Molekulare Verfahren im Kontext mitklinischer Praxis und Bestandsbetreuung beim Schwein
Labortechniken (1)
• DNA-Extraktion
• Photometrie
• Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
• Restriktionsanalyse
• Agarose-Gelelektrophorese
• Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Labortechniken (1)
DNA-Extraktion
In-house MethodenPhenol/Chloroform-ExtraktionNaJ-MethodeGuSCN-Methodeu.s.w.
Kommerziell erhältliche KitsBloodTissueVirale RNAPlantu.s.w.
Kombination aus Kit- und in-house Methode
Eigenschaften der Probe
ProbenartBlut, Plasma, Serum, Sputum, UrinKot, Tupfer, Organteile, etc.
Probenvolumen
Anteil an ‘fremder’ Nukleinsäurez. B. Schweine-DNA
Physikalische Eigenschaften der ProbeTupfer, Gewebe, Flüssigkeit, etc.
Inhibitoren für die DNA-Polymerase
Labortechniken (1)
Labortechniken (1)
DNA-Extraktion mit dem Viralen RNA Minikit
DNA-bindende Membran
Probenvolumen max. 630 µl
Zentrifugationssäule1. Lysieren der Probe mit AVL-Pufferzum Freisetzen der DNA/RNA
2. Binden der Proben-DNA/RNA an dieMembran der Zentrifugationssäule
3. Zentrifugation
4. Waschen der gebundenen DNA/RNA mitWaschpuffer 1
5. Zentrifugation
6. Waschen der gebundenen DNA/RNA mitWaschpuffer 2
7. Eluieren der DNA/RNA mit Elutionspuffer
Dauer der DNA/RNA-Extraktion: ca. 20 min
Labortechniken (1)
Photometrie
Lambert-Beersches Gesetz: E = ε • c • d
E Extinktion (E = -log(I0/I ) = -log T)ε molare Absorptionskoeffizient [l • mol-1 • cm-1]d Schichtdicke der Küvette [cm]c Konzentration [mol • l-1]
Konzentration: c = E / (ε • d)
Extinktionswerte optimal zwischen 0,1 und 1 (linearer Bereich)
Konzentration von Nukleinsäuren (E260 = 1):
dsDNA: 50 ng/µlssRNA: 40 ng/µl
Qualität von Nukleinsäuren:
dsDNA: E260/E280 ≥ 1,8
220 260 300Wellenlänge in nm
Abs
orpt
ion
Ultrospec 1100 pro
Polymerase-Kettenreaktion
Polymerase Chain Reaction
P C R
Labortechniken (1)
PCR-Reaktionskomponenten
Reaktionspuffer
DNA-Polymerase (thermostabil)
4 Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs) A, G, C und T
2 Oligonukleotide (Primer): Länge 20 – 30 Basen
Magnesiumchlorid
DNA- bzw. RNA-haltige Probe
Labortechniken (1)
PCR-Zyklus
1. Schritt: Denaturierung der Ziel-DNA
2. Schritt: Annealing (Anheften) der Primer
3. Schritt: Extension (Verlängerung) der Primer
1. + 2. + 3. Schritt = ein Zyklus
Labortechniken (1)
PCR-Qualitätskontrolle (1)
Separate Räume oder Bereiche für jeden Schritt der PCR
Vermeiden von direkten Verbindungen zwischen den Räumen
Keine Luftzirkulation von Post-PCR-Räumen zu Prä-PCR-Räumen
Zugangsregelung
Labortechniken (1)
PCR-Qualitätskontrolle (2)
feste Ausstattung für jeden Raum
Handschuhe tragen und regelmäßig wechseln
zum Pipettieren der Probe (DNA/RNA)gestopfte Spitzen benutzen
PCR-‘Master-Mix’ ansetzen undaliquotieren
Negativkontrollen und Positivkontrollen mitführen
Interne Kontrollen mitführen (Inhibitorkontrollen)
Labortechniken (1)
PCR-Techniken
Heiß-Start (Hot-Start)-PCR
Nested-PCR
Touchdown-PCR
Multiplex-PCR
RT-PCR (Reverse Transkriptase-PCR)
Labortechniken (1)
Nested PCR
Labortechniken (1)
Labortechniken (1)
Touch-Down PCR
Aktivierung der DNA-Polymerase 95°C, 15 min(Hot-Start)
Denaturierung 95°C, 30 sAnnealing 65°C, 90 sExtension 72°C, 60 s
Denaturierung 95°C, 30 sAnnealing 55°C, 90 sExtension 72°C, 60 s
10 x (- 1°Cpro Zyklus)
30 x
Labortechniken (1)
Multiplex-PCR
Beispiel: Gleichzeitiger Nachweis von B. hyodysenteriaeund L. intracellularis
In dem PCR-Ansatz befinden sich zwei spezifische Primerpaare fürB. hyodysenteriae undL. intracellularis
Voraussetzung: beide Primerpaare haben ähnliche Annealingtemperaturen
Labortechniken (1)
(Reverse Transkriptase) RT-PCR
Ausgangs-Nukleinsäure: RNA
1. Schritt: Umschreiben der RNA in DNA(Reverse Transkription)Bezeichnung der umgeschriebenen DNA: cDNA (copy DNA)
2. Schritt: PCR mit der umgeschriebenen DNA als Ziel-DNA
1. und 2. Schritt kombiniert: One-Step RT-PCR
Labortechniken (1)
Restriktionsanalyse
Restriktionsenzym (Restriktionsendonuklease) = Enzyme, die die DNA an
spezifischen Erkennungssequenzen schneiden
Enzym Quelle Erkennungssequenz Schnitt Enden
XbaI Xanthomonas badrii 5‘-TCTAGA-3‘ 5‘-T CTAGA-3‘ 5‘-Überhang3‘-AGATCT-5‘ 3‘-AGATC T-5‘
SmaI Serratia marcescens 5‘-CCCGGG-3‘ 5‘-CCC GGG-3‘ kein Überhang3‘-GGGCCC-5‘ 3‘-GGG CCC-5‘
PvuI Proteus vulgaris 5‘-CGATCG-3‘ 5‘-CGAT CG-3‘ 3‘-Überhang3‘-GCTAGC-5‘ 3‘-GC TAGC-5‘
Labortechniken (1)
5‘-GGCTGTGGCCTTTATTACAAAGTTGTCATCTAGAATGATAGCACTGG-3‘3‘-CCGACACCGGAAATAATGTTTCAACAGTAGATCTTACTATCGTGACC-5‘
Beispiel: Restriktionsverdau mit XbaI
5‘-GGCTGTGGCCTTTATTACAAAGTTGTCAT-3‘3‘-CCGACACCGGAAATAATGTTTCAACAGTAGATC-5‘
+
5‘-CTAGAATGATAGCACTGG-3‘3‘-TTACTATCGTGACC-5‘
XbaI,37°C,1 h
Agarose-GelElektrophorese (AGE)(Submarine Gelelektophorese)
Labortechniken (1)
Elektrophoresekammer
Labortechniken (1)
Kamm
Zähne
Schlitten
Endbegrenzer
Labortechniken (1)
Größentrennung von DNA-Fragmenten bei verschiedenen Agarosekonzentrationen
Agarosekonzentration (in %) Auftrennungsbereich linearer, dsDNA in Bp0,3 5.000 – 60.0000,6 1.000 – 20.0000,7 800 – 10.0000,9 500 – 7.0001,2 400 – 6.0001,5 200 – 3.0002,0 100 – 2.000
Elektrophoresepuffer: TAE (Tris/Acetat/EDTA)- oder TBE (Tris/Borat/EDTA) –Puffer
Spannung: 1 - 10 V/cmLaufzeit: 10 – 60 minFärbung: Ethidiumbromid (kanzerogen!)
Labortechniken (1)
Bildanalyse
Multiplex-PCR- B. hyodysenteriae (Bhyo) - L. intracellularis (Li)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
IK*
Bhyo
Li
B. pilosicoli
+ -+ -
Labortechniken (1)
* Interne Kontrolle
Labortechniken (1)
PolyAcrylamid-GelElektrophorese (PAGE)
Reagenzien
- Harnstoff (denaturierend)
- Acrylamid (lineares Polymer)
- Bisacrylamid (Vernetzer)
- Puffer
- Ammoniumperoxodisulfat (APS)
- Tetramethylethylendiamin (TEMED)
Labortechniken (1)
Auftrennung von Oligonukleotiden in denaturierenden Polyacrylamidgelen
Acrylamidkonzentration (in %) Auftrennungsbereich (Nukleotide)20 -30 2 – 815 - 20 8 – 2513,5 - 15 25 – 3510 – 13,5 35 – 458 – 10 45 – 706 - 8 70 – 300
Elektrophoresepuffer: TBE (Tris/Borat/EDTA) – PufferSpannung: 1500 VStromstärke: 40 mALeistung: 40 WLaufzeit: 1 – 2 h