194.6256 1514.7728 3640.82412403.2201982.4595 2166.15691941.9314 2566.2780 2867.40291793.7478 3800.87893478.80511584.7172 2337.2497 2727.3078
Identification d’une Protéine Riche en Prolines (PRP) At1g28290 par PMF (MALDI-TOF)
4 peptides non modifiés + 2 peptides portant des Hyp
1970 2253 2536 2819 3102Mass (m/z)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
Voyager Spec #1 MC=>NR(2.00)[BP = 941.5, 4887]
2543.2920
2705.3312
2706.3315
2542.28902544.2919
2704.3249
2381.2611
2867.37682212.0925
2868.38102707.3368
2380.25622211.0882 2545.29992382.2604
2866.36702213.0905
2869.37312488.22952326.1877
2226.10832487.2252 2708.34092285.1553 2383.2627 2546.2979
2284.1585 3029.41472214.0973 2649.2840 2811.36142231.1883 2870.3960 3030.43012620.25442490.22382220.2165 2752.28232328.1906 2974.40422590.2645 2813.35532458.21642241.1344
2163.1409
P1 + 162 P1 + 2*162
P1 + 3*162 P1 + 4*162 P1 + 5*162
P2 + 162
P2 + 2*162
P2 + 3*162
P2 + 4*162
P2 + 5*162P1
P1 : APVSPPAKPPVKPPVYPPTK m/z = 2163
P2
P2 : APVKPPTKPPVKPPVYPPTK m/z = 2218
jusqu’à 10*162 trouvé pour P2 et 6*162 pour P1 : hétérogénéité naturelle
Mise en évidence d’At1g28290IV- Etude des modifications post-traductionnelles
Analyse des MPT par SM : ex. de glycoprotéine (peroxydase végétale)
750 1400 2050 2700 3350 4000Mass (m/z)
0
4488.6
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
Voyager Spec #1 MC[BP = 941.5, 4489]
941.4915
842.5093
870.5423
2381.2597
2543.2955
1045.57651459.7883
2219.2123
943.4973856.5279 2212.0865
2383.2625844.5172 2705.34101179.6191 2545.30091461.7922877.0610 1136.6461
1606.6609 2488.22892226.09281365.66041047.5722 1791.7341 2707.3438858.5001 3802.85781194.6256 1514.7728 3640.82412403.2201982.4595 2166.15691941.9314 2566.2780 2867.40291793.7478 3800.87893478.80511584.7172 2337.2497 2727.3078
Avant déglycosylation
749.0 1399.2 2049.4 2699.6 3349.8 4000.0Mass (m/z)
6578.6
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
Voyager Spec #1 MC[BP = 941.5, 6579]
941.4863
842.5046
856.4673
1667.85552219.2446
870.5369
1084.5920
1244.6104 2164.16671512.7992
943.48961172.6184 1459.7924
2221.24781045.5739 1669.85631156.6614850.5033
2487.3306858.4772 1246.61291086.5999 3477.84332166.18951534.7823763.4308 1118.5417 1283.6970 2381.2939963.4855 3479.84991476.7859 1941.9398 2471.34422326.2241
Après déglycosylation HF - disparition des glycopeptides(pertes de 162)
- enrichissement en peptides déglycosylés