ElektrophoreseTeil 2
Skript zur Vorlesung „Grundlagen der Analytik I“im MSc-Studiengang Analytik
Prof. C. Vogt, Leibniz Universität Hannover 11.1.2007
Literatur
„Analytical Isotachophoresis“P. Bocek, M. Deml, P. Gebauer, V. Dolnik, VCH, Weinheim, 1988
„Gelelektrophorese“R. Westermeier, In Analytiker Taschenbuch, Bd. 7, Springer-Verlag, Berlin
„Isoelektrische Fokussierung“R. Westermeier, In Analytiker Taschenbuch, Bd. 7, Springer-Verlag, Berlin
„Capillary Electrophoresis: Principle and Practice“R. Kuhn, S. Hoffstetter-Kuhn, Springer Laboratory, Berlin, 1993
„Handbook of Capillary Electrophoresis“Ed. J. P. Landers, CRC Press, Boca Raton, 1997
“Advances in Electrophoresis”, Serie, Band 1, 2 und 6Eds. A. Chrambach, M. J. Dunn, B. J. Radola, VCH, Weinheim, 1987-1993
Gliederung
Grundlagengeschichtlicher Überblickwichtige GrößenTrennprinzipien
Zonenelektrophorese (ZE)Isotachophorese (ITP)Isoelektrische Fokussierung (IEF)
technische Realisierungen
KapillarelektrophoreseAufbau, apparative KomponentenPuffersysteme und AdditiveMizellare Elektrokinetische Kapillarchromatographie (MEKC)
Gelelektrophorese
Theorie
Ionenwanderung im elektrischen Feld
F = zi. e . E
Reibungskonstante
KR = 6 . π . η . ri
stationäre Geschwindigkeit (Migration)
vi = F / KR
vi = zi. e . E / 6 . π . η . ri
Ionenbeweglichkeit
µi = zi. e / 6 . π . η . ri
vi = µi. E
Theorie
κ⋅== qI
lUEEuv ii ⋅=
FnzIt ⋅⋅=⋅ qlR ⋅ρ= ρ spezifischer Widerstand
q Querschnitt
±± ⋅⋅∑⋅=κ iii uzcFSpezifische Leitfähigkeit
ir6eiz
iu⋅η⋅π
⋅±=± 0eff cc ⋅α=
Joul´sche Wärme RIQ 2 ⋅∼ T1lgη ∼
pH, E (U und L), Ionenstärke I, T
Theorie
κ⋅== qI
lUEEuv ii ⋅=
...2temp
2inj
2ads
2diff
2ges +σ+σ+σ+σσ =
vv
4NR ∆
⋅=2
wt16N ⎟
⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛⋅=
( ) ( )eo21 uuD
Uuu177.0R+⋅
⋅−⋅=
UR ≈ UN ≈
Theorie
Molekül Molekulargewicht D . 10-5 cm2/s
HCl 36.5 3.05NaCl 58.5 1.48Glycin 75.07 1.06Citronensäure 192.12 0.66Cytochrom C 12400 0.11Hemoglobin (human) 64500 0.969Tabak Mosaikvirus 3940000 0.0046
Diffusionskoeffizienten ausgewählter Moleküle(in H2O, bei 25°C)
Ursachen der Zonenverbreiterung
Longitudinale DiffusionN, D w
Joulsche WärmeT, laminare Flüsse
Länge des Injektionspfropfens
ProbenadsorptionPeaktailing
Elektrodispersionκ von Probe und Puffer → Fronting & Tailing
Ungleich hohe Pufferreservoirelaminare Flüsse
Detektorzellen-Größel Detektor < w
Elektroosmotischer Fluss - EOF
Eeo ⋅η
ξ⋅ε−=µ
ε0εrζ
η
Dielektrizitätskonstante des VakuumsDielektrizitätskonstante des MediumsPotential der elektrochemischen Doppelschicht am Übergang starre-diffuse SchichtViskosität der Lösung
Elektroosmotischer Fluss - EOF
EN, R, Q
Puffer-pHveo , zi,Puffer
IonenstärkeZeta-Potential, I [mA], Adsorption, Stacking
TemperaturViskosität
Organische ModifierZeta-Potential, Viskosität, Selektivität
TensideAdsorption, veo (Größe und Richtung), Selektivität
Neutrale hydrophobe PolymereAdsorption, veo , Viskosität
Kovalentes CoatingChemische Bindung, Modifizierungen, Stabilität
Beeinflussende Größen
Einflussgrößen
Apparative ParameterSpannungTemperaturKapillarlänge
Chemische ParameterPufferzusammensetzungPufferkonzentrationpH
Puffer-Hauptkomponenten
Phosphate / Borate / organische SäurenChromat / Imidazol / Creatinin
Puffer-Zusätze zur Veränderung der Trenneigenschaften
Mizellbildnerorganische LösungsmittelKomplexbildnerGele, Modifier für den elektroosmotischen Fluß, Harnstoff, Derivatisierungsreagenzien
Kapillarsysteme
Temperaturgradient übereinen Kapillarquerschnitt
Radius der Kapillare [µm]
Wandtem-peratur [K]
Wandtem-peratur [°C]
∆T Wand -Kapillarzentrum [K]
25 299,0 25,85 0,5350 301,2 28,05 1,3975 304,2 31,05 3,14
100 307,7 34,55 5,58125 311,6 38,45 8,72
Kapillarsysteme
Innerer Durchmesser 10....200 mm (50...100 mm) Äußerer Durchmesser 50....400 mm (360 mm)
Kapillarlänge 1.......100 cm (30...80 mm)
ungefülltfused silica (Teflon, Borosilikatglas)
beschichtetverringerte / keine Adsorption an der KapillarwandBeschichtung mit Methylzellulose, Polyacrylamid, Aminopropyl, Polyethylenimin
mit Gel gefülltPolymerisierung in der Kapillare oder Anwendung gelartiger Puffer
mit Partikeln gefülltFüllmaterial aus HPLC, Partikeldurchmesser 1-5 µm
Kapillarsysteme
A direkte Detektion
Puffersystemepuffernder Bereich (pH)
H3PO4 / NaH2PO4 / Na2HPO4 / Na3PO4 3 - 9H3BO3 / Na2B4O7 7 - 10NaHCO3 / Na2CO3 7 - 10TRIS 5 - 8Glutaminsäure 5 - 8
B indirekte Detektion (UV- oder Fluoreszenzdetektion)
Zitronensäure 2,5 - 5,5Imidazol 4 - 7Creatinin 3,5 - 5,5Benzoesäure 3 - 64-Hydroxybenzoesäure 3 - 6Phthalsäure 3 - 6Pyromellitsäure 3 - 7Salicylsäure 3 - 5Natriumchromat 7 - 11
Kapillarsysteme
Einfluss des Puffersystems auf die Trennungaromatischer Carbonsäuren
10 mM Phosphat pH 9.07
10 mM Borat pH 9.15
10 mM Tricine pH 8.0
l=50/60 cm, 100 µm iD, U=25 kV, λ=200 nm, Druckinjektion 2 s bei 0.3 psi
Injektionstechniken
Druck, Gravitation (Syphon-Effekt), Spannung
L128tdpV
4
⋅η⋅⋅π⋅⋅∆
=
hgp
Druckinjektion
L128tdpV
4
⋅η⋅⋅π⋅⋅∆
= ∆⋅⋅ρ=∆Gravitationsinjektion
Spannungsinjektion( )
LtcrU
Q2
epeo ⋅⋅⋅π⋅⋅µ+µ=
Injektionstechniken
- 0 . 0 2 0
- 0 . 0 1 0
0
42
A
0
- 0 . 0 0 5
- 0 . 0 1 0
42
B
0
- 0 . 0 0 5
- 0 . 0 1 0
4 t [ m i n ]2
C
Puffer: 10 mM Creatinin, 25 mM α-HIBA, 10 mM Hac, 2 mM 18-Krone-6Probe: 0.01 mM NH4
+, K+, Rb+, Li+, Na+, Ca2+
und Mg2+
Vergleich von Druckinjektion und elektrokinetischer InjektionA 20 s bei 10 kVB 10 s bei 5 kVC 10 s bei 0.5 psi
Detektionstechniken
Methode NWG abs. NWG[Mol] [mol/l]
_______________________________________________________
UV-Vis-Absorption 10-13 - 10-16 10-5 - 10-8
Fluoreszenz 10-15 - 10-17 10-7 - 10-9
Laserinduzierte Fluoreszenz 10-18 - 10-20 10-14 - 10-16
Amperometrie 10-18 - 10-19 10-10 - 10-11
Leitfähigkeit 10-15 - 10-16 10-7 - 10-8
Massenspektrometrie 10-16 - 10-17 10-8 - 10-9
_______________________________________________________
bezogen auf 10 nl Injektionsvolumen
Nachweisgrenzen
Detektion
für 100 µm iD Kapillarenur max. 77 % TransmissionVerluste durch Reflexion und Streuung
Beispiel: L = 50 cm, 75 µm iD
LrV 2 ⋅⋅π=( ) cm50cm00375.0V 2
⋅⋅π=
L2.2Vges µ=
Injektionsvolumen 1 – 30 nL
Je injiziertem nL Lösung entsteht Zonenlänge von 0.23 cm
bei 200 µm Appertur ergibt sich maximales Detektionsvolumen von 0.88 nL !
Einfluss der Trennspannung
25 kV
15 kV
l=50/60 cm, 100 µm iD, Puffer: 10 mM Phosphat pH 9.07, 22°C
Trennung aromatischer Carbonsäuren
Zusatz von Mizellbildnern
Klassifizierung der Tenside nach hydrophilen GruppenKationische Tenside
primäre, sekundäre, tertiäre und quarternäre Ammonium-salze, Pyridiniumsalze
Anionische TensideCarboxylate, Sulfate, Sulfonate, Ethersulfate, Phosphate
Zwitterionische TensideAminoxide, Betaine, Sulfobetaine, Lecithine
Nichtionische TensidePolyglycolether, Polyalkohole, Zuckertenside
Tenside mit mehreren verschiedenen hydrophilen GruppenDicarboxylate, Sulfobernsteinsäureester
Mizellare Elektrokinetische Kapillarchromatographie
Prinzip der MEKC
ti Migrationszeit des Analytent0 Migrationszeit der Lösung (ohne
elektrophoretische Wanderung)tM Migrationszeit des Mizellbildners
tM < ti < t0
für anionische Mizellbildner und neutrale Analyten
Zusatz von Mizellbildnern
Natriumdodecylsulfat SDS 8,1 62Natriumtetradecylsulfat STS 2,1 (50°C) 138Natriumdecansulfonat 40 40Natriumdodecansulfat 7,2 54N-Lauryl-N-methyltaurat (Na-Salz) LMT 8,7 -Natriumpolyoxyethylendodecylethersulfat 2,6 66N-Dodecanyl-L-valinat (Na-Salz) SDVal 5,7 (40°C) -Natriumcholat 13 - 15 2 - 4Natriumdeoxycholat 4 - 6 4 - 10Natriumtaurocholat 10 - 15 5Natriumtaurodeoxycholat 2 - 6 -Kaliumperfluoroheptanoat 28 25,6Dodecyltrimethylammoniumchlorid DTAC 16 (30°C) -Dodecyltrimethylammoniumbromid DTAB 15 56Tetradecyltrimethylammoniumbromid TTAB 3,5 75Cetyltrimethylammoniumbromid CTAB 0,92 61
Name Kürzel CMC Aggr.-zahl(mM) n
Zusatz von Mizellbildnern
10 mM Phosphat,pH 9.07
10 mM Phosphat, 30mM SDS, pH 9.07
l=50/60 cm, 100 µm iD, U=25 kV, λ=200 nmTrennung aromatischer Carbonsäuren
Zusatz von SDS zum Trennpuffer → MEKC
Pufferadditive
NH2
Oberflächenmodifier
N+
Br
NH2NH2 N
H
NH2
Diaminopropan Spermidin
TetrabutylammoniumbromidTBA-Br
N+
CH3
CH3CH3
BrCH3
Hexadecyltrimethylammoniumbromid
AcetonitrilMethanolEthanol2-Propanol 0 ...... 50 %AcetonDMF
Formamid 0 .... 100 %N-Methylformamid
nicht geeignet: halogenierte KW, Alkane
Organische LM
Einfluss aufIonenstärkeViskositätε PufferEOFLöslichkeiten derAnalyten