Relevanz von Virusvarianten für Diagnostik, Therapie und Krankheitsverlauf am Beispiel der
Hepatitis B
Thomas Bock, PhDRobert Koch-Institut, BerlinFG15, Molekulare Epidemiologie viraler Erreger
Fortbildung für den Öffentlichen GesundheitsdienstBerlin, 24. – 26. März 2010
Bock & Zentgraf 1995
Hepatitis-Viren: Hepatitis A Virus (HAV, Picornaviren)Hepatitis B Virus (HBV, Hepadnaviren)Hepatitis C Virus (HCV, Flaviviren, Hepaciviren)Hepatitis D Virus (HDV, Viroid)Hepatitis E Virus (HEV, Caliciviren)Hepatitis G Virus (GBV-C, Flaviviren)TT-Virus (Circoviren)SENV-D/H-Virus (Circoviren)NonA-nonG Viren
Andere Virusinfektionen mit Folge Hepatitis:
Humanes Cytomegalie Virus (HCMV, HHV5, Beta-Herpesvirus)Herpes simplex Virus (HSV1, [HSV2], Alpha-Herpesvirus)Epstein Barr Virus (EBV, HHV4, Gamma-Herpesvirus)Gelbfieber Virus (Yellow fever virus, YFV, Flaviviren)
Virus Hepatitis
Bock & Zentgraf 1995
http://www.clinical-
virology.org/gallery/cvn_em_01.html
Quelle: http://www.hepb.de/cps/rde/xchg/bms_hepb/hs.xsl/home_hepatitis-b_kampagne.html
WHO und Robert Koch-Institut, Berlin (Epidem. Bulletin 2009, 20:189-202)
• ca. 2 Milliarden von derzeit ca. 6,5 Milliarden Menschen aktuell mit HBV infiziert
• > 420 Millionen Menschen = 5%-7% der Weltbevölkerung chronisch HBV infiziert
• > 1 Million/Jahr Todesfälle (HBV-induzierten Leberzirrhose [57% aller Fälle], hepatozellulären Karzinom (HCC) [53% aller HCC]
• In Europa sind zwischen <0,1% (Nordeuropa) und 8% (Ost- und Südeuropa) der Bevölkerung chronisch mit HBV infiziert
• In der Bundesrepublik Deutschland wurden im Jahre 2008 1.850 akuter HBV-Neuerkrankungen an das RKI gemeldet, wobei etwa 5% Virusträger bleiben
Epidemiologie der Hepatitis B Virus Infektion
Hepatitis B Virus Verbreitung
Quelle: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/09/HBV_prevalence_2005.png
Pressefoto zum Start der Kampagne Hepatitis B 2009Welt-Hepatitis Tag 19.05.2009
Bock & Zentgraf 1995100 nm
Infektiöse HBV-Virionen
Nicht-infektiöse filamentöse und globuläre HBV-Partikel
(HBsAg)
1012 virale Kopien/ml Serum(1013 HBsAg* Partikel/ml Serum)
Hepatitis B Virus Partikel im Serum
• umhülltes ~40 nm DNA-Virus; ~20 nm Kapsid
• Hepadnavirus, Pararetrovirus
• pdDNA, ca. 3200 bp
• 4 überlappende Leserahmen (ORF)
• preC/Core, preS/surface, RT-Polymerase, X-Protein
• Promotoren: pg/Core, S and X-Promotor; Enh 1 und Enh 2
• 8 Genotypen
• strikt hepatotroph
Hepatitis B Virus
fila
men
teo
us
globular
Infectious virion„Dane-particel“(approx. 42 nm)
Not-infectiousHBsAg-particel(apprx. 20 nm)
CapsidHBcAg
HBVDNA genome
LHBs
MHBs
SHBs
SHBs
SHBs
Hepatitis B Virus Genom
HBV Virion
Surface Genes
X-GenC
apsidgen
Polymerase
HBV Genom
nach Kann & Gerlich, 1998, modifiziert
Interaktion
Virion
Nucleus
Hepatozyte
Translation
EnkapsidierungReverse
Transkription
pgRNApgRNADNA (-)
cccDNA Amplifikation
Transkription
mRNAmRNA
pgRNApgRNA
AAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAcccDNAcccDNA
cccDNA Formation
rcDNA
Entry
Polymerase
DNA (+)
(+) StrangSynthese
Virion Sekretion
ER
HBeAgHBsAg
Rezeptor ?
ER
virale ProteineSekretion
Hepatitis B Virus Lebenszyklus
Adapted from: Ganem D, et al. N Engl J Med 2004
HBV Minichromosom (Bock et al 2001)
• parenteral
(Blut/-produkte)
(Dialyse)
kontaminierte Instrumente
kontaminierte Spritzen
• sexuell
• perinatal
Übertragungswege des Hepatitis B Virus
Quelle: www.endowsec.com/pated/gifs/elv0010.gif
Quelle: CDC Sentinel Counties Study of Viral Hepatitis
Heterosexuelle(Promiskuität)
(41%)
Homosexuelle (9%)
familiärer Kontakt (2%)Heilberufe (1%)
Unbekannt (31%)
Drogen-abhängige
(15%)
Risikogruppen der Hepatitis B Virus-Infektion
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
Altersgruppen
Altersspezifische Inzidenz der Hepatitis B, Jilg; Dt. Ärzteblatt 1996
gem
eld
ete
Erk
ran
kun
gen
/100
.000
< 5 5 - 15 15 - 25 25 - 45 45 – 65 >65
3,9% 6,7% 25,9% 41,8% 15,3% 6,4%
Alterspezifische Verteilung von HBV Infektionen
Klinischer Verlauf der Hepatitis B Virus Infektion
akut(35%)
Chronische Hepatitis(5-10%)
Primäres Leberkarzinom
fulminant(<1%)
inapparent(65%)
„Gesunde“ HBsAg-Träger
Zirrhose
HBV Infektion
(10%)
Ausheilung
chronisch persistent(70%)
chronisch aktiv(30%)
(90%-95%)
?(>50%)
(10%)
tuepedia.de/index.php/Ludwig_Uhland
7,8% keine Risikofaktoren
0,4 % Steroid Missbrauch
0,4 % M. Wilson
0,7% Hämochromatose
15,7 % andere Leberzirrhose
3,0 % Hep B und C und Alkohol
6,3 % Hep. B und Alkohol
3,7% Hep. C und Alkohol
23,1 % Alkohol Missbrauch
7,1 %Hepatitis B und C18,7 % Hepatitis B
13,1 % Hepatitis C
Inzidenz des hepatozellulären Karzinoms in Hannover1995-1998 / n= 268
Kubicka et al, Liver 2000; 20(4):312-8
Akute Hepatitis B: Diagnostik
Serologie:
- HBsAg, anti-HBc (total und IgM)
- HBeAg, (anti-HBe)
Weitere Methoden:
- HBV-DNA (quantitaiv)
- Transaminasen
HBe/HBs Sero-conversion
Ganem & Prince, 2004
Chronische Hepatitis B: Diagnostik
• Zusätzlich zur Akut-Diagnostik:- Sonographie der Leber- zusätzliche biochemische Marker (Albumin, ChE, Quick, AFP)- Ausschluss anderer Infektionen (HIV, HDV, HCV)- Leberhistologie
Ganem & Prince, 2004
keine HBe/HBs Sero-conversion
Diagnostik der HBV Infektion
HBsAg positiv
HBeAg, HBV-DNA
(hoch-replikativ) (niedrig-replikativ)+ -
anti-HDV
>105 IE/ml <105 IE/ml
Chen CJ et al. EASL 2005
kumulative Inzidenz des HCC abhängig der “baseline” HBV DNA (n=3851)
P<0.01
HBV Viruslast und HCC-Risko
HBV-Core-spezifische Quantitative Real Time
Taqman PCR
HBV qPCRAmplification Plot
Standard Kurve
Kommerziell z.B.:COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV Test
Weltweite HBV-Genotyp Verteilung
A
A(e)
A
B(j)
B(a)
C
C
D
D
E
F
F
G
G
H
A(a)
A(a)
H
D
F
Adapted from Hamilton and Gross
• Interferon alpha: Genotyp A und B sprechen relativ gut an
Genotyp D und C sprechen nur moderat an
• Lamivudine: Resistenzrate höher bei A als in D
kein Unterschied zwischen B und C
• Adefovir: keine Genotyp-spezifischen Unterschiede
• andere Nukleoside: bislang nicht bestimmt
HBV Genotypen und Suszeptibilität zuantiviralen Substanzen
Variable preS/S-region zur HBV Genotypisierung
Methoden zur HBV Genotyp Bestimmung
Therapie der chronischen Hepatitis B Virus Infektion
• (PEG)-Interferon-αααα• Nucleoside Analoga (Lamivudine, Entecavir, Telbivudine)
• Nucleotide Analoga (Adefovir dipivoxil, Tenofovir)
• Hepatitis B Hyperimmunoglobulin (HBIG)
Prophylaxis des Hepatozellulären Karzinoms
Wirkung Antiviraler SubstanzenInhibition der Reversen Transkription
Inhibitoren der viralen Polymerase
durch Nucleos(t)idanaloga:
• Herpesvirus Polymerase:
Aciclovir, Ganciclovir
Inhibitoren der Reversen Transcriptase:
• HIV: AZT (Zidovudine)
• HBV Polymerase:
Lamivudin (ZeffixTM)
Adefovir (HepseraTM)
Entecavir (BaracludeTM)
Telbivudine (SebivoTM)
Tenofovir (Viread®)
Selektion von Therapie-resistenten Mutationen
Adapted from: Ganem D, et al. N Engl J Med 2004
Schema der Nucleos(t)idanalog-Wirkung
wt HBV Polymerase-Funktion Nucleotidanalog-Wirkung auf die HBV Polymerase Funktion führt zu Kettenabbruch
Kettenabbruch
modifiziert nach: Richman, Nature 2001, 410:995-1001
http://www.mcld.co.uk/hiv/images/lamivudine.gif
Hepatitis B: Problem der antiviralen Resistenz
• Nur ein virales Target - die HBV Polymerase
• Nur eine Substanzklasse (Nucleos(t)id-Analoga)
• Antivirale Substanzen:
– Lamivudine / Telbivudine (L-NUCLEOSID)
– Adefovir / Tenofovir (ACYCLISCHES PHOSPHONAT)
– Entecavir (CYCLOPENTEN RING GRUPPE)
Selektion von Hepatitis B Virus VariantenMutanten und Genotypen
Bock & Zentgraf 1995
Virale Faktoren:• HBV ist ein hoch replizierendes Virus (1012 IE/ml)
• Die virale Polymerase (Reverse Transcriptase) besitzt keine “proofing
reading” Aktivität
• 1 - 5 x10-5 Substitutionen/Position/Jahr (S/P/Y)
= >107 Fehler/Tag/Patient
• 104 fach höher im Vgl. zum humanen Genom
• Lange Halbwertszeit der cccDNA (6-10 d)
• Lange Halbwertszeit der infizierten Hepatozyte (>30d)
Wirt Faktoren:• Selektionsdruck des Immunsystems
• Selektionsdruck einer antiviralen Therapie
• Andere selektive Einflüsse
Einfluss von HBV Mutanten auf die Virus Replikation
Mutationen im HBV Genom führen zur:
• Modulation der HBV Replikation
• Beeinflussen die Wirtszell-Suszeptibilität
• Maskieren gegen das Immunsystem
• oder haben keinen Einfluss
Klinische Relevanz von HBV Mutanten
Mutationen im HBV Genom können assoziiert sein mit:
• schweren Leberentzündungen• fulminanter Hepatitis • Leberzirrhose • HCC (Leberzellkarzinom)• Resistenz gegen eine antivirale Therapie
preC C
TP spacer RT RNaseH
S X
BCPSP1 SP2S-Promoters
Enh I Enh IIXP
preS1preS2
A1762T/G1764AHBeAg neg.
G1896A/C1858TpreC-Stopp (HBeAg neg.)
Schwere Leberentzündung, Resistenz
P120T/D144A/G145R„a“ Determinante
„Escape“ Mutanten
M204V/I (YMDD)Lamivudine Resistenz
L180MLamivudine
Resistenz
K130M/V131Iüberlappt mit
A1762/G1764A
N236TAdefovirResistenz
A181VAdefovirResistenz
Stopp Codontrunkiertes X-Protein
HCC Assoziation
Polymerase ORF
Core/HBS/X ORF
3221
/0
3221
/0
1000
2000
3000
HBV Genom
Häufige Mutationen im HBV Genom
antivirale Resistenz
Fung SK & Lok ASF. Antivir Ther 2004; 9:1013–1026.Locarnini S, et al. Antivir Ther 2004; 9:679–693.
Behandlungsstart
Therapie-resistente Varianten
Therapie-suszeptibles Virus
Natürlich vorkommende Virusvarianten
� Mangelnde Suppression- Inadäquate Potenz des Medikaments- Inadäquate Medikamentenkonzentration- Inadäquate Einnahme (non compliance)- Prä-existierende HBV Resistenzmutanten
Time
HB
V R
eplik
atio
n
Mangelnde Suppression der viralen Replikation fördert die Selektion von resistenten Viren
50% T-C
10% T-C
Nachweis von Hepatitis B Virus Quasi-Spezies (YMDD vs YIDD)
50% YMDD/YIDD
10% YIDD
T
T/G
G
Definition der Therapie-Resistenz
• Genotypische Resistenz: Mutationen im HBV Genom welche
sich aufgrund der antiviralen Therapie entwickeln
• Virologischer Durchbruch: Rückfall der HBV Serum DNA
Spiegel während der antiviralen Therapie
• Klinischer Durchbruch: Virologischer Durchbruch mit erhöhten
ALT Spiegelen oder verschlechterter Histologie
• Phänotypische Resistenz: Verringerte Suszeptibilität (in vitro)
der antiviralen Therapie assoziiert mit genotypischer Resistenz
• Kreuzresistenz: Virusmutanten, die durch eine Substanz
selektioniert werden und auch mit einer Resistenz gegen eine
andere Substanz einhergehen
Cornberg, Wedemeyer et al., Z. Gastroenterologie 2007; 45:525-57
Definition der Therapie-ResistenzLeitlinien der „Arbeitsgemeinschaft Wissenschaftlicher
Medizinischer Fachgesellschaften“Cornberg, Wedemeyer et al., Z. Gastroenterologie 2007; 45:525-57
� Klinisch ausreichendes Ansprechen: nach 6 Monaten
antiviraler Therapie ist die Viruslast unter < 200 HBV-IE/ml
gesunken
� Primär virologisches non/bad-response: nach 3 Monaten
antiviraler Therapie kein Abfall der Viruslast um mindestens
>1 log
� Sekundäre Resistenz: nach initialem Ansprechen auf eine
antivirale Behandlung konsekutiver Anstieg der Viruslast um
mehr als >1 log über dem Detektionslimit
Res
iste
nz
(%)
70%
0
20
40
60
80
Jahr 1 Jahre 2 Jahre 3 Jahre 4
Lamivudin1
Adefovir2
29%
Telbivudine4
18%
Jahre 5
Entwicklung einer antiviralen Resistenz unterNukleos(t)id-Analog Behandlung
Entecavir<1% nach 1 Jahr bei
unbehandelten Pat.
20% nach 2 Jahren3 bei Lam-vorbehandelen Pat.
1Lai et al. Clin Infect Dis. 2003;36:687-96 2Hadziyannis et al. Gastroenterology 2006;131:1743–1751, 3Sherman et al. Hepatology 20084Lai et al. AASLD 20065Heathcote et al. AASLD 2007, Marcellin et al. AASLD 2007
Tenofovir5
0% after 72 Wochen
YMDD
rtM204
Fragment1
23
4
HBV Polymerase
Schema PCR/Sequenzierungsmethode zur Mutationsanalysevon Hepatitis B Virus Resistenzmutationen
1 1032 nt
Molekulargenetische Analyse der HBV Polymerase von HBV-infizierten Patienten bei Adefovir Behandlung
YMDD rtN236TrtA181V
A
B C D E
BF/G Polymorphe Bereiche
rtT184GETV
rtA194TTDF?
rtS202IETV
rtM250VETV
rtM204V/ILAM/LdT/ETV
rtL180MLAM/ETV
rtC256SLAM
0
10
20
30
40
50
60
7 21
38
53
80
10
6
11
5
12
0
12
4
12
7
12
9
13
1
13
5
14
5
15
3
16
3
17
3
18
1
18
7
20
7
21
5
22
1
23
1
23
8
25
3
25
7
26
0
26
6
26
8
27
1
29
0
33
6
Häufigkeitsverteilung von HBV Polymerase-Mutationenunter Adefovir Therapie
aa Substitutionen
An
zah
l Pat
ien
ten
n=276 Patienten
Bock et al. Hepatology 2007; 46:658A
Terminal Protein Spacer RNaseH
75 91 163
189
200
210
230
241
247
257
37 47
A B C D EF
1 344
1 153
Reverse Transcriptase
1 179/1 169 G
0
50
100
150
200
250
I16T
L91I
S106T
L115V
L122F
N124H
H126R
D131N
L180M
A181V
I187L
rtV19
1IM20
4IM20
4VL21
7RV23
3IN23
6TN24
8HC25
6W
260L
E263D
I266R
Q267M
/H
n=276 aa Substitution
nu
mb
er o
f p
atie
nts
FG A B C D E
Polymorphe Bereiche
Polymorphe Bereiche der HBV RT-Domäne
Qi et al. 2004 AASLD
Polymorphe Stellen (>1% Sequenz Variation) in der HBV RT-Domäne
59 (17%) der 344 HBV-RT Reste zeigen >1% Sequenzvariation bei HBeAg+ Patienten
Bock et al. Hepatology 2007; 46:658A
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
control 1 µM 10 µM 20 µM
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
control 1µM ADV 5µM ADV 10µM ADV0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
control 1 µM ADV 10 µM ADV 20 µM ADV
rtN236T
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
control 1 µM ADV 10 µM ADV 20 µM ADV
rtV233I
Wildtyp
rtN248H
Suszeptibilität von HBV Polymerase Mutanten gegenüber Adefovir Dipivoxil in funktionellen phänotypischen Assays
EC50=3 µM
EC50= >20 µM
EC50= 12 µMEC50= 16 µM
Bock et al. Hepatology 2007; 46:658A
Yang H. et al. Hepatology 2003;38:705A; Lai CL et al Hepatology 2003;38:262A
V173L L180M A181V/S A184G S202I M204I M204V N236T M250V
LAMLamivudine
ETV*Entecavir
LdTTelbivudine
FTCEmtricitabine
ADVAdefovir
YMDD
Kreuzresistenz bei HBV Therapeutika
* ETV Resistenz
benötigt YVDD
Mutation
TdFtenofovir
Terminal Protein Spacer RNaseH
75 91 163
189
200
210
230
241
247
257
37 47
A B C D EF
1 344
1 153
Reverse Transcriptase
1 179/1 169 G
Selektion kompensatorischer Mutationen unter sequentieller antiviraler Behandlung
Selektion kompensatorischer Mutationen unter antiviraler Behandlung: Patienten
Patient 1
Patient 3
Patient 2
preC CpreS1preS2 S
X
polymeraseTP spacer RNaseHRT
B-domainC-domainpre
CA
TG
=1
EcoR
11407
3221
S-ORFP-ORF
NH2 -
NH2 -
- COOH
B-domain C-domain
catalytic site
145
476
472
149
118
528 5
52
HBV wt adw 2
560TGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTC
NQYGTMQNLHDSCSRQLYVSLMLLYKTYGWKLHLYSHPIVLGFRKIPMGVGLSPFLLAQFTSAICSVVRRAFPHCLAFSYMDDVVLGAK- COOHa-determinant
1921 T
476N
1996 G
145R
2076 L
528M
2148 M
552V
2150 M
552I
sG145R
sP120T
L180M (W171W)
M204V (I195M)
M204I (I195T)
sG145R/M552I
sP120T/M204I
L180M/M204V
sG145R/L528M/M204V
sP120T/L180M/M204V
R
R
R
T
T
T
M
M
MM
V
V
VV
III
Muster von HBV Polymerase Mutanten
120
pHBV1.2
HBIg
FCV
LAM
HBIgP120T
LamL180M
LamM204V
HBIgG145R
Sensitivität von Polymerase Mutantengegenüber Lamivudine
- Keine Sensitivität- erhöhte Replikation
unter LAM Behandlung
con
tro
l
wt
pH
BV
1.2
P12
0T
M20
4V
L18
0M/M
204V
G14
5R/L
180M
/M20
4V
P12
0T/L
180M
/M20
4V
HB
V M
arke
r
- + - + - + - + - + - + - +
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
HBV Progeny DNA
1.0 µM Lamivudine
3.2 kb
Bock et al. Gastroenterology 2002
+ Lam + Lam + Lam
0
50
100
150
200
250
cont
rol
wt-HBV
wt-HBV
+ Lam
P120T
/L18
0M/M
204V
P120T
/L18
0M/M
204V
+ L
amG14
5R/L
180M/M
204V
P120T
/L18
0M/M
204V
+ L
am
Rational für eine De Novo Kombinations-Therapie
Drug A
Drug B
Wildtyp
Drug B ResistenzMutante
Drug A ResistenzMutante
→→ KombinationKombination vonvon TherapeutikaTherapeutika ohneohne KreuzresistenzKreuzresistenz
wt
Geringes Risiko zurGeringes Risiko zurSelektionSelektion vonvon MDRMDR
Clavel et al NEJM 2004;350:1023-35 ; Zoulim Antiviral Res 2004;64: 1-15
Wege zur Resistenzvermeidung
Maximieren der antiviralen Aktivität
– Wahl von Präparaten mit hoher antiviraler Potenz
– Vorgegebene Dosierung einhalten
– Leichte Einnahme, hohe Resorption (Nahrungsunabhängig)
– Für maximale Therapie-Adhärenz sorgen (Compliance)
Maximieren der Resistenzbarriere
– Vermeidung sequentieller Monotherapie
– Auswahl von Nukleos(t)idanaloga mit einer hohen Resistenz-
barriere
– Kombination komplementärer Resistenzprofile
Cornberg et al. Upgrade der Leitlinie, AWMF-Register-Nr.: 021/011, Z Gastroenterol 2007;45:1-50
Resistenz: Zusammenfassung der Leitlinie 2007
• Die neuen Leitlinien unterstreichen die Wichtigkeit der
Resistenzvermeidung und adäquatem Resistenzmanagement
- Bei >1 Mio Kop/ml Einsatz hochpotenter Substanzen
- HBV-DNA Monitoring alle 3 Monate, Intensivierung der Therapie bei
unvollständigem Ansprechen nach 6-12 Monaten
- Rasche Intervention nach sekundärem Therapieversagen (>1 log
Viruslastanstieg)
- Vermeidung sequenzieller Monotherapie
- „Add-on“ Therapie mit komplementärem Resistenzprofil
Cornberg et al. Upgrade der Leitlinie, AWMF-Register-Nr.: 021/011, Z Gastroenterol 2007;45:1-50
Robert Koch-Institut, FG15:Dr. Marina HöhneDr. Sabine DiedrichDr. Meike ChevillotteDr. Sandra NiendorfDr. Andreas Mas MarquesFr. Tina DittmannFr. Daniela GuttFr. Roswitha LorenzFr. Ute ObstFr. Christin KellnerFr. Kathrin StanossekFr. Jenny ThieleFr. Sonja Zimmermann
Royal Melbourne Hospital, AustraliaProf. Dr. Joseph TorresiProf. Dr. Stephen Locarnini
University of TübingenDeptartment of Molecular PathologyProf. Dr. Reinhard KandolfDr. Bernd KöberleinDr. Anja DüchtingDr. Stefanie SimonovicDipl. Biol. Agnes BryniokDipl. Biol. Friedericke Uttacand. med. Christine Walkercand. med. Martin Wolfcand. med. Christian WollboldtRosa MamatoHeike Kaiser
German Cancer Research Center, DKFZ, HeidelbergProf. Dr. Hanswalter ZentgrafProf. Dr. Frank Rösl
Duke University, Durham, USAProf. Dr. Hans Tillmann
Tran Hung Dao Hospital, Hanoi, Viet NamProf. Dr. Nguyen T. BinhDr. Song Le HuuDr. Nguyen Toan
Acknowledgments
Albert Schweitzer Hospital, Lambarene, GabonProf. Dr. Peter Kremsner
Medical School of HannoverProf. Dr. Heiner WedemeyerProf. Dr. Michael Manns
Charitè UniversitätsmedizinBerlin, Bemjamin Franklin, VirchowProf. Dr. Thomas BergProf. Dr. Carsten Tschöpe
www.a-birken.de/welt.gif