Real-time-PCR-Nachweissystem für Hefen und
Schimmelpilze in Getränken
vorgelegt von
Master of Science
Silvana Schulz
geb. in Ludwigslust
von der Fakultät III Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin,
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat. –
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. Lothar W. Kroh
Gutachter: Prof. Dipl.-Ing. Dr. Ulf Stahl
Gutachterin: Dr.-Ing. Kornelia Berghof-Jäger, BIOTECON Diagnostics GmbH
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 09. Juni 2015
Berlin 2015
II
DANKSAGUNG
Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr.-Ing. Ulf Stahl der TU Berlin für die wissenschaftliche
Betreuung dieser Arbeit.
Frau Dr. Kornelia Berghof-Jäger danke ich für die stetige Begleitung bei der Entwicklung des
Themas und die hilfreichen Diskussionsrunden.
Ich danke Herrn Dr. Cordt Grönewald für die wissenschaftlichen Hilfestellungen und
Ratschläge, die mir sowohl in den vergangenen Jahren, aber auch gegenwärtig oftmals
weitergeholfen haben. Vielen Dank für die Geduld beim Korrigieren dieser Arbeit.
Natürlich danke ich allen Mitarbeitern der BIOTECON Diagnostics, insbesondere den
Mitarbeitern der F&E-Abteilung. Ihr hattet stets ein offenes Ohr und einen passenden Tipp
bei kleineren und mittleren Katastrophen des Laboralltags. Vielen Dank für die schöne Zeit
bei euch!
Mein besonderer Dank gilt meiner Familie. Mit ihrer Unterstützung ist diese Arbeit
schlussendlich doch noch fertig geworden.
III
INHALTSVERZEICHNIS
DANKSAGUNG .............................................................................................................. II
INHALTSVERZEICHNIS ................................................................................................... III
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ........................................................................................... VII
TABELLENVERZEICHNIS .............................................................................................. VIII
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ............................................................................................ X
ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................................. XIV
SUMMARY .................................................................................................................. XV
1 EINLEITUNG ........................................................................................................... 1
1.1 Einführung ............................................................................................................... 1
1.2 Taxonomie und Phylogenie ..................................................................................... 2
1.3 Morphologie ............................................................................................................ 4
1.4 Bedeutung von Pilzen in Lebensmitteln ................................................................... 5
1.4.1 Allgemeine Bedeutung – vom Produzenten zum Destruenten .......................... 5
1.4.2 Kontamination von alkoholfreien Getränken ..................................................... 6
1.5 Angewandte Methoden zum Nachweis von Pilzen .................................................. 8
1.5.1 Mikrobiologischer Nachweis ............................................................................. 9
1.5.2 Molekularbiologische Nachweismethoden .......................................................12
1.5.3 Lebend/Tot-Differenzierung .............................................................................15
1.6 Ziele der Arbeit .......................................................................................................18
2 MATERIAL UND METHODEN ................................................................................... 19
2.1 Geräte ....................................................................................................................19
2.2 Reagenzien ............................................................................................................20
2.3 Verbrauchsmaterialien ...........................................................................................21
2.4 Puffer und Lösungen ..............................................................................................21
2.5 Nährmedien ...........................................................................................................22
2.5.1 Gebrauchsfertige Nährmedien ........................................................................22
2.5.2 Hergestellte Nährmedien .................................................................................22
2.6 Oligonukleotide ......................................................................................................23
IV
2.6.1 Sequenzen zur Amplifikation der 28S rDNA-Sequenz .....................................24
2.6.2 Primersequenzen zur Amplifikation eines pflanzenspezifischen Fragments ....24
2.7 Probenmatrices ......................................................................................................24
2.8 Primer Design ........................................................................................................24
2.9 Stammanzucht .......................................................................................................25
2.10 Gewinnung von RNA-freier, quantifizierbarer DNA .................................................25
2.11 Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration ............................................25
2.12 Gelelektrophorese ..................................................................................................25
2.13 Herstellung kompetenter E.coli XL1-blue-Zellen .....................................................26
2.14 Klonierung ..............................................................................................................26
2.14.1 Herstellung eines pflanzenspezifischen Amplifikats .........................................26
2.14.2 Herstellung eines pilzspezifischen Amplifikats für die Positivkontrolle .............27
2.14.3 Ligation mit pGEM®-T-Vektorsystem ..............................................................27
2.14.4 Transformation und Blau-Weiß-Selektion ........................................................28
2.14.5 PCR-Klonanalyse mittels Colony-PCR ............................................................28
2.14.6 Plasmidpräparation .........................................................................................28
2.15 Sequenzierung .......................................................................................................28
2.16 Sequenzanalyse .....................................................................................................28
2.17 Berechnung von Genomäquivalenten ....................................................................28
2.18 Real-time-PCR .......................................................................................................29
2.18.1 Gradienten-PCR ..............................................................................................29
2.18.2 Temperaturprofile für Real-time-PCR-Cycler ...................................................30
2.19 Herstellung des Mastermixes für Pilzgesamtnachweis-Assay ................................30
2.20 Spezifitätstestungen ...............................................................................................31
2.21 Probenaufarbeitung ................................................................................................31
2.21.1 Herstellung einer Sporensuspension ...............................................................31
2.21.2 Aufbereitung filtrierbarer Proben mit Lebend/Tot-Differenzierung ....................31
2.21.3 Anreicherung und Aufbereitung nicht-filtrierbarer Flüssigkeiten mit Lebend/Tot-
Differenzierung ..............................................................................................................31
2.22 Sensitivitätstestungen ............................................................................................32
V
2.22.1 Sensitivitätstestung des PCR-Assays mit quantifizierbarer DNA .....................32
2.22.2 Sensitivitätstestung mit dotierten Probenmatrices ...........................................32
2.22.2.1 Untersuchung von Flüssigkeiten auf Wiederfindungsraten .......................32
2.22.3 Sensitivitätstestung bei hoher Begleitflora .......................................................32
2.22.4 Dotierungen mit inaktivierten Zellen für die Lebend/Tot-Differenzierung ..........32
3 ERGEBNISSE ........................................................................................................ 33
3.1 Auswahl und Beschreibung der Zielregion .............................................................33
3.2 Generierung eines Plasmids mit plantaespezifischer DNA .....................................34
3.3 Primermodifikationen zur Erhöhung der Spezifität ..................................................36
3.4 Generierung der Positivkontrolle ............................................................................40
3.5 Einbringen einer internen Amplifikationskontrolle ...................................................41
3.6 Spezifitätstestungen ...............................................................................................42
3.6.1 Inklusivität .......................................................................................................42
3.6.2 Exklusivität ......................................................................................................43
3.7 Sensitivitätstestung des Assays mit quantifizierbarer DNA .....................................44
3.8 Weitere Optimierung des Real-time-PCR-Assays ..................................................47
3.8.1 Blockierung der Taq-Polymerase bei Raumtemperatur ...................................47
3.8.2 Gradienten-PCR ..............................................................................................48
3.8.3 Überprüfung der Performance .........................................................................51
3.9 Probenaufarbeitung für Fungi in Getränkematrices ................................................51
3.9.1 Aufarbeitung filtrierbarer Flüssigkeiten ............................................................51
3.9.2 Probenaufarbeitung für nicht-filtrierbare Flüssigkeiten .....................................54
3.9.2.1 Wiederfindungsrate in nicht-filtrierbaren Flüssigkeiten .............................54
3.9.2.1.1 Kohlensäurehaltige Flüssigkeiten ..........................................................54
3.9.2.1.2 Einsatzstoffe und Halbware ...................................................................56
3.9.2.2 Anreicherungs- und Detektionsdauer verschiedener Keime .....................59
3.9.2.3 Sensitivität bei hoher Begleitflora .............................................................60
3.10 Optimierung der Lebend/Tot-Differenzierung .........................................................62
4 DISKUSSION ......................................................................................................... 70
VI
4.1 Beurteilung der 28S rDNA als Zielregion ................................................................70
4.2 Spezifität des Real-time-PCR-Assays ....................................................................72
4.3 Sensitivität des Real-time-PCR-Assays (LOD und LOQ) ........................................76
4.4 Beurteilung der Methode zur Lebend/Tot-Differenzierung ......................................80
4.5 Beurteilung der Probenaufarbeitung .......................................................................87
4.6 Ausblick ..................................................................................................................93
LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................. XVI
NORMEN UND RICHTLINIEN ...................................................................................... XXIV
MANUALS ............................................................................................................... XXIV
ANHANG ................................................................................................................. XXV
I. Alignment der 28S-rDNA-Sequenzen repräsentativer Pflanzen von Position 120-
1080 unter Angabe der Primerpositionen ...................................................................... XXV
II. Alignment der in den pGEM®-T-Vektor eingebrachten pflanzlichen 28S-rDNA-
Sequenzen .................................................................................................................. XXIX
III. Klonierungsvektor pGEM®-T-57f(+) mit plantaespezifischem 28S-rDNA-Insert XXXI
IV. Klonierungsvektor pGEM®-T-57(+) mit fungispezifischem 28S-rDNA-Insert als
Positivkontrolle............................................................................................................ XXXII
V. Einstellen des Positivkontrollplasmids als Quantifizierungsstandard ............... XXXIII
VI. Stämme für Inklusivität .................................................................................... XXXIV
VII. Stämme für Exklusivität .................................................................................. XXXVII
VIII. Daten zur LOD/LOQ-Bestimmung ................................................................... XXXIX
IX. Anreicherungs- und Detektionszeitpunkt von verschiedener Hefen in Matrices .. LVIII
X. Absterbekinetik von Aspergillus-brasiliensis-Sporen............................................. LIX
VII
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 1: Darstellung der gegenwärtigen Systematik der Pilze ........................................................ 3
Abbildung 2: Einteilung der alkoholfreien Getränke ................................................................................ 6
Abbildung 3: Prinzip der TaqMan-PCR ................................................................................................. 14
Abbildung 4: Darstellung des rDNA-Repeats und des 28S-rDNA-Genabschnitts ................................ 33
Abbildung 5: UV-Visualisierung des Agarosegels mit pflanzenspezifischen Amplifikaten .................... 35
Abbildung 6: UV-Visualisierung der mittels Colony-PCR untersuchten Klonkandidaten ...................... 36
Abbildung 7: Struktur einer LNA™-Base ............................................................................................... 37
Abbildung 8: ΔCp-Werte der Mixe mit modifizierten Primern im Vergleich............................................ 39
Abbildung 9: Amplifikationskurven zur Einstellung der Positivkontrolle auf Genomäquivalente ........... 41
Abbildung 10: Amplifikationskurven taxonomisch verschiedener Fungi-Spezies ................................. 42
Abbildung 11: Amplifikationskurven der internen Amplifikationskontrolle bei der Exklusivitätstestung 43
Abbildung 12: Amplifikationskurven von Z. bailii und A. brasiliensis zur LOD/LOQ-Bestimmung ........ 45
Abbildung 13: Linearisierte Standardkurve zur interspezifischen Korrelation der LOD/LOQ-
Bestimmung ..................................................................................................................... 47
Abbildung 14: Amplifikationskurven der Reaktionsmixe mit antikörper- bzw. aptamergeblockter Taq-
Polymerase ...................................................................................................................... 48
Abbildung 15: Amplifikationskurven bei 63°C Annealingtemperatur ..................................................... 50
Abbildung 16: Amplifikationskurven bei 60°C Annealingtemperatur ..................................................... 50
Abbildung 17: Performanceprüfung mit einer Vielzahl an Negativkontrollen ........................................ 51
Abbildung 18: Wiederfindungsrate von A. brasiliensis-Sporen nach Filtration ..................................... 52
Abbildung 19: Amplifikationskurven von 1:10-verdünnten Colaproben ................................................ 55
Abbildung 20: Detektion von 1x103 KBE S. cerevisiae mit Begleitflora (E. coli) ................................... 61
Abbildung 21: Amplifikationskurven von S. cerevisiae nach Inaktivierung bei 80°C ............................ 63
Abbildung 22: S. cerevisiae und D. anomala (lebend und inaktiviert) mit differenten Dunkelphasen ... 64
Abbildung 23: Z. bailii und A. brasiliensis (lebend und inaktiviert) mit differenten Dunkelphasen ........ 65
Abbildung 24: Resultate der PCR-Analytik von A. brasiliensis-Sporen bei differenten Dunkelphasen 66
Abbildung 25: Verschiebung der Detektionszeitpunkte (ΔCp) bei zunehmender Inaktivierungszeit ..... 66
Abbildung 26: Saccharomyces cerevisiae in verschiedenen Zellzuständen ......................................... 68
Abbildung 27: Funktionalität der Lebend/Tot-Differenzierung in Getränkematrix ................................. 69
Abbildung 29: Grafische Darstellung des Klonierungsvektors pGEM®-T-57f(+) mit
pflanzenspezifischem Insert ......................................................................................... XXXI
Abbildung 30: Klonierungsvektor pGEM®-T-57(+)f mit eingebauter 28S rDNA-Sequenz aus
D. anomala .................................................................................................................. XXXII
VIII
TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 1: Auflistung der Methoden zum Nachweis von Fungi ............................................................... 9
Tabelle 2: Übersicht der verwendeten Geräte....................................................................................... 19
Tabelle 3: Übersicht der eingesetzten Reagenzien .............................................................................. 20
Tabelle 4: Übersicht der verwendeten Verbrauchsmaterialien ............................................................. 21
Tabelle 5: Übersicht der gebrauchsfertigen Nährmedien ...................................................................... 22
Tabelle 6: Sequenzen der 28S rDNA-spezifischen Primer ................................................................... 24
Tabelle 7: Sequenzen der pflanzenspezifischen Primer ....................................................................... 24
Tabelle 9: Protokoll zur Herstellung eines pflanzenspezifischen Amplifikats ........................................ 26
Tabelle 10: Temperaturprofil zur Herstellung eines pflanzenspezifischen Amplifikats ......................... 27
Tabelle 11: Protokoll zur Herstellung eines pilzspezifischen Amplifikats .............................................. 27
Tabelle 12: Temperaturprofil zur Herstellung eines pilzspezifischen Amplifikats ................................. 27
Tabelle 13: Pipettierschema für den Ligationsansatz ........................................................................... 27
Tabelle 14: Übersicht der verwendeten Genomgrößen/–gewichte zur LOD/LOQ-Bestimmung .......... 29
Tabelle 15: Temperaturprofil für die Real-time-PCR ............................................................................. 30
Tabelle 16: Zusammensetzung des Mastermixes für den Pilzgesamtnachweis-Assay ....................... 30
Tabelle 17: Einfluss verschiedener Primermodifikationen auf Cp-Werte bei Einsatz eines
pflanzenspezifischen Plasmids ........................................................................................ 38
Tabelle 18: Korrelation der Cp-Werte von DNA und Positivkontrollplasmid .......................................... 41
Tabelle 19: Taxonomie der zur LOD/LOQ-Bestimmung eingesetzten Spezies .................................... 44
Tabelle 20: Statistische Auswertung zur interspezifischen Korrelation ................................................. 46
Tabelle 21: FAM-Cp-Werte des antikörper- bzw. aptamerhaltigen Reaktionsmixes ............................. 48
Tabelle 22: FAM-Cp-Werte zur Bestimmung der Wiederfindungsrate von Aspergillus-Sporen nach
Filtration ........................................................................................................................... 53
Tabelle 23: Gegenüberstellung der erhaltenen Cp-Werte für (un)-verdünnte Colaproben ................... 55
Tabelle 24: Gegenüberstellung der Resultate der mikro- und molekularbiologischen Analyse ............ 57
Tabelle 25: PCR-Analyse nach Anreicherung in SSL bei grenzwertiger Dotierung .............................. 57
Tabelle 26: Cp-Werte zur Bestimmung der Wiederfindungsrate in nicht-filtrierbaren Proben ............... 58
Tabelle 27: Gegenüberstellung der Resultate zur Detektionszeit verschiedener Hefespezies nach
Anreicherung in Fruchtkonzentraten/Nektar .................................................................... 60
Tabelle 28: Detektion von S. cerevisiae in Anwesenheit von Begleitflora (E.coli) ................................ 62
Tabelle 29: Resultate zur Einstellung des Positivkontrollplasmids auf Genomäquivalente ............ XXXIII
Tabelle 30: Übersicht der untersuchten Pilz-Stämme ..................................................................... XXXIV
Tabelle 31: Eingesetzte DNA-Proben für Exklusivitätstestung ...................................................... XXXVII
Tabelle 32: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Rhodotorula mucilaginosa-DNA ................... XXXIX
Tabelle 33: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Cryptococcus curvatus-DNA............................... XL
Tabelle 34: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Mucor racemosus-DNA ..................................... XLI
Tabelle 35: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Absidia corymbifera-DNA ................................. XLII
Tabelle 36: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Schizosaccharomyces pombe-DNA ................ XLIII
Tabelle 37: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Fusarium oxysporum-DNA ............................. XLIV
Tabelle 38: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Cladosporium cladosporioides-DNA ................ XLV
IX
Tabelle 39: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Alternaria citri-DNA ......................................... XLVI
Tabelle 40: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Penicillium chrysogenum-DNA ...................... XLVII
Tabelle 41: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Aspergillus brasiliensis-DNA ......................... XLVIII
Tabelle 42: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Candida albicans-DNA ................................... XLIX
Tabelle 43: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Issatchenkia orientalis-DNA.................................. L
Tabelle 44: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Pichia anomala-DNA ........................................... LI
Tabelle 45: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Zygosaccharomyces bailii-DNA .......................... LII
Tabelle 46: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Dekkera anomala-DNA ...................................... LIII
Tabelle 47: LOD/LOQ: Cp-Werte der Negativkontrollen ...................................................................... LIV
Tabelle 48: Statistische Gesamtauswertung zur LOD/LOQ-Untersuchung .......................................... LV
Tabelle 49: Ausführliche Darstellung der Resultate für PCR und Mikrobiologie für die
Anreicherungsdauer vier verschiedener Hefen in drei Matrices ................................... LVIII
Tabelle 50: Absterbekinetik von Aspergillus-Sporen bei Hitzebehandlung .......................................... LIX
X
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
6-FAM 6-Carboxyfluorescein - Fluoreszenzfarbstoff
Abkz. Abkürzung
AfG Alkoholfreie Getränke
Amp Ampicillin
aw Wasseraktivität
BHQ1 engl. black hole quencher – Fluoreszenzfarbstoff
bp Basenpaare
BSA bovines Serumalbumin
CASO Caseinpepton-Sojamehlpepton-Agar
cfu engl. colony forming units – Koloniebildende Einheiten
Cp engl. crossing point – Kreuzungspunkt
CT engl. threshold cycle – Schwellenwertzyklus
demin demineralisiert
DG18 Dichloran-Glycerin-18-Agar
dNTP Desoxynukleosidtriphosphat
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
dTTP Desoxythymintriphosphat
dUTP Desoxyuraciltriphosphat
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EF-3 Elongationsfaktor 3 – DNA-Bereich
ELISA engl. enzyme linked immunosorbent assay – antikörperbasiertes
Nachweisverfahren
engl. englisch
EMA Ethidiummonoazid(-bromid)
et al. lat.: et alii (mask.), et aliae (fem.), et alia (neut.) - und andere
evtl. eventuell
FACS engl. fluorescence activated cell sorting – Fluoreszenzaktivierte
Zellsortierung
FungiFw Vorwärtsprimer des pilzspezifischen Assays
FungiP Sonde des pilzspezifischen Assays
FungiRv Rückwärtsprimer des pilzspezifischen Assays
G50 Glucose-50-Agar
GÄ Genomäquivalent
griech. griechisch
HEX Hexachloro-6-carboxy-flurorescein
HSTE Heringssperma-Tris-EDTA-Puffer
XI
IAK interne Amplifikationskontrolle
inc. sed. lateinisch: incertae sedis - unsichere Stellung
IPC engl. internal positive control - interne Positivkontrolle
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
ISO engl. International Organization für Standardization
ITS engl. internal transcribed spacer – DNA-Bereich
Kap. Kapitel
kb Kilobasen
KBE Koloniebildende Einheiten
lat. lateinisch
LC480 LightCycler® 480
LED engl. light emitting diode – Licht emittierende Diode
LFGB Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch
LNA engl. locked nucleic acids – fixierte Nukleinsäuren
LOD engl. limit of detection - Nachweisgrenze
LOQ engl. limit of quantification – Bestimmungsgrenze
µm Mikrometer
µl Mikroliter
mM millimolar
M molar
MA Malzextraktagar
MRS deMan-Rogosa-Sharpe-Agar
MW engl. molecular weight - Molekulargewicht
NC-IUB engl. Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry
nm Nanometer
NCBI engl. National Center for Biotechnology Information
NOR engl. nucleolus organizer region – DNA-Bereich
NTC engl. No Template Control - Negativkontrolle
NTS engl. non-transcribed spacer – DNA-Bereich
OFS Orangenfruchtsaftagar
PCR engl. polymerase chain reaction – Polymerase-Kettenreaktion
PET Polyethylenterephthalat
PDA engl. potato dextrose agar - Kartoffeldextroseagar
PES Polyethersulfon
pH lat. potentia Hydrogenii – negative, dekadischer Logarithmus der
Wasserstoffionenaktivität
PI Propidiumiodid
XII
Pl. Plural
PK Positivkontrolle
PMA Propidiummonoazid
PS Polysulfon
PVPP Polyvinylpolypyrrolidon
qPCR quantitative Polymerase-Kettenreaktion
RAPD engl. randomly amplified polymorphic DNA – zufällig vervielfältigte
polymorphe DNA
rDNA ribosomale Desoxyribonukleinsäure
rRNA ribosomale Ribonukleinsäure
RFLP Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
RT Raumtemperatur
Rxn. Reaktionen
S Svedberg-Einheit, Sedimentationskoeffizient
SELEX engl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment -
Systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung
SNP engl. single nucleotid polymorphism - Einzelnukleotidpolymorphismus
sp. lat. species – eine Spezies der Gattung
spp. Mehrzahl von sp.
SSL schneller Spurennachweis für Limonadenschädlinge
Taq lat. Thermus aquaticus - Spezies
TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer
TE Tris-EDTA-Puffer
TG Glasübergangstemperatur
TGYA engl. trypton glucose yeast extract agar – Trypton-Glucose-Hefeextraktagar
tntc engl. totally not to count – nicht auszählbar
U Units
UDG Uracil-DNA-Glykosylase
unmod. unmodifiziert
UV ultraviolettes Licht
VE voll entmineralisiert
VIC patentierter Fluoreszenzfabstoff der Fa. Applied Biosystems
vgl. vergleiche
v-PCR engl. viable PCR – Lebend-PCR
WSH Wasser standardisierter Härte
w/v engl. weight per volume percent - Massenprozent
X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid
XIII
YGC engl. yeast extract-glucose-chloramphenicol agar – Hefeextrakt –Glucose-
Chlorampenicol-Agar
YM engl. yeast extract malt extract agar – Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar
z.B. zum Beispiel
zusätzl. zusätzlich
ZNA engl. zip nucleic acid - Reißverschlussnukleinsäuren
z.T. zum Teil
λexc. engl. excitation – Anregung; Anregungswellenlänge
λemi. engl. emission – Aussendung; Emissionswellenlänge
XIV
ZUSAMMENFASSUNG
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Real-Time-PCR-Assay entwickelt, das den universellen
Nachweis von Pilzen ermöglicht. Mit der Vorauswahl an Primer- und Sondenkandidaten,
welche einen hoch konservierten DNA-Abschnitt der 28S-rDNA flankieren, wurden in-silico-
Analysen durchgeführt, die zeigen konnten, dass das Phylum der Mucoromycotina nicht
100% erfasst wurde. Nach Zusatz eines weiteren Primers konnten über 250 verschiedene
Pilzspezies der relevanten Phyla mit dem Real-Time-PCR-Assay nachgewiesen werden. Die
Detektionsgrenze des Assays liegt im Bereich von 1,6 Genomäquivalenten. Die
Quantifizierung fungoider DNA wurde mit 15 lebensmittelrelevanten Spezies vorgenommen.
Es konnte gezeigt werden, dass die Quantifizierung der Pilze trotz verschiedener Gen-
Kopienzahlen und Genomgrößen reproduzierbar möglich ist. Durch das Mitführen einer
Plasmidpositivkontrolle, die im Rahmen dieser Arbeit konstruiert wurde, kann der
Kontaminationsgrad einer Probe bestimmt werden. Exklusivitätsprüfungen mit DNA aus
Zelllinien sowie bakterieller und pflanzlicher DNA haben die Spezifität des Verfahrens
bestätigt. Der Assay beinhaltet Mechanismen zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen
wie z.B. die Verwendung von Uracil-DNA-Glykosylase.
Das Probenaufarbeitungssystem ist für die Anwendung in der Getränkeindustrie vorgesehen.
Alkoholfreie Getränke und ihre Einsatzstoffe können auf den Befall mit Verderbsorganismen
hin geprüft werden. Es werden zwei Extraktionsverfahren vorgestellt: filtrierbare
Flüssigkeiten werden filtriert und der Filter anschließend weiter aufgearbeitet; nicht-
filtrierbare Flüssigkeiten können nach einer möglichen Voranreicherung direkt ins
Reaktionsgefäß überführt werden. Die Nachweisgrenze liegt bei 1,5x101 KBE (in 100 ml) für
filtrierbare Flüssigkeiten und 5x101 KBE (in 100 µl) für nicht-filtrierbare Flüssigkeiten. Um nur
die Kontamination lebensfähiger Pilze anzuzeigen, beinhaltet die Probenaufarbeitung ein
Verfahren zur Lebend/Tot-Differenzierung mithilfe eines interkalierenden Farbstoffs. Die
Anwendbarkeit der Aufarbeitung wird mit Brauereieinsatzstoffen sowie Realproben
untersucht.
XV
SUMMARY
This graduate thesis describes the development of a real-time PCR assay for the universal
detection of fungi. The preselected primer and probes candidates flank the highly conserved
28S rDNA region but insilico analyses showed that they did not fit optimal for the phylum
Mucoromycotina. With an additional primer, it was possible to detect more than 250 fungi
species. The limit of detection for this assay is 1.6 genome equivalents. The quantification of
fungal DNA was evaluated using 15 food-relevant microorganisms. Although, fungi differ in
the gene copy numbers and the genome size it was shown that the quantification of the DNA
is reproducible using the artificial positive control. The exclusivity of the assay was proofed
with DNA extracted from bacteria, plants and cell cultures. The real-time PCR assay contains
several reagents to avoid cross contaminations, for example the enzyme uracil-DNA-
glycosylase.
The sample preparation system was made for the beverage industry. Soft drinks and their
raw material can be checked for fungal contaminations using the following two extraction
methods: filterable fluids are filtered and the whole filter passes the sample preparation while
non-filterable fluids are transferred to the reaction tube directly after an optional pre-
enrichment. The limit of the detection of the sample preparation system is 1.5x101 cfu (per
100 ml) for filterable and 5x101 cfu (per 100 µl) for non-filterable fluids. With the addition of
an intercalating dye, only the DNA of living fungi can be detected in the real-time PCR. The
applicability of the preparation system was tested with brewery raw material and real
samples.
1 EINLEITUNG
1
1 Einleitung
1.1 Einführung
Hefen und Schimmelpilze sind sowohl bei der Herstellung als auch dem Verderb von
Lebensmitteln und Getränken beteiligt. Der Verderb resultiert aus dem Zusammenspiel der
mikrobiellen Aktivität und dem Wachstum von Mikroorganismen in Abhängigkeit von den
eingesetzten Rohmaterialien und der Produktzusammensetzung (van der Vossen und
Hofstra 1996; Loureiro 2000). Für die Qualität des Produktes ist somit die Qualität der
Einsatzstoffe ausschlaggebend (Back 2008).
Wirtschaftliche Verluste infolge von Rückrufaktionen stellen für Produktionsbetriebe
schwerwiegende Konsequenzen dar (van der Vossen und Hofstra 1996; Back 2000, 2008;
Loureiro 2000; Boekhout und Robert 2003; Rawsthorne und Phister 2006). In den
vergangenen Jahren waren Verbraucher immer wieder aufgefordert, belastete Getränke in
die Filialen zurückzubringen oder zu entsorgen. Im August 2008 wurden hefeinfizierte, in
Glasflaschen abgefüllte Apfelschorlen wegen Explosionsgefahr zurückgerufen.
Sechstausend Flaschen einer Orangenlimonade wurde im Juli 2009 ebenfalls wegen einer
Hefebelastung und der bestehenden Berstgefahr zurückbeordert. In Energy Drinks konnte im
März 2010 eine Schimmelpilzbelastung beobachtet werden. Im Juli 2010 wurde der
Milchschimmel Geotrichum candidum in einer für Kleinkinder ausgelobten Bio-Fruchtschorle
nachgewiesen sowie 50 000 Flaschen einer Apfelschorle, abgefüllt in PET-Flaschen (Abkz.
Polyethylenterephthalat), nach Feststellung eines Hefebefalls und der bestehenden
Explosionsgefahr zurückgerufen (Beckmann et al. 2011). Auch wenn in den meisten Fällen
keine konkrete Gefahr für die Gesundheit der Verbraucher besteht, sind die Produkte nicht
für den menschlichen Verzehr geeignet (Loureiro 2000; Beckmann et al. 2011).
Für Produktionsbetriebe stellt die Auffindung von Kontaminationsquellen und die Feststellung
über die Identität der vorgefundenen Mikroorganismen eine besondere Herausforderung dar.
Allein mit mikrobiologischen Methoden sind Aussagen darüber, ob es sich um Verderbs-
oder harmlose Begleitflora handelt, teilweise schwierig und zeitintensiv (Loureiro 2000). Ein
schnelles Eingreifen in den Produktionsprozess zum Vermeiden weiterer Kontaminationen ist
faktisch nicht möglich.
Erschwerend kommt hinzu, dass der Verbraucher in den letzten Jahren zunehmend nach
minimal prozessierten Lebensmitteln verlangt (Loureiro 2000). Hersteller müssen demnach
neue Wege für Präventionsmaßnahmen gehen: der Zusatz natürlicher antimikrobieller
Substanzen oder nur geringe physikalische Behandlungen stellen den Anfang dar (Juvonen
et al. 2011).
1 EINLEITUNG
2
Eine kontinuierliche Routineüberwachung des gesamten Produktionsprozesses – von der
Rohware bis zum abgefüllten Produkt – ist damit zur Gewährleistung eines sicheren und
unverdorbenen Produktes unerlässlich. Dies lässt sich nur mit schnellen, sensitiven und
einfach zu handhabenden Nachweismethoden erreichen, die zum frühestmöglichen
Zeitpunkt ein Eingreifen in den laufenden Prozess erlauben.
1.2 Taxonomie und Phylogenie
Das heute gängige Wort „Pilz― leitet sich vom Althochdeutschen Wort buliz ab. Etymologen
gehen davon aus, dass sich der Begriff aus dem lateinischen bōlētus entwickelt hat (Kluge
and Seebold 1989). Die wissenschaftliche Bezeichnung Fungus (Pl. fungi = Pilz) entstammt
dem Lateinischen (Alexopoulos 1952). Die Lehre der Pilze wird Mykologie genannt (griech.
mýkēs = Pilz, logos = Lehre (Alexopoulos 1952)).
In der Domäne der Eukaryonten stellen Fungi neben den Protozoen, Chromista, Animalia
und Plantae ein eigenständiges Reich dar (Cavalier-Smith 1998). Der Systematik der
Eukaryonten von Adl et al. aus dem Jahr 2012 folgend werden Pilze zusammen mit den
Choanomonada (Kragengeißeltierchen) und Metazoa (vielzellige Tiere) der Gruppe der
Opisthokonta zugeordnet (Adl et al. 2012). Der Rang der Fungi untergliedert sich dabei in
mindestens sechs Phyla (siehe Abbildung 1): Asco-, Basidio-, Neocallimastigo-, Chytridio-
und Blastocladiomycota sowie Microsporidia. Die Subphyla, die diesen nicht zugeordnet
werden konnten (Mucoro-, Mortierello-, Entomophthoro-, Zoopago- und Kickxellomycotina),
verbleiben jeweils als Subphylum incertae sedis (Hibbett et al. 2007). Bisher nicht eindeutig
geklärt ist die Stellung der Cryptomycota: Jones et al. plädieren auf ein eigenständiges
Phylum innerhalb der Fungi, obwohl die Charakteristik eines Pilzes nur teilweise gegeben ist
(Jones et al. 2011b). Um diese Unklarheiten aufzuzeigen, ist dieses Phylum in der
dargestellten Systematik (siehe Abbildung 1) andersfarbig hervorgehoben.
Um Gemeinsamkeiten zwischen Asco- und Basidiomyceten zu verdeutlichen, werden diese
beiden Phyla im Unterreich Dikarya zusammengefasst. Die Ascomycota (griech. askos =
Beutel, Schlauch (Alexopoulos 1952)), welche etwa 64 000 Spezies umfassen und damit das
größte Phylum darstellen, untergliedern sich in drei Subphyla (Bellemain et al. 2010):
Pezizomycotina (Echte Schlauchpilze), Taphrinomycotina und Saccharomycotina (Echte
Hefen). Die Abteilung der Basidiomycota (griech. basidion = kleiner Fuß (Alexopoulos 1952))
umfasst etwa 30 000 Spezies, gegliedert in drei Unterabteilungen sowie zwei Subphyla
incertae sedis (Bellemain et al. 2010): Wallemiomycetes und Entorrhizomycetes werden
derzeit auf Grundlage verschiedener DNA-Analysen als Schwestergruppen zu den
Basidiomyceten gezählt, da sie keinem anderen Subphylum zugeordnet werden konnten
(Hibbett et al. 2007).
3
Abbildung 1: Darstellung der gegenwärtigen Systematik der Pilze Nach Adl et al. (2012) wird das Reich der Fungi der Gruppe Opisthokonta zugewiesen. Es untergliedert sich in 6 Phyla. Hibbett et al. stellten die Mucoro-, Entomophthoro-, Zoopago- und Kickxellomycotina erstmals als Subphyla incertae sedis dar (Hibbett et al. 2007). Adl et al. fügten das Subphylum Mortierellomycotina hinzu. Nach Jones und Richards (2011) stehen die Cryptomycota innerhalb dieses Reiches.
Neocallimastigo-
mycota Neocallimastigo-
mycotina Neocallimastigales
Chytridiomycota Chytridiomycetes
Chytridiales Cladochytriales Rhizophydiales Polychytriales
Spizellomycetales Rhizophlyctidales
Lobulomycetaceae
Monoblepharidales
Saccharomycotina Saccharomycetes
Taphrinomycotina
Schizosaccharomycetes Taphrinomycetes
Archaeorhizomycetes Neolectomycetes
Pneumocystidomycetes
Pezizomycotina
Arthoniomycetes Dothideomycetes Eurotiomycetes
Geoglossomycetes Laboulbeniomycetes Lecarnoromycetes
Leotiomycetes Lichinomycetes Orbiliomycetes Pezizomycetes
Sordariomycetes
Blastocladio- mycota Blastocladiales
Kickxellomycotina
Asellariales Dimargaritales
Harpellales Kickxellales
Glomeromycota
Zoopagomycotina Zoopagales
Entomophthoro-mycotina
Entomophthorales
Mucoromycotina Mucorales Endogonales
Microsporidia
Opisthokonta
Fungi
Ascomycota
Dikarya
Basidiomycota
Wallemiomycetes Wallemiales
Pucciniomycotina
Agaricostilbomycetes Atractiellomycetes Classiculomycetes
Cryptomycocolacomycetes Cystobasidiomycetes Microbotryomycetes
Mixiomycetes Pucciniomycetes
Ustilaginomycotina Exobasidiomycetes Ustilaginomycetes
inc. sed. Malasseziales
Entorrhizomycetes Entorrhizales
Agaricomycotina Agaricomycetes Tremellomycetes
Mortierellomycotina Mortierellales
Cryptomycota Rozella
1 EINLEITUNG
4
Arten, die den anaeroben Pilzen Neocallimastigomycota zugeschrieben werden, leben
ausschließlich im Verdauungstrakt von Säugetieren. In früheren Systematiken wurden sie
den Chytridiomycota zugeordnet, da sie mit ihnen die Ausbildung beweglicher Zoosporen
(griech. zoön = tierisch, sporos = Samen (Alexopoulos 1952)) gemein haben. Ebenfalls
Zoosporen besitzen Pilze des Phylums Cryptomycota, deren Zuordnung jedoch nicht
ausreichend geklärt ist. Jones et al. haben in den drei bisher untersuchten Lebenszyklen des
Wasserkeims keine Anzeichen für eine chitin- bzw. cellulosehaltige Zellwand gefunden
(Jones et al. 2011b). Dies wurde bis dato als eine charakteristische Eigenschaft der Fungi
aufgefasst, obwohl Protisten gleichermaßen eine chitinhaltige Zellwand besitzen. Ungeklärt
ist weiterhin die Zugehörigkeit des Phylums Microsporidia. Die Ursache hierfür liegt in einer
zellulären Besonderheit: anstelle der Mitochondrien besitzen sie Mitosomen, welche als
Rudimente früherer Mitochondrien angesehen werden und nur in anaeroben oder
mikroaerophilen Einzellern zu finden sind. Für die weitergehende Untergliederung des
Phylums Microsporidia gibt es zum derzeitigen Stand nicht genügend Untersuchungen (Adl
et al. 2012). Neueste phylogenetische Analysen von James et al. lassen jedoch vermuten,
dass Microsporidia und Cryptomycota ein gemeinsames Phylum von Endoparasiten bilden
könnten (James et al. 2013). Unter den Blastocladiomycota sind begeißelte, saprobische
und/oder parasitäre Pilze zusammengefasst.
1.3 Morphologie
Ganz allgemein versteht man unter Pilzen Mikroorganismen, die entweder als Einzelzellen
(Hefen) oder multizelluläre Kolonien (Schimmelpilze) wachsen. Während sich die Größe
einer Hefezelle mit etwa 3-10 µm beschreiben lässt, ist die des Schimmelpilzes aufgrund
seines Zellverbundes nicht definierbar (Kayser et al. 1989). Er zeigt als Grundgestalt oftmals
eine verzweigte Struktur mit einem Durchmesser von etwa 2-10 µm, welche als Hyphe
(griech. hyphe = Netz) bezeichnet wird (Kayser et al. 1989). Hyphen können sowohl septiert
(Latein: septum = Abtrennung, Abteilung) als auch unseptiert vorliegen und mehrere
Zellkerne besitzen (Kayser et al. 1989; Weber 2010). Das beim Koloniewachstum
entstehende Geflecht aus Hyphen wird in seiner Gesamtheit Myzel genannt. Derjenige Teil,
der in das Nährsubstrat eindringt, markiert das vegetatives Myzel, während der an der
Oberfläche verbleibende Teil als Luftmyzel charakterisiert ist (Kayser et al. 1989; Weber
2010). Hefen sind nur unter bestimmten Umständen in der Lage sog. Pseudohyphen zu
bilden (Dimorphismus): bei der Knospung spalten sich dabei die Tochterzellen nicht
vollständig von den Mutterzellen ab. Dabei entstehen typische Einschnürungen der
Zellwände. Dimorphismus tritt auch bei einigen Schimmelpilzen unter anaeroben
Bedingungen auf: einige Mucor-Arten bilden bei Abwesenheit von Sauerstoff Hyphen und
auch Einzelzellen wie Hefen aus (Kayser et al. 1989; Weber 2010; Baumgart et al. 2012).
1 EINLEITUNG
5
Die meisten bekannten Arten besitzen eine chitin- und glucanhaltige Zellwand. Eine
Ausnahme stellt hier Rozella dar: dieser Pilz weist nur ein zellwandumhülltes und damit
umweltresistentes Sporangium auf (James et al. 2006; Jones et al. 2011a, 2011b; Livermore
und Mattes 2013).
1.4 Bedeutung von Pilzen in Lebensmitteln
1.4.1 Allgemeine Bedeutung – vom Produzenten zum Destruenten
Prinzipiell gibt es drei Gründe, warum die Anwesenheit eines Mikroorganismus in einem
Lebensmittel wichtig sein kann (Fleet 1992):
1. Der Mikroorganismus führt eine gewünschte Veränderung des Produktes wie
z.B. eine Fermentation durch.
2. Der Mikroorganismus verändert das Produkt auf unerwünschte Weise und
kann damit den Verderb einleiten.
3. Der Mikroorganismus ist pathogen und stellt damit ein potentielles Risiko für
die Gesundheit dar.
Hefen und Schimmelpilzen kann jede dieser drei Rollen in Lebensmitteln zugeschrieben
werden. Sie sind bei der Herstellung von Bier, Wein, Joghurt und Käse beteiligt (Baleiras
Couto et al. 1996; Boekhout und Robert 2003; Hatoum et al. 2012), können aber gleichzeitig
zum Verderb führen (Fleet 1992). Außerdem kann der Befall eines Lebensmittels mit
mykotoxinbildenden Hyphomyceten vor allem bei immungeschwächten Menschen (und
Tieren) zu gesundheitlichen Schäden führen (Baumgart et al. 2012). Weniger als ein
Dutzend Pilze sind für über 90 Prozent aller Pilzinfektionen, welche durch Allergene oder
Toxine bzw. einen direkten Wirtbefall eine Immunantwort auslösen, verantwortlich
(Yamaguchi et al. 2007).
Jeder Prozessschritt und die Lagerung eines Produktes birgt die Gefahr einer Kontamination
mit Pilzen (Baleiras Couto et al. 1996). Durch ihre lipolytischen und proteolytischen
Eigenschaften können sie das Lebensmittel stark verändern, so dass neben der strukturellen
Modifikation oft auch eine Beeinträchtigung des Geschmacks, des Geruches und/oder der
Farbe registriert werden kann (z.B. Debaryomyces hansenii, Yarrowia lipolytica) (Fleet 1992;
Boekhout und Robert 2003; Rawsthorne und Phister 2006; Lucera et al. 2012). Bei
Fruchtsäften kann es zur Ausbildung einer Trübung oder eines Bodensatzes kommen (Back
2000; Baumgart et al. 2012). Diese Veränderungen können letztlich bis zum Verderb des
Produktes führen, welcher mit wirtschaftlichen Verlusten einhergeht (Back 2000; Boekhout
und Robert 2003; Rawsthorne und Phister 2006; Baumgart et al. 2012).
Grundlegend werden zwei Arten von Kontaminationen unterschieden: Bei der
Primärkontamination liegt bereits ein Befall des eingesetzten Rohstoffes wie z.B. Früchten
1 EINLEITUNG
6
vor, während bei der Sekundärkontamination der Befall während des Prozessablaufs auftritt
(Back 2000). Dies kann beispielsweise im Abfüllbereich eines Getränkeherstellers durch
unzureichend gesäuberte Flaschen, Sporen in der Raumluft oder über Schwitz-, Tropf- und
Sprühwasser vor dem Verschließen der Flaschen geschehen (Back 2000, 2008). Prinzipiell
ist eine Kontamination von intrinsischen (z.B. pH-Wert, Sauerstoffverfügbarkeit, Inhaltsstoffe,
Wasseraktivität) und extrinsischen Faktoren (z.B. Lagerungstemperatur, Lagerungsdauer,
Luftfeuchtigkeit) abhängig (Fleet 1992; Baumgart et al. 2012; Lucera et al. 2012).
Verderbspilze gehören meist den Phyla Asco- und Basidiomycota sowie dem Subphylum
Mucoromycotina an. Hefen zeigen einen meist stark ausgeprägten fermentativen Charakter
und eine hohe Osmotoleranz. Einige Arten wie z.B. Zygosaccharomyces bailii sind resistent
gegenüber bestimmten Konservierungsmitteln (Fleet 1992; Back 2000; Baumgart et al.
2012). Hyphomyceten können Produkte mit geringer Wasseraktivität befallen: der extrem
xerophile Pilz Xeromyces bisporus kann bei einem aw-Wert von 0,62 noch wachsen (Leong
et al. 2011). In Abhängigkeit der Säure tolerieren Schimmelpilze pH-Werte von etwa 3,0 bis
8,0 (Baumgart et al. 2012). Es finden sich psychrotrophe bis thermophile Vertreter, die meist
aerob, aber teilweise auch anaerob wachsen können (Baumgart et al. 2012).
1.4.2 Kontamination von alkoholfreien Getränken
Der Begriff der Alkoholfreien Getränke (Abk. AfG) umfasst lebensmittelrechtlich
eigenständige Getränkegattungen wie Fruchtsäfte, -nektare und Erfrischungsgetränke sowie
deren Erzeugnisse, aber auch Tafel-, Quell- und natürliche Mineralwässer (Back 2000).
Alkoholfreie Getränke (AfG)
hochsafthaltige
Getränke
nichtalkoholische aromatisierte
Getränke
Wässer
Abbildung 2: Einteilung der alkoholfreien Getränke Nach Back (Back 2000)
Säfte und Nektare
Fruchtsäfte
Fruchtnektare
Fruchtsirupe
Gemüsesäfte
Gemüsenektare
milchsauer vergorene
Gemüsesäfte bzw. -nektare
Erfrischungsgetränke
Fruchtsaftgetränke
X-Saftgetränke
Limonade
Cola-Limonaden
Brausen
Mineralstoff-Getränke
„Mineralwasser plus
Frucht―-Getränke
Brennwertreduzierte und –
arme Erfrischungsgetränke
Tafelgetränke
natürliches Mineralwasser
Quellwasser
Tafelwasser
Diätnektare Diätgetränke Heilwasser
1 EINLEITUNG
7
Dabei dürfen Fruchtsäfte einen Alkoholgehalt von 0,5% Vol. aufweisen - eine Ausnahme
stellt Traubensaft dar: hier wird nach der Verordnung EWG 822/87 des Rates vom 16. März
1987 über die gemeinsame Marktorganisation für Wein Anhang I (Nr. L84/43 ff.) bis zu
1% Vol. Alkohol geduldet.
Säfte und Nektare sind im Allgemeinen sehr nährstoffreich und bilden damit eine geeignete
Wachstumsgrundlage für Mikroorganismen. Aufgrund ihrer hohen Konzentration an
Fruchtsäuren und dem damit verbundenen niedrigen pH-Wert von etwa 2,5 - 4,5 begrenzt
sich das Spektrum möglicher Kontaminanten jedoch auf acidophile bzw. -tolerante Hefen,
Schimmelpilze und Alicyclobacillus sowie Essig- und Milchsäurebakterien (Pettipher et al.
1997; Back 2000; Wareing und Davenport 2000; Arias et al. 2002; Ros-Chumillas et al. 2002;
Baumgart et al. 2012). Ätherische Öle, die vor allem bei der Verarbeitung von Zitrusfrüchten
frei werden, hemmen das Wachstum von Kontaminanten. Bei stillen Getränken wird, sofern
die Verpackung dies zulässt, eine schonende Hitzebehandlung zur Abtötung von
Kontaminanten durchgeführt (Fleet 1992; Arias et al. 2002), so dass lediglich ein Restrisiko
des Befalls durch hitzeresistente, aber meist seltene Keime wie Byssochlamys fulva,
Neosartorya fischeri und Talaromyces flavus besteht (Back 2000; Wareing und Davenport
2000; Baumgart et al. 2012). In karbonisierten Getränken engt das anaerobe Milieu die
Gruppe möglicher Verderbsorganismen zusätzlich stark ein. Durch die zugesetzte
Kohlensäure muss der Organismus acidophil, (fakultativ) anaerob oder zumindest
mikroaerophil sein. Dies trifft nur noch auf gärfähige Hefen und Milchsäurebakterien zu.
Damit kann – bei gewährleisteter Keimfreiheit der Rohstoffe und Betriebsanlagen – eine
Kaltabfüllung des Getränks stattfinden (Back 2000; Arias et al. 2002). Erfrischungsgetränke
wie Brausen und Limonaden haben neben der zugesetzten Kohlensäure noch das geringe
Nährstoffangebot als Kontaminationsschutz (Back 2008).
Sowohl in stillen als auch karbonisierten Getränken kann ein Befall mit Saccharomyces
cerevisiae auftreten (Arias et al. 2002; Casey und Dobson 2004), welcher als häufigster
Limonadenschädling anzusehen ist (Back 2000). Die Hefe kann den im Getränk
vorhandenen Zucker (z.B. Glucose, Fructose, Maltose) verwerten, was zur Entstehung von
typischen fruchtesterartigen Gäraromen und Alkoholen führt (Fleet 1992; Back 2000). Dies
geht z.T. mit unangenehmen Geschmacks- und Geruchsänderungen einher. Durch das bei
der Gärung entstehende Kohlenstoffdioxid kommt es zu Verpackungsbombagen (Fleet
1992). Infolge der pektolytischen Aktivität klaren fruchttrübe Getränke aus und zeigen eine
verstärkte Bodensatzbildung. Stämme, die in alkoholfreien Getränken auftreten, sind meist
säuretoleranter als Brauereihefen (Back 2008). Prinzipiell ist auch eine Kontamination mit
einem Brauereistamm möglich (Back 2000, 2008).
In Fruchtzubereitungen wie Fruchtsirupen, -konzentraten, -pürees und Fruchtmark findet sich
am häufigsten ein Befall durch Zygosaccharomyces bailii (Back 2000, 2008; Casey und
1 EINLEITUNG
8
Dobson 2004; Rawsthorne und Phister 2006), da dieser Keim eine hohe Osmo- und
Säuretoleranz aufweist und zudem bei niedrigen Wasseraktivitäten und geringem
Sauerstoffgehalt wachsen kann (Fleet 1992; Steels et al. 1999; Back 2000, 2008;
Rawsthorne und Phister 2006). Wie Saccharomyces-Stämme bildet Zygosaccharomyces
unerwünschte Alkohole und Kohlensäure, wodurch Geschmacks- und Geruchsänderungen
eintreten (Steels et al. 1999; Back 2000).
Eine Kontamination mit Hyphomyceten ist nur in stillen Getränken möglich. Aufgrund ihres
Sauerstoffbedarfs können sie nur an der Flüssigkeitsoberfläche, im Flaschenhals oder den
Verschlüssen wachsen (Back 2000, 2008; Boekhout und Robert 2003). Sie bilden meist
einen sichtbares Myzel im Getränk aus (Back 2008). Die metabolische Umsetzung der
zugegebenen Konservierungsstoffe ist z.B. durch Arten wie Penicillium roquefortii möglich
(Back 2000, 2008). Sichtbar wird eine Kontamination vor allem bei abgefüllten, fruchttrüben
Getränken: infolge der pektolytischen Aktivität zeigt sich zunächst ein Wasserkragen am
Flaschenhals, welcher sich letztlich durch das gesamte Getränk zieht. Die abgebauten
Pektine fallen flockig zu einem starken Bodensatz aus (Back 2000, 2008). Penicillium- und
Aspergillus-Arten gelten als häufigste Luftkeime, während hitzeresistente Askosporen von
Schimmelpilzen wie Byssochlamys Primärkontaminationen auslösen (Back 2000, 2008;
Wareing und Davenport 2000).
Weitere Kontaminanten stiller Getränke sind verschiedene Candida-Arten wie C. parapsilosis
oder C. intermedia, Torulaspora delbrueckii, Pichia spp., Hanseniaspora spp. und
Metschnikowia spp. (Back 2000; Arias et al. 2002; Casey und Dobson 2004). Rhodotorula
und Cryptococcus können sich aufgrund des hohen Sauerstoffbedarfs selbst in stillen
Getränken kaum vermehren und treten daher als Latenzkeime in Erscheinung (Back 2008).
1.5 Angewandte Methoden zum Nachweis von Pilzen
Besonders für den Nachweis von Fungi in Lebensmitteln wurde in den letzten Jahrzehnten
bereits eine Vielzahl an mikro- und molekularbiologischen Detektionsverfahren entwickelt
und beschrieben.
Prinzipiell gilt es zwei Arten zu unterscheiden:
1. direkte Methoden, z.B. Anzucht der Organismen auf Agar oder in Flüssigkultur
2. indirekte Methode, bei der ein Genprodukt des Organismus nachgewiesen wird, z.B.
Enzymassays
Die angewandten Detektionsverfahren decken beinahe alle Bereiche der mikro- und
molekularbiologischen Methoden ab. Auf einige wichtige soll in den nächsten Abschnitten
genauer eingegangen werden.
1 EINLEITUNG
9
Tabelle 1: Auflistung der Methoden zum Nachweis von Fungi
Methode Prinzip Identifikation Quantifizierung
mikrobiologisch
Universalmedien Beurteilung des Koloniewachstums (Morphologie, Koloniezahl etc.) und evtl. Gasbildung
(X) X Selektiv-/Differentialmedien
X X
Durchflußzytometrie und FACS
Nachweis von Zielorganismen über Fluoreszenz*
X X
Impedanz
Messung des Wechselstromwiderstands an Elektroden durch Wachstum/Absterben
- X
molekularbiologisch
(Real-time)-PCR Nachweis eines Genabschnittes mit universellen oder spezies-/artspezifischen Primern
X X
Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (Abkz. RFLP)
Nachweis eines Genabschnittes mit universellen Primern mit anschl. Restriktionsverdau und Gelelektrophorese
X -
Randomly amplified polymorphic DNA Assay (Abkz. RAPD)
Zufälliger Nachweis von undefinierten Genabschnitten und anschl. gelelektrophoretische Auftrennung
X -
ELISA Nachweis von Proteinen X X
Chromatographie Nachweis bestimmter Metabolite (z.B. Alkohole, Säuren, Mykotoxine)
X X
Spektroskopie Analyse bestimmter Metabolite X X
Kolorimetrie Bestimmung einer Farbänderung in Flüssigkeit
- X
Fluorenzmikroskopie
Markierung von Zellen/Zellbestandteilen mit bestimmten Farbstoffen/ Gensonden
X X
(Loureiro 2000; Huang et al. 2003) X zur Identifikation/Quantifizierung anwendbar (X) zur Identifikation/Quantifizierung eingeschränkt anwendbar - zur Identifikation/Quantifizierung nicht anwendbar * nicht anwendbar für Hyphomyceten (nur für Einzelzellen)
1.5.1 Mikrobiologischer Nachweis
In der Lebensmittelindustrie ist die konventionelle, mikrobiologische Untersuchung einer
Probe auf Abwesenheit bzw. das Auszählen von Organismen auf Nährbodenplatten mit
anschließender makro- und/oder mikroskopischer Betrachtung häufig noch der Goldstandard
(Hierro et al. 2006). Aus diesem Grund wurde in den letzten Jahrzehnten eine Vielzahl an
Nährmedien zur Anzucht, Isolation und Selektion von Hefen und Schimmelpilzen entwickelt,
welche sich in Universal- und Selektivnährmedien untergliedern lassen.
Universalmedien variieren zumeist in der eingesetzten Zucker- (z.B. Glucose, Fructose,
Sucrose) und Stickstoffquelle (z.B. Pepton, Trypton, Casein) sowie den weiteren komplexen
Zusätzen (z.B. Hefe-, Malzextrakt) (Wareing und Davenport 2000). Gemein haben sie die
Anforderung durch ein breites Nährstoffangebot das Wachstum möglichst vieler relevanter
1 EINLEITUNG
10
Pilze zu erlauben und zu fördern, während Fremdkeime wie Bakterien unterdrückt werden
sollten. Letzteres wird durch die Zugabe von Antibiotika wie z.B. Chloramphenicol,
Chlortetracycline, Oxytetracycline oder Streptomycin oder das Senken des pH-Wertes auf
3,5 erreicht. Üblich ist jedoch die Verwendung von Antibiotika, da die Wiederfindungsrate
höher ist. Chloramphenicol eignet sich besonders, da es hitzestabil ist und daher vor dem
Autoklavieren dem Medium zugesetzt werden kann (Baumgart et al. 2012). Derzeit existiert
allerdings kein Medium, das den Anforderungen aller Pilze genügt, da in vielen Fällen
entweder Hefen oder Hyphomyceten im Fokus stehen. Des Weiteren ist die Wahl des
Mediums von der zu untersuchenden Probe abhängig (Baumgart et al. 2012). Das
Hefeextrakt-Glucose-Chloramphenicol-Medium (engl. yeast extract glucose chloramphenicol
broth, Abkz. YGC), das Hefeextrakt-Malzextrakt-Glucose-Medium (engl. yeast extract malt
extract glucose broth; Abkz. YM), der Malzextrakt-Agar (Abkz. MA bzw. MEA), der Würze-
Agar sowie der Trypton-Glucose-Hefeextrakt-Agar (Abkz. TGYA) unterstützen dennoch das
Wachstum einer großen Bandbreite an Pilzen und können demnach als Universalmedien
bezeichnet werden (Baumgart et al. 2012). Es ist ersichtlich, dass eine Vielzahl dieser
Medien einen sehr hohen Zuckergehalt aufweist, welches eine zusätzliche Hemmung
bakteriellen Wachstums zur Folge hat. Nährlösungen wie YGC oder YM werden zur
Untersuchung schwach kontaminierter Lebensmittel als Anreicherungsmedium verwendet.
Selektivnährmedien fördern das Wachstum eines Mikroorganismus oder einer Gruppe von
Mikroorganismen und sind demnach auf ihre Ansprüche und Fähigkeiten hin angepasst.
Hefearten, von denen eine gewisse Konservierungsstoffresistenz bekannt ist, werden auf
schwach sauren Nährböden wie z.B. Malzextrakt-Agar oder TGYA mit 0,5-1 % Essigsäure
angezogen (Rawsthorne und Phister 2006; Baumgart et al. 2012). Proben, in denen eine
hohe Keimzahl osmotoleranter Hefen erwartet wird, werden auf Glucose-50- (Abkz. G50)
oder Kartoffel-Dextrose-Agar (Abkz. PDA) mit 60 % Saccharose ausgespatelt (Baumgart et
al. 2012). Bei Lebensmitteluntersuchungen werden häufig Dichloran-Glycerin-Agar (DG18)
oder Dichloran-Bengalrot-Agar herangezogen (Baumgart et al. 2012). Mit der Zugabe von
18 % Glycerin wird der aw-Wert des Mediums herabgesetzt, wodurch xerophile
Schimmelpilze einen geeigneten Nährboden finden. Dichloran und Bengalrot sind
fungistatische Substanzen, die eine inhibierende Wirkung auf schnell wachsende Pilze
haben. Die Identifizierung langsam wachsender Arten wird infolge der Vermeidung von
Überwucherungen ermöglicht (Baumgart et al. 2012).
In der Mikrobiologie finden zwei grundlegende Arten der Keimzahlbestimmung Anwendung:
das Oberflächenverfahren sowie das Koch'sche Plattengussverfahren (Loureiro 2000).
Während das Plattengussverfahren eine Differenzierung zwischen Gär- und Atmungshefen
ermöglicht, aber gleichzeitig durch den erwärmten Agar einen Hitzestress auf die Keime
ausüben kann, werden mit Hilfe des Oberflächenverfahrens höhere Zellzahlen erzielt
1 EINLEITUNG
11
(Boekhout und Robert 2003). Allerdings stößt es infolge des geringen Probevolumens bei
geringen Keimzahlen an Nachweisgrenzen. Diese können durch den Einsatz der
Membranfiltration (Fleet 1992), welche sich mit dem Oberflächenverfahren kombinieren
lässt, oder einer vorhergehenden Anreicherung in Flüssigmedium umgangen werden.
Der Goldstandard in der Fruchtsaftindustrie ist das sog. SSL-Verfahren (Abkz. schneller
Spurennachweis für Limonadenschädlinge), das dem Nachweis osmophiler Hefen dient
(Back 2000; Baumgart et al. 2012). Eine Flüssiganreicherung der Probe unter optimierten
Bedingungen resultiert in einer recht kurzen lag-Phase und begünstigt zudem das
Auskeimen von Sporen (Back 2000). Die Zellvermehrung wird auch in schwach
kontaminierten Proben derart unterstützt, dass ein Überimpfen in eine Gussplatte mit
Orangenfruchtsaft-Agar (Abkz. OFS) bereits nach 24h bis 48h möglich ist. Dieser Agar weist
eine ähnliche Zusammensetzung wie die eingesetzten Getränkeproben auf: Zusatzstoffe wie
ätherische Öle in Kombination mit einem niedrigen pH-Wert bieten den Getränkeschädlingen
bessere Wachstumsbedingungen als der harmlosen Begleitflora (Baumgart et al. 2012).
Nach weiteren 2-5 Tagen kann die makro- und mikroskopische Auswertung erfolgen. In
Abhängigkeit der Probenbeschaffenheit (kohlensäurehaltig, (un-)konservierte Halbware wie
Konzentrat oder Püree, Zuschlagsstoffe, fruchttrübe und klare Getränke etc.) ist festgelegt,
welches Mischungsverhältnis von Probe zu Medium gewählt wird und ob eine direkte
Gusskultur in OFS-Agar sinnvoll ist. Das SSL-Verfahren zeichnet sich durch den geringen
Kostenfaktor und Materialaufwand sowie der relativen Zeitersparnis aus. Eine quantitative
Aussage kann infolge der Anreicherung nicht erfolgen – die Beurteilung der Kontaminanten
steht hier im Vordergrund (Back 2000).
Regelmäßige Qualitätskontrollen können den Befall und damit den Verderb reduzieren
(Casey und Dobson 2004), führen aber bei der mikrobiologischen Durchführung schnell zu
einem enormen Proben- und Arbeitsaufwand. Der hohe Zeitaufwand ist ein weiterer Nachteil
der kultivierungsabhängigen Techniken (Dlauchy et al. 1999; Arias et al. 2002; Bleve et al.
2003; Phister und Mills 2003; Casey und Dobson 2004; Hierro et al. 2006; Nocker und
Camper 2006). Hinzukommen die teilweise schwierige Beurteilung der Resultate und deren
ungenügende Reproduzierbarkeit, da je nach eingesetztem Medium und
Inkubationstemperatur variable Resultate erhalten werden (Baleiras Couto et al. 1996;
Nocker und Camper 2006). Gerade in industriellen Prozessen muss ein zeitsparendes,
sicheres Verfahren eingesetzt werden, das ein frühestmögliches Eingreifen in den
Produktionsprozess zulässt (Arias et al. 2002; Bleve et al. 2003; Martorell et al. 2005; Józwa
und Czaczyk 2012). Des Weiteren ist die quantitative Analyse von Schimmelpilzen in einer
Probe nicht möglich, da der Zerschlagenheitsgrad des Myzels der entscheidende Faktor für
die KBE-Bestimmung auf einem Nährboden ist. Die Methode der mikrobiologischen
Kultivierung ist außerdem stark abhängig vom physiologischen Zustand einer Zelle: im sog.
1 EINLEITUNG
12
VNBC-Status (engl. viable but non-culturable – lebend, aber nicht kultivierbar) sind Zellen
zwar metabolisch aktiv, bilden aber auf Nährböden keine Kolonien aus, wodurch eine
Zellzahlbestimmung nicht möglich ist (Bleve et al. 2003; Nocker und Camper 2009; Salinas
et al. 2009; Paparella et al. 2012).
Ein weiteres Verfahren zur Analyse vor allem flüssiger Lebensmittel ist die
Durchflußzytometrie. Der Probe wird hierbei ein fluoreszierender Farbstoff oder ein
fluoreszenzmarkierter Antikörper zugesetzt, welcher sich in oder an den entsprechenden
Zielkeim anlagert. Das Gerät verfügt über eine schmale Küvette, in der die Zellen einzeln per
Überdruck an einem Laserstrahl vorbei geleitet werden, wobei der Strahl in seiner
Wellenlänge mit dem Absorptionsspektrum des eingesetzten Farbstoffs übereinstimmen
muss. Je nach Zellgröße und –form werden Signale zu einem Detektor zurückgeworfen und
aufgenommen. Es werden dabei verschiedene Parameter wie Streulicht und
Fluoreszenzintensität gemessen (Józwa und Czaczyk 2012; Paparella et al. 2012). Aus den
Daten können schließlich quantitative Analysen und Aussagen über den Zellzustand
(Stadium des Zellzyklus, Analyse bestimmter Oberflächenmarker etc.) getroffen werden. Mit
der Weiterentwicklung zum FACS-System (Abkz. Fluorescence activated cell sorting)
werden die identischen Parameter wie bei der Durchflußzytometrie erfasst, gleichzeitig wird
allerdings noch eine Sortierung der Zellen in sterile Auffanggefäße nach den jeweils
ausgesendeten Signalen vorgenommen (Paparella et al. 2012). Voraussetzung zur Nutzung
dieser beiden Techniken ist das Vorliegen einer Einzelzellsuspension (Paparella et al. 2012).
Die Untersuchung schimmelpilzbelasteter Proben ist somit unmöglich. Es müssen Sporen
oder Konidien vorliegen, um zumindest eine qualitative Aussage erhalten zu können. Die
Durchflußzytometrie hat als schnelle, vollautomatisierte Methode Einzug in die
Lebensmittelindustrie gehalten, da sie die Identifikation von Einzelzellen in einer
Zellpopulation sowie zeitgleich die Differenzierung zwischen lebenden, metabolisch aktiven
und toten Zellen ermöglicht (Józwa und Czaczyk 2012; Paparella et al. 2012).
1.5.2 Molekularbiologische Nachweismethoden
Molekularbiologische Nachweisverfahren beruhen auf der Identifikation von Genen oder
Genprodukten eines Organismus oder einer Gruppe von Organismen. Mit der erstmaligen
Erwähnung der Polymerase-Kettenreaktion (Abkz. PCR) durch Saiki et al. im Jahr 1985 und
ausführlichen Beschreibung durch Mullis et al. 1986 wurden viele Varianten hiervon
entwickelt (Saiki et al. 1985; Mullis et al. 1986). Bei der klassischen PCR findet eine
enzymatisch katalysierte Vervielfältigung eines von zwei Primern flankierten DNA-
Abschnittes in einem mehreren Zyklen der Denaturierung, Primeranlagerung und
Strangverlängerung durchlaufenden Temperaturprofils statt (Saiki et al. 1985). Das
entstandene Amplifikat wird entweder direkt gelelektrophoretisch aufgetrennt oder mit
1 EINLEITUNG
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Restriktionsenzymen verdaut, so dass auf dem Gel ein spezifisches Fragmentmuster
entsteht (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus, Abkz. RFLP) (van der Vossen und
Hofstra 1996). Diese Methode ist jedoch sehr zeitaufwändig. Gerade zu Beginn der PCR-
Analytik existierten nur wenige sequenzierte Genome von Mikroorganismen, wodurch
spezies- oder artspezifische Primer Designs nicht möglich waren. Mit der Methode der
Randomly amplified polymorphic DNA (Abkz. RAPD) werden kurze, unspezifische Primer in
einen Reaktionsansatz eingebracht, die dann beliebig DNA-Abschnitte vervielfältigen. Auch
hier liefert die gelelektrophoretische Auftrennung ein spezifisches Muster, das zur
Identifizierung herangezogen werden kann – beispielsweise erlaubt es die Unterscheidung
unter- und obergäriger Hefen von Verderbsorganismen in der Brauerei und liefert dabei
schnellere Resultate als Flokkulationstests (Coakley und Ross 1996). Diese Verfahren
haben gemein, dass eine quantitative Aussage immer nur bedingt möglich, der
Arbeitsaufwand enorm hoch und dabei die Reproduzierbarkeit eingeschränkt ist.
Mit dem Einsatz der thermostabilen Thermus-aquaticus-DNA-Polymerase (Abkz. Taq)
anstelle des Klenow-Fragments der E.coli-DNA-Polymerase I konnten Arbeitsschritte und
Kreuzkontaminationen verringert werden ((Saiki et al. 1988) zitiert nach (Holland et al.
1991)). Die Ausstattung des PCR-Cyclers mit UV-Lampe und Kamera sowie dem
Hinzufügen von Ethidiumbromid, welches später durch andere interkalierende Farbstoffe wie
Hoechst 33258 oder SYBR® Green ersetzt wurde, erlaubten erstmals eine direkte, visuelle
Auswertung (Higuchi et al. 1992, 1993). Eine quantitative Aussage ist aufgrund der
unspezifischen Bindung an jede verfügbare DNA nur in gewissem Maße möglich. Erste
Versuche durch Holland et al. zur Generierung eines spezifischen Produktsignals während
der Amplifikationsphase sollten die weitere Reduzierung des Arbeitsaufwandes,
insbesondere nach erfolgter PCR, einleiten (Holland et al. 1991).
Beim TaqMan-Prinzip wird ein (früher radioaktiv-)markiertes Oligonukleotid, das spezifisch
für den von beiden Primern flankierten Bereich ist, nach Hybridisierung am komplementären
Strang über die 5‗3‗-Exonukleaseaktivität des Enzyms in Mono- und Dinukleotide
abgebaut. Heutzutage weist das Oligonukleotid am 5‗-Ende einen Reporterfarbstoff auf,
dessen Extinktionswellenlänge mit der Absorptionswellenlänge des Quenchers – einem
Fluorophor am 3‗-Ende – übereinstimmt (Cardullo et al. 1988). Durch die räumliche Nähe
beider Fluorophore wird somit bei Anregung des Reporters dessen emittiertes Licht
strahlungsfrei vom Quencher aufgenommen und seinem Emissionsspektrum entsprechend
abgestrahlt. Dieser Effekt wird FRET- oder Förster-Effekt genannt (Förster 1948). Erst bei
Hydrolyse der Sonde und der räumlichen Trennung der Farbstoffe kann das vom Reporter
emittierte Licht einer bestimmten Wellenlänge in Echtzeit von einem Detektor nachgewiesen
und in ein Signal umgewandelt werden. Durch die Online-Überwachung des Experimentes
mittels Computer wird das Verfahren Real-time-PCR genannt (Mülhardt 2009).
1 EINLEITUNG
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Abbildung 3: Prinzip der TaqMan-PCR Dargestellt ist das Prinzip der TaqMan-PCR nach Holland et al. (Holland et al. 1991). Das Enzym verlängert den von den Primern definierten Genabschnitt. Aufgrund der 5‗3‗-Exonukleaseaktivität hydrolysiert es den doppelsträngigen DNA-Abschnitt, an dem die TaqMan-Sonde spezifisch gebunden hat. Mit der räumlichen Trennung der beiden Farbstoffe (R = Reporter; Q = Quencher) verringern sich die Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, so dass die vom Reporterfluorophor emittierte Strahlung detektiert werden kann (Förster 1948).
Bei Hybridisierungssonden hingegen wird nach der Hybridisierung zweier unterschiedlicher
Oligonukleotide am Zielmolekül in räumlicher Nähe zueinander – ebenfalls unter Ausnutzung
des FRET-Effektes – nur die Lichtstärke des zweiten Farbstoffes gemessen (Mülhardt 2009).
Als Weiterentwicklung zu den TaqMan-Sonden traten in den 90er Jahren Molecular
Beacons - eine Sonderform der Hybridisierungssonden - in Erscheinung, bei denen am 5‗-
und 3‗-Ende zueinander komplementäre Sequenzen liegen, was zur Ausbildung einer
Haarnadelstruktur führt. Damit liegen beide Farbstoffe garantiert räumlich beieinander und
liefern erst bei der Hybridisierung an den komplementären DNA-Strang die gewünschte
Fluoreszenz (Tyagi und Kramer 1996). Nach EN ISO 20838:2006, welche die
„Anforderungen an Amplifikation und Nachweis bei qualitativen Verfahren― festschreibt, sind
spezifische Sonden als eine Möglichkeit zur Identitätsprüfung des generierten Amplifikats in
einem PCR-Reaktionsmix erklärt.
In den ersten Amplifikationszyklen kann eine exponentielle Vermehrung der DNA stattfinden
(Mülhardt 2009). Mit der zunehmenden Produktmenge treten dann erste Störfaktoren in
Erscheinung: Primer, Sonden und Nukleotide werden aufgebraucht und infolge der
wiederkehrend hohen Temperaturen verliert die Polymerase an Effizienz (Mülhardt 2009).
Dies führt schließlich zu einer verlangsamten Reaktion, welches sich in einem linearen
Anstieg der Fluoreszenzsignalkurve wiederspiegelt (Mülhardt 2009). Beim endgültigen
Stillstand der Reaktion ist schließlich keine weitere Erhöhung der Fluoreszenzsignale zu
verzeichnen (Mülhardt 2009). Für die Quantifizierung einer Probe wird die Reaktionskinetik
genutzt: derjenige Zyklus der exponentiellen Phase, in dem das spezifische Produktsignal
erstmals das Hintergrundsignal überschreitet (Abkz. CT, engl. threshold cycle oder Cp, engl.
Crossing point), ist bedeutend (Mülhardt 2009). Durch das Mitführen eines Standards
bekannter DNA-Menge kann die ursprüngliche DNA-Menge der Probe ermittelt werden,
indem man die CT-Werte des Standards gegen den Logarithmus der anfangs eingesetzten
DNA–Mengen aufträgt. Mit der erhaltenen Standardkurve kann über den CT-Wert der Probe
der Gehalt an Ziel-DNA bestimmt werden (Mülhardt 2009).
1 EINLEITUNG
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Die Polymerase-Kettenreaktion zeichnet sich vor allem durch ihre hohe Spezifität aus: sie
ermöglicht die Identifikation von Organismusgruppen (Gattungen, Familien, Ordnungen)
ebenso wie die einer Spezies oder Subspezies in verschiedenen Matrizes (alkoholfreie und –
haltige Getränke, Milchprodukte, Kosmetika, klinische Proben etc.) (Arias et al. 2002; Ros-
Chumillas et al. 2002; Bleve et al. 2003; Brinkman et al. 2003; Casey und Dobson 2004;
Martorell et al. 2005; Hierro et al. 2006; Rawsthorne und Phister 2006; Yamaguchi et al.
2007; Vollmer et al. 2008; Salinas et al. 2009). Prinzipiell besteht beim Einsatz von Matrizes
die Gefahr der Freisetzung von Störstoffen für die PCR. Dies können Polyphenole, Fette,
Proteine und Polysaccharide sein, die dann zur Inhibition oder zum kompletten Verhindern
einer Reaktion führen (Ros-Chumillas et al. 2002). Um dennoch Aussagen darüber zu
erhalten, ob eine PCR-Reaktion erfolgreich verlaufen ist, wurden interne
Amplifikationskontrollen (Abkz. IAK) eingeführt (Fittipaldi et al. 2012): bei der homologen IAK
wird die Amplifikation mit denselben Primern wie für die Ziel-DNA durchgeführt, während die
Zielregionen für die Sonden unterschiedlich und sie selbst verschieden fluoreszenzmarkiert
sind. Heterologe IAKs hingegen sehen die Amplifikation mit einem zweiten Primerpaar vor,
wobei auch hier die gleiche, aber modifizierte (Mutagenese, Sequenzvariationen) Zielregion
genutzt werden kann (Lee et al. 2004). Da die Reagenzien für die IAK grundsätzlich im PCR-
Mix zugesetzt sind, kann für jede einzelne Probe der Amplifikationserfolg festgestellt werden.
Das Mitführen einer internen Amplifikationskontrolle ist mittlerweile in den ISO-Normen EN
ISO 22174:2005 und EN ISO 20383:2006 festgeschrieben.
1.5.3 Lebend/Tot-Differenzierung
Ein wesentlicher Nachteil der Polymerase-Kettenreaktion ist die fehlende Differenzierung
zwischen lebenden und toten Zellen. Insbesondere nach der Durchführung entsprechender
Keimabtötungsverfahren verbleibt die DNA toter bzw. inaktivierter Zellen im System und
liefert ein falsches Bild über den Dekontaminationserfolg. Bereits im Jahr 1993 konnte
Josephson festhalten, dass die DNA inaktivierter Organismen - in diesem Fall
hitzebehandelte E. coli-Kulturen – nach bis zu 3 Wochen Lagerung bei 4°C in der PCR
nachgewiesen werden kann, während auf Nährmedien kein Wachstum mehr zu verzeichnen
war (Josephson et al. 1993). Falschpositive Resultate oder eine erhöhte Wertausgabe bei
der DNA-Quantifizierung sind die Folge (Nocker und Camper 2006). Ein Umstieg vom DNA-
auf den RNA-Nachweis kann dieses Problem vermeiden und wurde gerade in den 90er
Jahren als Detektionsverfahren für metabolisch aktive Zellen eingesetzt (McKillip et al. 1998;
Fittipaldi et al. 2012). Nur wenige RNA-Moleküle sind über einen längeren Zeitraum stabil.
Dies ist vor allem von der verwendeten Extraktionsmethode und den extrinsischen Faktoren
abhängig (Nocker und Camper 2009). Man geht davon aus, dass infolge des hohen
Degradierungsgrades nur RNA lebender Zellen in der PCR nachgewiesen wird. Die Methode
1 EINLEITUNG
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stößt jedoch an ihre Grenzen, da zum einen bei der RNA-Extraktion eine Kontamination mit
RNasen, also RNA degradierenden Enzymen, nicht ausgeschlossen werden kann und damit
eine Reproduzierbarkeit erschwert ist und zum anderen die RNA-Expression vom jeweiligen
physiologischen Zustand der Zelle abhängig ist, wodurch eine quantitative Aussage
problematisch ist (Fittipaldi et al. 2012). Weiterhin wird der RNA-Anteil jeweils nur indirekt
nachgewiesen, da sie zunächst von der Reversen Transkriptase in cDNA umgeschrieben
wird und damit bereits eine gewisse Fehlerquote in Abhängigkeit von der Enzymaktivität etc.
vorliegt (Mülhardt 2009).
Einen weiteren Differenzierungsnachweis liefert der Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen mit
anschließender Betrachtung unter einem Fluoreszenzmikroskop. Als Fluorophore werden
u. a. Fluoresceindiacetat, Propidiumiodid (Abkz. PI) oder Ethidiummonoazid (Abkz. EMA)
verwendet (Nelson et al. 2000; Hickey et al. 2004). Während Fluoresceindiacetat als
Enzymsubstrat agiert, kann es nur von lebenden Zellen aufgenommen und umgewandelt
werden, wogegen Propidiumiodid und Ethidiummonoazid nur geschädigte Zellmembranen
durchdringen können und anschließend in die DNA interkalieren (Hickey et al. 2004; Fittipaldi
et al. 2012). Eine quantitative Auswertung ist durch Auszählen der jeweiligen Zellen zwar
möglich, aber bei einem hohen Durchsatz ein enormer Arbeits- und Zeitaufwand. Schneller
und präziser ginge es mit einem Durchflußzytometer oder FACS, wobei die quantitative
Bestimmung von Hyphomyceten nicht realisierbar ist. Diese Geräte bedürfen zudem
enormer Anschaffungskosten und sehr geschultem Personal, da eine Auswertung durchaus
komplex sein kann.
Im Jahr 2003 setzte die Arbeitsgruppe um Nogva erstmals den interkalierenden Farbstoff
Ethidiummonoazid (auch Ethidiumbromidmonoazid genannt) zur Lebend/Tot-Differenzierung
von Bakterien in Kombination mit der PCR-Reaktion ein (Nogva et al. 2003). Rudi et al.
schlossen sich mit einer Differenzierung in komplexen Matrices an (Rudi et al. 2005).
Ethidiummonoazid (3-Amino-8-azido-5-ethyl-6-phenyl-phenanthridiniumbromid) ist ein
Analogon zu Ethidiumbromid und verhält sich demzufolge ähnlich. Es weist eine komplexe
Ringstruktur mit einer Azid-, einer Amino- und einer Ethylgruppe sowie einen Phenylrest auf
(Laugaa et al. 1983). EMA interkaliert stöchiometrisch ungefähr alle 10 bis 80 bp über
elektrostatische Wechselwirkungen zwischen dem negativgeladenen Phosphatrest der DNA
und dem positivgeladenen Stickstoffatom der Ringstruktur in die DNA (Marx et al. 1997;
Garbett et al. 2004; Fittipaldi et al. 2012). Liegt der Ligand in sehr hoher Konzentration vor,
kann als zweite Bindungsart eine Ionenbindung mit dem Phosphatrückgrat eintreten,
wodurch sich EMA in die DNA-Furchen einlagert (Laugaa et al. 1983; Fittipaldi et al. 2012).
Setzt man den Ligand-DNA-Komplex nach einer Inkubationszeit einer Lichtquelle mit einer
Wellenlänge von etwa 460 nm aus, findet eine photolytische Reaktion statt: die Azidgruppe
der Ringstruktur wird zu einem Nitrenradikal (enthält Doppelbindungen) modifiziert, welches
1 EINLEITUNG
17
hochreaktiv mit organischen Molekülen agiert (Nocker und Camper 2009; Fittipaldi et al.
2010, 2012). Da der Farbstoff zu diesem Zeitpunkt direkt in die DNA eingelagert ist, wird eine
kovalente Bindung mit ihr eingegangen (Nocker und Camper 2009; Agustí et al. 2013). Nicht
gebundene EMA-Moleküle reagieren mit umliegenden Wassermolekülen zu nicht-reaktiven
Hydroxylaminen (Nocker und Camper 2006, 2009; Fittipaldi et al. 2012)
Dieser Effekt kann für eine Lebend/Tot-Differenzierung ausgenutzt werden, sofern eine
Behandlung der Probe vor die eigentliche DNA-Extraktion geschaltet wird. Nach Zugabe
einer EMA-haltigen Lösung lagert sich der Farbstoff an freie DNA an oder dringt in
geschädigte Zellen bzw. Hyphen ein und interkaliert dort in die verfügbare DNA (Rawsthorne
and Phister 2006; Nocker und Camper 2009). Da EMA eine lichtempfindliche Agenz ist,
müssen Zugabe und Inkubation ohne direkte Lichtquelle durchgeführt werden. Nach der
Photolyse kann die DNA inaktivierter Organismen nicht mehr in der PCR nachgewiesen
werden. Hierfür existieren verschiedene Annahmen: Fittipaldi et al. gehen davon aus, dass
durch die Anlagerung des Farbstoffs eine strukturelle Modifikation eintritt, die dem Enzym die
Amplifikation dieses DNA-Abschnittes nicht ermöglicht (Fittipaldi et al. 2012). Die
Arbeitsgruppe um Nocker zieht in Erwägung, dass durch die Anlagerung des Farbstoffs die
DNA unlöslich wird und während der weiteren DNA-Extraktion zusammen mit Zelldebris
ausfällt. In einer Studie konnten sie zeigen, dass bei Extraktionen unter Einsatz von
Silikakugeln deutlich rotgefärbte Zelldebris ausfallen, sofern inaktivierte Zellen in der Probe
vorhanden waren (Hein et al. 2006). Dies wird mit den elektrostatischen Interaktionen
zwischen dem positivgeladenem Farbstoff und der negativgeladenen DNA, welche an
Silikaharzen haftet, erklärt (Hein et al. 2006; Fittipaldi et al. 2012). Eine weitere Ursache für
die fehlende Amplifikation kann in einer Fragmentierung der DNA nach der Photolyse liegen,
welche durch elektronenmikroskopische Bilder sichtbar wurde (Soejima et al. 2008; Fittipaldi
et al. 2012).
Neben Ethidiummonoazid kann auch Propidiummonoazid (Abkz. PMA, 3-Amino-8-azido-5-
[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridiniumdichlorid) als interkalierender
Farbstoff zur Lebend/Tot-Differenzierung eingesetzt werden (Nocker und Camper 2006;
Schmidlin et al. 2010). PMA gehört zu den Propidiumiodid-Derivaten und weist im Vergleich
zu EMA ein zusätzliches positivgeladenes Stickstoffatom innerhalb der Propylseitenkette auf
(Nocker und Camper 2006; Fittipaldi et al. 2012). Da für EMA in Abhängigkeit von
Konzentration, Einwirkzeit und zu behandelnder Spezies eine gewisse Zytotoxizität infolge
des Eindringens in intakte Zellen berichtet wurde, wurde vor allem bei Bakterienkulturen der
Einsatz von PMA bevorzugt (Nogva et al. 2003; Rudi et al. 2005; Nocker und Camper 2006).
Anfällig sind auch alternde oder sich teilende Zellen. Aufgrund der höheren Ladung ist PMA
weitgehend impermeabel und liefert damit weniger suppressive Daten (Nocker und Camper
2006).
1 EINLEITUNG
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1.6 Ziele der Arbeit
Die Ziele dieser Arbeit sollten die Entwicklung und Optimierung eines sensitiven und
spezifischen Real-time-PCR-Assays auf Basis der TaqMan®-Sondentechnologie zur
Quantifizierung von Pilz-DNA sowie einer dazugehörigen Probenaufbereitung sein. Die
Probenaufarbeitung sollte eine Differenzierung zwischen lebenden und toten
Mikroorganismen erlauben, um den Erfolg von Dekontaminationsverfahren sinngetreu
abbilden zu können. Je nach zu untersuchendem Produkttyp sollte eine vorherige
Anreicherung in geeignetem Medium optimiert werden. Das Verfahren sollte für den Einsatz
in der getränkeindustriellen Qualitätssicherung geeignet sein.
Zunächst sollten bereits vorliegende Primerkandidaten mit einer Vielzahl unterschiedlicher
Ziel-DNA überprüft werden. Wichtig war vor allem die eindeutige Abgrenzung zu
Organismen, die als Begleitflora in den Matrices anwesend sein könnten. Hierfür sollte die
DNA von Bakterien und Pflanzen mit den jeweiligen Primerkandidaten getestet werden.
Weiterhin spielte die Implementierung einer internen Amplifikationskontrolle als Indikator
einer möglichen Inhibition der PCR-Reaktion sowie die Generierung eines Positivstandards
zur späteren Quantifizierung des DNA-Gehaltes eine wesentliche Rolle. Für den PCR-Assay
sollte eine geeignete Probenaufarbeitungsmethode erarbeitet werden, mit der ein schneller,
sensitiver Nachweis fungoider Organismen in alkoholfreien Getränken erreicht würde. Für
Proben, die auf Abwesenheit pilzlicher Verderbskeime untersucht werden sollten, sollte eine
optimierte Anreicherungsphase entwickelt werden. Klare, nicht-karbonisierte Getränke
sollten für ein höheres Probevolumen mit einer Filtrationstechnik behandelt werden. Von
besonderer Wichtigkeit war die Entwicklung eines Verfahrens auf Basis eines
interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffs zur Lebend/Tot-Differenzierung, so dass nur die DNA
lebender/metabolisch aktiver Zellen in der PCR nachgewiesen würde.
2 MATERIAL UND METHODEN
19
2 Material und Methoden
2.1 Geräte
Tabelle 2: Übersicht der verwendeten Geräte
Art Gerätename Hersteller
Autoklav Typ 5075 ELV Systec, Wettenberg
Elektrophoresekammer Mini horizontal Midi horizontal
BaackLab, Schwerin
Feinwaage BP 2100 S ALJ 220-4NM
Sartorius Stedim Biotech GmbH, Göttingen
Kamera, Geldokumentation DP-CF-110.C Vilber Lourmat Deutschland GmbH, Eberhardzell
LED-Lichtquelle PhAST Blue GenUIL
Magnetheizrührer RH basic 2 IKAMAG® IKA
®-Werke GmbH & Co. KG,
Staufen
Mikroskop Eclipse E400 Nikon Instruments Europe BV, Amsterdam (NL)
Mikrowelle Typ 7839, 700W Severin Elektrogeräte GmbH, Sundern
Minizentrifuge Spectrafuge™ Mini Axon Labortechnik, Kaiserslautern
PCR-Arbeitshaube CleanCab Herolab GmbH Laborgeräte. Wiesloch
PCR-Arbeitshaube mit Cross-Linker
Clean Cab Plus Herolab GmbH Laborgeräte. Wiesloch
PCR-Arbeitshaube PCR Chamber BÄRO GmbH & Co. KG Lufthygiene, Leichlingen
PCR-Gerät GeneAmp® PCR System 9700 PE Applied Biosystems
Deutschland GmbH, Darmstadt
pH-Meter 766 Calimatic Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG, Berlin
Photometer NanoPhotometer IMPLEN GmbH, München
Pipetten 0,5-1000µl Eppendorf Reference Eppendorf Deutschland, Wesseling-Berzdorf
Real-Time-PCR-Gerät für Kapillaren
LightCycler® 2.0 Roche Diagnostics GmbH, Berlin
Real-Time-PCR-Gerät LightCycler® 480
LightCycler® 480 II
LightCycler® 96
Roche Diagnostics GmbH, Berlin
Real-Time-PCR-Gerät Stratagene Mx3005P Agilent Technologies Deutschland GmbH, Böblingen
Schüttelinkubator Certomat® BS-T B. Braun Biotech International,
Melsungen
Spannungsquelle für Elektrophoresekammer
Electrophoresis PowerSupply EPS 301
Amersham pharmacia biotech Europe GmbH, Nümbrecht
Sterilwerkbank Typ 8511 Köttermann GmbH & Co. KG, Uetze/Hänigsen
Sterilwerkbank Antares, Fisher Bioblock Scientific
Thermoblock QBT CLF Analytische Laborgeräte GmbH, Emersacker
Thermoschüttler Eppendorf 5436 Eppendorf comfort
Eppendorf Deutschland, Wesseling-Berzdorf
UV-Transilluminator ECX-20.M (6x8W 312nm Tube)
Vilber Lourmat Deutschland GmbH, Eberhardzell
Vakuumpumpe mit Abfallbehälter
Hersteller nicht bekannt
2 MATERIAL UND METHODEN
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Art Gerätename Hersteller
Vortexer Reax Top Reax 2000
Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach
Vortexer Vortex Genie 2 Scientific Industries, New York (USA)
Wasserbad Typ 1083 GFL, Burgwedel
Zellaufschlussgerät Disruptor Genie 2 Scientific Industries, New York (USA)
Zellaufschlussgerät MagNA Lyser Roche Diagnostics GmbH, Berlin
Zentrifuge Centrifuge 5403 Centrifuge 5415 C Centrifuge 5415 D Centrifuge 5417 R Centrifuge 5804
Eppendorf Deutschland, Wesseling-Berzdorf
Zentrifuge Spectrafuge 16M ABIMED GmbH, Langenfeld
2.2 Reagenzien
Tabelle 3: Übersicht der eingesetzten Reagenzien
Reagenz Hersteller
Agarose Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf
Ampicillin Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
AntiTaq 2 µg/µl GeneOn GmbH, Ludwigshafen am Rhein
Aqua B. Braun B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Buffer P1 Resuspensionspuffer QIAGEN Biotech GmbH, Hamburg
Chelex® 100 BIO-RAD Laboratories GmbH, München
dNTPs (je 100mM) Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
EDTA-Lösung, 0,5M, pH 8 AppliChem GmbH, Gatersleben
Enzyme Solution BIOTECON Diagnostics GmbH, Potsdam
Ethanol 96% Merck KGaA, Darmstadt
Ethidiumbromid Merck KGaA, Darmstadt
Glycerin Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Heringssperma-DNA Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim
Taq Polymerase (DNA free) BIOTECON Diagnostics GmbH, Potsdam
Reaktionspuffer (10X) BIOTECON Diagnostics GmbH, Potsdam
Isopropanol Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Magnesiumchlorid Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim
Natriumchlorid Merck KGaA, Darmstadt
Proteinase K Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim
Lyophilisationsreagenz BIOTECON Diagnostics GmbH, Potsdam
Reagent D BIOTECON Diagnostics GmbH, Potsdam
RNase A QIAGEN Biotech GmbH, Hamburg
10x TBE-Puffer AppliChem GmbH, Gatersleben
Trizma® Hydrochlorid, 1M, pH 7,6 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Tween 80 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Uracil-DNA-Glykosylase (UDG) Bioron GmbH, Ludwigshafen am Rhein
2 MATERIAL UND METHODEN
21
2.3 Verbrauchsmaterialien
Tabelle 4: Übersicht der verwendeten Verbrauchsmaterialien
Verbrauchsmaterial Hersteller
96x0,2ml Tear-Off 8-Tube Strip-Mat (LP), white + Optical Wide area 8-Cap Strip, natural
BIOplastics, Landgraaf (NL)
0,1 mm bzw. 0,5 mm Zirconia/Glas-Beads Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
foodproof® Sample Preparation Kit II BIOTECON Diagnostics GmbH, Potsdam
foodproof® StarPrep Two BIOTECON Diagnostics GmbH, Potsdam
LightCycler® 480 Multiwell Plate 96, white +
LightCycler® 480 Sealing Foil
Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim
PCR Clean-Up & Gel Extraction Kit Süd-Laborbedarf GmbH, Gauting
pGEM®-T Vector System I Promega GmbH, Mannheim
QIAGEN Plasmid Mini Kit QIAGEN Biotech GmbH, Hamburg
Whirl-Pak® (mit/ohne Filter) VWR International, Darmstadt
Farbfixierte Indikatorstäbchen pH-Fix 0.0-6.0 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
PES-Membranfilter Ø25 mm, 0,2 µm Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Polysulfon-Filterhalter Ø25 mm Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
250ml-Duran-Schottflasche mit Zweifach- Flaschenverteiler
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Minischlauchverbinder Y-Form Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Silikonschlauch Versilic Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Druckausgleichsset Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Laborverschraubungen für Zweifach-Flaschenverteiler
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Luer-Stopfen Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Petrischalen PS, 92x14mm nerbe plus GmbH, Winsen/Luhe
2.4 Puffer und Lösungen
Für die Herstellung von Puffern und Lösungen wurden Reagenzien der Firmen Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe), Sigma-Aldrich/Fluka (Taufkirchen) und Merck KgAa (Darmstadt) verwendet.
1X TE-Puffer (Tris-EDTA-Puffer)
10 mM Trizma® Hydrochlorid (pH 8)
1 mM EDTA
HSTE (Heringssperma-Tris-EDTA-Puffer)
10 µg/ml Heringssperma-DNA 0,5 mM EDTA
1 mM Trizma® Hydrochlorid (pH 8)
pH 7,6
6X Gelladepuffer
125 g/100ml Glycerin 40 ml Xylen Cyanol FF 100 mg 0,1 g/ml Bromphenolblau 1 ml dest. H2O 100 ml
WSH (Wasser standardisierter Härte)
Lösung A: MgCl2 (wasserfrei) 19,84 g/l CaCl2 (wasserfrei) 46,24 g/l
Lösung B: NaHCO3 35,02 g/l Die Lösung B wurde per Membranfiltration sterilisiert.
2 MATERIAL UND METHODEN
22
WSH: Lösung A 6 ml Lösung B 8 ml auffüllen mit VE-Wasser auf 1000 ml pH 7,0 ± 0,2
Die Wasserhärte beträgt 300 ppm für Kalziumkarbonat. Die Lösung wurde bei 121°C für 15 min autoklaviert.
0,85% Saline mit 0,1% Tween 80
Die Lösung wurde bei 121°C für 15min autoklaviert.
2.5 Nährmedien
Die Angaben zu den pH-Werten verwendeter Medien beziehen sich jeweils auf den Wert bei 25°C Umgebungstemperatur.
2.5.1 Gebrauchsfertige Nährmedien
Tabelle 5: Übersicht der gebrauchsfertigen Nährmedien
Nährmedium Hersteller
Gepuffertes Peptonwasser SIFIN GmbH, Berlin
Orangenfruchtsaftagar Döhler, Darmstadt
SSL-Bouillon Döhler, Darmstadt
2.5.2 Hergestellte Nährmedien
Die für die Nährmedienherstellung benötigten Reagenzien wurden von den Firmen Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe), Merck KgAa (Darmstadt) und AppliChem GmbH (Gatersleben) bezogen. Alle Chemikalien sind vom Hersteller für den Einsatz in der Mikrobiologie ausgewiesen und wurden jeweils in voll entmineralisiertem (Abkz. VE) Wasser gelöst. Angesetzte Nährmedien wurden jeweils bei 121°C für 15 min autoklaviert.
YM-Medium mit Chloramphenicol (yeast extract malt extract broth)
Hefeextrakt 3 g/l Malzextrakt 3 g/l Pepton aus Soja 5 g/l D(+)-Glucose 10 g/l Chloramphenicol 0,1 g/l pH 5,5
Durch die Zugabe von 15 g Agar-Agar wurde festes Nährmedium hergestellt. YGC-Medium (yeast glucose chloramphenicol broth)
Hefeextrakt 5 g/l D(+)-Glucose 20 g/l Chloramphenicol 0,1 g/l pH 6,6
Durch die Zugabe von 15 g Agar-Agar wurde festes Nährmedium hergestellt.
NaCl 8,5 g/l Tween 80 1,0 g/l Auffüllen mit VE-Wasser auf 1000 ml pH 7,2 ± 0,2
2 MATERIAL UND METHODEN
23
CASO-Bouillon (Caseinpepton-Sojamehlpepton-Bouillon)
Pepton aus Casein 17 g/l Pepton aus Soja 3 g/l D(+)-Glucose 2,5 g/l NaCl 5 g/l K2HPO4 2,5 g/l pH 7,3 ± 0,2
LB-Medium (lysogeny broth (Bertani 2004), häufig auch: Luria-Bertani)
Trypton 10 g/l Hefeextrakt 5 g/l NaCl 5 g/l Ampicillin 0,1 g/l pH 7
Die Antibiotikazugabe erfolgt erst nach Abkühlung des autoklavierten Mediums auf etwa 50°C.
LB/X-Gal/IPTG-Agarplatten
Trypton 10,0 g/l Hefeextrakt 5,0 g/l NaCl 5,0 g/l Ampicillin 0,1 g/l X-Gal 0,08 g/l IPTG 0,5 mM Agar 15,0 g/l
Die Antibiotikazugabe erfolgt erst nach Abkühlung des autoklavierten Mediums auf etwa 50°C. X-Gal und IPTG wurden kurz vor Verwendung der Agarplatten auf der Oberfläche ausgestrichen.
Malzextrakt-Agar
Malzextrakt 30 g/l Pepton aus Soja 3 g/l Agar 15 g/l
Glucose-50-Agar
D-Glucose 500 g/l Hefeextrakt 5 g/l Malzextrakt 10 g/l Agar-Agar 15 g/l H2O demin. 500 g/l pH 4,5
Natriumchlorid-Peptonpuffer
KH2PO4 18 g/l Na2HPO4x2H2O 36 g/l NaCl 21,5 g/l Pepton aus Casein 5 g/l pH 7±0,2
2.6 Oligonukleotide
Die eingesetzten Primer wurden bei den Firmen Ella Biotech GmbH (Martinsried) bzw. eurofins MWG GmbH (Ebersberg) synthetisiert, während Sonden bei der Metabion International AG (Martinsried) bzw. biomers.net GmbH (Ulm) bezogen wurden. Oligonukleotide mit LNA™-Basen wurden bei der Firma Exiqon A/S (Dänemark) in Auftrag gegeben. Der verwendete Nukleotidcode beruht auf den Vorgaben des Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (Abkz. NC-IUB) (Cornish-Bowden 1985). Lyophilisierte Oligonukleotide wurden mit Aqua B.Braun entsprechend den Herstellerangaben resuspendiert.
2 MATERIAL UND METHODEN
24
2.6.1 Sequenzen zur Amplifikation der 28S rDNA-Sequenz
Tabelle 6: Sequenzen der 28S rDNA-spezifischen Primer
Die Sequenzen der Hydrolysesonden (Abkz. FungiP) sowie der zusätzlichen Primer sind nicht gezeigt, da diese nicht im Rahmen dieser Arbeit erstellt wurden. Der Primer FungiRv3LNA enthält an Position 18 eine LNA™-Base. Der Primer PlantBlock ist am 3‗-Ende mit einem C3-Spacer blockiert.
2.6.2 Primersequenzen zur Amplifikation eines pflanzenspezifischen Fragments
Tabelle 7: Sequenzen der pflanzenspezifischen Primer
Bezeichnung Sequenz 5‘3‘ Funktion
VegFw1 TAGTCTGGAGAAGCGTCCTCAGC Vorwärtsprimer
VegRv1 TGGCTTTACCCGATAGAACTCG Rückwärtsprimer
2.7 Probenmatrices
Tabelle 8: Übersicht der eingesetzten Getränkematrices
Name der Probe Hersteller/Lieferant
Bananennektar, 25% Fruchtgehalt Eckes-Granini Deutschland GmbH, Nieder-Olm
Fruchtsaftkonzentrat Schwarze Johannisbeere, 100% Fruchtgehalt
Dein Saft GmbH, Dresden
Fruchtsaftkonzentrat Multivitamin, 100% Fruchtgehalt
Dein Saft GmbH, Dresden
Kirsch-Bananensaft Kaiser´s Tengelmann GmbH, Mühlheim/Ruhr
Vita Cola Thüringer Waldquell Mineralbrunnen GmbH, Schmalkalden
Colagrundstoff Brauerei-Probe
Zitronenaroma Brauerei-Probe
Vitaminmischung Brauerei-Probe
Apfelgrundstoff Brauerei-Probe
Malz-Rhabarber-Mischung Brauerei-Probe
Malz-Zitronen-Limetten-Mischung Brauerei-Probe
Invertzucker Brauerei-Probe
2.8 Primer Design
Es galt, eine Zielregion ausfindig zu machen, welche infolge der geringen intraspezifischen Variabilität den Nachweis einer großen Bandbreite fungoider DNA zulässt. Ein solch hochkonservierter Genabschnitt ist die 28S rDNA-Region. Eine Vielzahl an DNA-Sequenzen unterschiedlicher Fungi wurde aus der NCBI-Datenbank (engl. National Center for Biotechnology Information) bezogen und anschließend in das Geneious-Programm eingebunden. Mittels ClustalW-Algorithmus wurden sie aligniert und entsprechende Primerkandidaten festgelegt. Dabei sollte das nachzuweisende Fragment in Hinblick auf eine spätere Quantifizierung eine Sequenzlänge von ca. 100 bis 200bp aufweisen. Eine Vorauswahl geeigneter Kandidaten konnte bereits zu Beginn des Projektes übernommen werden.
Bezeichnung Sequenz 5’ 3’ Funktion
FungiFw1 Vorwärtsprimer
FungiFw2 GTCAGGTTGTTTGGGAATGC Vorwärtsprimer
FungiRv1 Rückwärtsprimer
FungiRv2 Rückwärtsprimer
FungiRv3 Rückwärtsprimer
FungiRv3LNA Rückwärtsprimer mit LNA™-Base
FungiRv4 Rückwärtsprimer
PlantBlock 3‗-Spacer C3 modifizierter Primer für Pflanzen
2 MATERIAL UND METHODEN
25
Für die Herstellung eines pflanzenspezifischen Plasmids war die Generierung eines DNA-Abschnittes notwendig, welcher den Sequenzbereich der 28S rDNA umfasst. Nach Alignierung von Sequenzen verschiedener Pflanzenspezies, von denen DNA verfügbar war, wurde ein Primerpaar nach den allgemeinen Richtlinien zum Primer Design ausgewählt.
2.9 Stammanzucht
Zur Anzucht von Mikroorganismen wurden Kulturen der hauseigenen Stammsammlung herangezogen. Aus den bei -80°C gelagerten Kulturen wurde mit einer Impföse Zellmaterial entnommen und auf das entsprechende Medium ausgestrichen. Hefen und Schimmelpilze wurden auf YM- bzw. YGC-Agar für 3 bis 7 Tage bei 30°C inkubiert. Xerophile Pilze wurden auf G50- bzw. Malzextrakt-Agar ebenfalls für 3 bis 7 Tage angezogen. Bakterien wurden je nach Nährstoffbedarf auf CASO- oder MRS-Agar bei 30 bis 37°C für 1 bis 2 Tage inkubiert.
2.10 Gewinnung von RNA-freier, quantifizierbarer DNA
Von einer bewachsenen Agarplatte wurde Zellmaterial mithilfe einer Impföse entnommen und in ein Reaktionsgefäß mit Zirkonium-/Glaskügelchen überführt. Bei Schimmelpilzen, die ein Substratmycel gebildet hatten, wurden zuvor Agarreste beseitigt. Für den Aufschluss bakterieller Zellen wurden 150mg Zirkonium-/Glaskügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 mm und für Hefen und Schimmelpilze 500 mg Zirkonium-/Glaskügelchen mit 0,5 mm Durchmesser verwendet. Nach Zugabe von 1 ml TE-Puffer wurden die Proben für 1 min bei 8000 xg zentrifugiert (Bei Einsatz von 1 ml Sporensuspension z.B. aus Rhizophagus irregularis entfiel die Zugabe von TE-Puffer). Das Zellpellet wurde anschließend in 200 µl Lysepuffer resuspendiert und bei 95°C für 10 min inkubiert. Der mechanische Aufschluss wurde im MagNA Lyser der Firma Roche Diagnostics für 1 min bei 6500 U vorgenommen. Alternativ kann ein Disruptor Genie Instrument herangezogen werden (10 min). Die aufgeschlossenen Zellen inkubierten anschließend für weitere 15 min bei 95°C. Zur Aufreinigung der DNA wurde dem Protokoll des foodproof
® Sample Preparation Kit II der Firma BIOTECON
Diagnostics GmbH gefolgt. Zur eluierten DNA wurden anschließend 100 µl eines RNase-A-haltigen Puffers (QIAGEN) pipettiert und der Ansatz für 10 min bei 37°C inkubiert. Das Extrakt wurde erneut dem Protokoll der Sample Preparation Kits folgend behandelt. Das finale Elutionsvolumen betrug ebenfalls 100 µl. Verdünnungen der Eluate wurden jeweils mit Heringssperma-TE-Puffer hergestellt. Die Lagerung erfolgte bei -20°C.
2.11 Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration
Die Konzentration der RNAse-verdauten DNA, Plasmid-DNA und Oligonukleotiden wurde mittels Absorptionsspektrometrie bestimmt. Bei einer Wellenlänge von 260 nm wurde die optische Dichte im Nanophotometer der Firma IMPLEN GmbH gemessen. Ein OD260-Wert von 1 entspricht einer Konzentration an doppelsträngiger DNA von etwa 50 µg/ml.
2.12 Gelelektrophorese
Zur visuellen Kontrolle von PCR-Amplifikaten, genomischer DNA und Plasmiden wurde in Abhängigkeit der Fragmentgrößen ein Gel mit 1-2% (w/v) Agarose in 0,5X TBE-Puffer hergestellt und mit je 1 µl je 10 ml Gelvolumen 0,3 µg/ml Ethidiumbromid versetzt. Die Proben wurden im Verhältnis 1:5 mit dem Gelladepuffer gemischt. Als Längenstandards wurden DNA-Leitern der Firma AppliChem (DNA Ladder 100 bp, DNA Ladder 1 kb; jeweils 0,025 µg/µl) aufgetragen. Als Laufpuffer wurde ebenfalls 0,5X TBE-Puffer verwendet. Bei einer Spannung von 120 V erfolgte die elektrophoretische Auftrennung der Fragmente. Zur Visualisierung und Dokumentation der DNA-Banden wurde das System der Firma Vilber Lourmat Deutschland GmbH genutzt.
2 MATERIAL UND METHODEN
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2.13 Herstellung kompetenter E.coli XL1-blue-Zellen
Mithilfe der Magnesiumchlorid-Calciumchlorid-Methode wurden kompetente Zellen für eine spätere Transformation hergestellt. Zunächst wurde aus einer bei -80 °C gelagerten E.coli XL1-blue-Stammkultur (Stratagene/Agilent Technologies, Santa Clara (USA)) mit einer Impföse Zellmaterial in 10 ml LB-Medium überführt und über Nacht bei 150 rpm und 37°C inkubiert. Mit 500 µl dieser Vorkultur wurden 50 ml LB-Medium beimpft und aerob bei 37°C und 150 rpm inkubiert bis eine OD550nm von ca. 0,5 erreicht war. Alle nachfolgenden Arbeiten wurden mit vorgekühlten Lösungen und bei 4°C durchgeführt. Der Ansatz wurde zunächst für 15 min auf Eis gelagert und anschließend für 10 min bei 4000 rpm zentrifugiert. Nachdem der Überstand vorsichtig abgetrennt wurde, wurde das Pellet in 20ml 0,1 M MgCl2 resuspendiert. Nach einer 20minütigen Inkubation auf Eis wurde erneut zentrifugiert (4000 rpm, 10 min). Das Zellpellet wurde in 10 ml 0,1 M CaCl2 aufgenommen, wiederum 20 min auf Eis inkubiert und zentrifugiert (4000 rpm, 10 min). Nach Abnehmen des Überstandes wurde der Ansatz in 1 ml 0,1 M CaCl2-Lösung resuspendiert, 250 µl 85%iges Glycerin zugefügt und für 5 min auf Eis inkubiert. Anschließend konnte der Ansatz in Aliquots á 100 µl bei -80°C weggefroren werden.
2.14 Klonierung
In Vorbereitung einer Klonierung mussten zunächst jeweils klonierfähige Amplifikate in einer Polymerasekettenreaktion hergestellt werden. Wichtig war hierbei der Einsatz eines dTTP-haltigen dNTP-Mixes. Die erhaltenen Amplifikate wurden zur Visualisierung in einem 2%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die spezifischen Banden wurden unter UV-Licht (70%, 365 nm) mit einem gesäuberten Skalpell ausgeschnitten, in ein 2ml-Reaktionsgefäß überführt und mithilfe des PCR Clean-Up & Gel Extraction Kits der Firma SLG den Herstellerangaben folgend aufgearbeitet. Die eluierte DNA wurde anschließend in der Ligation eingesetzt.
2.14.1 Herstellung eines pflanzenspezifischen Amplifikats
Zur Überprüfung einer erfolgreichen Unterdrückung der DNA aus Pflanzen, als phylogenetische Verwandte zu Pilzen, wurden 28S-rDNA-spezifische Primer designt. Diese wurden zur Amplifikation eines DNA-Fragmentes in einen PCR-Mastermix eingebracht. Als Ziel-DNA wurde extrahierte DNA aus Banane (lat. Musa acuminata), Erdbeere (lat. Fragaria ananassa), Karotte (lat. Daucus carota, Konz. 110 ng/µl), Erdnuss (lat. Arachis hypogaea, Konz. 25,5 ng/µl), Reis (lat. Oryzae sativa), Soja (lat. Glycine max) und Kürbis (lat. Cucurbita pepo, Konz. 12,5 ng/µl) eingesetzt und in einem Block-Thermocycler vervielfältigt.
Tabelle 9: Protokoll zur Herstellung eines pflanzenspezifischen Amplifikats
Reagenz Stammlösung Endkonzentration
Enzyme Solution 1,5 U/µl 1,5 U
HTB Puffer 10x 0,6x
MgCl2 50 mM 5 mM
BSA 30 mg/ml 0,75 mg/ml
dNTP (100%T) 10 mM 0,2 mM
Primer VegFw1 10 µM 0,4 µM
Primer VegRv1 10 µM 0,4 µM
H2O Ad 45 µl
2 MATERIAL UND METHODEN
27
Tabelle 10: Temperaturprofil zur Herstellung eines pflanzenspezifischen Amplifikats
Programmschritt Temperatur (°C) Zyklenanzahl Zeit (hh:mm:ss)
Initialisierung 95 1x 00:10:00
Denaturierung 95
40x
00:00:10
Annealing 53 00:00:30
Elongation 72 00:00:30
Kühlung 4 1x ∞
2.14.2 Herstellung eines pilzspezifischen Amplifikats für die Positivkontrolle
In Vorbereitung der Herstellung einer Positivkontrolle wurde zunächst ein pilzspezifisches Amplifikat – identisch zur Zielsequenz – generiert. Als Ziel-DNA wurde RNA-freie, quantifizierbare DNA der Hefe Dekkera anomala (DSM 70727, Konzentration 56,5 ng/µl) mit einem Volumen von 5 µl eingesetzt.
Tabelle 11: Protokoll zur Herstellung eines pilzspezifischen Amplifikats
Reagenz Stammlösung Endkonzentration
Enzyme Solution 1,5 U/µl 3 U
HTB Puffer 10x 0,6x
MgCl2 50 mM 5 mM
BSA 30 mg/ml 0,75 mg/ml
dNTP (100%T) 10 mM 0,2 mM
FungiFw1 12,5 µM 0,4 µM
FungiFw2 12,5 µM 0,4 µM
FungiRv1 12,5 µM 0,4 µM
FungiRv2 12,5 µM 0,4 µM
FungiRv3LNA 12,5 µM 0,4 µM
FungiRv 12,5 µM 0,4 µM
PlantBlock 125 µM 4 µM
H2O Ad 45 µl
Tabelle 12: Temperaturprofil zur Herstellung eines pilzspezifischen Amplifikats
Programmschritt Temperatur (°C) Zyklenanzahl Zeit (hh:mm:ss)
Initialisierung 95 1x 00:10:00
Denaturierung 95
45x
00:00:15
Annealing 63 00:01:00
Elongation 72 00:00:30
Kühlung 4 1x ∞
2.14.3 Ligation mit pGEM®-T-Vektorsystem
Alle Arbeitsschritte zur Ligation wurden auf Eis durchgeführt. Der Ligationsansatz wurde durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gemischt und über Nacht bei 4°C inkubiert.
Tabelle 13: Pipettierschema für den Ligationsansatz
Reagenz Stammlösung Endkonzentration Volumen in µl
Rapid Ligation Buffer 2x 1x 5
Insert-DNA 2,5
Aqua B.Braun 1,3
pGEM®-T-Vektor 50ng/µl 2 ng/µl 0,4
T4 DNA Ligase 3 Weiss Units/µl 0,24 Weiss Units/µl 0,8
2 MATERIAL UND METHODEN
28
2.14.4 Transformation und Blau-Weiß-Selektion
Zur Transformation kompetenter XL-1 Blue E.coli-Zellen wurden 100 µl dieser aufgetaut und der gesamte Ligationsansatz hinzugegeben. Das Zell-Vektor-Gemisch inkubierte für 20 min auf Eis. Mit dem Überführen des Ansatzes in einen auf 42°C geheizten Thermoblock für 2 min wurde ein Hitzeschock induziert. Anschließend wurden die Zellen erneut auf Eis inkubiert (10 min). Nach der Zugabe von 450 µl LB-Medium wurde das Gemisch für eine Stunde bei 37°C und 350 rpm geschüttelt. Für das Blau-Weiß-Screening wurden 50 bzw. 250 µl des Ansatzes auf LB/IPTG/X-Gal-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37°C bebrütet. Zur deutlichen Blaufärbung der unerwünschten Kolonien wurden die Nährböden anschließend für kurze Zeit bei 4°C gelagert. Weiße Kolonien wurden markiert, mit einer sterilen Impföse gepickt und in 20 ml LB/Amp-Medium überführt. Die Anreicherung wurde über Nacht unter leichtem Schütteln (150 rpm) bei 37°C inkubiert. Von diesen Klonen wurden bei erfolgreicher Klonierung Glycerinkulturen (1 Teil 85%iges Glycerin zu 4 Teilen Kultur) für die Stammsammlung angelegt und bei -80°C gelagert.
2.14.5 PCR-Klonanalyse mittels Colony-PCR
Zur Kontrolle der erfolgreichen Transformation wurden 100 µl der Übernachtkultur abgenommen und für 10 min bei 95°C aufgekocht. Nach einer kurzen Zentrifugation wurde der Ansatz im Verhältnis 1:10 verdünnt und als Template in die spezifische PCR eingesetzt. Wurde ein positives Signal generiert, konnten die Plasmide aus den Klonen isoliert werden.
2.14.6 Plasmidpräparation
Jeweils 1 ml der Übernachtkultur der Positivklone wurde für 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert. Das Zellpellet wurden den Herstellerangaben des QIAGEN Plasmid Mini Prep Kits folgend aufgearbeitet. Die Konzentration des erhaltenen Plasmids wurde mittels Absorptionsspektrometrie bestimmt. Die Lagerung erfolgte bei -20°C.
2.15 Sequenzierung
Zur Sequenzierung bestimmter DNA-Fragmente wurden diese an die Firma GATC Biotech AG nach Köln versandt. Die Analyse wurde mit den Standardprimern M13-for bzw. M13-rev vorgenommen.
2.16 Sequenzanalyse
Es wurden Alignierungen mit aus der NCBI-Datenbank geladenen Sequenzen der 28S rDNA von Pilzen und Pflanzen oder von der Firma GATC sequenzierten DNA-Abschnitten (Plasmide etc.) mit dem Programm Geneious R6 (Version 6.1.5, Firma Biomatters) vorgenommen. Dieses verwendet den ClustalW-Algorithmus.
2.17 Berechnung von Genomäquivalenten
Die Genomgewichte repräsentativer Pilze für die Berechnung der LOD/LOQ-Werte wurden auf Grundlage der in der NCBI-Genomdatenbank angegebenen Genomgrößen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/; letzter Stand: 01.02.2015) näherungsweise berechnet (National Library of Medicine 1993). Aufgrund der ständigen Aktualisierung der Daten haben sich einige wichtige Genomgrößen geändert. Diese sind mit (*) für den Stand vom Oktober 2011 bzw. (**) für den Stand vom Februar 2015 gekennzeichnet. Verwendet wurden jeweils die mit (*) markierten Einträge. Sofern keine Daten zum gewünschten Keim vorlagen, wurden die Werte nahverwandter Arten herangezogen. Bei mehreren vorliegenden Daten wurden jeweils Mittelwerte zur weiteren Berechnung genutzt.
2 MATERIAL UND METHODEN
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Tabelle 14: Übersicht der verwendeten Genomgrößen/–gewichte zur LOD/LOQ-Bestimmung
Zu untersuchende Spezies
Spezies zur Berechnung Stamm-nummer
Genomgröße in Mb
Genomäquivalent
(= GÄ) in fg Absidia corymbifera Lichtheimia corymbifera 008-049 36,58 41,00 Alternaria citri Alternaria arborescens EGS 39-128 33,89 37,99
Alternaria brassicicola ATCC 96836 29,54 33,11 Aspergillus brasiliensis Aspergillus niger (**) ATCC 1015 34,85 39,06
Aspergillus niger (*) CBS 513.88 35,74 40,05 Candida albicans Candida albicans (*) WO-1 21,74 24,7
Candida albicans (**) WO-1 14,473 16,22 Cladosporium cladosporioides
Cladosporium sphaerospermum
UM843 26,89 30,14
Cryptococcus curvatus Cryptococcus neoformans var. neoformans
B-3501A 19,7 22,08
Dekkera anomala Dekkera bruxellensis AWRI 1499 12,68 14,21 Fusarium oxysporum Fusarium oxysporum FOSC3-a 47,91 53,7
Fusarium oxysporum Fo47 49,66 55,66 Fusarium oxysporum Fo5176 54,77 61,39
Mucor racemosus Mucor circinelloides f. circinelloides
1006PhL 36,35 40,74
Penicillium chrysogenum Penicillium chrysogenum(*) Wisconsis
64,45 72,24
Penicillium chrysogenum(**) 32,52 36,56
Pichia anomala Pichia kudriavzevii M12 10,45 11,71 Pichia pastoris 9,2 10,31
Rhodotorula mucilaginosa Rhodotorula glutinis ATCC 204091 20,47 22,94 Zygosaccharomyces bailii Zygosaccharomyces bailii CLIB 213 10,27 11,51
(*) Stand Oktober 2011; (**) Stand Februar 2015, Quelle: (National Library of Medicine 1993)
Zunächst erfolgte die Berechnung des Molekulargewichts der einzelnen Spezies unter Einbeziehung der Genomgröße (in bp), des mittleren Molekulargewichtes eines Basenpaares und der Umrechnungskonstante u. Dies sei am Beispiel von Zygosaccharomyces bailii (Abkz. Z. bailii) gezeigt:
𝑀𝑊𝑍.𝑏𝑎𝑖𝑙𝑖𝑖 = 𝐺𝑒𝑛𝑜𝑚𝑔𝑟öß𝑒 ∗ 𝑀𝑊𝐵𝑎𝑠𝑒𝑛𝑝𝑎𝑎𝑟 ∗ 𝑢 = 10,27 ∗ 106𝑏𝑝 ∗ 675𝑔
𝑚𝑜𝑙∗ 1,66054 ∗ 10−27𝑘𝑔
𝑀𝑊𝑍.𝑏𝑎𝑖𝑙𝑖𝑖 = 1,151 ∗ 10−17𝑘𝑔 = 11,51𝑓𝑔 Gleichung 1 und 2
Das Genomgewicht von Zygosaccharomyces bailii beträgt demnach 11,51fg.
2.18 Real-time-PCR
2.18.1 Gradienten-PCR
Zur Feststellung der optimalen Annealingtemperatur wurde eine Gradienten-PCR mit dem LightCycler
® 96 durchgeführt. Hierfür wurde sowohl Schimmelpilz- (Aspergillus brasiliensis,
ATCC 1988) als auch Hefe-DNA (Dekkera anomala, DSM 70727) mit jeweils zwei Konzentrationen (100, 25GÄ) eingesetzt. Zudem wurde das Plasmid mit pflanzenspezifischem Insert (vgl. Kapitel
2.14.1) mit 2,3x104 bis 2,3x10
6 Kopien/Reaktion sowie eine Negativkontrolle pipettiert. Es wurde
ausschließlich Mastermix mit aptamergeblockter Taq-Polymerase (siehe Kapitel 2.19) verwendet. Unter Beachtung der Schmelztemperaturen der Primer und des Amplifikats wurde ein Temperaturbereich von 53°C ≤ T ≤ 67°C gewählt.
2 MATERIAL UND METHODEN
30
2.18.2 Temperaturprofile für Real-time-PCR-Cycler
Real-Time-PCR-Experimente wurden auf dem LightCycler® 480 I bzw. II Instrument der Firma Roche
Diagnostics (Software 1.5.0), dem Stratagene Mx3005P der Firma Agilent Technologies (Software MxPro v.4.10) durchgeführt. Die Detektion der spezifischen Ziel-DNA sowie der Positivkontrolle wurde im FAM-Kanal (LC480: 483-533 nm; Mx3005P: 492-513 nm) vorgenommen. Die interne Amplifikationskontrolle erzeugte ein Signal im HEX-Kanal (LC480: 533-580 nm; Mx3005P: 535-555 nm). Zur Auswertung wurden folgende Einstellungen vorgenommen: LightCycler: Abs Quant/2nd Derivative Max mit Color Compensation (FAM/VIC); Stratagene Mx3005p: Background based threshold mit Baseline Correction (Adaptive baseline mit Mx4000 v1.00 to v3.00 algorithm).
Tabelle 15: Temperaturprofil für die Real-time-PCR
Programmschritt Zyklenanzahl Analysemodus Zieltemperatur (°C) Inkubationszeit
(hh:mm:ss)
UDG-Inkubation und Denaturierung
1 none 37
95
00:05:00
00:05:00
Amplifikation 45 Quantifizierung 95
60
00:00:10
00:01:00
Kühlung 1 none 40 00:00:30
Es wurden jeweils die vom Hersteller eingetragenen Temperaturanstiegsraten verwendet. Versuche zur Bestimmung der LOD/LOQ-Werte des Assays wurden mit einer Annealingtemperatur von 63°C durchgeführt. Nach Austausch des Antikörpers durch ein Aptamer wurde die Annealingtemperatur nach unten korrigiert.
2.19 Herstellung des Mastermixes für Pilzgesamtnachweis-Assay
Das Gesamtvolumen des Mastermixes betrug 15 µl je Reaktion. Zunächst wurde ein Enzymmix aus Polymerase, Uracil-DNA-Glykosylase (Abkz. UDG) und Aptamer bzw. Antikörper vorbereitet, welcher 15 min bei RT inkubierte, um eine vollständige Blockierung des aktiven Zentrums des Enzyms zu gewährleisten. Anschließend wurden die verbleibenden Komponenten hinzugefügt. Zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen wurde anstelle von dTTP dUTP eingesetzt. Im zuvor hergestellten dNTP-Mix wies jedes Desoxynukleotid eine Konzentration von 10 mM auf. Versuche zur Bestimmung der LOD/LOQ-Werte wurden mit antikörpergeblockter Polymerase durchgeführt. Anstelle des Aptamers wurde AntiTaq des Herstellers GeneOn GmbH (Stammkonzentration 2 µg/µl) in einer Endkonzentration von 0,575 µg/µl zugegeben.
Tabelle 16: Zusammensetzung des Mastermixes für den Pilzgesamtnachweis-Assay
Reagenz Stammkonzentration Endkonzentration
Polymerase 5 U/µl 2,500 U
Uracil-DNA-Glykosylase 10 U/µl 0,100 U/µl
Aptamer bzw.
AntiTaq
100 µM
2 µg/µl
20,00 µM
0,575 µg/µl
HTB Puffer 10x 1,000x
Lyophilisierungsadditiv 25 % w/v 7,5 %w/v
BSA Sigma 30 mg/ml 1,500 mg/ml
dNTP-Mix (100% U) 10 mM 0,200 mM
MgCl2 1000 mM 4,000 mM
Sonden Je 100 µM 0,200 µM
Primer Je 100 µM 0,500 µM
PlantBlock 100 µM 5,000 µM
IAK-Primer Je 100 µM 0,250 µM
IAK-Sonde 100 µM 0,050 µM
IAK-Plasmid in HSTE 1 fg/µl 0,008 fg/µl
H2O ad.15 µl
Zu je 15 µl Mastermixvolumen wurden 10 µl Probevolumen pipettiert. Zu lyophilisierten Mastermixen in 8-well-Streifen wurden 25 µl Probevolumen hinzugegeben.
2 MATERIAL UND METHODEN
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2.20 Spezifitätstestungen
Die Überprüfung des spezifischen Nachweises wurde durch den Einsatz der DNA von Ziel- und Nicht-Zielorganismen erzielt. Zelllinien wurden von Mitarbeitern der Firma AnalytiCon Discovery GmbH (Potsdam) unter den optimalen und sterilen Bedingungen kultiviert und Überstände zur weiteren Analyse übergeben. Die verwendete DNA wurde entweder nach der Extraktionsmethode des Kapitels 2.10 bzw. mittels foodproof
® StarPrepTwo (siehe Kapitel 2.21.2) bei Pilzen, Zellkulturen und Bakterien
oder Magnetic Preparation Kit III bei pflanzlicher DNA gewonnen. Eingesetzt wurden 50 pg je Reaktion bei Inklusivitäts- und 100 pg je Reaktion bei Exklusivitätsprüfungen. Alle DNAs wurden im Vorfeld mit spezifischen Assays auf ihre Amplifizierbarkeit hin geprüft.
2.21 Probenaufarbeitung
2.21.1 Herstellung einer Sporensuspension
Für die Quantifizierung von Schimmelpilzen wurde auf Sporensuspensionen zurückgegriffen. Der entsprechende Keim wurde auf YM-Nähragar ausplattiert und für ca. 1 Woche bei 25-30°C inkubiert. Die sporulierten Hyphomyceten wurden mit 10 ml Saline mit 0,1%Tween 80 abgeschwemmt und in ein mit sterilen Glasperlen (ca. 1 cm Höhe) gefüllten 15ml-Falcon-Tube überführt. Die Suspension wurde für etwa 1 min gevortext und anschließend mikroskopisch in einer Thoma-Kammer ausgezählt. Es wurde auf das Vorhandensein von Myzelrückständen geachtet. Gegebenenfalls wurde die Suspension erneut gevortext. Für die Langzeitlagerung bei -20°C wurden 20%ige Glycerinkulturen mit einer Sporenkonzentration von 1x10
6 KBE/ml hergestellt.
2.21.2 Aufbereitung filtrierbarer Proben mit Lebend/Tot-Differenzierung
Filtrierbare Flüssigkeiten umfassen klare Wässer aller Art ohne Kohlensäure. Je Probe wurden 100 ml Volumen in eine sterile Schottflasche überführt und mit einem Zweifach-Flaschenverteilerdeckel verschlossen. Über einen, in einem Polysulfon-Membranhalter befindlichen, Polyethersulfon-Membranfilter (Abkz. PES) wurde die Probe filtriert. Nach vollständigem Durchfluss der Probe wurde der Filter in ein vorbereitetes StarPrepTwo-Reaktionsgefäß überführt (300 µl StarPrepTwo bei 300 rpm auf Magnetrührer). Für die Lebend/Tot-Differenzierung wurden 300 µl Reagent D-Lösung (10 µg/ml) hinzupipettiert und für 10 min lichtgeschützt inkubiert. Nach 5minütiger Photolyse im PhAST Blue oder auf einem Kühlblock unter einer Halogenlampe (20 cm Abstand zur Lampe) erfolgte der mechanische Aufschluss im MagNA Lyser bei 7000 U/min für 60 s. Anschließend wurden die Proben für 5 Minuten bei 95°C aufgekocht. Vor dem Einsatz in die PCR sollten die Proben bei 13000 rpm für 2 min zentrifugiert werden.
2.21.3 Anreicherung und Aufbereitung nicht-filtrierbarer Flüssigkeiten mit Lebend/Tot-
Differenzierung
Proben, bei denen auf die Abwesenheit von Pilzen getestet wurde, wurden zunächst im Verhältnis 1:10 in SSL-Medium verdünnt und für bis zu 48 h bei 27-30°C inkubiert. Zum Teil wurden grenzwertige Dotierungen vorgenommen. Vor der Probenentnahme wurden die Anreicherungen durchmischt. Jeweils 100 µl wurden entnommen und in ein StarPrepTwo-Gefäß überführt. Proben, bei denen eine quantitative Analyse durchgeführt werden sollte, wurden direkt in die Reaktionsgefäße pipettiert. Die Aufarbeitung wurde dem StarPrepTwo-Protokoll folgend vorgenommen (siehe Kapitel 2.21.2).
2 MATERIAL UND METHODEN
32
2.22 Sensitivitätstestungen
2.22.1 Sensitivitätstestung des PCR-Assays mit quantifizierbarer DNA
Zur Bestimmung der Sensitivität des Pilzgesamtnachweissystems wurde quantifizierbare, RNAse-verdaute DNA von einer Vielzahl von Pilzen (siehe Anhang VI) eingesetzt. Die DNA-Konzentrationen wurden in Hinblick auf die Genomgrößen (siehe Kapitel 2.17) der einzelnen Spezies in entsprechende Genomäquivalente (Abkz. GÄ) umgerechnet. In die PCR wurden jeweils 100 000, 10 000, 1 000, 100, 25, 6.25, 1.56 und 0.3 GÄ als Replikate (11 – 12fache Wiederholung) eingesetzt. Dabei wurde jede Verdünnungsreihe einzeln hergestellt, um Varianzen des Pipettiervorganges mit einzubeziehen. Weiterhin wurden Versuche mit 12 Verdünnungsreihen auf zwei Cyclerläufe á sechs Reihen aufgeteilt, damit eventuell auftretende Unterschiede aufgrund der eingesetzten Gebrauchsmaterialien und die Variabilität des Assays erkannt werden konnten. Alle Läufe wurden ausschließlich auf dem LightCycler480
®-II durchgeführt.
Als Analysemodus wurde jeweils „Abs Quant / 2nd Derivative Max― gewählt. Mit den erhaltenen Daten wurden zunächst Standardkurven für die Replikate eines Durchlaufs einer Spezies generiert. Weiterhin wurden von allen Replikaten der Mittelwert der Cp-Werte jeder Verdünnungsstufe sowie die dazugehörigen Standardabweichungen und die intraspezifische Korrelation berechnet. Auf Grundlage der erhaltenen Daten wurden der Mittelwert der Verdünnungsstufen, die Standardabweichung und Korrelation für alle Spezies zusammen erhoben, um letztlich Aussagen über interspezifische Abweichungen geben zu können.
2.22.2 Sensitivitätstestung mit dotierten Probenmatrices
2.22.2.1 Untersuchung von Flüssigkeiten auf Wiederfindungsraten
Zu 100 ml WSH wurden 100 µl einer 1,5x106 bis 1,5x10
2 KBE/ml Sporensuspension (Aspergillus
brasiliensis) unter sterilen Bedingungen hinzugegeben und dem Protokoll (Kapitel 2.21.2) folgend aufgearbeitet. Nicht-filtrierbare Flüssigkeiten wurden direkt mit 1x10
4 KBE Saccharomyces cerevisiae
dotiert (in Medium verdünnt) und anschließend nach dem unter dem Kapitel 2.21.3 beschriebenen Verfahren aufgearbeitet. Zur Überprüfung der Lebendkeimzahl wurden ebenfalls 100 µl einer geeigneten Verdünnungsstufe auf YM-/YGC-Agar ausplattiert.
2.22.3 Sensitivitätstestung bei hoher Begleitflora
Zur Spezifitätstestung der Aufarbeitung und des PCR-Systems wurden Proben artifiziell kontaminiert: Dekadisch in SSL-Medium verdünnte Fruchtsäfte bzw. –konzentrate wurden mit etwa 100 KBE/100 µl
Saccharomyces cerevisiae und 106 KBE/100 µl E. coli dotiert. Die Aufarbeitung – inklusive
Lebend/Tot-Differenzierung – wurde dem Aufarbeitungsprotokoll unter Punkt 2.21.2 (ohne Voranreicherung) folgend durchgeführt. Es wurde jeweils eine mikrobiologische Kontrolle beider Verdünnungen angelegt.
2.22.4 Dotierungen mit inaktivierten Zellen für die Lebend/Tot-Differenzierung
Versuche zur Optimierung der Lebend/Tot-Differenzierung wurden mit inaktivierten Zellen durchgeführt. Zellen bzw. Sporen wurden in SSL-Medium auf eine geeignete Zellzahl eingestellt und anschließend für 20 min bei 80°C im Thermoblock erhitzt. Zur Überprüfung der Behandlung wurden die Zellen unverdünnt auf YM-Agar ausplattiert und bei 27-30°C für bis zu einer Woche inkubiert.
3 ERGEBNISSE
33
3 Ergebnisse
3.1 Auswahl und Beschreibung der Zielregion
Voraussetzung für einen Assay, der es erlaubt, eine große Bandbreite unterschiedlicher
Hefen und Schimmelpilze sensitiv zu detektieren, war die Auswahl einer konservierten
Region. Für eine spätere Quantifizierung eignet sich ein multi-copy-Gen besonders. Mit dem
28S (Abkz: Svedberg-Einheit, Sedimentationskoeffizient) rDNA-Abschnitt, der bereits im
Vorfeld zu dieser Arbeit gewählt wurde, sollte ein solcher Bereich gefunden werden.
Ribosomale DNA kodiert für die ribosomale RNA, welche für die Proteinsynthese essentiell
ist, da sie als Strukturbestandteil der Ribosomen fungiert. Ein Ribosom besteht aus vier
(Prokaryonten: drei) verschiedenen RNA-Molekülen: 28S (23S in Prokaryonten, etwa 4000-
5000 Nukleotide), 18S (16S in Prokaryonten, etwa 2000 Nukleotide), 5.8S (160 Nukleotide)
und 5S (120 Nukleotide) (Graw 2006). Ribosomale DNA ist in der nucleolus organizer region
(Abkz. NOR) auf einem oder mehreren Chromosomen ubiquitär verteilt (Prokopowich et al.
2003; Rooney und Ward 2005). Ein rDNA-Repeat besteht aus zwei variablen, nicht-
codierenden Bereichen, den sog. internal transcribed spacer (Abkz. ITS), die eingebettet
zwischen den Genen der 18S und 28S rDNA und durch die 5.8S rDNA getrennt sind
(Gardes und Bruns 1993; Horton und Bruns 2001; Bellemain et al. 2010).
Abbildung 4: Darstellung des rDNA-Repeats und des 28S-rDNA-Genabschnitts Ribosomale DNA-Repeats wiederholen sich tandemartig bis zu 250 Mal in Fungi, wobei die einzelnen Abschnitte durch non transcribed spacer voneinander abgegrenzt sind. Ein rDNA-Repeat besteht aus dem 18S- und dem 28S-rDNA-Gen, die durch die zwei nicht-codierenden internal transcribed spacer getrennt sind. Zwischen diesen
wiederum findet sich der 5.8S-rDNA-Abschnitt. Die ausgewählte Zielsequenz befindet sich im Bereich der 28S-rDNA-Region.
18S 5.8S 28S
NTS NTS NTS NTS
NTS NTS
28S LSU
≈3950bp
rDNA repeat
rDNA repeat rDNA repeat
Primer 1 Primer 2 Sonde
ITS1 ITS2
5'
5'
5'
3'
3'
3'
3 ERGEBNISSE
34
Die rDNA-Repeats wiederholen sich in Fungi bis zu 250 Mal, wobei die einzelnen Bereiche
durch non-transcribed spacer (Abkz. NTS) voneinander abgegrenzt werden (Bellemain et al.
2010). Der gesamte DNA-Bereich weist sowohl variable, als auch konservierte Regionen auf,
so dass einige Abschnitte für die Speziesidentifikation (z.B. ITS1 und ITS2) und andere für
den allgemeinen Nachweis von Pflanzen, Pilzen u.a. Verwendung finden (Gardes und Bruns
1993; Henry et al. 2000; Sugita und Nishikawa 2003; Bellemain et al. 2010; Schoch et al.
2012) .
DNA-Sequenzen des betreffenden Genabschnittes, davon 139 Hefe- und 94
Schimmelpilzsequenzen, wurden zunächst aus der NCBI-Datenbank ausgewählt, im
Sequenzanalyseprogramm alignt und dienten anschließend als Ausgangspunkt für das
Primer- und Sonden-Design sowie der theoretischen Bewertung der Spezifität (Auswahl der
relevanten Spezies im Anhang VI). Fluoreszenzmarkierte Sonden können nach DIN EN ISO
20838:2006 zudem als Nachweis über die Amplifikation des korrekten Produkts eingesetzt
werden.
Insbesondere der vordere Genbereich zeichnete sich durch einen hohen
Konservierungsgrad aus, der es erlaubte, eine Vorauswahl an potentiellen Oligonukleotiden
zu treffen. Da innerhalb der platzierten Oligonukleotide einzelne Basenvariationen auftraten,
sollten diese durch den Einsatz weiterer Primer und Sonden abgedeckt werden. Eine
gleichmäßige Amplifikation des Genabschnittes möglichst vieler Fungi sollte dadurch erreicht
werden. Somit wurden drei weitere 3‗-Primer sowie ein zusätzlicher Forwardprimer empirisch
untersucht.
3.2 Generierung eines Plasmids mit plantaespezifischer DNA
Aufgrund des hohen Konservierungsgrades des 28S-rDNA-Gens war zu klären, ob mit den
ausgewählten Primern und Sonden auch nicht-fungoide Organismen detektiert werden
würden. Demzufolge wurden DNA-Sequenzen verschiedener Pflanzenarten der NCBI-
Datenbank entnommen und erneut eine theoretische Überprüfung der
Oligonukleotidspezifität vorgenommen. Beide pilzspezifischen Forwardprimer weisen an
Position 4 bzw. 5 des 5‗-Endes eine Fehlpaarung auf, welche eine Amplifikation pflanzlicher
DNA jedoch nicht unterbindet. Weiterhin unterscheidet sich die Sequenz des Reverseprimers
FungiRv3LNA in nur einer Base von der der pflanzlichen DNA.
Zur praktischen Überprüfung der Oligonukleotide und etwaiger Modifikationen war es
grundlegend, eine geeignete Probe pflanzlicher DNA zu verwenden. Bei der DNA-Extraktion
aus Pflanzenmaterial konnte nicht zweifelsfrei sichergestellt werden, dass nicht auch geringe
Mengen an fungoider DNA enthalten sein könnten. Daher sollte eine artifizielle Pflanzen-
DNA in Form eines Plasmids generiert werden, welches anschließend in den weiteren
Experimenten eingesetzt werden sollte. Zunächst wurde aus den vorliegenden DNA-
3 ERGEBNISSE
35
Sequenzen ein potentielles Primerpaar (VegFw1, VegRv1) abgeleitet, welches mit einer
Länge von 868 bp den 28S-rDNA-Zielbereich flankiert (siehe Anhang I). Nach erfolgreicher
Amplifikation des Abschnittes und Visualisierung mittels Agarosegelelektrophorese (siehe
Abbildung 5) wurden die spezifischen Banden aus Bananen-, Erdnuss- und Kürbis-DNA
ausgeschnitten, aufgereinigt und in den pGEM®-T-Vektor ligiert. Die Amplifikation von Soja-
und Karotten-DNA war aufgrund von Sequenzunterschieden im Bereich des Forwardprimers
nicht erfolgreich. Den herangezogenen NCBI-Datenbanksätzen für Erdbeere (Acc.No.
X58118) und Reis (Acc.No. M11585.1) nach, ist das Primerpaar komplementär zum DNA-
Strang, so dass das ausbleibende PCR-Produkt eine Folge der DNA-Degradierung ist.
Abbildung 5: UV-Visualisierung des Agarosegels mit pflanzenspezifischen Amplifikaten Die PCR zur Generierung des pflanzenspezifischen Amplifikats mit 868bp Länge wurde mit sieben verschiedenen DNAs und einer Negativkontrolle durchgeführt. Die Ergebnisse wurden schließlich mittels Gelelektrophorese visualisiert und ausgewertet. Beladung: 1: 1kb Marker, 2: Musa acuminata, 3: Fragaria ananassa, 4: Arachis hypogaea, 5: Daucus carota, 6: Cucurbita pepo, 7: Oryzae sativa, 8: Glycine max, 9: Negativkontrolle, 10: 100bp
Marker. Die spezifischen Banden der Taschen 2, 4 und 6 wurden für die Klonierung eingesetzt.
Nach Transformation in XL1 Blue E. coli-Zellen und anschließender Blau-Weiß-Selektion
konnten drei positive Klone von den Selektivnährböden entnommen und erfolgreich
angereichert werden. Die Insertion der DNA aus Musa acuminata (Banane) war nicht
erfolgreich: in keiner der untersuchten Kolonien konnte über die PCR die DNA-Sequenz
nachgewiesen werden (siehe Abbildung 6 Tasche 1 bis 3). Erfolgreich waren die
Transformationen mit dem A. hypogaea-Insert (sog. Plasmid 1, siehe Abbildung 6 Tasche 5)
und dem C. pepo-Insert (Plasmid 2 und 3, siehe Abbildung 6 Tasche 9 und 10). Die aus den
gewählten Klonen präparierten Plasmide wurden letztlich sequenziert, um nochmals die
Richtigkeit des Inserts prüfen zu können (siehe Anhang II). In zwei von drei Klonen (Plasmid
1 und 3) konnten die Abschnitte der verwendeten Oligonukleotide wiedergefunden werden.
Die Sequenzierung des zweiten Plasmids (aus Cucurbita pepo) gelang nicht vollständig. Mit
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1000 bp
800 bp
500 bp
300 bp
10000 bp
500 bp
3 ERGEBNISSE
36
der Colony-PCR (siehe Kapitel 2.14.5 und Abbildung 6) konnte allerdings gezeigt werden,
dass das Insert die korrekte Amplifikatlänge aufweist und somit eingebaut wurde.
Mit Hilfe des Plasmids mit pflanzenspezifischer DNA (siehe Abbildung 28 in Anhang III)
konnte nun die Spezifität der Oligonukleotide des Pilzgesamtnachweissystems getestet
werden. Dafür wurde ein Plasmid mit zunehmender Kopienzahl in den Assay eingebracht. Es
wurde geprüft, ob der Einsatz eines mit einer Locked nucleic acid-Base modifizierten Primers
und eines C3-Spacer-geblockten Primers sinnvoll ist.
3.3 Primermodifikationen zur Erhöhung der Spezifität
Unter dem Begriff Locked nucleic acid versteht man ein Nukleinsäureanalogon, dass durch
die hohe Bindungsaffinität zum Komplementärstrang eine enorme Spezifität aufweist und
daher vor allem im Bereich der single nucleotide polymorphisms (Abkz. SNPs) zur
Mutationsanalyse Anwendung findet (Ballantyne et al. 2008). In der Pentose des DNA- oder
RNA-Nukleotids wird mit einer zusätzlichen Methylenverbindung zwischen dem Sauerstoff
des C2-Atoms und dem C4-Atom eine strukturelle Änderung vorgenommen (siehe Abbildung
7), die den Zucker in der bevorzugten N-Stellung (C3'-endo-Pucker in A-DNA) festsetzt
(Obika et al. 1998; Braasch et al. 2002; Devor 2005). Dadurch wird eine hohe
Diskriminierung von Fehlpaarungen erreicht, da sich die Base einzig an die
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1000 bp
800 bp
500 bp
300 bp
200 bp
Abbildung 6: UV-Visualisierung der mittels Colony-PCR untersuchten Klonkandidaten Jeweils drei Klonkandidaten wurden je eingesetzter Pflanzen-DNA mit einer Pipettenspitze von einem Selektivnährmedium gepickt und vor dem Überführen in das Anreicherungsmedium in den pflanzenspezifischen Mastermix eingebracht. Beladung: 1: 100bp Marker, 2-4: Kandidaten Musa acuminata, 5-7: Kandidaten Arachis hypogaea, 8-10: Kandidaten Cucurbita pepo.
3 ERGEBNISSE
37
Komplementärbase anlagern kann (Ballantyne et al. 2008). Der DNA-Komplex weist nach
erfolgreicher Hybridisierung der Base eine große Stabilität auf, was in einer wesentlich
höheren Schmelztemperatur mündet (Quelle: Exiqon 2009).
Abbildung 7: Struktur einer LNA™-Base In der Pentose sind das 2‗-Sauerstoffatom und das C4-Atom über eine Methylenbrücke (gelb markiert) miteinander verbunden. Das Nukleotid wird in der bevorzugten N-Konformation gehalten, woraus eine hohe Affinität zur Komplementärbase hervorgeht (Braasch et al. 2002).
Im vorliegenden Assay weist ein Reverseprimer nur eine Base Unterschied im Vergleich zur
pflanzlichen Sequenz auf. Es galt zu klären, ob die Umwandlung in eine LNA™-Base in einer
Verbesserung der Spezifität resultiert.
Zur weiteren Erhöhung der Spezifität sollte ein C3-Spacer untersucht werden. Am 3‗-
Phosphatrest der letzten Primerbase wird dabei eine Propylgruppe angehangen, welche eine
Elongation des modifizierten Primers infolge der Strukturänderung unterdrücken soll (Zhou et
al. 2004; Dames et al. 2007). Der Blockprimer wurde der pflanzlichen 28S rDNA-Sequenz
entsprechend designt und sollte demzufolge an pflanzliche DNA, wie sie in realen Proben –
insbesondere Fruchtsäften - stets präsent sein kann, hybridisieren und eine Vervielfältigung
des Abschnitts unterbinden.
Die durch den Einsatz von LNA™- und C3-Spacer-geblocktem Primer auftretenden Effekte
sollten in direktem Vergleich zum Reverseprimer untersucht werden. Es wurden Mastermixe
produziert, die den unmodifizierten Primer FungiRv3 oder den LNA-Primer FungiRv3LNA
und/oder den Blockprimer PlantBlock enthielten. Der unmodifizierte Primer FungiRv3 wies
zwei zusätzliche Basen am 3‗-Ende auf, wodurch seine Schmelztemperatur jedoch nur 2 °C
über der des LNA™-Primers lag.
Effekte der einzelnen Primervarianten wurden mit fünf Konzentrationen des generierten
Pflanzenplasmids analysiert: es wurden Kopienzahlen von 1,1x107 bis 1,1x10
9 Kopien je
Reaktion eingesetzt. Jede Konzentration wurde als Duplikat untersucht. Für jeden Mix wurde
die Positivkontrolle (100 000 GÄ; Duplikat) mitgeführt. Die erhaltenen Cp-Werte jedes
Reaktionsmixes sowie die Auswertung sind in Abhängigkeit von der eingesetzten Plasmid-
Konzentration in Tabelle 17 aufgelistet. Es ist zu erkennen, dass bei Einsatz des
unmodifizierten Reverseprimers FungiRv3 in jeder Probe ein Signal generiert wurde. Höhere
Plasmidkonzentrationen resultierten in frühen Cp-Werten: 1,1x109 Kopien entsprechen einer
3 ERGEBNISSE
38
DNA-Menge von 5 ng und erreichten bereits bei Zyklus 9,77 den Schwellenwert. Die Cp-
Werte dieses Mastermixes dienten als Grundlage zur Beurteilung der Effekte der
Primermodifikationen.
Tabelle 17: Einfluss verschiedener Primermodifikationen auf Cp-Werte bei Einsatz eines pflanzenspezifischen Plasmids
Kopien (Plasmid)
unmod. Primer unmod. Primer und
Blockprimer LNA™-Primer
LNA™- und Blockprimer
1,14E+07 Cp 16,53 16,52 22,60 22,49 33,73 33,53 - -
x̅ (Cp) 16,52 22,54 33,63 -
σ (Cp) 0,01 0,08 0,14 -
Δ Cp (1) x -6,02 -17,21 -28,48*
Δ Cp (2) x x -11,19 -22,46*
Δ Cp (3) x x x -11,47*
2,28E+07 Cp 15,63 16,71 22,20 22,68 33,66 33,86 - -
x̅ (Cp) 16,17 22,44 33,76 -
σ (Cp) 0,76 0,34 0,14 -
Δ Cp (1) x -6,27 -17,59 -28,83*
Δ Cp (2) x x -11,32 -22,56*
Δ Cp (3) x x x -11,24*
1,14E+08 Cp 12,76 13,67 19,98 19,24 - 31,38 35,62 35,15
x̅ (Cp) 13,22 19,61 31,38 35,38
σ (Cp) 0,65 0,52 0,00 0,33
Δ Cp (1) x -6,39 -18,16 -22,16
Δ Cp (2) x x -11,77 -15,77
Δ Cp (3) x x x -4,00
2,28E+08 Cp 12,03 11,63 17,26 17,91 29,67 30,57 35,34 35,40
x̅ (Cp) 11,83 17,59 30,12 35,37
σ (Cp) 0,29 0,47 0,64 0,04
Δ Cp (1) x -5,76 -18,29 -23,54
Δ Cp (2) x x -12,53 -17,78
Δ Cp (3) x x x -5,25
1,14E+09 Cp 9,76 9,78 15,98 15,80 26,43 27,23 33,79 34,07
x̅ (Cp) 9,77 15,89 26,83 33,93
σ (Cp) 0,01 0,13 0,57 0,20
Δ Cp (1) x -6,12 -17,06 -24,16
Δ Cp (2) x x -10,94 -18,04
Δ Cp (3) x x x -7,10
x̅ (Δ Cp (1)) x -6,112 -17,66 -25,43
x̅ (Δ Cp (2)) x x -11,55 -17,10
x̅ (Δ Cp (3)) x x x -7,79
Der Versuch wurde auf dem LightCycler®480-II durchgeführt. Es wurden 5 Konzentrationen des Pflanzenplasmids
(1,1x107 bis 1,1x109 Kopien je Reaktion) jeweils als Duplikat mit den 4 Mastermixen getestet. Die Werte von Δ Cp
geben jeweils die Differenz zu den Cp-Werten eines Reaktionsmixes an: (1): Differenz zu Mix mit unmodifiziertem (Abkz. unmod.) Primer FungiRv3; (2): Differenz zu Mix mit unmodifiziertem Primer und Blockprimer; (3): Differenz zu Mix mit LNA™-Primer.(*) Bei Proben, in denen kein Signal generiert wurde, wurde von einem Cp-Wert von 45,
also der Zyklenanzahl, zur Berechnung ausgegangen. Aus den erhaltenen Differenzwerten (∆Cp (x)) wurde letztlich der mittlere ∆Cp-Wert (x̅ (∆Cp(x))) als Kennzeichen für die durchschnittliche Cp-Wert-Verschiebung im Vergleich zum Standardmix oder einem der modifizierten Reaktionsmixe berechnet. Während der Mix mit Standardprimern die Amplifikation des Plasmids ermöglichte, konnte unter Einsatz der Reaktionsmixe mit modifizierten Primern eine Amplifikation hinausgezögert bzw. unterbunden werden.
3 ERGEBNISSE
39
Abbildung 8: ΔCp-Werte der Mixe mit modifizierten Primern im Vergleich Grafische Darstellung der Effekte verschiedener Primermodifikationen bei Einsatz unerwünschter DNA. ΔCp-Werte sind als Mittelwerte aller eingesetzten Plasmidkonzentrationen errechnet und geben jeweils die Verschiebung des Cp-Wertes im Vergleich zu einem bestimmten Mastermix an: x̅ (Δ Cp (1)): in Bezug auf Standardmix; x̅ (Δ Cp (2)): in Bezug auf Standardmix mit Blockprimer; x̅ (Δ Cp (3)): in Bezug auf Mix mit LNA™-Primer. Es ist deutlich, dass mit den Modifikationen eine Verschiebung der Cp-Werte des pflanzenspezifischen Plasmids erreicht werden konnte und damit beide Primer einen positiven Effekt auf die Spezifität erzielten. Im Vergleich zum Standardmix konnte der Cp-Wert unter Verwendung des LNA™- und des C3-Primers um 25,43 Zyklen verzögert werden.
Zunächst sollte der Einfluss der Zugabe des Blockprimers PlantBlock, welcher spezifisch an
pflanzliche DNA hybridisieren sollte, analysiert werden (Tabelle 17, Abbildung 8). Eine
Amplifikation pflanzlicher DNA erfolgte unabhängig von deren Konzentration im Schnitt um
x̅ (Δ Cp (1)) = 6,11 Zyklen später als im Standardmix. Eine vollständige Unterdrückung der
Amplifikation konnte nicht verzeichnet werden. Mit Austausch des Reverseprimers durch
einen LNA™-modifizierten Primer wurden weiterhin alle Proben detektiert. Allerdings war
hier im Vergleich zum Standardmix im Mittel eine Verzögerung des Cp-Wertes von 17,66
Zyklen erkennbar. So wurden beispielsweise 1,1x109 Kopien des Plasmids erst ab Cp 26,43
bzw. 27,23 statt bereits ab Cp 9,77 nachgewiesen. Der Blockprimer in Kombination mit dem
Standardprimer erzielte noch im Schnitt um 11,55 Zyklen frühere Signale. Gab man
zusätzlich zum LNA™-Primer den mit einem C3-Spacer geblockten Primer im Überschuss
hinzu, wurden die Proben mit bis zu 2,28x107 Kopien nicht detektiert. Ab 1,1x10
8 Kopien
wurden Cp-Werte erhalten, die im Vergleich zum Standardprimer um 25,43 (x̅ (Δ Cp (1)))
Zyklen, zum Standardprimer mit C3-Primer um 17,10 Zyklen und zum Reaktionsmix mit
LNA™-Primer um 7,79 Zyklen (x̅ (Δ Cp (3))) später detektiert wurden. Auf Grundlage dieser
Resultate wurden alle weiteren Experimente mit einem Reaktionsmix durchgeführt, der
sowohl den LNA™-Primer als auch den Blockprimer enthielt.
-6,11
-17,66
-25,43
-11,55
-17,1
-7,79
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
∆C
p x ̅(Δ Cp (1))
x ̅(Δ Cp (2))
x ̅(Δ Cp (3))
mit Blockprimer mit LNA™-Primer mit LNA™- und Blockprimer
3 ERGEBNISSE
40
3.4 Generierung der Positivkontrolle
Unter dem Begriff der positiven PCR-Kontrolle ist nach DIN EN ISO 22174:2005 diejenige
Reaktion definiert, die die Ziel-DNA in einer festgelegten Menge oder Anzahl an Kopien
enthält und bei jedem PCR-Lauf mitgeführt werden muss. So kann zum einen die
Funktionalität der Oligonukleotide zur Vermeidung falsch-negativer Resultate geprüft und
zum anderen beim Einsatz einer Verdünnungsreihe eine Quantifizierung der Probe erreicht
werden.
Zur Generierung des Plasmids wurde RNA-freie, quantifizierte Dekkera-anomala-DNA
amplifiziert (siehe Kap. 2.14.2), mit dem Vektor pGEM®-T ligiert (Kap. 2.14.3) und
anschließend in E. coli-XL1-Blue-Zellen transformiert (Kap. 2.14.4). Nach der Präparation
und Aufreinigung des Plasmids (Yeast Mold PK 1) konnte es sequenziert werden1. Eine
schematische Darstellung des Plasmids ist im Anhang gegeben (Anhang IV, Abbildung 29).
Sie kongruiert in vollem Umfang mit der in der NCBI-Datenbank hinterlegten D. anomala-
Sequenz (Gen Bank Acc. No. DQ406714).
Um eine Verwendung als Quantifizierungsstandard zu ermöglichen, war es notwendig, das
generierte Plasmid mit einer auf Genomäquivalente eingestellten chromosomalen DNA zu
korrelieren. Es wurde RNA-freie, quantifizierte Dekkera anomala-DNA (Genomgewicht:
1 GÄ ≈ 14,51 fg) verschiedener Konzentrationen eingesetzt und eine Standardkurve erstellt.
Vom zu untersuchenden Kontrollplasmid wurden verschiedene Kopienzahlen jeweils als
Duplikate in die Reaktion eingebracht und über die Standardkurve ein Zusammenhang
zwischen eingesetzter Kopienzahl und zugehörigen Genomäquivalenten hergestellt.
Demzufolge entsprechen 100 Plasmidkopien etwa einem Genomäquivalent. Hierzu sei auf
Abbildung 9 verwiesen, welche den beinahe kongruenten Verlauf der Amplifikationskurven
von Kontrollplasmid und dazugehöriger DNA-Konzentration zeigt. Die tabellarische Übersicht
aller Cp-Werte ist dem Anhang V beigefügt. Die Auswertung der Cp-Werte und die
errechneten DNA-Konzentrationen der Duplikate sind in Tabelle 18 aufgelistet. Die
Korrelation zwischen Plasmid und eingesetzter DNA-Menge wird darin deutlich: 1,02x104 GÄ
entsprechen 9x103 Kopien des Kontrollplasmids (Berechnung mit LightCycler®480
Software 1.5.0). Die Ausgangskonzentration des Positivkontrollplasmids wurde auf 4x106
Plasmidkopien je Mikroliter eingestellt. Zur Verwendung als Positivkontrolle genügte eine
Verdünnung auf 1x103 Plasmidkopien.
1 Aus patentrechtlichen Gründen ist die Positivkontrollsequenz nicht aufgeführt.
3 ERGEBNISSE
41
Abbildung 9: Amplifikationskurven zur Einstellung der Positivkontrolle auf Genomäquivalente Die Verdünnungsstufen des Positivkontrollplasmids (blau) wurden jeweils als Duplikat aufgetragen
(LightCycler®480-II): 1x10
6 – 1x10
5 – 1x10
4 – 2,5x10
3 – 6,25x10
2–1,56x10
2 Kopien. RNA-freie, quantifizierte DNA
aus Dekkera anomala (rot) wurde mit folgenden Genomäquivalenten aufgetragen: 10 000 GÄ – 1 000 GÄ – 100 GÄ – 25 GÄ – 6,25 GÄ – 1,56 GÄ. Mengenangaben sind jeweils Gesamtmenge je Reaktion. Negativkontrollen sind grün hervorgehoben. Es ist ersichtlich, dass DNA und Positivkontrollplasmid beinahe kongruent zueinander verlaufen. Demnach entsprechen 1x10
6 Plasmidkopien etwa 10 000 Genomäquivalenten.
Auch die nachfolgenden Verdünnungsstufen verlaufen annähernd identisch.
Tabelle 18: Korrelation der Cp-Werte von DNA und Positivkontrollplasmid
D. anomala-DNA Kontrollplasmid
Standard (GÄ) Cp Konzentration
(GÄ)
Standard (Kopien)
x̅ (Cp) Konzentration
(GÄ)
1,00E4 21,74 1,02E4 1,00E6 21,93 9,00E3
1,00E3 25,32 9,64E2 1,00E5 25,48 8,71E2
1,00E2 28,74 1,02E2 1,00E4 29,01 8,52E1
2,50E1 30,88 2,49E1 2,50E3 31,12 2,13E1
6,25E0 32,73 6,12E0 6,25E2 32,89 5,34E0
1,56E0 34,18 1,57E0 1,56E2 34,06 1,78E0
Gegenübergestellt sind die erhaltenen Cp-Werte der Dekkera-anomala-DNA, eingestellt auf Genomäquivalente, und des Positivkontrollplasmids mit den per Software (LightCycler
® Software 1.5.0) ermittelten DNA-Gehalten
(grün markiert) des in Abbildung 9 gezeigten Experimentes. Auch hier ist eine Korrelation von DNA und Plasmid
ersichtlich: 10 000 GÄ generieren einen Cp-Wert von 21,74, während 1x106 Plasmidkopien im Zyklus 21,93
detektiert werden. Die nachfolgenden Verdünnungsstufen weisen ebenfalls homogene Cp-Werte auf.
3.5 Einbringen einer internen Amplifikationskontrolle
Die interne Amplifikationskontrolle ist nach DIN EN ISO 22174:2005 diejenige DNA, „die zu
jeder Reaktion in einer festgelegten Menge oder Anzahl an Kopien hinzugefügt wird und die
als interne Kontrolle hinsichtlich der Amplifikation dient―. Das Mitführen einer solchen
Kontrollreaktion ist nach DIN EN ISO 20838:2006 vorgeschrieben.
Für die interne Amplifikationskontrolle dieses Assays wurde ein bereits synthetisiertes
Zielprodukt mit artifizieller DNA-Sequenz verwendet, dessen Basenabfolge nachweislich in
keinem Mikroorganismus auftritt. Geeignete Oligonukleotide wurden ebenfalls im Vorfeld
designt. Es galt dasjenige Primerpaar der homologen Amplifikationskontrolle zu wählen,
dessen Produkt eine größere Basenlänge wie das eigentliche Zielprodukt aufweist. Die
y = - 3,5x+35,23
R2 = 0,9963
Flu
ore
szen
z (
465-5
10n
m)
-0,681
32,319
Zyklen 5 15 25 35 45
3 ERGEBNISSE
42
Reaktionsbedingungen für die IAK sollten suboptimal gewählt werden, d.h. es werden
geringere Primer- und Sondenkonzentrationen verwendet, um trotz Konkurrenz um dNTPs
und Polymerase die Reaktion in Richtung des kleineren Zielproduktes zu lenken (Prohaska
2009). Das Kontrollprodukt wies letztlich eine Basenlänge von 122 bp auf und ist damit
geringfügig länger als die Zielsequenz2. Das linearisierte IAK-Plasmid wurde in einer
Endkonzentration von 0,008fg/µl zum Mastermix (25 µl Reaktionsvolumen) hinzugegeben.
Die Detektion erfolgte im HEX-Kanal.
3.6 Spezifitätstestungen
3.6.1 Inklusivität
Der Norm DIN EN ISO 16140:2003 (Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln –
Arbeitsvorschrift für die Validierung alternativer Verfahren) und der amtlichen Sammlung von
Untersuchungsverfahren nach §64LFGB L 00.00-138 (Untersuchung von Lebensmitteln)
folgend wurden zur Inklusivitätsprüfung empirische Ergebnisse mit den Zielorganismen
erhoben. Anforderung war eine vergleichbare Amplifikationseffizienz der verschiedenen
Sequenzvarianten einer Vielzahl an Pilzen.
Abbildung 10: Amplifikationskurven taxonomisch verschiedener Fungi-Spezies Dargestellt sind die Amplifikationskurven taxonomisch verschiedener Fungi-Spezies aus 3 (Sub-)Phyla. Blau: Ascomycota: Fusarium poae (BCD 149), Pachysolen tannophilus (CBS 4044), Lipomyces kononenkoae (DSM 70302), Pichia farinosa (BCD 861), Citeromyces matritensis (BCD 1062), Eurotium amstelodami (BCD 3557), Scytalidium lignicola (BCD 3602), Candida glabrata (BCD 8932), Talaromyces flavus (BCD 12179), Diaporthe citri (DSM 1159), Aureobasidium pullulans (BCS 14484); Rot: Mucoromycotina: Zygorhynchus macrocorpus (BCD 2609), Radiomyces spectabilis (BCD 3505), Mycotypha africana (CBS 122.64), Mycotypha microspora (CBS 230.32); Dunkelgrün: Basidiomycota: Sterigmatomyces elviae (DSM 70852), Cryptococcus albidus (DSM 70197); Grün: PCR-NTCs. Es wurde jeweils eine DNA-Menge von 50 pg eingesetzt. In allen
Proben zeichnete sich ein gleichmäßiger und sigmoider Kurvenverlauf ab. Die Negativkontrollen sind negativ.
2 Aus patentrechtlichen Gründen sind weder Plasmidsequenz noch Hybridisierungsstellen abgebildet.
Zyklen 5 15 25 35 45
Flu
ore
szen
z (
465-5
10n
m)
0,513
33,513
3 ERGEBNISSE
43
Es wurde RNA-freie DNA, die jedoch nicht auf Genomäquivalente eingestellt war, mit einer
Endkonzentration von 50 pg/Rxn. eingesetzt. Insgesamt wurden 243 Fungi-Spezies (285
Stämme) getestet: darunter befanden sich 201 (240) Ascomyceten, 21 (23) Basidiomyceten,
19 (20) Mucoromycotina-Spezies sowie je eine Kickxellomycotina- und Blastocladiomycota-
Spezies. Alle im Anhang VI aufgeführten Pilzstämme wurden in der Real-time-PCR
detektiert.
3.6.2 Exklusivität
Nach §64LFGB L00.00-138 soll bei der Entwicklung von Polymerase-
Kettenreaktionssystemen untersucht werden, ob Nicht-Ziel-Organismen eine Störung des
Assays verursachen. Taxonomisch nahverwandte und nicht nahverwandte Mikroorganismen,
die aber in Lebensmittelmatrices präsent sein können, sollten untersucht werden. Hierfür
wurden 60 RNA-freie, quantifizierte DNAs, die mit anderen Assays3 auf ihre
Amplifizierbarkeit hin untersucht wurden, mit einem Gehalt von 100 pg je Reaktion
eingebracht. Darunter befanden sich 25 Bakterien, 20 Pflanzenspezies sowie 10 humane, 4
murine und 1 canine Zelllinie (detaillierte Auflistung unter Anhang VII, Tabelle 31). Keine der
aufgeführten Spezies generierte ein positives Signal im pilzspezifischen FAM-Kanal,
während die amplifizierte IPC im HEX-Kanal eine Inhibition des Assays ausschließen ließ
(siehe Abbildung 11).
Abbildung 11: Amplifikationskurven der internen Amplifikationskontrolle bei der Exklusivitätstestung Abgebildet sind die Amplifikationskurven der internen Amplifikationskontrolle für 20 Bakterienspezies und 10 Pflanzen (DNA-Menge jeweils 100 pg). Alle Proben wurden im FAM-Kanal negativ getestet. Der HEX-Kanal zeigt einen korrekten Reaktionsablauf ohne Inhibitionen an.
3 Die DNAs wurden im Rahmen anderer Entwicklungsprojekte innerhalb des Unternehmens
erfolgreich eingesetzt.
Zyklen 5 15 25 35 45
Flu
ore
szen
z (
465-5
10n
m)
-0,052
14,948
3 ERGEBNISSE
44
3.7 Sensitivitätstestung des Assays mit quantifizierbarer DNA
Mit der Überprüfung des limit of quantification (engl. Bestimmungsgrenze, Abkz. LOQ) soll
die kleinste Menge des Analyten, die mit definierter Richtigkeit und Präzision unter den
gegebenen Versuchsbedingungen gemessen und quantitativ bestimmt werden kann,
ermittelt werden. Das limit of detection (Abkz. LOD) beschreibt dagegen die absolute
Nachweisgrenze. Sie legt die niedrigste Konzentration des Target bezogen auf eine
definierte Menge an Matrix fest, die unter den gegebenen Versuchsbedingungen
reproduzierbar nachgewiesen werden kann (§64 LFGB L00.00-138).
Zur Testung der Sensitivität und damit der Feststellung der geringsten nachzuweisenden
DNA-Menge wurden 15 verschiedene Fungi-Stämme mit Hinblick auf eine gewisse
phylogenetische Varianz und Lebensmittelrelevanz ausgewählt. Vom größten Phylum, den
Ascomycota, wurden 11 verschiedene Spezies untersucht. Weiterhin wurden zwei
Basidiomycota- und zwei Mucoromycotina-Spezies herangezogen. Die Taxonomie ist
nachfolgend in Tabelle 19 dargestellt. Von allen eingesetzten Spezies wurde RNA-freie DNA
extrahiert, welche auf eine mögliche Degradierung hin mittels Agarosegelelektrophorese
geprüft wurde.
Tabelle 19: Taxonomie der zur LOD/LOQ-Bestimmung eingesetzten Spezies
Spezies Phylum Subphylum Klasse Ordnung
Cladosporium cladosporioides
Ascomycota Pezizomycotina Dothideomycotina Capnodiales
Alternaria citri Ascomycota Pezizomycotina Dothideomycetes Pleosporales
Aspergillus brasiliensis Ascomycota Pezizomycotina Eurotiomycetes Eurotiales
Penicillium chrysogenum
Ascomycota Pezizomycotina Eurotiomycetes Eurotiales
Fusarium oxysporum Ascomycota Pezizomycotina Sordariomycetes Hypocreales
Zygosaccharomyces bailii
Ascomycota Saccharomycotina Saccharomycetes Saccharomycetales
Dekkera anomala Ascomycota Saccharomycotina Saccharomycetes Saccharomycetales
Issatchenkia orientalis Ascomycota Saccharomycotina Saccharomycetes Saccharomycetales
Pichia anomala Ascomycota Saccharomycotina Saccharomycetes Saccharomycetales
Candida albicans Ascomycota Saccharomycotina Saccharomycetes Saccharomycetales
Schizosaccharomyces pombe
Ascomycota Taphrinomycotina Schizosaccharo-
mycetes Schizosaccharo-
mycetales
Rhodotorula mucilaginosa
Basidiomycota Pucciniomycotina Microbotryomycetes Sporidiobolales
Cryptococcus curvatus Basidiomycota Agaricomycotina Tremellomycetes Tremellales
Absidia corymbifera Mucoromycotina Mucorales
Mucor racemosus Mucoromycotina Mucorales
Pro Experiment wurden jeweils 2 verschiedene Spezies untersucht. Diese Vorgehensweise
ermöglichte einen direkten Vergleich der Amplifikationskurven - in Fluoreszenzhöhe und
erreichten Cp-Wert je DNA-Konzentration - verschiedener Spezies. Alle Versuche wurden auf
3 ERGEBNISSE
45
dem LightCycler®480-II durchgeführt. Die Cp-Wert-Berechnung erfolgte unter Anwendung
des 2nd Derivative Max der LightCycler®480-II Software.
Von den acht Verdünnungsstufen wurden 171 Replikate für die höchste DNA-Menge
(100 000 GÄ) und jeweils 173 Replikate für den Bereich von 10 000 bis 0,39 GÄ generiert.
Die Negativkontrolle wurde 140mal mitgeführt. Zunächst kann festhalten werden, dass alle
eingesetzten DNA-Proben mit dem pilzspezifischen Assay im FAM-Kanal detektiert wurden
(tabellarische Übersicht aller Daten pro Spezies im Anhang VIII). Die erhaltenen Cp-Werte
waren gleichmäßig verteilt, alle Kurven zeigten einen sigmoiden Verlauf. Es traten
Unterschiede in den finalen Fluoreszenzwerten auf (vgl. Abbildung 12). Das limit of detection
beträgt 0,39 GÄ, da keine niedrigere DNA-Menge getestet wurde.
Abbildung 12: Amplifikationskurven von Z. bailii und A. brasiliensis zur LOD/LOQ-Bestimmung Dargestellt sind die Verdünnungsreihen von Z. bailii (blau, 5 Replikate) und A. brasiliensis (rot, 6 Replikate). Es wurden zudem 8 Negativkontrollen (grün) aufgetragen, von denen drei im FAM-Kanal ein Signal lieferten. Die Amplifikationskurven der beiden Ascomyceten, die ein Genomgewicht von 11,5 fg (Z. bailii) und 40 fg (A. brasiliensis) aufweisen, verlaufen äußerst gleichmäßig und sigmoid. Die einzelnen Verdünnungsstufen sind optisch zu unterscheiden. Die Fluoreszenzen der Amplifikationskurven von Z. bailii erreichen höhere Werte. Das Experiment wurde auf dem LightCycler
®480-II durchgeführt.
Bei der genaueren statistischen Auswertung ist ersichtlich, dass im FAM-Kanal die
Standardabweichung der intraspezifischen Cp-Werte meist deutlich unter 0,5 lag (vgl. Tabelle
48). In denjenigen Fällen, wo sie darüber lag, kann dies auf Fehler beim Erstellen der
Verdünnungsreihe (siehe Replikat 10 bei C. albicans, Tabelle 42) oder das Auftragen einer
falschen Probe (siehe Replikat 10 bei A. citri, Tabelle 39) zurückgeführt werden. Des
Weiteren traten im niedrigen Konzentrationsbereich (0,39 GÄ) größere Schwankungen des
Cp-Wertes auf, was sich auch bei der interspezifischen Korrelation mit einer
Standardabweichung von 0,4 widerspiegelt. Ursache hierfür ist, dass im unteren
Konzentrationsbereich selbst eine geringe absolute Abweichung vom Standardwert stärker
Zyklen 5 15 25 35 45
Flu
ore
szen
z (
465-5
10n
m)
-1,053
58,947
3 ERGEBNISSE
46
ins Gewicht fällt als sie es bei hohen Konzentrationen würde. Die relative Abweichung vom
Standardwert ist dementsprechend hoch.
Die Templates – Pilz-DNA und IPC-Plasmid – konkurrieren um dNTPs, Enzym und andere
Einsatzstoffe. Daher verschiebt sich die Amplifikation der IPC bei sehr hohen Pilz-DNA-
Mengen um einige Cp-Werte nach hinten, was in einer Standardabweichung von bis zu 0,5
resultiert (vgl. Tabelle 20). Dagegen bleibt der Cp-Wert des IPC-Signals im geringen
Konzentrationsbereich (< 100 GÄ) gleich.
Cp-Werte gegen den Logarithmus der Genomäquivalente aufgetragen, ergaben letztlich eine
linearisierte Standardkurve, deren Steigung s einen Wert von -3,40 annahm (vgl. Abbildung
13). In einer optimalen PCR-Reaktion mit einer Effizienz von 2 verdoppelt sich ein Produkt je
Zyklus (Mülhardt 2009). Das bedeutet, dass es 3,32 Zyklen benötigt, bis aus einem Molekül
10 Moleküle entstanden sind. Die Cp-Werte einer dekadischen Verdünnungsreihe sollten
demnach eine Differenz von 3,32 aufweisen. Dieser Wert entspricht der Steigung der
Standardkurve. In der Realität wird der Wert selten erreicht, da er von der Templatemenge
und damit von der Amplifikationswahrscheinlichkeit (u.a. Zusammenfinden von Enzym,
Template und Nukleotiden) und den Reaktionsbedingungen abhängig ist (Mülhardt 2009).
Die Steigung s der linearisierten Standardkurve aller untersuchten Proben zeugt mit einem
Wert von -3,40 von einer sehr guten PCR-Effizienz mit geringer Fehlerrate (R2 = 1,00).
Auffällig ist die hohe Anzahl an positiv getesteten Negativkontrollen: von 140 eingesetzten
Proben lieferten 30 ein Signal im FAM-Kanal. Dies entspricht einem relativen Wert von
21,4%. Negativkontrollen wurden jeweils auf denselben Mikroplatten pipettiert wie die
Verdünnungsreihen. Alle getesteten Proben, sowohl NTCs als auch DNAs, waren bei der
internen Kontrolle positiv.
Tabelle 20: Statistische Auswertung zur interspezifischen Korrelation
Genomäquivalente je Reaktion (Detektion FAM / HEX)
100 000 GÄ 10 000 GÄ 1 000 GÄ 100 GÄ 25 GÄ 6,25 GÄ 1,56 GÄ 0,39 GÄ 0 GÄ (NTC)
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
∑ Replikate
171 171 173 173 173 173 173 173 173 173 173 173 173 173 173 173 140 140
% Positive
100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 21,4 100
x̅ (Cp) 16,6 33,2 20,2 32,0 23,7 30,9 27,1 30,4 29,2 30,6 31,2 30,8 33,1 30,9 35,0 31,0 38,8 31,0
σ (Cp) 0,1 0,5 0,0 0,4 0,1 0,2 0,3 0,0 0,1 0,0 0,1 0,0 0,2 0,0 0,4 0,0 2,67 0,19
Die Tabelle zeigt die zusammengefasste, statistische Auswertung aller untersuchten Replikate (∑ Replikate). Für jede Verdünnungsstufe wurden der prozentuale Anteil an positiv getesteten Proben (% Positive), der Mittelwert der erhaltenen Cp-Werte (x̅) sowie die dazugehörige Standardabweichung (σ) für den FAM- und HEX-Kanal berechnet. Die Replikate der verschiedenen Standardkonzentrationen wurden jeweils vollständig detektiert: Die Standardabweichungen (FAM-Kanal) liegen im Bereich von 0,0 bis 0,4. Aufgrund der Konkurrenz zwischen Pilz- und IPC-Template um PCR-Einsatzstoffe schwankt das IPC-Signal bei hohen Pilz-DNA-Mengen (σ100 000 GÄ = 0,5). Mit 21,4% wurde ein Fünftel aller Negativkontrollen positiv getestet.
3 ERGEBNISSE
47
Abbildung 13: Linearisierte Standardkurve zur interspezifischen Korrelation der LOD/LOQ-Bestimmung Aufgetragen sind die Cp-Werte mit jeweiliger Standardabweichung jeder Verdünnungsstufe gegen den Logarithmus der Genomäquivalenten (grün), generiert aus allen Cp-Werten der einzelnen Experimente jeder Spezies. Daraus ergibt sich eine linearisierte Standardkurve (schwarz) mit der Steigung s = -3,40.
3.8 Weitere Optimierung des Real-time-PCR-Assays
3.8.1 Blockierung der Taq-Polymerase bei Raumtemperatur
Die Untersuchungen zur Festlegung des LOD und LOQ wurden mit einem PCR-Mix
durchgeführt, der antikörpergeblockte, DNA-freie Taq-Polymerase enthielt. Da eine
Lyophilisation des Reaktionsmixes vorgesehen war, wurde auf den weiteren Einsatz des
glycerinhaltigen Antikörpers verzichtet. Glycerin stört den Gefriertrocknungsprozess aufgrund
seiner niedrigen Glasübergangstemperatur, wodurch die Flüssigkeit im System am
Tripelpunkt nicht vollständig sublimieren kann (Ringler 2000). Stattdessen wurde ein
Aptamer mit einer zuckerhaltigen Lyophilisationsreagenz eingesetzt.
Aptamere sind funktionelle Nukleinsäuren mit hoher Bindungsaffinität und Spezifität zu ihrem
Zielmolekül. Die Ausbildung von Sekundär- und Tertiärstrukturen erlaubt die passgenaue
Bindung an das Molekül (Friedrichs und Simmel 2007). Es war zu klären, ob nach der
Gefriertrocknung die Effizienz der Polymerase beeinträchtigt ist und die neue Blockierungsart
eine vergleichbare Amplifikation ermöglicht. Die Untersuchungen wurden auf dem
LightCycler®480 mit einer Standardreihe für beide Ansätze vorgenommen. Die Amplifikation
der eingesetzten D. anomala-DNA zeigte bei beiden Reaktionsmixen einen gleichmäßigen
Verlauf (siehe Abbildung 14). Die Cp-Werte der jeweiligen Verdünnungsstufen weisen keine
Unterschiede auf (vgl. Tabelle 21). Der Mastermix mit aptamergeblockter Taq-Polymerase
erreicht etwa 10 % höhere Fluoreszenzwerte. Die Steigungen der Standardkurven liegen mit
Werten von sAntikörper = -3,424 und sAptamer = -3,395 nah beieinander. Die Negativkontrollen
generieren bei der internen Kontrolle Signale.
y = -3,40x + 33,80R² = 1,00
15
20
25
30
35
40
-1 0 1 2 3 4 5 6
x ̅ (C
p)
log 10 (Genomäquivalente)
Interspezifische Korrelation
Standardkurve y
3 ERGEBNISSE
48
Tabelle 21: FAM-Cp-Werte des antikörper- bzw. aptamerhaltigen Reaktionsmixes
Genomäquivalente je Reaktion (Nominalkonzentration) – Detektion FAM
10 000 GÄ 1 000 GÄ 100 GÄ 25 GÄ 6,25 GÄ 1,56 GÄ
Antikörper Cp 20,60 24,03 27,51 29,48 31,19 32,33
GÄ (real) 1,01E4 1,00E3 9,46E1 2,57E1 5,95E0 1,56E0
Aptamer Cp 20,76 23,63 27,26 29,52 31,06 32,55
GÄ (real) 8,61E3 1,23E3 1,05E2 2,26E1 6,74E0 1,53E0
Gegenübergestellt sind die Cp-Werte (FAM) für eine Standardreihe von 10 000 bis 1,56 GÄ, die mit beiden Reaktionsmixen (Antikörper bzw. Aptamer) untersucht wurde. Die jeweils von der LightCycler
®-Software
berechneten Gehalte an Genomäquivalenten (GÄ (real)) sind für jede Verdünnungsstufe aufgeführt (grün). Im Vergleich liegen die Werte beider Reaktionsmixe beinander.
Abbildung 14: Amplifikationskurven der Reaktionsmixe mit antikörper- bzw. aptamergeblockter Taq-Polymerase Abgebildet sind die Amplifikationskurven zwei verschiedener Blockierungsarten der Taq-Polymerase nach der Lyophilisierung der Mastermixe (LightCycler
® 480): Rot: Aptamer, Blau: Antikörper. Grün dargestellt sind die
Negativkontrollen. Aufgetragen wurde eine Verdünnungsreihe mit D. anomala-DNA: 10 000 GÄ – 1 000 GÄ –
100 GÄ – 25 GÄ – 6,25 GÄ – 1,56 GÄ. Es ist ersichtlich, dass die Amplifikationskurven der aptamergeblockten Taq-Polymerase ebenso gleichmäßig verlaufen wie mit dem bisherigen Mastermix. Dabei werden zugleich höhere Fluoreszenzwerte erreicht. Die Steigung s der Standardkurve des aptamergeblockten Mixes (s = -3,395) ist der einer optimalen PCR näher (s = -3,32 bei Effizienz von 2), weist aber eine höhere Fehlerrate auf
(R2 = 0,9799).
3.8.2 Gradienten-PCR
Mit dem Einsatz der aptamergeblockten Taq-Polymerase war eine Prüfung der
Annealingtemperatur mittels Gradienten-PCR auf dem LightCycler® 96 notwendig. Hierfür
wurde unter Beachtung der Schmelztemperaturen von Primer und Amplifikat ein erster
Untersuchungsbereich von 53 bis 67°C gewählt. Neben dem Einsatz von zwei Ziel-DNAs
(A. brasiliensis, D. anomala) wurde auch ein pflanzenspezifisches Plasmid (siehe Kapitel
2.14.1 und 3.2) zugegeben. Dies sollte eine Aussage darüber erlauben, bei welcher
Annealingtemperatur unerwünschte Amplifikate am stärksten unterdrückt würden. Zum
gleichen Zweck wurde jeweils eine Negativkontrolle mitgeführt.
yAntikörper = -3,424x+33,51
yAptamer = -3,395x+33,53
R2Antikörper = 0,9949
R2Aptamer = 0,9799
Zyklen 5 15 25 35 45
Flu
ore
szen
z (
465-5
10n
m)
16,606
0,106
3 ERGEBNISSE
49
Die Beurteilung und die Auswahl einer Annealingtemperatur wurden stets unter
Berücksichtigung der bisherigen Resultate vorgenommen. Das Experiment mit dem
großzügig gewählten Temperaturbereich hat gezeigt, dass die relevante
Annealingtemperatur zwischen 60 und 63 °C liegt (Daten nicht gezeigt). Die Cp-Werte der
eingesetzten DNA-Mengen waren im Vergleich zu den Erfahrungswerten aus LOD- und
LOQ-Bestimmung nicht verschoben, die Fluoreszenzwerte im niedrigen Temperaturbereich
(60°C) um ca. 10% höher und unerwünschte Amplifikate wurden weitestgehend unterdrückt.
Die Amplifikate der Pilz-DNAs zeigten dagegen in den Abschnitten von 53 bis 59°C sowie
von 63 bis 67°C einen flachen Kurvenanstieg und niedrige Fluoreszenzwerte. Aus dem
zugegebenen Pflanzenplasmid und den Negativkontrollen wurden unspezifische PCR-
Produkte und Dimere generiert, die falschpositive Resultate lieferten. Obwohl auch bei 58 °C
gute Resultate erzielt werden konnten, musste dieses Temperaturspektrum aufgrund der
deutlich verminderten IPC-Amplifikation ausgeschlossen werden.
Zur Festlegung der optimalen Annealingtemperatur wurde ein direkter Vergleich der
Temperaturen von 60 und 63°C auf dem Stratagene Mx3005p durchgeführt. Aufgetragen
wurden eine Standardverdünnungsreihe von Dekkera anomala (DSM 70727), das Pflanzen-
Plasmid (10 pg, 4 Replikate) sowie 18 NTCs. Für beide Untersuchungen wurden dieselben
Verdünnungen verwendet. Beim Betrachten der Amplifikationskurven fällt zunächst auf, dass
der Verlauf der Proben mit Pilz-DNA in beiden Fällen sigmoid erfolgte und alle
Verdünnungsstufen detektiert wurden (vgl. Abbildung 15 und Abbildung 16). Der Anstieg war
im Experiment mit 60°C Annealingtemperatur flacher, was jedoch nicht in einer Cp-
Verschiebung resultierte. Während die höhere Annealingtemperatur deutliche
Amplifikationskurven aller plasmidhaltigen Proben und einiger Negativkontrollen generierte,
traten im Vergleichslauf (60°C) weniger unerwünschte Signale auf. Keine der eingesetzten
Pflanzen- und Negativkontrollen wurden als positive Probe detektiert. Nachfolgende
Experimente wurden somit mit der Annealingtemperatur von 60°C durchgeführt.
3 ERGEBNISSE
50
Abbildung 15: Amplifikationskurven bei 63°C Annealingtemperatur Abgebildet sind die Amplifikationskurven (Stratagene Mx3005p) einer Standardreihe von Dekkera anomala (rot), Plasmid mit pflanzenspezifischem Insert (4 Replikate, 10 pg, blau) sowie NTCs (18 Replikate, grün). Neben dem
gleichmäßigen Verlauf der Ziel-DNA sind Fluoreszenzsignale beim Plasmid sowie 5 Negativkontrollen gemessen worden, die jeweils in einer Kurve resultierten, die zwar hinter der des geringsten Standards (1,56 GÄ) verliefen, aber dennoch als positiv detektiert wurden.
Abbildung 16: Amplifikationskurven bei 60°C Annealingtemperatur Abgebildet sind die Amplifikationskurven (Stratagene Mx3005p) einer Standardreihe von Dekkera anomala (rot), Plasmid mit pflanzenspezifischem Insert (4 Replikate, 10 pg, blau) sowie NTCs (18 Replikate, grün). Die
Amplifikationskurven der Standardreihe verliefen im Vergleich zu Abbildung 15 etwas flacher aufgrund eines geringeren Anstiegs, aber dennoch sigmoid. Es wurden höhere Fluoreszenzwerte erzielt (ca. 40%) und keine unerwünschten Produkte generiert.
1000
Flu
ore
szen
z (
dR
)
3000
1000
Flu
ore
szen
z (
dR
)
4000
6000
26 Zyklen 6 12 18 32 38 44
44
26 Zyklen 6 12 18 32 38 44
44
3 ERGEBNISSE
51
3.8.3 Überprüfung der Performance
Mit den Erkenntnissen in Bezug auf die aptamergeblockte Taq-Polymerase und der
Annealingtemperatur sollte geprüft werden, ob die Anzahl falschpositiver Resultate, wie sie
bei der LOQ- und LOD-Bestimmung im Kapitel 3.7 auftraten (21,4% positive Proben bei
Negativkontrollen), verringert werden konnte. Neben dem Einsatz des Aptamers und des
neuen PCR-Temperaturprofils wurden zusätzliche Dekontaminationsmaßnahmen4 getroffen.
Es wurde lyophilisierter Mastermix herangezogen, der mit 32 Negativkontrollen und einer
Standardverdünnungsreihe von Dekkera anomala auf dem LightCycler®480 untersucht
wurde (siehe Abbildung 17).
Abbildung 17: Performanceprüfung mit einer Vielzahl an Negativkontrollen Dargestellt sind die Amplifikationskurven des PCR-Laufs zur Prüfung der Spezifität des Mastermixes mit aptamergeblockter Taq-Polymerase bei einer Annealingtemperatur von 60 °C (LightCycler
®480). A: FAM-Kanal:
Als Positivkontrolle wurde eine Standardverdünnungsreihe von Dekkera anomala (DSM 70727, rot) aufgetragen. Zusätzlich wurden 32 Negativkontrollen (grün) mitgeführt. Aus der Verdünnungsreihe ergaben sich gleichmäßig, sigmoide Kurven. Alle Negativkontrollen sind negativ. B: HEX-Kanal: Alle eingesetzten Proben generierten ein
Internes Kontrollsignal.
Es konnte gezeigt werden, dass mit den neuen Reaktionsbedingungen die Amplifikation der
Positivkontrollreihe (10 000 bis 1,56 GÄ) wie in vorherigen Experimenten sigmoide Kurven
hervorbrachte und alle Verdünnungsstufen detektiert wurden (siehe Abbildung 17 A). Alle
Negativkontrollen waren infolge der Dekontaminationsmaßnahmen im FAM-Kanal negativ.
Im HEX-Kanal waren alle Kontrollen IPC-positiv (siehe Abbildung 17 B).
3.9 Probenaufarbeitung für Fungi in Getränkematrices
3.9.1 Aufarbeitung filtrierbarer Flüssigkeiten
Zu den filtrierbaren Flüssigkeiten gehören klare Wässer ohne Kohlensäure, die sich mit
einem Volumen von 100 ml durch einen Polysulfonfilter (Abkz. PS-Filter) mit einer
Porengröße von 0,2 µm absaugen lassen. Als Modellmedium wurde Wasser mit
4 Alle Plastikmaterialien (Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße etc.) wurden vor dem Gebrauch 30 min
unter der PCR-Arbeitsbank mit UV (Abkz. ultraviolettes Licht) bestrahlt.
Flu
ore
szen
z (
533-5
80n
m)
A B
Zyklen 4 12 30 44
Flu
ore
szen
z (
465-5
10n
m)
32,420
-0,580
Zyklen 5 15 35 45
32,420
-0,137
13,863
36
3 ERGEBNISSE
52
standardisierter Härte (Abkz. WSH) verwendet. Verdünnungen von Hefezellen- oder
Sporensuspensionen wurden ebenfalls in WSH hergestellt.
Zur Bestimmung der Sensitivität wurden 100 µl einer dekadisch verdünnten Aspergillus-
brasiliensis-Sporensuspension von 1,5x106 bis 1,5x10
1 KBE/ml zu 100 ml WSH zugesetzt.
Jede Verdünnungsstufe wurde als Duplikat untersucht. Als Negativkontrolle der
Aufarbeitungsmethode wurde WSH mitgeführt (Einfachbestimmung). Die Anzahl
koloniebildender Einheiten wurde mikrobiologisch auf YGC-Agar überprüft (Ausplattieren der
letzten beiden Verdünnungsstufen). Nach vollständigem Absaugen der Flüssigkeit wurden
die Filter in vorbereitete StarPrepTwo-Reaktionsgefäße überführt und dem Protokoll unter
Kapitel 2.21.2 folgend bearbeitet. Der Mastermix wurde in lyophilisierter Form verwendet,
wodurch sich das Probevolumen für die PCR auf 25 µl erhöhte. Die PCR wurde auf dem
Stratagene Mx3005p durchgeführt.
Abbildung 18: Wiederfindungsrate von A. brasiliensis-Sporen nach Filtration Dargestellt sind die Amplifikationskurven der mittels Filtration und mechanisch-thermischer Lyse aufbereiteten
Duplex-Proben einer A. brasiliensis-Sporensuspension in jeweils 100 ml WSH. Dotierungslevel: Blau: 1,5x105
KBE; Gelb: 1,5x104 KBE; Orange: 1,5x10
3 KBE; Hellblau: 1,5x10
2 KBE; Rot: 1,5x10
1 KBE; Grün: PCR-NTCs
und WSH. Es wurden alle Dotierungen eindeutig nachgewiesen, während die entsprechenden Negativkontrollen kein Signal im FAM-Kanal ausgaben. Die Kurven wiesen einen gleichbleibenden Abstand zueinander auf, so dass der Verdünnungsfaktor gut erkennbar ist. Ein Filter der Probe mit 1x103 KBE wurde durch eine ungenügend
gesäuberte Flasche kontaminiert, wodurch eine frühzeitige Amplifikation zustande kam. Die Cp-Werte sind der nachstehenden Tabelle 22 zu entnehmen.
Bei der Betrachtung der Amplifikationskurven ist ersichtlich, dass alle Dotierungsstufen
nachgewiesen werden konnten (siehe Abbildung 18). Zudem sind alle mitgeführten
Negativkontrollen eindeutig negativ, so dass Kontaminationen der Reagenzien
ausgeschlossen werden konnten. Die zusammengehörigen Proben – als Duplikate
aufgetragen - verliefen beinahe kongruent zueinander, so dass die Reproduzierbarkeit des
Assays gegeben ist. Eine Ausnahme stellte hierbei eine Probe des Dotierungslevels von
Zyklen 6 12 18 32 38 44
44
Flu
ore
szen
z (
dR
)
1000
6000
3 ERGEBNISSE
53
1x103 KBE dar: aufgrund einer unzureichend gesäuberten Flasche wurde diese kontaminiert,
woraus ein verfrühtes Signal (Cp 25,56 zu 28,76) resultierte. Dies ergab bei der statistischen
Auswertung eine hohe Standardabweichung von σ = 1,6. Die weiteren dekadischen
Verdünnungsstufen wiesen einen gleichmäßigen Abstand von 2,9 bis 3,8 Zyklen auf.
Tabelle 22: FAM-Cp-Werte zur Bestimmung der Wiederfindungsrate von Aspergillus-Sporen nach Filtration
Dotierungslevel (KBE/100 ml): Mikrobiologie
Detektion FAM
Dotierungslevel (KBE/25 µl):
Mikrobiologie
Dotierungslevel (GÄ/25 µl):
PCR-Quantifizierung
1,5x105 Cp 22,22/22,04 6,90E3 GÄ 1,89E3/2,98E3
x̅ (Cp) 22,13
x̅ (GÄ) 2,43E3
σ (Cp) 0,09
σ (GÄ) 5,5E2
1,5x104 Cp 24,68/24,93 6,90E2 GÄ 5,70E2/4,70E2
x̅ (Cp) 24,805
x̅ (GÄ) 5,20E2
σ (Cp) 0,125
σ (GÄ) 5,0E1
1,5x103 Cp 25,56/28,76 6,90E1 GÄ 2,00E2/5,00E1
x̅ (Cp) 27,16
x̅ (GÄ) 1,25E2
σ (Cp) 1,6
σ (GÄ) 7,5E1
1,5x102 Cp 32,20/32,03 6,90E0 GÄ 7,52E0/8,85E0
x̅ (Cp) 32,115
x̅ (GÄ) 8,185E0
σ (Cp) 0,085
σ (GÄ) 6,65E-01
1,5x101 Cp 36,07/35,21 6,90E-1 GÄ 3,00E-1/1,11E0
x̅ (Cp) 35,64
x̅ (GÄ) 7,05E-1
σ (Cp) 0,43
σ (GÄ) 4,0E-1
undotiert Cp - - - GÄ - -
Eine dekadische Verdünnungsreihe mit Aspergillus-Sporen (1,5x105 – 1,5x10
1, undotiert), deren KBE-Zahl zu
Beginn des Experimentes mikrobiologisch bestimmt wurde, wurde in WSH angesetzt und als Duplikate jeweils durch einen PS-Filter mit 0,2 µm Porengröße filtriert. Der Filter wurde anschließend in das StarPrepTwo-Reaktionsgefäß überführt. Nach der mechanisch-thermischen Behandlung wurden 25 µl des Lysats in der PCR untersucht. Dargestellt sind die Cp-Werte der Einzelreaktionen für jede Dotierungsstufe sowie der aus den Duplikaten erhaltene Cp-Mittelwert und die Standardabweichung. Des Weiteren sind die Dotierungslevel für 25 µl Probevolumen – berechnet aus der erneuten mikrobiologischen Kontrolle (Ausplattieren von 100µl Suspension) und über die PCR-Standardreihe – beider Methoden gegenübergestellt. Zudem sind für die Duplikate der mittlere GÄ-Gehalt und die Standardabweichung aufgeführt. Der Vergleich beider Methoden zeigt, dass KBE- und GÄ-
Gehalt zueinander in Beziehung stehen: mit Ausnahme der kontaminierten Probe (1x103 KBE/100ml) liegen die
Werte beider Berechnungen stets im selben Bereich. In 25 µl Sporensuspension befanden sich nach
mikrobiologischer Auswertung 6,9x102 KBE, die Auswertung über die Stratagene-Software ergab 5,2x10
2 GÄ. Für
die weiteren Verdünnungsstufen stimmen die Werte ebenfalls überein.
Mittels Korrelation der Cp-Werte der Dotierungsstufen mit einer Standardkurve (D. anomala,
DSM 70727) über den Modus der Multiple Experiment Analysis (Software MxPro) war eine
Quantifizierung möglich. Vergleichend sind in Tabelle 22 die KBE-Werte der
mikrobiologischen Auswertung (Umrechnung aus 100µl ausplattierter Suspension) und die
GÄ-Gehalte der quantitativen Bestimmung gegenübergestellt. Es wurden die DNA-Mengen
der Einzel- als auch der Duplexproben analysiert. Bei einem mikrobiologisch bestätigten
Dotierungslevel von 1,5x105 KBE entspräche dies bei einem PCR-Volumen von 25 µl etwa
6,9x103 KBE. Mittels softwarebasierter Quantifizierung ergab sich in diesem Fall ein DNA-
Gehalt von 1,89x103 bzw. 2,98x10
3 GÄ. Ein Zusammenhang zwischen eingesetzter KBE-
3 ERGEBNISSE
54
Zahl und errechneten Genomäquivalenten in der Reaktion ist somit erkennbar. Die Werte der
weiteren Verdünnungsstufen lagen ebenfalls beieinander: während laut mikrobiologischer
Kontrolle etwa 6,9x102 KBE in 25 µl Probe enthalten waren, ergab die Auswertung über die
Standardkurve einen mittleren DNA-Gehalt von 5,2x102 GÄ. Ebenso verhält es sich mit den
niedrigeren Dotierungsstufen (5,0x101, 8,1x10
0 und 7,05x10
-1 GÄ).
3.9.2 Probenaufarbeitung für nicht-filtrierbare Flüssigkeiten
3.9.2.1 Wiederfindungsrate in nicht-filtrierbaren Flüssigkeiten
3.9.2.1.1 Kohlensäurehaltige Flüssigkeiten
Aufgrund der Kohlensäure kann die Flüssigkeit mit dem gewählten System nicht mechanisch
abgesaugt werden. Ein Ausschlagen der Kohlensäure ist jedoch ein zusätzlicher
Arbeitsschritt, der die Gefahr der Kreuzkontaminationen durch nicht sterile Arbeitsmaterialien
etc. birgt. Zudem sollte das Verfahren die Bearbeitung des finalen Produktes ohne
zusätzliche Arbeitsschritte ermöglichen. Als Modellmatrix für kohlensäurehaltige
Flüssigkeiten wurde handelsübliche Cola herangezogen, welche mit einem Probevolumen
von 100 µl aufgearbeitet wurde. Neben der undotierten Kontrolle wurde je eine Probe mit
Saccharomyces cerevisiae (1x103 bzw. 1x10
2 KBE) artifiziell kontaminiert. Das
Dotierungslevel wurde per Oberflächenverfahren mikrobiologisch bestätigt. Da in
vorangegangenen Versuchen stets vollständige Inhibitionen der PCR-Reaktion auftraten
(nicht gezeigt), erkennbar am fehlenden IPC-Signal, wurde im vorliegenden Experiment eine
Anpassung des pH-Wertes auf pH 5 bzw. 7 sowie eine Verdünnung des Lysats getestet.
Das PCR-Probevolumen betrug 10 µl. Die Auswertung der PCR hat gezeigt, dass
unverdünnte Colalysate weder im FAM- noch im IPC-Kanal ein Signal ausgeben. Die PCR-
Reaktion ist trotz unterschiedlicher pH-Werte vollständig inhibiert (vgl. Tabelle 23). Ein
neutraler pH-Wert hat damit keinen positiven Einfluss auf die Reaktion.
Die 1:10-Verdünnung der Lysate in Wasser konnte Störstoffe beseitigen und eine Inhibition
verhindern (vgl. Abbildung 19). Beide Dotierungsstufen generierten ein FAM-Signal:
zwischen den beiden Dotierungsstufen ergab sich ein Abstand der Cp-Werte von 3,68 (pH 5)
bzw. 3,79 (pH 7) Zyklen. Trotz unterschiedlicher pH-Werte stimmten die Cp-Werte eines
Dotierungslevels überein. Das Gesamtvolumen der Präparation betrug 640 µl. Unter
Berücksichtigung des PCR-Volumens und des Verdünnungsfaktors waren demnach 2,5
bzw. 0,25 GÄ in einer Reaktion vorhanden. Die erhaltenen Cp-Werte von 31,63/32,02 bzw.
35,21/35,81 spiegelten unter Berücksichtigung der Werte zur Sensitivitätstestung (vgl.
Kapitel 3.7) den Kontaminationsgrad wider. Verdünnte, aber undotierte Matrixkontrollen
sowie PCR-Negativkontrollen zeigten wie erwartet nur im IPC-Kanal eine erfolgreiche PCR-
Reaktion an.
3 ERGEBNISSE
55
Abbildung 19: Amplifikationskurven von 1:10-verdünnten Colaproben Dargestellt sind die Amplifikationskurven dotierter (S. cerevisiae) und undotierter Colaproben, welche verdünnt in die PCR eingesetzt wurden. Der pH-Wert der Ausgangsprobe wurde auf pH 5 bzw. pH 7 erhöht. Das Probevolumen betrug 10 µl. Proben: Dunkelblau: 1,6x10
3 KBE, pH 5; Orange: 1,6x10
2 KBE, pH 5; Blau: 1,6x10
3
KBE, pH 7; Rot: 1,6x102 KBE, pH 7; Hellgrün: undotiert, pH 5 und pH 7; Grün: PCR-NTCs. Trotz verschiedener
pH-Werte verliefen die identisch dotierten Proben gleich. Undotierte Matrix sowie PCR-Negativkontrollen zeigten keine Kontamination an.
Tabelle 23: Gegenüberstellung der erhaltenen Cp-Werte für (un)-verdünnte Colaproben
pH Dotierungslevel
(KBE/100µl) Unverdünnte Probe (Cp) 1:10-verdünnte Probe (Cp)
FAM HEX FAM HEX
5 1,6x103 - - 31,63 31,91
7 1,6x103 - - 32,02 32,13
5 1,6x102 - - 35,21 32,02
7 1,6x102 - - 35,81 31,12
5 undotiert - - - 32,22
7 undotiert - - - 32,04
NTC undotiert - 32,30 - 32,48
NTC undotiert - 32,30 - 32,09
Aufgeführt sind die Cp-Werte (FAM/HEX) für beide Dotierungsstufen (1,6x103 bzw. 1,6x10
2 KBE/100µl) mit den
jeweils eingestellten pH-Werten (5 bzw. 7). Die Lysate wurden sowohl als Original-DNA sowie 1:10 verdünnt in die PCR eingesetzt. Zusätzlich wurden undotierte Matrixproben und NTCs untersucht. Keines der Originallysate lieferte ein Signal im FAM- oder HEX-Kanal. Das IPC-Signal der No Template Control bestätigte allerdings die Funktionalität des PCR-Reaktionsmixes. Erst mit der Verdünnung der Lysate wurden dotierte Proben im FAM-Kanal detektiert. Zudem konnte in allen Proben die IPC amplifiziert und detektiert werden. Die Cp-Werte einer Dotierungsstufe waren trotz unterschiedlicher pH-Werte identisch. Der pH hat somit keinen Einfluss auf die Sensitivität des Assays. Die Wiederfindungsrate liegt für kohlensäurehaltige Getränke umgerechnet bei 0,25GÄ.
Zyklen 6 12 18 32 38 44
44
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ore
szen
z (
dR
)
0
1500
0
3 ERGEBNISSE
56
3.9.2.1.2 Einsatzstoffe und Halbware
Für die Untersuchung nicht-filtrierbarer Flüssigkeiten, die als Grundstoffe zur Produktion von
Limonaden, Säften oder Brausen eingesetzt werden, wurde zunächst eine Anreicherung der
Probe in SSL-Medium im Verhältnis 1 zu 10 vorgenommen. SSL-Medium wird in der
Industrie bei Durchführung des SSL-Verfahrens als Standardmedium verwendet. Als
Matrices konnte auf reale Brauereiproben zurückgegriffen werden. Neben sehr dunklen
Matrices wie Cola-, Apfelgrundstoff und Malz-Mischungen war auch hochviskoser
Invertzucker verfügbar. Alle Probemuster wurden stets auf ihre Kontaminationsfreiheit hin
getestet. Die 7 Matrices wurden über einen Zeitraum von 48 h bei 30°C bebrütet. Dabei
wurden sowohl undotierte als auch grenzwertig mit Saccharomyces cerevisiae dotierte
Ansätze (0 bis 10 KBE) mitgeführt. Nach 24 und 48 h erfolgte die Probenahme (Duplikate).
Undotierte, inkubierte Proben wurden zudem mit 1x104 KBE S. cerevisiae artifiziell
kontaminiert, um Aussagen zur Wiederfindungsrate nach der Aufarbeitung treffen zu können.
Mikrobiologische Kontrollen der Ansätze wurden sowohl als Gusskultur in OFS-Agar als
auch mittels Oberflächenverfahren analysiert.
Eine Gegenüberstellung der mikro- und molekularbiologischen Analyse kann der Tabelle 24
entnommen werden. Die mittels PCR erhaltenen Resultate beider Entnahmezeitpunkte sind
ausführlich in Tabelle 25 zusammengefasst. Zunächst wurde festgestellt, dass alle Matrices
kontaminationsfrei waren. Weder bei der mikrobiologischen noch der PCR-analytischen
Kontrolle wurden Kolonien bzw. Signale im FAM-Kanal detektiert. Die grenzwertige
Dotierung mit Saccharomyces cerevisiae zeigte nach Beurteilung der YM-Agarplatten
lediglich 0 - 2 KBE an, so dass präsumtiv nicht alle Proben erfolgreich beimpft wurden. Nach
Auswertung der Resultate beider Methoden hat sich diese Annahme bestätigt: lediglich zwei
von sieben Matrices (Apfelgrundstoff, Malz-Rhabarber-Mischung) wurden mit der Hefe
versetzt. In beiden Fällen konnte diese Kontamination bereits nach 24 h Anreicherungsdauer
bestätigt werden, wobei wiederum dekadisch verdünnte Lysate in die PCR eingesetzt
werden mussten, da sonst eine vollständige Inhibition der Reaktion beobachtet wurde. Die
Betrachtung und Beurteilung der Agarplatten konnte nach weiteren 24 Stunden
vorgenommen werden. Eine Auszählung der Einzelkolonien gestaltete sich aufgrund der
enormen Anzahl derer schwierig: die Analyse der OFS-Platten war nicht realisierbar, auf YM-
Platten wuchsen etwa 300 bzw. 500 Kolonien.
Die weitergehende Anreicherung ermöglichte schließlich die Detektion des Hefebefalls im
unverdünnten Lysat des Apfelgrundstoffs. Allerdings wurde ein Cp-Wert generiert, der weit
hinter dem des verdünnten Lysats lag, so dass hier eine Inhibition der PCR-Reaktion
vorliegen musste. Unterstützt wird diese Vermutung durch ein ausbleibendes IPC-Signal. In
der Malz-Rhabarber-Mischung konnte die Hefe erneut nur im verdünnten Lysat
nachgewiesen werden.
3 ERGEBNISSE
57
Tabelle 24: Gegenüberstellung der Resultate der mikro- und molekularbiologischen Analyse
Matrix Dotierung 24h Anreicherung 48h Anreicherung
PCR OFS YM PCR OFS YGC
Colagrundstoff - - 0 0 - 0 0
Zitronenaroma - - 0 0 - 0 0
Vitaminmischung - - 0 0 - 0 0
Apfelgrundstoff - - 0 0 - 0 0
Malz-Rhabarber - - 0 0 - 0 0
Malz-Zitrone-Limette - - 0 0 - 0 0
Invertzucker - - 0 0 - 0 0
Colagrundstoff + - 0 0 - 0 0
Zitronenaroma + - 0 0 + 0 0
Vitaminmischung + - 0 0 - 0 0
Apfelgrundstoff + + tntc ≈500 + tntc tntc
Malz-Rhabarber + + tntc ≈300 + tntc tntc
Malz-Zitrone-Limette + - 0 0 - 0 0
Invertzucker + - 0 0 - 0 0
Brauereigrundstoffe wurden auf ihre mikrobiologische Reinheit geprüft und anschließend mit S. cerevisiae beimpft, wobei das Dotierungslevel so niedrig gewählt wurde, dass präsumtiv nicht alle Proben erfolgreich mit der Hefe versetzt wurden. Alle Proben wurden mikrobiologisch (Oberflächenverfahren auf YM-Agar und Gusskultur in OFS-Agar) und molekularbiologisch (PCR) nach 24h und 48h Anreicherung in SSL-Medium untersucht. Die Grundstoffe waren mikrobiologisch rein – dies konnte sowohl in der PCR, als auch auf den Agarplatten bestätigt werden. Nur zwei der Matrices konnten mit der Hefe beimpft werden. In beiden Fällen war der Befall bereits nach 24h mit allen Nachweismethoden erkennbar. Mit den mikrobiologischen Verfahren war eine quantitative Aussage über den Befall allerdings aufgrund der hohen Koloniezahl (totally not to count, Abkz. tntc) und dem Wachstum in
den OFS-Agar erschwert.
Tabelle 25: PCR-Analyse nach Anreicherung in SSL bei grenzwertiger Dotierung
Unverdünnte Proben 1:10-verdünnte Proben
FAM (24h)
FAM (48h)
HEX (24h)
HEX (48h)
FAM (24h)
FAM (48h)
HEX (24h)
HEX (48h)
Colagrundstoff -/- -/- -/- -/- -/- -/- 32,64
32,18
32,80
32,90
Zitronenaroma -/- -/- 30,03
30,59
31,74
31,40 -/-
41,06
-
32,32
33,02
32,05
32,02
Vitaminmischung -/- -/- 38,57
34,43
35,74
- -/- -/-
32,99
32,70
31,97
32,49
Apfelgrundstoff -/- 28,61
28,42 -/- -/-
32,14
31,61
19,93
19,45
32,19
31,74
-
32,97
Malz-Rhabarber-Mischung
-/- -/- -/- -/- 36,05
35,52
26,73
27,11
32,03
31,94
32,22
31,65
Malz-Zitronen-Limetten-Mischung
-/- -/- -/- -/- -/- -/- 32,80
32,45
32,14
32,02
Invertzucker -/- -/- 34,43
-
32,23
32,18 -/- -/-
32,75
32,90
32,14
32,41
Aufgeführt sind die Ergebnisse aus der PCR-Analyse (FAM/HEX) der grenzwertig dotierten und in SSL-Medium verdünnten Brauereigrundstoffe. Die Probenahmen erfolgten nach 24 und 48h jeweils in Duplikaten. Die Proben wurden original und 1:10 verdünnt untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass auch hier die unverdünnten, dunklen Matrices verstärkt zu einer Inhibition der PCR-Reaktion führten: so konnten weder beim Colagrundstoff noch bei den Malzmischungen IPC-Signale detektiert werden. Dies wurde erst durch eine Verdünnung des Lysats möglich. Die grenzwertige Dotierung war im Apfelgrundstoff und der Malz-Rhabarber-Mischung erfolgreich und konnte bereits nach 24h, jedoch nur im verdünnten Lysat, nachgewiesen werden.
3 ERGEBNISSE
58
Zusätzlich wurde ein Signal im FAM-Kanal beim verdünnten Zitronenaroma gemessen,
deren Amplifikationskurve jedoch keinen typisch sigmoiden Verlauf nahm. Zudem wurde kein
Wachstum auf oder in den Agarplatten festgestellt. Eine Kontamination oder erfolgreiche
Dotierung war somit ausgeschlossen. Es handelte sich somit um ein falschpositives Signal.
Inkubierte, undotierte Einsatzstoffe wurden nach 24 bzw. 48 Stunden mit 1x104 KBE
Saccharomyces cerevisiae versetzt und aufgearbeitet, um Aussagen zur Wiederfindungsrate
in schwierigen Matrices zu erhalten. Die Lysate wurden wiederum unverändert als auch
verdünnt in die PCR eingesetzt. Alle erhaltenen Daten sind in Tabelle 26 aufgelistet.
Sehr dunkle Proben wie Cola- und Apfelgrundstoff, aber auch Malz-Zitrone-Limetten- und
Malz-Rhabarber-Mischung ließen als unverdünntes Lysat keine Amplifikation in der PCR zu,
so dass weder ein pilzspezifisches noch ein IPC-Signal erzeugt werden konnte bzw. das
IPC-Signal sehr stark verzögert detektiert wurde. Eine Erkennung des Hefebefalls fand bei
den Vitaminmischungsproben zwar statt, aber hier waren sowohl FAM- als auch HEX-
Signale verspätet, was ebenfalls eine Inhibition vermuten ließ. Dagegen konnte sowohl im
Invertzucker als auch Zitronenaroma, beides viskose, aber klare Produkte, die Kontamination
zweifelsfrei festgestellt werden. Insgesamt wurde demnach in 16 von 28 Proben Hefe-DNA
nachgewiesen, so dass die Wiederfindungsrate 42,9% betrug. Verdünnte man die Lysate
allerdings in NTC-Wasser, so konnte der Nachweis zu 100% erfolgen. Die Cp-Werte
variieren, allerdings wird bei Einsatzstoffen zunehmend auf mikrobiologische Abwesenheit
getestet, weshalb eine quantitative Aussage nicht zwingend notwendig ist.
Tabelle 26: Cp-Werte zur Bestimmung der Wiederfindungsrate in nicht-filtrierbaren Proben
Unverdünnte Proben 1:10-verdünnte Proben
FAM (24h)
FAM (48h)
HEX (24h)
HEX (48h)
FAM (24h)
FAM (48h)
HEX (24h)
HEX (48h)
Colagrundstoff -/- -/- -
32,12 -/-
34,93
36,28
34,15
32,65
33,01
32,68
32,38
32,57
Zitronenaroma 26,14
26,23
26,57
25,26
33,25
32,84
36,94
30,89
29,05
29,57
28,59
29,35
31,52
31,98
32,62
32,75
Vitaminmischung 32,55
37,04
37,86
39,05
34,00
41,21 -/-
29,40
27,87
28,93
29,35
31,90
31,53
31,91
31,98
Apfelgrundstoff -/- -/- -/- -/- 28,92
29,34
30,02
29,81
32,24
32,69
33,12
32,30
Malz-Rhabarber-Mischung
-/- -/- -/- 38,34
-
32,70
33,79
31,46
31,84
32,99
32,30
33,27
32,46
Malz-Zitronen-Limetten-Mischung
-/- -/- -/- 41,03
-
31,39
31,72
29,99
30,38
31,97
32,28
33,21
32,81
Invertzucker 27,26
27,95
26,25
27,29
32,82
32,01
36,63
35,38
28,79
29,09
28,69
29,33
31,85
31,82
32,01
32,93
Undotierte, aber vorinkubierte Brauereigrundstoffe (1:10 in SSL-Medium) wurden in Duplikaten nach 24 und 48h
mit 1x104 KBE Saccharomyces cerevisiae je StarPrepTwo-Reaktionsgefäß versetzt und aufgearbeitet. In
Zitronenaroma und Invertzucker wurden die Hefen in unverdünnten Proben zu beiden Untersuchungszeitpunkten mit gleichen Cp-Werten eindeutig detektiert. Die Inhaltsstoffe der Vitaminmischung inhibierten die PCR-Reaktion, so dass hier sowohl im FAM- als auch HEX-Kanal verspätete Signale gemessen wurden. In verdünnten Lysaten wurde in allen Fällen der Hefebefall erkannt, obwohl dunkle Matrices eine Verzögerung des Cp-Wertes hervorriefen (Cola, Malzmischungen). Das IPC-Signal ist bei verdünnten Lysaten stets amplifiziert worden.
3 ERGEBNISSE
59
3.9.2.2 Anreicherungs- und Detektionsdauer verschiedener Keime
Für jeden Mikroorganismus existieren Optima in Hinblick auf ex- und intrinsischen Faktoren
der Anreicherung. Bei der Prüfung eines Lebensmittels können jedoch nicht alle Parameter
berücksichtigt werden, so dass eine Methode gewählt werden muss, die für eine große
Bandbreite an Erreger geeignet ist. Bei der Kontrolle von alkoholfreien Getränken und ihren
Einsatzstoffen spielen vor allem Hefen eine bedeutende Rolle. Daher wurden die gewählten
Anreicherungsbedingungen mit 4 Hefen als Modellorganismen durchgeführt. Die Matrices
(Bananennektar, Schwarze-Johannisbeere-Fruchtkonzentrat, Multivitamin-Fruchtkonzentrat)
wurden pro Keim mit 2 verschiedenen Dotierungsleveln beimpft. Zudem wurden stets eine
undotierte Kontrolle sowie mikrobiologische Kontrollen auf YM-Agar mitgeführt. Nach 24 und
48 Stunden wurden aus den bei 27-30°C inkubierten und in SSL-Medium (1:10-Verhältnis)
angereicherten Säften bzw. Fruchtkonzentraten Proben entnommen. Die
mechanisch/thermische Aufarbeitung inklusive Lebend/Tot-Differenzierung erfolgte nach den
Vorgaben in Kapitel 2.22.2. Lysate der Matrices Schwarze Johannisbeere und Multivitamin
wurden vor der PCR-Analytik 1:10 verdünnt. Das Probevolumen betrug 10 µl.
Die ausführliche Auflistung der Resultate für PCR und Mikrobiologie (inkl. Cp-Werte und
KBE) ist im Anhang IX (Tabelle 49) hinterlegt. Von allen Matrices war die artifizielle
Kontamination bei den vier Spezies im Bananennektar als Erstes nachweisbar (Tabelle 27).
Trotz der geringen Dotierungen mit 1x100 bzw. 4x10
0 KBE S. cerevisiae war der Erreger in
beiden Fällen eindeutig nach 24h detektierbar. Gleiches gilt für die Dotierung in
Johannisbeerfruchtsaftkonzentrat, während nur eine (mit 4x100 KBE dotiert) von zwei
Anreicherungen im Multivitaminkonzentrat innerhalb dieses Zeitraums positiv getestet
werden konnte. Nach 48 Stunden Anreicherungsdauer wurde in den dotierten Proben der
Keim detektiert, wobei in der eben benannten Multivitaminprobe (mit 1x100 KBE dotiert) nur
ein „uncertain“ Signal erkannt wurde. Da die mikrobiologische Kontrolle keine Kolonien auf
dem YM-Nährboden anzeigt, ist eindeutig, dass in diese Probe keine Hefe eingebracht
wurde. Die KBE der weiteren dotierten Proben waren bereits nach 24h aufgrund der hohen
Zellzahlen nicht mehr auswertbar.
Die Dotierungslevel der Erreger Candida parapsilosis und Yarrowia lipolytica lagen im
Bereich von 101 bis 10
2 KBE. Yarrowia wurde mit beiden Dotierungsleveln bereits nach 24h
Anreicherung sowohl in der PCR (Cp 37,43/35,87) und auf dem Agar (59/252 KBE) im
Johannisbeerfruchtsaftkonzentrat nachgewiesen, während die Candida-Hefe trotz hoher
KBE-Zahl (250 KBE/tntc) erst nach 48 h eindeutig identifiziert werden konnte
(Cp 31,51/29,81). Dagegen konnte Candida wiederum in beiden Multivitaminanreicherungen
nach der ersten Probennahme erkannt werden. Die mikrobiologische Analyse ergab
504 KBE bei geringster Dotierungsstufe; in der PCR betrugen die Cp-Werte 36,93 und 36,38.
3 ERGEBNISSE
60
Zygosaccharomyces bailii war in diesem Anreicherungsversuch die am langsamsten
wachsende Hefe: in keiner der Matrices konnte mittels PCR ein Nachweis nach 24h erzielt
werden. Die mikrobiologische Kontrolle konnte bei allen Matrices nach 24h jeweils nur bei
der höher dotierten Probe den Hefebefall aufzeigen. Erst nach 2 Tagen konnte die PCR in
lediglich zwei von sechs dotierten Proben der Keim bestätigen, während auf dem Agar
infolge der hohen Koloniezahlen keine quantitative Analyse mehr möglich war. Allerdings
waren auch die Bebrütung und Auswertung der Nährplatten sehr zeitintensiv (bis zu 1
Woche).
Tabelle 27: Gegenüberstellung der Resultate zur Detektionszeit verschiedener Hefespezies nach Anreicherung in Fruchtkonzentraten/Nektar
Spezies Dotierungs-
level (KBE/100ml)
Nach 24h Anreicherung Nach 48h Anreicherung
Bananen-
nektar
Johannis-
beere (1:10)
Multivitamin (1:10)
Bananen-
nektar
Johannis-
beere (1:10)
Multivitamin (1:10)
PCR YM PCR YM PCR YM PCR YM PCR YM PCR YM
Z. bailii
4x100 - - - - - - - + - + - +
4,8x101 - + - + - + + + - + + +
undotiert - - - - - - - - - - - -
Y. lipolytica
1,6x101 + + + + - - + + + + + +
1,53x102 + + + + + + + + + + + +
Undotiert - - - - - - - - - - - -
C. parapsilosis
6,8x101 + + - + + + + + + + + +
7x102 + + - + + + + + + + + +
Undotiert - - - - - - - - - - - -
S. cerevisiae
1x100 + + + + - - + + + + - -
4x100 + + + + + + + + + + + +
Undotiert - - - - - - - - - - - -
Vier Hefespezies wurden in 3 Matrices (Bananennektar, Johannisbeer- und Multivitaminfruchtsaftkonzentrat; jeweils 1:10 in SSL) über einen Zeitraum von 48h bei 30°C inkubiert und nach 24h und 48h Proben entnommen, welche mit StarPrepTwo aufgearbeitet wurden. Zudem wurden undotierte Matrixkontrollen mitgeführt. Die
Dotierungslevel lagen im Bereich von 1x100 bis 7x10
2 KBE/100ml. Trotz des geringen Dotierungslevels war
Saccharomyces cerevisiae in 5 von 6 Proben bereits nach 24h in der PCR nachweisbar. Sehr spät war die Hefe Zygosaccharomyces bailii detektierbar: sie wurde selbst nach 48h Inkubationszeit in nur zwei von 6 Proben erkannt. Es zeigen sich bei Z. bailii Unterschiede zwischen den Resultaten aus PCR-Analytik und Mikrobiologie
(rot hinterlegt).
3.9.2.3 Sensitivität bei hoher Begleitflora
Lebensmittel bieten ein geeignetes Milieu für unterschiedliche Mikroorganismen, so dass der
Assay auch in Anwesenheit von Fremdkeimen reproduzierbare Resultate liefern muss. Zu
diesem Zweck wurde das Standardprotokoll zum qualitativen Nachweis in drei
Getränkematrices in Anwesenheit von 8x107 KBE E.coli (BCD 4692) angewandt. In jeweils 2
Proben jeder Matrix war zudem die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae (1x103 KBE)
3 ERGEBNISSE
61
enthalten. Proben, die aus Johannisbeer- und Multivitaminfruchtsaftkonzentrat gewonnen
wurden, wurden erneut vor der PCR 1:10 verdünnt. Das Probevolumen betrug 25 µl.
Bei der Betrachtung der Amplifikationssignale war erkennbar, dass alle mit Hefe dotierten
Proben ein Signal im FAM-Kanal ausgaben. Das nur mit E.coli dotierte
Multivitaminkonzentrat zeigte einen unerwarteten Cp-Wert im FAM-Kanal, wobei dieses
Resultat nach Beurteilung der Amplifikationskurve vernachlässigt werden konnte, da die
Kurve (siehe Abbildung 20, orange Kurve) keinen Anstieg zeigt und deutlich unterhalb der
Negativkontrolle verläuft. Proben ohne Hefe-DNA zeigten zudem im HEX-Kanal eine
korrekte Amplifikation der IPC an. Die Hefe konnte demnach in Anwesenheit hoher
Begleitflora nachgewiesen werden (vgl. Abbildung 20 und Tabelle 28), wobei der Cp-Wert –
unter Berücksichtigung der bisherigen Resultate zur LOD/LOQ-Bestimmung (vgl. Kapitel 3.7)
sowie der Wiederfindungsrate (vgl. Kapitel 3.9.2.1) - infolge störender Matrix und der
Begleitflora verzögert ist. Innerhalb der untersuchten Matrices dieses Versuches sind die
Resultate zwar homogen – so sind die Cp-Werte unter Einbeziehung der
Verdünnungsfaktoren (1:10 in PCR für Konzentrate) identisch (Nektar: 32,15/32,78;
Fruchtsaftkonzentrate: 35,87/35,49/35,70/35,25) – im Vergleich zu den
Sensitivitätsbestimmungen aber um eine Log-Stufe verspätet. Eine quantitative Aussage
wird damit erschwert; eine qualitative Aussage ist möglich.
Abbildung 20: Detektion von 1x103 KBE S. cerevisiae mit Begleitflora (E. coli)
Zur vereinfachten Darstellung ist jeweils nur eine mit S. cerevisiae und E. coli dotierte Probe je Matrix abgebildet: Blau: Bananennektar mit E. coli und S. cerevisiae; Schwarz: Bananennektar mit E. coli; Dunkelgrün: Johannisbeerfruchtsaftkonzentrat mit E. coli und S. cerevisiae (1:10); Grün: Johannisbeerfruchtsaftkonzentrat mit E. coli (1:10); Rot: Multivitaminfruchtsaftkonzentrat mit E. coli und S. cerevisiae (1:10); Orange: Multivitaminfruchtsaftkonzentrat mit E. coli (1:10); Gelb: PCR-NTC. In allen Matrices wurde die Hefe trotz der hohen E.coli-Konzentration nachgewiesen, während Proben ohne Hefe-DNA entsprechend negativ waren. Die
KBE-Zahlen wurden auf CASO- bzw. YM-Platten bestimmt.
Zyklen 5 15 25 35 45
Flu
ore
szen
z (
465-5
10n
m)
26,265
-3,735
3 ERGEBNISSE
62
Tabelle 28: Detektion von S. cerevisiae in Anwesenheit von Begleitflora (E.coli)
Matrix Dotierungslevel
(KBE/ml) Cp-Werte mit E. coli
FAM HEX
Bananennektar 1x10
4
32,15
32,78
31,72
31,76
undotiert - 32,10
Johannisbeer-fruchtsaftkonzentrat
1x104
35,87
35,49
31,82
31,94
undotiert - 31,87
Multivitamin-
fruchtsaftkonzentrat
1x104
35,70
35,25
32,07
32,10
undotiert 36,62 31,96
Drei Matrices (Bananennektar, Schwarze-Johannisbeere- und Multivitaminfruchtsaftkonzentrat) wurden 1:10 in
SSL-Medium verdünnt und mit 8x107 KBE E. coli versetzt. Zwei von drei Ansätzen wurden zusätzlich mit 1x10
4
KBE/ml S. cerevisiae dotiert (1x103 KBE im Aufarbeitungsgefäß). Die Proben wurden dem Standardprotokoll (inkl.
Lebend/Tot-Differenzierung) folgend aufgearbeitet. Alle mit Hefen versetzten Proben werden im FAM-Kanal eindeutig identifiziert, wobei die Cp-Werte im Vergleich zu Vorversuchen um etwa eine Log-Stufe verspätet auftraten. Undotierte Proben des Bananennektars und des Johannisbeerkonzentrats waren negativ. Die undotierte Probe des Multivitaminkonzentrats lieferte ein Signal.
3.10 Optimierung der Lebend/Tot-Differenzierung
Zur Visualisierung der Effekte, die bei der Behandlung mit einer interkalierenden Agenz zur
Differenzierung von lebenden und toten Zellen, auftraten, wurden zunächst Hefezellen –
später auch Schimmelpilzsporen – in SSL-Medium bei 80°C über einen Zeitraum von
mindestens 20 min inaktiviert. In regelmäßigen Abständen wurden dabei Proben entnommen
und der mechanisch/thermischen Aufarbeitung (inkl. Lebend/Tot-Differenzierung) zugeführt.
Als Ausgangswert wurden lebende Zellen zum Zeitpunkt t = 0 min verwendet.
Mikrobiologische Kontrollen auf YM-Platten wurden ebenfalls zu definierten Zeitpunkten
angelegt. Die Dunkelphase zur Anlagerung des Farbstoffs an die DNA war in den ersten
Versuchen auf 5 min festgelegt und damit identisch zur Belichtungsphase.
Im vorliegenden Experiment war zunächst festzustellen, ab welchem Zeitpunkt die Hefe
Saccharomyces cerevisiae bei einer thermischen Behandlung vollständig inaktiviert wird.
Dazu wurde der Keim über 40 min bei 80°C inkubiert und entsprechend mit Reagent-D-
Lösung versetzt. Je Aufarbeitung waren 1x103 KBE (in 100 µl) enthalten. Die Probenahme
(Duplikate) erfolgte nach 2, 5, 10, 15, 20 und 40 min, mikrobiologische Kontrollen wurden
zudem nach 5 und 15 min ausgestrichen.
In der PCR wurde wie erwartet für die lebenden Zellen (t = 0 min) ein Signal im FAM-Kanal
generiert, womit die Aktivität der Zellen bestätigt werden konnte (Abbildung 21). Nach einer
2minütigen Inkubationszeit bei 80°C konnten ebenfalls Hefezellen in der PCR nachgewiesen
werden, wobei der Cp-Wert (33,14/33,36) identisch zum Vorwert (33,21/32,78) war. Bereits
nach 5 Minuten wurde allerdings kein Signal mehr erhalten. Da im HEX-Kanal alle weiteren
Proben mit einer erfolgreichen Amplifikation der IPC die Funktionalität des Assays
3 ERGEBNISSE
63
bestätigten, konnte davon ausgegangen werden, dass alle Hefezellen bereits nach dieser
Zeit vollständig inaktiviert wurden. Diese Annahme ließ sich auch mit den mikrobiologischen
Kontrollen (t = 5 min / t = 15 min) untermauern, da auf den Nährböden kein
Koloniewachstum zu verzeichnen war. Es kann somit festgehalten werden, dass die DNA
inaktivierter Hefezellen mit der Reagent-D-Lösung bis unterhalb der Nachweisgrenze
gebunden und eine Amplifikation unterdrückt wurde.
Abbildung 21: Amplifikationskurven von S. cerevisiae nach Inaktivierung bei 80°C Es wurden vegetative Zellen der Hefe Saccharomyces cerevisiae in SSL-Medium bei 80°C inaktiviert. Der Ausgangswert mit t = 0 min (orange) wurde bestimmt und nach 2 (blau), 5 (grün), 10 (hellblau), 15 (rot), 20 (gelb) und 40 min (lila) Probematerial entnommen und nach Zugabe der Reagent-D-Lösung für 5 min im Dunkeln
gelagert. Bereits nach 5 min Inaktivierungszeit konnte keine Hefe-DNA mehr nachgewiesen werden
(LightCycler®480). Die DNA inaktivierter Zellen wurde gebunden.
Protokollen von Nocker und Agustí folgend wurde eine Verlängerung der Dunkelphase auf
10 min und die damit verbundenen Auswirkungen auf das Lebend-Zellsignal von vier
verschiedenen Spezies – 3 Hefen und 1 Schimmelpilz – untersucht (Nocker und Camper
2006; Agustí et al. 2013). Je Zellzustand (nach Kapitel 2.22.4) und Inkubationszeit wurde
jeweils eine Probe pro Spezies mitgeführt und dem Protokoll unter Kapitel 2.21.3
entsprechend aufgearbeitet. Zudem wurde eine nicht dotierte WSH-Kontrolle eingesetzt.
Angaben zu Zell- bzw. Sporenzahlen wurden jeweils mittels mikrobiologischer Kontrollen auf
YM-Platten erzielt. Das Probevolumen für die PCR-Analytik betrug 10 µl.
Saccharomyces cerevisiae wurde mit einer Zellzahl von 1,6x103 KBE je Probe eingebracht.
Die molekularbiologische Analyse hat gezeigt, dass die Amplifikationskurven der
Lebendzellen nach 5- und 10minütiger Dunkelphase ohne nennenswerte Unterschiede
verliefen. Dies bestätigten die Cp-Werte bei 29,06 für 5 min und 28,83 für 10 min
Inkubationszeit. Inaktivierte Hefezellen generierten ebenso wie die WSH-Kontrolle ein Signal
(siehe Abbildung 22), das allerdings mit der LightCycler®-Analysemethode des 2nd
Flu
ore
szen
z (
465-5
10n
m)
25,050
6,265
0,050
Zyklen 5 15 25 35 45
3 ERGEBNISSE
64
Derivative Max nicht zur Berechnung eines Cp-Wertes genügte (geringe Fluoreszenz, kein
Überschreiten des Hintergrundsignals). Die DNA abgestorbener Zellen konnte vollständig
geblockt werden.
Abbildung 22: S. cerevisiae und D. anomala (lebend und inaktiviert) mit differenten Dunkelphasen Dargestellt sind die Amplifikationskurven von lebenden bzw. inaktivierten Saccharomyces-cerevisiae- (A) bzw. Dekkera anomala-Zellen (B) in SSL-Medium, die für 5 bzw. 10 min im Dunkeln mit Reagent D inkubiert wurden. Proben: Hellbraun: 5 min, lebend; Braun: 10 min, lebend; Blau: 5 min, inaktiviert; Rot: 10 min, inaktiviert; Grün: WSH-Kontrolle; Gelb: PCR-NTC. Es ist in beiden Fällen keine Verschiebung des FAM-Signals der lebenden
Zellen bei längerer Dunkelphase zu beobachten gewesen. Proben mit inaktivierten Zellen lieferten keinen Cp-
Wert (LightCycler®480).
Dekkera-anomala-Zellen wurden mit einem Dotierungslevel von 2x103 KBE je Probe
untersucht. In der PCR-Analytik konnte gezeigt werden, dass sich die Ergebnisse für beide
Inkubationsbedingungen kaum unterschieden (siehe Abbildung 22). Der um einen Zyklus
frühere Cp-Wert der längeren Dunkelphase hängt mit dem insgesamt höheren
Fluoreszenzverlauf dieser Probe zusammen. Inaktivierte Hefezellen und die WSH-Kontrolle
zeigten hier ebenfalls eine beginnende Amplifikation an, bei der die gemessene Fluoreszenz
zwar die Hintergrundfluoreszenz überschreitet, aber der Anstieg so gering ist, dass die Probe
von der Software als negativ eingestuft wurde.
Die Resultate der Hefe Zygosaccharomyces bailii (Dotierungslevel 1x102 KBE je Probe) und
des Schimmelpilzes Aspergillus brasiliensis (Dotierungslevel 1x103 KBE je Probe)
bestätigten die bisherigen Ergebnisse: bei beiden Spezies war keine Verschlechterung der
Amplifikationskurve lebender Zellen bzw. Sporen bei längerer Inkubationszeit der Reagent-
D-Lösung erkennbar (vgl. Abbildung 23). Allerdings wurde in beiden Fällen nach einer
fünfminütigen Inkubation das Signal, das von inaktivierten Zellen bzw. Sporen ausging, nicht
vollständig unterdrückt. Dies wird erst nach 10 min Dunkelphase erreicht. Es kann somit
festgehalten werden, dass eine zehnminütige Inkubationszeit keine messbaren toxischen
Effekte auf lebende Zellen ausübte.
A B
Flu
ore
szen
z (
465
-510n
m)
-0,677
Zyklen 5 15 35 45
Flu
ore
szen
z (
465-5
10n
m)
21,323
0,155
18,155
Zyklen 5 15 35 45
3 ERGEBNISSE
65
Insbesondere Schimmelpilzsporen sind äußerst widerstandsfähige, hitzeresistente Hüllen,
die Heißsterilisationsprozesse überstehen können (Wareing und Davenport 2000). Im
Vorversuch, in dem die Inkubationszeit der Dunkelphase ausgetestet wurde, trat bei den
inaktivierten Aspergillus-Sporen ein nicht eindeutiges Resultat auf, welches mit einer
erweiterten Dunkelphase beseitigt werden könnte. Daher sollten die Sporen bei einer auf
20 min ausgedehnten Dunkelphase untersucht und die Inaktivierung bzw. Abtötung der
Sporen mikro- und molekularbiologisch dokumentiert werden. Hierfür wurde eine Aspergillus-
brasiliensis-Sporensuspension (DSM 1988) mit einer Konzentration von
1,4x104 Sporen/100 µl in YGC-Medium bei 80°C im Thermomixer inkubiert und nach 5, 10,
15, 20, 30, 40 und 60 min Proben entnommen. Als Referenzwert wurden nicht-
hitzebehandelte Sporen (t = 0 min) verwendet. Die Dunkelphase wurde für je eine Probe auf
20 min ausgedehnt und gegen eine 10minütige Inkubationsdauer getestet. Mikrobiologische
Kontrollen auf YGC-Platten wurden für jeden Zeitpunkt der Probenahme angelegt. Das
Probevolumen der PCR betrug 25 µl.
Bei der Betrachtung der Amplifikationskurven fiel zunächst eine stetige Verschiebung des Cp-
Wertes bei länger andauernder Inaktivierungszeit auf (siehe Abbildung 24). Ab einer
30minütigen, thermischen Behandlung traten die Signale der nachfolgenden Proben um den
Zyklus 32/33 auf. Eine vollständige Inhibierung des Signals inaktivierter Zellen war nicht zu
verzeichnen. Mitgeführte, undotierte Matrices (YGC-Medium und PCR-NTC) konnten eine
Kontamination ausschließen. Die Auswertung der mikrobiologischen Kontrollen ergab, dass
bereits nach 5 Minuten bei 80 °C kein Koloniewachstum mehr erkennbar war. Die Sporen
Abbildung 23: Z. bailii und A. brasiliensis (lebend und inaktiviert) mit differenten Dunkelphasen Dargestellt sind die Amplifikationskurven von lebenden bzw. inaktivierten Zygosaccharomyces-bailii-Zellen (A,
1x102 KBE) bzw. Aspergillus-brasiliensis-Sporen (B, 1x10
3 KBE) in SSL-Medium, die für 5 bzw. 10 min im
Dunkeln mit Reagent D inkubiert wurden. Proben: Hellbraun: 5 min, lebend; Braun: 10 min, lebend; Blau: 5 min, inaktiviert; Rot: 10 min, inaktiviert; Grün: WSH-Kontrolle; Gelb: PCR-NTC. Es ist bei beiden Pilzen keine
Verschiebung des FAM-Signals lebender Zellen bei längerer Dunkelphase zu beobachten gewesen. Inaktivierte Zellen, die nur 5 min inkubiert wurden, erzeugen eindeutige FAM-Cp-Werte (Z. bailii: 34,76, A. brasiliensis: 35,32). Nach einer zehnminütigen Dunkelphase werden keine Cp-Werte gemessen. Einzige Ausnahme ist die A. brasiliensis-Probe (rot, Cp 35,03), die von der LC-480-Software als Uncertain eingestuft wurde. Die Kurve
übersteigt zwar die Hintergrundfluoreszenz, verläuft aber parallel zur WSH-Kontrolle bei nur gering höheren Fluoreszenzwerten. Diese Probe kann daher als negativ angesehen werden.
3 ERGEBNISSE
66
sind zu diesem frühen Zeitpunkt durch die Hitzeeinwirkung geschwächt, so dass sie auf
optimalem Nährboden keine Regeneration erfahren.
Abbildung 24: Resultate der PCR-Analytik von A. brasiliensis-Sporen bei differenten Dunkelphasen Es wurden Sporen des Pilzes Aspergillus brasiliensis (1,4x10
4 Sporen/100µl) in YGC-Medium (grün) über einen
Zeitraum von 60 min bei 80°C inaktiviert. Zu Beginn (t = 0min, blau) wurde der Ausgangswert (Lebendwert) bestimmt und nach 5 (dunkelgrün), 10 (lila), 15 (cyan), 20 (hellblau), 30 (orange), 40 (türkis) und 60 min (rot)
jeweils Probematerial entnommen und zusammen mit der Reagent-D-Lösung für 10 bzw. 20 min im Dunkeln inkubiert. Es schloss sich die mechanisch-thermische Lyse an. Die Proben wurden mit dem Standardtemperaturprofil in der PCR (Stratagene Mx3005p) untersucht. Keine der inaktivierten Sporen konnte von der interkalierenden Agenz vollständig gebunden werden. Eine längere Dunkelphase hat somit keinerlei positiven Einfluss auf die Lebend/Tot-Differenzierung von Sporen.
Abbildung 25: Verschiebung der Detektionszeitpunkte (ΔCp) bei zunehmender
Inaktivierungszeit Dargestellt ist die mittlere Verzögerung des Positivsignals einer thermobehandelten Probe bei zunehmender Inkubationszeit in Bezug auf den Ausgangswert zum Zeitpunkt t = 0 min sowie der dazugehörigen Standardabweichung. Nach 30 min Hitzeeinwirkung war keine weitere Verschiebung des Cp-Wertes zu verzeichnen. Die verlängerte Dunkelphase lieferte exakt gleiche Resultate wie die 10minütige Dunkelphase.
-10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
5 10 15 20 30 40 60
ΔC
p
t in min
Δ Cp (t = 0 min)
Zyklen 6 12 18 32 38 44
44
Flu
ore
szen
z (
dR
)
3500
4000
0
3 ERGEBNISSE
67
In Abbildung 25 ist die Verzögerung der Detektionszeitpunkte als ΔCp in Bezug auf den
Referenzwert (Lebendwert, t = 0 min) bestimmt. Bereits zum ersten Entnahmezeitpunkt
verschiebt sich der Cp-Wert um 1,5 Zyklen im Vergleich zum Vorwert. Nach 10 minütiger
Inaktivierungszeit verschob sich das Signal um mehr als vier Zyklen. Eine thermische
Behandlung für 15 min verzögert die Detektion um 8 Zyklen. Die nachfolgenden
Probenahmen zeigten in der PCR eine Verschiebung des Detektionszeitpunktes um 9 Zyklen
im Vergleich zum Lebendwert. Korreliert man diesen Versuch mit einer Standardkurve
(Software MxPro: Multiple Experiment Analysis) und deren Anstieg, kann unter
Berücksichtigung der PCR-Effizienz berechnet werden, wie viel Prozent der Ausgangsmenge
nach Erreichen eines bestimmten Cp-Wertes in der Reaktion verblieben sind. Die PCR-
Effizienz ergibt sich aus der Gleichung:
𝐸 = 10−1
𝑚 − 1 = 10−1
3,269 − 1 = 102,25% Gleichung 3
Bei einer Effizienz von 100% (=2) wird eine Verdopplung des Produkts erreicht (Mülhardt
2009). Hier liegt die PCR-Effizienz knapp oberhalb von 100%, so dass pro Zyklus das
Produkt um das 2,04fache vermehrt wird. Es soll der verbliebene DNA-Gehalt zum Zeitpunkt
t = 60 min (Cp2) in Bezug auf den Ausgangswert t = 0 min (Cp1) ermittelt werden. Daher
werden die dazugehörigen Cp-Werte in die nachstehende Gleichung eingebracht:
𝑛 % =100%
2,04 𝐶𝑝 2−𝐶𝑝 1 =100%
2,04(33,25−24,36) =100%
2,048,89 = 0,177% Gleichung 4
Demnach verbleiben in der Reaktion 0,177% der ursprünglichen DNA-Menge. Die Dotierung
erfolgte mit 1,4x104 KBE in 640µl Präparationsvolumen und 25µl PCR-Volumen. In der PCR-
Reaktion (t = 0 min) lagen somit etwa 546 GÄ vor. Nach der Hitzebehandlung werden die
verbliebenen 0,177% (≈ 0,97 GÄ) eindeutig nachgewiesen. Eine vollständige Inaktivierung
der Sporen ist nicht erzielt worden. Eine weitere Verlängerung der Dunkelphase auf 20 min
konnte keine weiteren positiven Effekte erzielen. Daher wurde die 10minütige Inkubationszeit
belassen.
Die Lebend/Tot-Differenzierung sollte in Anwesenheit eines Überschusses an inaktivierten
Zellen geprüft werden. Dafür wurden Hefezellen von Saccharomyces cerevisiae
(1x105 KBE/ml) nach bekanntem Protokoll (siehe Kapitel 2.22.4) behandelt. Als Referenz
wurden nicht-inaktivierte Zellen (100% lebend) mitgeführt. Eine Mischung aus lebenden
(10%) und inaktivierten Zellen (90%) wurden ebenso wie die Referenzprobe und einer
Probe, die nur aus inaktivierten Zellen bestand (0% lebend), nach Zugabe der Reagent-D-
3 ERGEBNISSE
68
Lösung und 10minütiger Dunkelphase belichtet und anschließend lysiert. In die PCR-
Reaktion wurden jeweils 10 µl der Lysate eingesetzt (siehe Abbildung 26).
Abbildung 26: Saccharomyces cerevisiae in verschiedenen Zellzuständen Abgebildet sind die Amplifikationskurven von Saccharomyces cerevisiae nach der Lebend/Tot-Differenzierung mit 10minütiger Dunkelphase und mechanisch/thermischer Lyse. Proben: Rot: 100% lebende Zellen, Blau: 10% Lebende mit 90% inaktivierten Zellen, Grün: 100% inaktivierte Zellen. Es ist gezeigt, dass ein Überschuss an
inaktivierten Zellen eine genaue Amplifikation des Lebend-Anteils ermöglicht.
Die Amplifikation der DNA, die nur aus lebenden Zellen stammte, zeigte den gewohnten,
sigmoiden Verlauf und überschritt die Hintergrundfluoreszenz bei Zyklus 29,88. In der Probe
mit inaktivierten Zellen (0% lebend) wurde keine Amplifikation vorgenommen. Da die IPC-
Kontrolle detektiert wurde, konnte die vollständige Blockierung fungoider DNA bestätigt und
eine Inhibition der Reaktion ausgeschlossen werden. Lag DNA aus inaktivierten Zellen im
Überschuss vor, konnte die DNA aus lebenden Zellen ohne Sensitivitätsverlust
nachgewiesen werden, wobei der auftretende Cp-Shift von 3,72 Zyklen der Verringerung des
DNA-Gehaltes um eine Zehnerpotenz widerspiegelte.
Abschließend sollte die Effektivität der Lebend/Tot-Differenzierung in einer Getränkematrix
untersucht werden. Dazu wurde handelsüblicher Bananensaft 1:10 in YM-Medium verdünnt
und mit lebenden bzw. inaktivierten Zellen der Hefe Saccharomyces cerevisiae (2x104 KBE)
versetzt. Als Referenzwert wurde zudem Saft ohne Zellzusatz mitgeführt. Für jede Probe
wurde der Vergleich der direkten Lyse und der Lyse mit vorgeschalteter Lebend/Tot-
Differenzierung (5 min Dunkelphase) erstellt. Lysate wurden mit einem Volumen von 10 µl in
die PCR eingesetzt.
Zyklen 5 15 35 45
Flu
ore
szen
z (
465-5
10n
m)
0,383
25,383
3 ERGEBNISSE
69
In Abbildung 27 sind die zugehörigen Amplifikationskurven beider Extraktionen dargestellt:
der Detektionszeitpunkt der Extrakte mit lebenden Zellen war in beiden Ansätzen identisch.
Eine Amplifikation der DNA aus inaktivierten Zellen ist nur in der Probe ohne Reagent-D-
Zugabe erkennbar. Sofern die Agenz zugesetzt wird, kann die DNA abgetöteter Hefe-Zellen
blockiert werden und steht der Polymerase nicht zur Verfügung. Eine Lebend/Tot-
Differenzierung ist in Getränkematrix anwendbar.
Abbildung 27: Funktionalität der Lebend/Tot-Differenzierung in Getränkematrix Bananennektar (1:10 in YM-Medium) wurde mit lebenden bzw. inaktivierten Saccharomyces-cerevisiae-Zellen (1x10
4 KBE) versetzt sowie als undotierte Matrix mitgeführt und mechanisch/thermisch aufgearbeitet (A). Im
rechten Bild wurde eine Behandlung mit Reagent D vorgeschaltet (B). Proben: Blau: mit lebenden Zellen; Rot: mit inaktivierten Zellen; Grün: undotiert; Gelb: PCR-NTC. Während die DNA inaktivierter Zellen im linken Bild noch
deutlich amplifiziert wurde, konnte das Signal nach Zusatz des Reagent D unterdrückt werden.
4 DISKUSSION
70
4 Diskussion
Das Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit war die Entwicklung eines Real-time-PCR-
Nachweissystems auf Grundlage des TaqMan-Prinzips mit Hydrolysesonden für Pilze in
alkoholfreien Getränken sowie der dazugehörigen Probenaufarbeitung, die die
Unterscheidung lebender und toter Organismen ermöglichen sollte. Der
molekularbiologische Assay enthält sowohl eine interne Amplifikations- als auch eine
Positivkontrolle, mit denen jeder Versuch auf seine Funktionalität hin getestet werden kann.
Mit der Überprüfung einer Vielzahl an Sequenzdaten für den Genabschnitt der 28S rDNA
konnte die Vorauswahl an geeigneten Primer- und Sondenkandidaten bestätigt und für den
Nachweis zusätzlicher Spezies erweitert werden. Die Sensitivität und Spezifität des Assays
konnte mit RNA-freier, quantifizierter DNA getestet und auf weniger als einen
Genomäquivalenten festgelegt werden. Insgesamt konnten 243 verschiedene Pilzspezies
unterschiedlicher taxonomischer Gruppen mit dem vorliegenden Verfahren eindeutig
nachgewiesen werden. Die Abgrenzung zu Nicht-Zielorganismen konnte durch den Einsatz
modifizierter Primer erreicht und mit der Untersuchung von 60 Spezies bestätigt werden.
Bei der mechanisch/thermischen DNA-Extraktion sind zwei Methoden optimiert worden:
filtrierbare Flüssigkeiten können mit einem Gesamtvolumen von 100 ml über einen Filter mit
0,2 µm Porengröße abgesaugt werden, welcher anschließend im Ganzen weiter bearbeitet
wird; nicht-filtrierbare Flüssigkeiten werden je nach Anforderung direkt aufgearbeitet und
quantifiziert oder zunächst einer Flüssiganreicherung zugeführt. Die Sensitivität der
Probenaufarbeitung bewegt sich für filtrierbare Proben im Bereich von 1x101 KBE/100 ml und
für nicht-filtrierbare im Bereich von 5x101 KBE/100 µl. Gering kontaminierte Matrices können
zumeist bereits nach 24 h positiv in der PCR getestet werden. Bei sehr gestressten oder
langsam wachsenden Keimen muss die Anreicherung auf 48 h ausgedehnt werden. Die
Methode wurde mit handelsüblichen Säften und Fruchtsaftkonzentraten sowie alkoholfreien
Brauereiproben angepasst.
4.1 Beurteilung der 28S rDNA als Zielregion
Hefen und Schimmelpilze üben nicht nur gewünschte Effekte auf eine Lebensmittelmatrix
aus: Produkte sind bei jedem Prozessschritt anfällig für Kontaminationen mit Fungi, die zu
Veränderungen der Produktmorphologie und des Geschmacks oder dem Verderb führen
können (Fleet 1992; Boekhout et al. 1994; Back 2000; Rawsthorne und Phister 2006;
Baumgart et al. 2012; Lucera et al. 2012). Des Weiteren besteht bei einem Befall mit
Schimmelpilzen wie Aspergillus spp. oder Fusarium spp. die Gefahr der Synthese von
Mykotoxinen, die insbesondere für immungeschwächte Menschen und Tiere problematisch
sein können (Baumgart et al. 2012).
4 DISKUSSION
71
Produktschädigungen können bei jeder Getränkegattung auftreten, wobei Einsatzstoffe,
zugeführte Wässer oder die Raumluft nur einige Beispiele für denkbare
Kontaminationsquellen sind (Back 2000, 2008). Insbesondere in industriellen Prozessen, bei
denen wirtschaftliche Faktoren bedeutend sind, ist die frühzeitige Registrierung einer
Kontamination und das damit verbundene rechtzeitige Eingreifen in den Prozess von großer
Wichtigkeit (Arias et al. 2002; Bleve et al. 2003; Martorell et al. 2005). Das derzeit
angewandte SSL-Verfahren erfüllt diese Anforderung nicht, da die Beurteilung der
Orangenfruchtsaftagarplatten mindestens 2 bis 7 Tage in Anspruch nimmt.
Das zu entwickelnde Real-time-PCR-Kit sollte zwingend den Nachweis einer Vielzahl an
Pilzen ermöglichen, da es idealerweise nicht nur für die Matrix der alkoholfreien Getränke
eingesetzt werden sollte. Damit war die Auswahl einer Genregion, die ubiquitär verbreitet
und trotzdem über das Taxon konserviert ist, unumgänglich. Des Weiteren liegt in
prozessierten Lebensmitteln DNA vermehrt in degradierter Form vor, so dass die Analyse
eines kurzen DNA-Segments bevorzugt werden sollte (Codex Alimentarius CAC/GL 74-
2010) (Demeke und Jenkins 2010).
Als Zielregion für den pilzspezifischen Assay wurde der vordere Genabschnitt der 28S rDNA
gewählt, welcher zusammen mit den Bereichen der 5.8S und 18S rDNA sowie den beiden
ITS-Regionen in einem rDNA-Repeat organisiert ist. Nach Alignierung und Beurteilung der
Sequenzdaten von 139 Hefe- und 94 Schimmelpilzen im Sequenzanalyse-Programm konnte
mit der D1/D2-Domäne ein geeigneter Zielbereich identifiziert werden. Im gewählten
Abschnitt der D1-Region geht die 28S rDNA in einen hochkonservierten Bereich über, der
mit dem Erreichen der D2-Region endet (Wesselink et al. 2002). Innerhalb der
taxonomischen Varianz unterscheidet sich der gewählte Sequenzbereich in nur wenigen
Basen (16 von 53 Oligonukleotidpositionen), wobei die verschiedenen Kombinationen durch
die eingesetzten Primer weitestgehend abgedeckt waren. Zur bereits bestehenden
Vorauswahl wurde ein zusätzlicher Forwardprimer in den Assay eingebracht, der mit der
Detektion von Mucoromycotina-Gattungen wie Actinomucor spp., Cunninghamella spp.,
Mucor spp., Mycotypha spp., Pilaira spp. oder Zygorhynchus spp. das Feld der
nachzuweisenden Pilze um eine wichtige Gruppe erweitern konnte. Mucorales beispielweise
infizieren Pflanzenbestandteile, vor allem Früchte wie Erdbeeren und sind damit als
potentielle Kontaminanten von Einsatzstoffen für die Getränkeindustrie bedeutend (Hoffmann
et al. 2013). Rhizopus spp., Mucor spp. und Thamnidium spp. sind weiterhin als Erreger in
gekühlten, tiefgefrorenen und frischen Fleisch- und Wurstwaren bekannt, so dass die
Erfassung dieser Gattungen in Hinblick auf die Adaption auf andere Lebensmittelmatrices
unumgänglich ist (Baumgart et al. 2012).
4 DISKUSSION
72
4.2 Spezifität des Real-time-PCR-Assays
Die Zielregion des zu entwickelnden Real-time-PCR-Assays zeichnet sich im gewählten
Abschnitt durch einen hohen Konservierungsgrad aus, so dass die Sequenz selbst bei
Betrachtung einer enormen taxonomischen Breite beinahe unverändert bleibt (Prokopowich
et al. 2003; Kobayashi 2011). Aus diesem Grund war die Abgrenzung zu taxonomisch
verwandten Gruppierungen - insbesondere den Pflanzen – problematisch und für die
Beurteilung des Assays entscheidend. Dennoch sollten möglichst viele Pilzspezies erfasst
werden, um der Funktion eines Pilzgesamtnachweissystems gerecht zu werden.
Nach Beurteilung des Alignments von 139 Hefe- und 94 Schimmelpilzsequenzen wurden die
Primer- und Sondenkandidaten ausgewählt. Zunächst belief sich die Zusammensetzung des
Assays auf einen Forward- und 4 Reverseprimer sowie dem Blockprimer. Damit wurden
anfänglich gute Resultate erzielt. Da mit dem Forwardprimer FungiFw1 die Gruppe der
Mucoromycotina jedoch nicht ausreichend erfasst wurde, wurde ein zusätzliches
Oligonukleotid eingebracht. FungiFw1 und FungiFw2 unterscheiden sich lediglich in der
Basenabfolge an Position 4 und 5 des 5‗-Primerbereichs. Mit den Untersuchungen zur
LOD/LOQ-Bestimmung, in denen die Pilze Absidia corymbifera (DSM 1144) und Mucor
racemosus (CBS 225.37) mitgeführt wurden (vgl. Kapitel 3.7), sowie zur Inklusivität und der
damit verbundenen Prüfung von 17 weiteren Spezies konnte gezeigt werden (vgl. Kapitel
3.6.1), dass die Amplifikation von Mucoromycotina-Spezies ebenso gut verläuft wie bei den
verbleibenden Pilzen.
Von den Phyla Asco-, Basidio- und Blastocladiomycota sowie den Subphyla insertae sedis
Mucoro- und Kickxellomycotina konnten Sporen bzw. Kolonien zur Spezifitätstestung genutzt
werden (Auflistung der Spezies und Stämme im Anhang VI). Insgesamt wurden 243 Fungi-
Spezies bzw. 285 verschiedene Stämme mit dem entwickelten Real-time-PCR-Assay positiv
getestet. Die Liste umfasst dabei nicht nur lebensmittelrelevante Pilze: der arbuskuläre
Mykorrhiza-Pilz Rhizophagus irregularis (Phylum: Kickxellomycotina) wird ebenso detektiert
wie der Blastocladiomycet Allomyces arbuscula. Eine ausführliche, quantitative Analyse
wurde aufgrund der Vielzahl an Fungi nicht durchgeführt.
Es war nicht möglich, Probematerial jedes Pilzphylums zu erhalten, da einige Fungi bis dato
nicht einzeln kultivierbar sind (Blackwell 2010; James und Berbee 2011): Genomische und
morphologische Analysen des Phylums Cryptomycota – mit dem bisher einzig benannten
Genus Rozella – konnten beispielsweise nur über die Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung und
Antikörpermarkierung von (marinen) Wasserproben bzw. der Kultivierung im
Wirtsorganismus Allomyces und anschließender Sequenzierung erhalten werden (Jones et
al. 2011a; James et al. 2013). Von denjenigen Phyla, von denen keine DNA-Probe verfügbar
war, existierten teilweise auch keine aussagekräftigen 28S-rDNA-Sequenzen in der NCBI-
4 DISKUSSION
73
Datenbank, so dass eine Überprüfung der Oligonukleotidkompatibilität nicht möglich war:
Vom Endoparasit Rozella liegen aufgrund seiner schwierigen Kultivierungsbedingungen
insgesamt nur 1080 Einträge in der Nukleotiddatenbank vor (insgesamt; Stand 01.02.2015);
das Phylum Microsporidia (64,052 insgesamt, davon 342 Einträge für rDNA; Stand
01.02.2015) sowie das Subphylum Zoopagomycotina (53 Einträge insgesamt; Stand
01.02.2015) lassen sich ebenfalls nicht abschließend beurteilen. In-silico-Analysen konnten
dagegen bei den Phyla Chytridio- und Blastocladiomycota sowie von den Subphyla
Mortierello-, Kickxello-, Neocallimastigo- und Entomophthoromycotina durchgeführt und der
zu den Oligonukleotiden komplementäre Abschnitt identifiziert werden. Allerdings hat sich
gezeigt, dass bei Neocallimastigomycotina und Blastocladiomycota der Forwardprimer
FungiFw1 nur mit jeweils einer Fehlpaarung im Bereich des 5‗-Endes hybridisieren kann. Wie
die Untersuchung von Allomyces arbuscula jedoch beweist, ist eine Detektion des
Blastocladiomycets möglich (siehe Anhang VI). Ob die quantitative Analyse gewährleistet ist,
konnte aufgrund des geringen Probematerials nicht geprüft werden.
Ein Nachweis aller Vertreter des Reiches ist aufgrund der Vielzahl an Pilzen nicht
überprüfbar: Experten gehen davon aus, dass momentan weniger als 10% der geschätzten
1,5 Millionen Spezies bekannt sind (Stajich et al. 2009; James und Berbee 2011). Andere
Quellen gehen von 5,1 Millionen Pilzspezies aus (Blackwell 2011). Ein Großteil der
neuidentifizierten Pilze kann einem Phylum zugeordnet werden, aber manche Spezies
beschreiben bis dato unbekannte Taxa. Daher können mit der hier getroffenen Auswahl aus
lebensmittelrelevanten und/oder ubiquitär verbreiteten Fungi nur die wichtigsten Phyla
(Basidio-, Asco-, Blastocladiomycota, Mucoro- und Kickxellomycotina) abgedeckt werden,
wobei Asco- und Basidiomycota etwa 98% aller beschriebenen Pilze umfassen (Stajich et al.
2009). Spezies, die in der Inklusivitätsprüfung nicht berücksichtigt wurden, aber für
Produktionsbetriebe von Bedeutung sind, müssen insbesondere für die quantitative Analytik
bei Bedarf nachgetestet werden.
Ein kritischer Punkt war die anfängliche Amplifikation pflanzlicher DNA und die Frage nach
einer 100%ig pilzfreien Pflanzenprobe, um definitive Aussagen über diese Problematik
erhalten zu können. Bei der DNA-Extraktion pflanzlicher Bestandteile wie Blättern oder
Früchten war die Anwesenheit von Pilzen – insbesondere Schimmelpilzen, die im Erdreich
vorkommen sowie Endophyten – denkbar: So befällt der Mucorales-Pilz Rhizopus stolonifer
Obst wie z.B. Erdbeeren, Spezies der Gattung Ustilaginomycotina sind als Pflanzenparasiten
bekannt (Stajich et al. 2009; Hoffmann et al. 2013). Ob durch Methoden wie der
Oberflächensterilisation mit Agenzien wie Natriumhypochlorit oder der DNA-Extraktion aus
dem Pflanzeninneren eine Keimfreiheit erreicht werden würde, war ebenfalls fraglich (Schulz
et al. 1993). Daher wurde beschlossen, eine artifizielle Pflanzen-DNA in Form eines
Plasmids zu generieren (vgl. Kapitel 3.2). Hierfür war zunächst das Entwickeln von Primern
4 DISKUSSION
74
notwendig, die den Zielbereich der 28S rDNA flankieren und dabei hoch spezifisch für
Pflanzen sind. Nach Beurteilung der Sequenzen relevanter Pflanzen mit verfügbarer DNA,
die aus der NCBI-Datenbank geladen wurden, und der Feststellung der geringen Divergenz
zu den Pilzen konnten die Primer VegFw1 und VegRv1 abgeleitet werden (siehe Anhang I).
Damit wurde ein 868 bp langes DNA-Fragment gewählt, das auf der 28S-rDNA-Sequenz des
Cucurbita pepo die Positionen 140 bis 1008 bp einnimmt (GenBank Acc. No. AF479108). Mit
der erfolgreichen Klonierung des Fragments konnten Versuche zur Erhöhung der Spezifität
vorgenommen werden.
Die Schlüsselstelle zur erhöhten Spezifität war dem Reverseprimer FungiRv3
zugeschrieben, da sich dieser in nur einer Base von der pflanzlichen Sequenz unterschied:
in 5‗-3‗-Richtung an Position 3 der Matrize ist anstelle einer Thyminbase bei den Plantae ein
Cytosin eingebaut. Unspezifische Amplifikate infolge von Mismatching waren die Folge.
Deutlich wurde dies vor allem in den Versuchen mit Primern, die Modifikationen zur
Unterbindung der Amplifikation pflanzlicher DNA aufwiesen (vgl. Kapitel 3.3).
Zunächst wurde der Einfluss eines LNA™-Primers geprüft. In locked nucleic acids (engl.
fixierte Nukleinsäuren) sind eine oder mehrere Basen durch den Einbau einer
Methylenbrücke zwischen dem Sauerstoffatom des C2-Atoms und dem C4-Atom strukturell
verändert (Koshkin et al. 1998; Obika et al. 1998; Braasch et al. 2002; Devor 2005;
Ballantyne et al. 2008). Damit ist das Molekül in der idealen Konformation festgesetzt; die
strukturelle Flexibilität geht aufgrund der erhöhten thermodynamischen Stabilität verloren
(Braasch et al. 2002; Devor 2005). Eine Hybridisierung kann demnach nur an den 100%ig
komplementären Strang erfolgen, zu dem eine verstärkte Bindungsaffinität herrscht
(Ballantyne et al. 2008). Diese zeigt sich in der Erhöhung der Schmelztemperatur des
Doppelstrangs um 2 bis 8 °C je LNA™-Monomer (Devor 2005; Ballantyne et al. 2008;
Exiqon 2009). Dadurch ergibt sich ein Vorteil der LNA™- gegenüber den Standard-Primern:
beim Einsatz kürzerer Primer und Sonden können dennoch stringente
Annealingbedingungen mit guter Performance angewandt werden (Latorra et al. 2003; Devor
2005; Dörries 2006). Zudem zeichnet sich ein LNA™-Primer durch eine hohe
Amplifikationseffizienz aus, wodurch selbst geringe DNA-Mengen problemlos vervielfältigt
werden können. Dies ist im Besonderen für forensische Analysen, bei denen oftmals nur
sehr geringe DNA-Mengen vorliegen, interessant (Ballantyne et al. 2008). Weitere
Anwendungen finden sich bei der allelspezifischen PCR, Real-time-PCR (als TaqMan-
Sonde, Molecular Beacons u.a.) und Microarrays (Latorra et al. 2003; Devor 2005;
Ballantyne et al. 2008). Im klinischen Bereich ist der Einsatz als Antisense-Oligonukleotid,
welches nach dem Andocken den Zielbereich einer DNA oder RNA für nachfolgende
Prozesse blockiert und damit als Genregulator dient, vielversprechend (Braasch et al. 2002;
Latorra et al. 2003; Tolstrup 2003; Ballantyne et al. 2008). Im vorliegenden Assay sollte der
4 DISKUSSION
75
Einsatz eines LNA™-Primers die Amplifikation fungoider DNA verstärken, während
pflanzliche DNA mittels C3-Spacer-gelinktem Primer unterdrückt werden sollte. Die am 3‗-
Ende des Oligonukleotids angehängte Propylgruppe verursacht eine strukturelle Modifikation
des Primers, welche ein Ablesen durch die Polymerase und damit die Amplifikation
unterbindet. Vor allem in Hybridisierungssonden ist dies ein vielfach genutztes Prinzip (Zhou
et al. 2004).
Als Alternative zum LNA™-Primer wurden zip nucleic acids (engl.
Reißverschlussnukleinsäuren, Abkz. ZNA) getestet. Hierbei handelt es sich um
Oligonukleotid-Oligokation-Konjugate mit kationischen Sperminresten, welche die
elektrostatische Abstoßung zweier negativ geladener DNA-Stränge verringern und somit ihre
Hybridisierung fördern sollen (Pons et al. 2006; Noir et al. 2008; Moreau et al. 2009). Wie
LNAs™ weisen sie höhere Schmelztemperaturen und eine gute Diskriminierung von
Fehlpaarungen auf, wodurch sich ihre Anwendungsbereiche überschneiden (Moreau et al.
2009). ZNAs haben im vorliegenden Assay als Singleprimer verwertbare Resultate erzielt,
konnten diese aber im Multiplex-Ansatz nicht beibehalten (Daten nicht gezeigt). Daher wurde
die Optimierung des Mastermixes unter Einsatz des LNA™-Primers fortgeführt.
Die Effekte, die durch den Einsatz der modifizierten Primer erzielt wurden, konnten in den
Versuchen des Kapitels 3.3 aufgezeigt werden. Unter Verwendung verschiedener
Mastermixvarianten konnte bewiesen werden, dass sowohl Block- als auch LNA™-Primer
großen Einfluss auf die Amplifikation pflanzlicher DNA ausüben. Durch Zusatz des LNA™-
Primers fand im Vergleich zum unmodifizierten Primer FungiRv3 eine Verzögerung des
pflanzlichen Signals um im Schnitt 17 Zyklen statt. Der Blockprimer erhöhte den Cp-Wert um
etwa 6 Zyklen. Aber erst durch die Kombination beider Primer können pflanzliche Signale bis
zu einer gewissen Konzentration vollständig unterdrückt werden: Im Falle des eingesetzten
Pflanzenplasmids bewegt sich der Grenzwert zwischen 2,3x107 und 1,1x10
8 Kopien. Dort,
wo trotz Einsatz beider Varianten noch Signale zu verzeichnen sind, werden diese in starker
Abhängigkeit zur DNA-Konzentration nochmals um 4 bis 7 Zyklen im Vergleich zum Mix, der
nur den LNA™-Primer enthält, hinausgezögert.
Die Spezifität des Real-time-PCR-Assays wurde durch die Verwendung des LNA™- und des
C3-Spacer-gelinkten Primers deutlich verbessert. Es konnte gezeigt werden, dass eine
Abgrenzung zu taxonomisch nahverwandten Pflanzen möglich ist. Die bestätigt sich auch
durch den Einsatz RNA-freier, quantifizierter Pflanzen-DNA (100 pg je Reaktion) zur
Exklusivitätstestung. Keine der getesteten DNAs lieferte ein Positivsignal im FAM-Kanal. Es
wäre denkbar, dass bei einer sehr hohen DNA-Konzentration die Amplifikation nach
Verbrauch der Primer nicht weiter unterbunden wird. Dies ist in nachfolgenden Versuchen,
die vorzugsweise mit Fruchtsäften/-konzentraten durchgeführt wurden, allerdings nicht
erkennbar gewesen. Die Ursache hierfür liegt darin, dass prozessierte Matrices einen
4 DISKUSSION
76
gewissen Anteil an freier DNA bzw. DNA inaktivierter Zellen aufweisen, der bei der
Lebend/Tot-Aufbereitung durch den interkalierenden Farbstoff des Reagent D inaktiviert
wird, während neu freigesetzte DNA (aus der Lyse) schließlich in der PCR blockiert wird.
Die Exklusivitätsprüfung hat weiter zeigen können, dass die Abgrenzung zu Bakterien und
Zelllinien verschiedener Herkunft gegeben ist und eine Spezifität für Pilze vorliegt. Die
Beschaffung pilzfreier Proben kann sich - wie schon bei den Pflanzen – problematisch
gestalten, da Fungi als ubiquitäre Organismen beinahe jeden Lebensraum und als
Pathogene eine Vielzahl an Wirten besiedeln können: Vertreter der Familie Mucorales sind
als Parasiten von Pflanzen, Tieren und anderen Pilzen bekannt (Hoffmann et al. 2013).
Durch die regelmäßige Überprüfung und Kontrolle der hausinternen Stammsammlung
konnte die Richtigkeit der bakteriellen Stämme und der daraus erhaltenen DNA gewährleistet
werden. Es wurden ausschließlich steril bearbeitete Zellkulturüberstände verwendet, welche
regelmäßig mikroskopisch beurteilt wurden, um Kontaminationen auszuschließen.
4.3 Sensitivität des Real-time-PCR-Assays (LOD und LOQ)
Nachdem die Selektivität des Assays durch Inklusivitäts- und Exklusivitätsuntersuchungen
nach ISO 22118:2011 (§64 LFGB L00.00.138) bestätigt werden konnte, schlossen sich
ausführliche Versuche zur Bestimmung des limit of detection und limit of quantification an,
mit denen die Sensitivität beurteilt werden sollte. Die RNA-freie DNA von 15
lebensmittelrelevanten Pilzen, welche ein breites phylogenetisches Spektrum abdeckten,
konnte nach einer Konzentrationsbestimmung mittels Absorptionsspektroskopie quantifiziert
und in gewünschter DNA-Konzentration in die Reaktion zur Bestimmung von LOD und LOQ
eingesetzt werden. Die untersuchten Pilzspezies weisen unterschiedliche Genomgrößen
(von 10 bis 72 fg) und mit großer Wahrscheinlichkeit auch eine Varianz der rDNA-Kopien
innerhalb des Genoms auf (Prokopowich et al. 2003). Die exakten Kopienzahlen der 15
Spezies sind nicht bekannt. Innerhalb des Reiches der Fungi wird jedoch von 10 bis 250
rDNA-Repeats ausgegangen (Ashbya gossypii: 50 Kopien, Saccharomyces cerevisiae: 150
Kopien, Aspergillus nidulans: 45 Kopien, Cryptococcus neoformans: 55 Kopien) (Kobayashi
et al. 1998; Wendland et al. 1999; Prokopowich et al. 2003; Ganley und Kobayashi 2007).
Zur Bestimmung der LOD und der LOQ wurden die DNAs zur besseren Vergleichbarkeit auf
Genomäquivalente eingestellt. Damit variieren sowohl DNA-Gehalt als auch rDNA-
Kopienzahl bei identischen Genomkopien in der Reaktion. Unter Beachtung der
unterschiedlichen Genkopienanzahl (Varianz von 10 bis 250 Kopien) ist davon auszugehen,
dass die resultierenden Cp-Werte zweier Pilze mit identischem Genomäquivalenten bis zu
einer Log-Stufe – also bei optimaler PCR-Effizienz um 3,32 Zyklen – auseinander liegen
können. Genau dies ist bei den Einzeluntersuchungen jeder Spezies zu erkennen: die Cp-
4 DISKUSSION
77
Werte für 10 000 GÄ liegen beispielsweise im Bereich von x̅ = 15,16 (I. orientalis) bis
x̅ = 18,98 (Cl. cladosporoides) und weisen damit eine Differenz von 3,82 Zyklen auf. In den
weiteren Stufen der Verdünnungsreihen tritt eine solche Differenz wiederholt auf. Dies lässt
auf rDNA copy numbers schließen, die sich in etwa um den Faktor 10 voneinander
unterscheiden. Infolge der interspezifischen Korrelation aller Werte werden die Cp-Werte der
beiden stark vom Mittel (x̅ = 16,6) abweichenden Spezies jedoch relativiert, so dass die
Gesamtstandardabweichung nur bei 0,1 liegt. Es zeigt sich somit, dass die Kopienzahl des
rDNA-Gens zwar einen Einfluss auf den Amplifikationszeitpunkt hat, aber eine
Quantifizierung dennoch realisierbar ist. Die Effizienz des Assays liegt deutlich über 90% für
alle quantifizierten Pilzspezies und erfüllt damit die Anforderungen an ein robustes System
(siehe Anhang VIII) (Codex Alimentarius CAC/GL 74-2010). Die Robustheit wird mit der
Adaption auf verschiedene Cycler-Plattformen nochmals unterstrichen.
Quantitative Analysen sollten in jedem PCR-Lauf realisierbar sein, um genaue Aussagen
über den Kontaminationsgrad zu erhalten. Hierfür wurde eine Plasmidpositivkontrolle auf
Basis eines pGEM®-T-Vektors erstellt, welche nach ISO 22174:2005 und ISO 20838:2006
auch die Funktionalität der zielgenspezifischen Reagenzien bestätigen sollte. Nach
Amplifikation des Zielbereichs aus D. anomala-DNA wurde das PCR-Produkt
gelelektrophoretisch aufgetrennt und die spezifische Bande (ca. 106bp) heraus geschnitten.
Das aufgereinigte DNA-Fragment konnte anschließend in einen Vektor ligiert und dieser in
kompetente XL-1 Blue E. coli-Zellen transformiert werden. Es befindet sich somit in einem
Plasmid eine Kopie des 28S-rDNA-Zielbereichs. Mit der Sequenzierung der erhaltenen
Positivkontrolle konnte dies bestätigt werden. Die Untersuchung zur Einstellung der
Positivkontrolle (siehe Kap. 3.4) hat gezeigt, dass eine Korrelation zwischen dem single-
copy-Plasmid und der eingesetzten DNA-Menge hergestellt werden kann: 106 Kopien
erreichen den gleichen Cp-Wert (21,93) wie 10 000 GÄ von D. anomala (21,74), 105 Plasmid-
Kopien (Cp 25,48) den gleichen wie 1 000 GÄ (Cp 25,32) usw. Damit ließe sich theoretisch
herleiten, dass die Hefe D. anomala etwa 100 Kopien des rDNA-Gens im Genom aufweisen
muss. Der Wert liegt real allerdings deutlich darunter, da zwei unterschiedliche Fragmente,
die insbesondere in ihrer Länge (3100bp Plasmid gegen Gesamt-DNA) verschieden sind, in
der PCR-Reaktion nicht identisch amplifiziert werden können (Mülhardt 2009). Eine direkte
Bestimmung der rDNA-Kopienzahl der Hefe ist damit nicht machbar. Es ermöglicht jedoch
eine Quantifizierung an eingesetzten Genomäquivalenten. In der vorliegenden Arbeit wurde
die Kontrolle für Dekkera-anomala-DNA eingestellt; eine Anpassung an die interspezifischen
Werte der Sensitivitätsbestimmung (Kap. 3.7) ist sinnvoll, da diese als Mittelwert aus den 15
Pilzstämmen errechnet wurden.
Durch die Auswahl eines multi-copy-Gens können sehr niedrige Nachweisgrenzen erreicht
werden. Der vorliegende Assay erzielt einen LOD- bzw. LOQ-Wert von 0,39 GÄ. Unter der
4 DISKUSSION
78
Annahme, dass in Fungi das 28S-rDNA-Gen etwa 10 bis 250 Mal vorhanden ist, kann selbst
ein einziger Organismus damit noch ausreichend Zielmoleküle in die PCR-Reaktion
einbringen, um eine Detektion sowie eine Quantifizierung zu ermöglichen. Dies ist
gleichzeitig der sensibelste Punkt des Systems: geringste Kreuzkontaminationen (unsaubere
Reagenzien etc.) können bereits zu einem falschpositiven Resultat führen. Die eingesetzten
Materialien (Reagenzien, Pipettenspitzen etc.) sollten damit möglichst DNA-frei sein.
Die Falschpositivrate pf+ errechnet sich nach §64 LFGB 00.00-138 folgendermaßen:
𝑝𝑓+ =𝑛𝑓+
𝑛𝑟−+𝑛𝑓+∗ 100% Gleichung 5
nf+ … Anzahl falsch eingestufter bekanntermaßen negativen Proben nr- … Anzahl der tatsächlich negativen Untersuchungsergebnisse
Ergänzt man die Werte der Negativkontrollen aus der Sensitivitätsbestimmung (vgl. Kap.
3.7und Anhang VIII), erhält man:
𝑝𝑓+ =30
110+30∗ 100% = 21,43% Gleichung 6
Die hohe Falschpositivrate der Negativkontrollen im Sensitivitätstest in Höhe von 21% zeigt
die Gefahr der Kreuzkontaminationen deutlich. Betrachtet man die hundertprozentige
Nachweisquote der 0,39 GÄ-Stufe und die hohe Positivrate der NTCs im Zusammenhang, ist
eine Unterscheidung zwischen „falschpositiv― und „richtigpositiv― in diesem Bereich nicht
eindeutig möglich. Daher sollte die Nachweis- und Quantifizierungsgrenze des Assays auf
1,56 GÄ festgelegt werden. Die klare Unterscheidung zu den Negativkontrollen kann damit
erreicht werden. Negativkontrollen sind ebenso wie Positivkontrollen in jedem PCR-
Experiment mitzuführen, um falschpositive Resultate erkennen zu können (ISO 22174:2005
und ISO 20838:2006).
Der Assay enthält Mechanismen zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen: die Hot-Start-
Funktion der Polymerase (ISO 20838:2006) sowie den Einsatz der Uracil-DNA-Glykosylase
(ISO 22174:2205). Für die Hot-Start-Funktion ist ein spezifischer Antikörper oder ein
passendes Aptamer notwendig. Antikörper werden meist in einer glycerinhaltigen Lösung
gelagert, um ein komplettes Einfrieren und die daraus resultierende Schädigung des
Antikörpers zu verhindern. Glycerin hindert aufgrund seiner niedrigen
Glasübergangstemperatur (TG = -65°C) allerdings auch den Einfrierprozess vor der
Gefriertrocknung, bei dem sich eine Eiskristall- und eine aufkonzentrierte, amorphe
Glasphase, die die Wertstoffe umschließt und konserviert, ausbilden (Ringler 2000). Die
Glas-Dynamik-Hypothese nach Chang et al. erklärt, dass zugesetzte Stabilisatoren wie
Zucker eine starre, inerte Matrix bilden, in der das Enzym beim Einfrieren eingelagert wird
(Chang et al. 2005). Die Bewegungsfreiheit als Grundvoraussetzung für chemische Prozesse
wie Umfaltung und Denaturierung ist in diesem Stadium stark eingeschränkt (Chang et al.
2005). Der Hypothese des water substitute (engl. Wasserersatz) folgend, stehen bei der
4 DISKUSSION
79
eigentlichen Lyophilisation nach dem vollständigen Entzug des Wassers freie
Hydroxylgruppen des zugesetzten Zuckers zur Ausbildung von Wasserstoffbrücken zur
Verfügung (Chang et al. 2005). Dies reduziert die freie Enthalpie, da mehr Energie zum
Umfalten des Proteins benötigt werden würde (Chang et al. 2005). Damit ist das native
Proteingerüst der Polymerase stabilisiert (Chang et al. 2005). Glycerin- und DNA-freie
Antikörper waren für den Assay nicht verfügbar. Aus diesem Grund musste das Enzym mit
einem geeigneten Aptamer blockiert werden.
Die Auswahl eines Aptamers erfolgt nach einem unter zunehmend stringenten Bedingungen
verlaufenden Selektionsprozess aus einer Kandidatenbibliothek heraus (SELEX-Verfahren,
Abkz. systematic evolution of ligands by exponential enrichment) (Ikebukuro und Noma
2003; Friedrichs und Simmel 2007). Essentielle Eigenschaften für das vorliegende Assay
waren eine reversible Bindung an das Enzym und die Hot-Start-Funktion. PCR-Artefakte, die
durch Fehlhybridisierung und Primerdimerbildung entstehen, können durch einen Antikörper
oder einem speziellen Oligonukleotid vermieden werden, da diese Moleküle das aktive
Zentrum des Enzyms bei Umgebungstemperatur blockieren. Erst bei Temperaturen über
70°C zersetzt sich der Komplex infolge der Denaturierung des Blockmoleküls und gibt damit
das aktive Zentrum frei. Die Sensitivität und Spezifität einer PCR-Reaktion ist damit
gegenüber der konventionellen Methode deutlich erhöht (Mülhardt 2009). Dies zeigte sich
auch in den sich anschließenden Versuchen: obwohl auch die antikörpergeblockte
Polymerase in Bezug auf Sensitivität und Spezifität gute Resultate erzielte, konnte nach der
Umstellung auf das Aptamer und dem Herabgesetzten der Annealingtemperatur auf 60°C bei
gleichbleibender Sensitivität die Spezifität nochmals verbessert werden. Die
Falschpositivrate von Negativkontrollen konnte reduziert werden (0 von 30), so dass die
Bestimmungen der ISO-Norm5 erfüllt werden (ISO 22118:2011); die Amplifikation pflanzlicher
DNA – getestet durch den Einsatz eines Plasmids mit pflanzenspezifischem Insert – konnte
weiter unterdrückt werden.
Mit dem Einsatz einer Uracil-DNA-Glykosylase und dUTP anstelle von dTTP können – der
ISO 20838:2006 folgend - carry-over-Kontaminationen aus vorangegangenen PCR-
Reaktionen vermieden werden (Mülhardt 2009). In das Amplifikat wird für jede Thymin- eine
Uracilbase eingebaut. Die nachfolgende PCR-Reaktion beginnt zunächst mit einem 37°C-
Schritt, bei dem die UDG alle uracilhaltigen PCR-Produkte durch die Spaltung der N-
glycosidischen Bindung abbaut, so dass diese nicht mehr amplifizierbar sind. Das Enzym
selbst wird während der initialen Denaturierungsphase inaktiviert und stört den weiteren
Amplifikationsprozess nicht (Mülhardt 2009).
5 Eine Falschpositiv- bzw. Falschnegativrate von 5% und weniger erfüllt die Anforderungen nach ISO
22118:2011.
4 DISKUSSION
80
Neben der Positivkontrolle, die zur Quantifizierung genutzt werden kann, wurde eine interne
Amplifikationskontrolle in den Assay eingebracht. Nach ISO 22174:2005 und ISO
20838:2006 soll in jeder PCR-Reaktion eine interne oder externe Amplifikationskontrolle
mitgeführt werden, da das Risiko besteht infolge einer Inhibition (z.B. durch DNA-Extraktion
freigesetzte Schwebstoffe, Farbstoffe, Polyphenole etc.) falschnegative Resultate zu
erhalten. Die IAK muss prinzipiell immer amplifiziert werden. Eine Ausnahme tritt ein, wenn
viel Ziel-DNA in den Assay eingebracht wird und die IAK als Folge der Konkurrenz um
dNTPs, Polymerase etc. nicht oder nur unzureichend amplifiziert wird. Die Ziel-DNA für die
IAK wird in Form eines Plasmids mit synthetisiertem Insert eingesetzt, wobei die
Konzentration des Plasmids so gewählt wird, dass die Amplifikation des PCR-Produktes im
Vordergrund steht. Die Detektion der IAK findet zu einem späten Zeitpunkt der Reaktion statt
(Cp > 30). Die nicht-kompetitive Amplifikationskontrolle, welche über ein eigenständiges
Primerpaar und eine spezifische Sonde detektiert wird, hat ein geringfügig längeres
Fragment als das PCR-Produkt, um möglichst identische Amplifikationsbedingungen zu
schaffen, aber dabei die Reaktion zugunsten des kleineren PCR-Produktes zu verlagern.
Abschließend kann festgehalten werden, dass ein Real-time-PCR-Assay entwickelt wurde,
welches unter Einsatz von RNA-freier DNA ein Detektions- und Quantifizierungslimit von
1,6 GÄ aufweist. Die Identifikation der Ziel-DNA wird über spezifische Primerpaare und
Sonden erreicht, wobei im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein zusätzlicher Forwardprimer
in das System eingebracht wurde, um den Nachweis und die Quantifizierung der
Mucoromycotina zu ermöglichen. Durch die Verwendung zweier Primermodifikationen
konnte die Spezifität des Assays verbessert und die Amplifikation unerwünschter DNAs (z.B.
pflanzlichen Ursprungs) weitestgehend blockiert werden. Durch die Anpassung der
Reaktionsbedingungen (Polymerase-Blockierung mit Aptamer, Herabsetzen der
Annealingtemperatur) sowie der Verwendung DNA-freier Materialien wurde die Rate an
falschpositiven Resultaten deutlich reduziert. Mit der internen Amplifikations- und der
Positivkontrolle erfüllt der Multiplex-Assay die Anforderungen nach ISO 22174:2005 und ISO
20838:2006.
4.4 Beurteilung der Methode zur Lebend/Tot-Differenzierung
Der Nachweis von Mikroorganismen in Getränken ist von großer Wichtigkeit, da diese u.a.
zum Verderb des Produkts führen, schädliche Mykotoxine bilden oder allergische Reaktionen
nach dem Verzehr hervorrufen können (Fleet 1992; Back 2000; Boekhout und Robert 2003;
Rawsthorne und Phister 2006; Baumgart et al. 2012; Lucera et al. 2012). Neben dem
gesundheitlichen Risiko für den Verbraucher verlangt der mögliche wirtschaftliche Verlust
4 DISKUSSION
81
des Herstellers nach einem Untersuchungsverfahren, das die Erfolge der durchgeführten
Sterilisationsmaßnahmen aufzeigt (Arias et al. 2002; Bleve et al. 2003; Martorell et al. 2005).
Die in der Industrie angewandten Sterilisationsmaßnahmen sind auf das jeweilige Produkt
und seine Verpackung abgestimmt, aber kein Verfahren scheint gegen alle Arten von
Erregern wirksam. In Getränken, in denen aufgrund der Abfüllung in PET-Flaschen keine
Heißabfüllung möglich ist (z.B. Cola, Limonaden, stille Getränke u.Ä.), kommt häufig das
Kaltentkeimungsmittel Velcorin® (Dimethyldicarbot, E242) zum Einsatz (Zink 1997; Wareing
und Davenport 2000), welches zur Abtötung von Kahm- und Gärhefen sowie
gärungserregenden Bakterien zugesetzt wird (Pollmer 2000). In höherer Konzentration ist es
auch gegen Schimmelpilze und Wildhefen effektiv (Pollmer 2000). Allerdings konnten bereits
Velcorin®-tolerante Hefen identifiziert werden: Zygosaccharomyces lentus ist zudem tolerant
gegenüber den Konservierungsmitteln Sorbin- und Benzoesäure, niedrigen pH-Werten und
hohen Zuckerkonzentrationen und damit ein schwer zu beseitigender Verderbsorganismus
(Steels et al. 1999; Pollmer 2000). Laut Hersteller ist das Produkt zudem im Vorfeld auf
Sporenfreiheit zu testen und die Keimbelastung zu reduzieren (Lanxess 2009). Stille
Getränke, die mittels Hitzesterilisation behandelt werden können, bergen auch nach dem
Prozess die Gefahr einer Kontamination mit hitzeresistenten Askosporen der Spezies
Byssochlamys fulva, Talaromyces flavus oder Neosartorya fischeri (Fleet 1992; Back 2000;
Wareing und Davenport 2000; Arias et al. 2002; Baumgart et al. 2012).
Zur korrekten Darstellung des Dekontaminationserfolges genügt der entwickelte PCR-Assay
alleine nicht, da jede zugängliche DNA, auch diejenige aus Erregern, die bei den
Sterilisationsmaßnahmen abgetötet werden konnten, nachgewiesen werden würde (Fittipaldi
et al. 2012). Eine Aussage darüber, wie viel lebende Pilze tatsächlich im System verblieben
sind, kann damit nicht getroffen werden. Eine Differenzierung zwischen lebenden und toten
Zellen ist somit für die Probenaufarbeitungsmethode essentiell.
In den letzten Jahren hat sich der Einsatz interkalierender Agenzien in Kombination mit der
DNA-Amplifikation als sogenannte viable-PCR (engl. PCR zum Nachweis lebensfähiger
Organismen, Abkz. v-PCR) – auch in Form einer isothermalen Amplifikation - für die
Lebend/Tot-Differenzierung vermehrt durchgesetzt (Fittipaldi et al. 2012). Als interkalierende
Agenzien werden vorwiegend Propidiummonoazid oder Ethidiumbromidmonoazid
zugegeben, wobei ihre Anwendung für verschiedene Mikroorganismen untersucht wurde:
vegetative Bakterienzellen, bakterielle Sporen, Fungi, Viren und Protozoen wurden hierfür
herangezogen (Fittipaldi et al. 2012). Welches Agenz in welcher Konzentration eingesetzt
wird, ist dabei vom zu beseitigenden Organismus abhängig: während PMA aufgrund seiner
höheren, positiven Ladung bei Bakterien bevorzugt wird, findet EMA häufig bei Pilzen und
gramnegativen Bakterien Anwendung (Nocker und Camper 2009; Minami et al. 2010;
Fittipaldi et al. 2012). Für den vorliegenden Assay wurde das Produkt Reagent D (Fa.
4 DISKUSSION
82
BIOTECON Diagnostics), eingesetzt welches für die Beseitigung der DNA toter
Enterobacteriaceae in Milchprodukten vorgesehen ist. Das vorgegebene Protokoll wurde für
die ersten Analysen übernommen.
Zur Beurteilung der Effektivität der interkalierenden Agenz wurden Hefezellen und
Schimmelpilzsporen (1x102 bzw. 1x10
3 KBE) in SSL-Medium über einen bestimmten
Zeitraum (min. 20min) bei 80°C in einem Thermomixer inaktiviert. Zum Vergleich wurden
neben den Untersuchungen mittels PCR Kulturen auf YM-Agar angelegt. Unter Anwendung
des Standardprotokolls (nach Herstellerangaben) konnte bereits nach 5minütiger
Dunkelphase die DNA inaktivierter Saccharomyces- und Dekkera--Zellen vollständig
unterdrückt werden. Für Aspergillus-Sporen und Zygosaccharomyces bailii genügte die
kurze Einwirkzeit des Reagent D nicht: die inaktivierten Sporen generierten nach 5minütiger
Inkubationszeit einen Cp-Wert von 35,32, die Hefen einen Wert von 34,76. Wie in Studien
bereits vermutet wurde, scheint die Effektivität der interkalierenden Agenz somit vom Zelltyp
(Spore oder vegetative Zelle) und der Spezies abhängig zu sein (Fittipaldi et al. 2010, 2012).
Eine Erhöhung der Einwirkzeit birgt jedoch – vor allem bei Verwendung von EMA für
Bakteriensuspensionen - die Gefahr des Eindringens in lebende Zellen und damit
verbundene zytotoxischer Effekte, welche letztlich zu einer Unterschätzung des tatsächlichen
Lebendbefalls der Probe führen können (Nogva et al. 2003; Rudi et al. 2005; Nocker und
Camper 2006; Fittipaldi et al. 2010, 2012). Eine Verlängerung der Dunkelphase auf zunächst
10min sollte darüber Aufschluss geben: im direkten Vergleich zur 5minütigen Dunkelphase
war jedoch bei allen vier Spezies keine Verschiebung des Cp-Wertes der Lebendprobe, was
auf einen negativen Effekt auf die aktiven Zellen schließen ließe, zu verzeichnen. Sollten die
Zellen infolge der verdoppelten Dunkelphase geschädigt worden sein, resultiert dies nicht in
signifikanten Unterschieden in der PCR. Das Signal der inaktivierten Zygosaccharomyces-
Zellen konnte nun ebenso wie das der inaktivierten Saccharomyces- und Dekkera-Zellen
vollständig unterdrückt werden. Dagegen generierte die Probe der inaktivierten Aspergillus-
Sporen ein Signal, das die LightCycler®-Software als „uncertain“ deklarierte. Insbesondere in
diesem Experiment war in den Proben mit DNA aus inaktivierten Zellen bzw. Sporen sowie
der WSH-Kontrolle ein leichter Anstieg im letzten Abschnitt der PCR zu erkennen, was auf
eine Kontamination mit geringen DNA-Mengen hinweist.
Da nach der 10minütigen Einwirkzeit das Signal der inaktivierten Aspergillus-Sporen nicht
vollständig beseitigt war, wurde eine Ausdehnung der Dunkelphase auf 20min getestet. Über
einen Zeitraum von 60min wurden die Sporen (1,4x104 KBE) bei 80°C thermisch behandelt
und in regelmäßigen Zeitabständen Proben entnommen, welche parallel für 10 bzw. 20min
mit der Agenz inkubiert wurden. Zum einen konnte festgestellt werden, dass keine
Signalverschiebung bei längerer Dunkelphase zu verzeichnen ist. Zum anderen nimmt ab
4 DISKUSSION
83
einer 30minütigen Hitzebehandlung das in der PCR generierte Signal nicht weiter ab.
Vielmehr treten die Signale aller nachfolgend entnommenen Proben um den Cp 32/33 auf.
Eine vollständige Unterdrückung der Signale aus inaktivierten Sporen wurde somit nicht
erreicht. Auf den ersten Blick spricht es für die Ineffektivität der Agenz. Bei genauerer
Betrachtung liegt dies allerdings in der hohen Sensitivität des Real-time-PCR-Assays und
der möglichen Thermotoleranz einiger Sporen begründet. Wie in Kapitel 3.10 (Gleichung 3
und 4) beschrieben, können mithilfe einer Standardkurve die nach der Thermobehandlung im
System verbliebenen Sporen im Vergleich zur Ausgangsmenge berechnet werden. Da der
Cp-Wert über den gesamten Behandlungszeitraum um ca. 9 Zyklen erhöht wird, verbleiben
rechnerisch etwa 0,177% vom Ausgangswert in der PCR-Reaktion. Umgerechnet entspricht
dies etwa einem Genomäquivalenten. Die Analysen zur LOD- und LOQ-Bestimmung haben
deutlich gezeigt, dass mit der Auswahl des multi-copy-Gens genügend Ziel-DNA für den
Nachweis und die Quantifizierung von weniger als 1 GÄ zur Verfügung steht.
Der Verbleib einer geringen Anzahl aktiver Sporen im System konnte bereits von Fujikawa
und Itoh beobachtet werden: in einer Studie inaktivierten sie Aspergillus-Sporen mittels
Hitzebehandlung und konnten feststellen, dass jede thermische Inaktivierung einem Muster
folgt (Fujikawa und Itoh 1996): in einer semilogarithmischen Darstellung, in der die
Lebendanzahl der Sporen N im Verhältnis zur Ausgangslebendanzahl N0 (entspricht log 𝑁
𝑁𝑜 )
über den Zeitpunkt t abgebildet ist, bildet sich im vorderen Bereich eine Schulter, die in ein
Gefälle übergeht und in einem Auslauf endet. In der Schulter zeigt sich diejenige Zeit, die
benötigt wird, um eine Inaktivierung der Sporen in Gang zu setzen. Die zunehmende Anzahl
inaktivierter Sporen spiegelt sich im Gefälle wieder, deren Steilheit ebenso wie die Länge der
Schulter temperaturabhängig ist. Zum Ende des Gefälles geht die Kurve in den Auslauf über,
der in Abhängigkeit von der Ausgangskonzentration und der Inaktivierungstemperatur gegen
einen bestimmten Wert p strebt. Dieser gibt letztlich die Überlebensrate der Sporen nach der
Thermobehandlung an. Die Studie bewies, dass ab einer Ausgangskonzentration von 103
Sporen pro Milliliter eine gewisse Anzahl während der Behandlung eine Thermotoleranz
entwickeln kann, welche jedoch nur einmalig gegeben ist: eine Anzucht der Sporen auf Agar
und eine erneute Thermobehandlung führen wiederum zu sensitiven und thermotoleranten
Sporen. Die Toleranz scheint damit eher zufällig als konsistent. Sinnvoller als eine einmalige
Hitzebehandlung ist die wiederholte Wärmezufuhr, wodurch die Sporen stufenweise
vollständig inaktiviert werden können. Für die Untersuchung der Lebend/Tot-Differenzierung
wurde diese Vorgehensweise jedoch nicht angewandt. Demnach verblieben wahrscheinlich
thermotolerante Aspergillus-Sporen im System, welche nach der Probenaufarbeitung in der
PCR detektiert werden konnten. Die mikrobielle Anzucht zeigt an dieser Stelle Schwächen:
4 DISKUSSION
84
bereits nach 5min Inaktivierungsdauer konnte kein Koloniewachstum auf den Agarplatten
festgestellt werden.
Die Konzentration des interkalierenden Farbstoffs im Reagent D ist gering6. Dadurch werden
die Pilzzellen auch bei längerer Dunkelphase keinen signifikanten, zytotoxischen Effekten
ausgesetzt, welche die Beurteilung des Lebendanteils beeinflussen (Fittipaldi et al. 2012).
Eine Dunkelphase von mehr als 5 Minuten ist damit unproblematisch und, wie der Test mit
10minütiger Inkubationszeit zeigt, effektiver bei der Unterdrückung des Signals inaktivierter
Zellen. Der Fluoreszenzfarbstoff hat mehr Zeit in membrangeschädigte Zellen einzudringen
und sich an die DNA zu binden (Fittipaldi et al. 2012). Eine weitere Verlängerung ist nach
bisherigen Untersuchungen nicht notwendig und wurde in Bezug auf ein kurzes
Bearbeitungsprotokoll nicht weiter verfolgt. Andorrà et al. haben in ihrer Studie sowohl für
EMA als auch PMA ebenfalls die 10minütige Inkubation als Optimum zur Beseitigung
inaktivierter Hefezellen herausgefunden (Andorrà et al. 2010).
Für die optimale Beseitigung der DNA geschädigter Organismen spielt die
Inkubationstemperatur eine bedeutende Rolle. Der Fluoreszenzfarbstoff muss in die
aufgebrochenen Zellen eindringen können. Wählt man eine Temperatur um 0°C
(Dunkelinkubation im Kühlschrank), wird die freie Diffusion durch eine starre Membran
erschwert (Fittipaldi et al. 2012). Bei Umgebungstemperatur besitzt die Membran dagegen
die natürliche Beweglichkeit, was die Diffusion des Farbstoffs ins Zellinnere fördert. Die
herabgesetzte Temperatur wird im Review von Fittipaldi et al. als Mittel zur Verminderung
der zytotoxischen Effekte und dem damit fälschlich abgebildeten Kontaminationsgrad infolge
des Eindringens in intakte Zellen verstanden (Fittipaldi et al. 2012). Eine exakte Abwägung
zwischen tatsächlicher Zytotoxizität und bestmöglichem Resultat muss damit für die jeweilige
Anwendung geprüft werden. Insbesondere beim Einsatz von PMA, dessen Aufnahme
aufgrund seiner erhöhten Ladung bereits vermindert ist, erzielt eine niedrige Temperatur
einen gegenteiligen Effekt. Dies konnte in Versuchen mit hitzeinaktivierten Salmonella- und
Listeria-Zellen, bei denen die Inkubation bei 0°C die geringste Signalunterdrückung aufwies,
bestätigt werden (Nkuipou-Kenfack et al. 2013). Da im vorliegenden Assay keine
signifikanten Schädigungen durch den Farbstoff bei verlängerter Inkubationszeit beobachtet
werden konnte, ist eine Inkubation bei 0°C nicht notwendig. Für die verbesserte Diffusion der
Agenz wurde die Dunkelphase bei Raumtemperatur durchgeführt.
Weitere wichtige Faktoren zur erfolgreichen Beseitigung der DNA abgetöteter Organismen
sind der Trübungsgrad der Lösung und die Anzahl an inaktivierten Zellen sowie die Auswahl
einer geeigneten Lichtquelle und der Belichtungszeit (Fittipaldi et al. 2012).
6 Die exakte Konzentration und die Art des Farbstoffs können aus patentrechtlichen Gründen nicht
genannt werden.
4 DISKUSSION
85
Das Verhältnis von lebenden und inaktivierten Zellen beeinflusst die Quantifizierung des
Lebendanteils: in verschiedenen Studien – vorwiegend mit PMA und Bakterien durchgeführt
- konnte beobachtet werden, dass bei einem Überfluss an toten Zellen (> 3 Log10) zu wenig
Farbstoff zur Bindung an die DNA zur Verfügung steht (Fittipaldi et al. 2012). Der
Lebendanteil würde infolge der unzureichenden Signalunterdrückung überschätzt (Fittipaldi
et al. 2012). Bei Erwartung sehr hoher Zahlen an inaktivierten Zellen sollte daher eine
Erhöhung der Farbstoffkonzentration in Erwägung gezogen werden.
Der Trübungsgrad ist abhängig von der Konzentration an Mikroorganismen und freien
Schwebstoffen in der Suspension. Die eingesetzte Lichtquelle muss für die erfolgreiche
kovalente Bindung an die DNA bzw. die Hydrolyse der freien Farbstoffmoleküle Zugang zum
Farbstoff finden und sollte nicht durch Schwebteilchen abgelenkt werden (Wagner et al.
2008; Fittipaldi et al. 2012). Bei sehr trübem Probematerial ist daher eine Verdünnung
sinnvoll, da sonst auch eine Beeinflussung bzw. Inhibition der PCR-Reaktion denkbar ist.
Als geeignete Lichtquelle werden Halogenlampen mit 500 – 750 W beschrieben, die mit
einem Abstand von 20 – 30 cm auf die Probe gerichtet sein sollten (Fittipaldi et al. 2012).
Aufgrund der enormen Hitzeentwicklung müssen die Proben auf Eis gestellt werden, um eine
Überhitzung des Probematerials zu vermeiden. Damit sind reproduzierbare Bedingungen
jedoch nicht realisierbar, da Wärmeentwicklung, Lichteinfall und Kühlungsgrad
unterschiedlich sein können. Zudem sind Resultate nur bedingt mit anderen Studien
vergleichbar, da je nach verwendeter Lampe auch andere Wellenlängen ausgesandt werden,
die dem Absorptionsmaximum des jeweiligen Farbstoffs verschieden genügen. Als
Alternative bieten sich LEDs (Abkz. light emitting diode) an, wie sie beispielsweise im PhAST
Blue verwendet werden. Es werden stets gleichbleibende Bedingungen geschaffen, da jede
Probe mit derselben Wellenlänge von einzelnen LEDs angestrahlt wird. Nach Ablauf der
Inkubationszeit stellt sich das System automatisch ab. Eine Kühlung der Proben ist nicht
notwendig.
Je nach verwendeter Differenzierungsmethode definiert sich der Begriff „lebensfähig― über
einen anderen Begriff (Nocker und Camper 2009). Die Lebend/Tot-Differenzierung per
interkalierenden Farbstoff ist über die Membranintegrität der Zelle gekennzeichnet. Sofern
der Farbstoff aufgrund von Membranschädigungen in das Zellinnere eindringen kann, ist sie
„nicht lebensfähig― (Nocker und Camper 2009). Bei der traditionellen mikrobiologischen
Anzucht wird die „Lebensfähigkeit― mit dem Begriff der Kultivierbarkeit gleichgesetzt. Dies
birgt jedoch die Gefahr, Zellen, die sich im viable-but-non-culturable-Stadium befinden, nicht
zu erfassen. Zellen dieses Stadiums weisen eine intakte Membran und metabolische
Aktivität auf, sind aber auf Standardmedien nicht kultivierbar und würden demnach nicht
detektiert werden (Bleve et al. 2003; Nocker und Camper 2009; Salinas et al. 2009;
Paparella et al. 2012). In der v-PCR werden sie allerdings nachgewiesen und quantifiziert, da
4 DISKUSSION
86
der Farbstoff nicht ins Zellinnere eindringen kann. Die benötigte Zeit bis zu den ersten
Analyseergebnissen ist mit der v-PCR natürlich deutlich verkürzt. Die mikrobielle
Untersuchung bedarf einer tage- oder wochenlangen Kultivierung der Proben auf z.T.
speziellen Nährmedien und verschiedenen Inkubationstemperaturen, um für die relevanten
Mikroorganismen auch geeignete Wachstumsbedingungen zu schaffen und ein korrektes
Abbild der Kontamination zu erhalten (Dlauchy et al. 1999; Arias et al. 2002; Bleve et al.
2003; Phister und Mills 2003; Casey und Dobson 2004; Hierro et al. 2006; Nocker und
Camper 2006).
Die Lebensfähigkeit definiert sich bei mRNA-Analysen über den Begriff der metabolischen
Aktivität, da der Expressionsgrad eines Gens untersucht wird (Nocker und Camper 2009).
Allerdings sind Genexpressionen vom Zellzustand (Zellstadium, Alter, Zelltyp usw.)
abhängig, so dass – vor allem in Mischkulturen - kaum reproduzierbare Resultate erhalten
werden. Des Weiteren lässt sich RNA nicht direkt nachweisen, sondern muss zunächst
mittels reverser Transkription in cDNA umgeschrieben werden, was wiederum von der
Enzymaktivität abhängig ist (Caradec et al. 2010). Um die Effektivität des Umschriebs in
verschiedenen Proben beurteilen zu können, ist ein zusätzlicher spezifischer Housekeeping-
Gen-Assay z.B. für β-Actin, der Unterschiede in differenten Cp-Werten anzeigen würde,
denkbar (Caradec et al. 2010). Damit würde sich jedoch der Analyseaufwand und
Materialeinsatz erhöhen. Außerdem wurde in neueren Studien gezeigt, dass auch
Housekeeping-Gene in vitro und in vivo große Variationen aufweisen können (Caradec et al.
2010). Zudem birgt die Handhabung von RNA stets die Gefahr der Kontamination mit RNA-
abbauenden RNasen und einem daraus resultierenden falschen Abbild des
Lebendkeimzahlgehaltes (Mülhardt 2009).
Abschließend bleibt festzuhalten, dass mit der ausgewählten Methode zur Lebend/Tot-
Differenzierung ein schnelles und leicht zu handhabendes Verfahren gefunden wurde. Mit
den vorliegenden Ergebnissen ist bewiesen worden, dass es möglich ist, das PCR-Signal
abgetöteter Zellen sowohl im Kulturmedium als auch in realer Probe vollständig zu
unterdrücken. Bei reinen Sporensuspensionen konnte die Detektion um 3 Log10-Stufen
verzögert werden. Eine vollständige Unterdrückung war aufgrund der möglichen
Thermotoleranz der Sporen nicht realisierbar. Die Anwendbarkeit der Methode sollte bei
besonders trüben Proben explizit untersucht werden, um eine mögliche Optimierung der
Farbstoffkonzentration und Inkubationsbedingungen vorzunehmen.
4 DISKUSSION
87
4.5 Beurteilung der Probenaufarbeitung
In der Getränkeindustrie finden sich verschiedene Anforderungen und Richtwerte für
Verfahren zum Nachweis von Pilzen. Zum einen wird häufig eine Unterscheidung zwischen
Hefen und Schimmelpilzen vorgenommen, zum anderen verlangen die verschiedenen
Produkttypen nach unterschiedlichen mikrobiologischen Nachweismethoden (Baumgart et al.
2012). Im Handbuch zu „Mikrobiologischen Untersuchungsmethoden in Lebensmitteln―
werden 7 Produkttypen vermerkt, die nach dem Ausgangsstoff und dem jeweiligen
Endprodukt hin unterteilt werden in (Baumgart et al. 2012):
1. Konservierte Halbware zur Herstellung von Limonaden und Brausen (z.B. Konzentrat,
Püree, Mark, Fruchtzubereitung)
2. Konservierte Halbware zur Herstellung von stillen Getränken (wie 1)
3. spezielle Zuschlagsstoffe (z.B. Dickungsmittel, Zuckersirup, Vitaminmischung)
4. fruchttrübe Getränke mit pH-Wert < 5 (z.B. Säfte, Nektare, Fruchtsaftgetränke,
Limonaden), zusätzl. Unterteilung in (nicht-)karbonisierte Produkte
5. klare Getränke mit pH-Wert < 5 (z.B. Limonaden, Brausen) und Spülwasserproben,
zusätzl. Unterteilung in (nicht-)karbonisierte Produkte
6. empfindliche Getränke mit pH-Wert > 5 (z.B. Gemüsesaft, Gemüsetrunk,
Mischgetränke)
7. Wasserproben.
In diese Kategorien lassen sich alle Getränkegattungen, wie sie in Abbildung 2 dargestellt
sind, einordnen. Bei den angewandten Verfahren handelt es sich um das klassische SSL-
Verfahren, bei dem nach einer Voranreicherung ein Teil der Flüssigkultur auf OFS-Agar
ausgegossen oder eine direkte Anzucht auf OFS vorgenommen wird, und die
Membranfiltration, bei der der Filter schließlich submers bzw. anaerob inkubiert wird
(Baumgart et al. 2012). Das eingesetzte Probevolumen und das Probe-Medium-Verhältnis
variieren beim SSL-Verfahren (20 bis 100 ml Probe zu 50 ml Medium) (Baumgart et al.
2012). Die Anreicherungsdauer beträgt drei bis sieben Tage. Mit der Unterscheidung von
Hefe- und Schimmelpilzen gehen auch verschiedene Richtwerte der mikrobiellen Belastung
einher. In einigen Produktgruppen ist eine geringe Hefekeimzahl erlaubt, während die
Abwesenheit von Schimmelpilzen gefordert ist. Die Richtwerte sind dabei auf das jeweilige
Endprodukt abgestimmt: so sollten CO2-freie Getränke grundsätzlich keimfrei sein, um ein
mikrobielles Wachstum im zuckerhaltigen Milieu auszuschließen, während in CO2-haltigen
Getränken aufgrund der wachstumsunfreundlichen Umgebung (Sauerstoffmangel, Säure
etc.) ein Richtwert von 10 Zellen/Sporen in 10 ml Probe angegeben ist (Baumgart et al.
2012). Das bisherige Standardverfahren für Schimmelpilze in alkoholfreien Getränken bedarf
einer sehr langen Inkubationszeit.
4 DISKUSSION
88
Mit der hier beschriebenen Probenaufarbeitung sollte ein vereinfachtes Verfahren zur
Detektion von Pilzen in alkoholfreien Getränken und deren flüssige Einsatzstoffe entwickelt
werden. Mit einer klaren Unterteilung in filtrierbare und nicht-filtrierbare Flüssigkeiten wurde
der Ausgangspunkt für zwei Systeme gelegt, die letztlich in einer identischen Aufarbeitung
münden. Der entwickelte PCR-Assay ermöglicht keine Identifikation von Pilzspezies, so dass
eine Unterscheidung von Hefen und Schimmelpilzen nicht möglich ist. Demzufolge können
die von Baumgart gelisteten Richtwerte nicht adaptiert werden (Baumgart et al. 2012).
Vielmehr ist der jeweils niedrigere Richtwert zu wählen und auf das Produkt anzuwenden,
um eine Erfüllung der Kriterien zu gewährleisten. Damit wird zudem ein weiterer Schritt zur
Reinheit des Produktes vorgenommen.
Stille Wässer und stille Mineralwässer mit Frucht werden einem Filtrationssystem zugeführt,
welches im Unternehmen entwickelt wurde. Dieses ermöglicht die parallele Untersuchung
von bis zu 12 Proben á 100 ml. Die Proben werden in sterile Schottflaschen umgefüllt,
welche mit einer Absaugeinheit verbunden sind. Mittels einer Pumpe wird die Flüssigkeit aus
der Flasche in einen Abfallbehälter befördert, wobei sie jeweils einen Filter mit 0,2 µm
Porengröße passiert. Der Filter wird anschließend aus dem Filterhalter unter sterilen
Bedingungen entnommen und direkt der Probenaufarbeitung zugeführt. Beim Einbringen in
das StarPrepTwo-Gefäß ist darauf zu achten, dass die Filteroberseite mit den potentiellen
Mikroorganismen ins Gefäßinnere zeigt, damit eine vollständige Benetzung dieser mit der
Reagent-D-Reagenz gewährleistet ist. Bei der Zugabe des Farbstoffs kann der Filter auch
mit der Flüssigkeit abgespült werden. Während der Dunkelinkubation sollte das Gefäß
regelmäßig gewendet werden, um die Benetzung aufrechtzuerhalten. Nach der Photolyse
erfolgen die mechanisch-thermische DNA-Extraktion sowie die PCR-Analytik. Mit dieser
Untersuchungsmethode kann ein großes Probevolumen ohne vorherige Verdünnungsschritte
analysiert werden. Damit ist der Nachweis von sehr kleinen Keimbelastungen möglich. So
konnten unter Einsatz einer dekadisch verdünnten Aspergillus-brasiliensis-
Sporensuspension selbst 1,5x101 KBE in 100 ml Volumen vollständig wiedergefunden
werden. Mittels Korrelation der Verdünnungsreihe mit einer Standardkurve des
Positivkontrollplasmids über den Multiple-Experiment-Analysis-Modus der Stratagene-
Software MxPro, der den Vergleich verschiedener PCR-Läufe ermöglicht, konnten die
Quantifizierung und der Vergleich zur mikrobiologischen Anzucht erfolgen. Diese hat
bestätigt, dass beide Verfahren vergleichbare Resultate hervorbringen. Unter Einhaltung der
beschriebenen Vorgehensweise tritt kein messbarer Verlust an Probematerial ein, z.B. durch
das Hängenbleiben am Filter, so dass aussagekräftige Ergebnisse in der PCR erhalten
werden. Dieses Verfahren ist somit zur quantitativen, aber auch zur qualitativen Analyse
geeignet und könnte auch für Limonaden und Brausen vor der Karbonisierung durchgeführt
werden.
4 DISKUSSION
89
Nicht-filtrierbare Flüssigkeiten wie Zuckersirupe, Fruchtkonzentrate oder Pürees werden dem
zweiten Verfahren zugeführt, bei dem insgesamt weniger Probevolumen analysiert und das
Produkt je nach Anforderung zunächst vorangereichert wird. Eine Voranreicherung wird in
den Fällen durchgeführt, in denen die mikrobielle Reinheit des Produktes bestätigt werden
muss. Dies ist nach Baumgart für die Gruppen der konservierten Halbwaren (1), der
fruchttrüben (4) und klaren Getränke (5) sowie der empfindlichen Getränke (6) der Fall
(Baumgart et al. 2012). Für die Voranreicherung kann SSL-Medium, aber auch ein anderes
geeignetes Medium wie z.B. YM herangezogen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die
Anreicherung mit SSL vorgenommen. Da es sich häufig um viskose, farbintensive oder mit
Schwebstoffen (z.B. Fruchtfleisch) versetzte Flüssigkeiten handelt, wird mit der Zugabe zum
Medium auch ein erster Verdünnungsschritt erzielt. Die Inkubation sollte – in Abhängigkeit
vom erwarteten Organismus – bei 27-30°C für 24h erfolgen. Ein Versuch mit 7
verschiedenen Brauereieinsatzstoffen (z.B. Apfel- und Colagrundstoff) hat zeigen können,
dass eine Dotierung mit 2 KBE der Hefe Saccharomyces cerevisiae bereits nach 24 h
eindeutig nachweisbar ist. Die genaue Auswertung der Agarplatten war aufgrund der hohen
Koloniezahlen nicht möglich. Vor dem Einbringen in die PCR wurden die Lysate nochmals
1:10 verdünnt, um Inhibitionen der Reaktion zu vermeiden. Durch diesen zusätzlichen
Verdünnungsschritt muss eine Probe mit mindestens 500 KBE kontaminiert sein, damit der
LOD von 1,56 GÄ erreicht und eine eindeutig positive Aussage erzielt werden kann7. In
Proben, die nicht zusätzlich verdünnt werden müssen, z.B. kohlensäurehaltige Wässer, wird
bei 50 KBE je Aufarbeitung (je 100µl) der Befall eindeutig identifiziert.
Diejenige Zeit, die benötigt wird, um eine potentielle Kontamination eines Produktes soweit
fortschreiten zu lassen, dass sie in der PCR detektiert wird, ist vom Keim und dem
umgebenden Milieu abhängig. Ein Versuch mit 4 verschiedenen Hefen (S. cerevisiae, Z.
bailii, Y. lipolytica und C. parapsilosis) und 3 Matrices (Bananennektar, Johannisbeer- und
Multivitaminfruchtsaftkonzentrat) konnte die kurze Anreicherungsdauer von S. cerevisiae
nochmals bestätigen (1x100 bis 4x10
0 KBE in 100ml). Yarrowia lipolytica ließ sich bei einem
Dotierungslevel von 101 KBE in allen Matrices ebenfalls nach 24 h nachweisen. Candida
parapsilosis wuchs in Johannisbeerfruchtsaftkonzentrat etwas verlangsamt: nach 24 h
konnte nur die mikrobielle Anzucht die Kontamination anzeigen. Mit gezählten 250 KBE trat
hier der soeben beschriebene Effekt ein: durch den zusätzlichen Verdünnungsschritt reicht
die in die PCR gelangende DNA-Menge nicht mehr aus, um eine Kontamination anzuzeigen,
da die Detektionsgrenze unterschritten wurde. Inwieweit gestresste Keime angereichert
werden können, lässt sich anhand des Keims Z. bailii in diesem Versuch erkennen: die bei
7 Befinden sich 500 KBE in einem StarPrepTwo-Gefäß mit 640 µl Gesamtvolumen, entspricht dies
0,8 GÄ/µl. Eine 1:10-Verdünnung ergibt 0,08 GÄ/µl. Mit 25µl PCR-Volumen gelangen rechnerisch 2 GÄ in die Reaktion.
4 DISKUSSION
90
4°C gelagerte Stammkultur der Hefe zeigt sehr langsames Wachstum in der Anreicherung
unter optimalen Bedingungen. In der PCR kann der Keim nur in 2 von 6 Proben
nachgewiesen werden, während die mikrobielle Anzucht bei allen dotierten Proben
Koloniewachstum bestätigt. Allerdings betrug die Inkubation bis zur Auswertung der Platten
eine Woche, was für Hefen ein ungewöhnlich langer Zeitraum ist. In vorhergehenden
Experimenten waren die Hefekolonien von Z. bailii nach 1-2 Tagen bereits gut auswertbar.
Die lange Inkubationszeit unterstützt demnach die Annahme einer gestressten Kultur. Es ist
denkbar, dass die Zellen geschädigt waren und bei der Lebend/Tot-Differenzierung den
Farbstoff ins Zellinnere aufnahmen, wodurch ihre DNA nicht mehr amplifizierbar war. Hier
stößt die PCR-Analytik an ihre Grenzen, da sich die Zellen z.B. nach der Sterilisation in der
PCR nicht nachweisen ließen, aber die Gefahr besteht, dass sie sich über einen längeren
Zeitraum im nährstoffreichen Milieu des Produktes regenerieren und später auch
reproduzieren können. Genau dies tritt bei der Voranreicherung ein, wodurch die Zellen nach
dem Ausplattieren und der weiteren Inkubation unter optimalen Bedingungen anhand des
Koloniewachstums nachweisbar sind. An dieser Stelle können schließlich nur die
regelmäßige Produktkontrolle über einen definierten Zeitraum, bevor das Produkt in den
Handel gelangt, oder eine stufenweise Hitzeinaktivierung der Keime den Nachteil der
Lebend/Tot-Differenzierung ausgleichen. Der Versuch zur Sporeninaktivierung (Kapitel 3.10
und 4.4) hat allerdings aufgezeigt, dass auch die Mikrobiologie falsche Abbilder der
Kontamination nach einer Sterilisationsmaßnahme darstellen kann. Hier wurde die
hitzeinaktivierte Sporensuspension direkt ausplattiert, wodurch die Sporen nicht in die
Regenerationsphase eintraten und demnach auch unter den angegebenen
Inkubationsbedingungen keine Kolonien wuchsen. Die Kombination des SSL-Verfahrens mit
der entwickelten DNA-Extraktionsmethode führt zu einer enormen Zeitersparnis, die ein
frühzeitiges Eingreifen in den Produktionsprozess ermöglicht.
Die Wiederfindungsrate dieser zweiten Aufarbeitungsmethode wurde durch die Dotierung mit
1x104 KBE (S. cerevisiae) mit den 7 Brauereieinsatzstoffen, die bereits in SSL-Medium
verdünnt wurden, untersucht. Ein direktes Überführen in die PCR nach der Lyse ermöglichte
nur bei den klaren Flüssigkeiten (Zitronenaroma, Vitaminmischung und Invertzucker) den
Nachweis des Keims. Wurden die Lysate wiederum verdünnt in die PCR eingesetzt, konnte
bei allen Matrices die Hefe detektiert werden. Sehr trübe oder dunkle Einsatzstoffe und
Halbwaren sollten demnach immer 1:100 verdünnt (1:10 in Medium sowie nochmals 1:10 in
die PCR) der PCR-Reaktion zugeführt werden, um Inhibitionen auszuschließen.
Sowohl PCR-Mastermix als auch StarPrepTwo-Reagenz enthalten Stoffe, die der
Vermeidung von Inhibitionen dienen. Der Lysepuffer enthält Chelex® 100, ein
Styrendivinylbenzen-Copolymer mit Iminodiacetationen, welches aufgrund seiner hohen
Affinität zu polyvalenten Metallionen diese binden kann (BIO-RAD Laboratories Instruction
4 DISKUSSION
91
Manual). Zudem zeichnet sich das Chelex-Harz durch eine hohe Alkalinität aus, welches
während der thermischen Lyse zur Destabilisierung der Zellmembran führt und gleichzeitig
die DNA vor Degradation schützt (Walsh et al. 1991; Möhlenhoff et al. 2001). Um
freiwerdende Phenole, die einer Studie von Mullen zufolge vor allem in Trauben-,
Granatapfel-, Moosbeeren- und trübem Apfelsaft vorkommen, effektiv abzufangen, enthält
der Lysepuffer zudem Polyvinylpolypyrrolidon (Abkz. PVPP) (Mullen et al. 2007; Demeke
und Jenkins 2010). Phenole können mit Magnesiumionen, die als Cofaktoren für die DNA-
Polymerase dienen und damit für die Enzymaktivität grundlegend sind, Komplexe bilden,
was zu Inhibitionen oder dem Ausfall der PCR-Reaktion führen kann (Wilson 1997). Der
PCR-Reaktionsmix beinhaltet außerdem bovines Serumalbumin (Abkz. BSA), welches
ebenfalls die von Phenolen ausgehenden Inhibitionen vermindern kann (Garland et al. 2010).
Mit diesen drei Reagenzien ist das System, das in sehr dunklen Matrices aufgrund des
notwendigen Verdünnungsschritts an Sensitivität verliert, robust. Anhand der
implementierten Amplifikationskontrolle des PCR-Reaktionsmixes können auftretende
Inhibitionen erkannt werden. Es ist denkbar, dass die Zentrifugation der Probe und die
Abnahme des Überstandes vor Zugabe des StarPrepTwo-Puffers eine Verringerung bzw.
Beseitigung der inhibitorischen Effekte mit sich brächte. Allerdings geht mit dieser
Vorgehensweise die erhöhte Gefahr der Kreuzkontamination einher. Mit dem derzeitigen
Verfahren muss das Probegefäß nur einmalig für die Zugabe der Probe und des Reagent-D
geöffnet werden.
Das vorliegende Verfahren nutzt das Prinzip der mechanisch/thermischen Lyse, bei dem die
Zellen zunächst durch Kugeln aufgebrochen werden. Die Effizienz des Aufschluss ist dabei
abhängig von der Kollisionsrate und der Aufprallenergie – beides ist abhängig von der
Geschwindigkeit – sowie der Schwere des Kugelmaterials (Müller et al. 1998; Klimek-Ochab
et al. 2011). Pilzzellwände bestehen aus mehreren Schichten quervernetzter Chitin-, β-
Glucan-, Lipid- und Peptidmoleküle, wodurch sie widerstandsfähiger sind als die
Zellmembranen aus Lipiddoppelschichten anderer Organismen (Karakousis et al. 2006). Da
in den Produkten vorwiegend vegetative Zellen und Sporen vorkommen, konnten die
StarPrepTwo-Beads (0,1 mm) gewählt werden, die eine möglichst große Kollisionsfläche
schaffen. Um alle Zellen/Sporen aufzuschließen, wurde bei Verwendung des MagNA Lysers
die höchste Umdrehungsgeschwindigkeit eingestellt. Bei der Extraktion intrazellulärer
Bestandteile (Proteine, DNA etc.) aus Schüttelkulturen oder festen Nährmedien werden
dagegen großflächig verzweigte Konidien und Hyphen zersetzt, so dass eher größere und
dementsprechend schwerere Beads eingesetzt werden (Klimek-Ochab et al. 2011).
Die thermische Lyse unterstützt den mechanischen Aufschluss und führt zur Denaturierung
der freiwerdenden Proteine. DNA-abbauende Enzyme wie DNasen würden sonst die
Kontamination in der PCR falsch abbilden. Neben den wenigen Prozessschritte, dem
4 DISKUSSION
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geringen Material-, Geräte- und Arbeitsaufwand zeichnet sich das Verfahren durch seine
Effizienz für Hefen und Schimmelpilzen (quantitative Bestimmung für Sporen und vegetative
Zellen, qualitative Bestimmung für Hyphen) aus.
Neben dem hier vorgestellten Verfahren existieren natürlich eine Reihe anderer
Aufschlussmethoden. Karakousis et al. haben in einer Studie die Effizienz verschiedener
Methoden anhand einiger Pilzspezies u.a. mikroskopisch verglichen (Karakousis et al. 2006).
Sie konnten zeigen, dass die Effizienz einer Lyse mit den zellwandabbauenden Enzymen
Proteinase K bzw. Lyticase morphologieabhängig ist: in Spezies, die vorwiegend in
Konidienform vorliegen (hier: A. fumigatus), werden nur 10% der Kultur aufgeschlossen,
während hefeartige Zellen (hier: C. albicans) bis zu 100% lysiert werden können.
Reproduzierbare Resultate können somit nicht erzielt werden. Bereits Müller konnte
feststellen, dass die Konidien filamentöser Pilze häufig resistent gegen den enzymatischen
Aufschluss sind (Müller et al. 1998). Enzyme bedürfen zudem einer langen Inkubationszeit,
wodurch sich der Zeitaufwand erhöht. Sie eignen sich daher lediglich als Hilfsstoffe anderer
Extraktionsmethoden (Karakousis et al. 2006). Chemische Aufschlussmethoden mit Säuren
bzw. Laugen sind ebenfalls zeitintensiv und für hohe Probenaufkommen ungeeignet. Zudem
besteht die Gefahr von DNA-Schädigungen (z.B. Depurinierung, Degradierung), welches die
Quantifizierung negativ beeinflusst (Karakousis et al. 2006). Eine Kombination aus flüssigem
Stickstoff und dem mechanischen Aufschluss mittels Mörser und Pistille mit anschließender
Phenol-Chloroform-Fällung zeigt sehr gute Resultate für Konidien und Hyphen (bis 100%
Lyseeffizienz) (Karakousis et al. 2006). Allerdings ist dieses Verfahren nur für größere
Probevolumina (z.B. Kulturen aus Fermentern) und geringen Probezahlen anwendbar. Die
Phenol-Chloroform-Extraktion, die der Ausfällung der störenden Proteine dient, muss
zwingend unter einem Laborabzug durchgeführt werden, da Phenol zu starken Reizungen
der Atemwege führen kann und Chloroform betäubend wirkt. Die Entsorgung organischer
Lösungsmittel ist aufwendig und teuer (Mülhardt 2009). Zudem müssen Mörser und Pistille
nach jeder Extraktion aufwendig gereinigt werden, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
In den letzten Jahren wurden vermehrt DNA-Extraktionsverfahren aus schwierigen Matrices
mit Einsatz von Magnetic Beads entwickelt (Mülhardt 2009). Sie spielen vor allem im Bereich
der Laborautomation eine große Rolle, können aber auch händisch als Einzelreaktion
angewandt werden. Die paramagnetischen Kugeln können sich frei in der Lösung bewegen
und freiliegende DNA über ihre positive Ladung an sich binden (Mülhardt 2009). Führt man
einen Magneten an die Gefäßwand, werden die beladenen Beads an dieser Stelle
konzentriert, so dass Waschschritte ohne Verlust an Kugeln mehrfach durchgeführt werden
können. Nach Zugabe eines Elutionspuffers wird die DNA in den Puffer abgegeben, wobei
ein geringer Anteil an den Kugeln verbleiben kann. Der Verlust beträgt in – ähnlich wie bei
Silica/Glasmilch-Membranen - etwa 5-10%, kann aber durch die Menge an eingesetzten
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Kügelchen verringert werden (Mülhardt 2009). Magnetic Beads sind wesentlich teurer als
einfache Kügelchen und benötigen spezielle, magnetische Reaktionsgefäßständer. Für die
Laborautomation sind zudem Roboter notwendig, deren Anschaffung nicht für jedes Labor
rentabel ist. Es ist jedoch möglich, dass unter Verwendung dieser Methode eine bessere
Sensitivität in den dunklen, trüben Probenmatrices erzielt werden könnte, da die gebundene
DNA mehreren Reinigungsschritten zugeführt werden könnte. PCR-inhibierende Stoffe
können damit beseitigt werden.
Im Vergleich zu den aufgeführten Verfahren ist das entwickelte Probenaufarbeitungssystem
durch seine zeitsparende und einfache Handhabung, den geringen Gerätebedarf und dem
geringen Kostenaufwand hervorzuheben. Die Gefahr von Kreuzkontaminationen ist auf ein
Minimum reduziert worden. Das System ist robust und auch in Anwesenheit einer hohen
Konzentration von Begleitorganismen stabil.
4.6 Ausblick
Mit dem Real-time-PCR-Assay und dem Probenaufarbeitungssystem inklusive Lebend/Tot-
Differenzierung kann ein Nachweis von lebensfähigen Pilzen in alkoholfreien Getränken
erzielt werden. Die DNA-Extraktion kann dabei individuell angepasst werden: die Dauer der
Anreicherungsphase kann in Hinblick auf sehr langsam wachsende Keime verlängert bzw.
für sehr schnell wachsende Hefen verkürzt werden; das Filtrationsvolumen kann
herabgesetzt werden. Das entwickelte Extraktionsprotokoll kann als Grundgerüst für die
Adaption auf weitere Lebensmittelmatrices dienen. So kann das Verfahren für den Nachweis
von Pilzen in Milch-, Fleisch- und Fischerzeugnissen sowie Getreideprodukten ausgeweitet
werden. Insbesondere schwierige Matrices, bei denen eine PCR-Inhibition auftreten kann,
sollten mit automatischen Systemen aufgearbeitet werden. Dies führt zu einem geringeren
Arbeitsaufwand und kann in einer Sensitivitätssteigerung münden. Es ist denkbar, dass die
Anreicherungszeit nochmals reduziert werden könnte.
Um das universelle Nachweisverfahren als solches bestätigen zu können, müssen
fortlaufend relevante Keime mit dem Real-time-PCR-Assay untersucht werden. Eine
Optimierung der Primer- und Sondensequenzen kann notwendig sein, sofern ein
Verderbsorganismus mit den bisherigen Oligonukleotiden wiedererwartend nicht identifiziert
werden sollte. Weiterhin besteht die Möglichkeit, das System auf weitere
Organismusgruppen zu erweitern. Ein universelles Gesamtnachweissystem für Pilze und
Bakterien ist denkbar: eine Quantifizierung und Identifikation könnte über verschiedene
Fluoreszenzfarbstoffe realisiert werden.
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MANUALS
BIO-RAD Laboratories: Chelex® 100 and Chelex 20 Chelating Ion Exchange Resin – Instruction
Manual; Download: 04.05.2014
ANHANG
XXV
ANHANG
I. Alignment der 28S-rDNA-Sequenzen repräsentativer Pflanzen von Position 120-
1080 unter Angabe der Primerpositionen
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
125 135 145 155 165 175
M11585O.sativa GCGCGACCCC AGGTCAGGCG GGACTACCCG TCCGAATTGT AGTCTGGAGA GGCGTCCTCA
AY049041T.aest TGAG------ AATCGGGCGG CTGTGCC--G TCCGAATTGT AGTCTGGAGA GGCGTCCTCA
AY686777H.lupu --AG------ AATCGGACGT CTTCGGC--G TTCGAATTGT AGTCTGAAGA AGCGTCCTCA
AY189058D.caro TGAA------ AATTGAGCAG CTACGCT--G TTCAAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTGTTCA
AY727975C.sine TGAA------ AATCGAGCGA CCCCGTCG-- TTCGAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA
AY177420C.aura TGAA------ AATCGGGCGC CCCCGGCG-- TCCGAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA
X05910C.lemon TGAA------ AATCGGGCGC CCCCGGCG-- TCCGAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA
AF479108C.pepo TGAG------ AATCGGGCGC CCTCGGCG-- TTCGAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA
EF135611E.coca TGAG------ AATCGGATGC CCCTGGTG-- TTCGAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA
X58118F.anana TGAG------ AATCTGGCGC CGCCGCG--T GCCGAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA
AF479172N.taba TTAG------ AATCGGGCGG CTCCGCC--G TTCGAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA
EU161982S.lyco TTAG------ AATCGGGCGG CTCCGTC--G TCCGAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA
DQ122982P.edul TGAG-A---- -ATCGGGCGC CCCCGGCG-- TCCGAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA
VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------T AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA
VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
185 195 205 215 225 235
M11585O.sativa GCG-ACGG-A CCGGGCCCAA GTCC-CCTAG AAAGGGGCGC CTGGGAGGGT GAGAGCCCCG
AY049041T.aest GCG-ACGG-A CCGGGCCCAA GTCC-CCTGG AAAGGGGCGC CTGGGAGGGT GAGAGCCCCG
AY686777H.lupu GCG-GCGG-A CCGGGCCCAA GTCC-CCTGG AAAGGGGCGC CGGAGAGGGT GAGAGCCCCG
AY189058D.caro GTG-ACGG-A CCGGGCCCAA GTCC-CCTGG AAGGGGTCGC CAGAGAGGGT GAGAGCCCCG
AY727975C.sine GCG-GCGG-A CCGGGCCCAA GTCC-CCTGG AAAGGGGCGC CGGAGAGGGT GAGAGCCCCG
AY177420C.aura GCG-GCGG-A CCGGGCCCAA GTCC-CCTGG AAAG-GGCGG CGGAGAGGGT GAGAGCCCCG
X05910C.lemon GCG-GCGG-A CCGGGCCCAA GTCC-CCTGG AAAG-GGCGG CGGAGAGGGT GAGAGCCCCG
AF479108C.pepo GCG-ACGG-A CCGGGCACAA GTCC-CCTGG AAGGGGGCGC CAGAGAGGGT GAGAGCCCCG
EF135611E.coca GCG-GCGG-A CCGGGCTCAA GTCC-CCTGG AAGGGGGCGC CGGAGAAGGT GAGAGCCCCG
X58118F.anana GCGTACGGTA TCGGGAACAA CTCCC--TGG AA--GGGCGC CGCAGAGGGT GAGACCCCCC
AF479172N.taba GCGGCGG--A CCGGGCCCAA GTCC-CCTGG AAGGGGGCGC CAGAGAGGGT GAGAGCCCCG
EU161982S.lyco GCGGCGG--A CCGGGCCCAA GTCC--CTGG AAGG-GGCGC CGGAGAGGGT GAGAGCCCCG
DQ122982P.edul GCGGCGG--A CCGGGCCCAA GTCC-CCTGG AAGGGGGCGC CGGAGAGGGT GAGAGCCCCG
VegFw1 GC-------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
245 255 265 275 285 295
M11585O.sativa TCCG-GCCCG GAC--CCTGT CGCCCCACGA GGCGCCGTCA ACGAGTCGGG TTGTTTGGGA
AY049041T.aest TCCG-GCCCG GAC--CCTGT CGCCCCACGA GGCGCCGTCA ACGAGTCGGG TTGTTTGGGA
AY686777H.lupu T-CGTGCCCG GAC--CCTGT CGCACCACGA GGCGCTGTCG GCGAGTCGGG TTGTTTGGGA
AY189058D.caro T-CGTGCCCG GAC--CCTGT TGCACCACGA GGCGCTGTCT ACGAGTCGGG TTGTTTGGGA
AY727975C.sine T-CGTGCCCG GAC--CCTGT CGCACCACGA GGCGCTGTCC GCGAGTCGGG TTGTTTGGGA
AY177420C.aura T-CGCGCCCG GAC--CCTGT CGCACCACGA GGCGCTGTCT GCGAGTCGGG TTGTTTGGGA
X05910C.lemon T-CGCGCCCG GAC--CCTGT CGCACCACGA GGCGCTGTCT GCGAGTCGGG TTGTTTGGGA
AF479108C.pepo T-TGCGCTCG GAC--CCTGT CGCACCACGA GGCGCTGTCA ACGAGTCGGG TTGTTTGGGA
EF135611E.coca T-CGTGCCCG GAC--CCTGT CGCACCACGA GGCGCTGTCT GCGAGTCGGG TTGTTTGGGA
X58118F.anana GTTGTGCCCG GAC--CCTGT CGCACCACGA GGCGCTGTCG GCGAGTCGGG TTGTTTGGGA
AF479172N.taba T-TGTGCCCG GAC--CCTGT CGCACCACGA GGCGCTGTCT ACGAGTCGGG TTGTTTGGGA
EU161982S.lyco T-CGTGCCCG GAC--CCTGT CGCACCACGA GGCGCTGTCT ACGAGTCGGG TTGTTTGGGA
DQ122982P.edul T-CGTGTCCG GACC--CTGT CGCATCACGA GGCGCTGTCT ACGAGTCGGG TTGTTTGGGA
VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
305 315 325 335 345 355
M11585O.sativa ATGCAGCCCA AATCGGGCGG TAAACTCCGT CC-AAGGCTA AATACAGGCG AGAGACCGAT
AY049041T.aest ATGCAGCCCA AATCGGGCGG TAGACTCCGT CC-AAGGCTA AATACAGGCG AGAGACCGAT
AY686777H.lupu ATGCAGCCCC AATCGGGCGG TAAATTCCGT C-CAAGGCTA AATACGGGCG AGAGACCGAT
AY189058D.caro ATGCAGCCCC AATCGGGCGG TAAATTCCGT C-CAAGGCTA AATACAGGCG AGAGACCGAT
AY727975C.sine ATGCAGCCCT AATCGGGCGG TAAATTCCGT CC-AAGGCTA AATACGGGCG AGAGACCGAT
AY177420C.aura ATGCGGCCCA AATCGGGCGG TAAATTCCGT CC-AAGGCTA AATACGGGCG AGAGACCGAT
X05910C.lemon ATGCGGCCCA AATCGGGCGG TAAATTCCGT CC-AAGGCTA AATACGGGCG AGAGACCGAT
AF479108C.pepo ATGCAGCCCC AATCGGGCGG TAAATTCTGT CC-AAGGCTA AATATGGGCG AGAGACCGAT
EF135611E.coca ATGCAGCCCA AATCGGGCGG TAAATTCCGT CC-AAGGCTA AATACGGGCG AGAGACCGAT
X58118F.anana ATGCAGCCCC AATAGGGCGG TAAATTCCGT CC-AAGGCTA AATACGGGCG AGAGACCGAT
AF479172N.taba ATGCAGCCCA AATCGGGCGG TGAATTCCGT CC-AAGGCTA AATACGGGCG AGAGACCGAT
EU161982S.lyco ATGCAGCCCA AATCGGGCGG TGAATTCCGT CC-AAGGCTA AATACTGGCG AGAGACCGAT
DQ122982P.edul ATGCAGCCCC AATCGGGCGG TAAATTCCGT CC-AAGGCTA AATACGGGCG AGAGGCCGAT
VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
ANHANG
XXVI
VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
365 375 385 395 405 415
M11585O.sativa AGCGAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT
AY049041T.aest AGCGAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT
AY686777H.lupu AGCAAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT
AY189058D.caro AGCAAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT
AY727975C.sine AGCAAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT
AY177420C.aura AGCAAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT
X05910C.lemon AGCAAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT
AF479108C.pepo AGCAAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAATAGT
EF135611E.coca AGCGAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAACAGT
X58118F.anana AGCAAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT
AF479172N.taba AGCGAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT
EU161982S.lyco AGCGAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT
DQ122982P.edul AGCAAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT
VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
425 435 445 455 465 475
M11585O.sativa GCTTGAAATT GCCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GGCCGGCGAT G--CCCCGGC
AY049041T.aest GCTTGAAATT GCCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GGCCGGCGAT GCGCCCCGGC
AY686777H.lupu GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GGCCGGCGAT GCGCTCCGGT
AY189058D.caro GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GATCGGCGAT GCGCCCCGGT
AY727975C.sine GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GGCTGGCGAT GCGCCCCGGT
AY177420C.aura GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GGCCGGCGAT GCGCCCCGGT
X05910C.lemon GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GGCCGGCGAT GCGCCCCGGT
AF479108C.pepo GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GGCCGGCGAT GTGCTCCAGT
EF135611E.coca GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGAA--- ------TGGG GGCCGGCGAT GCGCCTCGGT
X58118F.anana GCTTGAAATT GTCGGGAGGG CAAAGCC--- -G-----ATG GGCCGGCGAT GCGCCCCGGT
AF479172N.taba GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GGCCGGCGAT GCGCCCCGGT
EU161982S.lyco GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGGA--- -T-----GGG GGCCGGCGAT GCGCCCCGGT
DQ122982P.edul GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GGCCGGCGAT GCGTCCCGGT
VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
485 495 505 515 525 535
M11585O.sativa CGTATGC-GG AACGGCTTCG -GCTG-GTCC GTCGATCGGC TCGGGGCGTG GACTGTTGTC
AY049041T.aest CGTATGC-GG AACGGC--TC TTGCTGGTCC GCCG-----C TCGGNNNNNN NNNNNNNNNN
AY686777H.lupu CGGATGT-GG AACGGTGA-G AGCCG-GTCC GCCGATCGAC TCGGAGCGCG GACCGATGCG
AY189058D.caro CGGATGT-GG AACGGTGTCA AGCCG-GTCT GCCGATCGAC TCGGGGTGTG GACCTGTGCG
AY727975C.sine CGGATGT-GG AACGGCGTCC AGCCG-GTCC GCCGATCGAC TCGGGGCGTG GACCGGTGCG
AY177420C.aura CGGATGC-GG AACGGCGA-G AGCCG-GTCC GCCGATCGGC TCGGGGCGCG GACCGATGCG
X05910C.lemon CGGATGC-GG AACGGCGA-G AGCCG-GTCC GCCGATCGGC TCGGGGCGCG GACCGATGCG
AF479108C.pepo CGGATGT-GG AAAGGTGATA AGCCA-GTCC GCCAATCGAC TTGGGGCATG GACCGATGCG
EF135611E.coca CGGATGC-GG AACGGCGA-G AGCCG-GTCC GCCGATCGGC TCGGGGCGTG GACCGACGCG
X58118F.anana CGGATGT-GG AACGGTCAC- AGCCG-GTCC GCCGCTCGAC TCGGGGCGTG GACCGTTGCG
AF479172N.taba CGGATGT-GG AACGGTGACG AGCCG-GTCC GCCGATCGAC TCGGGGCGTG GACCAGCGTG
EU161982S.lyco CGGATGT-GG AACGGCGACG AGCCG-GTCC GCCGATCAGC TCGGGGCGTG GACCAGCGTG
DQ122982P.edul CGGATGC-GG AACGGCGAC- AGCCG-GTCT GCCGATCGGC TCGGGACGTG GACCGGTGCG
VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
545 555 565 575 585 595
M11585O.sativa CGGC---CGC GCCGGCGGCC AAAGCCCGGG GGCTC--CGC GCCCCCGGCA GCCGTCGTC-
AY049041T.aest NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNG CCGTCGTCGG
AY686777H.lupu GA---TTGGG GGGGCGGCCC AAGCCCGGGC TGTTGATA-T GCCTGTGGAG ATGTCGTCCC
AY189058D.caro GA---TTGGT GCGGCGGCCA AAGCCCGGGT TGTAGATA-C GCCTGTGGAG ACGCCGTCGC
AY727975C.sine GA---TCGGG GCGGAGGCCA AAGCCCGGGC AGTCGAAA-A GCCCGCGGAG ACGCCTTCGC
AY177420C.aura GA---TTGCG GCGGCGGCCC AAGCCCGGGC CTTCGATA-A GCCTGTGGAG ACGTCGTCAC
X05910C.lemon GA---TTGCG GCGGCGGCCC AAGCCCGGGC CTTCGATA-A GCCTGTGGAG ACGTCGTCAC
AF479108C.pepo GA---TTGAG ACGGCGGCCA AAGCCCAGGC CTTTGTTA-C GCTTGTGGAG ACGTCGTCGT
EF135611E.coca GG---TTGCG GGGGCGTCCC AAGCCCGGGC CTTTGATA-C GCCCGTGGAG ACGTCGCCCT
X58118F.anana GA---TTGCG GCGGCGGCCA AAGCCCGGGC TGTCGACATG --CCGTGGAG ACGTCGTCGA
AF479172N.taba GA---TTGGG GGGGCGGCCA AAGCCCGGGC TTTCGATAC- GCCCGTGGA- ACGCCGTCTC
EU161982S.lyco GA---TTGGG GGGGCGGCCA AAGCCCGGGC TCTCGATAC- GCCCGTGGA- ACGCCGTCTC
DQ122982P.edul GA---TCGGG GCGGCGGCCC AAGCCCGGGC TCTCGATA-C GCCCGCGGAC ATGCCGTCTC
VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
605 615 625 635 645 655
M11585O.sativa ---GGACGCA GCCGGTCACC GCGCGCCTCT ---GGCCGGC CCCTCGGGGC GTCGCGCC--
ANHANG
XXVII
AY049041T.aest CACGGCCGGT ACC------- -CGCGCGCCG AAAGGCGTGC CCCTCGGGGC ACTGCGCTG-
AY686777H.lupu CTCGATTGTG GAATACAG-C GCGCGCCG-T CTCGGCGTGC TTC---GGCA TCTGCGCGCT
AY189058D.caro GTCAATTGTG GTTGGCA--- GCACGCGCCT CTTGGCGTGC CT---CGGCA TCTGCGTGCT
AY727975C.sine CCCGATCGTG GCTGGCA--- GCGCGCGCCC TCGGGCGTGC TCC---GGCA TCTGCGCGCT
AY177420C.aura CGCGATCGTG GCTGGCA--- GCGCGCGCCT TCGGGCGTGC TTC--GCGCA CCTGCGCGCT
X05910C.lemon CGCGATCGTG GCTGGCA--- GCGCGCGCCT TCGGGCGTGC TTC--GCGCA CCTGCGCGCT
AF479108C.pepo CCCGATCGTG GCTGGCA--- GCACGCGCCT TTTGGCGTGC TTC---GGCA TCTGCGTGCT
EF135611E.coca CGCGATCGTG GAACACA--- GCGCGCGCCT TTGGCGCTCA C------GCA ---GCGCGCT
X58118F.anana CGCGATCATG GCTGGCA--- GCGCGCGCCT TCGGGCCTGC CTC---GCGA CCTGCGTGCT
AF479172N.taba CTTGATTGTG GTAGGCA--- GCGCGCGCCT CC-GGCGTGC TTC---GGCA TCTGCGCGCT
EU161982S.lyco CCCGATTGTG GAAGGCA--- GCGCGCGCCT CC-GGCGTGC TTC---GGCA TCTGCGCGCT
DQ122982P.edul CCCGATCGTG GATGGCAG-C GCGCGC-CGT CACGGCGTGC CTC---GGCA CCTGCGCGCT
VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
665 675 685 695 705 715
M11585O.sativa ----GCAACG GCCTGCGGGC TCCC-CATCC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC
AY049041T.aest -----CAACG CCCTGCGGGC TCCC-CATCC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC
AY686777H.lupu CCAGGCATCG GCCTGCGGGC TCCC-CATTC GGCCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC
AY189058D.caro CCTGGCACAG GCCTGCGGGT TCCC-CATTC GGCCCGTCTT GAA-CACGGA CCAAGGAGTC
AY727975C.sine CCCGGCGCCG GCCTGCGAGC TCCC-CATTC GGCCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC
AY177420C.aura CCCGGCATCG GCCTGCGGGC TCCCCCATTC GGCCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC
X05910C.lemon CCCGGCATCG GCCTGCGGGC TCCCCCATTC GGCCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC
AF479108C.pepo CCTGGCATCG GCCTGTGGGC TCCC-CATTC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC
EF135611E.coca CCTGGCGTCG GCCTGCGGGC TCCC-CATTC GGCCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC
X58118F.anana CCTGGTAACG GC-TGCGGGC TCCCC-ATTC GGCCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC
AF479172N.taba CCGGACGCTG GCCTGTGGGC TCCC-CATTC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC
EU161982S.lyco CCGGACGCTG GCCTGTGGGC TCCC-CATTC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC
DQ122982P.edul CCAGGCACCG GCCTGCGGGC TCCC-CATTC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC
VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
725 735 745 755 765 775
M11585O.sativa TGACATG-CG TGCGAGTCGA CGGGTTCTGA AACCTGGGAT GCGCAAGGAA GCTGACGAGC
AY049041T.aest TGACATG-CG TGCGAGTCGA CGGGTTCTGA AACCTGGGAT GCGCAAGGAA GCTGACGAGC
AY686777H.lupu TGACATG-TG TGCGAGTCAA CGGGCTAGTA AACCCGTAAG GCGCAAGGAA GCTGACTGGC
AY189058D.caro TGACATGT-G TGCGAGTCAA CGGGTGATTA AACCCGTAAG GCGCAAGGAA GCTGATTGGC
AY727975C.sine TGACATG-TG TGCGAGTCAA CGGGCGAGTA AACCCGTAAG GCGCAAGGAA GCTGACCGAC
AY177420C.aura TGACATG-TG TGCGAGTCAA CGGGCCAGTA AACCCGTAAG GCGCAAGGAA GCTGATTGGC
X05910C.lemon TGACATG-TG TGCGAGTCAA CGGGCCAGTA AACCCGTAAG GCGCAAGGAA GCTGATTGGC
AF479108C.pepo TGACATG-TG TGCGAGTTAA CGGGCGAGTA AACCCGTAAG GCGCAAGGAA GCTGACTGGT
EF135611E.coca TGACATG-TG TGCGAGTCAA CGGGCGAGTA AACCCGTAAG GCRYAAGGAA GCTGACTGGC
X58118F.anana TGACATGT-G TGCGAGTCAA CGGGTGATTA AACCCGTAAG GCGCAAGGAA GCTAATGCGC
AF479172N.taba TGACATG-TG TGCGAGTCAA CGGGCGAGTA AACCCGTAAG GCGTAAGGAA GCTGATTGGT
EU161982S.lyco TGACATG-TG TGCGAGTCAA CGGGCGAGTA AACCCGTAAG GCGTAAGGAA GCTGATTGGT
DQ122982P.edul TGACATGT-G TGCGAGTCAA CGGGCGAGTA AACCCGTAAG GCGCAAGGAA GCTGACTGGC
VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
785 795 805 815 825 835
M11585O.sativa GGGAGGCCCT CACG-----CCGCACCGCTGG CCGACCCTGA TCT-TCTGTG AAGGGTTCGA
AY049041T.aest GGGAGGCCCT CACG---GCC GCACCGCTGG CCGACCCTGA TCT-TCTGTG AAGGGTTCGA
AY686777H.lupu GGGATC--CC CTTGTGGGTT GCACCGCCGA CCGACCTTGA TCT-TCTGAG AAGGGTTCGA
AY189058D.caro GGGATCCCCC T--GTGGGGT GCACCGCCGA CCGACCTTGA TCT-TCTGAG AAGGGTTCGA
AY727975C.sine GGGATCCCCT CGCG---GTT GCACCGTCGA CCGACCTTGA TCT-TCTGAG AAGGGTTCGA
AY177420C.aura GGGATCCCTC GC----GGGT GCACCGCCGA CCGACCTTGA TCT-TCTGAG AAGGGTTCGA
X05910C.lemon GGGATCCCTC GC----GGGT GCACCGCCGA CCGACCTTGA TCT-TCTGAG AAGGGTTCGA
AF479108C.pepo GGGATCCCTT TGTG--GGTT GCACCACCGA CCGACCTTGA TCT-TTTGAG AAGGGTTCGA
EF135611E.coca GGGATCCCCT CGTG--GGTT GCACCGCCGA CCGACCTTGA TCT-TTTGAG AAGGGTTCGA
X58118F.anana GGGATCCCTT TAC---GGGT GCACCGCCGA CCGACCTTGA TCT-TCTGAG AAGGGTTCGA
AF479172N.taba GGGATCCCCC TGAG--GGGT GCACCGCCGA CCGACCTTGA TCT-TCTGTG AAGGGTTCGA
EU161982S.lyco GGGATCCCCT GA----GGGT GCACCGCCGA CCGACCTTGA TCT-TCTGAG AAGGGTTCGA
DQ122982P.edul GGGATCCCCT CCGAG-GGTT GCACCGCCGA CCGACCTTGA TCT-TCTGAG AAGGGTTCGA
VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
845 855 865 875 885 895
M11585O.sativa GTTGGAGCAC GCC-TGTCGG --GACC--CG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG
AY049041T.aest GTTGGAGCAC GCC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG
AY686777H.lupu GTGAGAGCAT GCC-TGTCGG --GACC--CG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG
AY189058D.caro GTGTGAGCAT TCC-TGTCGG --GACC--CG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG
AY727975C.sine GTGCGAGCAT GCC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG
ANHANG
XXVIII
AY177420C.aura GTGTGAGCAT GCC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG
X05910C.lemon GTGTGAGCAT GCC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG
AF479108C.pepo GTGTGAGCAT GCC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG
EF135611E.coca GTGAGAGCAT GCC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG
X58118F.anana GTGTGAGCAT GCC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG
AF479172N.taba GTGTGAGCAT ACC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG
EU161982S.lyco GTGTGAGCAT ACC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGC-GGGCG
DQ122982P.edul GTGAGAGCAT GCC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG
VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
905 915 925 935 945 955
M11585O.sativa AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCTCGA AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG
AY049041T.aest AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCTCGA AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG
AY686777H.lupu AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG
AY189058D.caro AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG
AY727975C.sine AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG
AY177420C.aura AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG
X05910C.lemon AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG
AF479108C.pepo AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG
EF135611E.coca AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG
X58118F.anana AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTC
AF479172N.taba AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG
EU161982S.lyco AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG
DQ122982P.edul AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG
VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
965 975 985 995 1005 1015
M11585O.sativa ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCATCTAG TAGCTGGTTC CCTCCGAA-G
AY049041T.aest ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCATCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG
AY686777H.lupu ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCATCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG
AY189058D.caro ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCGTCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG
AY727975C.sine ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCGTCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG
AY177420C.aura ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCGTCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG
X05910C.lemon ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCGTCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG
AF479108C.pepo ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCGTCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG
EF135611E.coca ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCGTCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG
X58118F.anana ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCGTCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG
AF479172N.taba ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCGTCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG
EU161982S.lyco AC--TTGGTA TAGG-GCGAA AGACTAATCG AACCGTCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG
DQ122982P.edul ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCATCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG
VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1025 1035 1045 1055 1065 1075
M11585O.sativa TTTCCCTCAG GATAGCT--G GAGCCCATTA CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA
AY049041T.aest TTTCCCTCAG GATAGCT--G GAGCCCATTA CGAGTTCTAT CAGGTAAAGC CAA-TGATTA
AY686777H.lupu TTTCCCTCAG GATAGCT-GG AGCTCGTAGA CGAGTTCTAT CAGGTAAAGC CAA-TGATTA
AY189058D.caro TTTCCCTCAG GATAGCTG-G AGCCCGGGTG CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA
AY727975C.sine TTTCCCTCAG GATAGCTG-G AGCCCGGGCG CGAGTTCTAT CAGGTAAAGC CAA-TGATTA
AY177420C.aura TTTCCCTCAG GATAGCTG-G AGCCCGGAAA CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA
X05910C.lemon TTTCCCTCAG GATAGCTG-G AGCCCGGAAA CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA
AF479108C.pepo TTTCCCTCAG GATAGCTG-G AGCCCGCGTG CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA
EF135611E.coca TTTCCCTCAG GATAGCTGG- -AGCTCGGCA CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA
X58118F.anana TTTCCCTCAG GATAGCTTGG AGCCCGTGAA CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA
AF479172N.taba TTTCCCTCAN GATAGCT-GG AGCTCGCGTG CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA
EU161982S.lyco TTTCCCTCAG GATAGCT-GG AGCTCGCGTG CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA
DQ122982P.edul TTTCCCTCAG GATAGCTGG- -AGCTCGGCA CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA
VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
VegRv1 ---------- ---------- ---------- CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CA--------
Abgebildet ist das Alignment verschiedener, lebensmittelrelevanter Pflanzenspezies mit den daraus abgeleiteten
Primersequenzen (gelb markiert). Die Sequenzen wurden der NCBI-Datenbank entnommen. Die Accession Numbers der
Einträge sind im Namen enthalten. Spezies: O.sativa: Oryza sativa; T.aest: Triticium aestivum; H.lupu: Humulus lupulus;
D.caro: Daucus carota; C.sine: Camellia sinensis; C.aura: Citrus aurantium; C.lemon: Citrus lemon; C.pepo: Cucurbita pepo;
E.coca: Erythroxylum coca; F.anana: Fragaria ananassa; N.taba: Nicotiana tabacum; S.lyco: Solanum lycopersicum; P.edul:
Passiflora edulis.
ANHANG
XXIX
II. Alignment der in den pGEM®-T-Vektor eingebrachten pflanzlichen 28S-rDNA-
Sequenzen
1 10 20 30 40 50 60
| | | | | | |
Insertsequenz Plasmid 2 ------GGCGATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATTTAGT
Insertsequenz Plasmid 3 TCTNNGGGCGATTGGGCC-GACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATTTAGT
Insertsequenz Plasmid 1 -----------------------------------------------ANTAGTGATTAGT
VegFw1 --------------------------------------------------------TAGT
VegRv1 ------------------------------------------------------------
61 70 80 90 100 110 120
| | | | | | |
Insertsequenz Plasmid 2 CTGGANNAGCGTCCTCAGCGACGGACCGGGCACAAGTCCCCTGGAAGGGGGCGCCAGAGA
Insertsequenz Plasmid 3 CTGGAGAAGCGTCCTCAGCGACGGACCGGGCACAAGTCCCCTGGAAGGGGGCGCCAGAGA
Insertsequenz Plasmid 1 CTG-AGAAGN-TCCTCAGCNN-GGACCGGGCCCA-GTCCCCTNGAAGGGG-CNCCGAGAG
VegFw1 CTGGAGAAGCGTCCTCAGC-----------------------------------------
VegRv1 ------------------------------------------------------------
121 130 140 150 160 170 180
| | | | | | |
Insertsequenz Plasmid 2 GGGTGAGAGCCCCGTTGCGCTCGGACCCTGTCGCACCACGAGGCGCTGTCAACGAGTCGG
Insertsequenz Plasmid 3 GGGTGAGAGCCCCGTTGCGCTCGGACCCTGTCGCACCACGAGGCGCTGTCAACGAGTCGG
Insertsequenz Plasmid 1 GNNNNAGAGCCCCGTTGNGCTCGGACCNNGTCGCACCACGAGGCGCTGTCGGCGAGTCGG
VegFw1 ------------------------------------------------------------
VegRv1 ------------------------------------------------------------
181 190 200 210 220 230 240
| | | | | | |
Insertsequenz Plasmid 2 GTTGTTTGGGAATGCAGCCCCAATCGGGCGGTAAATTCTGTCCAAGGCTAAATATGGGCG
Insertsequenz Plasmid 3 GTTGTTTGGGAATGCAGCCCCAATCGGGCGGTAAATTCTGTCCAAGGCTAAATATGGGCG
Insertsequenz Plasmid 1 GNNGTTTGG-AATGCAGCCCCAATCGGGCGGTAA-TTCCGTCCAAGGCTAAATATTGGCG
VegFw1 ------------------------------------------------------------
VegRv1 ------------------------------------------------------------
241 250 260 270 280 290 300
| | | | | | |
Insertsequenz Plasmid 2 AGAGACCGATAGCAAACAAGTACCGCGAGGGAAAGATGAAAAGGACTTTGAAAAGAGAGT
Insertsequenz Plasmid 3 AGAGACCGATAGCAAACAAGTACCGCGAGGGAAAGATGAAAAGGACTTTGAAAAGAGAGT
Insertsequenz Plasmid 1 AGAGACCGATAGCGAACAAGTACCGCGAGGGAAAGATGAAAAGGACTT-GAAAAGAGAGT
VegFw1 ------------------------------------------------------------
VegRv1 ------------------------------------------------------------
301 310 320 330 340 350 360
| | | | | | |
Insertsequenz Plasmid 2 CAAATAGTGCTTGAAATTGTCGGGAGGGAAGCGGATGGGGGCCGGCGATGTGCCCCAGTC
Insertsequenz Plasmid 3 CAAATAGTGCTTGAAATTGTCGGGAGGGAAGCGGATGGGGGCCGGCGATGTGCTCCAGTC
Insertsequenz Plasmid 1 CAAAGAGTGCTTGAAATTGTCGGGAGGGAAGCGGATGGGGGCCGGCGATGTGTCTCGGTC
VegFw1 ------------------------------------------------------------
VegRv1 ------------------------------------------------------------
361 370 380 390 400 410 420
| | | | | | |
Insertsequenz Plasmid 2 GGATGTGGAAAGGTGATAAGCCAGTCCGCCAATCGACTTGGGGCATGGACCGATGCGGAT
Insertsequenz Plasmid 3 GGATGTGGAAAGGTGATAAGCCAGTCCGCCAATCGACTTGGGGCATGGACCGATGCGGAT
Insertsequenz Plasmid 1 GGATGTGGAACGGTT-TGTGCCGGTCCGCCAATCGACTCGAGACATTGACCGACGCGGAT
VegFw1 ------------------------------------------------------------
VegRv1 ------------------------------------------------------------
421 430 440 450 460 470 480
| | | | | | |
Insertsequenz Plasmid 2 TGAGACGGCGGCCAAAGCCCAGGCCTTTGTTACGCTTGAGGAGACGTCGTCGTCCCGATC
Insertsequenz Plasmid 3 TGAGACGGCGGCCAAAGCCCAGGCCTTTGTTACGCTTGTGGAGACGTCGTCGTCCCGATC
Insertsequenz Plasmid 1 TGTGATGGTGGCCCAAGCCTGGGTTGTTGAGATGCTCGCGGAGACGTCATCATCACGATT
VegFw1 ------------------------------------------------------------
VegRv1 ------------------------------------------------------------
481 490 500 510 520 530 540
| | | | | | |
Insertsequenz Plasmid 2 GTGGCTGGCAGCACGCGCC-ATTTGGCGTGCTTCGGCATCTGCGTGCTCCTGGCATCGGC
Insertsequenz Plasmid 3 GTGGCTGGCAGCACGTGCC-TTTTGGCGTGCTTCGGCATCTGCGTGCTCCTGGCATCGGC
Insertsequenz Plasmid 1 GTGGACGGCAGCGCGCGCTGATTCGGCGTGCTTCGGCACTTGCGCGCTCCTGGCGTCGGC
VegFw1 ------------------------------------------------------------
VegRv1 ------------------------------------------------------------
541 550 560 570 580 590 600
| | | | | | |
Insertsequenz Plasmid 2 CTGTGGGCTCCCCATTCGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTGACATGTGTGCG
Insertsequenz Plasmid 3 CTGTGGGCTCCCCATTCGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTGACATGTGTGCG
Insertsequenz Plasmid 1 CTGTGGGCTCCCCATTCGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTGACATGTGTGCG
VegFw1 ------------------------------------------------------------
VegRv1 ------------------------------------------------------------
ANHANG
XXX
601 610 620 630 640 650 660
| | | | | | |
Insertsequenz Plasmid 2 AGTTAACGGGCGAGTAAACCCGTAAGGCGCAAGGAAGCTGACTGNNGGGATCCCTTTGTG
Insertsequenz Plasmid 3 AGTTAACGGGCGAGTAAACCCGTAAGGCGCAAGGAAGCTGACTGGTGGGATCCCTTTGTG
Insertsequenz Plasmid 1 AGTCAACGGGCGAGTAAACCCGTAAGGCGCAAGGAAGCTGATTGGTGGGATCCTCTTGTG
VegFw1 ------------------------------------------------------------
VegRv1 ------------------------------------------------------------
661 670 680 690 700 710 720
| | | | | | |
Insertsequenz Plasmid 2 GGTTGCACCACCGACCGACNNNGATCTTTTTGAGAAGGGTTCGAGTGTGAGCATGCCCTG
Insertsequenz Plasmid 3 GGTTGCACCACCGACCGACCTTGATCTTTT-GAGAAGGGTTCGAGTGTGAGCATGCC-TG
Insertsequenz Plasmid 1 GGTTGCACCGCCGACCGACCCTGATCTTTT-GTGAAGGGTTCGAGTGAGAGCATACC-TG
VegFw1 ------------------------------------------------------------
VegRv1 ------------------------------------------------------------
721 730 740 750 760 770 780
| | | | | | |
Insertsequenz Plasmid 2 TCGGGGACCCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGAGCGGGGCGAAGCCAG-----------
Insertsequenz Plasmid 3 TCGGGA--CCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGAGCGGGGCGAAGCCAGAGGAAACTCTG
Insertsequenz Plasmid 1 TCGGGA--CCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGAGCGGGGCGAAGCCAGAGGAAACTCTG
VegFw1 ------------------------------------------------------------
VegRv1 ------------------------------------------------------------
781 790 800 810 820 830 840
| | | | | | |
Insertsequenz Plasmid 2 ------------------------------------------------------------
Insertsequenz Plasmid 3 GTGGAGGCCCGCAGCGATACTGACGTGCAAATCGTTCGTCTGACTTGGGTATAGGGGCGA
Insertsequenz Plasmid 1 GTGGAGGCCCGCAGCGATGCTGACGTGCAAATCGTTCGTCTGACTTGGGTATAGGGGCGA
VegFw1 ------------------------------------------------------------
VegRv1 ------------------------------------------------------------
841 850 860 870 880 890 900
| | | | | | |
Insertsequenz Plasmid 2 ------------------------------------------------------------
Insertsequenz Plasmid 3 AAGACTAATCGAACCGTCTAGTAGCTGGTTCCCTCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCTGGA
Insertsequenz Plasmid 1 AAGACTAATCGAACCGTCTAGTAGCTGGTTCCCTCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCTGGA
VegFw1 ------------------------------------------------------------
VegRv1 ------------------------------------------------------------
901 910 920 930 940 950 960
| | | | | | |
Insertsequenz Plasmid 2 ------------------------------------------------------------
Insertsequenz Plasmid 3 GCCCGCGTGCGAGTTCTATCGGGTAAAGCCAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGA
Insertsequenz Plasmid 1 GCCCGAGGGCGAGTTCTATCGGGTAAAGCCAAATCCCGCGGCCATGGCGGCCGGGAGCAT
VegFw1 ------------------------------------------------------------
VegRv1 ---------CGAGTTCTATCGGGTAAAGCCA-----------------------------
961 970
| |
Insertsequenz Plasmid 2 -----------------
Insertsequenz Plasmid 3 CC---------------
Insertsequenz Plasmid 1 GCGACGTCGGCCCAATC
VegFw1 -----------------
VegRv1 -----------------
ANHANG
XXXI
III. Klonierungsvektor pGEM®-T-57f(+) mit plantaespezifischem 28S-rDNA-Insert
Abbildung 28: Grafische Darstellung des Klonierungsvektors pGEM®-T-57f(+) mit pflanzenspezifischem Insert Generiert aus DNA von Cucurbita pepo (Steierischer Kürbis). Bearbeitet und erstellt mit dem Sequenzanalyseprogramm Geneious (Kearse et al. 2012). Die Hybridisierungsstellen der pflanzenspezifischen Primer VegFw1 und VegRv1 sind grün hervorgehoben.
ANHANG
XXXII
IV. Klonierungsvektor pGEM®-T-57f(+) mit fungispezifischem 28S-rDNA-Insert als
Positivkontrolle
Abbildung 29: Klonierungsvektor pGEM®-T-57(+)f mit eingebauter 28S rDNA-Sequenz aus D. anomala Bearbeitet und erstellt mit dem Sequenzanalyseprogramm Geneious (Kearse et al. 2012). Die Primer- (grün) und Sondenhybridisierungsstellen (rot) sind markiert.
ANHANG
XXXIII
V. Einstellen des Positivkontrollplasmids als Quantifizierungsstandard
Tabelle 29: Resultate zur Einstellung des Positivkontrollplasmids auf Genomäquivalente Die beim Probennamen angegebenen, erwarteten Konzentrationen sind jeweils auf die DNA-Gesamtkonzentration je Reaktion gesehen. In einem PCR-Lauf wurde, auf Genomäquivalente bereits eingestellte, Dekkera anomala-DNA als Standardreihe definiert und verschiedene Plasmidkopienzahlen in Relation gesetzt.
Probenname Probeart Cp Errechnete
Konzentration in GÄ
𝒙 (Cp) 𝝈(Cp) 𝒙 (GÄ) 𝝈(GÄ)
D. anomala-DNA (1E4 GÄ)
Standard 21,74 1,02E4 - - - -
D. anomala-DNA (1E3 GÄ)
Standard 25,32 9,64E2 - - - -
D. anomala-DNA (1E2 GÄ)
Standard 28,74 1,02E2 - - - -
D.anomala-DNA (2,5E1 GÄ)
Standard 30,88 2,49E1 - - - -
D. anomala-DNA (6,25E0 GÄ)
Standard 32,73 6,12E0 - - - -
D. anomala-DNA (1,56E0 GÄ)
Standard 34,18 1,57E0 - - - -
Kontrollplasmid
1,56E2 Kopien
Unbekannt 34,14 1,65E0 34,06 0,11 1,78E0 1,92E-1
unbekannt 33,98 1,92E0
Kontrollplasmid 6,25E2 Kopien
Unbekannt 32,89 5,36E0 32,89 0,00 5,34E0 1,92E-2
Unbekannt 32,89 5,33E0
Kontrollplasmid
2,5E3 Kopien
Unbekannt 31,13 2,11E1 31,12 0,02 2,13E1 2,81E-1
Unbekannt 31,10 2,15E1
Kontrollplasmid 1E4 Kopien
Unbekannt 29,03 8,39E1 29,01 0,03 8,52E1 1,85E0
Unbekannt 28,99 8,66E1
Kontrollplasmid 1E5 Kopien
Unbekannt 25,46 8,83E2 25,48 0,03 8,71E2 1,68E1
Unbekannt 25,50 8,59E2
Kontrollplasmid 1E6 Kopien
Unbekannt 21,95 8,86E3 21,93 0,03 9,00E03 1,95E2
Unbekannt 21,91 9,14E3
NTC Negativkontrolle - 0 - - - -
Negativkontrolle - 0 - - - -
ANHANG
XXXIV
VI. Stämme für Inklusivität
Tabelle 30: Übersicht der untersuchten Pilz-Stämme Spezies Stamm Spezies Stamm
Absidia corymbifera DSM 1144 Humicola fuscoatra BCD 3590 Absidia glauca CBS 100.48 Humicola grisea DSM 2691 Absidia spinosa BCD 3485 Hyalodendron lignicola DSM 1877 Acremonium strictum BCD 6986 Hyphopichia burtonii DSM 3505; DSM 70355 Actinomucor elegans BCD 3486 Issatchenkia orientalis CBS 5147 Alternaria alternata BCD 12263 Kazachstania exigua MUCL 29838 Alternaria citri CBS 106.27 Kazachstania unispora BCD 877 Allomyces arbuscula DSM 954 Kloeckera apiculata ATCC 9774 Ascochyta BCD 8541 Kodamaea ohmeri BCD 862 Aspergillus aculaetus DSM 63261 Kluyveromyces lactis DSM 70807 Aspergillus brasiliensis DSM 1988 Kluyveromyces marxianus BCD 811; BCD 2563;
BCD 5186; DSM 70106; DSM 70792
Aspergillus candidus BCD 12139; BCD 14518 Lachancea kluyveri DSM 70517 Aspergillus carneus DSM 1518 Lachancea
thermotolerans CBS 6340
Aspergillus clavatus DSM 817 Lecythophora hofmannii DSM 2693 Aspergillus fumigatus DSM 819 Lipomyces kononenkoae DSM 70302 Aspergillus glaucus BCD 124 Lipomyces lipofer DSM 70305 Aspergillus ochraceus BCD 12158 Lipomyces starkeyi BCD 852 Aspergillus parasiticus DSM 2038 Lipomyces tetrasporus DSM 70314 Aspergillus penicillioides DSM 1623 Lodderomyces
elongisporus DSM 70320
Aspergillus ruber BCD 482 Metschnikowia lunata CBS 5946 Aspergillus sydowi DSM 63373 Metschnikowia
pulcherrima DSM 70321
Aspergillus tamarii BCD 5441 Millerozyma farinosa BCD 861 Aspergillus terreus DSM 826 Monascus purpureus BCD 286 Aspergillus ustus BCD 12168 Monilia fructigena DSM 2678 Aspergillus versicolor DSM 1943 Monilia spec. BCD 8535 Aspergillus wentii DSM 3701 Moniliella suaveolens DSM 2400 Aureobasidium pullulans DSM 3042 Mortierella macrocystis BCD 3494 Aureobasidium spec. BCD 3118; BCD 5649 Mucor circinelloides BCD 6069 Beauveria bassiana DSM 875 Mucor genevensis BCD 3496 Botrytis spp. BCD 3776 Mucor hiemalis BCD 3498 Bullera dendrophila DSM 70745 Mucor racemosus CBS 225.37 Byssochlamys fulva BCD 955 Mycosphaerella pinodes DSM 62763 Byssochlamys nivea BCD 956 Mycotypha africana CBS 122.64 Candida albicans ATCC 10231 Mycotypha microspora CBS 230.32 Candida beechii CBS 4261 Myrothecium sp. BCD 12984 Candida boidinii DSM 70024;DSM 70033;
DSM 70034 Neosartorya fischeri DSM 3700
Candida catenulata DSM 70136 Nigrospora clurus CBS 313.36 Candida diddensiae BCD 800 Ogatea methanolica DSM 2147 Candida ernobii DSM 70858 Ogatea polymorpha DSM 70277 Candida freyschussii DSM 70047 Ogatea trehalophila DSM 70391 Candida friedrichii DSM 70050 Pachylosen tannophilus CBS 4044 Candida glaebosa CBS 5691 Paecilomyces variotii CBS 628.66 Candida glabrata BCD 8932 Penicillium
aurantiogriseum BCD 12165
Candida haemulonii DSM 70624 Penicillium brevicompactum
DSM 2215
Candida inconspicua MUCL 27868 Penicillium camembertii DSM 1995 Candida intermedia BCD 685 Penicillium citrinum DSM 1997 Candida krusei DSM 70075 Penicillium chrysogenum DSM 1075 Candida magnoliae DSM 70638 Penicillium corylophilum BCD 12182 Candida maltosa BCD 806 Penicillium crustosum BCD 6994 Candida multigemmis DSM 70862 Penicillium digitatum DSM 2750 Candida norvegica DSM 70863 Penicillium griseofulvum DSM 896 Candida rugosa BCD 814 Penicillium italicum DSM 2755 Candida sake BCD 1054; CBS 2920 Penicillium nalgiovense DSM 897 Candida solani BCD 818 Penicillium pinophilum DSM 1960 Candida tenuis BCD 819 Penicillium purpurogenum BCD 3006
ANHANG
XXXV
Spezies Stamm Spezies Stamm
Candida tropicalis ATCC 20247; ATCC 20326
Penicillium roquefortii BCD 3599
Candida vini DSM 70184 Penicillium simplicissimum
DSM 1097
Candida zeylanoides BCD 690 Penicillium thomii BCD 2001 Candida parapsilosis ATCC 20384 Penicillium verrucosum DSM 1836 Cephalosporium roseum BCD 2980 Penicillium viridicatum DSM 62878 Ceratocystis paradoxa MUCL1869 Phanerochaete
chrysosporium CBS 316.75
Ceratocystis piliferum ATCC 60758 Phoma spec. BCD 3114 Chaetomium globosum BCD 1181; ATCC 6205 Phomopsis phaseoli CBS 422.50 Choanephora infundibulifera var. cucurbitarum
DSM 960 Pichia anomala DSM 70783
Chrysosporium farinicola CBS 624.83 Pichia canadensis CBS 601 Citeromyces matritensis BCD 1062 Pichia fermentans BCD 711; DSM 70090 Cladosporium cladosporioides
BCD 12266 Pichia guilliermondii BCD 804
Claviceps pupurea DSM 714 Pichia membranefaciens DSM 70178 Clavispora lusitaniae DSM 70102 Pilaira anomala BCD 3504 Colletotrichum gloeosporioides
BCD 7988 Pithomyces chartarum DSM 62925
Cryptococcus albidus DSM 70197 Pleospora herbarum DSM 62928 Cryptococcus curvatus BCD 2578; DSM 70022 Priceomyces carsonii DSM 70392 Cryptococcus flavus BCD 823 Purpureocillium lilacinum BCD 3595 Cryptococcus humicola DSM 70067 Radiomyces spectabilis BCD 3505 Cryptococcus laurentii BCD 824 Rhizoctonia solani BCD 7224 Cryptococcus neoformans
BCD 3511 Rhizophagus irregularis MUCL43194 (SYMPLANTA-001)
Rhizopus nigricans BCD 3506 Cunninghamella elegans BCD 164; BCD 3491 Rhodotorula glutinis BCD 3530 Curvularia geniculata CBS 333.64 Rhodotorula minuta DSM 70408 Cylindrocarpon sp. BCD 12950 Rhodotorula sp. ATCC 20254 Debaryomyces etchellsii ATCC 20126 Rhodotorula rubra BCD 4081 Debaryomyces hansenii BCD 589; BCD 3512 Saccharomyces bayanus BCD 1392; DSM 70412 Debaryomyces marama ATCC 11627 Saccharomyces
carlsbergensis BCD 728
Dekkera anomala DSM 70727 Saccharomyces cerevisiae
ATCC 9763; ATCC 12341; ATCC 18790; DSM 1333; DSM 70416; DSM 70452
Dekkera bruxellensis DSM 70001 Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus
BCD 14525; BCD 14526; BCD 14527; DSM 70487
Diaporthe citri DSM 1159 Saccharomyces pastorianus
DSM 6580; NCYC 73
Dipodascopsis uninucleata var. uninucleata
BCD 3552 Saccharomycopsis figuligera
BCD 3514
Drechslera sp. BCD 7979 Saitoella complicata BCD 14119 Endomycopsis fibuliger DSM 70554 Schizosaccharomyces
octosporus DSM 70573
Emericella nidulans BCD 3554 Schizosaccharomyces pombe
BCD 773
Emericella rugulosa DSM 945 Sclerotinia sclerotiorum DSM 1946 Epicoccum nigrum DSM 2586 Scopulariopsis brevicaulis DSM 1218 Eremascus albus BCD 12125 Scytalidium lignicola BCD 3602 Eremascus fertilis BCD 12124; CBS 103.09 Septoria BCD 8386 Eupenicillium abidjanum DSM 2207 Sporidiobolus johnsonii BCD 778; DSM 70847 Eurotium amstelodami BCD 467; BCD 3557;
BCD 12175
Sporidiobolus salmicolor BCD 4982
Eurotium chevalieri DSM 62064 Stachybotrys chartarum DSM 2144 Eurotium rubrum BCD 12172; BCD 14524 Sterigmatomyces elviae DSM 70852 Filobasidium capsuligenum
DSM 70253 Syncephalastrum racemosum
BCD 162; BCD 296; BCD 480; BCD 3507
Fusarium acuminatum BCD 7005 Talaromyces flavus BCD 12179 Fusarium bulbicum BCD 133 Thielaviopsis spp. BCD 3558; BCD 7384
ANHANG
XXXVI
Spezies Stamm Spezies Stamm
Fusarium avenaceum BCD 119 Torulaspora delbrueckii CBS 5636; CBS 6339; DSM 70607
Fusarium cerealis BCD 14058 Trichoderma hamatum BCD 6990 Fusarium concolor DSM 62179 Trichoderma spp. BCD 5666 Fusarium culmorum DSM 62184 Trichoderma viride BCD 352 Fusarium equiseti BCD 110 Trichophyton
mentagrophytes BCD 6061
Fusarium moniliforme BCD 120 Trichosporon cutaneum DSM 70684 Fusarium moniliforme var. subglutanis
BCD 114 Trichothecium roseum BCD 318; DSM 860
Fusarium oxysporum BCD 14059; DSM 841 Ulocladium chartarum DSM 63070 Fusarium poae BCD 149 Venturia inaequalis DSM 1002 Fusarium proliferatum BCD 253 Verticillium lecanii ATCC 28300 Fusarium sambucinum BCD 14062 Verticillium sp. BCD 13586 Fusarium solani BCD 7100 Verticimonosporium
ellipticum
Fusarium sporotrichioides
DSM 62423 Wallemia sebi DSM 5329
Gaeumannomyces graminis var. graminis
DSM 1463 Xeromyces bisporus CBS 347.94
Geomyces pannorum DSM 2689 Yarrowia lipolytica ATCC 20225; ATCC 20226; BCD 2556
Geotrichum candidum BCD 985 Zygorhynchus macrocorpus
BCD 2609
Gibberella zeae BCD 14056 Zygorhynchus moelleri CBS 501.66 Gliocladium spp. BCD 4093 Zygosaccharomyces bailii DSM 70492 Gloeosporium pedemontanum
CBS 273.51 Zygosaccharomyces bisporus
DSM 70415
Guilliermondella selenospora
DSM 3431 Zygosaccharomyces cidri MUCL 31280
Hanseniaspora guilliermondii
DSM 70285 Zygosaccharomyces fermentati
MUCL 27824
Hanseniaspora uvarum BCD 3526 Zygosaccharomyces florentinus
DSM 70506
Hanseniaspora vinea DSM 70283 Zygosaccharomyces lentus
CBS 8516
Hansenula anomala BCD 1082 Zygosaccharomyces microellipsoides
DSM 6959
Helminthosporium spp. BCD 3588 Zygosaccharomyces rouxii
ATCC 48230; DSM 70835
ANHANG
XXXVII
VII. Stämme für Exklusivität
Sofern nicht anders benannt, wurde die DNA aus Plantae jeweils aus der Frucht oder den Blättern dem Herstellerprotokoll des Magnetic Preparation Kit III (Biotecon Diagnostics GmbH, Potsdam) folgend extrahiert. Bakterien-DNA wurde teilweise der betriebsinternen DNA-Datenbank entnommen.
Tabelle 31: Eingesetzte DNA-Proben für Exklusivitätstestung Art der Probe Spezies/Zelllinienname Stammnummer
Bakterien Alicyclobacillus acidocaldarius Aliivibrio fischeri DSM 507
Alteromonas macleodii DSM 6062 Bacillus subtilis DSM 10 Brochothrix thermosphacta DSM 20171 Citrobacter freundii DSM 30040 Clostridium sporogenes DSM 1664 Edwardsiella tarda DSM 30052 Enterococcus faecalis Escherichia coli DSM 30083 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Lactobacillus delbrueckii DSM 20074 Lactococcus garvieae DSM 20385 Micrococcus luteus BCD 10938 Pleosiomonas shigelloides DSM 8224 Photobacteria phosphoreum BCD 5162 Proteus vulgaris DSM 2140 Pseudomonas aeruginosa Salmonella enterica Salmonella enteritidis Shigella sonnei BCD 7889 Vibrio cholerae ATCC 14034 Vibrio parahaemolyticus DSM 10027 Vibrio vulnificus DSM 10143 Yersinia enterocolitica DSM 4780
Pflanzen Allium sativum (Pulver) Anethum graveolens (gemahlen) Beta vulgaris Capsicum sp. Carum carvi Cocos nucifera (geraspelt) Cucurbita pepo Foeniculum vulgare Fragaria vescana Malus domestica Musa acuminata Pimpinella anisum Prunus cerasus Prunus domestica Rubus fruticosus Rubus idaeus Solanum lycopersicum Syzygium aromaticum (getrocknet) Thymus vulgaris (gehackt) Zingiber officinale (Pulver)
humane Zelllinien A375 A549 A2058 FaDu H9 HaCaT Jurkat
ANHANG
XXXVIII
Art der Probe Spezies/Zelllinienname Stammnummer
QgP SW480
Murine Zelllinien 3T3 B16-F10 R1-H Renca
Canine Zelllinien MDCK2
ANHANG
XXXIX
VIII. Daten zur LOD/LOQ-Bestimmung
Tabelle 32: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Rhodotorula mucilaginosa-DNA
Rhodotorula mucilaginosa (DSM 70403) – Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM / HEX)
PCR-Lauf Replikat 100 000 10 000 1 000 100 25 6,25 1,56 0,39
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
1 1 16,45 30,61 20,07 30,54 23,63 30,43 26,98 30,63 28,66 30,68 30,74 30,89 32,27 30,85 34,27 31,16
1 2 16,69 30,68 20,35 30,44 23,84 30,67 27,12 30,71 29 30,87 30,83 30,85 32,28 30,92 35,42 30,96
1 3 16,58 30,51 20,2 30,68 23,85 30,56 26,94 30,71 29,04 30,95 30,86 30,89 32,79 30,97 40 31
1 4 16,56 30,65 20,34 30,64 23,76 30,3 27,05 30,61 28,69 30,75 31,14 30,74 33,07 30,65 35,44 30,87
1 5 16,28 30,51 20 30,66 23,53 30,7 26,82 30,56 28,94 30,64 30,81 30,8 32,73 30,86 34,3 31,04
1 6 16,58 30,56 20,37 30,48 23,8 30,6 26,99 30,73 28,88 30,8 30,81 30,89 33,07 30,63 34,15 30,97
2 7 16,56 30,62 20 30,63 23,59 30,71 27,25 30,59 29,16 30,78 31,13 31,08 32,95 30,91 34,23 31,08
2 8 16,62 30,51 19,85 30,61 23,61 30,66 26,99 30,7 28,98 30,69 31,25 30,87 33 30,94 34,59 31,1
2 9 16,34 30,99 19,94 30,73 23,84 30,49 26,93 30,79 29,04 30,7 31,15 30,91 32,79 30,98 34,99 30,85
2 10 16,29 30,68 20,55 30,46 23,74 30,61 27,28 30,75 29,58 30,61 31,12 30,82 32,83 31,24 34,25 31,02
2 11 17,14 30,33 20,07 30,52 24,1 30,25 27,56 30,59 29,36 30,81 31,25 30,89 33,3 30,67 35,5 30,89
2 12 16,91 30,49 20,3 30,63 24,15 30,44 27,28 30,49 29,42 30,77 31,41 30,63 33,52 30,61 33,71 30,85
% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
(x̅) 16,58 30,60 20,16 30,58 23,75 30,54 27,08 30,67 29,03 30,75 31,01 30,88 32,83 30,87 35,19 30,99
(σ) 0,24 0,16 0,21 0,09 0,15 0,15 0,20 0,07 0,25 0,10 0,19 0,08 0,30 0,17 1,60 0,09
𝐸 = (10−1
𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1
−3,396 − 1) ∗ 100% = 96,99%
y = -3,396x + 33,73R² = 0,999
15
20
25
30
35
40
-1 0 1 2 3 4 5 6
(x̅)
Cp
Log 10 Genomäquivalente
Rhodotorula mucilaginosa
Standardkurve
ANHANG
XL
Tabelle 33: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Cryptococcus curvatus-DNA
Cryptococcus curvatus (DSM70022) – Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM/HEX)
PCR-Lauf Replikat 100 000 10 000 1 000 100 25 6,25 1,56 0,39
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
1 1 16,36 30,57 20,16 30,55 23,51 30,41 27,06 30,63 28,97 30,81 30,72 30,83 32,7 30,97 33,88 30,99
1 2 16,47 30,69 20,02 30,63 23,46 30,59 26,83 30,73 28,79 30,72 30,58 30,88 32,44 30,91 34,07 31,08
1 3 16,49 30,62 19,93 30,43 23,52 30,53 26,66 30,64 28,76 30,81 30,65 30,9 32,4 31,06 34,9 30,85
1 4 16,45 30,57 19,89 30,65 23,35 30,62 26,96 30,78 29,03 30,69 30,79 30,97 32,18 30,93 34,14 31,11
1 5 16,37 30,59 20,04 30,58 23,6 30,59 26,92 30,6 28,93 30,87 30,73 31 32,14 30,89 33,96 31,31
1 6 16,22 30,79 19,71 30,67 23,18 30,6 26,32 30,84 28,86 30,89 30,59 30,84 32,04 30,95 33,63 31,18
2 7 16,52 30,56 20,2 30,48 23,59 30,61 27 30,57 29,04 30,73 30,58 30,72 32,44 30,96 35,09 31,16
2 8 16,56 30,88 20,1 30,62 23,36 30,49 26,77 30,56 29 31,09 30,96 30,93 32,83 31,12 33,99 30,97
2 9 16,61 30,74 20,08 30,28 23,54 30,31 27,18 30,67 29,06 30,7 30,95 30,98 32,59 31 35,19 31,18
2 10 16,51 30,62 20,01 30,52 23,58 30,31 26,98 30,69 28,89 30,75 30,98 30,87 33,09 30,84 34,03 30,9
2 11 16,32 30,68 20,47 30,63 23,8 30,28 27,28 30,88 29,26 30,77 31,5 30,9 33,36 31 35,01 31,03
2 12 16,61 30,63 20,73 30,66 24,25 30,52 27,95 30,65 29,73 30,86 31,66 31,1 33,86 31,1 36,95 30,92
% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
(x̅) 16,46 30,66 20,06 30,55 23,50 30,49 26,91 30,69 28,96 30,80 30,82 30,89 32,56 30,97 34,35 31,07
(σ) 0,11 0,10 0,18 0,11 0,15 0,13 0,25 0,10 0,13 0,11 0,26 0,08 0,39 0,07 0,54 0,13
𝐸 = (10−1
𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1
−3,318 − 1) ∗ 100% = 97,5%
y = -3,318x + 33,33R² = 0,998
15
20
25
30
35
40
-1 0 1 2 3 4 5 6
(x̅)
Cp
Log 10 Genomäquivalente
Cryptococcus curvatus
Standardkurve
ANHANG
XLI
Tabelle 34: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Mucor racemosus-DNA
Mucor racemosus (CBS 225.37) – Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM/HEX)
PCR-Lauf Replikat 100 000 10 000 1 000 100 25 6,25 1,56 0,39
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
1 1 15,32 30,56 18,98 30,49 22,59 30,58 25,83 30,69 27,76 30,65 29,72 30,77 31,52 30,97 33,58 30,82
1 2 15,55 30,65 19,11 30,48 22,78 30,63 26,01 30,67 27,98 30,84 29,82 30,73 32,1 30,91 36,8 31,01
1 3 15,39 30,62 19,03 30,56 22,49 30,48 26,07 30,65 27,8 30,76 29,74 30,73 31,87 30,88 34,13 30,99
1 4 15,6 30,73 19,01 30,45 22,57 30,5 25,87 30,51 27,95 30,67 29,81 30,76 31,66 31,08 33,89 30,94
1 5 15,64 30,6 19,17 30,52 22,93 30,44 26,08 30,75 28,04 30,69 29,91 30,88 32,15 31 34,03 30,92
1 6 15,46 30,73 19,12 30,46 22,66 30,54 26,17 30,64 28,22 30,85 30,17 30,87 31,89 30,95 33,85 31,04
2 7 15,55 30,83 19,16 30,43 22,53 30,49 26,02 30,76 28,02 30,74 30,03 30,96 32,04 30,95 35,45 31,01
2 8 15,7 30,37 19,1 30,42 22,72 30,56 25,97 30,62 28,12 30,79 29,36 30,45 32,08 30,94 37,94 30,9
2 9 15,53 30,75 19,22 30,5 22,61 30,45 25,94 30,7 28,01 30,61 29,9 30,79 31,77 30,98 35,19 31,01
2 10 15,85 30,77 19,58 30,46 22,98 30,72 26,33 30,6 28,31 30,84 30,19 31,09 31,94 31,01 34,14 30,96
2 11 15,7 30,74 19,16 30,27 22,77 30,72 25,91 30,69 27,96 30,76 29,9 30,77 31,91 31,06 33,13 31
2 12 15,32 31,05 19,07 30,91 22,35 30,54 25,67 30,6 29,33 30,88 30,18 31,05 31,54 31,23 32,85 31,07
% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
(x̅) 15,55 30,67 19,15 30,46 22,69 30,56 26,02 30,66 28,02 30,75 29,87 30,80 31,90 30,98 34,74 30,96
(σ) 0,15 0,12 0,15 0,07 0,15 0,09 0,14 0,07 0,15 0,08 0,22 0,15 0,18 0,06 1,41 0,06
𝐸 = (10−1
𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1
−3,454 − 1) ∗ 100% = 94,77%
y = -3,454x + 32,89R² = 0,998
15
20
25
30
35
40
-1 0 1 2 3 4 5 6
(x̅)
Cp
Log 10 Genomäquivalente
Mucor racemosus
Standardkurve
ANHANG
XLII
Tabelle 35: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Absidia corymbifera-DNA
Absidia corymbifera (DSM 1144) - Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM / HEX)
PCR-Lauf Replikat 100 000 10 000 1 000 100 25 6,25 1,56 0,39
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
1 1 15,54 30,52 19,32 30,58 22,53 30,74 25,99 30,52 27,97 30,74 29,86 30,92 32,07 31,23 32,8 31,06
1 2 15,62 30,33 18,87 30,66 22,51 30,8 26,22 30,71 28,02 30,69 29,94 31,15 32,23 30,77 34,13 31,48
1 3 15,6 30,61 19,11 30,33 22,52 30,76 26,04 30,52 28,14 30,88 29,97 30,9 32,2 31,12 34,29 30,92
1 4 15,77 30,49 19,13 30,35 22,84 30,53 26,85 30,55 28,88 30,81 31,06 30,9 32,71 30,92 35,17 31,03
1 5 15,72 30,28 18,67 30,94 22,38 30,61 26,04 30,76 28,08 30,86 30,01 30,75 32,33 31,01 34,79 30,72
1 6 15,63 30,65 18,97 30,92 23,09 30,64 27,04 30,16 28,74 30,8 30,68 30,86 32,98 30,63 34,53 30,91
2 7 15,73 30,58 19,29 30,31 22,64 30,25 26,16 30,64 28,17 30,54 29,81 30,7 31,9 30,7 33,59 30,88
2 8 15,74 30,88 19,04 30,5 22,83 30,57 26,61 30,59 28,5 30,57 30,23 30,64 32,06 30,82 34,01 30,87
2 9 15,65 30,74 19,07 30,18 22,58 30,5 25,91 30,53 28,13 30,55 29,84 30,76 31,7 30,85 33,38 30,87
2 10 15,83 30,47 19,14 30,55 22,92 30,32 26 30,53 28,12 30,7 29,92 30,77 32,32 30,8 33,93 30,87
2 11 15,92 30,63 19,03 30,33 22,65 30,54 26,1 30,45 28,16 30,57 30,13 30,68 31,75 30,96 34,05 30,75
2 12 N/A N/A 19,01 30,25 22,54 30,49 25,94 30,53 28,09 30,71 29,91 30,86 31,33 30,93 35,06 31,05
% positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
(x̅) 15,70 30,56 19,06 30,51 22,68 30,57 26,27 30,54 28,26 30,70 30,13 30,82 32,20 30,89 34,06 30,94
(σ) 0,11 0,16 0,17 0,24 0,20 0,16 0,37 0,15 0,29 0,12 0,38 0,14 0,37 0,17 0,63 0,19
𝐸 = (10−1
𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1
−3,418 − 1) ∗ 100% = 96,14%
y = -3,418x + 32,87R² = 0,999
15
20
25
30
35
40
-1 0 1 2 3 4 5 6
(x̅)
Cp
Log 10 Genomäquivalente
Absidia corymbifera
Standardkurve
ANHANG
XLIII
Tabelle 36: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Schizosaccharomyces pombe-DNA
Schizosaccharomyces pombe (DSM 70572) –Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM/HEX)
PCR-Lauf Replikat 100 000 10 000 1 000 100 25 6,25 1,56 0,39
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
1 1 16,36 34,07 19,83 33,25 23,23 31,74 26,62 30,44 28,91 30,61 30,91 30,64 32,87 30,92 30,69 30,86
1 2 16,75 34,11 20,22 33,05 23,71 31,65 26,97 30,25 29,09 30,58 30,77 30,83 32,55 30,84 34,6 31,29
1 3 16,11 34,64 19,76 33,73 23,06 32,03 26,31 30,36 28,45 30,47 30,49 30,7 32,54 31,04 33,95 31,17
1 4 16,3 34,223 19,84 33,32 23,24 31,14 26,55 30,31 28,64 30,35 30,67 30,56 32,66 30,78 34,11 31,03
1 5 16,43 33,91 20,28 33,22 23,44 31,77 26,54 30,56 28,71 30,36 30,77 30,64 32,69 31,1 34,17 30,98
1 6 16,51 34,24 20,13 32,76 23,49 31,12 26,68 30,36 28,73 30,46 30,89 30,86 32,79 30,93 34,7 30,95
2 7 16,47 34,08 20,12 33,41 23,64 32,18 27,07 30,64 29,2 30,79 31,3 31,07 33,38 31,19 34,91 31,09
2 8 16,47 35,17 19,99 34,38 23,59 32,62 26,85 30,49 29,01 30,79 31,14 30,92 32,94 31,23 34,88 31,24
2 9 16,28 34,46 19,86 33,93 23,33 32,66 26,93 30,49 28,87 30,73 30,88 31,07 33,94 31,31 34,76 31,22
2 10 16,21 35,06 19,78 34,1 23,28 31,96 26,85 30,52 28,89 30,79 30,91 30,97 34,13 31 34,97 31,46
2 11 16,47 35,07 19,97 34,22 23,49 31,99 26,83 30,48 29,03 30,65 30,9 30,84 32,79 31,26 34,91 31,52
2 12 16,47 34,49 19,99 34,6 23,49 32,03 26,89 30,69 29,03 30,7 30,94 30,98 32,99 31,22 34,6 31,5
% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
(x̅) 16,40 34,46 19,98 33,58 23,41 31,90 26,75 30,45 28,87 30,60 30,88 30,83 33,03 31,05 34,24 31,16
(σ) 0,16 0,44 0,17 0,50 0,19 0,48 0,22 0,11 0,21 0,16 0,21 0,17 0,53 0,17 1,17 0,20
𝐸 = (10−1
𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1
−3,358 − 1) ∗ 100% = 98,52%
y = -3,358x + 33,4R² = 0,998
15
20
25
30
35
40
-1 0 1 2 3 4 5 6
(x̅)
Cp
Log 10 Genomäquivalente
Schizosaccharomyces pombe
Standardkurve
ANHANG
XLIV
Tabelle 37: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Fusarium oxysporum-DNA
Fusarium oxysporum (DSM 841) –Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM/HEX)
PCR-Lauf Replikat 100 000 10 000 1 000 100 25 6,25 1,56 0,39
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
1 1 15,63 33,03 19,18 33,75 22,88 30,87 26,18 30,15 28,46 30,44 30,15 30,51 32,3 30,9 34,3 30,81
1 2 15,62 33 19,16 33,87 22,96 30,67 26,49 30,24 28,74 30,43 30,58 30,8 32,53 30,83 34,23 30,9
1 3 15,67 32,99 19,19 33,3 22,82 31,2 26,54 30,18 28,53 30,2 30,54 30,64 32,52 30,8 34,03 31,08
1 4 15,65 32,76 19,53 32,03 22,67 32,05 26,26 30,23 28,53 30,47 30,31 30,62 32,36 30,79 33,94 30,97
1 5 15,65 32,91 19,2 34,48 22,76 31,92 26,61 30,1 28,45 30,19 30,54 30,7 32,61 30,9 34,73 31,05
1 6 15,67 32,69 19,78 31,65 23,18 31,09 26,79 30,33 28,87 30,45 30,87 30,81 33,01 30,74 34,54 30,93
2 7 15,71 33,6 19,09 33,73 22,74 31,52 26,12 30,17 28,43 30,28 30,72 30,61 32,51 30,73 34,88 30,96
2 8 15,69 33,21 19,16 34 22,75 31,17 26,28 30,26 28,52 30,54 30,53 30,77 32,65 30,96 34,24 30,83
2 9 15,96 32,28 19,23 33,98 22,85 31,49 26,32 30,44 28,65 30,59 30,48 30,68 32,51 30,84 34,4 31,05
2 10 15,8 32,81 18,97 34,17 22,55 31,77 26,12 30,55 28,29 30,44 30,47 30,91 32,52 31,03 34,12 31,11
2 11 15,77 32,55 19,12 33,87 22,7 31,28 26,19 30,49 28,46 30,58 30,53 30,74 32,21 30,88 34,19 31,1
2 12 N/A N/A 19,04 34,09 22,8 31,07 26,07 30,51 28,45 30,31 30,48 30,59 32,55 30,75 32,47 30,84
% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
(x̅) 15,71 32,89 19,24 33,53 22,81 31,37 26,35 30,29 28,54 30,42 30,52 30,71 32,52 30,85 34,33 30,98
(σ) 0,10 0,33 0,21 0,85 0,16 0,41 0,21 0,14 0,15 0,13 0,18 0,11 0,20 0,09 0,28 0,10
𝐸 = (10−1
𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1
−3,472 − 1) ∗ 100% = 94,10%
y = -3,472x + 33,18R² = 0,999
15
20
25
30
35
40
-1 0 1 2 3 4 5 6
(x̅)
Cp
Log 10 Genomäquivalente
Fusarium oxysporum
Standardkurve
ANHANG
XLV
Tabelle 38: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Cladosporium cladosporioides-DNA
Cladosporium cladosporioides (DSM 62121) –Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM/HEX)
PCR-Lauf Replikat 100 000 10 000 1 000 100 25 6,25 1,56 0,39
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
1 1 19,01 33,6 22,73 31,06 26,06 30,16 29,74 30,52 31,8 31,01 33,77 31,09 34,7 31,07 36,91 31,11
1 2 19,11 32,72 22,79 31,05 26,16 30,32 29,79 30,59 31,9 30,76 33,52 30,97 35,71 30,86 36,89 30,98
1 3 18,99 33,59 22,67 31,29 26,26 30,29 29,71 30,64 31,77 30,84 33,51 31,16 35,76 31,08 36,85 31,06
1 4 18,99 33,19 22,64 31,67 26,03 30,27 29,52 30,52 31,59 30,87 33,63 31,16 34,96 31,09 40 30,92
1 5 18,83 34,01 22,45 31,92 26,03 30,45 29,33 30,6 31,6 30,67 33,54 31,17 34,74 30,99 36,16 31,14
1 6 19,06 33,6 22,64 31,69 26,17 30,28 29,68 30,74 31,81 30,8 33,74 31,01 35,33 31,05 37,35 31,13
2 7 18,94 33,77 22,73 30,92 26,13 30,29 29,55 30,51 31,82 30,76 33,29 30,93 35,52 30,97 36,26 31,04
2 8 18,99 32,99 22,64 31,27 26,03 30,3 29,9 30,58 31,69 30,96 33,9 31,21 35,36 31,09 36,59 30,95
2 9 18,97 34,15 22,65 31,8 26,07 30,59 29,46 30,63 31,77 30,94 33,79 30,71 35,44 30,96 36,45 31,03
2 10 18,95 33,29 22,88 30,78 26,35 30,19 29,95 30,63 32,03 30,96 33,89 30,92 36,06 30,92 37,95 31,06
2 11 18,93 33,27 22,79 30,75 26,29 30,33 29,9 30,47 31,97 30,91 34,13 31,06 35,64 31,3 37,62 31,06
% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
(x̅) 18,98 33,47 22,69 31,29 26,14 30,32 29,68 30,58 31,80 30,86 33,70 31,04 35,38 31,03 37,18 31,04
(σ) 0,07 0,41 0,11 0,40 0,11 0,11 0,19 0,07 0,13 0,10 0,22 0,14 0,41 0,11 1,04 0,07
𝐸 = (10−1
𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1
−3,3381 − 1) ∗ 100% = 97,56%
y = -3,381x + 36,19R² = 0,998
15
20
25
30
35
40
-1 0 1 2 3 4 5 6
(x̅)
Cp
Log 10 Genomäquivalente
Cladosporium cladosporoides
Standardkurve
ANHANG
XLVI
Tabelle 39: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Alternaria citri-DNA
Alternaria citri (CBS 106.27) –Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM/HEX)
PCR-Lauf Replikat 100 000 10 000 1 000 100 25 6,25 1,56 0,39
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
1 1 17,29 33,11 20,84 32,44 24,65 30,53 27,97 30,18 30,16 30,54 31,92 30,78 34,23 30,94 35,76 31,02
1 2 17,48 33,07 20,89 32,46 24,51 30,35 28 30,2 30,32 30,51 32,26 30,83 34,31 30,78 36,18 30,89
1 3 17,23 33,49 20,84 32,55 24,42 30,8 27,98 30,18 30,24 30,6 32,14 30,8 33,98 30,76 35,9 30,79
1 4 17,14 33,76 20,91 32,49 24,44 30,55 27,85 30,44 29,98 30,46 31,95 30,81 34,22 31 35,82 30,73
1 5 17,43 32,97 20,89 32,2 24,44 30,51 27,82 30,28 30,06 30,53 31,92 30,83 34,15 31,12 35,54 30,88
1 6 17,2 33,94 20,9 31,88 24,53 30,32 27,76 30,16 29,92 30,63 32,03 30,8 33,85 30,92 35,74 30,97
2 7 17,58 33,65 21,14 32,23 24,61 30,63 28,32 30,25 30,15 30,53 32,21 30,75 34,63 30,87 35,96 31,18
2 8 17,63 34,45 21,43 32,45 24,74 30,73 28,21 30,21 30,33 30,51 32,34 30,75 33,93 30,97 35,47 30,97
2 9 17,64 34,7 21,19 32,82 24,85 30,65 28,19 30,25 30,36 30,71 32,58 30,94 34,84 30,94 36,05 30,86
2 10 17,65 33,73 21,3 32,57 24,87 30,3 24,48 30,22 30,45 30,84 32,76 30,84 34,78 30,89 36,56 30,85
2 11 17,78 32,94 21,42 31,85 24,78 30,76 28,45 30,42 30,11 30,55 31,97 30,76 33,9 30,96 35,86 30,92
% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
(x̅) 17,46 33,62 21,07 32,36 24,62 30,56 27,73 30,25 30,19 30,58 32,19 30,81 34,26 30,92 35,89 30,91
(σ) 0,21 0,56 0,22 0,28 0,16 0,17 1,05 0,09 0,16 0,10 0,27 0,05 0,34 0,10 0,29 0,12
𝐸 = (10−1
𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1
−3,438 − 1) ∗ 100% = 95,37%
y = -3,438x + 34,79R² = 0,999
15
20
25
30
35
40
-1 0 1 2 3 4 5 6
(x̅)
Cp
Log 10 Genomäquivalente
Alternaria citri
Standardkurve
ANHANG
XLVII
Tabelle 40: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Penicillium chrysogenum-DNA
Penicillium chrysogenum (DSM 848) –Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM/HEX)
PCR-Lauf Replikat 100 000 10 000 1 000 100 25 6,25 1,56 0,39
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
1 1 16,18 35,03 19,77 33,42 23,06 31,55 26,52 30,15 29,22 30,44 31,01 30,67 32,76 30,83 32,86 30,73
1 2 16,22 35,34 19,78 33,24 22,93 31,66 26,23 30,28 28,37 30,27 30,48 30,75 32,74 30,84 34,44 31,02
1 3 16,31 34,96 19,79 33,09 23,02 31,63 26,47 30,29 28,55 30,5 30,54 30,55 32,54 30,86 34,49 30,87
1 4 16,35 34,68 19,96 32,61 22,98 31,66 26,15 30,11 28,31 30,3 30,25 30,63 32,37 30,88 34,04 30,9
1 5 16,36 35,1 20,19 30,57 23,15 30,46 26,16 30,24 28,31 30,45 30,23 30,51 32,15 30,91 34,04 30,99
1 6 16,33 35,51 19,93 33,21 22,92 31,55 26,29 30,03 28,32 30,16 30,36 30,53 32,06 30,83 33,97 31,07
2 7 16,36 35,01 19,7 33,29 22,84 31,5 26,34 30,21 28,46 30,12 30,22 30,55 32,5 30,72 33,83 30,87
2 8 16,24 35,48 19,67 33,65 22,99 31,7 26,22 30,22 28,17 30,15 30,34 30,52 32,28 30,69 34,41 30,97
2 9 16,33 35,22 19,84 32,95 23 31,2 26,53 30,2 28,53 30,21 30,54 30,59 32,42 30,74 34,38 30,92
2 10 16,18 35,29 19,7 34,15 22,92 31,95 26,1 30,36 28,28 30,21 30,05 30,65 32,23 30,88 34,16 31,02
2 11 16,36 34,53 19,85 33,66 22,95 31 26,37 30,26 28,22 30,34 30,31 30,59 32,46 30,82 34,33 30,91
% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
(x̅) 16,29 35,10 19,83 33,08 22,98 31,44 26,31 30,21 28,43 30,29 30,39 30,59 32,41 30,82 34,09 30,93
(σ) 0,07 0,29 0,14 0,88 0,08 0,39 0,14 0,09 0,27 0,13 0,24 0,07 0,21 0,07 0,44 0,09
𝐸 = (10−1
𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1
−3,307 − 1) ∗ 100% = 100,62%
y = -3,307x + 32,94R² = 0,999
15
20
25
30
35
40
-1 0 1 2 3 4 5 6
(x̅)
Cp
Log 10 Genomäquivalente
Penicillium chrysogenum
Standardkurve
ANHANG
XLVIII
Tabelle 41: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Aspergillus brasiliensis-DNA
Aspergillus brasiliensis (DSM 1988) - Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM / HEX)
PCR-Lauf Replikat 100 000 10 000 1 000 100 25 6,25 1,56 0,39
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
1 1 17,29 33,66 20,41 32,94 24 31,01 27,31 30,49 29,69 30,29 31,84 30,82 33,17 30,94 35,48 30,85
1 2 17,28 33,58 20,45 32,82 23,84 30,92 27,24 30,47 29,43 30,43 31,38 30,73 33,24 31,14 35,29 30,93
1 3 17,26 33,82 20,52 32,48 23,95 30,91 27,46 30,65 29,59 30,77 31,71 30,8 33,58 31,04 35,49 30,97
1 4 17,33 33,58 20,56 31,88 23,89 30,85 27,28 30,49 29,56 30,51 31,46 30,85 33,14 30,88 35,29 31,15
1 5 17,34 33,11 20,55 31,26 23,86 30,68 27,3 30,24 29,27 30,28 30,97 30,31 32,7 30,81 34,23 30,98
1 6 17,46 33,1 20,94 32,27 24,15 30,91 27,45 30,55 29,61 30,45 31,75 30,55 33,66 30,97 35,12 30,96
2 7 17,27 34,58 20,77 33,25 23,93 31,17 27,35 30,3 29,47 30,52 31,26 30,72 33,04 31,06 35,67 31,24
2 8 17,26 33,72 20,95 31,77 24,25 30,77 27,76 30,34 29,7 30,49 31,64 30,87 33,73 31,09 35,52 31,02
2 9 17,04 35,06 20,74 32,94 23,9 31,66 27,51 30,34 29,34 30,31 31,57 30,68 33,63 31,13 35,37 31,05
2 10 17,53 33,5 20,96 31,94 24,19 30,75 27,63 30,31 29,61 30,47 31,06 30,76 33,49 30,92 35,49 30,98
2 11 17,44 34,07 20,88 33,09 24,19 30,66 27,46 30,15 29,46 30,31 31,52 30,6 33,33 30,74 34,8 31,24
% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
(x̅) 17,32 33,80 20,70 32,42 24,01 30,94 27,43 30,39 29,52 30,44 31,47 30,70 33,34 30,97 35,25 31,03
(σ) 0,12 0,56 0,20 0,61 0,14 0,27 0,15 0,14 0,13 0,14 0,27 0,16 0,30 0,12 0,39 0,12
𝐸 = (10−1
𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1
−3,329 − 1) ∗ 100% = 99,71%
y = -3,329x + 34,03R² = 0,999
15
20
25
30
35
40
-1 0 1 2 3 4 5 6
(x̅)
Cp
Log 10 Genomäquivalente
Aspergillus brasiliensis
Standardkurve
ANHANG
XLIX
Tabelle 42: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Candida albicans-DNA
Candida albicans (ATCC 10231) – Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM/HEX)
PCR-Lauf Replikat 100 000 10 000 1 000 100 25 6,25 1,56 0,39
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
1 1 15,86 35,27 19,66 33,72 22,92 31,58 26,33 30,15 28,61 30,44 30,27 30,62 32,56 30,85 34,08 31,01
1 2 15,77 35,47 19,48 33,78 22,68 31,51 26,11 30,36 28,57 30,53 30,13 30,64 31,92 30,7 34,51 30,88
1 3 15,84 34,95 19,57 32,95 23,1 30,3 26,33 30,27 28,35 30,54 30,26 30,64 32,53 30,83 34,45 30,99
1 4 15,79 35,8 19,88 30,56 23,06 31,76 26,79 30,33 28,94 30,24 30,65 30,7 32,74 31,06 34,3 30,82
1 5 15,73 35,62 19,58 31,22 23,26 30,08 26,31 30,2 28,5 30,34 30,65 30,6 32,47 30,89 33,77 31,2
1 6 15,85 33,94 19,34 33,52 23,33 30,09 26,53 30,06 28,77 30,3 30,64 30,61 32,57 30,83 34,33 31,17
2 7 15,93 35,84 19,58 34,65 23,19 30,78 26,51 30,36 28,94 30,43 30,69 30,54 32,57 31,02 34,36 31,11
2 8 16,01 35,13 19,47 35,11 23,83 31,39 26,84 30,49 28,89 30,47 31,04 30,69 32,82 30,97 34,81 31,07
2 9 15,82 35,76 19,51 33,57 22,85 31,82 26,6 30,2 28,75 30,61 30,65 30,61 32,61 31,03 34,62 30,79
2 10 15,98 34,91 19,62 33,62 23,07 31,2 29,66 30,45 30,65 30,68 32,48 30,78 34,88 31,13 36,45 30,8
2 11 15,92 34,9 19,78 32,33 22,81 32,06 26,63 30,34 28,67 30,35 30,76 30,76 33,58 30,23 34,93 30,88
2 12 16,62 30,87 19,96 32,42 23,81 30,07 27,13 30,21 28,86 30,48 30,85 30,75 32,61 30,9 34,92 31,06
% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
(x̅) 15,93 35,24 19,59 33,18 23,10 31,14 26,79 30,29 28,88 30,45 30,75 30,65 32,84 30,87 34,60 30,97
(σ) 0,22 0,54 0,14 1,30 0,30 0,68 0,93 0,12 0,59 0,13 0,60 0,07 0,74 0,23 0,66 0,14
𝐸 = (10−1
𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1
−3475 − 1) ∗ 100% = 93,96%
y = -3,475x + 33,49R² = 0,999
15
20
25
30
35
40
-1 0 1 2 3 4 5 6
(x̅)
Cp
Log 10 Genomäquivalente
Candida albicans
Standardkurve
ANHANG
L
Tabelle 43: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Issatchenkia orientalis-DNA
Issatchenkia orientalis (CBS 5147) - Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM / HEX)
PCR-Lauf Replikat 100 000 10 000 1 000 100 25 6,25 1,56 0,39
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
1 1 15,04 32,58 18,91 31,97 22,61 31,1 26,11 30,27 28,06 30,26 30,11 30,61 31,97 30,88 34,18 31,14
1 2 15,05 32,28 18,78 32,09 22,3 31,55 25,63 30,34 27,85 30,29 29,79 30,64 31,92 30,72 33,54 30,87
1 3 15,18 32,05 18,74 31,84 22,15 31,19 25,69 30,33 27,85 30,27 29,95 30,59 31,81 30,81 33,9 31,06
1 4 15,07 32,7 18,7 32,55 22,14 31,36 25,62 30,48 27,81 30,48 29,9 30,64 31,71 30,85 33,65 30,91
1 5 14,99 32,79 18,62 31,99 22,13 31,74 25,61 30,13 27,73 30,31 29,81 30,57 31,53 30,74 33,58 30,81
1 6 15,05 32,63 18,77 31,55 22,47 30,49 25,76 30,29 27,82 30,34 29,61 30,32 31,62 30,76 33,37 30,89
2 7 15,19 32,66 18,92 31,78 22,32 31,63 25,93 30,19 27,92 30,55 30,04 30,65 31,93 30,82 33,8 31,08
2 8 15,25 33,11 18,88 32,42 22,29 31,1 25,81 30,49 28,06 30,32 29,98 30,51 31,65 30,9 33,83 31,07
2 9 15,33 32,56 18,81 32,27 22,25 31,55 25,81 30,2 27,89 30,24 29,95 30,56 31,61 30,89 33,57 30,79
2 10 15,11 33,71 18,81 32,49 22,12 31,69 25,81 30,18 27,99 30,36 29,95 30,52 31,88 30,82 33,71 30,99
2 11 15,27 32,78 18,88 32,12 22,33 31,14 26,05 30,24 27,88 30,29 30,28 30,69 31,9 30,63 33,79 31,03
2 12 15,33 32,8 18,91 31,93 22,45 30,99 25,91 30,19 27,99 30,35 30,1 30,55 31,82 30,89 33,89 30,9
% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
(x̅) 15,16 32,71 18,80 32,10 22,28 31,32 25,80 30,29 27,90 30,34 29,94 30,57 31,78 30,80 33,72 30,97
(σ) 0,11 0,41 0,09 0,30 0,15 0,35 0,16 0,11 0,10 0,09 0,17 0,10 0,15 0,08 0,21 0,11
𝐸 = (10−1
𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1
−3,439 − 1) ∗ 100% = 95,33%
y = -3,439x + 32,54R² = 0,999
15
20
25
30
35
-1 0 1 2 3 4 5 6
(x̅)
Cp
Log 10 Genomäquivalente
Issatchenkia orientalis
Standardkurve
ANHANG
LI
Tabelle 44: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Pichia anomala-DNA
Pichia anomala(DSM 70783) - Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM / HEX)
PCR-Lauf Replikat 100 000 10 000 1 000 100 25 6,25 1,56 0,39
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
1 1 17,05 34,9 20,59 32,78 24,03 30,96 27,57 30,54 29,75 30,56 31,52 30,73 33,54 31,06 35,19 30,95
1 2 17,16 33,95 20,66 32,27 24,05 30,85 27,67 30,36 29,67 30,59 31,49 30,7 33,51 30,91 35,15 31,17
1 3 17,07 34,26 20,72 31,96 24,15 30,76 27,63 30,19 29,59 30,51 31,59 30,77 33,71 30,98 34,96 31,04
1 4 17,19 34,24 20,5 32,39 24,02 30,68 27,37 30,33 29,44 30,67 31,21 30,67 33,29 30,87 35,46 30,98
1 5 17,22 33,1 20,73 32,44 23,99 30,84 27,51 30,28 29,54 30,61 31,53 30,75 33,62 30,89 35,73 30,96
1 6 16,72 38,77 20,63 34,13 23,97 31,76 27,63 30,2 29,45 30,59 31,54 30,73 33,37 30,75 35,25 30,99
2 7 16,33 40 20,7 31,77 24 31,01 27,58 30,1 29,42 30,56 31,62 30,76 33,25 31,08 35,52 31,21
2 8 16,94 36,67 20,55 34,51 24,13 30,8 27,44 30,45 29,64 30,67 31,43 30,83 33,04 31,07 35,34 30,95
2 9 16,93 35,9 20,87 30,95 24,05 30,97 27,67 30,14 29,93 30,6 31,55 30,82 33,66 30,91 35,43 30,94
2 10 17,01 36,02 20,93 31,08 24,45 30,22 27,58 30,47 29,51 30,61 32,06 30,56 33,63 30,87 35,26 31,2
2 11 17,12 33,6 20,71 31,87 24,19 30,35 27,76 30,25 30,15 30,62 31,92 30,69 33,83 31 35,46 30,97
% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
(x̅) 16,98 35,58 20,69 32,38 24,09 30,84 27,58 30,30 29,64 30,60 31,59 30,73 33,50 30,94 35,34 31,03
(σ) 0,25 2,09 0,12 1,06 0,13 0,38 0,11 0,14 0,22 0,04 0,22 0,07 0,22 0,10 0,20 0,10
𝐸 = (10−1
𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1
−3,392 − 1) ∗ 100% = 97,16%
y = -3,392x + 34,20R² = 0,999
15
20
25
30
35
40
-1 0 1 2 3 4 5 6
(x̅)
Cp
Log 10 Genomäquivalente
Pichia anomala
Standardkurve
ANHANG
LII
Tabelle 45: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Zygosaccharomyces bailii-DNA
Zygosaccharomyces bailii (DSM 70492) - Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM / HEX)
PCR-Lauf Replikat 100 000 10 000 1 000 100 25 6,25 1,56 0,39
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
1 1 16,92 33,87 20,49 32,14 23,9 31,01 27,69 30,24 29,75 30,48 31,51 30,78 33,71 31,08 35,13 31,06
1 2 16,67 34,93 20,17 34,22 23,59 32,01 27,29 30,56 29,1 30,52 31,32 30,83 33,62 30,82 35,27 31,22
1 3 16,86 34,43 20,3 34,71 23,94 30,46 27,6 30,34 29,95 30,6 31,79 30,87 33,28 30,85 35,31 31,1
1 4 16,91 32,6 20,41 32,54 23,9 30,47 27,25 30,26 29,24 30,59 31,26 30,71 33,34 30,92 34,92 31,34
1 5 16,98 33,8 20,49 32,48 23,47 33,84 27,54 30,23 29,78 30,55 32,04 30,83 33,79 30,76 35,41 30,7
1 6 16,46 38,07 20,61 30,77 23,71 30,85 27,43 30,47 29,94 30,48 31,36 30,86 33,77 30,84 35,89 31
2 7 17,17 33,26 20,6 32,8 24,18 30,25 27,89 30,47 29,89 30,67 32,05 30,66 33,74 30,87 36,22 31,01
2 8 16,86 34,58 20,54 32,89 23,92 30,74 27,58 30,14 29,52 30,32 31,26 30,69 33,38 30,78 35,46 30,96
2 9 16,93 34,72 20,6 32,84 23,99 30,69 27,58 30,11 29,71 30,47 31,58 30,65 33,55 30,82 35,19 30,77
2 10 17,01 33,8 20,83 31,5 24,06 30,75 27,56 30,18 29,8 30,56 31,62 30,6 33,68 30,77 34,93 30,94
2 11 16,87 34,82 20,5 33,46 24 30,62 27,27 30,2 29,49 30,53 31,67 30,77 33,95 30,85 35,86 30,83
% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
(x̅) 16,88 34,44 20,50 32,76 23,88 31,06 27,52 30,29 29,65 30,52 31,59 30,75 33,62 30,85 35,42 30,99
(σ) 0,18 1,33 0,17 1,07 0,20 0,98 0,19 0,14 0,27 0,09 0,27 0,09 0,20 0,09 0,40 0,18
𝐸 = (10−1
𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1
−3,449 − 1) ∗ 100% = 94,96%
y = -3,449x + 34,27R² = 0,999
15
20
25
30
35
40
-1 0 1 2 3 4 5 6
(x̅)
Cp
Log 10 Genomäquivalente
Zygosaccharomyces bailii
Standardkurve
ANHANG
LIII
Tabelle 46: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Dekkera anomala-DNA
Dekkera anomala (DSM 70727) - Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM / HEX)
PCR-Lauf Replikat 100 000 10 000 1 000 100 25 6,25 1,56 0,39
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
1 1 17,7 33,78 21,22 32,49 24,91 30,65 28,14 30,33 30,16 30,67 32,46 30,88 34,43 31,00 35,53 30,81
1 2 17,83 33,64 21,18 32,03 24,79 30,24 28,36 30,24 30,53 30,6 32,32 30,93 34,66 31,15 36,17 31,04
1 3 17,79 33,68 21,26 32,28 24,8 30,44 28,02 30,30 30,19 30,46 32,05 30,69 34,15 30,79 35,69 30,96
1 4 17,73 33,97 21,15 31,89 24,8 30,43 28,20 30,24 30,43 30,73 32,50 30,91 34,54 30,96 36,09 30,97
1 5 17,72 33,66 21,22 31,64 24,8 30,52 28,10 30,45 30,21 30,67 32,51 30,92 34,49 31,15 35,31 31,04
1 6 17,80 33,77 21,3 31,69 24,69 30,69 28,30 30,44 30,59 30,68 32,57 30,97 34,26 30,79 36,34 31,00
2 7 17,6 35,6 21,20 32,63 24,71 30,40 27,92 30,65 30,16 30,73 31,87 30,94 33,9 31,03 35,89 31,10
2 8 17,62 35,21 21,21 33,11 24,93 30,27 28,41 30,46 30,14 30,52 32,18 30,92 33,92 31,04 36,44 31,06
2 9 17,62 34,87 21,51 31,05 25,12 31,02 28,45 30,33 30,33 30,64 32,41 30,81 33,94 31,22 36,06 31,23
2 10 17,62 35,69 21,65 30,59 24,81 30,97 28,03 30,35 30,12 30,66 32,55 30,80 34,56 30,94 37,08 30,97
2 11 17,56 35,01 21,26 31,02 25,01 30,06 28,15 30,26 30,47 30,66 32,26 30,76 34,48 30,93 35,95 31,00
% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
(x̅) 17,69 34,44 21,29 31,86 24,85 30,52 28,19 30,37 30,30 30,64 32,33 30,87 34,30 31,00 36,05 31,02
(σ) 0,09 0,79 0,15 0,73 0,12 0,28 0,16 0,12 0,17 0,08 0,21 0,08 0,27 0,13 0,46 0,10
𝐸 = (10−1
𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1
−3,411 − 1) ∗ 100% = 96,4%
y = -3,411x + 34,94R² = 0,999
15
20
25
30
35
40
-1 0 1 2 3 4 5 6
(x̅)
Cp
LOG 10 Genomäquivalente
Dekkera anomala
Standardkurve
ANHANG
LIV
Tabelle 47: LOD/LOQ: Cp-Werte der Negativkontrollen
NTC-Replikate (Cp-Werte FAM / HEX)
PCR-
Lauf
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
1 - 30,89 - 31,19 40,00 31,06 37,97 30,89 28,92 30,97 33,18 30,84 - 30,99 - 31,05 - 30,84 - 30,97 38,98 30,98 N/A N/A
2 - 31,28 - 31,07 - 30,98 - 30,94 - 31,07 - 30,84 30,54 30,96 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
3 - 30,77 38,06 30,98 - 30,95 - 30,96 - 30,94 40,00 N/A - 30,9 - 30,9 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
4 - 30,94 - 31,02 - 30,9 40,00 31,15 - 31,22 40,00 30,99 - 31,22 - 31,09 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
5 - 31,03 - 30,86 37,64 30,9 - 30,93 40,00 31,47 - 31,23 - 31,14 - 31,01 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
6 - 31,00 - 31,17 - 31,00 39,59 31,00 - 30,85 - 31,02 - 30,91 - 30,86 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
7 - 31,04 40,00 31,05 40,00 31,15 - 30,99 - 31,21 - 31,18 - 31,15 40,00 30,99 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
8 - 31,18 - 30,96 - 30,88 40,00 31,03 40,00 30,57 40,00 31,13 - 31,04 - 31,15 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
9 - 31,23 - 29,94 40,00 29,93 - 31,11 - 31,16 - 31,07 - 31,17 - 31,14 40,00 31,07 N/A N/A N/A N/A N/A N/A
10 40,00 31,25 - 31,05 - 30,87 - 31,17 - 31,11 - 30,82 - 30,92 - 31,11 - 30,93 - 30,94 - 31,06 - 31,10
11 - 31,21 40,00 30,93 39,97 31,19 39,54 31,07 - 31,04 - 30,85 - 31,18 - 30,90 - 30,84 - 30,84 - 30,95 - 31,03
12 40,00 30,62 - 30,99 - 30,87 - 31,05 - 30,92 - 31,13 - 30,92 - 31,01 - 31,18 40,00 30,83 - 30,83 - 30,94
13 - 31,07 - 30,97 - 30,35 - 31,14 - 30,90 - 31,10 - 30,88 - 30,99 - 30,89 - 31,27 - 30,83 40,00 30,95
14 - 30,82 - 31,12 - 30,70 - 31,00 - 30,87 - 31,00 38,13 30,76 - 30,76 - 30,86 N/A N/A N/A N/A N/A N/A
15 - 31,00 - 31,04 - 31,25 - 30,82 - 31,03 - 31,03 40,00 31,04 - 30,98 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
∑ Replikate 140
% Positive 21,43 100
(x̅) 38,75 30,99
(σ) 2,67 0,19
ANHANG
LV
Tabelle 48: Statistische Gesamtauswertung zur LOD/LOQ-Untersuchung
Spezies
Genomäquivalente je Reaktion (x̅ und σ FAM / HEX)
100 000 GÄ 10 000 GÄ 1 000 GÄ 100 GÄ 25 GÄ 6,25 GÄ 1,56 GÄ 0,39 GÄ NTC
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
Rhodotorula mucilaginosa (DSM 70403)
∑ Replikate 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 N/A N/A
% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% N/A N/A
x̅ (Cp) 16,58 30,60 20,17 30,59 23,79 30,54 27,10 30,66 29,06 30,75 31,04 30,86 32,88 30,85 35,07 30,98 N/A N/A
σ (Cp) 0,24 0,15 0,20 0,09 0,18 0,15 0,20 0,09 0,27 0,09 0,21 0,10 0,35 0,18 1,59 0,10 N/A N/A
Cryptococcus curvatus
(DSM 70022)
∑ Replikate 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 N/A N/A
% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% N/A N/A
x̅ (Cp) 16,46 30,66 20,11 30,56 23,56 30,49 26,99 30,69 29,03 30,81 30,89 30,91 32,67 30,98 34,57 31,06 N/A N/A
σ (Cp) 0,11 0,09 0,26 0,11 0,25 0,12 0,37 0,10 0,25 0,11 0,34 0,09 0,52 0,08 0,89 0,13 N/A N/A
Mucor racemosus (CBS 225.37)
∑ Replikate 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 N/A N/A
% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% N/A N/A
x̅ (Cp) 15,55 30,70 19,14 30,50 22,67 30,55 25,99 30,66 28,13 30,76 29,89 30,82 31,87 31,00 34,58 30,97 N/A N/A
σ (Cp) 0,15 0,16 0,15 0,14 0,17 0,09 0,16 0,07 0,39 0,08 0,23 0,16 0,20 0,09 1,45 0,07 N/A N/A
Absidia corymbifera (DSM
1144)
∑ Replikate 11 11 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 40 40
% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 22,5% 100%
x̅ (Cp) 15,70 30,56 19,05 30,49 22,67 30,56 26,24 30,54 28,25 30,70 30,11 30,82 32,13 30,90 34,14 30,95 39,95 30,98
σ (Cp) 0,11 0,16 0,17 0,24 0,20 0,16 0,36 0,14 0,28 0,12 0,37 0,13 0,43 0,16 0,66 0,19 0,14 0,28
Schizo-saccharomyces
pombe (DSM 70572)
∑ Replikate 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 N/A N/A
% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% N/A N/A
x̅ (Cp) 16,40 34,46 19,98 33,66 23,42 31,91 26,76 30,47 28,88 30,61 30,88 30,84 33,02 31,07 34,27 31,19 N/A N/A
σ (Cp) 0,16 0,42 0,17 0,56 0,18 0,46 0,21 0,13 0,20 0,16 0,20 0,17 0,50 0,17 1,13 0,21 N/A N/A
Fusarium oxysporum (DSM
841)
∑ Replikate 11 11 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 40 40
% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 22,5% 100%
x̅ (Cp) 15,71 32,89 19,22 33,58 22,81 31,34 26,33 30,30 28,53 30,41 30,52 30,70 32,52 30,85 34,17 30,97 39,95 30,98
ANHANG
LVI
Spezies
Genomäquivalente je Reaktion (x̅ und σ FAM / HEX)
100 000 GÄ 10 000 GÄ 1 000 GÄ 100 GÄ 25 GÄ 6,25 GÄ 1,56 GÄ 0,39 GÄ NTC
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
σ (Cp) 0,10 0,33 0,21 0,83 0,15 0,40 0,22 0,15 0,15 0,13 0,17 0,11 0,19 0,09 0,58 0,10 0,14 0,28
Cladosporium cladosporoides (DSM 62121)
∑ Replikate 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 16 16
% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 25% 100%
x̅ (Cp) 18,98 33,47 22,69 31,29 26,14 30,32 29,68 30,58 31,80 30,86 33,70 31,04 35,38 31,03 37,18 31,04 39,41 31,07
σ (Cp) 0,07 0,41 0,11 0,40 0,11 0,11 0,19 0,07 0,13 0,10 0,22 0,14 0,41 0,11 1,04 0,07 1,02 0,16
Alternaria citri (CBS 106.27)
∑ Replikate 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 16 16
% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 25% 100%
x̅ (Cp) 17,46 33,62 21,07 32,36 24,62 30,56 27,73 30,25 30,19 30,58 32,19 30,81 34,26 30,92 35,89 30,91 39,41 31,07
σ (Cp) 0,21 0,56 0,22 0,28 0,16 0,17 1,05 0,09 0,16 0,10 0,27 0,05 0,34 0,10 0,29 0,12 1,02 0,16
Penicillium chrysogenum
(DSM 848)
∑ Replikate 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 16 16
% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 12,5% 100%
x̅ (Cp) 16,29 35,10 19,83 33,08 22,98 31,44 26,31 30,21 28,43 30,29 30,39 30,59 32,41 30,82 34,09 30,93 39,80 31,00
σ (Cp) 0,07 0,29 0,14 0,88 0,08 0,39 0,14 0,09 0,27 0,13 0,24 0,07 0,21 0,07 0,44 0,09 0,20 0,11
Aspergillus brasiliensis (DSM
1988)
∑ Replikate 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 16 16
% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 37,5% 100%
x̅ (Cp) 17,32 33,80 20,70 32,42 24,01 30,94 27,43 30,39 29,52 30,44 31,47 30,70 33,33 30,97 35,25 31,03 40,0 31,1
σ (Cp) 0,12 0,56 0,20 0,61 0,14 0,27 0,15 0,14 0,13 0,14 0,27 0,16 0,30 0,12 0,39 0,12 0,0 0,1
Candida albicans (ATCC 10231)
∑ Replikate 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 N/A N/A
% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% N/A N/A
x̅ (Cp) 15,93 34,87 19,62 33,12 23,16 31,05 26,81 30,29 28,88 30,45 30,76 30,66 32,82 30,87 34,63 30,98 N/A N/A
(Cp) 0,22 1,31 0,17 1,26 0,35 0,72 0,90 0,12 0,56 0,12 0,58 0,07 0,71 0,22 0,64 0,14 N/A N/A
Issatchenkia orientalis
(CBS 5147)
∑ Replikate 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 N/A N/A
% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% N/A N/A
x̅ (Cp) 15,16 32,72 18,81 32,08 22,30 31,29 25,81 30,28 27,90 30,34 29,96 30,57 31,78 30,81 33,73 30,96 N/A N/A
ANHANG
LVII
Spezies
Genomäquivalente je Reaktion (x̅ und σ FAM / HEX)
100 000 GÄ 10 000 GÄ 1 000 GÄ 100 GÄ 25 GÄ 6,25 GÄ 1,56 GÄ 0,39 GÄ NTC
FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX
σ (Cp) 0,11 0,39 0,09 0,29 0,15 0,35 0,16 0,11 0,10 0,09 0,17 0,09 0,14 0,08 0,20 0,11 N/A N/A
Pichia/Hansenula anomala
(DSM 70783)
∑ Replikate 12 12 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 26 26
% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 31% 100%
x̅ (Cp) 17,02 35,25 20,69 32,38 24,09 30,84 27,58 30,30 29,64 30,60 31,59 30,73 33,50 30,94 35,34 31,03 34,93 30,97
σ (Cp) 0,27 2,28 0,12 1,06 0,13 0,38 0,11 0,14 0,22 0,04 0,22 0,07 0,22 0,10 0,20 0,10 4,28 0,11
Zygo-saccharomyces
bailii (DSM 70492)
∑ Replikate 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 16 16
% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 37,5% 100%
x̅ (Cp) 16,88 34,44 20,50 32,76 23,88 31,06 27,52 30,29 29,65 30,52 31,59 30,75 33,62 30,85 35,42 30,99 40,0 31,1
σ (Cp) 0,18 1,33 0,17 1,07 0,20 0,98 0,19 0,14 0,27 0,09 0,27 0,09 0,20 0,09 0,40 0,18 0,0 0,1
Dekkera anomala (DSM 70727)
∑ Replikate 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 26 26
% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 31% 100%
x̅ (Cp) 17,69 34,44 21,29 31,86 24,85 30,52 28,19 30,37 30,30 30,64 32,33 30,87 34,30 31,00 36,05 31,02 34,93 30,97
σ (Cp) 0,09 0,79 0,15 0,73 0,12 0,28 0,16 0,12 0,17 0,08 0,21 0,08 0,27 0,13 0,46 0,10 4,28 0,11
ANHANG
LVIII
IX. Anreicherungs- und Detektionszeitpunkt von verschiedener Hefen in Matrices
Tabelle 49: Ausführliche Darstellung der Resultate für PCR und Mikrobiologie für die Anreicherungsdauer vier verschiedener Hefen in drei Matrices
Spezies Dotierungslevel
(KBE/100ml) Nach 24h Anreicherung Nach 48h Anreicherung
Bananen-
nektar
Johannis-
beere (1:10) Multivitamin (1:10)
Bananen-
nektar
Johannis-
beere (1:10) Multivitamin (1:10)
PCR (Cp)
YM (KBE/100µl)
PCR (Cp)
YM (KBE/100µl)
PCR (Cp)
YM (KBE/100µl)
PCR (Cp)
YM (KBE/100µl)
PCR (Cp)
YM (KBE/100µl)
PCR (Cp)
YM (KBE/100µl)
Z. bailii
4x100 - 0 - 0 - 0 - 315 - 528 - 218
4,8x101 - 7 - 12 - 5 34,88 tntc - tntc 35,94 tntc
undotiert - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0
Y. lipolytica
1,6x101 35,20 149 37,43 59 - 0 23,35 tntc 28,76 tntc 28,58 tntc
1,53x102 33,27 tntc 35,87 252 36,22 149 22,65 tntc 27,52 tntc 29,19 tntc
Undotiert - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0
C. parapsilosis
6,8x101 35,83 tntc - 250 36,93 504 25,70 tntc 31,51 tntc 29,34 tntc
7x102 32,91 tntc - tntc 36,38 tntc 24,08 tntc 29,81 tntc 28,96 tntc
Undotiert - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0
S. cerevisiae
1x100 35,97 tntc 34,17 tntc - 0 16,60 tntc 20,93 tntc 40,00 tntc
4x100 33,79 tntc 30,30 tntc 35,67 tntc 16,13 tntc 20,52 tntc 21,60 tntc
Undotiert - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0
Gelistet sind die Cp-Werte der PCR-Reaktionen sowie die ausgezählten KBE der angelegten YM-Nährmedien zu den Beprobungszeitpunkten nach 24h und 48h Anreicherung. Untersucht wurde die optimale Anreicherungsdauer der vier Hefen Zygosaccharomyces bailii, Yarrowia lipolytica, Candida parapsilosis und Saccharomyces cerevisiae in den Matrices Bananennektar, Johannisbeer- und Multivitaminfruchtsaftkonzentrat. Die Matrices wurden im Verhältnis 1:10 mit SSL-Medium versetzt und nach der Dotierung bei 27 bis 30°C inkubiert. Eine undotierte Kontrollprobe wurde mitgeführt. Die Hefen Y. lipolytica, C. parapsilosis und S. cerevisiae wurden in allen Matrices bereits nach 24h in der PCR detektiert, während Z. bailii nach 48h nur in 2 von drei Matrices nachgewiesen werden konnte.
ANHANG
LIX
X. Absterbekinetik von Aspergillus-brasiliensis-Sporen
Tabelle 50: Absterbekinetik von Aspergillus-Sporen bei Hitzebehandlung
t in min Cp 1 Cp 2 x̅ (Cp) σ (Cp) Δ Cp (t = 0 min)
0 24,36 24,36 24,36 0 0
5 25,68 26,42 26,05 0,52 -1,69
10 28,94 28,91 28,925 0,02 -4,57
15 32,33 32,11 32,22 0,15 -7,86
20 30,66 31,07 30,87 0,29 -6,51
30 32,93 33,19 33,06 0,18 -8,7
40 33,31 32,94 33,13 0,26 -8,77
60 33,35 33,15 33,25 0,14 -8,89
Aspergillus-brasiliensis-Sporen (1x104
Sporen/100 µl) wurden über einen Zeitraum von 60 min thermisch
behandelt (80°C). Zu definierten Zeitpunkten (min) wurden Proben als Duplikate entnommen. Als Referenzwert wurde Sporensuspension zum Zeitpunkt t = 0 min, also ohne thermische Behandlung, mitgeführt. Alle Proben wurden mit Reagent D behandelt, lysiert und mittels PCR analysiert. Es sind die Cp-Werte der Einzelproben (Cp 1, Cp 2) zu jedem Entnahmezeitpunkt sowie der sich daraus ergebende Cp-Mittelwert (x̅ (Cp)) und die Standardabweichung (σ (Cp)) berechnet worden.