Untersuchung der Wechselwirkungen von ökologisch relevanten bi- und trivalenten
Metallionen mit bakteriellen EPS
Vom Fachbereich Chemie der Universität Duisburg-Essen
(Campus Essen) zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation
von
Guido Furth
aus
Heinsberg
Essen 2006
Die vorliegende Arbeit wurde im Fachgebiet
Physikalische Chemie
der Universität Duisburg-Essen in der Zeit von Februar´04 bis September´06 angefertigt.
Berichterstatter: Prof. Dr. Christian Mayer
Prof. Dr. Karl Molt Tag der mündlichen Prüfung: 14. Feb. 2007
Danksagung
Herrn Prof. C. Mayer möchte ich für die Überlassung des fachübergreifenden Themas und für die fortwährende Unterstützung im Verlauf dieser Arbeit danken. Bei Herrn Prof. K. Molt bedanke ich mich für die Übernahme des Korereferates. Mein besonderer Dank gilt den Mitgliedern der Forschergruppe „Physikalische Chemie von Biofilmen“ für ihre unerschöpfliche Diskussionsbereitschaft, der Übermittlung vieler mikrobiologischer Aspekte und ihren hilfreichen Anregungen zur Durchführung dieser Arbeit. Frau Dr. Annegret Therheiden danke ich für ihre konstruktiven Verbesserungs-vorschläge an meiner Arbeit. Bei Herrn Manfred Zähres möchte ich mich für die stete Unterstützung bei den Aufnahmen der NMR-Spektren bedanken. Besonders bedanken möchte ich mich auch bei Herrn Robert Knieriem, der mir durch die Einweisung in die chiroptischen Methoden und seiner moralischen Unterstützung sehr geholfen hat. Allen Mitarbeitern der PC und der Mikrobiologie, die nicht namentlich erwähnt wurden, möchte ich für die hilfreichen Diskussionen und die freundliche Atmosphäre danken. Besonderer Dank geht an die DFG für die finanzielle Unterstützung. Meiner Familie gilt mein ganz besonderer Dank. Ich weiß, dass es für alle nicht immer einfach war. Ohne ihr Verständnis, ihre Ermutigungen und den Rückhalt den mir im besonderen meine Frau Claudia und meine beiden Kinder Laura und Annabell gaben, wäre diese Arbeit überhaupt nicht zustande gekommen.
Das Bekannte ist endlich, das Unbekannte unendlich. Geistig stehen wir auf einem Inselchen inmitten eines grenzenlosen Ozean von Unerklärlichem. Unsere Aufgabe ist es, von Generation zu Generation ein klein wenig mehr Land trockenzulegen.
Thomas Huxley
Inhaltsverzeichnis
i
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ............................................................................................................ 1
2 Theoretische Grundlagen ............................................................................................... 3
2.1 Biofilme und Extrazelluläre Polymere Substanzen (EPS) ............................................... 3
2.1.1 Lebensraum Biofilm................................................................................................ 3
2.1.2 EPS von Biofilmen.................................................................................................. 4
2.2 Polysaccharidexprämierende Bakterien ........................................................................... 7
2.2.1 Leuconostoc mesenteroides..................................................................................... 7
2.2.2 Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus .............................................................. 8
2.2.3 Xanthomonas campestris......................................................................................... 9
2.3 Polysaccharide.................................................................................................................. 11
2.3.1 Struktur und Eigenschaften ..................................................................................... 11
2.3.2 Polysaccharide als Polyelektrolyte.......................................................................... 13
2.3.3 Polysaccharide bakteriellen Ursprungs ................................................................... 18
2.3.3.1 Dextran ........................................................................................................ 18
2.3.3.2 Hyaluronsäure ............................................................................................. 19
2.3.3.3 Xanthan ....................................................................................................... 20
2.4 Schwermetalle in der Umwelt .......................................................................................... 22
2.5 Methoden zur Charakterisierung von EPS ....................................................................... 25
2.5.1 Größenausschlusschromatographie (SEC).............................................................. 25
2.5.2 Konduktometrie....................................................................................................... 27
2.5.3 CD-Spektroskopie ................................................................................................... 30
2.5.4 Rotationsviskosimetrie ............................................................................................ 34
2.5.4.1 Koaxial-Zylinder-Rotationsviskosimeter .................................................... 36
2.5.4.2 Kegel-Platte-Rotationsviskosimeter............................................................ 38
2.5.4.3 Platte-Platte-Rotationsviskosimeter ............................................................ 39
2.5.5 NMR-Spektroskopie als physikalische Methode zur Strukturaufklärung............... 40
Inhaltsverzeichnis
ii
3 Material ................................................................................................................................. 43
3.1 Polysaccharide.................................................................................................................. 43
3.2 Chemikalien ..................................................................................................................... 43
3.3 Geräte ............................................................................................................................... 45
3.3.1 Computer Software ................................................................................................. 46
4 Methoden .............................................................................................................................. 47
4.1 Reinigung und Abbau von kommerziellen EPS............................................................... 47 4.2 Bestimmung der Molmasse von Polyelektrolyten mit SEC............................................. 47
4.3 Konduktometrische Titration ........................................................................................... 48
4.4 Viskosimetrie von EPS..................................................................................................... 50
4.4.1 Rotationsviskosimetrische Titration........................................................................ 51
4.4.2 Bestimmung von newtonschem und nichtnewtonschem Verhalten........................ 52
4.5 Circulardichroismus ......................................................................................................... 52
4.6 NMR-Spektroskopie......................................................................................................... 53
5 Ergebnisse............................................................................................................................. 54
5.1 Charakterisierung der EPS-Proben................................................................................... 54
5.1.1 Molmassenbestimmung der Proben ........................................................................ 54
5.1.2 Viskosität der Proben in wässriger Lösung............................................................. 58
5.2 Konduktometrische Titration mit Kationen ..................................................................... 59
5.2.1 Leitfähigkeitsmessungen von Dextran .................................................................... 59
5.2.2 Leitfähigkeitsmessungen von Hyaluronat............................................................... 61
5.2.3 Leitfähigkeitsmessungen von Xanthan......................................................... 65
5.3 Rotationsviskosimetrische Untersuchung in Ab- bzw. Anwesenheit von mehr-
wertigen Kationen .................................................................................................................. 70
5.3.1 Viskositätsmessungen in Abhängigkeit von der Kationenkonzentration................ 70
5.3.1.1 Viskositätsänderungen von Dextranlösung................................................. 71
5.3.1.2 Viskositätsänderungen von Hyaluronatlösung............................................ 72
5.3.1.3 Viskositätsänderungen von Xanthanlösung ................................................ 74
5.3.2 Viskositätsmessungen in Abhängigkeit von der Schergeschwindigkeit ................. 75
5.3.2.1 Viskositätsänderungen von Dextranlösung................................................. 76
5.3.2.2 Viskositätsänderungen von Hyaluronatlösung............................................ 77
5.3.2.3 Viskositätsänderungen von Xanthanlösung ................................................ 78
Inhaltsverzeichnis
iii
5.4 Einfluss zweiwertiger Kationen auf die optische Aktivität von Polysacchariden ........... 79
5.4.1 Circulardichroismus von Hyaluronat ...................................................................... 79
5.4.2 Circulardichroismus von Xanthan........................................................................... 81
5.5 Charakterisierung von Polysacchariden durch NMR-Spektroskopie............................... 83
5.5.1 1H-NMR-spektroskopische Untersuchung der Wechselwirkung von bakteriellen
EPS mit zweiwertigen Kationen ...................................................................................... 84
5.5.1.1 Dextran .............................................................................................. 85
5.5.1.2 Hyaluronat ......................................................................................... 86
5.5.1.3 Xanthan.............................................................................................. 87
5.5.2 13C-NMR-spektroskopische Untersuchung der Wechselwirkung von bakteriellen
EPS mit zweiwertigen Kationen ...................................................................................... 89
5.5.2.1 Dextran .............................................................................................. 89
5.5.2.2 Hyaluronat ......................................................................................... 90
5.5.2.3 Xanthan.............................................................................................. 92
5.5.3 HSQC-spektroskopische Charakterisierung von Hyaluronat ....................... 95
6 Diskussion............................................................................................................ 96
6.1 Verhalten von Polysacchariden in Abwesenheit von mehrwertigen Kationen ................ 96
6.1.1 Dextran .................................................................................................................... 98
6.1.2 Hyaluronat............................................................................................................... 99
6.1.3 Xanthan ................................................................................................................... 104
6.2 Wechselwirkung der Polysaccharide mit mehrwertigen Kationen .................................. 108
6.2.1 Dextran .................................................................................................................... 110
6.2.2 Hyaluronat............................................................................................................... 112
6.2.3 Xanthan ................................................................................................................... 118
7 Zusammenfassung.............................................................................................. 126 8 Literatur .............................................................................................................. 128 9 Anhang ................................................................................................................ 137
Anhang A – Abbildungsanhang ....................................................................... 137
Anhang B – Abbildungsverzeichnis ................................................................. 152
Anhang C – Tabellenverzeichnis...................................................................... 158
1 Einleitung
1
1 Einleitung Der größte Teil der auf der Erde lebenden Mikroorganismen kommt in so genannten
Biofilmen vor [1]. Mit dem Begriff des Biofilms werden verschiedene mikrobielle
Lebensgemeinschaften wie Mikrokolonien, Flocken und Schlämme bezeichnet. Biofilme
entstehen, wenn Mikroorganismen sich an Grenzflächen anlagern und dort wachsen. Alle
Organismen, so auch biofilmbildende Bakterien, benötigen neben Stickstoff- und
Kohlenstoffquellen (Makronährstoffe) Spuren- oder Mikronährstoffe für ihre Entwicklung.
Zu den Spurenelementen gehören eine Reihe von Metallen, die aufgrund ihrer Dichte von ca.
5 g/cm³ und höher zu den Schwermetallen gezählt werden [2]. Die meisten Schwermetalle
sind Übergangsmetalle mit unvollständig aufgefüllten d-Orbitalen. Diese d-Orbitale sind die
Ursache, dass Schwermetall-Ionen eine Reihe von Komplexen bilden können, die teilweise
redoxaktive Fähigkeiten besitzen [3]. Die Schwermetalle mit der größten Bedeutung für die
meisten Organismen im Stoffwechsel sind Eisen, Kupfer, Mangan und Zink [4]. Zink spielt
neben der Funktion als Cofaktor in über 300 Enzymen (z. B. Alkoholdehydrogenase, RNA-
und DNA-Polymerasen) vor allem als Strukturelement in Proteinen wie z. B.
Zinkfingerproteinen eine entscheidende Rolle [4, 5, 6]. Die Quellen der
Schwermetallemission sind teils natürlichen (Vulkane, Verwitterung), teils anthropogenen
Ursprungs (Rauchgase, Fabrikabwässer, Bergbau, Sondermüll, Autoabgase). Das
nichtessentielle Element Cadmium findet in der Elektroindustrie und Galvanik sowie als
Farbpigment in Farben und in Batterien eine weite Anwendung und tritt als Beiprodukt der
Zink- und Eisengewinnung auf [7]. Wie auch Zink zählt Cadmium nicht zu den redoxaktiven
Metallen. Neben der Funktion als Biokatalysatoren wirken sowohl essentielle als auch
nichtessentielle Schwermetalle in Abhängigkeit von ihrer Konzentration als Zellgifte. So kann
ein Überschuss an Eisen oder Kupfer die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies über die
Fenton-Reaktion verursachen, die dazu führen, dass biologische Makromoleküle wie DNA,
Proteine oder Lipide durch Oxidationen zerstört werden [5, 7]. Weiterhin können Metalle wie
Cadmium oder Blei an wichtige Domänen innerhalb der Enzyme binden, deren Funktion
inhibieren und infolge dessen den gesamten Stoffwechsel beeinflussen. Diese Inaktivierung
wird häufig durch die hohe Affinität zu Amino- und Carboxylgruppen verursacht. Um dem
entgegen zu wirken, haben Mikroorganismen in Biofilmen eine Reihe von Mechanismen
entwickelt, um sich vor einer Schwermetalltoxizität zu schützen. Die Metallbindung an
extrazellulären Präzipitaten stellen erste Schutzmechanismen nach außen hin dar. Diese so
genannten extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) die überwiegend aus
Polysacchariden, Proteinen und Nukleinsäuren bestehen, machen bis zu 95% der
1 Einleitung
2
Trockenmasse eines Biofilms aus [8]. Um die Wechselwirkung von Biofilmen mit der
Umgebung, die Struktur von Biofilmen und die damit verbundene Änderung der
physikalischen Eigenschaften insbesondere durch die Wechselwirkung mit zweiwertigen
Metallionen besser zu verstehen, werden von Bakterien exprämierte Polysaccharide wie
Alginat, Xanthan, Hyaluronsäure und Dextran intensiv untersucht.
Im Focus der vorliegenden Arbeit steht die Wechselwirkung von zwei- und dreiwertigen
Schwermetall–Kationen mit zunehmend verzweigten Polysacchariden.
Mit Hilfe der Konduktometrie werden charakteristische Struktureigenschaften wie die
Stöchiometrie zwischen den Metallionen und den Untereinheiten der Polymere sowie die
Stabilität der Komplexe (∆κ*-Wert) bestimmt. Die Methode der Rotationsviskosimetrie zeigt
die Tertiärstruktur der Polysaccharide in Lösung. Die 1D- bzw. 2D-NMR-Spektroskopie ist
ein probates Mittel zur Untersuchung von langkettigen Kohlenhydraten. So ist es möglich,
durch den Einsatz spezieller Sonden während einer NMR-Messung die unmittelbare
Umgebung eines komplexierten bivalenten Kations zu ergründen. Die Einflüsse eines
zweiwertigen Kations auf die Chiralitätszentren der Polymere lassen sich durch
spektroskopische Methoden wie der CD-Spektroskopie ermitteln.
2 Theoretische Grundlagen
2 Theoretische Grundlagen
2.1 Biofilme und Extrazelluläre Polymere Substanzen (EPS)
2.1.1 Lebensraum Biofilme Etwa 99% der auf der Erde lebenden Mikroorganismen kommen in so genannten Biofilmen
vor [9]. Mit dem Begriff des Biofilms werden verschiedene mikrobielle
Lebensgemeinschaften an Grenzflächen wie Mikrokolonien, Flocken und Schlämme
bezeichnet. Allen Biofilmen ist gemein, dass die Mikroorganismen für einen relativ langen
Zeitraum in einer großen räumlichen Nähe zueinander in einer stark hydratisierten Matrix,
den extrazellulären polymeren Substanzen (EPS), eingebettet sind [10]. Eine
Modellvorstellung von einem aquatischen Biofilm ist in Abbildung 2.1 dargestellt.
Abbildung 2.1: Modell eines Biofilms in wässriger Umgebung. Es sind diskrete Mikrokolonien, in denen die Zellen in eine dichte EPS-Matrix eingebettet sind, erkennbar. Die Pfeile symbolisieren den konvektiven Fluss durch offene Wasserkanäle in der Matrix [10].
Biofilme weisen häufig eine große Artenvielfalt an Mikroorganismen auf und stellen nicht nur
einen Lebensraum für Bakterien, sondern auch für Pilze, Algen und Protozoen dar [10].
Durch den relativ langen Zeitraum in dem die Mikroorganismen in unmittelbarer Nähe
angesiedelt sind, kann es zu zahlreichen Wechselwirkungen kommen, welche letztendlich zur
Bildung einer synergetischen Gemeinschaft führen kann. Diese Mikrokonsortien sind dann in
der Lage komplexe Verbindungen abzubauen [11]. Die hohe Zelldichte in einem Biofilm
3
2 Theoretische Grundlagen
4
ermöglicht den Austausch von Informationen in Form von Genen oder niedermolekularen
Signalmolekülen. Diese membranpermeablen Signalmoleküle werden von den
Mikroorganismen selbst produziert und durch Diffusion in die Umgebung freigesetzt.
Zusammenfassend kann man sagen, dass das Leben der Mikroorganismen im Biofilm eine
Reihe von Vorteilen bietet. Neben optimal angepassten Lebensbedingungen in der jeweiligen
Mikronische sind die Organismen durch die umgebende EPS-Matrix gegen verschiedene
Umwelteinflüsse geschützt [11], da beispielsweise Biozide kaum die Zellen erreichen. Die
Gelmatrix kann bis zu 98 % Wasser speichern [12] und bietet daher Schutz gegen
Austrocknung.
2.1.2 EPS von Biofilmen
Der Begriff „EPS“ steht für eine Reihe von Biopolymeren. Je nach Definition versteht man
hierunter „extrazelluläre Polysaccharide“, „Exopolysaccharide“ [13] oder „extrazelluläre
polymere Substanzen biologischen Ursprungs, die an der Bildung mikrobieller Aggregate
beteiligt sind“ [14]. In dieser Arbeit wird die Abkürzung für „außerhalb der Zelle liegende
organische Makromoleküle in mikrobiellen Aggregaten“ verwendet, welche letztlich 1999 in
dieser Form von Wingender et al. [15] definiert wurde.
Den größten Anteil der EPS machen häufig die Polysaccharide aus. Aber auch Proteine,
Lipide und Nukleinsäuren können in beträchtlichen Anteilen vorkommen. Die Polysaccharide
sind von den genannten Komponenten mit Abstand am besten untersucht [16]. Es sind
Homopolysaccharide als Bestandteil der EPS gefunden worden, die nur aus einem einzelnen
Monosaccharid-Typus bestehen. Dazu gehören z. B. Mutan, Curdlan, Dextran, Levan und
Cellulose, die nur aus neutralen Bausteinen (Glucose, Fructose) bestehen, oder andere, die nur
aus anionischen Bausteinen, den Uronsäuren aufgebaut sind [10,16]. Ebenso sind
Heteropolysacccharide bekannt, die aus verschiedenen neutralen oder geladenen Bausteinen
bestehen, welche aus Wiederholungseinheiten von 2-8 Zuckern zusammengesetzt sind, z.B.
Xanthan oder Hyaluronat. Die Polysaccharide können linear und verzweigt auftreten, wobei
das Rückgrat meist aus 1,3- oder 1,4- glykosidisch verbundenen Monosaccharid-Bausteinen
mit α- oder β-Konfiguration der Zucker besteht [16].
2 Theoretische Grundlagen
5
Tabelle 2.1: Allgemeine Zusammensetzung bakterieller EPS [11] EPS Komponenten
(Untereinheiten, Vorstufen)
Hauptbindungstypen Struktur des Polymerrückgrats
Substituenten (Beispiele)
Polysaccharide Monosaccharide Uronsäuren
glycosidische Bindungen
lineare, verzweigte Seitenketten
organisch: O-Acetyl. N-Acetyl.Succinyl. Pyrovyl.
anorganisch : Sulfat. Phosphat
Proteine (Polypeptide)
Aminosäuren Peptidbindungen linear Oligosaccharide (Glycoproteine) Fettsäuren (Lipoproteine)
Nukleinsäuren Nukleotide Phosphodiester- bindungen
linear
Phospholipide Fettsäuren Glycerin Phosphat Ethanolamin Serin Cholin Zucker
Esterbindungen Seitenketten
Huminstoffe phenolische Verbindungen einfache Zucker Aminosäuren
Etherbindungen C-C Bindungen Peptidbindungen
Quervernetzungen
Die EPS halten den Biofilm zusammen und verleihen ihm seine Form sowie einen großen
Teil seiner physikalisch-chemischen Eigenschaften. Überdies sind die EPS bei der
Primäradhäsion der Mikroorganismen an Oberflächen von großer Bedeutung. Sie bilden
sozusagen den Klebstoff, der den Biofilm an der Oberfläche hält. Der quantitative Anteil der
EPS in Biofilmen und deren Zusammensetzung sind in Abhängigkeit von
Umgebungsbedingungen teilweise starken Schwankungen unterworfen. Die EPS können
dabei einen Anteil von 50% bis 90% der gesamten organischen Substanz im Biofilm
einnehmen [11].
Durch so genannte schwache Wechselwirkungen sowie durch Verschlaufung und Verknotung
fädiger Makromoleküle bilden die EPS ein dreidimensionales Netzwerk. Die schwachen
Wechselwirkungen können durch Ausbildung von London–Kräften, elektrostatischen
Wechselwirkungen und Wasserstoffbrücken-Bindungen zustande kommen. Die resultierende
Kraft, die dieses Netzwerk zusammenhält, ist keineswegs gering, da sie sich aus der Summe
aller Typen von Wechselwirkungen zusammensetzt [17]. Die geladenen Gruppen der
Polysaccharide (z. B. Carboxylgruppen an Uronsäuren) sowie Substituenten (z. B.
Acetamidogruppen in Polysacchariden) haben dabei einen entscheidenden Einfluss auf die
physikalisch-chemischen Eigenschaften des Biofilms, zu denen die Festigkeit, die Viskosität,
2 Theoretische Grundlagen
6
die Wasserbindungskapazität, die Bindungsfähigkeit und die Selektivität, mit der
anorganische Ionen gebunden werden, zählen [18].
2 Theoretische Grundlagen
2.2 Polysaccharidexprämierende Bakterien
2.2.1 Leuconostoc mesenteroides
Abbildung 2.2: Rasterelektronische (SEM) Aufnahme von Leuconostoc mesenteroides
Die Spezies Leuconostoc mesenteroides ist ein epiphytisches Bakterium, welches in der Natur
weit verbreitet ist. Diesem Gram-positiven, nicht pathogenen und heteotrophen Bakterium ist
es möglich, unter anaeroben Konditionen zu bestehen [19]. Das Erscheinungsbild entspricht
in den meisten Flüssigkulturen den Kokken. Die Bakterien liegen entweder isoliert, als Paare
oder kettenförmig vor, wobei ihre Struktur stark mit den Wachstumsbedingungen korreliert
ist. Zellen, deren Nahrungsgrundlage die Glucose war oder welche auf festem Untergrund
inkubierten, haben häufig eine gestreckte oder stäbchenförmige Morphologie [20]. Ferner
wurde für Leuconostoc mesenteroides eine gute Eignung für Fermentationsprozesse bestätigt,
so dass es in der Industrie insbesondere bei der Lebensmittelherstellung zum Einsatz
kommt [21]. Bei den industriell herbeigeführten Stoffwechselprodukten handelt es sich
überwiegend um Lactate, Ethanol und Kohlendioxid.
Oft haben die von Leuconostoc mesenteroides exprämierten EPS eine hohe Viskosität, welche
überwiegend auf die hohe Konzentration an Polysacchariden zurückgeführt wird [22]. Dabei
handelt es sich in der Regel um Dextran und Levan, welche, wenn sie unerwünscht vorliegen,
zu erheblichen Problemen bei der industriellen Fermentation führen [23].
7
2 Theoretische Grundlagen
2.2.2 Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus
Abbildung 2.3: Rasterelektronische (SEM) Aufnahme von Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus
In den vergangenen Jahren wurden immer wieder Veränderungen an der Taxonomie der
Streptokokken vorgenommen. Eine Möglichkeit der Einteilung berücksichtigt die kulturellen,
biochemischen und serologischen Eigenschaften [24]. Dabei werden die Keime in vier
Gruppen unterteilt: die Pyogen-Streptokokken, die Viridans-Streptokokken, die Laktis-
Streptokokken und die Enterokokken.
Die tatsächlichen phylogenetischen Beziehungen der Streptokokken der dritten Gruppe
konnten erst in den letzten Jahren durch Anwendung von DNA-DNA- und DNA-RNA-
Hybridisierungen sowie durch Sequenzierungstechniken und chemotaxonomische
Zellwandanalysen eingehender untersucht werden. In diesem Zusammenhang konnte durch
Hybridisierungsstudien eine Ähnlichkeit zwischen Streptococcus zooepidemicus und
Streptococcus equi festgestellt werden [25]. Aus diesem Grund wurde die Umbenennung von
Streptococcus zooepidemicus in Streptococcus equi subsp. zooepidemicus vorgeschlagen
[25].
Streptococcus equi subsp. zooepidemicus ist ein kokkenförmiges, Gram-positives, fakultativ
anaerobes aber aerotolerantes Bakterium, welches sich bevorzugt in Ketten anordnet. Die
Aerotoleranz vieler Streptocokken ist durch die Anwesenheit der Superoxid-Dismutase
bedingt, welche den Einfluss der Superoxid-Radikale minimiert [26, 27]. Der Organismus
schützt sich darüber hinaus mit Hilfe von NADH-Oxidase (NOX) vor einer irreversiblen
Oxidation durch elementaren Sauerstoff. Dabei reduziert das Enzym den molekularen
Sauerstoff zu Wasser.
8
2 Theoretische Grundlagen
Streptococcus equi subsp. zooepidemicus ist durchaus pathogen und verursacht oft enzootisch
auftretende Erkrankungen wie Septikämien, eitrige Wundinfektionen, Endometritiden,
Arthritiden und Mastitiden. Tiere können latente Träger dieser Bakterienspezies sein. Von
Heim- und Haustieren ist das Pferd am häufigsten von Infektionen mit Streptococcus equi
subsp. zooepidemicus betroffen [28].
In letzter Zeit weckte dieses Bakterium zunehmendes Interesse bei der Industrie, da es mit
Hilfe von Fermentationspraktiken zur Herstellung von Polysacchariden insbesondere der
Hyaluronsäure und dessen Salz dem Hyaluronat im industriellen Maßstab genutzt werden
kann [29].
2.2.3 Xanthomonas campestris
Abbildung 2.4: Rasterelektronische (SEM) Aufnahme von Xanthomonas campestris
Xanthomonas campestris gehört zur Gattung von Bakterien, zu der gelbpigmentierte
Pseudomonaden zusammengefasst werden. Wie alle dieser Gruppe angehörenden Bakterien
sind sie Gram-negativ, besitzen eine stäbchenförmige Morphologie und sind monotrich, polar
begeißelt. Dieses pflanzenpathogene aber für Menschen ungefährliche Bakterium wächst
aerob und bildet keine Sporen [30]. Die gelbe Pigmentierung der Xanthomonaden findet ihre
Ursache in einer bromhaltigen Polyenverbindung.
Verschiedene Pathovare dieses Bakteriums sind wirtschaftlich bedeutende
Pflanzenkrankheitsereger. So verursacht es zum Beispiel die Adernschwärze bei allen
Kulturformen der Brassica-Arten aber auch bei Wildformen der Kreuzblütengewächse. Hier
konnte der saatgutübertragbare Erreger nachgewiesen werden [31].
9
2 Theoretische Grundlagen
10
Wie viele andere Bakterien auch, exprämiert Xanthomonas campestris vielerlei polymere
Substanzen (EPS). Dazu zählt unter anderem das Polysaccharid Xanthan, welches industriell
erzeugt und wässrigen Lösungen zur Viskositätserhöhung zugesetzt wird (z.B. Pudding,
Diätsuppen, Druckerschwärze) [32].
2 Theoretische Grundlagen
2.3 Polysaccharide
2.3.1 Struktur und Eigenschaften Polysaccharide ist der Sammelbegriff für makromolekulare Kohlenhydrate, deren Moleküle in
vielen Fällen aus einem einfachen Baustein der allgemeinen Formel Cn(H2O)n aufgebaut sind
[33]. Ein Großteil der Trockenmasse der EPS besteht wie schon beschrieben aus
Polysacchariden. Um ihre Funktion in Biofilmen zu verstehen, ist es nötig, grundlegende
Wesensmerkmale darzulegen. In der Abbildung 2.5 sind einige typische Monomerbausteine
dargestellt.
Pentosen
O H
OH
OH
H
H
OHH
OH
O H
OHOH
H
H
OH
H
OH
O H
OHH
OHH
OHH
OHOH
α-D-Glucofuranose α-D-Xylofuranose α-D-Arabinofuranose
Hexosen
O
H
HH
OH
H
O H
H O H
O H
O H
O
H
OHH
H
OHOH
H H
OH
OH
O
OHH
HH
OHOH
H OH
H
OH
β-D-Galactopyranose β-D-Mannopyranose α-D-Glucopyranose
Uronsäuren
O
H
HH
OH
H
O H
H O H
O H
O HO
O
H
OHH
H
OHO H
H H
O H
OHO
O
H
HH
H
OHO H
H O H
O H
O HO
β-D-Galacturonsäure α-D-Glucuronsäure β-D-Mannuronsäure
Abbildung 2.5: Häufige Monosaccharideinheiten in Biopolymeren
11
Je nach Zusammensetzung eines Polysaccharids unterscheidet man Homopolysaccharide wie
Dextran, Cellulose oder Stärke, die nur aus einem Saccharidbaustein bestehen, von den vor
allem in Pflanzengummen und Bindegewebe vorkommenden Heteropolysacchariden, wie
Pektine, Mannane und Xylane, die sich aus mehreren unterschiedlichen Bausteinen
2 Theoretische Grundlagen
12
zusammensetzen. Neben der Zusammensetzung werden die Polysaccharide aufgrund ihrer
Funktion in Reserve- (Stärke, Glykogen) und Gerüstpolysaccharide (Celluose, Chitin)
unterteilt. Die Reservepolysaccharide dienen als Energielieferanten. So ist z. B. die Stärke die
Glucosespeicherform der meisten höheren Pflanzen und wird in Form kleiner
wasserunlöslicher Körner (Granula) in den Chloroplasten abgelagert. Gerüstpolysaccharide,
wie die Cellulose, sorgen für die Stabilität von Pflanzen. Durch die Zusammenlagerung der
Cellulosemoleküle zu Elementar- und Mikrofibrillen entsteht ein stabiles Polysaccharidgerüst
[34] .
Die wichtigsten Polysaccharide stellen die Cellulose und Stärke dar. Das ß-1,4-glykosidisch
verknüpfte Cellulosemolekül ist sowohl hinsichtlich der Menge als auch der Verarbeitung das
bedeutendste Biomolekül. Durchschnittlich bildet ein Baum täglich circa 14 g Cellulose, was
aneinandergereiht der 175-fachen Strecke zwischen Erde und Sonne (2,6·1010 km) entspricht
[33]. Das als Zellstoff bezeichnete technische Produkt enthält noch viele andere Bestandteile,
die durch verschiedene Aufschlussverfahren wie „Steam Explosion“ abgetrennt wird [34].
Das zweite wichtige Polysaccharid, die Stärke, besteht zu 20 – 30% aus Amylose (α-1,4-
verknüpfte Glucose) und zu 70 – 80% aus Amylopektin (α-1,4 mit α-1,6-verzweigte
Glucose). Je nach Quelle kommt es in sehr unterschiedlichem Gehalt in Kartoffeln, Mais,
Reis und anderen Pflanzen vor. Mengenmäßig betrachtet ist die Stärke das wichtigste
Nahrungsmittel des Menschen. Der Kohlenhydratbedarf eines Erwachsenen (Schätzungsweise
500 g/Tag) wird zum Großteil durch Stärke abgedeckt [33]. Von besonderer Bedeutung für
die Struktur der Polysaccharide ist die Art der glykosidischen Bindung zwischen den
Monomerbausteinen. Dabei spielt nicht nur die Position der Verknüpfung (1,3-, 1,4- oder 1,6-
Bindung), sondern auch das diastereomere C1-Atom eine Rolle. Dieses kann eine
Verknüpfung in α- oder β-Form eingehen und damit die Vielfalt der Strukturen vergrößern.
Eine Auswahl wichtiger Polysaccharide ist in Tabelle 2.1 zusammengestellt.
Tabelle 2.2: Zusammenstellung wichtiger Polysaccharide [34]
Polysaccharid Verknüpfung Struktur Molmasse Vorkommen Amylopektin α–1,4; α–1,6 verzweigt 3⋅105 – 1⋅109 Stärkebestandteil
Amylose α–1,4 linear 5⋅104 – 1⋅106 Stärkebestandteil Cellulose β–1,4 linear 3⋅104 – 1,5⋅106 Pflanzenzellwand
Chitin β–1,4 linear ~ 4⋅105 Insekten Dextran α–1,6 verzweigt 1,5⋅104 – 5⋅107 Bakterien
Glykogen α–1,4; α–1,6 verzweigt bis 1,6⋅106 Leber Hyaluronsäure β–1,3; β–1,4 linear > 5⋅104 Bindegewebe
2 Theoretische Grundlagen
Tabelle 2.2 (Fortsetzung): Zusammenstellung wichtiger Polysaccharide [34]
Polysaccharid Verknüpfung Struktur Molmasse Vorkommen Pektin α–1,4 linear 1⋅104 – 5⋅105 Pflanzen
Pullulan α–1,4; α–1,6 linear 1⋅104 – 5⋅106 Pilz Xanthan β–1,4 linear 2 – 1,5⋅107 Bakterien
Aufgrund der Vielzahl an Polysacchariden ergibt sich ein großer Bereich von technischen
Anwendungen. Derivatisierungsreaktionen der nativen Polymere ermöglichen eine
Anpassung, Optimierung und Erweiterung der möglichen Einsatzgebiete. Bei der
wasserunlöslichen Cellulose resultiert aus der Derivatisierung beispielsweise ein Aufbrechen
der intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen. Die so erhaltenen Celluloseether und -
ester sind je nach Grad und Ort der Substitution, sowie Art der eingeführten Gruppe(n) bereits
kaltwasserlöslich und finden vielfältige technische Anwendungen.
2.3.2 Polysaccharide als Polyelektrolyte Eine Vielzahl der bekannten Polysaccharide ist geladen und gehört damit auch zu den
Polyelektrolyten. Unter diesem Begriff versteht man Makromoleküle, die eine große Anzahl
ionisch dissoziierbarer Gruppen tragen. Wird ein Polyelektrolyt in einem geeigneten polaren
Lösungsmittel, meist Wasser, gelöst, so dissoziiert dieser in ein hochgeladenes Polyion und
eine der Ladung entsprechenden Anzahl entgegengesetzt geladener Gegenionen [35, 36].
Dabei unterscheidet man zwischen anionischen und kationischen Polyelektrolyten. Beispiele
für einen anionischen und einen kationischen Polyelektrolyten sind in Abbildung 2.6
dargestellt.
*
*
SO3- Na+
N+
*
Cl-
Abbildung 2.6: Anionischer Polyelektrolyt Natrium-Polystyrolsulfonat (links) und kationischer Polyelektrolyt Polydiallyldimethyl-ammoniumchlorid (rechts)
13
2 Theoretische Grundlagen
Aufgrund der Kombination, der für die Polyelektrolyten typischen Eigenschaften, spielen
diese sowohl in der Natur als auch in technischen Prozessen eine gewichtige Rolle. So
übernehmen sie als Proteine wichtige Funktionen in Stoffwechselprozessen. Als
Nukleinsäuren (DNA, RNA) fungieren sie als Träger der Erbinformationen. In der Technik
werden natürliche und synthetische Polyelektrolyte vielseitig eingesetzt, z. B. als
Flockungsmittel in der Wasseraufarbeitung [35-38]. Der großen Bedeutung von
Polyelektrolyten steht jedoch trotz intensiver Forschung über viele Jahre hinweg ein noch
immer lückenhaftes Verständnis der mannigfaltigen Eigenschaften gegenüber [39,40].
Die Lösungseigenschaften der geladenen Polymere, wie z. B. hydrodynamische und
kolligative Eigenschaften, werden im Gegensatz zu den ungeladenen Polymeren maßgeblich
von langreichweitigen elektrostatischen Wechselwirkungen der auf der Kette lokalisierten
Ladungen bestimmt. Sie unterscheiden sich aus diesem Grund gravierend von den
Lösungseigenschaften neutraler Polymere. Für ein Verständnis der beschriebenen
Eigenschaften müssen sowohl intra- und intermolekulare Coulomb-Wechselwirkungen als
auch osmotische und konformative Effekte berücksichtigt werden. Die Stärke der Coulomb-
Wechselwirkung wird z. B. von der Dichte der Ladung auf dem Polymer bestimmt. Für das
von einer lokalen Ladungsdichte erzeugte lokale elektrische Potential liefert die „Poisson
Gleichung“ die Lösung ( ist der Nablaoperator). ∇
( ) ( )r
rrεε
ρφ0
2 −=∇ mit r
qrr
i
επεφ
04)( = (2.1)
Hierbei bezeichnet qi eine Punktladung (qi = zi⋅e, mit zi gleich Ladungszahl und e gleich
Elementarladung), ε0 die Dielektrizitätskonstante des Vakuums und εr die relative
Dielektrizitätskonstante des umgebendem Mediums. Wird ein System mit verschiedenen
ionischen Spezies betrachtet, besteht zwischen der lokalen Ladungsdichte ρ(r) und der
lokalen Ionenkonzentration ni(r) (Anzahl pro Einheitsvolumen) die Beziehung:
∑=i
ii rnzer )()(ρ (2.2)
Aufgrund der Elektroneutralitätsbedingung gilt mit der Gesamtteilchenkonzentration (Anzahl
pro Einheitsvolumen) der Spezies ni0:
14
2 Theoretische Grundlagen
∑ =i
iinz 00 (2.3)
Nimmt man eine Boltzmann-Verteilung für die relative Verteilung der Ionen am Ort des
Potentials bezogen auf die Gesamtlösung an und führt den zeitlichen Mittelwert des
elektrischen Potentials (<φ(r)>) ein, ergibt sich für die lokale Teilchenkonzentration:
⎥⎦⎤
⎢⎣⎡ ⟩⟨−=
kTrznrn i
ii)(exp)( 0 φ (2.4)
Die „Poisson-Boltzmann“ (PB) Gleichung wird durch Substitution von Gleichung (2.2) und
(2.4) in Gleichung (2.1) erhalten.
∑ ⎥⎦⎤
⎢⎣⎡ ⟩⟨−−=
kTrezn
rern i
ii)(exp)( 0
0
φεε
(2.5)
Die PB Gleichung ist von fundamentaler Wichtigkeit, wenn theoretische Betrachtungen über
das Verhalten von niedermolekularen oder polymeren Elektrolyten angestellt werden. Da die Stärke und die Reichweite der elektrostatischen Kräfte sehr stark von der Ionenstärke
der Lösung abhängig ist, kann eine Variation der Ionenstärke zu einer Änderung der
Eigenschaften einer Polyelektrolytlösung führen: In Polyelektrolytlösungen geringer
Ionenstärke stoßen sich die Polyionen über große Distanzen aufgrund der Coulomb-
Wechselwirkungen der geladenen Hauptketten ab. Im Falle flexibler Polyelektrolyte führen
zusätzlich intramolekulare elektrostatische Kräfte zu einer Abstoßung der Kettensegmente
und somit zu einer Aufweitung des Polymerknäuels bis hin zu weitgehend gestreckten
Konformationen bei sehr geringer Ionenstärke und gleichzeitig hoher Ladungsdichte [41].
Eine Erhöhung der Ionenstärke ist gleichbedeutend mit einer zunehmenden Abschirmung der
Ladungen und führt so zu einer schwächeren inter- und intramolekularen Coulomb-
Wechselwirkung. Daher verhalten sich Polyelektrolyte bei sehr hoher Ionenstärke fast wie
ungeladene Polymere. Beim Austausch der Gegenionen durch mehrwertige Ionen wurden
intensive Wechselwirkungen zwischen diesen und den Polymeren beobachtet. Häufig ändert
sich die Konformation in der Gegenionenumgebung, so dass die Struktur einem beladenen
Eierkarton (engl. Eggbox) ähnelt. Ein solches Wechselwirkungsbeispiel ist in Abbildung 2.7
schematisiert für Algenalginat in Anwesenheit von Ca2+-Ionen dargestellt.
15
2 Theoretische Grundlagen
Abbildung 2.7: Das „Eggbox“-Modell für Calcium-Alginat; hellblaue Kettensegmente: Polymannuronatblöcke; dunkelblaue Kettensegmente: Polyguluronatblöcke; rechts: Detailansicht der Koordination eines Calciumions innerhalb einer „Eggbox“ [42] Viele Arbeitsgruppen haben in der Vergangenheit den Knäuel-Stäbchen-Übergang von
flexiblen Polyelektrolyten, hervorgerufen durch eine Erhöhung der Ladungsdichte oder eine
Erniedrigung der Ionenstärke, theoretisch untersucht [43-47]. Hierbei wurden mit Hilfe von
molekulardynamischen sowie Monte-Carlo-Simulationen Knäuelstrukturen (a), gestreckte
Konformationen (b) und „Perlenketten-Strukturen“ (c) vorhergesagt (Abb. 2.8). Eine Ursache
für die ebenfalls experimentell bestätigte Vielfalt der Kettenkonformationen
(Sekundärstruktur) liegt darin, dass Wasser in den meisten Fällen ein schlechtes
Lösungsmittel für das Polymer-Rückgrat ist [48-50]. Die Sekundärstruktur wird somit durch
ein Zusammenspiel aus elektrostatischen Kräften und den Polymer-Solvens-
Wechselwirkungen bestimmt [51].
16
2 Theoretische Grundlagen
))
AbbildunKonforma
In der V
quantitati
standen
Leitfähigk
Aktivitäts
Das durc
Wechselw
Gegenion
potentiom
Bisher e
ermittelte
umfassen
für diesen
sowohl
Wechselw
für flexibl
a
)
g 2.8: Computersimulation eines statisttion (b) und einer Perlenketten Struktur (c) [
ergangenheit wurde mit Hilfe diverser ex
ves Verständnis des Lösungsverhaltens von P
neben Lichtstreuung, Röntgenstreu
eitsmessungen insbesondere solche Me
bestimmung der mobilen Gegenionen erlaub
h die hohe Ladungsdichte bedingte elek
irkung zwischen den hochgeladenen Polyion
en. Diese Korrelation hat eine Reduktion der
etrischen Messungen mittels ionenselektiv
rwies sich jedoch eine grundlegende In
r Daten von schwachen Polyelektrolyten
de theoretische Beschreibung dieser Substan
Sachverhalt liegt in der Abhängigkeit der e
von der Konformation des Polyions a
irkungen der Polyanionen untereinander. E
e Polyelektrolyte nicht möglich.
b
c
ischen Knäuels (a), der gestreckten 52]
perimenteller Methoden versucht, ein
olysacchariden zu entwickeln. Hierbei
ung, Viskositätsmessungen und
thoden im Vordergrund, die eine
en [53-56].
trostatische Feld bewirkt eine starke
en und den entgegengesetzt geladenen
Gegenionenaktivität zur Folge, was bei
er Elektroden ersichtlich wird [36].
terpretation sämtlicher experimentell
als sehr schwierig und damit eine
zklasse als nicht möglich. Der Grund
xperimentell zugänglichen Observablen
ls auch von den elektrostatischen
ine Separation der beiden Beiträge ist
17
2 Theoretische Grundlagen
Bei konformativ starren Polyelektrolyten hingegen sind Konformationsänderungen strukturell
ausgeschlossen und alle beobachteten Effekte sind ausschließlich auf zwischenmolekulare
Coulomb-Wechselwirkungen zurückzuführen. Dies sollte die genaue Interpretation der
Messdaten und damit verbunden eine theoretische Beschreibung vereinfachen.
2.3.3 Polysaccharide bakteriellen Ursprungs
2.3.3.1 Dextran
O
HH
H
OHOH
H OH
H
CH2
O
n Abbildung 2.9: Abbildung einer Monomereinheit des Dextrans (Monosaccharidbaustein)
Dextran ist ein schleimartiges, hochmolekulares, neutrales Biopolysaccharid dessen
Grundgerüst aus verzweigten Glucose-Monomeren (s. Abb. 2.9) besteht. Seine Molmasse
liegt zwischen 5 · 103 − 6 · 106 g/mol. Die Glucoseeinheiten sind über 1,2-, 1,3-, aber auch
über 1,4-glykosidische Bindungen miteinander verknüpft [57].
Wegen der physiologisch guten Verträglichkeit weckt Dextran zunehmend die
Aufmerksamkeit der Humanmedizin. So wird es zum Beispiel als 6%ige Lösung in
Blutplasmaersatzmitteln eingesetzt und kommt als Verdickungsmittel wegen seiner guten
Wasserbindungsfähigkeit in einigen Hautcremes zum Einsatz.
In der Lebensmittelindustrie wird Dextran ebenfalls als Verdickungsmittel eingesetzt und
findet sich dort als Nahrungsmittelzusatz in Suppen, Soßen und anderen Speisen wieder [21].
Die Quellungseigenschaften und das Fehlen elektrischer Ladungen prädestinieren Dextran als
Säulenmaterial für die Gel-Permeations-Chromatographie (GPC), wo es modifiziert zur
Analyse wässriger Lösungen von großen Biomolekülen zum Einsatz kommt [33].
Dextran wird extrazellulär von Bakterien der Gattung Leuconostoc durch enzymatische
Umsetzung von Saccharose gebildet und ist so auch über Fermentationsprozesse industriell
zugänglich. In der Regel dauert dieser mikrobiologische Prozess 24 Stunden und benötigt
unter optimalen Bedingungen eine Temperatur von 25°C [58].
18
2 Theoretische Grundlagen
2.3.3.2 Hyaluronsäure
O
H
HH
H
OH
H OH
COOH
O
O
H
HH
H
OHH
NH
OH
CH3O
n
O
O
Abbildung 2.10: Abbildung einer Grundeinheit der Hyaluronsäure (Disaccharidbaustein)
Die Hyaluronsäure ist eine makromolekulare Kette aus Disaccharideinheiten, die wiederum
aus je zwei Glukosederivaten bestehen: D-Glucuronsäure (s. Abb. 2.10, links) und N-Acetyl-
D-glucosamid (s. Abb. 2.10, rechts). Beide unterscheiden sich von der β-D-Glucose nur durch
eine Substitution am C-6- bzw. am C-2-Kohlenstoff. Im Disaccharid wird die Glucuronsäure
glykosidisch β-1,3 an das N-Acetylglucosamid geknüpft, das wiederum mit der nächsten
Glucuronsäure in der polymeren Kette β-1,4 verbunden ist. In neutraler wässriger Lösung
bilden sich Wasserstoffbrückenbindungen hauptsächlich mit den Carboxyl- und den
N-Acetylgruppen und es entsteht ein Zufallsknäuel mit einem Durchmesser von 500 nm. Bei
Konzentrationen kleiner 1 g/L entfaltet sich das Polymer spontan [59].
Im Vergleich zu den restlichen Glycosaminoglycanen (GAGs) nimmt die Hyaluronsäure eine
Sonderstellung ein. Im Gegensatz zu den GAGs ist dieses Polysaccharid kein Proteoglykan
und besitzt mit einigen Millionen g/mol eine außerordentliche Molekülgröße, welche bei
vielen Untersuchungsmethoden störend wirkt. Des Weiteren fehlen gegenüber den GAGs die
Sulfatreste und eine Kernregion wurde nie gefunden. Eine ausreichende Klärung der
Biosynthese steht ebenfalls noch aus, im Besonderen fehlen fundierte Kenntnisse bezüglich
der Initialschritte.
Ein in der Literatur beschriebener Mechanismus der Biosynthese von Hyaluronsäure bedingt
einen alternierenden Einschub von UDPGlcNAc und UDPGlcNA vom reduzierenden Ende
der wachsenden Kette. Dieser Aufbaumechanismus ist eher typisch für die Bildung
bakterieller Polysaccharide, wobei immer der letzte eingefügte UDP-Rest das Ende der Kette
bildet [60].
Hyaluronsäure ist Hauptbestandteil der Synovia (Gelenkflüssigkeit) und wirkt als
Schmiermittel bei allen Gelenkbewegungen. Sie zeichnet sich hier zusätzlich durch thixotrope
Eigenschaften aus. Ihre Viskosität verändert sich mit einwirkenden mechanischen Kräften,
d. h. die Viskosität nimmt ab, je stärker die Scherkräfte werden [61].
19
2 Theoretische Grundlagen
Aus diesem Grund werden seit etwa 1990 Hyaluronsäurepräparate für die industrielle
Vermarktung konzipiert, welche in kranke Gelenke gespritzt werden. Die Wirksamkeit ist
recht unterschiedlich. Bei vielen Patienten wirkt es funktionsverbessernd, eine deutliche
Besserung wird für 6 bis 12 Monate prognostiziert. Die beobachteten allergischen Reaktionen
waren anfangs durch die Tatsache bedingt, dass die Hyaluronsäure-Produkte früher aus
Hahnenkämmen hergestellt wurden und daher Spuren von Hühnerprotein enthielten. Seit die
Hyaluronsäure-Produkte über Fermentationsprozesse mit Streptocokken hergestellt werden,
sind allergische Reaktionen äußerst selten geworden [62].
2.3.3.3 Xanthan
O
OOH
HH
OOH
H H
H O
OH
HH
OH
H OH
H
COOH
O
HH
H
OO
H OH
HCH 2OH
O
HH
H
OOH
H OH
H
CH 2OH
O
CH 2OAcH
HH
OH
H OH
HO
HOOC
CH3
n
Abbildung 2.11: Abbildung einer Grundeinheit des Xanthans (Pentasaccharidbaustein)
Xanthan stellt ein von Xanthomonas campestris, Pseudomonas aeruginosa oder Azobacter
vinelandii unter aeroben Bedingungen gebildetes, verzweigtes, anionisches
Heteropolysaccharid dar. Die Hauptkette besteht aus β-1,4 glykosidisch verknüpften Glucose-
Molekülen, welche mit der Cellulose identisch sind. Ketalartig ist die Benztraubensäure an
eine Seitenkette jedes zweiten Glucosemoleküls gebunden [63]. Die Seitenketten bestehen
dabei aus β-D-Mannose, aus β-1,4-D-Glucuronsäure und aus α-1,2-D-Mannose. Ähnlich wie
Cellulose ist auch Xanthan über den ganzen pH-Bereich stabil. Bei hohen Temperaturen wird
das Xanthan von starken Oxidationsmitteln wie z.B. Hypochlorit oder Persulfat abgebaut.
Man geht davon aus, dass die Konformation des natürlichen Xanthans in rechtgängigen
Einzel- und Doppelhelices mit einer Windungshöhe von 47Å vorliegt. Das Molekulargewicht
von Xanthan liegt bei 106 – 107 Dalton [64].
20
2 Theoretische Grundlagen
21
Industriell wird Xanthan im Chargen-Verfahren durch submerse Gärung unter starker
Belüftung hergestellt. Außerdem kann es mit der zweitägigen Batch-Fermentation gewonnen
werden. Dabei liegt die Ausbeute bei 25 – 30 g/L. Die gesamte Weltproduktion liegt bei
10.000 t [65].
Strukturviskose Xanthanlösungen werden als Verdickungsmittel und Stabilisatoren für
Emulsionen in Nahrungsmitteln (wie z. B. Marmeladen, Mayonnaisen, Saucen, Speiseeis),
Kosmetika, Farben und in der Erdölindustrie als Hilfsmittel beim Bohren eingesetzt [66].
2 Theoretische Grundlagen
2.4 Schwermetalle in der Umwelt
Der Eintrag von Schwermetallen in die Oberflächengewässer stellt eine Beeinträchtigung
aquatischer Lebensgemeinschaften dar. Hier beobachtet man im Besonderen eine
Anreicherung der toxischen Metalle in Biofilmen, welche als Schwebstoffe, Oberflächenfilme
oder Sedimentbiofilme vorliegen. Diese starke Affinität zu den EPS führt zu mannigfaltigen
Problemen. So gelangen beispielsweise durch die Aufnahme von kontaminiertem Biomaterial
durch Mikrorganismen die Schwermetalle in die Nahrungskette [67]. Um eine Abnahme der
Schwermetallemission zu erwirken, bedarf es gezielter Maßnahmen [68]. Durch Verschärfung
der Auflagen im Bereich Umweltschutz für deutsche Unternehmen wurde zwischen 1985 und
2000 ein starker Rückgang der Schwermetallemissionen in die Oberflächengewässer erwirkt
(Abb 2.12). Außer für Arsen und Nickel, bei denen der nicht beeinflussbare geogene Anteil
recht hoch ist, wurden die geforderten Reduktionsvorgaben der Internationalen
Meeresschutzabkommen in der Größenordnung von 50% (Cr, Cu, Ni, Zn sowie das Metalloid
As), beziehungsweise 70% (Cd, Hg, Pb) für die genannten Schwermetalle erreicht oder
überschritten. Sie liegen zwischen 36% bei Nickel und 85% bei Quecksilber und sind vor
allem auf die drastische Reduzierung der industriellen Direkteinträge zurückzuführen. Einen
entscheidenden Beitrag zu dieser Umweltentlastung haben neben den Maßnahmen im Bereich
der Industrie auf Grund verschärfter gesetzlicher Anforderungen auch der seit 1990
eingetretene Rückgang industrieller Aktivitäten in den neuen Bundesländern geleistet. Im Jahr
2000 spielten industrielle Direkteinleitungen nur noch eine untergeordnete Rolle. Die
Bedeutung der Einleitungen aus kommunalen Kläranlagen war zwar nach wie vor hoch,
jedoch wurden im Jahre 2000 die Gewässerbelastungen durch diffuse Quellen dominiert [69].
5
CEmission Tonnen pro Jahr
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Schwermetallemission 198
d Cu Zn Pb Cr
63 1263 7172 913 947
22
2 Theoretische Grundlagen
Schwermetallemission 1995
Cd Cu Zn Pb Cr Emission Tonnen pro Jahr 15 697 3505 373 316
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Cd Cu Zn Pb Cr Emission Tonnen pro Jahr 12 683 3187 296 283
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Schwermetallemission 2000
Dränwasser Erosion Hofabläufe und Abdrift Bergbaualtlasten Kommunale Kläranlagen
Grundwasser Abschwemmung Urbane Flächen Atmosphärische Deposition Industrielle Direkteinleitung
Abbildung 2.12: Schwermetallemissionen aus Punkt- und diffusen Quellen in die Oberflächengewässer Deutschlands im Jahr 1985, 1995 und 2000 [69]
Die diffusen Quellen haben gegenwärtig einen Anteil von etwa 76% bei Cadmium und
Kupfer, 84% bei Blei und Chrom und 80% bei Zink. Als maßgebliche Eintragspfade wurden
Kanalisationen und nicht angeschlossene Einwohner, die Erosion und der Grundwasserzufluss
identifiziert. Mischwasserentlastungen und Niederschlagsabflüsse aus Trennsystemen
verursachen 10 - 40% der gesamten Schwermetallemissionen. Dabei werden besonders hohe
Anteile bei Zink, Blei und Kupfer erreicht. Da in den Mischsystemen ein nicht unbedeutender
Anteil des Niederschlagsabflusses zur Kläranlage weitergeleitet wird, ergibt sich bezogen auf
Schwermetalle eine geringere Gewässerbelastung als beim Trennsystem. Durch Erosion
werden insbesondere die Metalle Chrom und Blei in die Gewässer eingetragen. Bei Arsen
(57%) und Nickel (45%) überwiegen die geogenen Emissionen (Grundwasserpfad) [70].
23
2 Theoretische Grundlagen
24
Auch wenn die Emissionen abgenommen haben, ist der Eintrag derzeit immer noch
unvertretbar hoch, so dass vorrangig die Reinigung der städtischen Regenabwässer auf Dauer
verbessert werden muss.
2 Theoretische Grundlagen
2.5 Methoden zur Charakterisierung von EPS
2.5.1 Größenausschlusschromatographie (SEC)
Die Größenausschlusschromatographie (engl. Size Exclusion Chromatography, SEC) ist eine
chromatographische Methode, die im Idealfall die Fraktionierung der Probe ausschließlich
nach den hydrodynamischen Radien der einzelnen Moleküle ermöglicht. Die Grundlagen
dieser Methode stammen aus den Arbeiten von Porath und Flodin [71]. Sie erzeugten
quervernetzte Dextran-Gele, mit denen die Trennung wässriger Proteinlösungen möglich war.
Moore erweiterte die Methode auf organische Lösungsmittel, indem er vernetzte Polystyrole
zur Fraktionierung synthetischer Polymere einsetzte [72]. Der ursprüngliche Begriff
Gelpermeationschromatographie (GPC) geht auf die Verwendung von Gelen als
Trennmaterial zurück. Heutzutage werden, je nach Lösungsmittel, für die
Größenausschlußchromatographie verschiedene Begriffe wie Gelfiltration und
Ausschlußchromatographie verwendet. Eine schematische Darstellung des
Trennmechanismus der SEC findet sich in Abbildung 2.13.
A) B)
Abbildung 2.13: Darstellung des porösen Säulenfüllmaterials (A) und des Trenn-mechanismus der SEC (B)
Abbildung 2.10 zeigt drei Polymere (A bis C) unterschiedlicher Größe. Je nach
hydrodynamischem Radius können kleinere Polymere (z. B. Teilchen C) tiefer in die Poren
eindringen und damit zeitlich erst nach den größeren Probenbestandteilen (Teilchen A)
eluieren. Dieses Verhalten ist im rechten Teil der Abbildung 2.10 anhand des
Elutionsdiagramms sichtbar. Das effektiv wirksame Volumen eines Teilchens setzt sich dabei
aus dem Volumen des Makromoleküls und der Solvathülle zusammen. Die zur Trennung
25
2 Theoretische Grundlagen
eingesetzten porösen Säulenfüllmaterialien wurden seit den Anfängen der SEC ständig
verbessert. So verringerte sich beispielsweise deren Partikelgröße von anfangs 30 µm auf
heute bis 3 – 5 µm [73]. Kleinere Partikel ermöglichen eine bessere Auflösung, d. h. eine
bessere Trennung der Substanzgemische. Diesen Vorteilen steht aber ein Druckanstieg durch
die größere Packungsdichte gegenüber, was zu einer höheren Belastung des Trennmaterials
und anderer Systemkomponenten (z. B. Pumpen) führt. Die Größen der Partikelporen liegen
im Bereich von 0,003 – 0,4 µm. Je nach Lösungsmittel und Trennaufgabe (analytisch oder
präparativ) kann das Säulenfüllmaterial variiert werden.
Allgemein unterscheidet man folgende Gruppen:
1. Halbstarre Materialien:
- hochverzweigtes, quervernetztes Polystyrol für organische Löungsmittel
- hydrophile Gele für wässrige Lösungsmittel (z. B. Polyglycerylmethacrylat,
Polyacrylamid-Gel, etc.)
2. Silicabasierende Materialien:
- höhere mechanische Stabilität und größerer Löungsmittel-Anwendungsbereich
- Probleme mit Absorption
- geringere Auswahl an Porositäten
3. Soft Polymer Gele:
- kein Einsatz in der Analytik (nicht druckstabil)
- präparative Säulen, z. B. Sephadex (Dextran etc.)
Treten keine Wechselwirkungen zwischen Probe und Säulenmatrix auf, so kann das
Retentionsvolumen VR eines Teilchens mit Hilfe des Verteilungskoeffizienten KSEC und den
Säulenvolumina V0 (Zwischenkornvolumen) und VPore (Porenvolumen) über die folgende
Gleichung beschrieben werden [74]:
PoreSECR VKVV ⋅+= 0 (2.6)
Der Verteilungskoeffizient KSEC, der das Verhältnis der mittleren Konzentration innerhalb und
außerhalb der Poren beschreibt, hängt nur von Diffusionsprozessen und nicht von
enthalpischen Effekten ab.
26
2 Theoretische Grundlagen
In der Praxis ist die Trennung mittels Größenausschlußchromatographie wesentlich
komplexer. Abweichungen vom idealen Verhalten können durch Wechselwirkungen der
Probe mit dem Säulenfüllmaterial (Adsorption, Ionenausschluß und Degradation) oder
Störungen, die auf die Proben selbst zurückzuführen sind (Aggregat- und Assoziatanteile),
auftreten [75]. Durch diese zusätzlichen Wechselwirkungen kann die Elutionsreihenfolge
gestört werden. Im schlimmsten Fall verbleibt die Probe auf den Säulen, wodurch diese
irreversibel beschädigt werden.
2.5.2 Konduktometrie Wie schon beschrieben können Elektrolyte entweder als einfache Kation-Anion-Paare oder
aber auch polymer (s. Polyelektrolyte Kap. 2.3.2) vorliegen. Erfolgt ein Stromtransport erst
im gelösten Zustand spricht man von „potentiellen Elektrolyten“, wobei Elektrolyte im
ungelösten Zustand „echte Elektrolyte“ genannt werden [76]. Beschreiben wir einen
Elektrolyten als einen Stoff aus Kation K+ und Anion A- so ergibt sich für die Dissoziation mit
Kc als Dissoziationskonstante, folgendes Gleichgewicht [77]:
[ ][ ]KA
AKKc
−+
= (2.7)
Die Leitfähigkeit einer Elektrolytlösung ergibt sich aus dem Widerstand R der Zelle und der
Geometrie des Elektrolyten. Er wird in Ω gemessen und gehorcht dem Ohmschen Gesetz.
IUR = (2.8)
U: Potentialdifferenz in V; I: elektrischer Strom in A
Berücksichtigt man die Gestalt des Leiters, d. h. seinen Querschnitt A und seine Länge l erhält
man den spezifischen Widerstand ρ gemessen in Ω cm.
lRA ⋅
=ρ (2.9)
Die spezifische Leitfähigkeit κ ist als Kehrwert des spezifischen Widerstandes definiert.
27
2 Theoretische Grundlagen
ρκ 1
= (2.10)
Zur Berücksichtigung der Konzentrationsabhängigkeit der Leitfähigkeit eines Elektrolyten
wird die molare Leitfähigkeit λm sowie die Äquivalenzleitfähigkeit λ in Ω-1 cm2 mol-1
definiert.
cmκλ = ;
evcκλ = (2.11)
Die Äquivalentkonzentration cev hängt von der Ladungszahl des Kations z+ oder Anions z-
und von den stöchiometrischen Koeffizienten ν+ bzw. ν- ab.
czcev ++= ν (2.12)
Die molare Leitfähigkeit und die Äquivalentleitfähigkeit sind keine konstanten Größen,
sondern hängen von der Beweglichkeit der Ionen ab. Je nach Ladung und Größe bewegen
sich die Ionen in einem elektrischen Feld mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. Des
Weiteren beruht die Leitfähigkeit auf dem Stromtransport durch die Ionen und hängt darüber
hinaus vom Dissoziationsgrad des Elektrolyten ab. Aus diesem Grund erwartet man für die
Abhängigkeit der Leitfähigkeit von der Konzentration für starke und schwache Elektrolyte
unterschiedliche Gesetzmäßigkeiten [78].
Im Gegensatz zu schwachen Elektrolyten liegen starke Elektrolyte selbst bei sehr hohen
Konzentrationen vollständig dissoziiert vor. Die Leitfähigkeit nimmt daher direkt proportional
zur Konzentration des Elektrolyten zu. Allerdings beobachtet man auf Grund von
interionischen Wechselwirkungen, dass die Leitfähigkeit langsamer ansteigt als theoretisch
erwartet. Bei sehr hohen Konzentrationen nimmt sie wieder ab. Dies ist bei starken
Elektrolyten auf Ionenassoziation zurückzuführen. Die Äquivalentleitfähigkeit sinkt ebenfalls
mit zunehmender Konzentration, da Wechselwirkungen zwischen den Ionen in Form
coulombscher Kräfte zunehmen und damit die Ionenbeweglichkeit eingeschränkt wird.
Teilweise kommt es zur Bildung von Ionenpaaren, die neutral sind und den Strom nicht leiten.
Diese Abhängigkeit der Äquivalentleitfähigkeit für Konzentrationen kleiner 10-2 mol/L kann
mit Hilfe des „Kohlrauschschen Quadratwurzelgesetzes“ angepasst werden [79].
28
2 Theoretische Grundlagen
ck−= ∞λλ (2.13)
Hierbei bedeutet λ∞ die Ionenleitfähigkeit bei unendlicher Verdünnung und k der
Proportionalitätsfaktor. Schwache Elektrolyte sind in stark verdünnten Lösungen vollständig
dissoziiert. Allerdings nimmt der Dissoziationsgrad mit steigender Konzentration ab. Für
Lösungen, in denen interionische Wechselwirkungen vernachlässigt werden können, lässt sich
der Dissoziationsgrad α aus dem Verhältnis der Äquivalentleitfähigkeit und der
Äquivalentleitfähigkeit bei unendlicher Verdünnung berechnen.
∞
=λλα (2.14)
Wobei hier α das Verhältnis der Konzentration des Kations bzw. des Anions zur
Gesamtkonzentration des Elektrolyten ausdrückt.
[ ]c
K +
=α bzw. [ ]c
A−
=α (2.15)
Bestimmt man die Leitfähigkeit von Elektrolyten im Rahmen einer konduktometrischen
Titration, wird der elektrische Widerstand in einer Leitfähigkeitsmesszelle ermittelt. Die
schematische Anordnung einer solchen Präzisionsleitfähigkeitsmesszelle ist in Abbildung
2.14 A gegeben.
A) ∼ B)
Abbildung 2.14: A) Skonduktometrische Unte
chematische Darstellung einer Präzisionsleitfähigkeitsmesszelle für rsuchungen. B) Wheatstone Brückenschaltung [80]
29
2 Theoretische Grundlagen
Die Zelle wird in eine Widerstandsbrückenschaltung (Wheatstone-Brücke) so eingebaut, dass
beim Abgleich der Brücke der unbekannte Zellwiderstand im Verhältnis zu den bekannten
Widerständen gemessen werden kann (s. Abb. 2.14 B) [80]. Aus dem Zellwiderstand R ergibt
sich gemäß Gleichung (2.9) und (2.10) die elektrische Leitfähigkeit.
Al
R⋅=
1κ bzw. CG ⋅=κ (2.16)
G: Leitwert des Elektrolyten R1 gemessen in Simens, S= Ω-1
Die Zellkonstante C wird über Kalibrierung der Messzelle bestimmt. Gewöhnlich werden
hierzu KCl-Lösungen eingesetzt, für welche die spezifische Leitfähigkeiten bekannt sind.
Zur Vermeidung von Polarisationserscheinungen sowie von elektrolytischen Vorgängen
werden die Messungen bei Wechselstrom durchgeführt. Die abzugleichenden Widerstände
sind damit Blindwiderstände, für die neben dem Ohmschen Anteil auch kapazitive und
induktive Widerstände berücksichtigt werden müssen.
2.5.3 CD-Spektroskopie
Ist die Konfiguration einer Verbindung bekannt, so muss dies nicht zwangsläufig bedeuten,
dass die Sekundärstruktur und damit die Konformation dieser eindeutig geklärt ist. Als
Beispiel dient die D-Glucose, bei der alle Substituenten die aus sterischen Gründen
begünstigten äquatorialen Positionen des Pyranringes besetzen. Aus diesem Grund beobachtet
man bei den Oligomeren der Glucose, der Stärke und Cellulose ausschließlich diese
Konformation. Anders ist dies in flexiblen Verbindungen dieses Zuckerrings, in denen die
Moleküle in verschiedenen Konformationen vorliegen oder je nach experimentellen
Bedingungen unterschiedliche Konformationen einnehmen können. Keine Methode – mit
Ausnahme der kernmagnetischen Resonanz – reagiert auf Änderungen der Molekülgestalt so
empfindlich wie der Circulardichroismus (CD).
Aus diesem Grund eignet sich die CD-Spektroskopie ausgezeichnet zur Strukturaufklärung
von optisch aktiven Verbindungen. Durch die Einstrahlung von linear polarisierten Licht in
eine Lösung mit optisch aktiver Substanz, wird im Bereich der Absorptionsbande des
Analyten beim Austritt elliptisch polarisiertes Licht beobachtet [81]. Das linear polarisierte
30
2 Theoretische Grundlagen
Licht kann als Überlagerung einer links- und einer rechtspolarisierten Teilwelle gleicher
Amplitude angesehen werden.
A) B)
Abbildung 2.15: A) Zirkular polarisiertes Licht; Erzeugung aus zwei linear polarisierten Wellen, die 90 ° phasenverschoben sind. B) Links polarisiertes Licht
Läuft die Teilwelle E2 der Teilwelle E1 voraus, erhält man, wie in Abbildung 2.15 B zu sehen,
links polarisiertes Licht. Läuft allerdings die Teilwelle E1 der Teilwelle E2 voraus, folgt
daraus rechts polarisiertes Licht.
Für eine optisch aktive Verbindung besitzen die Absorptionskoeffizienten εL und εR
unterschiedliche Werte, so dass die beiden Teilwellen von der Probe unterschiedlich stark
absorbiert werden. Die Folge einer Abweichung dieser beiden Parameter ist, dass das
austretende Licht dann nicht mehr linear, sondern elliptisch polarisiert, da die beiden
zirkularen Anteile nicht mehr die gleiche Amplitude besitzen.
Abbildung 2.16: Durch unterschiedliche Absorption des links- bzw. rechtspolarisierten Lichts einer optisch aktiven Verbindung (εL ≠ εR) resultiert ein CD-Signal [82].
Circulardichroismus ist somit die ungleiche Absorption von links- und rechtspolarisiertem
Licht (∆ε = εL-εR) [83].
31
2 Theoretische Grundlagen
Die CD-Spektroskopie bietet wertvolle Hilfe bei der Konfigurations- und
Konformationsanalyse komplizierter organischer Verbindungen, vor allem von Naturstoffen.
Abbildung 2.17: UV-Spektrum und zugehöriges Circulardichrogramm im Bereich der Absorption; Charakteristisch für einen positiven Cotton-Effekt. Befinden sich zwei oder mehr Chromophore in räumlicher Nähe zueinander, resultiert in der
Regel aus ihrer Wechselwirkung eine Kopplung, exciton coupling oder split CE genannt,
anhand derer man die Konfiguration des Moleküls bestimmen kann. Abbildung 2.17 zeigt den
typischen S-förmigen Kurvenverlauf eines solchen split CE [84]. Wie dort abgebildet, können
CD-Banden positiv oder negativ sein und treten nur in einem Wellenlängenbereich auf, für
den auch "normale" Absorptionsbanden existieren.
Es hat sich eingebürgert, den Circulardichroismus und die damit verbundene anomale
Rotationsdispersion als Cotton-Effekt (CE) zusammenzufassen [81]. Definitionsgemäß
spricht man von einem positiven Cotton-Effekt, wenn das Maximum der Kurve bei größerer
Wellenlänge liegt als das Minimum.
Allgemein werden CD-Bestimmungen bei Naturstoffen vor allem verwendet, um
den Gehalt an Sekundärstrukturelementen (α-Helix, β-Faltblatt und
Schleifenbereichen) abzuschätzen,
Konformationsänderungen zu beobachten, z. B.
bei der Bindung eines Liganden,
bei Protein-Protein-Wechselwirkungen,
bei der Rückfaltung denaturierter Naturstoffe,
32
2 Theoretische Grundlagen
bei Faltungsvorgängen und
zur Bestimmung der Stabilität einer Verbindung in bestimmten Puffern oder
unter bestimmten Bedingungen, sowie um
Umweltisolate aus verschiedenen Quellen zu vergleichen.
CD-Signale von z. B. Proteinen treten in zwei Spektralbereichen auf. Signale im
kurzwelligen UV-Bereich von 170 bis 250 nm (der so genannten Amid-Region) sind vor
allem auf die Peptidbindung zurückzuführen, während die Signale im langwelligen UV-
Bereich von 250 bis 300 nm von den aromatischen Aminosäuren stammen. Zudem geben
Disulfid-Brücken Signale bei 250 nm.
Die gebräuchlichen CD-Spektrometer sind aus historischen Gründen in Einheiten der
Elliptizität einer Lösung geeicht. Daher wird bei Spektren häufig auch die Elliptizität Θ nach
Lambert-Beer angegeben [83].
( )cdRL εεπ
−=Θo18010ln
41 (2.17)
Eine schematische Darstellung eines solchen Spektrometers ist in Abbildung 2.18 gezeigt.
Hierbei handelt es sich um ein „Yobin Yvon Dichrograph Mark III“.
33
Abbildung 2.18: Schematische Darstellung eines Strahlengangs in einem CD-Spektrometer (Yobin Yvon Dichrograph Mark III)
Die Vorteile der CD-Spektroskopie gegenüber anderen Methoden liegen in der geringen
Stoffmenge, die für eine Messung benötigt wird und der vergleichsweise kurzen Messzeit.
2 Theoretische Grundlagen
2.5.4 Rotationsviskosimetrie Wird ein Stoff (gasförmig, flüssig oder fest) verformt, so setzt er der Formänderung einen
Widerstand entgegen, den man allgemein als seine Viskosität bezeichnet. Bewegt sich eine
Flüssigkeitsschicht mit konstanter Geschwindigkeit v in x-Richtung parallel zu einer zweiten
Schicht, dann wirkt zwischen den beiden Schichten eine Reibungskraft FR. Die
Bewegungsenergie wird durch die Reibung in Wärme umgewandelt. Die Viskosität eines
Stoffes ist daher ein Maß für die innere Reibung [76].
Zur Erklärung dieser Stoffeigenschaft betrachtet man folgendes Modell, das einen
Flüssigkeitsfilm zwischen einer starren Fläche und einer beweglichen Fläche darstellt, die
sich mit der Geschwindigkeit v bewegt (Abb. 1). Auf die der bewegten Platte benachbarten
Flüssigkeitsschicht wird infolge der wirkenden Adhäsionskräfte die gleiche Geschwindigkeit
übertragen. Diese Schicht überträgt dann über die (im Verhältnis zu den Adhäsionkräften
schwächeren) Kohäsionskräfte einen Teil des Impulses auf die nächste Flüssigkeitsschicht,
diese wieder auf die nächste usw.. Dadurch bildet sich ein Geschwindigkeitsgradient aus.
Dieser Strömungstyp, bei dem die benachbarten Flüssigkeitsschichten übereinander
hinweggleiten, ohne sich zu vermischen, wird laminare Strömung genannt. Im Gegensatz
dazu werden Strömungen, in denen Flüssigkeitswirbel entstehen, als turbulente Strömungen
bezeichnet [85].
Abbildung 2.19: Laminares Strömungsdiagram
Die Reibungskraft FR zwischen den benachbarten Schichten einer laminaren Strömung ist für
viele Flüssigkeiten proportional zur Schichtfläche A und zum Geschwindigkeitsgefälle
senkrecht zur Bewegungsrichtung x.
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛⋅=
dydvAFR η (2.18)
34
2 Theoretische Grundlagen
Dies ist das Newtonsche Gesetz für viskoses Fließen. Der Proportionalitätsfaktor η wird als
dynamische Viskosität bezeichnet und besitzt die Einheit Pa⋅s. Er gibt die auf eine
Flüssigkeitsschicht bei einem bestimmten Geschwinigkeitsgefälle wirkende Reibungskraft an.
Die Reibungskraft ist für Newtonsche Flüssigkeiten (viele niedermolekulare Flüssigkeiten
oder auch hochverdünnte Polymerlösungen) eine Stoffkonstante, die nur von Temperatur und
Druck, nicht aber vom Geschwindigkeitsgefälle G abhängt. Mit anderen Worten, für
Newtonsche Flüssigkeiten ist der Quotient aus Schubspannung τ und Geschwindigkeits-
gradient G konstant.
.constG =⋅= τη mit A
FR=τ ; dydvG = (2.19)
Die dynamische Viskosität ist für viele Stoffe bei konstanter Temperaur und konstanter
chemischer Struktur nicht konstant, sondern abhängig von den Spannungen und
Verformungen, denen die Stoffe unterworfen werden. Verdoppelt man z. B. die
Schergeschwindigkeit, so führt ein Nicht-Newtonsches Verhalten nicht zu einer
Verdoppelung der Schubspannung, wie das für eine Newtonsche Flüssigkeit nach obiger
Gleichung der Fall wäre [86]. Die wichtigsten Erscheinungen des nicht-Newtonschen
Fließverhaltens in Abhängigkeit von der Schergeschwindigkeit zeigt die folgende
Abbildung 2.20.
dilatant
η / P
a⋅s
newtonsch
pseudoplastisch
s-1
Abbildung 2.20: Schematische Darstellung des Fließverhaltens nicht-Newtonscher Fluide
Bei der Dilatanz nimmt die Scherviskosität mit steigender Schergeschwindigkeit zu. Dies
führt dazu, dass das Fluid beim Fließen dickflüssiger wird. Bei einem plastischem Fluid
35
2 Theoretische Grundlagen
36
beginnt das Fließen erst oberhalb einer Mindestschubspannung. Unterhalb dieser Grenze
verhält sich die Substanz wie ein Feststoff [85]. Ein Beispiel hierfür sind disperse Systeme
mit hohen Einwaage-Konzentrationen (Farben, Lacke, Mayonnaise, Zahnpasta, Vaseline). Die
Pseudoplastizität (Strukturviskosität) ist charakteristisch für Polymerlösungen oder
–schmelzen. Bei kleinen Schergeschwindigkeiten (sog. 1. Newtonscher Bereich) ist die
Scherviskosität unabhängig von der Schergeschwindigkeit, d. h., die Kettenmoleküle bzw.
–segmente relaxieren schnell genug (sie kehren nach der Störung durch die Scherung so
schnell in ihre Ausgangslage zurück, dass sich die Struktur der Lösung nicht verändert).
Oberhalb einer kritischen Schergeschwindigkeit nimmt die Scherviskosität ab. Als mögliche
Erklärung für dieses Phänomen wird eine Streckung der Polymerketten mit zunehmender
Schergeschwindigkeit angenommen, bis ein Maximalwert erreicht ist. Beispiele: Lacke,
Thermoplaste, Mehrbereichsöle, Klebstoffe [87].
In der Polymerphysik findet die Viskosimetrie breite Anwendung. Anhand der Abhängigkeit
der dynamischen Viskosität der Polymerlösung von der Molmasse der Polymere lässt sich die
Form der Polymere (z.B. in Abhängigkeit von Lösungsmittel) ermitteln [88]. Andererseits
kann aus Kalibrierkurven, die mit Hilfe von Polymeren bekannter Molmassen aufgestellt
wurden, die Molmasse eines gleichen Polymers unbekannten Polymerisationsgrades bestimmt
werden [89].
Für die Messung der Viskosität stehen zahlreiche Verfahren wie z. B. die Kapillar- und
Rotationsviskosimetrie zur Verfügung. Bei der Rotationsviskosimetrie bestehen die
Messanlagen entweder aus zylindrischen oder t-spindelförmigen Kegel-Platte oder Platte-
Platte Messkörpern. Erstere eignen sich für niedrig bis mittel viskose, letztere für mittel bis
hochviskose Systeme.
2.5.4.1 Koaxial-Zylinder-Rotationsviskosimeter Im Koaxial-Zylinder-Rotationsviskosimeter befindet sich die Messflüssigkeit im Ringspalt
zwischen dem inneren und dem äußeren Zylinder. Wenn der innere Zylinder rotiert, spricht
man vom Searle-System. Im umgekehrten Fall handelt es sich um das Couette-System [86].
Dabei bildet sich ein Geschwindigkeitsgefälle zwischen dem inneren und dem äußeren
Zylinder aus (Couette-Strömung), d. h. es wird eine Scherung mit vorgegebenem
Geschwindigkeitsgradienten verursacht. Das Drehmoment, das durch das Gefälle auf den
inneren bzw. äußeren Zylinder übertragen wird, ist der dynamischen Viskosität direkt
2 Theoretische Grundlagen
proportional [76]. Die Auslenkung wird von einer Torsionsfeder kompensiert und die
Gleichgewichtslage elektrisch abgegriffen.
Abbildung 2.21: Schematische Darstellung eines Koaxial-Zylinder-Rotationsviskosi- meters [86]
Das Schergefälle DS ergibt sich dabei aus der Rotationsgeschwindigkeit ω und der Breite des
Messspaltes,
22
22
iaS rr
rD⋅⋅⋅
=ω , [s-1] (2.20)
Die Schubspannung τ ergibt sich aus der am Zylindermantel des Messkörpers angreifenden
Kraft F bezogen auf die Zylinderoberfläche.
hrF
i ⋅⋅⋅=
πτ
2, [Pa] (2.21)
Scherkräfte, die auf den Zylinderunter-(ober)-teil wirken, werden mittels Korrekturfaktoren
(von Gerätehersteller bestimmt). Um eine hohe Messgenauigkeit zu erreichen, sollte zudem
ra-ri<<ri sein, damit τ zwischen Messkörper und Messbecher konstant ist, d. h. keine
Wandeffekte entstehen. Wandeffekte bewirken, dass bei hoch viskosen Zubereitungen die
Fliessgrenze in unmittelbarer Nähe des rotierenden Zylinders überschritten wird, in der Nähe
des stationären Messbechers noch unterschritten ist. Damit verläuft die Scherung nicht
graduell über die ganze Spaltbreite, sondern in einer enger definierten Zwischenschicht.
37
2 Theoretische Grundlagen
2.5.4.2 Kegel-Platte-Rotationsviskosimeter Das Kegel-Platte-Viskosimeter wird auch als Kegel-Platte-Rheometer bezeichnet, da neben
der Viskosität auch andere Fließeigenschaften bestimmt werden können.
Das Kegel-Platte-Rheometer besteht aus einer ebenen Platte mit dem Radius r und einem sehr
stumpfen Kegel, die koaxial zueinander angeordnet sind. Die Kegelspitze liegt im Zentrum
der Kreisplatte. Der Spalt zwischen Platte und Kegel ist der Scherspalt mit dem Winkel α, in
dem die zu untersuchende Substanz eingebracht wird [90]. Wenn die Kegeloberfläche und die
Fläche der Platte ungefähr gleich groß sind (bei kleinem α), sind die Schubspannungen an der
Platte und am Kegel ungefähr gleich groß und damit stimmen die Schergeschwindigkeiten an
Platten- und Kegeloberfläche überein.
Abbildung 2.22: Schematische Darstellung eines Kegel-Platte- Rotationsviskosimeters [86]
Der Öffnungswinkel α zwischen Platte und Kegel beträgt ca. 0.2-5°, wobei kleinere Winkel
bevorzugt werden. Das Drehmoment D ergibt sich aus:
αω
=D , [s-1] (2.22)
und die Schubspannung aus:
223
rF⋅⋅
⋅=
πτ , [Pa] (2.23)
Aufgrund des sehr schmalen Kegelspaltes und der eindeutig definierten Scherfläche treten
keine Rand- und Wandeffekte auf. Weitere Vorteile liegen im sehr geringen Materialbedarf
für die Messung und dem minimalen Zeitaufwand für das Einfüllen und Reinigen.
38
2 Theoretische Grundlagen
2.5.4.3 Platte-Platte-Rotationsviskosimeter Als Alternative zum Kegel-Platte-Prinzip bietet sich das Platte-Platte-Prinzip an. Das Platte-
Platte-Viskosimeter besteht aus zwei parallelen ebenen Platten mit den Radien r. Antrieb und
Messeinrichtung können an derselben Platte angebracht, aber auch voneinander getrennt sein.
Abbildung 2.23: Schematische Darstellung eines Platte-Platte-Viskosimeters [86]
Die Scherung entspricht der Torsion eines zylindrischen Stabes [90]. Die Strömung im Spalt
zwischen den beiden Platten ist komplizierter als beim Kegel-Platte-Viskosimeter. Das
Drehmoment berechnet sich nach:
dydvd
dydv
dydv
dydv
rDdydv
R
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛⋅⋅⎟⎟
⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛
⋅= ∫
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛
τπ
03
32 (2.24)
Hierin bedeuten τ die Schubspannung, r den Radius, D das Drehmoment und dν/dy die
Schergeschwindigkeit. Die Platte-Platte-Einrichtung ist insbesondere für grobkörnige
Dispersionen und Suspensionen vorteilhaft, da der Platte-Platte-Spalt ausreichend variabel
eingestellt werden kann.
39
2 Theoretische Grundlagen
40
2.5.5 NMR-Spektroskopie als physikalische Methode zur Strukturaufklärung Die Methode der kernmagnetischen Resonanz, abgekürzt NMR (engl. Nuclear Magnetic
Resonance), ist eine der wichtigsten Methoden für die Strukturaufklärung von Biomolekülen,
insbesondere der von Polysacchariden. Zu diesem Thema gibt es bereits mannigfaltige
Veröffentlichungen [91], so dass hier nur oberflächlich auf die Grundlagen der NMR-
unterstützten Charakterisierung von Polysacchariden eingegangen wird. Im Rahmen dieser
Arbeit wird der 13C-NMR-Spektroskopie besondere Aufmerksamkeit geschenkt.
Im Gegensatz zur optischen Spektroskopie wird bei der NMR-Spektroskopie die Absorption
als eine Funktion der Strahlungsfrequenz grafisch dargestellt. Die Aufklärung von
strukturchemischer Fragestellungen in der Biochemie ist eine der wichtigsten Anwendungen
der 1H-NMR-Spektroskopie. Zur Aufklärung einer Struktur können alle Informationen aus
einem NMR-Spektrum herangezogen werden [92].
Dazu gehören:
• Die Anzahl chemisch nicht-äquivalenter Protonenkerne.
• Die Lage der Signale zur Ermittlung der chemischen Verschiebung und von
Abschirmungseffekten.
• Die Multiplizität der Peakgruppen.
• Die Ermittlung der Kopplungskonstanten.
• Die Peakflächen als Maß für die Anzahl von Kernen in einer Peakgruppe.
Zusätzliche Informationen zur Molekülstruktur lassen sich aus den Relaxationszeiten
gewinnen, soweit diese experimentell bestimmt wurden.
Die natürliche Häufigkeit des 13C-Isotops von nur 1,1% und das im Vergleich kleinere
gyromagnetische Verhältnis bedingen eine etwa 6000mal geringere Empfindlichkeit der 13C-
NMR-Spektroskopie gegenüber der 1H-Resonanz [93]. Dennoch kann, durch geeignete Wahl
der Experimente, die chemische Verschiebung in den 13C-Spektren zur Strukturaufklärung
organischer oder biochemischer Moleküle wie in der Protonen-NMR genutzt werden.
Einflüsse der chemischen Umgebung des Kerns können vergleichbar wie in der 1H-
Spektroskopie zur Strukturaufklärung herangezogen werden. Die Wechselwirkungen sind hier
nicht auf das unmittelbare Nachbaratom beschränkt. So lassen sich Substituenteneinflüsse
selbst über fünf Kohlenstoffatome hinweg noch in Verschiebungseffekten nachweisen.
2 Theoretische Grundlagen
Die besondere Bedeutung d gt in der Möglichkeit,
Informationen zum Kohlenstoff- nen-NMR zur Wasserstoff-
Peripherie des Moleküls zu er hen Verschiebung ist mit
200 ppm deutlich breiter Zur Erleichterung der
Spektreninterpretation werden häufig Doppel-Resonanz-
Techniken eingesetzt. Beispiel tkopplung die Spin-Spin-
Kopplung von 13C-Kernen m ng der Probe mit einer
breitbandigen Radiofrequenz, d nen-Resonanzbereich liegt,
entkoppelt (Abb. 2.24). Im -NMR-Spektrum ist das
entkoppelte Spektrum wesentlic Entkopplungsmethode liegt
darin, dass alle Informationen üb
Abbildung 2.24: Impulsfolge be
Mit Hilfe anderer Methoden i
Wasserstoffkerne am 13C-Kern z
Distortionless Enhancement by
Wasserstoffatome keine Signal
Experimenten einen wesentliche
Abbildung 2.25: Angeregter Kmit Hilfe des 90°-Pulses auf 13Cτ-Periode differenzieren sich diegebundenen Wasserstoffatome [
er 13C-NMR-Spektroskopie lie
Gerüst und nicht wie in der Proto
halten. Der Bereich der chemisc
als für Protonen-Resonanzen.
in der 13C-NMR-Spektroskopie
sweise wird bei der Breitbanden
it 1H-Kernen durch Bestrahlu
ie im gesamten anregbaren Proto
Vergleich zum gekoppelten 13C
h vereinfacht. Der Nachteil dieser 13 1
er C, H-Koppi der Breitbande
st es jedoch m
u bestimmen. Be
Polarization Tra
e, so dass diese
n Beitrag zur qua
ern ist 1H. Nach in einen Multiqu Operatortherme
95].
lu
n
ö
i
n
l
da
ngen verloren gehen [92].
tkopplung [92]
glich, die Anzahl der direkt gebundenen
einer DEPT-Messung beispielsweise (engl.
sfer) [94] ergeben Kohlenstoffkerne ohne
Information in Kombination mit anderen
itativen Analyse bietet.
er Zeit τ entsteht ein Antiphasentherm, der ntentherm überführt wird. In der folgenden in Abhängigkeit von der Anzahl der direkt
41
2 Theoretische Grundlagen
Ein weiterer Vorteil der DEPT-Methode besteht darin, dass die Empfindlichkeit gegenüber
einem normalen Entkopplungsexperiment für die 13C-Kerne bis auf das achtfache gesteigert
werden kann. Die obige Abbildung 2.25 zeigt die Impulsfolge für ein solches Experiment.
Die bisher erläuterten Methoden gehören zum Bereich der 1D-NMR-Spektroskopie. Für
kompliziertere Systeme werden allerdings häufig Experimente der 2D-heteronuklear
korrelierten NMR-Spektroskopie benötigt. Die Aufnahme des unempfindlichen
Kohlenstoffkerns ist jedoch äußerst langwierig, so dass eine normale 2D-NMR-Messung mit
z. B. der C, H-COSY-Methode (engl. Correlated Spectroscopy) häufig durch ein inverses
Verfahren wie der HSQC-Methode (engl. Heteronuclear Single Quantum Coherence) ersetzt
wird. Der Einsatz dieses Verfahrens führt zu einer Verkürzung der Messzeit, wobei auf dem
Kanal des unempfindlichen Kerns Kohärenzen erzeugt werden, welche sich auf den
empfindlichen 1H-Kern übertragen. Die resultierenden Resonanzen des 1H-Kerns werden
gemessen und führen zu einem Spektrum in dem die Heterokerne über die Ordinaten vereint
(1H=X-Achse; 13C=Y-Achse) werden. Auf diese Weise ist eine genaue Signalzuordnung
möglich, da nur Signale von direkt gebundenen C- und H-Atomen erscheinen [96]. Die
Impulsfolge für ein solches Experiment ist, wie in Abbildung 2.26 zu sehen, sehr komplex
und besteht sowohl im 13C-Kanal als auch im Protonen-Kanal aus einer Vielzahl von 90°- und
180°-Impulsen, die durch die Zeiten τ und t1 getrennt sind.
Abbildung 2.26: Angeregter Kern ist 1H. In der Zeit τ wird die Polarisation von 1H auf 13C übertragen. In t1 entwickelt sich diese 13C-Verschiebung ohne 1H-Kopplungen. Während der Zeit δ dephasiert ein Gradient (Echo/Antiecho) die Magnetisierung. Nach einem Polarisationstransfer rephasiert der letzte Gradient (G2) τ die gewünschte Magnetisierung. Detektiert wird 1H unter 13C-Entkopplung [96].
42
3 Material
43
3 Material
3.1 Polysaccharide Für diese Arbeit wurden unterschiedliche Polysaccharide verwendet. Als Modelsubstanz für
die Gattung der ungeladenen Polysaccharide wurde das Dextran, ein verzweigtes
Polysaccharid, dass von Leuconostoc mesenteroides exprämiert wird, genutzt. Darüber hinaus
wurden Experimente mit geladenen Polysacchariden durchgeführt, wobei zwei
unterschiedlich stark verzweigte Polyelektrolyte eingesetzt wurden. Zum einen die
Hyaluronsäure bzw. deren Natriumsalz das Hyaluronat. Hierbei handelt es sich um ein
geladenes, unverzweigtes Polysaccharid, dass durch industrielle Fermentation mit
Streptococcus equi subspecies zooepidemicus gewonnen wird. Zum anderen wurde das
Natriumsalz des Xanthans, ein geladenes, verzweigtes Polysaccharid mit einem
Glucoserückgrad, welches ebenfalls durch Fermentation (Xanthomonas campestris) erhalten
wird, verwendet. In der unten aufgeführten Tabelle 3.1 sind unter anderem die Hersteller der
genutzten Polysaccharide aufgeführt.
Tabelle 3.1: Verwendete Polysaccharide
Substanzname Hersteller Herkunft Best.-Nr. CAS-Nr.
Dextran Sigma Leuconostoc mesenteroides
D4876-50G 9004-54-0
Hyaluronsäure (Natriumsalz) Fluka Streptococcus equi sp. Zooepidemicus
53747
9067-32-7
Xanthan (Natriumsalz) Sigma Xanthomonas campestris
G12553-100G
11138-66-2
3.2 Chemikalien Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente wurden zwei- bzw. dreiwertige
Salze genutzt. Zudem wurden Chemikalien zur spezifischen Kationenentfernung, sowie als
NMR-Lösemittel oder zur Kalibrierung der Messapparaturen benötigt. Die wichtigsten dieser
Substanzen sind in Tabelle 3.2 zusammengestellt.
3 Material
44
Tabelle 3.2: Verwendete Chemikalien
Substanzname Formel Hersteller Best.-Nr. Mol.-Gew.
Aceton C3H6O Riedel de Haën
32201
58.08
Bleiacetat-Dihydrat C4H6O4Pb • 2 H2O
Fluka 15319 379,33
Cadmiumacetat-Dihydrat C4H6O4Cd • 2 H2O
Fluka 20901 266.52
Calciumchlorid-Hexahydrat CaCl2 • 6 H2O
Riedel de Haën
12074 219.08
Deuteriumoxid D2O Merck 103428 20.03
Eisen-(II)-chlorid-Tetrahydrat
FeCl2 • 4 H2O
Aldrich
22,029-9
270.32
Eisen-(III)-chlorid-Hexahydrat
FeCl3 • 6 H2O
Riedel de Haën
103943
270.32
Ethanol, absolut C2H6O
Merck 100983 46.07
Ethylendiamintetraessigsäure-di-Natriumsalz-Dihydrat (Titriplex III), (Na2-EDTA)
C10H14N2Na2O8 • 2 H2O
Merck
108418
372.24
Kupfer-(II)-chlorid-Dihydrat
CuCl2 • 2 H2O
Riedel de Haën
31286
Magnesiumchlorid-Hexahydrat MgCl2 • 6 H2O Merck
105833
203.30
Manganchlorid-Tetrahydrat MnCl2 • 4 H2O Fluka
63544
125.84
Natriumacetat C2H3NaO2
Merck
106268
82.03
Natriumchlorid NaCl
Baker
0278
58.44
Natriumhydroxid Plätzchen
NaOH Merck 106498 40.00
Schwefelsäure, 95-97%,
H2SO4
Riedel de Haën
30743
98.08
Zinkacetat-Dihydrat C4H6O4Zn • 2 H2O
Fluka 96459 219.50
3 Material
45
3.3 Geräte Im Rahmen der Promotionsarbeit wurden diverse Apparaturen und Messinstrumente benötigt.
Diese für die vorliegende Arbeit relevanten Gerätschaften sind in Tabelle 3.3 angegeben.
Tabelle 3.3: Verwendete Geräte
Gerät Hersteller und Bezeichnung
Analysenwaage Sartorius, BP 210 S
Analyzer f. LS 30 Contraves
Analyzer f. LS 40 Contraves
CD-Spektrometer AVIV CD Spektropolarimeter (Model 62 ADS)
Dialyseschlauch Fa. Serva, Visking
Elektrode Tetracon 96 WTW
GPC-Entgaser Viskotek, Degasser VE 7510
GPC-Dualdetektor Viskotek, Model 270
GPC-Pumpe Viskotek, Solvent Pump VE 1122
GPC-RI-Detektor Viskotek, VE 3580
Konduktometer LF 537/537-A WTW
Kryostat Mgw/Lauda Klein-Kryomat C6CT
Laborzentrifuge Hettich Universal 2S
Lyophilisationsanlage Crist, ALPHA 1-2
Magnetrührer IKA-Combimag RCT
Pipette Eppendorf Reference 50-250 µL
Reagenzglasschüttler Vortex Genie 2, Fa. Scientific Industries
Rotationsviskosimeter Low shear 30 und Low shear 40; Contraves
Steuereinheit f. LS 40 Contraves
Thermometer mgw Lauda R 40/2 Digital Thermometer
Thermostat Reotherm 115 contraves 3
Transferpette Brand (100 µL – 1000 µL)
Ultraschallfinger Branson – Digital Sonifier W-250D
Die hier nicht erwähnten Geräte gehören zur Laborgrundausstattung.
3 Material
46
3.3.1 Computer Software Zur Auswertung der GPC-Ergebnisse und der NMR-Spektren wurden spezielle Computer-
programme benötigt, welche in untenstehender Tabelle aufgeführt sind.
Tabelle 3.4: Verwendete Computer-Software
Hersteller Programm Version
Viskotek OmniSEC 4.2
Departamento de Quimica Organica, Universidade de
Santiago de Compostela
MestRe-C (1D) 2.3
Departamento de Quimica Organica, Universidade de
Santiago de Compostela
MestRe-C (2D) 4.9
4 Methoden
47
4 Methoden
4.1 Reinigung und Abbau von kommerziellen EPS Die kommerzielle EPS (Dextran, Hyaluronat und Xanthan) wird in einer 0,1 molaren
Natriumchlorid-Lösung mit einer Konzentration von 1,2 g/L gelöst. Für den Abbau des
hochpolymeren Moleküls wird die Lösung über 3 h auf 50°C erhitzt und über diese
Zeitspanne hinweg mit einem Ultraschallgerät der Firma Branson mit einer Intensität von 60
Watt beschallt. Das Xanthan wurde darüber hinaus zum weiteren Abbau über 5 h, 10 h und 15
h beschallt. Die trübe Lösung wird filtriert und 2h bei 4000 rpm zentrifugiert. Für die
Abtrennung niedermolekularer Fremdkörper und für den Ionenaustausch kommen
Dialyseschläuche (Visking, Serva Heidelberg, Deutschland) mit einer Ausschlussgrenze von
12.000-14.000 g/mol zum Einsatz. Der bei der Zentrifugation erhaltene Überstand wird über
einen Zeitraum von ca. 16 h dialysiert, wobei der Wasserwechsel zu Beginn der Dialyse alle
15 min (4x) und alle 30 min (6x) vollzogen wird. Dies entspricht einer ausgetauschten
Wassermenge von 50 L. Die über Nacht weiter dialysierte Lösung wird eingefroren und über
zwei Tage lyophilisiert.
Um eine möglichst sterile Präparation zu gewährleisten, wurden die verwendeten Glasgeräte
mit konz. Schwefelsäure gespült und die Metallspatel, Rührkerne, sowie die Pinzetten vor
dem Gebrauch mit Ethanol abgeflammt. Die Lyophilisate wurden bis zu ihrer weiteren
Verwendung kühl (-18°C) gelagert.
4.2 Bestimmung der Molmasse von Polyelektrolyten mit SEC Zur Bestimmung der Molmasse der kommerziellen Polysaccharide bzw. deren abgebauten
Varianten, wurden Lösungen dieser in einer SEC-Malls-Anlage untersucht. Für die
Messungen kamen drei Säulen, welche in Reihe geschaltet wurden, zum Einsatz. Eine
Vorsäule (ViscoGEL PWXL, 6.0 × 40 mm) mit einer Partikelgröße von 12 µm wurde als
Schutz für die nachfolgenden Trennsäulen vorgeschaltet. Bei den SEC-Säulen handelt es sich
um zwei „ViscoGEL PWXL“-Säulen mit den Abmessungen von 6.0 × 300 mm und einer
Porengröße von 6-13 µm. Bei der genutzten Apparatur kommt die Methode der so genannten
„Tripledetektion“ zum Einsatz. Hierunter versteht man die Kombination dreier Detektoren zur
Bestimmung der Molmasse. Neben der Detektion des Refraktionsindex, mit einem VE 3580-
4 Methoden
Detektor der Firma Viskotek wird hierbei mit einem Dualdetektor (270, Viskotek), welcher
eine Streulichteinheit, sowie ein Viskosimeter beinhaltet, gemessen.
Mit dem Programm „OmniSEC 4.2“ der Firma Viskotek wurde die GPC-Anlage gesteuert.
Des Weiteren wurden die erhaltenen Messdaten mit diesem Programm ausgewertet und die
Molmasse berechnet.
Für die Messung wurde das Lyophilisat (2 mg/mL) in tridestilliertem Wasser gelöst und die
Apparatur mit entgastem tridestilliertem Wasser gespült. Nach einer Betriebsdauer des Lasers
von 20 min wurde die sterilfiltrierte (Sterilfilter; 0,2 µm) Probe im Überschuss zugegeben, um
eine vollständige Füllung der Probenschleife (100 µL) des Injektors zu gewährleisten. Um die
Reproduzierbarkeit zu überprüfen, wurden die Messungen mindestens dreimal wiederholt.
4.3 Konduktometrische Titration Es wurden unterschiedlich konzentrierte, wässrige Lösungen (100 mL) der über drei Stunden
abgebauten bzw. nichtabgebauten Lyophilisate (0,5 mg/mL bis 3,0 mg/mL) angesetzt und
über 1 h durch Rühren homogenisiert. Die Apparatur besteht aus einem Konduktometer,
sowie einer Tetracon-Elektrode der Firma WTW. Die Messungen wurden bei 25°C (± 0,1°C)
durchgeführt wobei die Temperatur mit Hilfe eines Kryostaten der Firma Lauda konstant
gehalten wurde. Titriert wurde mit einer 0,05 molaren Salzlösung in 100 µL-Schritten.
Die dadurch erhaltenen Leitwerte (κ) wurden gegen die Kationenkonzentration (c)
aufgetragen und durch den resultierenden Graphen Ausgleichskurven gelegt. So ist es
möglich, eine wechselwirkungsbedingte Diskontinuität nachzuweisen und den
Äquivalenzpunkt zu bestimmen. Des Weiteren erhält man den Äquivalenzpunkt durch
Ableitung der Leitfähigkeitsfunktion, wobei diese oberhalb der Äquivalenzkonzentration
annähernd konstant wird ( .constddc
=κ
).
Ist die Stoffmenge nM der Polysacchariduntereinheit bekannt, so kann das stöchiometrische
Verhältnis zwischen Kation und Monomereinheit am Äquivalenzpunkt berechnet werden. Die
Stoffmenge wird wie folgt bestimmt (Gl. 4.1).
M
PolyM M
Vcn
⋅= (4.1)
48
4 Methoden
Wobei cPoly die Konzentration des Polysaccharids in der Lösung ist, V das Messvolumen und
MM der Molmasse einer Monomereinheit entspricht. Dividiert man die Stoffmenge des Salzes
am Äquivalenzpunkt nÄ durch die Stoffmenge des Polysaccharidmonomers nM im
Messvolumen, erhält man als Quotient das stöchiometrische Verhältnis zwischen Kation und
Polysacchariduntereinheit QÄ (Gl. 4.2).
M
ÄÄ n
nQ = (4.2)
Eine weitere für die Stabilität der sich einstellenden Komplexe charakteristische Größe wird
durch die Methode der Konduktometrischen Titration erhalten. Die Differenz zwischen der
Leitfähigkeit am Äquivalenzpunkt der Polysaccharidlösung (κÄ) und der entsprechenden
Leitfähigkeit einer reinen Salzlösung (κSalz) bei identischer Konzentration ergibt
∆κ* (s.Abb. 4.1).
( ) 0* kÄSalz +−=∆ κκκ (4.3)
Um den Startwert der reinen Elektrolytlösung bezüglich der Polymerlösung anzupassen wird
die Konstante k0, welche dem Startwert der Polymerlösung entspricht, hinzuaddiert.
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0,2
0,22
0,24
0,26
0,28
0,3
-0,01 0,01 0,03 0,05 0,07 0,09 0,11 0,13 0,15c (mol/L)
κ (m
S/cm
)
∆κ∗
Äquivalenzpunkt
b
a
k 0
Abbildung 4.1: Exemplarische Abbildung der Leitfähigkeitsfunktion einer Titration einer reinen Salzlösung in bidestilliertes Wasser (a) und einer Salzlösung in eine wässrige Polyelektrolytlösung (b). 49
4 Methoden
4.4 Viskosimetrie von EPS
Die für diese Arbeit genutzten Rotationsviskosimeter (LS30 u. LS40) der Firma Contraves
wurden nach einer Aufwärmphase von mindestens einer halben Stunde kalibriert. Der
Nullpunktsabgleich musste vor jeder Messung durchgeführt werden, um Massenträgheits-
effekte des Messkörpers auszuschließen und einen elektronischen Nullpunkt zu erhalten. Der
Abstand zwischen Messbecher und Messkörper beträgt 3 mm und der Messkörper ist
21,5 mm hoch. Mit einer Referenzprobe wird die Funktionstüchtigkeit der Apparatur
kontrolliert, bevor die eigentlichen Messungen gestartet werden. Bei den Messungen ist
darauf zu achten, dass die Oberfläche des Messkörpers glatt, grat- und fettfrei ist. Darüber
hinaus muss der Abstand zwischen Messkörper und Messbecher bei der Durchführung der
Experimente überall gleich sein (s. Abb. 2.17, Kap. 2.5). Um eine konstante Temperatur von
25°C (±0,1°C) über den Messverlauf zu gewährleisten, wird ein Reotherm 115 Kryostat der
Firma Contraves verwendet.
Um Rückschlüsse auf die vorliegende Knäuelstruktur der Polysaccharide in wässriger Lösung
ziehen zu können, wurde mit Hilfe der ermittelten Molmassen (vgl. Kap. 4.2) unter
Einbeziehung der Viskositäten der Staudinger-Index ([η]) bestimmt.
[ ]cLs
Ls 1⋅
−=
ηηη
η (4.4)
η: Viskosität der Lösung; ηLs: Viskosität des Lösemittels; c: Konzentration des gelösten Polymers
Mit dem Staudinger-Index ist die Berechnung des Exponenten der „Mark-Houwink-
Gleichung“ (α) möglich, welcher ein Indiz für die Kompaktheit der Molekülstruktur in
Lösung ist.
[ ] αη MK ⋅= (4.5)
K: empirisch ermittelte Konstante; M: Molmasse
50
4 Methoden
4.4.1 Rotationsviskosimetrische Titration Um eine optimale Solvatisierung der gefriergetrockneten und über drei Stunden abgebauten
bzw. nichtabgebauten Polysaccharide (1,5 mg/mL) in wässriger Lösung zu gewährleisten,
wurden diese durch einstündiges Rühren homogenisiert und über Nacht im Kühlschrank
gelagert. Die Proben (50 mL) wurden in ein am Thermostatkreislauf angeschlossenes Gefäß
gegeben und eine halbe Stunde gerührt. Da der Messbecher nur 4 mL Lösung aufnehmen
kann, wurde die Titration im thermostatisierten Gefäß durchgeführt und nach Einstellung des
Gleichgewichts (ca. 5 min) sofort in den Messbecher des Viskosimeters überführt. Um eine
Reproduzierbarkeit der Messung sicherzustellen wurden die Messungen fünfmal wiederholt.
Die Anwesenheit von Luftblasen in der Lösung führen zu Messungenauigkeiten, da eine
heterogene Scherung die Folge ist. Aus diesem Grund wurde durch die Reduktion der
Rührgeschwindigkeit auf ein Mindestmaß und durch die Vermeidung von Turbulenzen bei
der Überführung der Probe versucht, eine Luftblasenbildung zu verhindern. Gemessen wurde
20 s bei einer Schergeschwindigkeit von 2,0 s-1 und titriert wurde mit einer 0,05 molaren
Salzlösung in 50 µL-Schritten.
Die dadurch erhaltenen Viskositäten wurden gegen die Salzkonzentration aufgetragen und
durch den resultierenden Graphen wurde eine Ausgleichsgerade gelegt (s. Abb. 4.2).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014
Konzentration Me2+ (mmol/L)
η (m
Pa*s
)
Äquivalenzpunkt
Abbildung 4.2: Exemplarische Abbildung der Viskositätsfunktion einer Titration einer Salzlösung in eine wässrige Polyelektrolytlösung
51
4 Methoden
52
So ist es möglich, den Äquivalenzpunkt über die rotationsviskosimetrische Titration zu
bestimmen und damit wie im Abschnitt 4.3 beschrieben, das stöchiometrische Verhältnis von
Kationen zur Polymeruntereinheiten zu berechnen.
4.4.2 Bestimmung von newtonschem und nichtnewtonschem Verhalten Wie unter 4.4.1 beschrieben wurde eine wässrige Polysaccharidlösung (1,5 mg/mL) der
abgebauten und der unbehandelten Lyophilisate angesetzt und über Nacht bei 8°C quellen
gelassen. Nach der Kalibration (s. Kap. 4.4) der Messanlage, wurden die Lösungen in den
Messzylinder gegeben und eine halbe Stunde auf 25°C temperiert. Gemessen wurde 1.5 min
bei variabler Schergeschwindigkeit (0,5 s-1 bis 8,0 s-1). Um eine Reproduzierbarkeit der
Messungen zu gewährleisten wurden diese fünfmal wiederholt.
4.5 Circulardichroismus Mit Hilfe der CD-Spektroskopie wird für die Polysaccharide die Änderung des
Circulardichroismus in Abhängigkeit von der zugesetzten Salzkonzentration bestimmt.
Gemessen wird mit einem CD-Spektropolarimeter der Firma AVIV (Model 62 ADS). Hierbei
ist es möglich die Proben zu temperieren, so dass bei einer konstanten Temperatur von 25°C
die circulardichroitische Änderung der Probe detektiert werden kann. Die verwendete
Quarzküvette besitzt einen optischen Durchgang von 1 mm und ein Volumen von 200 µL. Es
ist darauf zu achten, dass die Küvettenoberfläche absolut rein (kein Schmutz oder Kratzer) ist
und die zu vermessende Lösung keine optisch wirksamen Verunreinigungen, wie z. B. Blasen
oder Staubpartikel, enthält. Zu diesem Zweck wurden die Polysaccharid-Lösungen
sterilfiltriert (Sterilfilter; 0,2 µm). Der Wellenlängenbereich lag während der Messungen bei
150-300 nm und das Messintervall betrug 20 nm/min. Für die Messungen wurden
ausschließlich abgebaute Polysaccharide verwendet (7 mg/mL), da aufgrund der hohen
Viskosität der unbehandelten Lösungen eine Präparation nicht möglich war.
Die zu vermessenden Lösungen mit einer jeweils gegebenen Salzkonzentration wurden im
Vorfeld angesetzt, da eine Titration apparaturbedingt ausgeschlossen war. Hierbei wurde
jeweils 1 mL Lösung mit entsprechender Salzkonzentration am Vortag angesetzt und über
Nacht bei 8°C quellen gelassen.
4 Methoden
53
4.6 NMR-Spektroskopie Die Lyophilisate wurden in D2O (Merck) bei pD 7,0 resuspendiert. Die Deuteriumresonanz
wurde als ,,field-frequency-lock" verwendet und die NMR-Spektren wurden mit einem DRX-
500-, sowie mit einem DRX-300-NMR-Spektrometer der Firma Bruker aufgenommen. Die
aus der Messung resultierenden 1D-Spektren wurden mit dem Programm MestRe-C 2.3 und
die 2D-Spektren mit dem Programm MestRe-C 4.9 (Departamento de Quimica Organica,
Universidade de Santiago de Compostela) ausgewertet. Die Temperatur im Messkopf betrug
während der Messungen 60°C.
Die 1H-NMR-Spektren wurden mit 64K x 512 Datenpunkten sowie einer spektralen Weite
von 9980 Hz aufgenommen. Die Eingestrahlten Pulse hatten einen Winkel von 15° und die
Wartezeit zwischen den Pulsen betrug 8,5 Sekunden.
Die 13C-NMR-Spektren wurden mit 64K x 1024 Datenpunkten und einer spektralen Weite
von 32680 Hz aufgenommen. Die Proben wurden mit einem 90° Puls angeregt, wobei die
Wartezeit zwischen den Pulsen 2,5 Sekunden betrug. Während der Messung wurden 5000 bis
6000 Scans durchgeführt. Es wurde mit der „Reversed-Gated-Decoubling-Methode“
gemessen, denn diese Methode ermöglicht eine Aufnahme der Spektren ohne den Kern-
Overhauser-Effekt. Dies hat zur Folge, dass neben der chemischen Verschiebung bei der
Analyse des Spektrums auch noch das Intensitätsverhältnis berücksichtigt werden kann.
Die 2D-NMR-Spektren wurden mit 64K x 512 Datenpunkten und einer spektralen Weite für
den 13C-Kanal von 7360 Hz und für den 1H-Kanal von 2650 Hz aufgenommen. Es wurde mit
der „HSQC-Methode“ gemessen. Dabei handelt es sich um eine inverse 1H-13C-Korrelation.
Diese ermöglicht es, eine heteronukleare Resonanzuntersuchung in relativ kurzer Zeit
durchzuführen.
Als Grundlage der Signalzuordnung wurden die veröffentlichten Daten verschiedener
Arbeitsgruppen genutzt [97-102]. Für die Experimente mit bivalenten Kationen erfolgte die
Zuordnung der Signale über Referenzen zu Spektraldaten, die für reine Polysaccharid-
Lösungen in Abhängigkeit von der Polysaccharidkonzentration und dem Abbauverfahren
erhalten wurden.
5 Ergebnisse
54
5 Ergebnisse
5.1 Charakterisierung der EPS-Proben
Eine wichtige Größe, um die Eigenschaften von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS)
zu ergründen, ist ihre molare Masse. Aus diesem Grund wurden die für diese Arbeit
verwendeten EPS und die abgebauten Varianten mittels GPC charakterisiert. Des Weiteren ist
die Viskosität einer wässrigen EPS-Lösung stark von der Art und der Konformation des
gelösten Biopolymers abhängig, so dass diese charakteristische Größe mit Hilfe eines
Rotations-viskosimeters bestimmt wurde.
Bei den in dieser Arbeit untersuchten EPS handelt es sich um Dextran von Leuconostoc
mesenteroides, um das Natriumsalz der Hyaluronsäure von Streptococcus equi subspecies
zooepidemicus und um das Natriumsalz des Xanthans von Xanthomonas campestris.
In diesem Kapitel sind die Ergebnisse der GPC, sowie der Viskosimetrie der wässrigen EPS-
Lösungen zusammengefasst.
5.1.1 Molmassenbestimmung der Proben Für die Messungen wurden die Polysaccharide wie in Kapitel 4.2 beschrieben in
tridestilliertem Wasser gelöst und mit der SEC-Malls analysiert. Die erhaltenen Molmassen
sind in Tabelle 5.1 aufgeführt.
Tabelle 5.1: Mittlere molare Massen der verwendeten EPS
extrazelluläre polymere Substanz mittl. Molmasse
Dextran 2.0 ⋅ 105 g/mol
Hyaluronat 1.7 ⋅ 106 g/mol
Hyaluronat, 3 Stunden durch Ultraschall-
einwirkung abgebaut
4.0 ⋅ 105 g/mol
Xanthan 2.90 ⋅ 106 g/mol
Xanthan, 3 Stunden durch Ultraschall-
einwirkung abgebaut
1.70 ⋅ 106 g/mol
Xanthan, 5 Stunden durch Ultraschall-
einwirkung abgebaut
1.04 ⋅ 106 g/mol
5 Ergebnisse
Tabelle 5.1 (Fortsetzung): Mittlere molare Massen der verwendeten EPS
extrazelluläre polymere Substanz mittl. Molmasse
Xanthan, 10 Stunden durch Ultraschall-
einwirkung abgebaut
6.8 ⋅ 105 g/mol
Xanthan, 15 Stunden durch Ultraschall-
einwirkung abgebaut
1.4 ⋅ 105 g/mol
In Abbildung 5.1 sind die Signale einer Messung des Viskositätsdetektors (links) und des
Differentialrefraktometers (rechts) exemplarisch für Hyaluronsäure aufgeführt.
-17.98
289.90
597.77
905.64
1213.51
1521.38
1829.25
Vis
com
eter
DP
(mV
)
Retention Volume (mL)0.00 2.81 5.63 8.44 11.25 14.06 16.88 19.69 22.50
-503.34
-502.20
-501.06
-499.92
-498.77
-497.63
-496.49R
efra
ctiv
e In
dex
(mV
)
Retention Volume (mL)0.00 2.81 5.63 8.44 11.25 14.06 16.88 19.69 22.50
Abbildung 5.1: Exemplarische Abbildung der Elutionskurve für Hyaluronat, detektiert mit dem Viskositätsdetektor (links) und dem Differentialrefraktometer (rechts)
Da der Umgang mit den nicht abgebauten Polysacchariden, insbesondere dem Xanthan,
wegen der hohen Viskosität der wässrigen Lösungen nicht unproblematisch war, wurde eine
mechanische Degradation der Molmasse erwogen. Dieser Ultraschallabbau wurde durch den
Vergleich der Molmassen der einzelnen Fraktionen kontrolliert (Tab. 5.1). Betrachtet man das
Elutionsvolumen für die jeweiligen Fraktionen, so fällt auf, dass das Maximum für längere
Abbauzeiten zu höheren Retentionsvolumen hin verschoben ist. Dies wird in der Abbildung
5.2 für die 5 h abgebaute, die 10 h abgebaute und die 15 h abgebaute Xanthanfraktion
deutlich.
55
5 Ergebnisse
56
Abbildung 5.2: SEC-Malls für den Ultraschallabbau von Xanthan (0 h, 5 h, 10 h, 15 h mit einer Intensität von 60 Watt)
Wie die Elutionskurven in obiger Abbildung zeigen, nimmt die Verschiebung der Peaks mit
zunehmender Abbauzeit ab. Dieser Effekt ist am ausgeprägtesten zwischen der 10 h Fraktion
und der 15 h Fraktion zu beobachten. Diese Ergebnisse zeigen somit, dass der Abbau
offensichtlich in keinem linearen Zusammenhang mit der Degradationszeit steht. Eine
Auftragung der mittleren Molmasse in Abhängigkeit von der Abbauzeit liefert einen nicht
linearen Zusammenhang (Abb. 5.3) dargestellt.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 5 10Degradationszeit [h]
Mitt
lere
Mol
mas
se [1
06 g/m
ol]
15
Abbildung 5.3: Auftragung der mittleren Molmassen der abgebauten Fraktionen gegen die Degradationszeit
-533.23
-533.02
-532.81
-532.61
-532.40
-532.19
-531.98
Ref
ract
ive
Inde
x (m
V)
Retention Volume (mL)0.00 3.75 7.50 11.25 15.00 18.75 22.50 26.25 30.00
-
kein Ultraschallabbau kein Ultraschallabbau
522.84
-521.06
-519.27
-517.49
-515.71
-513.92
-512.14
Ref
ract
ive
Inde
x (m
V)
Retention Volume (mL)0.00 2.81 5.63 8.44 11.25 14.06 16.88 19.69 22.50
-549.68
-528.04
-506.39
-484.75
-463.11
-441.47
-419.83
Ref
ract
ive
Inde
x (m
V)
Retention Volume (mL)0.00 6.25 12.50 18.75 25.00 31.25 37.50 43.75 50.00
-549.32
-508.56
-467.81
-427.05
-386.29
-345.54
-304.78
Ref
ract
ive
Inde
x (m
V)
Retention Volume (mL)0.00 6.25 12.50 18.75 25.00 31.25 37.50 43.75 50.00
α-D-Glucofuranose α-D-Glucofuranose
5 Ergebnisse
57
5.1.2 Viskosität der Proben in wässriger Lösung Für die Messungen wurden die Polysaccharide, wie im Abschnitt 4.4.1 des Methodenteils
beschrieben, in destilliertem Wasser gelöst und mit einem Rotationsviskosimeter analysiert.
Die Messungen wurden bei einer Schergeschwindigkeit von 2 s-1, einer Temperatur von
25°C und einer Dauer von 20 s durchgeführt. Die erhaltenen Viskositäten, sowie die
berechneten Exponenten der „Mark-Houwink-Gleichung“ (α) sind in Tabelle 5.2 aufgeführt.
Tabelle 5.2: Viskosität der verwendeten EPS mit einer Konzentration von 1,5 mg/mL extrazelluläre polymere Substanz Viskosität α
Dextran 0.97 mPa⋅s 0,11
Hyaluronat 58 mPa⋅s 0,78
Hyaluronat 3 Stunden durch Ultraschall-
einwirkung abgebaut
2.8 mPa⋅s 0,49
Xanthan 224 mPa⋅s 0,88
Xanthan 3 Stunden durch Ultraschall-
einwirkung abgebaut
3.1 mPa⋅s 0,55
Xanthan 5 Stunden durch Ultraschall-
einwirkung abgebaut
2.0 mPa⋅s 0,48
Xanthan 10 Stunden durch Ultraschall-
einwirkung abgebaut
1.6 mPa⋅s 0,43
Xanthan 15 Stunden durch Ultraschall-
einwirkung abgebaut
1.5 mPa⋅s 0,34
Die Viskosität der Lösung des verzweigten und ungeladenen Dextrans ist am niedrigsten. Bei
dem geladenen und unverzweigten Makromolekül Hyaluronat ist die Viskosität höher. Das
Xanthan als verzweigtes und geladenes Polymer besitzt die höchste Lösungs–Viskosität.
Das Verhalten der viskosen wässrigen Lösungen und damit die Struktur der gelösten
Polysaccharide wird durch den Ultraschallabbau beeinflusst. Bei zunehmender
Beschallungszeit nimmt nicht nur die Molmasse sondern auch die Viskosität der Lösung ab.
Darüber hinaus führt die Ultraschallbehandlung zu einer kompakteren Knäuelstruktur.
Während die unbehandelten Polyelektrolyte in wässriger Lösung einem vollständig
durchspülten Knäuel entsprechen (α≈ 1,0), beobachtet man für das Hyaluronat nach einer
dreistündigen Ultraschallbehandlung, dass sich die Dichte des gelösten Makromoleküls
erhöht. Ein Exponent (α) von 0,51 entspricht einem nur teilweise durchspülten Knäuel. Dies
5 Ergebnisse
58
wird ebenfalls für die über 3 h, 5 h, 10 h und 15 h abgebauten Xanthanfraktionen beobachtet
[89].
Wie stark der Einfluss der Degradation auf die Viskosität ist, kann man beim Xanthan
deutlich beobachten. Die Viskosität wird nach einem dreistündigem Ultraschallabbau um das
75-fache verringert. Betrachtet man allerdings den Abbau über größere Zeiträume, so fällt auf,
dass eine weitere Verringerung der Viskosität, wie in Tabelle 5.2 zu sehen, für Abbauzeiten
>3 h vergleichsweise gering ausfällt. Aus diesem Grund wurden für die weiteren
Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit überwiegend die über 3 h abgebauten Fraktionen
verwendet.
5 Ergebnisse
5.2 Konduktometrische Titration mit Kationen Um einen Einblick in die Wechselwirkungscharakteristik von Metallionen mit EPS zu
erhalten, bedarf es der Bestimmung des Äquivalenzpunktes. Dabei handelt es sich um einen
wichtigen Aspekt der quantitativen Analyse bezüglich der Wechselwirkungspositionen. Ein
probates Mittel zur Bestimmung des Äquivalenzpunktes ist die konduktometrische Titration
mit Kationen. Diese wurde wie in Kapitel 4.3 beschrieben durchgeführt. Bei den Titranden
handelt es sich um Lösungen der zwei bzw. dreiwertigen Metall- und Schwermetallionen der
Salze Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Manganchlorid, Eisen(II)chlorid, Eisen(III)chlorid,
Kupferchlorid, Zinkacetat, Cadmiumacetat und Bleiacetat.
5.2.1 Leitfähigkeitsmessungen von Dextran Gemessen wurden Lösungen des Dextrans von 0,5 bis 3,0 mg/mL bei einer Temperatur von
25°C. Die Leitfähigkeitsfunktion zeigt keine Diskontinuität, so dass für Titrationen mit den
oben genannten Salzlösungen keine Äquivalenzpunkte bestimmt werden können (s. Abb. 5.4).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
tfäh
igke
it [m
S/cm
]
Abbildung 5.4: Exemplarische Abbildung für eine Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Ca2+-Lösung (0,05 mol/L)
In Abbildung 5.4 ist die Leitfähigkeit einer Dextran-Lösung gegen die Kationenkonzentration
aufgetragen. In diesem Fall handelt es sich um Ca2+-Ionen, die zur Polysaccharidlösung
titriert wurden. Die Titrationskurve weist bei allen Messungen lediglich eine unterschiedliche
59
5 Ergebnisse
Steigung auf. Ansonsten wurden weder bei Variation des Salzes noch bei der
Konzentrationsänderung der Dextranlösung auffällige Abweichungen vom kontinuierlichen
Verlauf beobachtet. Die leichte Krümmung bei höheren Konzentrationen ist auf den Einfluss
des Kohlrauschschen Quadratwurzelgesetzes zurückzuführen. Die Vergleichsabbildungen für
weitere Dextrankonzenrationen sowie der unterschiedlichen Salze sind im Anhang (s. Abb.
A.1 bis A.8) zufinden.
5.2.2 Leitfähigkeitsmessungen von Hyaluronat Wie in Abschnitt 5.2 beschrieben, wurden für das Hyaluronat konduktometrische Titrationen
mit wässrigen Lösungen verschiedener Metallkationen durchgeführt. Hierbei wurden
verschieden konzentrierte wässrige Lösungen des Hyaluronats von 0,5 bis 3,0 mg/mL bei
einer Temperatur von 25°C gemessen. Aufgrund der resultierenden Wechselwirkungen
zwischen dem geladenen Polysaccharid und den hinzutitrierten Kationen gibt es einen
diskontinuierlichen Verlauf der Leitfähigkeitsfunktion. Ein exemplarischer Verlauf einer
typischen Leitfähigkeitsmessung, bei der die Leitfähigkeit gegen die Kationenkonzentration
aufgetragen wird, ist in der Abbildung 5.5 zu sehen.
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0,55
0,6
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
tfäh
igke
it [m
S/cm
]
α-D-Glucofuranose
Abbildung 5.5: Exemplarische Abbildung für eine Titration einer Lösung (100 mL) des über 3 h abgebauten Hyaluronats (1,5 mg/mL) mit einer Pb2+-Lösung (0,05 mol/L)
60
5 Ergebnisse
Zu Beginn der Leitfähigkeitstitration nimmt die Leitfähigkeit im Vergleich zum restlichen
Funktionsverlauf nur langsam zu. Wird allerdings die Äquivalenzkonzentration des Kations
(s. Abb. 5.5) überschritten, so verläuft diese kontinuierlich und mit einer größeren Steigung
als im Anfangsbereich. Auch hier gilt wie beim Dextran, dass die Abweichung bei höheren
Elektrolytkonzentrationen durch das Kohlrausche Quadratwurzel-Gesetz bedingt wird. Wie in
Kapitel 4.3 erläutert, ist es möglich durch graphische Extrapolation den Äquivalenzpunkt zu
bestimmen. Trägt man zusätzlich das erste Differenzial der Leitfähigkeitsfunktion auf (s. Abb.
5.6), so kann mit Hilfe der Bedingung, dass diese ab dem Äquivalenzpunkt annähernd
konstant wird (s. Kap. 4.3) die Äquivalenzkonzentration genauer verifiziert werden.
0
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
∆κ
[mS/
cm]
Abbildung 5.6: Exemplarische Darstellung der ersten Ableitung einer Leitfähigkeitsfunktion von Hyaluronat (1,0 mg/mL; 100 mL) mit dem Kation „Pb2+“
α-D-Glucofuranose
Vergleicht man die im Anhang (s. Abb. A.9 bis A.15) abgebildeten Leitfähigkeitsgraphen, so
fällt auf, dass es Variationen im Zusammenhang mit den jeweiligen Kationen gibt. Oberhalb
der Äquivalenzkonzentration beobachtet man unterschiedliche Steigungen der Graphen,
welche von der molaren Leitfähigkeit des Kations geprägt sind. Darüber hinaus tritt eine mehr
oder weniger ausgeprägte Diskontinuität in den einzelnen Abbildungen auf. Die
Diskontinuität im Bereich der Äquivalenzkonzentration ist ein charakteristisches Merkmal für
die Stabilität des sich einstellenden Komplexes zwischen EPS und Metallion und ist um so
ausgeprägter, je intensiver die Wechselwirkungen sind. Als Maß für die Intensität der
Wechselwirkung wird, wie in Kapitel 4.3 beschrieben, die Differenz der Leitfähigkeit
zwischen reinem Elektrolyt und dem wechselwirkenden Elektrolyt ∆κ * bestimmt. 61
5 Ergebnisse
62
Die erhaltenen Äquivalenzkonzentrationen und die berechneten ∆κ*-Werte für die jeweiligen
Kationen sind in den folgenden Tabellen zusammengestellt.
Tabelle 5.3: Äquivalenzkonzentration Tabelle 5.4: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Calcium und ∆κ*-Werte von Magnesium
Hyaluronat
[mg/mL]
Ca2+
[mol/L]
∆κ*
[mS/cm]
Hyaluronat
[mg/mL]
Mg2+
[mol/L]
∆κ*
[mS/cm]
0,5 2,5⋅10-5 0,018 0,5 3,0⋅10-5 0,015
1,0 5,5⋅10-5 0,031 1,0 5,5⋅10-5 0,023
1,5 8,0⋅10-5 0,074 1,5 7,0⋅10-5 0,040
2,0 10,5⋅10-5 0,076 2,0 10,0⋅10-5 0,045
2,5 12,5⋅10-5 0,080 2,5 12,5⋅10-5 0,053
3,0 15,0⋅10-5 0,087 3,0 15,0⋅10-5 0,056
Tabelle 5.5: Äquivalenzkonzentration Tabelle 5.6: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Mangan und ∆κ*-Werte von Kupfer
Hyaluronat
[mg/mL]
Mn2+
[mol/L]
∆κ*
[mS/cm]
Hyaluronat
[mg/mL]
Cu2+
[mol/L]
∆κ*
[mS/cm]
0,5 2,8⋅10-5 0,029 0,5 2,5⋅10-5 0,027
1,0 5,5⋅10-5 0,025 1,0 5,0⋅10-5 0,053
1,5 7,5⋅10-5 0,039 1,5 7,5⋅10-5 0,075
2,0 10,0⋅10-5 0,072 2,0 10,0⋅10-5 0,096
2,5 12,5⋅10-5 0,059 2,5 12,5⋅10-5 0,122
3,0 15,0⋅10-5 0,063 3,0 15,0⋅10-5 0,139
Tabelle 5.7: Äquivalenzkonzentration Tabelle 5.8: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Eisen(II) und ∆κ*-Werte von Zink
Hyaluronat
[mg/mL]
Fe2+
[mol/L]
∆κ*
[mS/cm]
Hyaluronat
[mg/mL]
Zn2+
[mol/L]
∆κ*
[mS/cm]
0,5 4,0⋅10-5 0,030 0,5 3,0⋅10-5 0,032
1,0 3,5⋅10-5 0,043 1,0 6,5⋅10-5 0,069
1,5 8,0⋅10-5 0,064 1,5 7,3⋅10-5 0,075
2,0 10,0⋅10-5 0,075
2,5 12,0⋅10-5 0,090
3,0 15,0⋅10-5 0,114
5 Ergebnisse
63
Tabelle 5.9: Äquivalenzkonzentration Tabelle 5.10: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Cadmium und ∆κ*-Werte von Blei
Hyaluronat
[mg/mL]
Cd2+
[mol/L]
∆κ*
[mS/cm]
Hyaluronat
[mg/mL]
Pb2+
[mol/L]
∆κ*
[mS/cm]
0,5 3,0⋅10-5 0,016 0,5 2,5⋅10-5 0,010
1,0 5,3⋅10-5 0,056 1,0 6,0⋅10-5 0,064
1,5 8,0⋅10-5 0,084 1,5 7,5⋅10-5 0,102
Die entsprechenden Werte für die Äquivalenzkonzentration sowie für ∆κ* konnten für die
Titration mit Eisen(III) nicht ermittelt werden. Bei einer Konzentration von 0,9 mmol/L
wurde immer wieder das Löslichkeitsprodukt der wässrigen Lösung überschritten, so dass die
gebildeten Komplexe in Form von Flocken ausfielen. Aus diesem Grund war es auch nicht
möglich das stöchiometrische Verhältnis von Kation zu Polysacchariduntereinheit zu
bestimmen.
Diese charakteristische Größe, welche untrennbar mit der Konformation des Komplexes
verknüpft ist, wurde für alle im Rahmen dieser Arbeit verwendeten bivalenten Salze
errechnet. Das berechnete Verhältnis wird für Hyaluronat mit den Konzentrationen von 0,5
bis 2,0 mg/mL in der Tabelle 5.11 aufgeführt.
Tabelle 5.11: Stöchiometrisches Verhältnis zwischen den komplementären Kationen und der Polymeruntereinheit von Hyaluronat
Hyaluronatkonzentration [g/L]
0,5 1,0 1,5 2,0
Calciumchlorid 1:5,26 1:4,78 1:4,94 1:5,01
Magnesiumchlorid 1:4,38 1:4,78 1:5,64 1:5,54
Manganchlorid 1:4,79 1:4,78 1:5,26 1:5,26
Eisen(II)chlorid 1:3,29 1:5,26 1:4,93 1:5,26
Kupferchlorid 1:5,26 1:5,26 1:5,26 1:5,26
Zinkacetat 1:4,38 1:4,05 1:5,45
Cadmiumacetat 1:4,38 1:5,01 1:4,94
Biv
alen
te S
alze
Bleiacetat 1:5,26 1:4,39 1:5,26
Bei den Schwermetallionen Zink, Cadmium und Blei war die Berechnung des Verhältnisses
oberhalb einer Konzentration von 1,5 mg/mL des Hyaluronats nicht möglich, da sich bei der
5 Ergebnisse
Titration ein Feststoff bildete. Folglich scheidet die Bestimmung eines Äquivalenzpunktes als
Grundlage für die Berechnung aus (s. Tab. 5.11).
Wird der Mittelwert für die aufgeführten Ergebnisse gebildet, so kommen auf ein Kation fünf
Monomereinheiten.
5.2.3 Leitfähigkeitsmessungen von Xanthan Für wässrige Lösungen des Xanthans in Konzentrationen von 0,5 bis 3,0 mg/mL wird
entsprechend Kapitel 4.3 die Leitfähigkeit in Abhängigkeit der zugesetzten
Kationenkonzentration bei einer Temperatur von 25°C gemessen. Ebenso wie beim
Hyaluronat gibt es auch beim Xanthan, wegen der resultierenden Wechselwirkungen
zwischen dem geladenen Polysaccharid und den hinzutitrierten Kationen, einen
diskontinuierlichen Verlauf der Leitfähigkeitsfunktion. Ein exemplarischer Verlauf einer
typischen Leitfähigkeitsmessung, bei der die Leitfähigkeit gegen die Kationenkonzentration
aufgetragen wird, ist in der Abbildung 5.7 zu sehen.
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
tfäh
igke
it [m
S/cm
]
Äquivalenzpunkt
Abbildung 5.7: Exemplarische Abbildung einer Leitfähigkeitskurve für die Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung (100 mL) der Konzentration 1,0 mg/mL mit einer Zn2+-Lösung der Konzentration 0,05 mol/L
64
5 Ergebnisse
Der grundsätzliche Verlauf der Leitfähigkeitsfunktion ähnelt der des Hyaluronats (vgl.
Abb. 5.5). Bis zum Äquivalenzpunkt hin nimmt die Leitfähigkeit nur wenig zu, die Funktion
verläuft sehr flach. Wird die Äquivalenzkonzentration des Kations (s. Abb. 5.7) überschritten,
so verläuft der Funktionsgraph mit einer größeren Steigung. Die Abweichung bei höheren
Elektrolytkonzentrationen resultiert aus dem Kohlrauschschen Quadratwurzel-Gesetz. Wie in
Kapitel 4.3 erläutert, ist es möglich, durch eine graphische Auswertung der
Leitfähigkeitsfunktion und deren erste Ableitung (s. Abb. 5.8) den Äquivalenzpunkt zu
bestimmen. Hierbei wird der Äquivalenzpunkt entsprechend den Abbildung 5.7 und 5.8
abgelesen.
0
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005Konzentration Me2+ [mol/L]
∆κ
[mS/
cm]
Äquivalenzpunkt
Abbildung 5.8: Exemplarische Darstellung der ersten Ableitung einer Leitfähigkeitsfunktion von Xanthan (1,5 mg/mL; 100 mL) in Abhängigkeit von der Zn2+-Ionenkonzentration
Wie die Abbildungen im Anhang (s.Abb. A.16 bis A.22) zeigen, treten für Xanthan im
Leitfähigkeitsgraphen kationenspezifische Varianzen auf. Am auffälligsten ist hierbei, neben
den unterschiedlichen Steigungen oberhalb der Äquivalenzkonzentration, welche von der
molaren Leitfähigkeit des Kations abhängen, die mehr oder weniger ausgeprägte
Diskontinuität in den einzelnen Abbildungen. Dieser Knick im Bereich der
Äquivalenzkonzentration ist ein charakteristisches Merkmal für die Stärke des sich
einstellenden Komplexes und ist um so ausgeprägter, je intensiver die Wechselwirkungen
sind. Als Maß für die Intensität der Wechselwirkung, wird die Differenz der Leitfähigkeit
zwischen reinem Elektrolyt und dem wechselwirkenden Elektrolyt ∆κ* bestimmt.
65
5 Ergebnisse
66
Die erhaltenen Äquivalenzkonzentrationen sowie die berechneten ∆κ*-Werte für die
jeweiligen Kationen sind in den folgenden Tabellen zusammengestellt.
Tabelle 5.12: Äquivalenzkonzentration Tabelle 5.13: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Calcium und ∆κ*-Werte von Magnesium
Xanthan
[mg/mL]
Ca2+
[mol/L]
∆κ*
[mS/cm]
Xanthan
[mg/mL]
Mg2+
[mol/L]
∆κ*
[mS/cm]
0,5 2,7⋅10-5 0,003 0,5 2,5⋅10-5 0,012
1,0 5,0⋅10-5 0,05 1,0 5,5⋅10-5 0,019
1,5 8,0⋅10-5 0,078 1,5 7,5⋅10-5 0,045
2,0 10,0⋅10-5 0,081 2,0 9,5⋅10-5 0,070
Tabelle 5.14: Äquivalenzkonzentration Tabelle 5.15: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Mangan und ∆κ*-Werte von Kupfer
Xanthan
[mg/mL]
Mn2+
[mol/L]
∆κ*
[mS/cm]
Xanthan
[mg/mL]
Cu2+
[mol/L]
∆κ*
[mS/cm]
0,5 3,3⋅10-5 0,002 0,5 3,0⋅10-5 0,025
1,0 6,0⋅10-5 0,028 1,0 5,5⋅10-5 0,043
1,5 9,0⋅10-5 0,032 1,5 7,0⋅10-5 0,059
2,0 9,5⋅10-5 0,063 2,0 9,5⋅10-5 0,083
Tabelle 5.16: Äquivalenzkonzentration Tabelle 5.17: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Eisen(II) und ∆κ*-Werte von Zink
Xanthan
[mg/mL]
Fe2+
[mol/L]
∆κ*
[mS/cm]
Xanthan
[mg/mL]
Zn2+
[mol/L]
∆κ*
[mS/cm]
0,5 3,0⋅10-5 0,021 0,5 3,0⋅10-5 0,009
1,0 5,5⋅10-5 0,034 1,0 5,5⋅10-5 0,045
1,5 7,5⋅10-5 0,058 1,5 6,5⋅10-5 0,082
2,0 9,0⋅10-5 0,064 2,0 9,5⋅10-5 0,088
5 Ergebnisse
Tabelle 5.18: Äquivalenzkonzentration Tabelle 5.19: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Cadmium und ∆κ*-Werte von Blei
Xanthan
[mg/mL]
Cd2+
[mol/L]
∆κ*
[mS/cm]
Xanthan
[mg/mL]
Pb2+
[mol/L]
∆κ*
[mS/cm]
0,5 3,5⋅10-5 0,034 0,5 3,0⋅10-5 0,037
1,0 5,5⋅10-5 0,049 1,0 5,5⋅10-5 0,070
1,5 10,0⋅10-5 0,093 1,5 10,0⋅10-5 0,130
Die entsprechenden Werte für die Äquivalenzkonzentration und für ∆κ* konnten für die
Titration mit Eisen(III) nicht ermittelt werden. Ab einer Konzentration von 0,65 mmol/L
wurde immer wieder das Löslichkeitsprodukt der wässrigen Lösung überschritten, so dass die
gebildeten Komplexe in Form von Flocken ausfielen.
Darüber hinaus wurden die Werte für höhere Konzentrationen als 2,0 mg/mL in den obigen
Tabellen nicht berücksichtigt, da wegen der im Vergleich mit dem Hyaluronat offensichtlich
stärkeren Wechselwirkung der bivalenten Kationen ein außerordentlich ungleichmäßiger
Kurvenverlauf die Folge war. Ein Ausschnitt der Leitfähigkeitskurve für die Titration einer
Xanthan-Lösung ist in Abbildung 5.9 dargestellt.
0,7
0,71
0,72
0,73
0,74
0,75
0,76
0,77
0,78
0,79
0,8
0 0,00025 0,0005 0,00075 0,001 0,00125
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
tfäh
igke
it [m
S/cm
]
Abbildung 5.9: Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung der Konzentration 2,5 mg/mL mit einer Lösung von Cd2+-Ionen mit einer Konzentration von 0,05 mol/L
67
5 Ergebnisse
68
Durch die nicht eindeutige Zuordnung des Äquivalenzpunktes fehlte jegliche Grundlage zur
Bestimmung der Äquivalenzkonzentration und zur Berechnung von ∆κ*, sowie des
stöchiometrischen Quotienten QÄ.
Die charakteristische Größe des stöchiometrischen Verhältnisses von Kation zur
Polymeruntereinheit, welche untrennbar mit der Konformation des Komplexes verknüpft ist,
wurde für das Xanthan mit den Konzentration von 0,5 bis 2,0 mg/mL berechnet (s. Tab. 5.20).
Tabelle 5.20: Stöchiometrisches Verhältnis zwischen den komplementären Kationen und der Polymeruntereinheit von Xanthan
Xanthankonzentration [g/L]
0,5 1,0 1,5 2,0
Calciumchlorid 1:1,97 1:2,13 1:2,0 1:2,14
Magnesiumchlorid 1:2,14 1:1,94 1:2,14 1:2,25
Manganchlorid 1:1,62 1:1,78 1:1,78 1:2,25
Eisen(II)chlorid 1:1,78 1:1,94 1:2,13 1:2,37
Kupferchlorid 1:1,78 1:1,94 1:2,29 1:2,29
Zinkacetat 1:1,78 1 :1,94 1:2,46 1:2,25
Cadmiumacetat 1:1,53 1:1,94 1:1,97
Biv
alen
te S
alze
Bleiacetat 1:1,78 1:1,94 1:1,97
Bei den Schwermetallionen Cadmium und Blei wurde das Verhältnis oberhalb einer
Xanthankonzentration von 1,5 mg/mL nicht berücksichtigt, da sich bei der Titration ein
Feststoff bildete. Folglich scheidet die Bestimmung eines Äquivalenzpunktes und damit der
Äquivalenzkonzentration zur Berechnung von ∆κ*, sowie des stöchiometrischen
Verhältnisses aus.
Wird der Mittelwert für die aufgeführten Ergebnisse gebildet, so kommen auf ein Kation zwei
Monomereinheiten.
5 Ergebnisse
5.3 Rotationsviskosimetrische Untersuchung in Ab- bzw. Anwesenheit von mehrwertigen Kationen In Abschnitt 5.1.2 wurde bereits die Viskositätsänderung durch eine mechanische
Degradation der Molmasse beschrieben. Im Kapitel 5.2 wurden die Ergebnisse der
Wechselwirkung von bi- und trivalenten Kationen während einer Leitfähigkeitsmessung
geschildert. Zur weiteren Charakterisierung wird in diesem Kapitel anhand der bei der
Rotationsviskosimetrie erhaltenen Ergebnisse sowohl der Einfluss von bi- bzw. trivalenten
Kationen auf die Viskosität einer EPS-Lösung, als auch der Einfluss variierender
Schergeschwindigkeiten auf die EPS-Lösungen gezeigt.
5.3.1 Viskositätsmessungen in Abhängigkeit von der Kationenkonzentration Mit Hilfe der Rotationsviskosimetrie wurde der Einfluss von Kationen auf die Viskosität von
EPS-Lösungen untersucht, wobei die Vorgehensweise weitestgehend der der
konduktometrischen Titration entsprach (s. Absch. 4.4.1). Bei den verwendeten Kationen
handelt es sich um zwei bzw. dreiwertige Metall- und Schwermetallionen der Salze
Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Manganchlorid, Eisen(II)chlorid, Eisen(III)chlorid,
Kupferchlorid, Zinkacetat, Cadmiumacetat und Bleiacetat.
0
10
20
30
40
50
60
70
0 0,0001 0,0002 0,0003 0,0004 0,0005 0,0006 0,0007 0,0008 0,0009
Konzentration Me2+ [mol/L]
η [m
Pa*s
]
Abbildung 5.10: Beispielabbildung für die Viskositätsmessung einer Fe3+-Titration. Es wurde in 50 µL-Schritten eine Eisen(III)-Lösung (0,05 mol/L) in eine Hyaluronatlösung (1,5 mg/mL; 50 mL) gegeben
69
5 Ergebnisse
Bei dem Versuch EPS-Lösungen mit dem trivalenten Kation Fe3+ zu titrieren, wurde ab einer
Konzentration von 0,9 mmol/L, immer das Löslichkeitsprodukt der wässrigen Lösung
überschritten und es fiel ein Feststoff aus. Des Weiteren sind die bis zu dieser Konzentration
ermittelten Messwerte wenig repräsentativ, da die Messungen nicht reproduzierbare
Ergebnisse liefern. In obiger Abbildung 5.10 werden die Messwertschwankungen im Verlauf
einer solchen Messung aufgezeigt.
Es kommt also, wie in dieser Abbildung dargestellt, während der Messungen zu erheblichen
Viskositätssprüngen, welche unabhängig vom untersuchten Polyelektrolyt und seiner
Konzentration beobachtet wurden.
5.3.1.1 Viskositätsänderungen von Dextranlösung Die Messungen wurden entsprechend Abschnitt 4.4.1 des Methodenteils durchgeführt. Das
Dextran (1,5 mg/mL) wurde in destilliertem Wasser gelöst (50 mL) und bei einer Temperatur
von 25°C vermessen. Die erhaltenen Viskositäten wurden gegen die Kationenkonzentration
aufgetragen. Eine exemplarische Abbildung für ein solches Diagram liefert die
Abbildung 5.11.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014
Konzentration Me2+ [mol/L]
η [m
Pa*s
]
Abbildung 5.11: Exemplarische Abbildung für eine rotationsviskosimetrische Titration an Dextranlösung. Es wurde in 50 µL-Schritten eine Ca2+-Lösung (0,05 mol/L) in eine Dextranlösung (1,5 mg/mL; 50 mL) gegeben
70
5 Ergebnisse
Im Fall des abgebildeten Titrationsverlaufs handelt es sich um Ca2+-Ionen, die zur
Polysaccharidlösung titriert wurden. Die Titrationskurve weist jedoch für alle anderen
Kationen (auch Eisen(III)chlorid) stets einen linearen Verlauf auf. Die leichten Varianzen der
Messpunkte liegen alle im Rahmen der versuchsbedingten Toleranz. Betrachtet man die im
Anhang abgebildeten Graphen der rotationviskosimetrischen Titrationen des Dextrans, so fällt
auf, dass ein Einfluss auf die Viskosität durch Zugabe von bi- bzw. trivalenten Kationen
ausbleibt. Die Viskosität der Dextranlösungen bleibt also grundsätzlich für alle
durchgeführten Versuche konstant.
5.3.1.2 Viskositätsänderungen von Hyaluronatlösung Wie schon im Abschnitt 5.3.1 beschrieben wurde auch für das Hyaluronat eine
rotationsviskosimetrische Titration mit Kationen durchgeführt. Hierbei wurden wässrige
Lösungen des Hyaluronats (1,5 mg/mL) bei einer Temperatur von 25°C gemessen. Aufgrund
der resultierenden Wechselwirkungen zwischen dem geladenen Polysaccharid und den
hinzutitrierten Kationen, weicht der Verlauf der Viskositätsfunktion von einer Geraden ab.
Ein exemplarischer Verlauf einer typischen Viskositätsmessung, bei der die Viskosität gegen
die Kationenkonzentration aufgetragen wird, ist in der Abbildung 5.12 zu sehen.
0
10
20
30
40
50
60
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014
Konzentration Me2+ [mmol/L]
η [m
Pa*s
]
Äquivalenzpunkt
Abbildung 5.12: Exemplarischer Verlauf für eine typische Viskositätsmessung des Hyaluronats (nicht abgebaut). Es wurde in 50 µL-Schritten eine Ca2+-Lösung (0,05 molar) in eine Hyaluronatlösung (1,5 mg/mL; 50 mL) titriert
71
5 Ergebnisse
72
Wie in obiger Abbildung zu erkennen, nimmt die Viskosität während der Titration bis zum
Erreichen eines nahezu konstanten Wertes, in diesem Fall ca. 18 mPa⋅s, ab. Allerdings ist der
Funktionsgraph dabei keineswegs linear, er folgt vielmehr einem kontinuierlich abnehmenden
Verlauf der sich asymptotisch einer konstanten Viskosität nähert. Eine solche
Viskositätsabnahme ist typisch für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten bivalenten
Kationen und wurde bei allen Messdurchläufen beobachtet.
Wie im Abschnitt 4.4.1 des Methodenteils erläutert, ist es möglich, durch graphische
Extrapolation den Äquivalenzpunkt zu bestimmen. Diese ist gemeinsam mit den berechneten
stöchiometrischen Verhältnissen zwischen Kation und Polymeruntereinheit in Tabelle 5.21
aufgeführt.
Tabelle 5.21: Äquivalenzkonzentration und stöchiometrisches Verhältnis zwischen den kompleme tären Kationen und der Polymeruntereinheit von Hyaluronat (1,5 mg/mL) n
Äquivalenz-
konzentration[mol/L]
Kation-Monomer-
Verhältniss
Calciumchlorid 9,0⋅10-5 1:4,4
Magnesiumchlorid 8,0⋅10-5 1:5,0
Manganchlorid 8,0⋅10-5 1:5,0
Eisen(II)chlorid 9,0⋅10-5 1:4,4
Kupferchlorid 8,0⋅10-5 1:5,0
Zinkacetat 8,0⋅10-5 1:5,0
Cadmiumacetat 8,5⋅10-5 1:4,7
Biv
alen
te S
alze
Bleiacetat 8,0⋅10-5 1:5,0
Wird der Mittelwert für die aufgeführten Verhältnisse gebildet, so kommen auf ein Kation ca.
fünf Polymeruntereinheiten. Vergleicht man die erhaltenen Äquivalenzkonzentrationen der
Viskosimetrie mit denen der Konduktometrie, so fällt auf, dass diese im Mittel um 7,5%
voneinander abweichen.
5 Ergebnisse
5.3.1.3 Viskositätsänderungen von Xanthanlösung Für Xanthan wurden wässrige Lösungen mit einer Polysaccharidkonzentration von
1,5 mg/mL bei einer Temperatur von 25°C gemessen. Ebenso wie beim Hyaluronat ergeben
sich auch beim Xanthan, wegen der resultierenden Wechselwirkungen zwischen dem
geladenen Polysaccharid und den hinzutitrierten Kationen in Abhängigkeit von der
Konzentration, unterschiedliche Viskositäten. Dies führt zu einer Abweichung vom linearen
Verhalten während der Titration. Ein exemplarischer Verlauf einer typischen
Viskositätsmessung, bei der die Viskosität gegen die Kationenkonzentration aufgetragen
wird, ist in der Abbildung 5.13 zu sehen.
Das Diagram ähnelt bei gleicher Konzentration stark dem des Hyaluronats. Der
Funktionsgraph ist ebenfalls nichtlinear und folgt einem kontinuierlich abnehmenden Verlauf,
der sich asymptotisch einer konstanten Viskosität nähert. Im Vergleich zum Hyaluronat ist
jedoch die asymptotische Annäherung zu niedrigeren Konzentrationen hin verschoben, so
dass der Äquivalenzpunkt von dem des Hyaluronats abweicht.
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014
Konzentration von Me2+ [mol/L]
η [m
Pa*s
] Äquivalenzpunkt
Abbildung 5.13: Exemplarische Abbildung der Viskositätsänderung einer Xanthan-Lösung (1,5 mg/mL; 3h abgebaut) durch Titration mit einer CaCl2-Lösung (0,05 mol/L)
Die hier, wie auch beim Hyaluronat, detektierte Viskositätsabnahme ist typisch für die im
Rahmen dieser Arbeit untersuchten bivalenten Kationen und wurde bei allen Messdurchläufen
beobachtet.
Durch graphische Extrapolation, wie im Abschnitt 4.4.1 des Methodenteils beschrieben,
wurden die Äquivalenzpunkte und somit die Äquivalenzkonzentrationen bestimmt. Diese sind
73
5 Ergebnisse
gemeinsam mit den berechneten stöchiometrischen Verhältnissen in Tabelle 5.22 für eine
Xanthankonzentration von 1,5 mg/mL aufgeführt.
Tabelle 5.22: Äquivalenzkonzentration und stöchiometrisches Verhältnis zwischen den komplementären Kationen und der Polymeruntereinheit von Xanthan (1,5 mg/mL)
Äquivalenz-
konzentration[mol/L]
Kation-Monomer-
Verhältniss
Calciumchlorid 8,5⋅10-5 1:1,9
Magnesiumchlorid 8,0⋅10-5 1:2,0
Manganchlorid 8,0⋅10-5 1:2,0
Eisen(II)chlorid 8,5⋅10-5 1:1,9
Kupferchlorid 9,0⋅10-5 1:1,8
Zinkacetat 8,0⋅10-5 1:2,0
Cadmiumacetat 8,5⋅10-5 1:1,9
Bleiacetat 8,0⋅10-5 1:2,0
Biv
alen
te S
alze
Wird der Mittelwert für die aufgeführten Verhältnisse gebildet, so kommen auf ein Kation ca.
zwei Polymeruntereinheiten. Vergleicht man die erhaltenen Äquivalenzkonzentrationen mit
denen der Konduktometrie, so fällt eine durchschnittliche Abweichung von 7% auf.
5.3.2 Viskositätsmessungen in Abhängigkeit von der Schergeschwindigkeit Die Viskosität einer wässrigen EPS-Lösung ist stark von der Tertiärstruktur des gelösten
Biopolymers abhängig, so dass diese charakteristische Größe mit Hilfe eines
Rotationsviskosimeters bestimmt werden kann. Um das Fließverhalten und damit die
Abhängigkeit einer solch viskosen Lösung von der Schergeschwindigkeit zu ergründen,
wurden unter Variation der Rotationsfrequenz die Viskositäten ermittelt. Dabei wurden
wässrige Proben von Dextran, Hyaluronat und Xanthan mit und ohne Salzzusatz untersucht.
In diesem Abschnitt ist das newtonsche und nichtnewtonsche Verhalten von EPS-Lösungen
unter interionischen Wechselwirkungen mit einem bi- bzw. trivalenten Kation sowie ohne
Fremdioneneinwirkung dokumentiert.
74
5 Ergebnisse
5.3.2.1 Viskositätsänderungen von Dextranlösung Wie im Abschnitt 4.4.2 des Methodenteils näher erläutert, wurde das Dextran in destilliertem
Wasser aufgenommen und bei 25°C für 1,5 min vermessen. Bei den zuvor durchgeführten
viskosimetrischen Untersuchungen des Dextrans in Anwesenheit von bi- bzw. trivalenten
Kationen wurde während einer Messung keine Varianz der Impulsübertragung beobachtet (s.
Absch. 5.3.1.1). Dieser Sachverhalt wurde hier im Rahmen der durchgeführten
Viskositätsmessungen sowohl bei den Lösungen mit Salzzusatz als auch ohne bestätigt. Ein
Einfluss auf die Viskosität blieb aus, wie in Abbildung 5.14 für eine Dextranlösung mit einer
Konzentration von 1,5 mg/mL zu sehen ist.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 1 2 3 4 5
Schergeschwindigkeit [s-1]
η [m
Pa*s
]
Abbildung 5.14: Abbildung einer Viskositätsmessung von Dextran (1,5 mg/mL) bei unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten
Die Viskosität der Dextranlösung bleibt bei den eingesetzten Schergeschwindigkeiten von 0,5
bis 5,0 s-1 konstant, so dass eine Gerade resultiert. Darüber hinaus zeigen Messungen bis zu
einer Schergeschwindigkeit von 8,0 s-1 keinerlei Einfluss auf die untersuchten Proben, so dass
es sich bei den untersuchten Dextranlösungen in guter näherung um newtonsche Flüssigkeiten
handelt.
75
5 Ergebnisse
5.3.2.2 Viskositätsänderungen von Hyaluronatlösung Als Grundlage für die Messungen wurden die unter Abschnitt 4.4.2 aufgeführten
Versuchsbedingungen berücksichtigt. Die wässrige Hyaluronatlösung wurde bei 25°C
vermessen und die Viskositäten bei unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten
aufgezeichnet. Ein solches Diagram, bei dem die Schergeschwindigkeit (dreier
unterschiedlicher Messungen) gegen die Viskosität aufgetragen wird, ist in Abbildung 5.15
dargestellt. Bei den gezeigten Ergebnissen handelt es sich um einen Viskositätsverlauf von
Hyaluronat ohne Salzzusatz und um zwei Viskositätsverläufe mit Salzzusatz. In diesem Fall
wurde Ca2+ als Kation für die Messungen der unteren beiden Verläufe eingesetzt. Es kann ein
deutlicher Unterschied gegenüber dem salzfreien Verlauf beobachtet werden.
0
10
20
30
40
50
60
70
0 1 2 3 4 5
Schergeschwindigkeit [s-1]
η [m
Pa*s
]
ohne Zusätzemit 0,08 mM CaCl2mit CaCl2 gesättigt
Abbildung 5.15: Abbildung einer Viskositätsmessung von Hyaluronat (1,5 mg/mL) bei unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten und Salzkonzentrationen (CaCl2)
Betrachtet man den oberen Graphen des Diagramms, bei dem kein Salz hinzugegeben wurde,
so sieht man eine Abnahme der Viskosität, während die Schergeschwindigkeit zunimmt. Dies
entspricht einer Abweichung vom klassischen Verhalten einer newtonschen Flüssigkeit (s.
Kap. 2.5.4). Für den Funktionsgraphen einer Lösung mit Äquivalenzkonzentration (s. Tab. 5.3
u. 5.21), sowie für den im Diagram abgebildeten Verlauf einer gesättigten Lösung, gilt dies
nicht. Bei diesen bleibt die Viskosität unabhängig von der Schergeschwindigkeit konstant und
entspricht somit dem Verhalten einer newtonschen Flüssigkeit.
76
5 Ergebnisse
5.3.2.3 Viskositätsänderungen von Xanthanlösung Beim Xanthan, wie auch beim Dextran und dem Hyaluronat, wurde darauf geachtet, eine
homogene wässrige Lösung zu erhalten. Die Viskositäten wurden bei unterschiedlichen
Schergeschwindigkeiten und einer Temperatur von 25°C bestimmt. Die Ergebnisse einer
solchen Messung wurden in ein Diagram übernommen und die Viskosität gegen die
Schergeschwindigkeit aufgetragen. Ein exemplarisches Diagram ist in Abbildung 5.16 für
drei Messungen unterschiedlicher Salzkonzentrationen dargestellt. In diesem Fall wurde
CaCl2 für die Messungen verwendet.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5
Schergeschwindigkeit [s-1]
η [m
Pa*s
]
ohne Zusätzemit 0,08 mM CaCl2gesättigt mit CaCl2
Abbildung 5.16: Abbildung einer Viskositätsmessung von Xanthan (1,5 mg/mL) bei unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten und Salzkonzentrationen (CaCl2)
Ganz ähnlich den Beobachtungen beim Hyaluronat erkennt man für die Probe ohne
Salzzusatz, dass eine nahezu lineare Abnahme der Viskosität über den Verlauf einer
Schergeschwindigkeitszunahme die Folge ist (nichtnewtonsches Verhalten). Für eine EPS-
Lösung mit Ca2+-Ionen in der Äquivalenzkonzentration (s. Tab. 5.12 u. 5.22) sowie eine Ca2+-
Ionen gesättigte Lösung, gilt dies nicht. Bei diesen beiden bleibt die Viskosität unabhängig
von der Schergeschwindigkeit konstant, welches einem newtonschen Verhalten der viskosen
Lösung entspricht.
77
5 Ergebnisse
5.4 Einfluss zweiwertiger Kationen auf die optische Aktivität von
Polysacchariden
Um den Einfluss von bivalenten Kationen auf extrazelluläre polymere Substanzen bezüglich
ihrer optischen Aktivität zu untersuchen, wurden circulardichroitische Messungen
überwiegend im Wellenlängenbereich des fernen UVs (150 nm – 300 nm) durchgeführt. Die
in diesem Bereich optisch aktiven chiralen Zentren geben Aufschluss über mögliche
konformative Wechselwirkungen zwischen Kation und Biopolymer. Hierbei wurden
unterschiedlich konzentrierte Polysaccharidlösungen im Rahmen von Titrationsversuchen
untersucht. Es handelt sich dabei um Relativmessungen des Hyaluronats und dem Xanthan.
In diesem Abschnitt sind die Ergebnisse verschiedener Titrationsversuche der beiden
geladenen Polysaccharide aufgeführt.
5.4.1 Circulardichroismus von Hyaluronat Die Messungen wurden, wie im Methodenteil (s. Absch. 4.5) beschrieben, durchgeführt. Zu
diesem Zweck lagen Lösungen der Konzentration 7 mg/mL des über 3 h abgebauten
Hyaluronats (s. Absch. 4.1) mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen vor, welche nach der
Filtration mit zirkular polarisiertem Licht bestrahlt wurden.
-250
-200
-150
-100
-50
0200 205 210 215 220 225 230 235 240 245 250
λ (nm)
mD
eg
Abbildung 5.17: CD-Kurven von über 3 h abgebautem Hyaluronat (a) und von Hyaluronat-Lösungen mit einer Ca2+-Konzentration von 0,0025 mol/L (b), 0,005 mol/L (c) und 0,0075 mol/L (d)
d
c b a
78
5 Ergebnisse
Die Messergebnisse werden zur graphischen Auswertung in ein Diagram übertragen, bei
welchem der Circulardichroismus gegen die Wellenlänge aufgetragen wird. Wie in obiger
Abbildung 5.17 zu sehen, besitzt das Polysaccharid bei 210 nm eine negative Bande mit einer
Intensität von –220 mDeg. Eine Wellenlängenverschiebung des Minimums für
unterschiedliche Salzkonzentrationen wurde nicht beobachtet, jedoch wurde eine Änderung
bezüglich der Intensitäten gegenüber der salzfreien Fraktion festgestellt. Bei einer
Salzkonzentration von 2,5 mmol/L nimmt der Intensitätsbetrag der Absorptionsbande auf
198 mDeg ab und sinkt für steigende Ca2+-Konzentrationen bis auf einen Wert von 135 mDeg
für eine Konzentration von 7,5 mmol/L Ca2+-Ionen.
Im Diagram der Abbildung 5.18, wird die Abhängigkeit des Circulardichroismus einer
wässrigen Hyaluronatlösung (7 mg/mL; 3 h abgebaut) mit zunehmender Konzentration von
Blei-Ionen unter obigen Konditionen dargestellt. Die detektierte negative Bande für salzfreies
Hyaluronat besitzt eine Intensität von –210 mDeg. Abweichend von den Messungen in
Anwesenheit von Ca2+-Ionen, wurde eine Wellenlängenverschiebung der Absorptionsbande
für unterschiedliche Salzkonzentrationen beobachtet.
-250
-200
-150
-100
-50
0200 205 210 215 220 225 230 235 240 245 250
λ (nm)
mD
eg
Abbildung 5.18: CD-Kurven von über 3 h abgebautem Hyaluronat (a) und von Hyaluronat-Lösungen mit einer Pb2+-Konzentration von 0,002 mol/L (b), 0,005 mol/L (c) und 0,0075 mol/L (d)
d
c
b
a
Über den Titrationsverlauf hinweg, wird eine Verschiebung zu höheren Wellenlängen
beobachtet. Bei einer Salzkonzentration von 2 mmol/L verschiebt sich das Minimum nach
212 nm und der Intensitätsbetrag der Bande nimmt dabei auf 171 mDeg ab. Das Signal-
79
5 Ergebnisse
Rausch-Verhältnis wird mit steigender Pb2+-Konzentration zunehmend schlechter, so dass die
Ergebnisse für Konzentrationen oberhalb von 5 mmol/L nicht reproduzierbar sind.
Des Weiteren zeigt sich im Rahmen der spektroskopischen Untersuchungen ein
Zusammenhang zwischen der Intensität für die Absorptionsbande bei 210 nm und der
Konzentration des Hyaluronats. Die Absorptionsbande ist um so ausgeprägter, je höher die
Konzentration des Polysaccharids in der Lösung ist.
5.4.2 Circulardichroismus von Xanthan Für Xanthan wurden entsprechend CD-Spektren von Xanthan-Lösungen (7 mg/mL; 3 h
abgebaut) unterschiedlicher Calciumchlorid-Konzentration aufgezeichnet. Bei dem hier
verwendeten Verfahren wird die eingestrahlte Wellenlänge sukzessive reduziert und der
Circulardichroismus in den Spektren gegen diese aufgetragen.
-13.000
-11.000
-9.000
-7.000
-5.000
-3.000
-1.000210 220 230 240 250 260 270 280
λ (nm)
mD
eg
Abbildung 5.19: Vergrößerung von CD-Kurven aufgenommen im Bereich von 210 bis 280 nm von über 3 h abgebautem Xanthan und von Xanthan-Lösungen mit einer Ca2+-Konzentration von 0,002 mol/L, 0,005 mol/L und 0,0075 mol/L
2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0- 1 2
- 1 0
- 8
- 6
- 4
- 2
0
2
4
6
8 x a c 0 2 .a c d x a c 0 3 .a c d x a c 0 4 .a c d
m D e g
W e l le n lä n g e ( λ n m )
In Abbildung 5.19 wird die Abhängigkeit des Circulardichroismus einer wässrigen
Xanthanlösung mit zunehmender Konzentration von Calcium-Ionen bei pH 6,0 in einem
Spektralbereich von >200 nm gezeigt. Das Polysaccharid besitzt bei 220 nm eine negative
Bande mit einer Intensität von –12.500 mDeg. Eine Wellenlängenverschiebung des
Minimums für unterschiedliche Salzkonzentrationen, sowie eine Änderung der Intensität
80
5 Ergebnisse
81
wurde nicht beobachtet. Allerdings fällt ein vergleichsweise niedriges Signal-Rausch-
Verhältnis (s. Abb. 5.18) bei gleichzeitig hoher CD-Aktivität auf.
Darüber hinaus wurde im Rahmen der spektroskopischen Untersuchungen ähnlich wie beim
Hyaluronat eine Beziehung zwischen der Intensität für die negative Absorptionsbande bei
220 nm bzw. der positiven bei 203 nm (s. Abb. 5.18) und der Konzentration des Xanthans
festgestellt. Die Absorptionsbanden sind um so ausgeprägter, je höher die Konzentration des
Polysaccharids ist.
5 Ergebnisse
5.5 Charakterisierung von Polysacchariden durch NMR-Spektroskopie
Im Rahmen dieser Arbeit wurden neben den schon beschriebenen physikalischen Methoden
zur Charakterisierung der EPS auch kernmagnetische Resonanzuntersuchungen durchgeführt.
Dabei handelt es sich um die Verfahren der 1H-NMR-Spektroskopie, der 13C-NMR-
Spektroskopie, sowie einer Kombination der beiden Verfahren im Rahmen der HSQC-
Methode (engl. Heteronuclear Single Quantum Coherence).
Die aufgeführten Ergebnisse veranschaulichen überwiegend die Wechselwirkung von
bivalenten Kationen, insbesondere der paramagnetischen Metallionen Mangan(II) und
Kupfer(II), welche als Sonden für die zu erwartenden Wechselwirkungen mit den
Polysacchariden eingesetzt wurden. Darüber hinaus wurden NMR-Spektren der EPS-
Lösungen in Abhängigkeit von der Ultraschallbehandlung detektiert, um zu untersuchen,
inwieweit über eine derartige Nachbehandlung die spektrale Auflösung gesteigert werden
kann.
In Abbildung 5.20 ist für Xanthan eine Steigerung der spektralen Auflösung (13C-NMR) als
folge des Ultraschallabbaus zu sehen. Durch die Degradation wurde wie die Ergebnisse in
Abschnitt 5.1.2 zeigen, die Viskosität der Lösung reduziert. Dies ermöglicht eine schnellere
Bewegung der Moleküle bei gleichzeitiger Konzentrationserhöhung des Xanthans.
Abbauzeit Konzentration
0 h 16 mg/mL
0255075100125150175200 (ppm)
3 h 20 mg/mL
10 h 51 mg/mL
15 h 125 mg/mL
Abbildung 5.20: Einfluss der Abbauzeit bzw. der Konzentration auf die spektrale Auflösung und das Signal-Rausch-Verhältnis einer 13C-NMR-Untersuchung von Xanthan bei 60°C
Als Folge wird eine Steigerung des Signal-Rausch-Verhältnisses beobachtet.
82
5 Ergebnisse
Derselbe Effekt wurde beim Hyaluronat beobachtet, wobei eine ungleich stärkere Zunahme
des Signal-Rausch-Verhältnisses erzielt wurde. Ein Vergleich des unabgebauten Hyaluronats
mit dem über 3 h abgebauten ist in Abbildung 5.21 dargestellt.
a)
0255075100125150175200
b)
(ppm)
Abbildung 5.21: Einfluss der Abbauzeit bzw. der Konzentration auf die spektrale Auflösung einer 13C-NMR-Untersuchung von Hyaluronat bei 60°C; 0 h abgebaut und 16 mg/mL (a); 3 h abgebaut und 75 mg/mL (b)
Die beiden Spektren wurden ebenfalls bei 60°C aufgenommen. Die Konzentration des
Hyaluronats im oberen Spektrum betrug 16 mg/mL, welches der maximal zu lösenden Menge
des nicht abgebauten Hyaluronats entsprach. Das Spektrum für eine Konzentration von
75 mg/mL des abgebauten Hyaluronats weist ganz offensichtlich sowohl eine verbesserte
spektrale Auflösung als auch ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis auf.
5.5.1 1H-NMR-spektroskopische Untersuchung der Wechselwirkung von bakteriellen
EPS mit zweiwertigen Kationen
Neben den in diesem Kapitel bereits beschriebenen konduktometrischen, rheologischen und
chiroptischen Methoden wurden im Rahmen dieser Arbeit zur weiteren Charakterisierung der
Wechselwirkungen von bivalenten Kationen mit geladenen EPS die 1H-Kernresonanzen der
EPS in Anwesenheit von Mangan(II) und Kupfer(II) untersucht. Hierzu wurden Messungen
83
5 Ergebnisse
ohne Salzzusatz mit denen in Gegenwart von paramagnetischen Ionen verglichen. Diese
Ergebnisse sind in den folgenden Abschnitten aufgeführt.
5.5.1.1 Dextran Auf der Grundlage, dass ein Erkenntnisgewinn für eine Kernresonanzuntersuchung mit 1H-Kernen ausbleibt, wird an dieser Stelle auf die Präsentation der Spektren von Dextran in
Anwesenheit von bivalenten Kationen verzichtet. Abgesehen von einer Linienverbreiterung
aller Signale bei steigender Konzentration der paramagnetischen Kationen (≤ 1,2 mmol/L),
wurden keinerlei Einflüsse beobachtet. Insbesondere blieben spezifische Wechselwirkungen
aus. Aus diesem Grund wird in diesem Abschnitt ausschließlich eine Signalzuordnung für das 1H-NMR-Spektrum einer elektrolytfreien Dextranlösung (s. Abb. 5.22) vorgenommen.
0 .51 .01 .52 .02 .53 .03 .54 .04 .55 .05 .5
3 .9 04 .0 04 .1 04 .2 04 .3 04 .4 04 .5 0
H-5 H-6 H-4
H-3 H-2
H-1
(ppm)
Abbildung 5.22: Exemplarische Abbildung eines 1H-NMR-Spektrums einer Dextran-Lösung der Konzentration 75 mg/mL, gemessen bei 60°C
Die Messung wurde entsprechend den Anweisungen des Abschnitts 2.5.5 durchgeführt. Die
Dextran-Lösung mit einer Konzentration von 75 mg/mL wurde in D2O aufgenommen und bei
einer Temperatur von 60°C untersucht.
84
5 Ergebnisse
5.5.1.2 Hyaluronat In Abbildung 5.23 sind die 1H-NMR-Spektren von über 3 h abgebauten Hyaluronat mit einer
Konzentration von 75 mg/mL sowohl ohne Salzzusatz als auch in Gegenwart von 1,2 mmol/L
Mn2+- bzw. Cu2+-Ionen gezeigt. Die Linienbreite der Signale nimmt vom oberen Spektrum
zum untersten zu. Bei dem Spektrum mit der höchsten Auflösung handelt es sich um die
Messung einer Hyaluronat-Lösung ohne Salzzusatz (a). Das mittlere Spektrum (b) resultiert
aus der Messung einer Hyaluronat-Lösung in Gegenwart von Manganchlorid und wurde, wie
die anderen auch, bei 60°C aufgenommen.
0 . 51 . 01 . 52 . 02 . 53 . 03 . 54 . 04 . 55 . 05 . 5
a)
[CH3C(O)N]
[H-2]
[H-3, H-5] H-4, H-5
[H-6], H-6H-3
H-2
[H-4]H-1
[H-1]
0 . 50 . 51 . 01 . 01 . 51 . 52 . 02 . 02 . 52 . 53 . 03 . 03 . 53 . 54 . 04 . 04 . 54 . 55 . 05 . 05 . 55 . 5
b)
0 . 50 . 51 . 01 . 01 . 51 . 52 . 02 . 02 . 52 . 53 . 03 . 03 . 53 . 54 . 04 . 04 . 54 . 55 . 05 . 05 . 55 . 56 . 06 . 0
c)
Abbildung 5.23: Gegenüberstellung dreier 1H-NMR-Spektren von Hyaluronat in Gegenwart von 1,2 mmol/L Mn2+-Inonen (b), 1,2 mmol/L Cu2+-Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a). Die Signale, die zum N-Acetyl-D-glucosamid gehören, sind durch eckige Klammern gekennzeichnet ([...])
(ppm)
85
5 Ergebnisse
86
Bei dem letztgenannten Spektrum wird eine Überlappung der H-1 Signale beobachtet. Die
Resonanzen für H-3 bis H-5 überlappen ebenfalls in den Bereichen von 3,86 bis 4,08 ppm
und 4,10 bis 4,30 ppm, so dass eine Zuordnung der Signale schwierig wird. Es wird eine
Zunahme der relativen Linienbreite gegenüber dem Spektrum a für das H-2 Signal des
N-Acetyl-D-glucosamids von 20 Hz und für das H-2 Signal des D-Glucuronans von 12 Hz
ermittelt. Die Linienbreite des Acetamido-Signals nimmt um 60 Hz zu. In Anwesenheit von
Kupferchlorid wurde das unterste der in Abbildung 5.23 dargestellten Spektren (c)
aufgezeichnet. Hierbei ist die Linienbreite so weit vorangeschritten, dass abgesehen von der
Acetamido-Gruppe bei 2,3 ppm mit einer Linienbreite von 353 Hz, keine Zuordnung der
Resonanzen möglich ist. Im Vergleich mit dem Spektrum a (Abb. 5.23) nimmt die relative
Linienbreite der Acetamido-Resonanz um 350 Hz zu.
5.5.1.3 Xanthan Die Messungen wurden konform der in Abschnitt 4.6 beschriebenen Methode durchgeführt.
Dabei wurde eine Xanthan-Lösung der Konzentration 125 mg/mL in D2O angesetzt und bei
60°C in An- bzw. Abwesenheit von mehrwertigen Metallionen NMR-spektroskopisch
untersucht. In Abbildung 5.24 werden drei 1H-NMR-Spektren von Xanthan in Gegenwart von
Mn2+-Inonen (b), Cu2+-Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a) einander gegenübergestellt. Ähnlich
wie beim Hyaluronat wird eine Linienverbreiterung bei Zugabe der paramagnetischen Ionen
in einer Konzentration von 1,2 mmol/L beobachtet. Diese ist aber im Gegensatz zu den
Untersuchungen des Hyaluronats regiospezifisch. Damit ist gemeint, dass sich der Einfluss
der Linienbreite nicht über das gesamte Spektrum erstreckt, sondern auf zwei Signale
beschränkt ist. Hierbei handelt es sich zum einen um die Resonanz für das CH3-Signal der
Pyruvatgruppe bei 1,87 ppm und zum anderen um die Resonanz bei 4,13 ppm. Dabei besitzt
das Kupfer(II) offensichtlich den größeren Einfluss von den Beiden paramagnetischen
Kationen wie in Abbildung 5.24 durch den Vergleich der relativen Linienbreiten ersichtlich.
Hierbei wird eine Zunahme der relativen Linienbreiten für das Xanthanspektrum in
Gegenwart von Mangan gegenüber dem Spektrum a für das CH3-Signal der Pyruvatgruppe
um 44 Hz und für die Resonanz bei 4,13 ppm um 11 Hz beobachtet.
5 Ergebnisse
0 . 50 . 51 . 01 . 01 . 51 . 52 . 02 . 02 . 52 . 53 . 03 . 03 . 53 . 54 . 04 . 04 . 54 . 55 . 05 . 05 . 55 . 56 . 06 . 06 . 56 . 5
a)
CH3 Acetat CH3 Pyruvat
(ppm)
87
0 . 50 . 51 . 01 . 01 . 51 . 52 . 02 . 02 . 52 . 53 . 03 . 03 . 53 . 54 . 04 . 04 . 54 . 55 . 05 . 05 . 55 . 56 . 06 . 06 . 56 . 5
b)
(ppm)
0 . 50 . 51 . 01 . 01 . 51 . 52 . 02 . 02 . 52 . 53 . 03 . 03 . 53 . 54 . 04 . 04 . 54 . 55 . 05 . 05 . 55 . 56 . 06 . 06 . 56 . 5
c)
(ppm)
Abbildung 5.24: Gegenüberstellung dreier 1H-NMR-Spektren von Xanthan aufgezeichnet in Gegenwart von 1,2 mmol/L Mn2+-Inonen (b), 1,2 mmol/L Cu2+-Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a).
Beim Vergleich der Spektren a und c wird eine signifikante Linienverbreiterung des CH3-
Signals der Pyruvatgruppe um 159 Hz beobachtet. Die Zunahme der relativen Linienbreite
der Resonanz bei 4,13 ppm ist unsicher, da eine eindeutig Zuordnung durch den Einfluss des
paramagnetischen Kattions nicht möglich ist.
5 Ergebnisse
5.5.2 13C-NMR-spektroskopische Untersuchung der Wechselwirkung von bakteriellen
EPS mit zweiwertigen Kationen
Im Rahmen der kernspezifischen Resonanzuntersuchungen wurde neben dem bereits
beschriebenen Einfluss von bivalenten Kationen auf die 1H-Kerne (s.o.) auch der Einfluss auf
die 13C-Isotope der EPS untersucht. Die besondere Bedeutung der 13C-NMR-Spektroskopie
liegt in der Möglichkeit, zusätzlich Informationen zum Kohlenstoff-Gerüst neben der
Wasserstoff-Peripherie des Moleküls zu erhalten. Der Bereich der chemischen Verschiebung
ist hierbei mit 200 ppm deutlich breiter als für die Protonen-Resonanzen.
Analog zur 1H-NMR-Spektroskopie handelt es sich bei den verwendeten paramagnetischen
Kationen um Mangan(II) und Kupfer(II).
5.5.2.1 Dextran Es wird an dieser Stelle wie in Abschnitt 5.5.1.1 auch auf die Präsentation der Dextran-
Spektren in Anwesenheit von bivalenten Kationen verzichtet, da keine signifikanten
Aussagen getroffen werden können. Abgesehen von einer Linienverbreiterung aller Signale
bei steigender Konzentration der paramagnetischen Kationen wurden keinerlei Einflüsse
beobachtet. Insbesondere blieben spezifische Wechselwirkungen aus. Aus diesem Grund wird
in diesem Abschnitt ausschließlich eine Signalzuordnung für das 13C-NMR-Spektrum einer
elektrolytfreien Dextran-Lösung (s. Abb. 5.25) durchgeführt.
01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 0 01 1 01 2 0
6 66 76 86 97 07 17 27 37 47 57 67 7
C-4 C-6
C-5 C-2 C-3
C-1
(ppm)
Abbildung 5.25: Exemplarische Abbildung eines 13C-NMR-Spektrums einer Dextranlösung (75 mg/mL), gemessen bei 60°C
88
5 Ergebnisse
Die Messung wurde wie im Abschnitt 2.5.5 beschrieben durchgeführt. Das Dextran
(75 mg/mL) wurde in D2O gelöst und das 13C-NMR-Spektrum bei einer Temperatur von
60°C aufgenommen.
5.5.2.2 Hyaluronat Zur Untersuchung des Hyaluronats wurde dieses nach Abschnitt 4.1 gereinigt und über 3 h
abgebaut. Das Lyophilisat wurde in D2O resuspendiert (75 mg/mL) und die Spektren bei 60°C
aufgenommen. Die 13C-NMR-Spektren für die Messungen von Hyaluronat in Anwesenheit
von Kupfer(II) und Mangan(II) mit den Konzentrationen von 0,3 mmol/L und 1,2 mmol/L
zeigen grundsätzlich die gleichen Eigenschaften, so dass auf eine Darstellung der Kupfer-
Spektren in diesem Kapitel verzichtet wurde und auf den Anhang (s. Abb. A.23) verwiesen
werden muss. In Abbildung 5.26 ist die Auswirkung einer Manganzugabe auf das gesamte
Spektrum exemplarisch für die untersuchten paramagnetischen Kationen gezeigt.
102030405060708090100110120130140150160170180190200
a)
C2, C3, C5,[C5],[C4] C4 [C7]
C1 [C3] [C8] [C1] C6 [C2]
[C6]
b)
c)
(ppm) Abbildung 5.26: Exemplarische Gegenüberstellung dreier 13C-NMR-Spektren von Hyaluronat in Gegenwart von 0,3 mmol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a). Die Signale die zum N-Acetyl-D-glucosamid gehören sind durch eckige Klammern gekennzeichnet ([...])
89
5 Ergebnisse
Im Gegensatz zu den Ergebnissen der 1H-NMR-Spektroskopie (s. Abschnitt 5.5.1.2) wird bei
steigender Kationenkonzentration eine regiospezifische Wechselwirkung deutlich. Der
Einfluss beschränkt sich auf die Signale bei 25,5 ppm, 79,5 ppm, 176,8 ppm und 178,5 ppm.
Zur besseren Übersicht wurden hier die betroffenen Bereiche in den Abbildungen 5.27 und
5.28 vergrößert dargestellt.
a) C5
70717273747576777879
[C5] C3 C2 [C4]
b)
c)
Abbildung 5.27: Vergrößerung des Bereichs zwischen 70 und 80 ppm für 13C-NMR-Spektren von Hyaluronat in Gegenwart von 0,3 mmol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a). Die Signale, die zum N-Acetyl-D-glucosamid gehören sind durch eckige Klammern gekennzeichnet ([...])
(ppm)
212223242526272829176177178179180181182183184
c)
b)
a) [C7]
C6
[C8]
(ppm)
Abbildung 5.28: Vergrößerung des Bereichs zwischen 175 und 185 ppm (linke Abb.) bzw. von 20 bis 30 ppm (rechts) für 13C-NMR-Spektren von Hyaluronat in Gegenwart von 0,3 mmol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a). Die Signale, die zum N-Acetyl-D-glucosamid gehören sind durch eckige Klammern gekennzeichnet ([...]) 90
5 Ergebnisse
91
Wie in Abbildung 5.28 zu sehen, nimmt die relative Linienbreite für das Signal des
Carboxylat-Kohlenstoffs sowie für das C-6-Signal der Hydroxymethyl-Gruppe des
Acetylglucosamids stark zu. Hierbei ist aufgrund der außerordentlichen Zunahme der
Linienbreite die letztgenannte Resonanz genau wie das C-5-Signal der Glucuronsäure
(79,5 ppm) schon bei einer Konzentration von 0,3 mmol/L Mangan(II) nicht mehr
nachweisbar. Bei einer Konzentration von 1,2 mmol/L fällt auf, dass eine Zunahme der
Linienbreite für das gesamte Spektrum resultiert. Hervorzuheben wäre allerdings das Methyl-
Signal der Acetamido-Gruppe bei 25,5 ppm, bei dem man eine signifikante Zunahme der
Linienbreite von 45 Hz auf 160 Hz beobachtet (s. Abb. 5.28). Darüber hinaus erfahren das
C-4-Signal des Acetylglucosamids, sowie die C-3-Resonanz der Glucuronsäure eine
Verschiebung zu höheren Frequenzen hin. Dabei beträgt die Differenz der chemischen
Verschiebung für das C-4-Signal 0,65 ppm und für die C-3-Resonanz 0,82 ppm.
Als Grundlage für die Auswertung wurden die von Siciňska et al. veröffentlichten Ergebnisse
genutzt [98]. Die Zuordnung der Resonanzen für das C-3- bzw. C-5-Signal wurde durch die
Ergebnisse der inversen 1H-13C-Korelation (HSQC), welche weiter unten im Abschnitt 5.5.2.4
gezeigt werden, möglich.
5.5.2.3 Xanthan
Die Messungen wurden, wie im Methodenteil (s. Absch. 4.6) beschrieben durchgeführt. Zu
diesem Zweck lagen Lösungen (125 mg/mL) des über 15 h abgebauten Xanthans
(s. Absch. 4.1) mit unterschiedlicher Salzkonzentration vor, welche 13C-NMR-
spektroskopisch untersucht wurden. Die 13C-NMR-Spektren für die Messungen von Xanthan
in Anwesenheit von Kupfer(II) und Mangan(II) mit den Konzentrationen von 0,3 mmol/L und
1,2 mmol/L weisen wie beim Hyaluronat keinerlei Unterschiede auf, so dass ebenfalls auf
eine Darstellung der Kupfer-Spektren verzichtet wurde.
In Abbildung 5.29 ist die Auswirkung einer Manganzugabe auf das gesamte Spektrum
gezeigt. Wie schon die im Abschnitt 5.5.1.3 erhaltenen Ergebnisse der 1H-NMR-
Spektroskopie zeigen, wird bei steigender Kationenkonzentration eine regiospezifische
Wechselwirkung deutlich. Es wird hier ebenso eine Beschränkung der Wechselwirkungen auf
wenige Signale beobachtet. Dabei handelt es sich um die Signale bei 27,8 ppm, 105,1 ppm
und 178,2 ppm.
5 Ergebnisse
255075100125150175200
a) Glc, Glc´C-2
Man, Man´, Pyr C-4
Pyr CH C-2, C-3, C-4, C-5
Ac CH Ac, Carb C=O
92
Abbildung 5.29: Exemplarische Gegenüberstellung dreier 13C-NMR-Spektren von Xanthan in Gegenwart von 0,3 mmol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a)
9698100102104106108110112114116 Abbildung 5.30: Vergrößerung des Bereichs zwischen 96 und 116 ppm für 13C-NMR-Spektren von Xanthan in Gegenwart von 0,3 mmol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a)
GlcA, Glc, Glc´ C-1
Pyr C-2 Man C-1 Man´C-1 Man, Man´C-6
Pyr C=O
b)
c)
(ppm)
a) Pyr C-2 Man C-1, Man´C-1
GlcA, Glc, Glc´ C-1
b)
c)
(ppm)
5 Ergebnisse
Zur besseren Übersicht wurden hier die betroffenen Bereiche in den Abbildungen 5.30 und
5.31 vergrößert dargestellt.
16182022242628303234 (ppm)
Ac CH Pyr CH
168170172174176178180182184186188
c)
b)
a) Ac, Carb C=O
Pyr C=O
Abbildung 5.31: Vergrößerung des Bereichs zwischen 168 und 188 ppm (linke Abb.) bzw. von 15 bis 35 ppm (rechts) für 13C-NMR-Spektren von Xanthan in Gegenwart von 0,3 mmol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a)
Wie in Abbildung 5.31 zu sehen wird eine extreme Linienverbreiterung für das Signal des
Carboxylat-Kohlenstoffs sowie für das CH3-Signal der Pyruvat-Gruppe detektiert. Hierbei ist
der Nachweis der erstgenannten Resonanz schon bei einer Konzentration von 0,3 mmol/L
Mangan(II) nicht mehr möglich und die Linienbreite für das CH3-Signal der Pyruvat-Gruppe
nimmt von 60 Hz auf 297 Hz zu. Darüber hinaus wird bei einer Konzentration von
1,2 mmol/L eine Zunahme der Linienbreite für das C-2- Signal der Pyruvat-Gruppe sowie
dem gesamten C-1-Signal (105,1 ppm) aller Zuckerringe beobachtet. Dies führt wie in
Abbildung 5.30 dargestellt zu einer Abnahme der Signalauflösung, so dass die Resonanzen
nur wenig differenziert detektiert werden konnten. Die 13C-NMR-Spektren für Xanthan in
Gegenwart von Kupfer(II)ionen sind wie für das Hyaluronat im Anhang abgebildet
(s. Abb. A.24).
93
5 Ergebnisse
5.5.3 HSQC-spektroskopische Untersuchung von Hyaluronat Zur weiteren Charakterisierung des Hyaluronats wurden 2D-NMR-Untersuchungen
durchgeführt. Hierbei wurde der Polyelektrolyt nach Abschnitt 4.1 gereinigt und über 3 h
abgebaut. Das Lyophilisat wurde mit einer Konzentration von 75 mg/mL in D2O
resuspendiert und die Spektren mit einem DRX-300-NMR-Spektrometer der Firma Bruker
aufgenommen.
Bei der Auswertung der 13C-NMR-Spektren des Hyaluronats ergaben sich im Bereich von
80 ppm bis 90 ppm Diskrepanzen bezüglich der Ergebnisse von Siciňska et al., welche als
Grundlage für die Auswertung der 1D-13C-NMR-Spektren genutzt wurden. Insbesondere die
Zuordnung des C-3 Signals erwies sich als schwierig. Die von Siciňska et al. durchgeführten
Untersuchungen erfolgten bei einer Temperatur von <37°C. Um einen eventuellen
Temperatureffekt bei den erhaltenen Messergebnissen als Ursache für die Differenzen zu
berücksichtigen, wurden inverse 1H-13C-Korelationsmessungen bei einer Temperatur von
60°C durchgeführt. Ein exemplarisches 2D-Spektrum für diese Messung ist in
Abbildung 5.32 dargestellt.
ppm
2.53.03.54.04.55.05.5 ppm
30
40
50
60
70
80
90
100
C-4, C-5
C-3
Abbildung 5.32: Exemplarisches 2D-Spektrum einer inversen 1H-13C-Korelation (HSQC) von Hyalronat (75 mg/mL) bei 60°C. Aufgetragen sind ein 1H-NMR-Spektrum (X-Achse) und das 13C-NMR-Spektrum eines DEPT-Experiments (Y-Achse) 94
5 Ergebnisse
95
Auf der X-Achse ist das 1H-NMR-Spektrum aufgetragen und auf der Y-Achse befindet sich
das 13C-NMR-Spektrum eines DEPT-Experiments. Aus diesem Grund fehlen das
Carboxylat- sowie das Carbonyl-Signal beim 13C-NMR-Spektrum (ca. 175 ppm). Die
Zuordnung des CH3-Signals für die Acetamido-Gruppe ist unzweifelhaft. Diese ist beim 13C-NMR-Spektrum bei 25,5 ppm und beim 1H-NMR-Spektrum bei 2,3 ppm zu finden. Eine
temperaturbedingte Verschiebung des Signals ausgelöst durch die Temperaturdifferenz im 1H-NMR-Spektrum sowie im 13C-NMR-Spektrum wurde nicht beobachtet.
Anders sieht dies für das angesprochene C-3-Signal der Glucuronsäure aus. Dieses verschiebt
sich beim 13C-NMR-Spektrum unter dem Einfluss der höheren Temperatur um nahezu 3 ppm
zu höheren Werten hin, so dass es die Position mit dem C-5-Signal tauscht. Dies entspricht
den beobachteten Wechselwirkungseffekten aus Abschnitt 5.5.2.2, wobei das C-5-Signal
durch den paramagnetischen Einfluss eine so extreme Linienverbreiterung erfährt, dass eine
Detektion nicht mehr möglich ist.
Eine Auflistung der 13C-Resonanzen, die durch die HSQC-Methode bei 60°C für die
Monomere des Hyaluronats ermittelt wurden, erfolgt in unten aufgeführter Tabelle 5.23.
Tabelle 5.23: Chemische Verschiebung der Signale für die Monomere des Hyaluronats (Glucuronsäure und Glucosamid) bei 13C-NMR-Spektren angegeben in der Einheit ppm. 13C-Resonanzen C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 CH3C(O)NH CH3C(O)NHGlucuronsäure 106,1 75,6 76,8 83,0 79,1 177,8 Glucosamid 103,5 57,4 85,9 71,7 78,5 63,8 176,4 25,5
6 Diskussion
96
6 Diskussion
Bei Untersuchungen von Wingender et al. wurde als ein wesentlicher Bestandteil des
Biofilms von Pseudomonas aeruginosa, das Alginat mit 95% der Trockenmasse ausgemacht
[103]. Das Alginat besitzt eine außerordentlich hohe Affinität zu mehrwertigen Metallionen,
insbesondere zum Calcium(II) mit dem es über die Carboxylatgruppen der Glucuronate
komplexiert [104]. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen rückte die Frage, in welcher Form die
Ladung bzw. der Verzweigungsgrad der EPS eine Rolle bei den Wechselwirkungen zwischen
Kation und Biopolymer spielt, immer weiter in den Focus. Darüber hinaus ist die Prägnanz
von Schwermetallen in aquatischen Systemen bekannt (s. Kap. 2.4), so dass das Interesse, den
Einfluss ökologisch relevanter Metallionen im Speziellen auf Biofilme zu untersuchen,
wuchs.
Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Wechselwirkungen von mehrwertigen Metallionen mit
extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) und die resultierende Struktur der sich bildenden
Komplexe näher untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden drei Modellpolysaccharide
exemplarisch für die von Bakterien exprämierten EPS in Anwesenheit und in Abwesenheit
von mehrwertigen Kationen untersucht und die Ergebnisse miteinander verglichen. Bei den
Polysacchariden handelt es sich um das verzweigte, ungeladene Dextran, das unverzweigte,
geladene Hyaluronat und das verzweigte und geladene Xanthan.
6.1 Verhalten von Polysacchariden in Abwesenheit von mehrwertigen Kationen Wie bereits erwähnt wurde mit Hilfe diverser physikalischer Methoden die EPS weitergehend
charakterisiert. Um mit diesen reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, mussten die
Polysaccharide allerdings entsprechend präpariert werden. Eines der größten Hindernisse für
die Untersuchungen war die hohe Viskosität der Polymerlösungen, welche sich beim Lösen
der unbehandelten Biopolymere einstellte. Des Weiteren musste eine gleichbleibende Qualität
der zu untersuchenden Proben sichergestellt werden. Zu diesem Zweck wurde die
Aufarbeitung der kommerziellen EPS wie im Abschnitt 4.1 beschrieben erarbeitet.
Zur Ermittlung einer geeigneten Prozedur für den Molmassenabbau wurden die Proben
systematisch auf die Verträglichkeit unterschiedlicher Degradationsmethoden untersucht. Um
einen Vergleich der Substanzen und damit eine Reproduzierbarkeit der Ergebnisse
6 Diskussion
97
sicherzustellen, ist es wesentlich, dass die Reinigungsprozedur keinerlei unerwünschte
Effekte auf die Seitenketten bzw. die funktionellen Gruppen der Polysaccharide ausübt. Aus
diesem Grund schied die „milde saure Hydrolyse“, wie sie von Mayer et al. zum Abbau von
Alginaten verwendet wurde, für die hier untersuchten Polysaccharide aus [104]. Bei
Anwendung dieser Methode wurde beobachtet, dass neben den glycosidischen Bindungen
ebenso die Acetamido-Gruppen des Hyaluronats gespalten wurden. Dies führt zu einer
Verfälschung der Untersuchungsergebnisse, da diese funktionelle Gruppe die physikalischen
Eigenschaften des Hyaluronats signifikant beeinflusst. Eine weitere Möglichkeit der
selektiven Spaltung von glycosidischen Bindungen ist die verbreitete Methode der
enzymatischen Degradation. Hierbei greifen die eingesetzten Enzyme im Idealfall wie eine
Schere zwischen die Zuckerringe und trennen diese voneinander. Für die Spaltung des
Hyaluronats zeigt diese Methode gute Ergebnisse. Sie scheitert allerdings beim Xanthan an
einer nicht ausreichenden Selektivität, so dass zusätzlich eine Spaltung der Zuckerbindungen
an den Seitenketten beobachtet wird. Aus diesem Grund wurde diese Art des Abbaus
ebenfalls verworfen. Für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten EPS erscheint die
Methode des Ultraschallabbaus bei Anpassung der Amplitude, der Temperatur und der
Zeitdauer am geeignetsten. Wie die mit SEC-Malls erhaltenen Ergebnisse in Tabelle 5.1
bestätigen, wurde durch Anwendung des Ultraschalls ein Abbau der Polyelektrolyte erzielt.
Des Weiteren wurde die gewünschte Abnahme der Lösungs-Viskosität durch die
Molmassenreduktion herbeigeführt (s. Tab. 5.2).
Wie im Abschnitt 5.1.1 beschrieben, wurde ein nicht linearer Zusammenhang zwischen der
Abbauzeit und der resultierenden Molmasse beobachtet. Dieser Sachverhalt, der in Abbildung
5.3 zum Ausdruck gebracht wird, resultiert aus dem Zusammenspiel der Intensität
(Amplitude) und der Frequenz des Ultraschalls. Diese konstantgehaltenen Parameter führen
wahrscheinlich zu einer mit diesem Wertepaar verbundenen Molmasse, an welche sich der
Verlauf der Zeitfunktion asymptotisch annähert.
Neben dem Molmassenabbau ist die Reinigung und damit die Entfernung von Fremdstoffen,
die bei der Fermentation oder beim Abbau in die Proben eingebracht wurden, essentiell. Die
Abtrennung geschieht durch Filtration der Suspensionen und anschließender Zentrifugation.
Die Beseitigung von Fremdsalzen und Fragmenten, die leichter sind als 12.000 bis 14.000
g/mol geschieht durch Dialyse.
6 Diskussion
98
6.1.1 Dextran Grundsätzlich ist für das Dextran anzumerken, dass diesen eine Sonderstellung im Rahmen
dieser Promotionsarbeit zukommt. Als Vertreter der ungeladenen Polysaccharide dient es als
Vergleichssubstanz bezüglich der geladenen Polysaccharide. Es bietet durch seine verzweigte
Struktur darüber hinaus die Möglichkeit, den Einfluss der Seitenketten auf die physikalischen
Eigenschaften zu untersuchen.
Die Molmasse des kommerziellen Dextrans wurde mittels SEC-Malls bestimmt
(s. Absch. 5.1). Es ist mit einer Molmasse von 2,0 ⋅ 105 g/mol das Kleinste der untersuchten
Polysaccharide und besitzt, trotz seines hohen Verzweigungsgrades in wässrigen Lösungen,
eine niedrige Viskosität (s. Absch. 5.1.2). Dies liegt wahrscheinlich an der neutralen Ladung
des Polysaccharids, welche zu geringen intermolekularen Wechselwirkungen führt. Eine
Vernetzung ist ebenfalls auszuschließen, da sich die ermittelte Viskosität nur unwesentlich
von der des Wassers abhebt. Die über das Polymer verteilten Hydroxylgruppen führen
darüber hinaus zu einer guten Löslichkeit in der wässrigen Phase, wobei allerdings die
Bildung von kompakten Knäueln vermutet wird. Dafür sprechen die Ergebnisse der
Rotationsviskosimetrie (Absch. 5.3.2.1), sowie der berechnete Exponent α der Mark-
Houwink-Gleichung. Dieser beträgt α= 0,11 und wurde mit Hilfe der spezifischen Viskosität
des Dextrans in wässriger Lösung ermittelt. Die Geometrie liegt damit zwischen der einer
Kugel (α= 0,0) und der einer Gauß-Kette (α= 0,50) [76]. Des Weiteren zeigt sich, dass die
Viskosität unabhängig von der Schergeschwindigkeit konstant bleibt (s. Absch. 5.3.2). Dies
entspricht der klassischen Vorstellung einer newtonschen Flüssigkeit.
Bei höheren Konzentrationen (s. Kap. 5) ist allerdings eine Quellung des Dextrans als Folge
des Kontakts zwischen den hydrodynamischen Äquivalenzsphären und damit eine starke
Zunahme der Viskosität bekannt [105]. Aufgrund der niedrigen Viskosität der Dextranlösung
ist es offensichtlich, dass die kritische Konzentration des Dextrans im Rahmen der
durchgeführten Messungen nicht erreicht wurde und somit eine Polymer-Polymer-Verhakung
(engl. Entanglements) ausblieb.
6 Diskussion
99
6.1.2 Hyaluronat Beim bifunktionellen Copolymer Hyaluronat handelt es sich um das Natriumsalz der
Hyaluronsäure, welches sich aus alternierenden β-1,3 und β-1,4 verknüpften
Monomereinheiten zusammensetzt. Das Glucuronat sowie das Glucosamin aus denen das
Hyaluronat besteht, beeinflussen die physikalischen Eigenschaften des Polyelektrolyten
wegen ihrer funktionellen Gruppen stark. Aus diesem Grund ist das Wissen um ihr
quantitatives Erscheinungsbild in einem solchen Molekül essentiell. Die Molmasse des
kommerziellen Hyaluronats wurde mittels SEC-Malls bestimmt (s. Absch. 5.1) und beträgt
1,7 ⋅ 106 g/mol. Damit ist diese ca. 10 mal größer als die des Dextrans, welches im Rahmen
dieser Arbeit untersucht wurde.
Für den Metabolismus der meisten Organismen ist die Präsenz von externen Wasser
unabdingbar. Ohne dieses wird der Stoffwechsel entscheidend gestört und führt über kurz
oder lang zu einer Austrocknung der Lebensform. Wie in der Literatur beschrieben, besitzt die
Hyaluronsäure eine außerordentlich starke Wasserbindefähigkeit [62]. Dies ist für einen
Biofilm von großer Bedeutung und wurde bei den hier durchgeführten Studien ebenfalls für
das Natriumsalz beobachtet. Die äußerst kompakte sowie stabile Form im festen Zustand wird
durch die starken intramolekularen bzw. intermolekularen Wechselwirkungen bedingt.
Hierbei spielen Wasserstoffbrücken eine wesentliche Rolle. Wie Mitra et al. durch
Röntgenbeugungs-experimente herausfanden, kann das Hyaluronat als Einfach-, Doppel- und
Dreifachhelix vorliegen. Hierbei ist das Natriumion oktaedrisch koordiniert und führt zu einer
zusätzlichen intra- bzw. intermolekularen Verknüpfung der Hyaluronatfasern [106].
In wässriger Lösung führen Solvatisierungsvorgänge zu einer Aufweitung der
Molekülstruktur, so dass sich die Reibungseigenschaften der Lösung verändern und damit
auch deren Viskosität. Wird das hydrodynamische Volumen der Polymerteilchen betrachtet,
so gibt es eine Beziehung zwischen diesem und der Molmasse, welche durch den Staudinger-
Index ausgedrückt wird. Hierbei handelt es sich um das Verhältnis von hydrodynamischem
Volumen zur Molmasse. Eine charakteristische Eigenschaft von statistischen Knäueln ist,
dass ihre Dichte mit steigender Molmasse abnimmt. Dies wurde analog bei den
durchgeführten Viskositätsmessungen beobachtet. Mit Hilfe des Staudinger-Indexes und dem
daraus abgeleiteten Exponenten α (s. Mark-Houwink-Gl. Absch. 4.4), wurde eine
strukturbezogene Interpretation der gelösten Teilchen möglich (s. Absch. 5.1.2). Das
unabgebaute Molekül liegt demnach in aufgeweiteter Form als vollständig durchspültes
Knäuel vor. Dies entspricht im Idealfall einem Exponenten von α = 1,0. Wird das abgebaute
6 Diskussion
100
Hyaluronatmolekül in wässriger Lösung betrachtet, so fällt eine Abnahme der Viskosität,
bedingt durch eine Oberflächenreduktion der Knäuelstruktur, auf. Die Molmassenreduktion
führt wie schon beschrieben zu einer Dichtezunahme des Knäuels, welche mit den
Ergebnissen aus Abschnitt 5.1.2 belegt werden kann. Der Exponent nimmt für das über eine
Dauer von 3 h mit Ultraschall abgebaute Hyaluronat um 37,5% ab, so dass ein Hinweis auf
ein nur teilweise durchspültes Knäuel mit eindeutig höherer Dichte vorliegt. Allerdings nimmt
die Dichte weniger stark zu als bei einem neutralen Polymer wie dem Dextran (s. α -Werte,
Absch. 5.1.2). Dies liegt wahrscheinlich an den negativen Ladungen der Carboxylatgruppen,
welche sich gegenseitig abstoßen. Dieser Effekt führt zu einer zusätzlichen Aufweitung und
bleibt beim ungeladenen Dextran aus. Des Weiteren bedarf die Verdrängung der gebundenen
Wassermoleküle einer größeren Energie als beim Dextran, da diese stärker an das Glucuronat
gebunden sind. Die intensive Wasserstoffbrückenbindung wird durch die Ladung der
Carboxylatgruppe bedingt und führt beim Polyelektrolyten zu einer ausgedehnteren
Hydratschicht als beim Dextran. Diese mehrlagige Schicht verhindert zusätzlich eine weitere
Komprimierung des Hyaluronatknäuels. Einen weiteren Beweis für die Struktur eines
Polyelektrolyten wie dem Hyaluronat sowie für die resultierenden Wechselwirkungen
erbringt die Viskosität einer wässrigen Lösung in Abhängigkeit von der
Schergeschwindigkeit. Während beim Dextran keinerlei Einfluss der Schergeschwindigkeit
auf die Viskosität beobachtet wird, zeigen die Ergebnisse in Kapitel 5.3.2.2 für das
Hyaluronat eine Abnahme der Viskosität mit zunehmender Schergeschwindigkeit. Dies
geschieht aufgrund einer Ausrichtung der Polymerfasern entlang der Strömungsrichtung,
welche einem für Polymere typischen pseudoplastischen Verhalten entspricht (s. Absch.
2.5.3). Wie die berechneten Ergebnisse der Tabelle 5.2 im Ergebnisteil zeigen, müsste das
über 3 h abgebaute Hyaluronat nahezu als Gauß-Kette vorliegen. Damit würde dieses von der
idealisierten Kugelform abweichen, die als Grundlage zur Beschreibung der Viskosität einer
newtonschen Flüssigkeit dient. Wie experimentell bewiesen, verringert sich die Viskosität
durch eine Steigerung der Schergeschwindigkeit, so dass eine Abweichung vom newtonschen
Verhalten beobachtet wird. Dies spricht klar für die Richtigkeit der berechneten Struktur des
Polyelektrolyten in wässriger Lösung.
Des Weiteren zeigen theoretische Betrachtungen bezüglich der Konformation, dass das
Hyaluronat, ähnlich wie im festen Zustand, in wässriger Lösung eine helikale Struktur besitzt.
Die von Haxaire et al. durchgeführten Rechnungen zeigen, dass es einen weiten, energetisch
stabilen Bereich für Hyaluronat mit diversen helikalen Moden entlang der Hyaluronatfaser
gibt [107]. Hierbei reicht das Erscheinungsbild der Struktur über eine linkshändig vierfach
6 Diskussion
gefaltete bis hin zu einer rechtshändig fünffach gefalteten Symmetrie. Die Struktur ist dabei
sowohl vom pH-Wert der Lösung, als auch von der Art der Gegenionen abhängig.
Energieminimierte Strukturen des Hyaluronats sind einmal parallel und einmal orthogonal in
Abbildung 6.1 dargestellt.
Abbildung 6.1: Exemplarische Darstellung von Hyaluronat in wässriger Lösung nach Rechnungen von Haxaire et al. [107]
Entgegen der Annahme, die Struktur der Hyaluronsäure bestehe in wässriger Lösung im
wesentlichen aus einem statistischen Knäuel [108], wurde im Rahmen chiroptischer sowie in
NMR-Untersuchungen eine lokale Ordnung bestätigt [109, 110].
Wie die Ergebnisse im Kapitel 5.4.1 zeigen, konnte die Lage der CD-Bande für die
Glucosamineinheit des Hyaluronats konform den Literaturangaben bei 210 nm reproduziert
werden [111]. Buffington et al. beschreiben in ihrer Arbeit zur CD-Spektroskopie von
Hyaluronat in wässriger Lösung, dass die Ordnung wesentlich vom pH-Wert der Lösung
abhängig ist [112]. Bei einer Abnahme des pH-Wertes wird eine Intensitätsänderung der
Bande für den π–π*-Übergang des Acetylgucosamids bei 210 nm beschrieben.
Die durch 13C-NMR-Studien erhaltenen Ergebnisse von Hyaluronatfragmenten niedriger
Molmasse legen den Schluss nahe, dass Wasserstoffbrücken zwischen den Monomereinheiten
zu einer Stabilisierung entlang der Polymerfaser führen [113]. Allerdings, so wird weiter von
Scott et al. postuliert, werden die direkten intramolekularen Wasserstoffbrücken, wie sie z. B.
in Dimethylsulfoxid vorliegen, in wässrigen Lösungen durch Wassermoleküle und die von
ihnen ausgehenden Wasserstoffbrücken substituiert. Dies erklärt die starke Wasserbindungs-
fähigkeit des Hyaluronats bei dem sich intensive Wasserstoff-brücken mit den
Wassermolekülen bilden. Wird neben der großen Zahl an potentiellen Anbindungspunkten
eine zusätzliche Bildung von Wassereinschlüssen berücksichtigt, so erscheint die hohe
101
6 Diskussion
Wasserabsorption durchaus plausibel. In Abbildung 6.2 wird eine mögliche Konfiguration
einer Tetrasaccharideinheit in wässriger Lösung gezeigt.
O OO
O
C
O O
HOHO
OOH
HOH2C
NHC
O
CH3
O
HO
OHO
HO
C
OO
HOH2C
NH
CO CH3
HO
H HO
H
HO
HH
OH
Abbildung 6.2: Ausschnitt von Hyaluronat (Tetrasaccharideinheit) in wässriger Lösung
Die zwei sich wiederholenden Disaccharide sollen für ein besseres Verständnis einer zweifach
gefalteten Helix führen, wie sie auch in Abbildung 6.3 schematisch dargestellt ist.
Abbildung 6.3: Schematische Darstellung eines Hyaluronatauschnittes (Tetrasaccharid-einheit) in einem unpolaren Lösemittel (z. B. DMSO).
Bei der obigen Abbildung 6.3 ist die Wechselwirkung zwischen der Carboxylatgruppe und
der Acetamidogruppe schematisch dargestellt. Diese führen zu einer Faltung des Moleküls,
wobei in wässriger Lösung wahrscheinlich eine Aufweitung der Faltung durch eindringenden
Wassermoleküle die Folge ist. Die Wassermoleküle setzen sich zwischen die Carboxylat- und
die Acetamidogruppe, welche daraufhin über Wasserstoffbrückenbindungen miteinander
verknüpft werden.
102
6 Diskussion
103
Die NMR-Messungen wurden bei einer erhöhten Temperatur von 60°C durchgeführt um über
die damit verbundene Verringerung der Viskosität der wässrigen Lösungen eine Verbesserung
des Signal-Rauschverhältnisses zu erzielen. Diese Methode führte bereits bei Emmerichs et
al. zu guten Resultaten [114]. Die Temperaturerhöhung bewirkt eine bessere Beweglichkeit
der Moleküle, so dass eine Abnahme der Viskosität und damit eine Steigerung der spektralen
Auflösung resultiert. Wie sich allerdings durch den Vergleich mit den Ergebnissen von
Siciňska et al. sowie von Mary et al. herausstellte, wurde die Signalzuordnung bei einer
Temperatur über 37°C problematisch, da sich die Lage der 13C-Resonanzen im NMR-
Spektrum von den Literaturwerten unterscheidet [98, 99]. Die Annahme, dass der
Temperaturunterschied diesen Verschiebungseffekt auslöst, wurde durch die Ergebnisse von
Siciňska et al. erhärtet, da diese im Rahmen ihrer Arbeit einen Temperatureinfluss auf die
chemische Verschiebung detektierten. Die dort beschriebenen NMR-Messungen wurden
zwischen 4°C und 37°C durchgeführt. Um den Einfluss der Temperatur genauer zu
verifizieren und eine Signalzuordnung bei einer Temperatur von 60°C zu ermöglichen, wurde
eine inverse 1H-13C-Korrelationsmessung (HSQC) mit einem DRX-300-NMR-Spektrometer
der Firma Bruker durchgeführt (s. Absch. 5.5.2). Das aufgetragene Spektrum des DEPT-
Experimentes (Y-Achse) liefert dabei eine verbesserte Auflösung der Resonanzen gegenüber
einem NMR-Experiment mit einer ausschließlichen 13C-Anregung. Die Vermutung, dass es
sich bei der Signalverschiebung um einen Temperatureffekt handeln könnte, wurde bestätigt.
Die Änderung der chemischen Verschiebung bei höherer Temperatur wird auf eine erhöhte
Beweglichkeit der Makromoleküle zurückgeführt. Ein Indiz für diese These liefert die Arbeit
von Toffanin et al., welche ebenfalls eine Abweichung zu den NMR-Ergebnissen von
Siciňska et al. beschreibt [115]. Bei ihren NMR-Untersuchungen wurden aus nur wenigen
Saccharidbausteinen bestehende Hyaluronatfragmente eingesetzt, welche aufgrund ihrer
niedrigen Molmasse in wässriger Lösung zu einer geringen Viskosität führen. Damit
verbunden besitzen die kleineren hydrodynamischen Sphären eine höhere Beweglichkeit, so
dass eine Steigerung der spektralen Auflösung sowie eine Abweichung gegenüber den
Ergebnissen von Siciňska et al. bezüglich der C-3-Position beim 13C-NMR-Spektrum
resultiert (s. Kap. 5.5.4.2). Die Vorrausetzungen von Toffanin et al. sind vergleichbar mit
denen dieser Arbeit, da hier genauso durch die Steigerung der Temperatur eine Abnahme der
Viskosität und damit einhergehend eine Zunahme der Beweglichkeit der Moleküle bewirkt
wird. Aus diesem Grund ist es plausibel, dass sich die erhaltenen Positionen der 13C-
Resonanzen mit denen von Toffanin et al. nahezu decken.
6 Diskussion
104
6.1.3 Xanthan Das Heteropolymer Xanthan (Natriumsalz) besitzt ebenso wie das Hyaluronat bzw. das
Dextran auch ein aus Saccharideinheiten aufgebautes Rückgrad. Dies besteht wie beim
Dextran aus Glucose-Molekülen, welche über eine β-1,4 glycosidische Bindung miteinander
verknüpft sind. Abweichend vom Dextran, welches nur aus ungeladenen Glucose-
untereinheiten aufgebaut ist, wird an jedem zweiten Glucosering die Brenztraubensäure einer
Seitenkette ketalartig gebunden. Die Seitenketten bestehen dabei aus β-D-Mannose, aus β-
1,4-D-Glucuronsäure, aus α-1,2-D-Mannose und einer endständigen Pyruvatgruppe. Eben
diese Pyruvatgruppe beeinflusst die physikalischen Eigenschaften des Xanthans
charakteristisch. Es wurde z. B. ein Zusammenhang zwischen der Pyruvatkonzentration und
der Viskosität einer wässrigen Xanthan-Lösung ermittelt. Wie von Candia et al. beschrieben
nimmt die Viskosität mit steigender Konzentration der Pyruvatgruppen zu [116]. Das
Gegenion Natrium(I) führt wahrscheinlich zu einer Kompensation der sich abstoßenden
negativen Pyruvatladung und darüber hinaus zur Bildung von „schwachen“ intermolekularen
Wechselwirkungen. Diese könnten ähnlich wie beim Calcium(II)alginat zu einer Entstehung
von Verknüpfungspunkten beitragen, welche durch die Pyruvatgruppen komplexiert
werden [104]. Durch die Neutralisation der negativen Ladungen mit dem Na+-Ion können bei
Überschreitung der kritischen Konzentration die Moleküle ausreichend nah zusammen
rücken, so dass eine Polymer-Polymer-Verhakung (Entanglements) resultiert. Dies erklärt
vielleicht auch das niedrigere Löslichkeitsprodukt des Xanthans verglichen mit dem des
Hyaluronats und dem des Dextrans. Bei Konzentrationen über 20 mg/mL des unabgebauten
Xanthans wurde häufig die Bildung eines Niederschlags beobachtet. Die
Ausfällungskonzentration muss hierbei nicht so groß sein wie beim Dextran oder dem
Hyaluronat, da die Aktivität der Pyruvatgruppen zu einer stärkeren Wechselwirkung der
Polymere untereinander und damit zu einer Agglomeration führt. Die Molekülgröße des
verwendeten unabgebauten kommerziellen Xanthans wurde mittels SEC-Malls bestimmt und
besitzt mit 2,9 ⋅ 106 g/mol mit Abstand die größte Molmasse der untersuchten Polysaccharide.
Wie schon an anderer Stelle angemerkt (s. Absch. 2.1 u. 6.1.2) ist es für biofilmbildende
Organismen wichtig, dass ein Teil der exprämierten polymeren Substanzen eine gute
Wasserbindungsfähigkeit besitzt. Dies gilt auch für das Xanthan als Bestandteil der EPS des
Xanthomonas campestris, welches über eine außerordentliche Wasserbindekapazität verfügt.
Die ebenfalls äußerst kompakte sowie stabile Form im festen Zustand wird durch die starken
intramolekularen bzw. intermolekularen Wechselwirkungen bedingt. Hierbei spielen wie auch
beim Hyaluronat Wasserstoffbrücken eine wesentliche Rolle. Da Moorhouse et al. in ihrer
6 Diskussion
105
Arbeit über die Struktur von Xanthan im festen Zustand, die Kristallisation dieses Polymers
als äußerst schwierig einstufen, ist die Methode der Röntgenbeugung nur bedingt zur
Strukturaufklärung geeignet [117]. Allerdings beschreiben diese Autoren in Kombination mit
energetischen Betrachtungen eine mehrfache, rechtshändige Helixstruktur des Xanthans im
festen Zustand.
Genau wie die Struktur von Xanthan im festen Zustand ist die des Moleküls in wässriger
Lösung bisher nicht eindeutig geklärt. Es wurde jedoch ein Zusammenhang zwischen der
Ordnung des Moleküls und der Temperatur aufgezeigt [118, 119]. Hierbei wird eine
Stabilisierung sowohl der Einfach-Helix sowie der Doppel-Helix durch niedrige
Temperaturen vermutet. Weiterhin postulieren Liu et al., dass bei einer Temperaturerhöhung
der Übergang von einem geordneten Zustand der Doppel-Helix in eine aufgeweitete dimere
Knäuelstruktur mit teilweise geordneten Regionen erfolgt. Diese geordneten Regionen
werden wahrscheinlich durch Wechselwirkungen zwischen den Seitenketten sowie dem
Rückgrad des Xanthans bedingt [120]. Ebenso wie beim Hyaluronat führen in wässriger
Lösung Solvatisierungsvorgänge zu einer Aufweitung der Molekülstruktur, so dass sich die
Reibungseigenschaften der Lösung verändern und damit auch deren Viskosität. Wird das
hydrodynamische Volumen der Polymerteilchen betrachtet, so gibt es eine Beziehung
zwischen diesem und der Molmasse. Die Ergebnisse aus Kapitel 5.1 zeigen die Abhängigkeit
der Viskosität der Polymerlösungen von ihrer Molmasse auf. Mit Hilfe des Staudinger-
Indexes und dem daraus abgeleiteten Exponenten α (s. Mark-Houwink-Gl., Absch. 4.4) ist
eine Interpretation der Knäuelstruktur der gelösten Teilchen möglich (s. Absch. 5.1.2). Das
unabgebaute Molekül liegt demnach mit einem Exponenten von α = 0,88 in aufgeweiteter
Form als vollständig durchspültes Knäuel vor. Werden die abgebauten Xanthanfraktionen in
wässriger Lösung betrachtet, so fällt eine Abnahme der Viskosität mit abnehmender
Molmasse auf. Die Molmassenreduktion führt zu einer Dichtezunahme des Knäuels, welche
mit den Ergebnissen aus Abschnitt 5.1.2 belegt werden kann. Der Exponent nimmt für das
über 3 h mit Ultraschall abgebaute Xanthan nicht ganz so stark wie beim Hyaluronat um 33%
ab, so dass ein Hinweis auf eine nur teilweise durchspültes Knäuel mit eindeutig höherer
Dichte vorliegt. Hierbei weicht der Exponent genau wie beim 5 h abgebauten Xanthan nur
unwesentlich vom Idealwert einer Gauß-Kette mit α = 0,50 ab. Für das über 10 h und 15 h
abgebaute Xanthan verdichtet sich das Knäuel weiter, so dass sich die Struktur des gelösten
Moleküls einer Kugelsymmetrie annähert. Allerdings nimmt die Dichte bei vergleichbarer
Molmasse weniger stark zu als bei einem neutralen Polymer wie dem Dextran (s. α -Werte,
Absch. 5.1.2). Dies liegt wahrscheinlich an den negativen Ladungen der Pyruvatgruppen
6 Diskussion
sowie der Carboxylatgruppen des Natriumsalzes, welche sich gegenseitig abstoßen. Dieser
Effekt führt zu einer zusätzlichen Aufweitung und bleibt beim ungeladenen Dextran aus.
Einen weiteren Beweis für die postulierte makroskopische Struktur sowie für die
resultierenden Wechselwirkungen erbringt das Verhalten der wässrigen Lösung bei
variierender Schergeschwindigkeit. Während beim Dextran keinerlei Einfluss auf die
Viskosität beobachtet wird, zeigt sich beim Xanthan eine Abnahme der Viskosität mit
zunehmender Schergeschwindigkeit. Dies geschieht aufgrund einer Ausrichtung der
Polymerfasern entlang der Strömungsrichtung, welche einem für Polymere typischen
pseudoplastischen Verhalten entspricht (s. Absch. 2.5.3). Entsprechend müsste das über 3 h
abgebaute Xanthan nahezu als Gauß-Kette vorliegen. Damit würde dieses von der
idealisierten Kugelform abweichen, die als Grundlage zur Beschreibung der Viskosität einer
newtonschen Flüssigkeit dient. Wie experimentell bewiesen, verringert sich allerdings die
Viskosität durch eine Steigerung der Schergeschwindigkeit, so dass eine Abweichung vom
newtonschen Verhalten beobachtet wird. Dies spricht klar für die Richtigkeit der berechneten
Struktur des Polyelektrolyten in wässriger Lösung.
OO
O
O
O
O
O
O
O
*
O
H2CO
O
O
O
CH2OHCH2OH
AcOCH2
O
ONa+
Na+
HO
OH
OH
OH
OH
OH
HO
HO
OH
OO
O
O
O
O
O
O
O
O
H2CO
O
O
O
CH2OHCH2OH
AcOCH2
O
ONa+
Na+
HO
OH
OH
OH
OH
OH
HO
HO
OH
OO
O
O
O
O
O
O
O
O
H2CO
O
O
O
CH2OHCH2OH
AcOCH2
O
ONa+
Na+
HO
OH
OH
OH
OH
OH
HO
HO
OH
n
Abbildung 6.4: Ausschnitt von Xanthan (Trisaccharideinheit)
Die durch circulardichroitische Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse des nativen Xanthans
spiegeln die optische Aktivität der funktionellen Gruppen wider. Diese Chromophoren
befinden sich in den Seitenketten des Polysaccharids. Dabei handelt es sich um die
Acetylgruppe der D-Mannose und die Carboxylatgruppen der D-Glucuronsäure bzw. der
Pyruvatgruppe. Angeregt durch UV-Licht im Bereich von 210 nm erfolgt ein n–π*-Übergang
für die Chromophoren. Wie in der Literatur aufgezeigt, besitzen die CD-Spektren eines
statistischen Knäuels zwei für Xanthan charakteristische Banden [121, 122]. Eine positive bei
200 nm und eine negative bei 220 nm. Wie die Ergebnisse im Kapitel 5.4.2 zeigen, wurde die
106
6 Diskussion
107
Lage der Banden des nativen Xanthans bei den hier durchgeführten Messungen reproduziert.
Also liegt das Xanthan in wässriger Lösung mit der verwendeten Konzentration von 7 mg/mL
als statistisches Knäuel vor.
Die NMR-Messungen wurden wie beim Hyaluronat bei einer Temperatur von 60°C
durchgeführt, um hinsichtlich der hohen Viskosität der wässrigen Lösungen eine
Verbesserung des Signal-Rauschverhältnisses zu erzielen. Wie die 13C-NMR-Ergebnisse
(s. Absch. 5.5) allerdings zeigen, reicht für Xanthan eine Konzentration von 16 mg/mL bei
einer Temperatur von 60°C nicht aus, um aussagekräftige 13C-NMR-Spektren zu erhalten.
Damit aber ein Anstieg der Viskosität bei zunehmender Xanthankonzentration sowie eine
Abnahme der Mobilität der Polymerketten ausbleibt, wurden die Makromoleküle mittels
Ultraschall partiell depolymerisiert. Dies bewirkt eine gute Löslichkeit der Xanthanfragmente
und entsprechend eine verbesserte Beweglichkeit der Moleküle in Lösung. Durch diese
Maßnahme wurde das Signal/Rauschverhältnis sowie die spektrale Auflösung der 13C-NMR-
Spektren entscheidend verbessert. Wie die erhaltenen Spektren ebenfalls zeigen, ist die
verwendete Degradationsmethode ausreichend selektiv bezüglich der glykosiydischen
Trennung, so dass nur Bindungen zwischen den Glucoseeinheiten des Rückgrades gespalten
wurden.
6 Diskussion
108
6.2 Wechselwirkung der Polysaccharide mit mehrwertigen Kationen
Die Ergebnisse von Schürks et al. zeigen, dass das Alginat als ein wesentlicher Bestandteil
des Biofilms von Pseudomonas aeruginosa eine außerordentliche Affinität zu mehrwertigen
Metallionen besitzt [104]. Um diese Ergebnisse in die Diskussion bezüglich der hier
eingesetzten Modellpolysaccharide einfließen zu lassen, wurden die Wechselwirkungen von
Calcium(II), Magnesium(II) und Mangan(II) auf Dextran, Hyaluronat sowie Xanthan
betrachtet. Darüber hinaus ist der Einfluss von Schwermetallionen auf aquatische Systeme
von großem Interesse, da durch die starke Anbindung eine Aufkonzentrierung ökologisch
bedenklichen Materials und damit verbunden ein erhöhtes Gefahrenpotenzial induziert wird.
Aus diesem Grund wurden weitergehend die Wechselwirkungen von Schwermetallionen wie
Eisen(II), Eisen(III), Kupfer(II), Zink(II), Cadmium(II) und Blei(II) mit den
Modelpolysacchariden untersucht.
Ein Ziel dieser Untersuchungen war es, den Bindungsmechanismus zwischen den
Polyscchariden und den mehrwertigen Kationen näher zu beschreiben. Hierfür wurden unter
anderem hochauflösende 13C-NMR-Spektren der Polysaccharide in Gegenwart
unterschiedlicher Kationenkonzentrationen aufgezeichnet. Es wurde vermutet, dass sich das
Spektrum bei einer koordinativen Bindung der Kationen zu einzelnen Monomerbausteinen
bzw. zu funktionellen Gruppen der einzelnen Bausteine verändert. Da die Kohlenstoffatome
keine direkte Bindung mit den Kationen eingehen, erwartete man zwei Änderungen des
Spektrums. Die erste Möglichkeit ist eine Verschiebung der Signale aufgrund der neuen
chemischen Umgebung. Die zweite mögliche Änderung ist eine Verbreiterung der betroffenen
Signale aufgrund der eingeschränkten Beweglichkeit koordinativ gebundener funktioneller
Gruppen. Eine Verstärkung dieses Effekts verspricht man sich durch den Einsatz
paramagnetischer Sonden in Form von paramagnetischen, bivalenten Kationen. Solche Ionen
spielen in der NMR-Spektroskopie eine wichtige Rolle. Bei 13C-NMR-Messungen wird
normalerweise darauf geachtet, paramagnetische Verunreinigungen zu vermeiden, da sie die
Relaxationszeiten verkürzen und damit die Linien verbreitern. Die Gegenwart von
paramagnetischen Ionen kann zusätzlich eine Verschiebung der Signale bewirken. Da aber
nicht alle Signale eines Moleküls gleichmäßig beeinflusst werden, lässt sich der Effekt gezielt
bei der Spektrenanalyse einsetzen. Hierbei muss man zwei Arten der Wechselwirkung
unterscheiden, die beide zu Signalverschiebungen führen. Zum einen die
Kontaktwechselwirkung und zum anderen die Pseudokontaktwechselwirkung. Beide setzen
eine Komplexbildung zwischen dem Substrat und dem paramagnetischen Metallion voraus,
6 Diskussion
109
wobei sich in Lösung ein Gleichgewicht zwischen freien Komponenten und Komplexen
einstellt. Durch die Kontaktwechselwirkung wird im Komplex Spindichte des ungepaarten
Elektrons auf das Substratmolekül übertragen. Da die Spindichteverteilung am Ort der
beobachteten Kerne sehr unterschiedlich ist, wird auch der Verschiebungseffekt nicht überall
im Molekül gleich groß sein. Die Pseudokontaktwechselwirkung ist eine dipolare
Wechselwirkung zwischen dem magnetischen Dipolfeld des ungepaarten Elektrons und dem
des beobachteten Kerns. Das Mangan(II) sowie das Kupfer(II) besitzen ein ungepaartes
Elektron. Ionen in denen ungepaarte Elektronen auftreten, besitzen ein permanentes
magnetisches Moment. Ohne äußeres Feld sind die magnetischen Momente statistisch verteilt
und heben sich gegenseitig auf. Legt man ein äußeres magnetisches Feld an, so richten sich
die magnetischen Momente in Feldrichtung aus, es entsteht eine Magnetisierung, die dem
äußeren Feld gleichgerichtet ist. Die paramagnetische Suszeptibilität ist unabhängig von der
Feldstärke, aber temperaturabhängig, da eine Temperaturzunahme der Ausrichtung der
permanenten Magnete im äußeren Feld entgegenwirkt [33].
Mit Hilfe von Titrationsversuchen ist es möglich, über den Bindungsmechanismus hinaus die
Struktur der sich einstellenden Komplexe zu untersuchen. Es wurde vermutet, dass sich die
Struktur der gelösten Polysaccharide durch die sukzessive Zugabe von mehrwertigen
Metallionen verändert. Entsteht eine koordinative Bindung der Polymeren mit den Kationen,
so geschieht dies nicht ohne makroskopische Auswirkungen. Es wurde angenommen, dass
durch die Wechselwirkung der Polysaccharide mit den Kationen in wässriger Lösung eine
Änderung der Viskosität einhergeht. Wie Emmerichs et al. beobachteten, kann dies durch eine
Vernetzung der Polymeren mit den Kationen durch die Bildung von Netzwerkpunkten
ausgelöst werden [114]. Dies würde zu einer Viskositätszunahme führen. Eine weitere
Möglichkeit besteht darin, dass sich die Teilchendichte durch eine stärkere Faltung des
Polymers und einer intensiveren intramolekularen Wechselwirkung in Anwesenheit von
Metallkationen vergrößert. Dies würde einer Viskositätsabnahme entsprechen. Verändert sich
die unmittelbare Umgebung einer funktionellen Gruppe durch die Wechselwirkung mit einem
mehrwertigen Metallion, ist ein Einfluss auf die chiroptischen Eigenschaften der Polymer-
Lösung wahrscheinlich. Ausgelöst würde dies durch die Änderung der chemischen
Umgebung der Chromophoren, so dass der Circulardichroismus bei einer solchen Probe ein
anderer wäre als bei einer kationenfreien Lösung. Es wurde weitergehend vermutet, dass die
Wechselwirkungen der Kationen mit den Biopolymeren einen diskontinuierlichen Verlauf
einer Leitfähigkeitstitration bedingen. Diese nicht kontinuierliche Zunahme der Leitfähigkeit
wird wahrscheinlich neben der kohlrauschschen Komponente durch koordinative Bindungen
6 Diskussion
110
zwischen den Polysacchariden und den mehrwertigen Metallionen verursacht. Tritt eine
Komplexierung auf, so sind die Ladungsträger in einem elektrischen Feld gehemmt bis sich
ein Gleichgewicht zwischen den freien Komponenten und den Komplexen während der
Titration einstellt. Dies würde bis zur Gleichgewichtsbildung zu einer niedrigeren
Leitfähigkeitszunahme gegenüber einer polysaccharidfreien Lösung führen.
6.2.1 Dextran Um den Einfluss von mehrwertigen Kationen auf ungeladene EPS zu untersuchen, wurde das
Dextran als Modellpolysaccharid eingesetzt. Dabei liegt der Schwerpunkt der
Untersuchungen darauf, eine Änderung der physikalischen Eigenschaften in Anwesenheit von
bi- bzw. trivalenten Kationen nachzuweisen. Das Rückgrad des Dextrans besteht aus über
glycosidische Bindungen verknüpften Glucose-Einheiten. Die Hydroxylgruppen der
Glucosemonomere besitzen am Sauerstoff lokalisierte freie Elektronenpaare, sind also
Lewisbasen. Werden diese partiell negativen Ladungen einer Lewissäure in Form eines
Kations ausgesetzt, resultiert aufgrund coulombscher Kräfte eine Anziehung. Diese auf
theoretischen Überlegungen fußende Annahme wird in der Literatur für dreiwertige
Metallionen bestätigt [123]. Die chiroptischen Untersuchungen von Crescenzi et al. zeigen,
dass ein Einfluss auf das Dextran durch die untersuchten Lanthanoide vorliegt [124]. Die
Ergebnisse von de Soares et al. sprechen dafür, dass die Hydroxylgruppen, welche am C-2-
bzw. C-3-Atom der Monomereinheiten gebunden sind, mit den untersuchten Lanthanoiden
komplexieren [125]. Dabei nimmt die Stabilität des Komplexes von La3+ über Ce3+ zu Nd3+
ab. Der von Mazi et al. beschriebene Einfluss auf die Viskosität zeigt, dass im
Konzentrationsbereich bis 0,08 mol/L die Viskosität der 20%igen Dextran-Lösung abnimmt
um dann anschließend bis zu einer Konzentration von 0,16 mol/L wieder zuzunehmen. Mit
Hilfe des ermittelten Minimums ist es möglich, nach den Ergebnissen von Hirashima et al.
ein stöchiometrisches Verhältnis zu berechnen. Für das Polymer/Kation-System beträgt das
Verhältnis 1:1 [126]. Dieser eindeutig belegte Einfluss der Lanthanoide auf Dextran in
wässriger Lösung konnte mit den hier untersuchten Kationen Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Fe3+,
Cu2+, Zn2+, Cd2+ und Pb2+ nicht reproduziert werden. Wie in Kapitel 5.3.1.1 zu sehen, erfolgt
in Anwesenheit von bivalenten sowie von trivalenten Kationen im Konzentrationsbereich von
0,2 bis 1,6 mmol/L keine Änderung der Viskosität einer Dextran-Lösung mit der
Konzentration von 1,5 g/L. Eine Leitfähigkeitsänderung einer wässrigen Dextran-Lösung, wie
6 Diskussion
111
sie in Abhängigkeit der Kationenkonzentration für Lanthanoide beschrieben wurde, konnte
mit den hier untersuchten Kationen nicht nachvollzogen werden [123]. Der in Abbildung 5.4
des Kapitels 5.2.1 dargestellte Leitfähigkeitsgraph zeigt exemplarisch für die hier
untersuchten Kationen einen linearen Verlauf für die Titration einer Calcium(II)-Lösung in
eine Dextran-Lösung und beweist damit, dass keine vergleichbaren Wechselwirkungen mit
den bivalenten Kationen vorliegen. Darüber hinaus wurde eine spezifische Wechselwirkung
von bivalenten Kationen mit Dextran mit Hilfe der paramagnetischen Kationen Mangan(II)
und Kupfer(II) ausgeschlossen. Die NMR-Untersuchungen zeigen keinen Unterschied bei der
chemischen Verschiebung der Resonanzen von Dextran-Lösungen in Anwesenheit von
bivalenten Kationen zu denen ohne Kationen auf. Es wurde allerdings in Gegenwart der
paramagnetischen Ionen, wie erwartet durch die Induktion eines lokalen Magnetfeldes
innerhalb der Probe ein Einfluss auf die Relaxationzeit beobachtet, so dass eine
Linienverbreiterung für das gesamte Spektrum resultiert.
Grundsätzlich zeigt der Vergleich der Literaturergebnisse mit denen dieser Arbeit, dass die
Wertigkeit der positiven Ionen ein wesentliches Merkmal für die Interaktion zwischen Kation
und dem neutralen Polysaccharid darstellt. Die für diese Arbeit genutzten Kationen sind
entsprechend weniger starke Lewissäuren als die trivalenten Lanthanoide. Dies bedeutet, dass
die Wechselwirkungen mit den freien Elektronenpaaren des Makromoleküls so gering
ausfallen, dass sie mit den verwendeten Methoden nicht nachgewiesen werden können und
somit keinen signifikanten Einfluss auf die physikalischen Eigenschaften des Dextrans haben.
Dementsprechend wird es durch Biofilme mit Dextran als wesentlichen Bestandteil der EPS
zu keiner bedeutsamen Akkumulation von bivalenten Schwermetallionen kommen.
Neben der Ladung des Kations müssen für die Wechselwirkung von Dextran mit einem
solchen weitere Faktoren eine Rolle spielen, da das trivalente Eisen(III)ion ebenfalls keine
charakteristische Änderung der physikalischen Eigenschaften verursacht. Werden die
Kationen miteinander verglichen, erkennt man einen signifikanten Unterschied in den
Ionenradien. Diese sind im Gegensatz zu den Lanthanoiden für die hier untersuchten Ionen
abgesehen von Pb2+ mit 1,19 Å alle kleiner bzw. gleich 1,00 Å. Das Eisen(III)ion nimmt mit
einem Radius von nur 0,55 Å nicht einmal halb so viel Raum ein wie die dreiwertigen
Lanthanoide mit einem Ionenradius von ≥ 1,14 Å. Daraus kann eine Größenabhängigkeit der
Wechselwirkungsaktivität der Ionen abgeleitet werden. Dafür spricht auch die von Mazi et al.
beobachtete Stabilitätsreihe der Lanthanoidenkomplexe (s.o) [123]. Durch die Zuordnung der
entsprechenden Ionenradien für die geschilderten Metalle ist es möglich, analog zu den hier
6 Diskussion
112
diskutierten Beobachtungen eine Zunahme der Komplexstabilität mit steigendem Ionenradius
zu postulieren.
Zusammenfassend bedeutet dies Folgendes: je größer die Ladung ist und je mehr Oberfläche
eine Kationensäure besitzt, um so ausgeprägter sind die Wechselwirkungen mit dem Dextran.
6.2.2 Hyaluronat Die von Emmerichs et al. erhaltenen Ergebnisse bezüglich der Wechselwirkungen der
bivalenten Kationen Calcium(II), Magnesium(II) und Mangan(II) mit dem Algen- sowie dem
Bakterienalginat konnten mit dem Polysaccharid Dextran wie in Kapitel 6.2.2 beschrieben
nicht reproduziert werden [114]. Die geringe Lewisbasizität der Hydroxylgruppen scheint für
eine signifikante Wechselwirkung nicht ausreichend stark zu sein. Aus diesem Grund wurde
eine Untersuchung etwaiger Wechselwirkungen von mehrwertigen Metallionen mit einem
geladenen Biopolymer wie dem Hyaluronat angestrebt. Dieses Copolymer besitzt ähnlich wie
das Alginat eine Glucuronatuntereinheit. Dabei war davon auszugehen, dass eine
Wechselwirkung der Metallionen mit den in dissoziierter Form negativ geladenen
Carboxylgruppen sehr wahrscheinlich ist. Bei dem zweiten Monomer, aus welchem sich das
Hyaluronat zusammensetzt, handelt es sich um ein Glucosamid. Da zu diesem Thema noch
keine Ergebnisse veröffentlicht wurden, waren hierbei die Wechselwirkungen mit den
untersuchten Kationen völlig unklar, so dass nur eine eventuelle Wechselwirkung mit der
Amidgruppe vermutet wurde.
Zu einer Charakterisierung der Wechselwirkungen der Metallionen mit dem Hyaluronat in
wässriger Lösung wurden Leitfähigkeitstitrationen (s. Absch. 4.3) durchgeführt. An dieser
Stelle erfolgte ein Vergleich der Wechselwirkungen von Calcium(II), Magnesium(II),
Mangan(II), Eisen(II), Eisen(III), Kupfer(II), Zink(II), Cadmium(II) und Blei(II). Der
jeweilige Leitwert wurde in mS/cm notiert. Der Verlauf einer solchen Titration ist in
Abbildung 5.5 am Beispiel des über 3 h abgebauten Hyaluronats mit Blei(II) dargestellt. Die
anderen Titrationsverläufe sind im Anhang unter A.9 bis A.15 aufgeführt. Aus den
eingesetzten Hyaluronatkonzentrationen von 0,5 mg/mL bis 2,0 mg/mL konnten
Stoffmengenkonzentrationen (s. Tab. 5.3 bis 5.10) bezogen auf die jeweiligen
Polymeruntereinheiten berechnet werden. Die ermittelten Äquivalenzpunkte liegen zwischen
den Werten 0,025 und 0,11 mmol/L für die untersuchten Kationen und einer
Hyaluronatkonzentration von 1,5 mg/mL. Dies bedeutet, dass die Anbindung der Ionen in
6 Diskussion
einem Verhältnis von einem Kation zu fünf Polymeruntereinheiten erfolgt. Aufgrund dieses
Ergebnisses kann man sagen, dass die Kationen mit dem Hyaluronat wechselwirken, da eine
Hemmung der Beweglichkeit der Ladungsträger in dem angelegten elektrischen Feld
resultiert. Dies wird in Abbildung 5.5 deutlich, wo bis zum Erreichen des Äquivalenzpunktes
eine Abweichung zum polysaccharidfreien Verlauf beobachtet wird. Hierbei ist die
Abweichung der Leitfähigkeitskurve in Form der Diskontinuität für jedes untersuchte Kation
unterschiedlich stark ausgeprägt. Ein solches Verhalten spricht für die Bildung
unterschiedlich starker Komplexe. Denn je stärker ein Komplex, um so intensiver sind auch
die Wechselwirkungen zwischen Kationen und den Monomeren des Hyaluronats. Als
Indikator für die Stabilität des Komplexes bzw. für die Wechselwirkungsintensität wurde die
Differenz ∆κ* (s. Tab. 5.3 bis 5.10) der Leitfähigkeitskurven in Anwesenheit von Hyaluronat
und in Abwesenheit des Polysaccharids wie in Kapitel 4.3 beschrieben berechnet.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Ionenradius [Å]∆κ∗ [mS/cm × 10-
1
Pb2+ Ca2+ Cd2+ Zn2+ Cu2+ Mg2+ Mn2+
Abbildung 6.5: Balkendiagramm für den Ionenradius bivalenter Kationen mit der durch Leitfähigkeitstitrationen ermittelten Abnahme der spezifischen Leitfähigkeit κ*.
Durch den Vergleich der Ergebnisse wird eine tendenzielle Steigerung der Wechselwirkungen
einhergehend mit der Zunahme der Ionenradien beobachtet, da die ∆κ*-Werte wie in
Abbildung 6.6 dargestellt mit steigendem Ionenradius ebenfalls zunehmen. Diese
Beobachtung entspricht der Schlussfolgerung für die Wechselwirkung des Dextrans mit
dreiwertigen Lanthanoiden, bei der ebenfalls ein Zusammenhang zwischen Komplexstabilität
und Ionenradius festgestellt wurde (s. Absch. 6.2.2).
Die Bildung von solchen Komplexen bewirkt wahrscheinlich eine Änderung der
Molekülstruktur, so dass sich die Reibungseigenschaften der Lösung verändern und damit
113
6 Diskussion
114
auch deren Viskosität. Um dieser Frage nachzugehen, wurden rotationsviskosimetrische
Titrationen durchgeführt. Der Verlauf einer solchen Titration ist in Abbildung 5.12 am
Beispiel des Hyaluronats mit Calcium(II) dargestellt. Alle weiteren Titrationsverläufe sind im
Anhang aufgeführt. Hierbei wurde abweichend zu den Ergebnissen von Emmerichs et al. eine
Abnahme der Viskosität bei gleichzeitiger Konzentrationszunahme der mehrwertigen
Kationen in einer wässrigen Hyaluronatlösung beobachtet [114]. Es wird davon ausgegangen,
dass eine Vernetzung wie sie beim Alginat mit bivalenten Kationen beobachtet wurde,
ausbleibt und stattdessen eine Zunahme der intramolekularen Wechselwirkungen resultiert.
Wie die Abbildungen 6.2 und 6.3 in Kapitel 6.1.2 veranschaulichen, werden die solvatisierten
Hyaluronatketten in wässriger Lösung über Wasserstoffbrücken stabilisiert und liegen als
statistische Knäuel vor. Es wird vermutet, dass die positiven Ladungsträger durch
coulombsche Wechselwirkungen getrieben in diese Knäuelstruktur diffundieren und so zu
einer Faltung des Polyelektrolyten beitragen. Ausgelöst wird dies durch eine intensive
intramolekulare Verknüpfung über die Kationen mit den funktionellen Gruppen. Des
Weiteren werden die negativen Ladungen entlang der Hyaluronatkette durch die
mehrwertigen Metallionen kompensiert, so dass sich diese nicht weiter abstoßen. Dies führt
zu einer Dichtezunahme des Knäuels und entsprechend zu einer Abnahme der Reibung der
Polymerketten untereinander. Die resultierende, kontinuierliche Abnahme der Viskosität wie
sie in Abbildung 5.12 zu sehen ist, schreitet solange voran, bis sich ein Gleichgewicht
zwischen den freien Komponenten und den Komplexen während der Titration einstellt.
Oberhalb dieser Äquivalenzkonzentration beobachtet man eine konstante Viskosität. Mit
Hilfe dieser Äquivalenzkonzentration und der eingesetzten Hyaluronatkonzentration von 1,5
mg/mL konnten Stoffmengenkonzentrationen bezogen auf die jeweiligen Polymerunter-
einheiten, die mit den Kationen wechselwirken, berechnet werden. Die in Tabelle 5.21
zusammengefassten Ergebnisse entsprechen im Wesentlichen denen der konduktometrischen
Titration wobei auf ein Kation annähernd fünf Polymeruntereinheiten kommen.
Dass eine Kontraktion der Hyaluronatmoleküle in Gegenwart von mehrwertigen Kationen
sehr wahrscheinlich ist, zeigen auch die Ergebnisse der Viskositätsuntersuchung von
Hyaluronat-Lösungen in Kapitel 5.3.2.2. Hierbei wurde der Einfluss auf die Viskosität in
Abhängigkeit der Schergeschwindigkeit untersucht. Während in Abwesenheit von
mehrwertigen Kationen eine Abnahme der Viskosität einer Hyaluronat-Lösung mit
zunehmender Schergeschwindigkeit beobachtet wurde, bleibt für eine Hyaluronat-Lösung in
Anwesenheit von mehrwertigen Kationen eine Viskositätsänderung aus (s. Abb. 5.15). Eine
charakteristische Eigenschaft von Polymeren sowie von Polyelektrolyten ist, dass diese in
6 Diskussion
115
Lösung vom klassischen newtonschen Verhalten abweichen. Dies geschieht normalerweise
durch die Bildung eines vollständig durchspülten Knäuels. Die gelösten Polymere werden
durch die Zunahme der Scherkräfte zunehmend gestreckt, so dass eine Ausrichtung parallel
zur Strömungsrichtung resultiert. Dies führt zu schergeschwindigkeitsabhängigen
Viskositäten, wobei diese Strukturänderung in der Regel reversibel ist. Da sich die Viskosität
der Hyaluronat-Lösung in Gegenwart der mehrwertigen Kationen nicht verändert, wird eine
Komprimierung der Knäuelstruktur vermutet. Diese wird wahrscheinlich durch intensive
intramolekulare Wechselwirkungen bedingt und verhindert so eine Streckung des Moleküls
während einer Scherung.
Um diese Wechselwirkungen weitergehend zu charakterisieren, wurden im Rahmen dieser
Arbeit NMR-Untersuchungen durchgeführt. Man vermutet für die Kationen Mangan(II) und
Kupfer(II) einen ähnlichen Anlagerungsmechanismus wie bei den Kationen Calcium(II),
Magnesium(II), Eisen(II), Eisen(III), Zink(II), Cadmium(II) und Blei(II). Aufgrund des
Effektes der paramagnetischen Ionen Mangan(II) und Kupfer(II) wurde eine Veränderung der
NMR-Spektren von gelöstem Hyaluronat erwartet. Die Beeinflussung der Resonanzsignale
des Hyaluronats sollte Informationen über den Komplex Mangan- bzw. Kupfer-Hyaluronat
liefern und somit indirekt auch Informationen über die Hyaluronatkomplexe der übrigen
mehrwertigen Kationen. Hierfür wurden Konzentrationsreihen mit gleichen
Hyaluronatanteilen (der über 3 h abgebauten Fraktionen), aber unterschiedlichen Mangan-
bzw. Kupferkonzentrationen angesetzt. Von diesen Lösungen wurden hochauflösende 13C-
NMR-Spektren nach der „reversed gated decoupling“ Methode (s. Kap. 4.6) aufgezeichnet.
Die Spektren wurden verglichen und zeigten signifikante Linienverbreiterungen an
bestimmten Kohlenstoffatomen der Zuckerringe. Diese Spektren sind in Abbildung 5.26 für
Hyaluronat-Lösungen in Anwesenheit von Mangan(II) exemplarisch für die untersuchten
paramagnetischen Kationen dargestellt.
Man sieht hier sehr deutlich, dass beim Glucuronat nur zwei Signale verbreitert werden, siehe
dazu auch Abbildung 5.28. Aus der vergrößerten Darstellung lässt sich entnehmen, dass die
stärkste Beeinflussung an der C-6 Position gefunden wird. Das C-6 ist der Kohlenstoff der in
dissoziierter Form negativ geladenen Carboxylgruppe. Die zweite Verbreiterung findet sich
am Kohlenstoff der Position 5, also am direkt benachbarten Kohlenstoff (s. Abb. 5.27). Man
kann also von einer Wechselwirkung der Manganionen mit der negativ geladenen
Carboxylgruppe ausgehen. Das Manganion befindet sich in direkter Nähe zum C-6
Kohlenstoff und verursacht aufgrund des zusätzlichen Magnetfeldes eine starke Verbreiterung
des Signals. Dieses Magnetfeld strahlt auch auf das C-5-Atom aus und verbreitert somit auch
6 Diskussion
116
sein Signal. Diese Linienverbreiterungen sprechen für eine Wechselwirkung der
Manganionen mit der Carboxylatgruppe des Glucuronats. Bei den Resonanzen des
Glucosamids werden ebenfalls zwei Linien verbreitert (s. Abb. 5.27 und 5.28). Aus der
Abbildung 5.28 lässt sich entnehmen, dass die stärkste Beeinflussung an der C-7 Position
gefunden wird. Dabei handelt es sich um den Carbonylkohlenstoff der Amid-Gruppe. Des
Weiteren wird für die benachbarte C-8 Position der Methylgruppe eine Linienverbreiterung
detektiert. Eine Verbreiterung des Signals der Methylprotonen wird ebenfalls im 1H-NMR-
Spektrum einer Hyaluronat-Lösung in Anwesenheit von Mangan(II) beobachtet (s. Abb.
5.23). Es wird vermutet, dass sich das Manganion in der unmittelbaren Umgebung zum C-7
Kohlenstoff befindet und dort durch das zusätzliche Magnetfeld eine starke Verbreiterung des
Signals verursacht. Dieses Magnetfeld strahlt auch auf das C-8-Atom sowie auf die Protonen
der Methylgruppe aus und verbreitert somit auch diese Signale.
Die NMR-Ergebnisse sprechen für eine Wechselwirkung der Manganionen mit der
Carbonylgruppe des Glucosamids. Eine indirekte Bestätigung dieser Annahme wird durch die
chiroptischen Ergebnisse der CD-Spektroskopie geliefert. Die CD-Spektren der Abbildung
5.17 zeigen exemplarisch den Einfluss von Calcium(II) auf Hyaluronat in wässriger Lösung.
Es wird vermutet, dass diese Änderung des Circulardichroismus in Anwesenheit von
Calcium(II) durch einen ähnlichen Anlagerungsmechanismus wie bei den Kationen
Magnesium(II), Mangan(II), Eisen(II), Eisen(III), Kupfer(II), Zink(II), Cadmium(II) und
Blei(II) ausgelöst wird. Die Amidgruppe wird durch die unmittelbare Nähe des
Calcium(II)ions in ihrer räumlichen Anordnung verändert. Dieser Einfluss auf die
Ausrichtung des Chromophors bewirkt eine Intensitätsabnahme des Circulardichroismus wie
in Abbildung 5.17 gezeigt. Berücksichtigt man die bisher diskutierten Ergebnisse, so ist eine
Komplexstruktur wie in Abbildung 6.6 dargestellt sehr wahrscheinlich. In dieser Struktur ist
eine Drehung der Amidgruppe um die Stickstoffbindung zum Zuckerring angedeutet, welche
für den sich ändernden Circuladichroismus verantwortlich gemacht werden kann. Des
Weiteren befindet sich das Metallion in unmittelbarer Nähe der Carboxylat- sowie der
Carbonylgruppe. Dies passt sehr gut zu den erhaltenen NMR-Ergebnissen. Werden die bereits
für Wechselwirkungen mit einwertigen Kationen veröffentlichten Strukturen des Hyaluronats
in fester Form als auch in wässriger Lösung berücksichtigt, sprechen die im Rahmen dieser
Promotionsarbeit erhaltenen Ergebnisse für einen oktaedrischen Komplex, so wie er in
Abbildung 6.6 schematisch dargestellt ist [106].
6 Diskussion
Abbildung 6.6: Postulierte Struktur eines oktaedrischen Metall-Hyaluronatkomplexes zweier Tetrasaccharideinheiten. Der Entwurf geht konform mit den im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Ergebnissen.
Die weiteren Befunde sprechen dafür, dass dieses Model eines oktaedrischen Komplexes auf
alle im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Metallionen in wässriger Lösung gleichermaßen
angewendet werden kann.
117
Berücksichtigt man die gesammelten Fakten, so kann eine Affinität der ökologisch relevanten
Kationen zum Hyaluronat vorausgesetzt werden. Dies bedeutet für aquatische Biofilme mit
Hyaluronat als wesentlichen Bestandteil der EPS, dass eine Akkumulation von mehrwertigen
Kationen in deren Matrix wahrscheinlich ist. Diese Anreicherung von teilweise toxischem
Material ist keinesfalls unproblematisch, da es auf diese Weise in die Nahrungskette gelangen
kann. Die Aufnahme von planktonischen Partikeln mit erhöhter Schwermetallkonzentration
durch höhere Organismen kann zu einem unkalkulierbaren Risiko für diese und allen der
Nahrungskette angehörenden Spezies führen. Die mannigfaltigen Auswirkungen, wie
beispielsweise die Schwächung des Immunsystems oder die Bildung von Allergien, können
durch den Verzehr von z. B. Fisch und anderen marinen Lebensformen bis zum Menschen
vordringen. Die Wechselwirkungen mit den Schwermetallen, wie sie im Rahmen dieser
Arbeit für das Hyaluronat diskutiert wurden, können möglicherweise auch positiven Nutzen
bringen. Es ist denkbar, dass die Affinität der Schwermetallionen zum Hyaluronat zu einer
Verbesserung der Wasserqualität eingesetzt werden kann. Würde man stationäre Hyaluronat-
gele in Klärwerken als Filtersystem einsetzen oder das Hyaluronat den Klärschlämmen
beimengen, so könnten die Schwermetallionen möglicherweise aus dem Wasser entfernt
werden. Ein anschließendes Recycling durch eine chemische Behandlung würde ein solches
Verfahren, neben der endgültigen Entsorgung der Klärschlämme, schließlich abrunden.
6 Diskussion
118
6.2.3 Xanthan
Eine Wechselwirkung von mehrwertigen Metallionen mit geladenen EPS wurde bereits im
Rahmen dieser Arbeit durch die Untersuchung von Hyaluronat sowie den Untersuchungen
von Emmerichs et al bezüglich dem Alginat bestätigt [114]. Bei diesen Polyelektrolyten
handelt es sich allerdings um lineare, unverzweigte Copolymere. Der strukturelle Einfluss von
EPS mit geladenen Seitenketten wurde bei den bisher veröffentlichten Untersuchungen nicht
berücksichtigt. Eine Charakterisierung solcher Wechselwirkungen ist mit Hilfe des Xanthans
gebildet von Xanthomonas campestris möglich. Das hetero Polymer Xanthan (Natriumsalz)
besitzt ebenso wie das Hyaluronat bzw. das Dextran ein aus Saccharideinheiten aufgebautes
Rückgrad. Dies besteht wie beim Dextran aus Glucose-Molekülen, welche über eine β-1,4
glycosidische Bindung miteinander verknüpft sind. Abweichend vom Dextran, welches nur
aus ungeladenen Glucoseuntereinheiten aufgebaut ist, wird an jedem zweiten Glucosering die
Brenztraubensäure einer Seitenkette ketalartig gebunden. Die Seitenketten bestehen dabei aus
β-D-Mannose, aus β-1,4-D-Glucuronat, aus α-1,2-D-Mannose und einer endständigen
Pyruvatgruppe. Es war davon auszugehen, dass eine Wechselwirkung der Metallionen mit
den in dissoziierter Form negativ geladenen Carboxylatgruppen des Glucuronats sowie der
Pyruvatgruppe sehr wahrscheinlich ist.
Um diese Wechselwirkungen der Kationen mit dem Xanthan in wässriger Lösung
weitergehend zu charakterisieren, wurden Leitfähigkeitstitrationen (s. Absch. 4.3)
durchgeführt. An dieser Stelle erfolgte ein Vergleich der Wechselwirkungen von Calcium(II),
Magnesium(II), Mangan(II), Eisen(II), Eisen(III), Kupfer(II), Zink(II), Cadmium(II) und
Blei(II). Der jeweilige Leitwert wurde in mS/cm notiert. Der Verlauf einer solchen Titration
ist in Abbildung 5.7 am Beispiel des über 3 h abgebauten Xanthans mit Zink(II) dargestellt.
Die anderen Titrationsverläufe sind im Anhang unter A.15 bis A.22 aufgeführt. Aus den
eingesetzten Xanthankonzentrationen von 0,5 mg/mL bis 2,0 mg/mL konnten
Stoffmengenkonzentrationen (s. Tab. 5.12 bis 5.19) bezogen auf die jeweiligen
Polymeruntereinheiten berechnet werden. Die ermittelten Äquivalenzpunkte liegen zwischen
den Werten 0,022 und 0,07 mmol/L für die untersuchten Kationen und einer
Xanthankonzentration von 1,5 mg/mL. Dies bedeutet, dass eine Anbindung der Ionen in
einem Verhältnis von einem Kation zu zwei Polymeruntereinheiten erfolgt. Aufgrund der
erhaltenen Ergebnisse kann man sagen, dass die Kationen mit dem Xanthan wechselwirken,
da eine Hemmung der Beweglichkeit der Ladungsträger in dem angelegten elektrischen Feld
die Folge ist. Dies wird in Abbildung 5.7 deutlich, wo bis zum Erreichen des
6 Diskussion
Äquivalenzpunktes eine Abweichung zum polysaccharidfreien Verlauf beobachtet wird.
Hierbei wurde für jedes untersuchte Kation ein charakteristischer Verlauf der Diskontinuität
beobachtet. Dieser ist wie beim Xanthan auch von der Wechselwirkungsaktivität zwischen
den Kationen und dem Polysaccharid abhängig. Die Komplexstabilität kann in Form der
Differenz ∆κ* (s. Tab. 5.3 bis 5.10) der Leitfähigkeitskurven in Anwesenheit von Hyaluronat
und in Abwesenheit des Polysaccharids, wie in Kapitel 4.3 beschrieben, bestimmt werden.
Wie die Ergebnisse in Kapitel 5.2.3 zeigen, wird beim Xanthan ebenso wie beim Hyaluronat
und dem Dextran mit Zunahme der Ionenradien ein Anstieg der Wechselwirkungen
beobachtet.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Ionenradius [Å]∆κ∗ [mS/cm × 10-
1
Pb2+ Ca2+ Cd2+ Zn2+ Cu2+ Mg2+ Mn2+
Abbildung 6.7: Balkendiagramm für den Ionenradius bivalenter Kationen mit der durch Leitfähigkeitstitrationen ermittelten Abnahme der spezifischen Leitfähigkeit κ*.
Dieser Zusammenhang zwischen Ionenradius und den ∆κ*-Werten wird im Balkendiagramm
der Abbildung 6.7 verdeutlicht.
Es wurde vermutet, dass die Bildung von solchen Komplexen ebenso wie beim Hyaluronat (s.
Kap. 6.2.2) wahrscheinlich eine Änderung der Molekülstruktur bewirkt, so dass sich die
Reibungseigenschaften der Lösung verändern und damit auch deren Viskosität. Diese
Annahme wurde im Zusammenhang mit dreiwertigen Metallionen bereits in der Literatur
diskutiert. Rodd et al. haben im Rahmen ihrer Untersuchungen eine Zunahme der Viskosität
nach Zugabe von Aluminium(III) beobachtet [127]. Beim Überschreiten der kritischen
Konzentration, so wird von Shu et al. berichtet, bildete sich ein Gel [128]. Der Mechanismus,
welcher der Gelbildung zugrunde liegt, ist allerdings noch unklar. Um den Verlauf der
Gelbildung weitergehend zu ergründen, wurden kinetische Untersuchungen in Gegenwart von
119
6 Diskussion
Chrom(III)ionen mit Xanthan-Lösungen durchgeführt [129]. Bei den 1H-NMR-Studien von
Hansen et al. wurde in Anwesenheit des paramagnetischen Kations ein Einfluss auf die Spin-
Gitter-Relaxation beobachtet. Dies wird auf eine Zunahme der Viskosität durch die
Wechselwirkung von Xanthan mit dem dreiwertigen Metallion zurückgeführt, wobei das
Kation eine intermolekulare Vernetzung begünstigt. Eine solche Vernetzung wird auch für
das Alginat in wässriger Lösung und in Anwesenheit von bivalenten Kationen postuliert
[114]. Hierbei wird angenommen, dass die Metallionen Netzwerkpunkte ausbilden, über
welche eine intermolekulare Verbrückung möglich wird. Um einer Änderung der Viskosität
von Xanthan-Lösungen in Gegenwart von mehrwertigen Kationen nachzugehen, wurden im
Rahmen der Promotionsarbeit rotationsviskosimetrische Titrationen durchgeführt. Der
Verlauf einer solchen Titration ist in Abb. 5.12 am Beispiel des Xanthans mit Calcium(II)
dargestellt. Alle weiteren Titrationsverläufe sind im Anhang den Kationen entsprechend
aufgeführt. Die Untersuchungsergebnisse (s. Absch. 5.3.1.3) zeigen, analog zur Literatur, für
die Titration von Eisen(III) in eine Xanthan-Lösung eine Gelbildung. Für die Titration von
bivalenten Kationen wurde allerdings abweichend zu den Ergebnissen von Emmerichs et al.
eine Abnahme der Viskosität bei gleichzeitiger Konzentrationszunahme der zweiwertigen
Kationen in einer wässrigen Xanthan-Lösung beobachtet [114]. Es wird davon ausgegangen,
dass eine Vernetzung wie sie beim Alginat mit bivalenten Kationen beobachtet wurde,
ausbleibt und stattdessen eine Zunahme der intramolekularen Wechselwirkungen resultiert.
OO
OO
OO
OH2C
O
OO
O
CH2OHCH2OH
AcOCH2
HO
OH
HOHOHOOH
OH
O
O
O O
OH
HO
O
OO
OO
OO
O
CH2
O
O
O O
CH2OHCH2OH
AcOCH2
HO
OH
HOHOHOOH
OH
O
O
O O
OH
HO
H3CO
**
Na+
n
n
Na+
CH3
Abbildung 6.8: Schematische Darstellung einer möglichen Struktur der intermolekularen Wasserstoffbrückenbindung von Xanthan (Natriumsalz) in wässriger Lösung [130].
120
6 Diskussion
121
Wie die von Tako et al. postulierte Struktur zweier Pentasaccharideinheiten von Xanthan in
wässriger Lösung veranschaulicht (s. Abb. 6.8), werden die solvatisierten Doppelhelices in
wässriger Lösung über Wasserstoffbrücken stabilisiert und liegen als statistisches Knäuel vor
[130]. Es wird vermutet, dass die bivalenten, positiven Ladungsträger durch coulombsche
Wechselwirkungen getrieben in diese Knäuelstruktur diffundieren und die einwertigen
Natriumionen verdrängen. Durch das Eindringen der zweiwertigen Kationen würde eine
Faltung des Polyelektrolyten begünstigt. Ausgelöst würde diese Faltung durch eine intensive
Wechswelwirkung der Kationen mit den Carboxylatgruppen der Seitenkette. Des Weiteren
werden die negativen Ladungen entlang der Xanthankette durch die Metallionen kompensiert,
so dass sich die negativen Gruppen nicht weiter abstoßen. Dies führt zu einer Dichtezunahme
des Knäuels und entsprechend zu einer Abnahme der Reibung der Polymerketten
untereinander. Die resultierende, kontinuierliche Abnahme der Viskosität wie sie in
Abbildung 5.13 zu sehen ist, schreitet solange voran, bis sich ein Gleichgewicht zwischen den
freien Komponenten und den Komplexen während der Titration einstellt. Oberhalb dieser
Äquivalenzkonzentration beobachtet man eine konstante Viskosität. Mit Hilfe dieser
Äquivalenzkonzentration und der eingesetzten Xanthankonzentration von 1,5 mg/mL konnten
Stoffmengenkonzentrationen bezogen auf die jeweiligen Polymeruntereinheiten, die mit den
Kationen wechselwirken, berechnet werden. Die in Tabelle 5.22 zusammengefassten
Ergebnisse entsprechen im Wesentlichen denen der konduktometrischen Titration, wobei auf
ein Kation annähernd zwei Polymeruntereinheiten kommen.
Dass eine Kontraktion der Xanthanmoleküle in Gegenwart von bivalenten Kationen sehr
wahrscheinlich ist, zeigen auch die Ergebnisse der Viskositätsuntersuchung von Xanthan-
Lösungen in Kapitel 5.3.2.3. Hierbei wurde der Einfluss auf die Viskosität in Abhängigkeit
der Schergeschwindigkeit untersucht. Analog zu den Ergebnissen des Hyaluronats in
wässriger Lösung wurde in Abwesenheit von mehrwertigen Kationen eine Abnahme der
Viskosität einer Xanthan-Lösung mit zunehmender Schergeschwindigkeit beobachtet. Ebenso
wie beim Hyaluronat bleibt eine Viskositätsänderung der Xanthan-Lösung in Anwesenheit
von zweiwertigen Kationen jedoch aus (s. Abb. 5.16). Eine charakteristische Eigenschaft von
Polymeren sowie von Polyelektrolyten ist, dass diese in Lösung vom klassischen
newtonschem Verhalten abweichen. Dies geschieht normalerweise durch die Bildung eines
vollständig durchspülten Knäuels. Die gelösten Polymere werden durch die Zunahme der
Scherkräfte zunehmend gestreckt, so dass eine Ausrichtung parallel zur Strömungsrichtung
resultiert. Dies führt zu schergeschwindigkeitsabhängigen Viskositäten, wobei diese
Strukturänderung in der Regel reversibel ist. Ein solches Verhalten wird auch für die
6 Diskussion
122
Polelektrolyten Xanthan und Hyaluronat in wässriger Lösung angenommen. Da sich die
Viskosität der Xanthan-Lösung in Gegenwart der bivalenten Kationen ebenso wie beim
Hyaluronat nicht verändert, wird für die beiden Polymere in Lösung ein ähnlicher
Wechselwirkungsmechanismus vermutet. In beiden Fällen führt dieser zu einer
Komprimierung der Knäuelstruktur, welche wahrscheinlich durch intensive intramolekulare
Wechselwirkungen bedingt wird. Auf diese Weise wird eine signifikante Streckung des
Moleküls während einer Scherung verhindert.
Um diese Wechselwirkungen weitergehend zu charakterisieren, wurden analog zum
Hyaluronat (s. Kap. 6.2.2) NMR-Untersuchungen durchgeführt. Man vermutet für die
Kationen Mangan(II) und Kupfer(II) einen ähnlichen Anlagerungsmechanismus wie bei den
Kationen Calcium(II), Magnesium(II), Eisen(II), Eisen(III), Zink(II), Cadmium(II) und
Blei(II). Aufgrund des Effektes der paramagnetischen Ionen Mangan(II) und Kupfer(II)
wurde eine Veränderung der NMR-Spektren von gelöstem Xanthan erwartet. Die
Beeinflussung der Resonanzsignale des Xanthans sollte Informationen über den Komplex
Mangan- bzw. Kupfer-Xanthan liefern und somit indirekt auch Informationen über die
Xanthankomplexe der übrigen mehrwertigen Kationen. Hierfür wurden Konzentrationsreihen
mit gleichen Xanthananteilen der über 3 h abgebauten Fraktionen, aber unterschiedlichen
Mangan- bzw. Kupferkonzentrationen angesetzt. Von diesen Lösungen wurden
hochauflösende 13C-NMR-Spektren nach der reversed gated decoupling Methode (s. Kap.
4.6) aufgezeichnet. Die Spektren wurden verglichen und zeigten signifikante
Linienverbreiterungen an bestimmten Kohlenstoffatomen der Seitenketten. Diese Spektren
sind in Abbildung 5.29 für Xanthan-Lösungen in Anwesenheit von Mangan(II) exemplarisch
für die untersuchten paramagnetischen Kationen dargestellt.
Die Annahme, dass eine Wechselwirkung des bivalenten Kations mit dem Glucuronat der
Xanthanseitenkette erfolgt, konnte an dieser Stelle nicht bestätigt werden. Ein Einfluss auf die
Signalbreite oder auf die Signalintensität der Carboxylatresonanzen des Glucuronats wurden
nicht detektiert (s. Abb. 5.29). Werden die Vergrößerungen in den Abbildungen 5.30 bzw.
5.31 betrachtet, wird die Vermutung, dass die Carboxylgruppe der Pyruvatgruppe in eine
Wechselwirkung mit den mehrwertigen Kationen involviert ist, bestätigt. Es wurde für drei
Resonanzen der Pyruvylgruppe eine Linienverbreiterung detektiert. Wie in Abbildung 5.30
(links) zu sehen, ist das C-1-Signal des Kohlenstoffs der in dissoziierter Form negativ
geladenen Carboxylgruppe von diesem Effekt am stärksten betroffen. Die zweite
Verbreiterung findet sich am direkt benachbarten Kohlenstoff der Position 2 (s. Abb. 5.30).
Die dritte Verbreiterung wurde für den Kohlenstoff der Methylgruppe detektiert, welche
6 Diskussion
123
ebenfalls an den C-2-Kohlenstoff der Pyruvylgruppe kovalent gebunden ist (s. Abb. 5.31).
Man kann also von einer Wechselwirkung der Manganionen mit der negativ geladenen
Carboxylgruppe der Pyruvatgruppe ausgehen. Das Manganion befindet sich in direkter Nähe
zum Carboxylkohlenstoff und verursacht aufgrund des zusätzlichen Magnetfeldes eine starke
Verbreiterung des Signals. Dieses Magnetfeld strahlt auch auf das C-2-Atom sowie auf den
Kohlenstoff der Methylgruppe aus und verbreitert somit auch diese Signale. Eine
Verbreiterung des Signals der Methylprotonen wird ebenfalls im 1H-NMR-Spektrum einer
Xanthan-Lösung in Anwesenheit von Mangan(II) beobachtet (s. Abb. 5.24). Es wird
vermutet, dass sich das Manganion in der unmittelbaren Umgebung zum Methylkohlenstoff
befindet und dort durch das zusätzliche Magnetfeld eine starke Verbreiterung des Signals
verursacht. Ein weiterer Einfluss auf die Linienbreite bzw. deren Intensität wurde im 13C-
NMR-Spektrum nicht beobachtet.
Die NMR-Ergebnisse sprechen für eine Wechselwirkung der Manganionen mit der
Carboxylgruppe der Pyruvatgruppe. Eine indirekte Bestätigung dieser Annahme wird durch
die chiroptischen Ergebnisse der CD-Spektroskopie geliefert. Die CD-Spektren der
Abbildung 5.19 zeigen exemplarisch Xanthan in wässriger Lösung in Gegenwart von
Calcium(II). Wie dort zu sehen, bleibt eine Änderung des Circulardichroismus in
Anwesenheit von Calcium(II) aus. Ein möglicher Grund hierfür ist, dass eine koordinative
Bindung eines bivalenten Kations mit der Carboxylgruppe der Pyruvatgruppe keine Änderung
der chiroptischen Eigenschaften verursacht. Dieses Verhalten wurde beim Hyaluronat
ebenfalls beobachtet, wo ausschließlich eine Änderung des Circulardichroismus für das
Signal des Glucosamids beobachtet wurde und die koordinative Bindung des Kations mit der
Carboxylgruppe keinen weiteren Einfluss auf das Spektrum zeigte. Führt man die Änderung
des CD-Signals auf eine Drehung der Amidgruppe zurück, so folgt daraus, dass die
Wechselwirkung mit der Carboxylgruppe zu keinerlei weiteren konformativen Änderung der
Struktur führt. Überträgt man dieses Ergebnis auf die CD-Untersuchung des Xanthans, wird
analog ein konformativer Einfluss für die Wechselwirkung der Kationen mit den
Pyruvatgruppen ausgeschlossen.
Fasst man die bisher diskutierten Ergebnisse zusammen, so ist eine Komplexstruktur wie sie
von Tako et al. für einen Calcium(II)-Xanthankomplex vorgeschlagen wurde (Abb. 6.9) nicht
plausibel. In Abbildung 6.9 wird eine Wechselwirkung zwischen den Carboxylatgruppen der
Pyruvatgruppe sowie des Glucuronats schematisch dargestellt. Dies ist aber nach den hier
vorliegenden Erkenntnissen nicht möglich, da die NMR-Ergebnisse eine ausschließliche
6 Diskussion
Wechselwirkung der Carboxylgruppe der Pyruvatgruppe aufzeigen. Des Weiteren würde in
einem solchen Komplex auf jedes Kation eine Polymeruntereinheit kommen.
OO
OO
OO
OH2C
O
O
O O
CH2OHCH2OH
AcOCH2
HO
OH
HOHO
HOOH
OH
O
O
O O
OH
HO
O
OO
OO
OO
O
CH2
O
O
O O
CH2OHCH2OH
AcOCH2
HO
OH
HOHO
HOOH
OH
O
O
O O
OH
HO
O
**
Ca2+ Ca2+
n
n
Abbildung 6.9: Schematische Darstellung einer möglichen Struktur der intermolekularen Calcium(II)-Brückenbindung von Xanthan (Calciumsalz) einschließlich intramolekularer Assoziation in wässriger Lösung vorgeschlagen von Tako et al. [130]. Dies widerspricht aber den Ergebnissen der konduktometrischen Titration sowie der
rotationviskosimetrischen Titration, mit welchen ein Verhältnis von einem Kation zu zwei
Polymeruntereinheiten bestimmt wurde.
Abbildung 6.10: Schematische Darstellung einer möglichen Struktur der intermolekularen Brückenbindung von Xanthan über bivalente Kationen einschließlich intramolekularer Assoziation analog zu den im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse. 124
6 Diskussion
125
Mit der obigen Abbildung 6.10 erhält man eine schematische Darstellung, bei der die hier
erhaltenen Ergebnisse berücksichtigt wurden. Wie dort abgebildet wird eine oktaedrische
Koordination des Natriumions über die Acetylgruppe und zwei Carboxylatgruppen der
Glucuronate aufgezeigt. Diese Glucuronate sind Teile zweier Seitenketten und gehören
jeweils zu einer benachbarten Pentasaccharideinheit. Des Weiteren wird davon ausgegangen,
dass ein tetraedrischer Komplex durch die Wechselwirkung von einem bivalenten Kation mit
zwei Carboxylatgruppen von gegenüberliegenden Pyruvatgruppen gebildet wird. Dieser
Bindungsmechanismus, wie er hier für die Bildung eines tetraedrischen Chelatkomplexes
geschildert wird, gilt wahrscheinlich für alle im Rahmen dieser Arbeit untersuchten
Metallionen gleichermaßen.
Betrachtet man die gesammelten Fakten, dann gilt eine Affinität der ökologisch relevanten
Kationen zum Xanthan, wie sie auch für das Hyaluronat beobachtet wurde, als bewiesen.
Dies bedeutet entsprechend, dass aquatische Biofilme, mit Xanthan als wesentlichen
Bestandteil der EPS, mehrwertige Kationen akkumulieren können. Das unkalkulierbare
Risiko für die Spezies in dessen Nahrungskette die Schwermetalle eindringen gilt an dieser
Stelle genauso wie für das Hyaluronat.
Es ist denkbar, dass die Affinität des Xanthans zu Schwermetallionen ebenso wie beim
Hyaluronat beschrieben durch den Einsatz in Klärwerken zu einer Verbesserung der
Wasserqualität beitragen kann.
7 Zusammenfassung
126
7 Zusammenfassung Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen bezüglich der
Wechselwirkungen von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) und ökologisch
relevanten bi- bzw. trivalenten Kationen in wässriger Lösung durchgeführt. Mittels
physikalischer Methoden wurden die Modellpolysaccharide Dextran, Hyaluronat sowie
Xanthan in Anwesenheit und in Abwesenheit von mehrwertigen Metallionen (Ca2+, Mg2+,
Mn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Cd2+ und Pb2+) charakterisiert. Das ungeladene Dextran wurde
als Vergleichssubstanz für die geladenen Polyelektrolyte Hyaluronat und Xanthan eingesetzt.
Um bei geladenen Molekülen den Einfluss von Seitenketten zu untersuchen, wurde das
Xanthan mit dem Hyaluronat verglichen. Ein partieller Abbau der Polymeren in Lösung
wurde durch eine Ultraschalldegradation erzielt. Dabei wurde die Molmasse für das
Hyaluronat von 1,7 ⋅ 106 g/mol auf 4,0 ⋅ 105 g/mol und für Xanthan von 2,9 ⋅ 106 g/mol auf
1,4 ⋅ 105 g/mol reduziert. Dies führt zu einer Viskositätsabnahme der Polymerlösung und
somit zu einer höheren Beweglichkeit der solvatisierten Moleküle. Das Dextran war mit einer
Molmasse von 2,0 ⋅ 105 g/mol bereits gut löslich und wurde aus diesem Grund nicht weiter
abgebaut. Mit Hilfe von Leitfähigkeits- bzw. rotationsviskosimetrischen Titrationen wurde
das Verhältnis von Kationen zu den Polymeruntereinheiten für Hyaluronat mit 1 zu 5 und für
Xanthan mit 1 zu 2 am Äquivalenzpunkt bestimmt. Die Polyelektrolytlösungen zeigten in
Abwesenheit von mehrwertigen Kationen eine Abweichung vom klassischen newtonschen
Verhalten. Dies wurde durch Untersuchungen der Viskosität in Abhängigkeit zur Scherrate
festgestellt. In Anwesenheit von bi- bzw. trivalenten Metallionen gab es keine Abweichungen
vom newtonschen Verhalten. Es wird vermutet, dass in Gegenwart von Kationen eine starke
intramolekulare Wechselwirkung zu einer Dichtezunahme des Moleküls und damit zu einer
Abnahme der Viskosität der Lösungen führt. Bestätigt wurde dies durch rotations-
viskosimetrische Titrationen, bei denen eine Abnahme der Viskosität der Lösungen bei
gleichzeitiger Erhöhung der Kationenkonzentration beobachtet wurde. Strukturspezifische
Wechselwirkungen wurden für das Hyaluronat sowie für Xanthan mittels CD-Spektroskopie
und 1H- bzw. 13C-NMR-spektroskopischen Untersuchungen nachgewiesen. Hierbei
beobachtete man für das Hyaluronat regiospezifische Wechselwirkungen der untersuchten
Kationen mit den Amidgruppen sowie den Carboxylatgruppen. Für das Xanthan zeigten die
Untersuchungen eine spezifische Wechselwirkung der mehrwertigen Metallionen
ausschließlich mit den Carboxylatgruppen der Pyruvatgruppen auf.
7 Zusammenfassung
Bei Berücksichtigung der gesammelten Fakten wurde eine Affinität der hier untersuchten
ökologisch relevanten Kationen zu den geladenen Vertretern der EPS nachgewiesen. Für das
Hyaluronat bedeutet dies in Gegenwart von mehrwertigen Kationen die Bildung eines
intramolekularen, oktaedrischen Chelatkomplexes, dessen Stabilität mit dem Kationenradius
zunimmt (s. Abb. 7.1).
Abbildung 7.1: Postulierte Struktur eines oktaedrischen Metall-Hyaluronatkomplexes zweier Tetrasaccharideinheiten.
Das Xanthan bildet ebenfalls in Gegenwart von mehrwertigen Kationen einen
intramolekularen Chelatkomplex, bei welchem allerdings eine tetraedrische Koordination des
Kations vermutet wird. Bei diesem Komplex nimmt die Stabilität wie beim Hyaluronat mit
dem Kationenradius zu. Die in der Literatur beschriebene Annahme, dass Xanthan mit den
mehrwertigen Kationen über die Pyruvatgruppen und die Glucuronate wechselwirken, konnte
nicht bestätigt werden [130]. Analog zu den hier erhaltenen Ergebnissen wird vielmehr davon
ausgegangen, dass die koordinativen Bindungen auf die Pyruvatgruppen beschränkt sind (s.
Abb. 7.2).
Abbildung 7.2: Strukturvorschlag für die Wechselwirkung von Xanthan mit mehrwertigen Kationen.
127
8 Literaturverzeichnis
128
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9 Anhang
9 Anhang Anhang A – Abbildungsanhang Konduktometrie
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
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S/cm
]
Abbildung A.1: Exemplarische Abbildung für eine Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Mg2+-Lösung (0,05 mol/L)
0
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0,2
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0,4
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0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
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S/cm
]
Abbildung A.2: Exemplarische Abbildung für eine Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Mn2+-Lösung (0,05 mol/L)
137
9 Anhang
0
0,1
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0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
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S/cm
]
Abbildung A.3: Exemplarische Abbildung für eine Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Fe2+-Lösung (0,05 mol/L)
0
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1
1,5
2
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
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S/cm
]
Abbildung A.4: Exemplarische Abbildung für eine Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Fe3+-Lösung (0,05 mol/L) 138
9 Anhang
0
0,1
0,2
0,3
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1
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
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it [m
S/cm
]
Abbildung A.5: Exemplarische Abbildung für eine Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Cu2+-Lösung (0,05 mol/L
0
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0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
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S/cm
]
Abbildung A.6: Exemplarische Abbildung für eine Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Zn2+-Lösung (0,05 mol/L 139
9 Anhang
0
0,05
0,1
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0,45
0,5
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
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S/cm
]
Abbildung A.7: Exemplarische Abbildung für eine Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Cd2+-Lösung (0,05 mol/L
0
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0,3
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0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
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S/cm
]
Abbildung A.8: Exemplarische Abbildung für eine Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Pb2+-Lösung (0,05 mol/L 140
9 Anhang
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0,2
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0,8
1
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
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it [m
S]
Abbildung A.9: Exemplarische Abbildung für eine Titration einer Lösung (100 mL) des über 3 h abgebauten Hyaluronats (1,5 mg/mL) mit einer Ca2+-Lösung (0,05 mol/L)
0
0 ,2
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1
0 0,00 05 0,00 1 0,00 15 0 ,0 02 0,00 25 0 ,0 03 0,00 35 0,0 04 0 ,0 04 5 0,0 05
Konzentrat io n M e2+ [mo l/L]
Lei
tfähi
gkei
t [m
S/cm
]
Abbildung A.10: Exemplarische Abbildung für eine Titration einer Lösung (100 mL) des über 3 h abgebauten Hyaluronats (1,5 mg/mL) mit einer Mg2+-Lösung (0,05 mol/L) 141
9 Anhang
0,3
0,4
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1,1
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0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
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S/cm
]
Abbildung A.11: Exemplarische Abbildung für eine Titration einer Lösung (100 mL) des über 3 h abgebauten Hyaluronats (1,5 mg/mL) mit einer Mn2+-Lösung (0,05 mol/L)
0
0,2
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0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
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S/cm
]
Abbildung A.12: Exemplarische Abbildung für eine Titration einer Lösung (100 mL) des über 3 h abgebauten Hyaluronats (1,5 mg/mL) mit einer Fe2+-Lösung (0,05 mol/L)
142
9 Anhang
0,3
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0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
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it [m
S/cm
]
Abbildung A.13: Exemplarische Abbildung für eine Titration einer Lösung (100 mL) des über 3 h abgebauten Hyaluronats (1,5 mg/mL) mit einer Cu2+-Lösung (0,05 mol/L)
0
0,1
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0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
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S/cm
]
Abbildung A.14: Exemplarische Abbildung für eine Titration einer Lösung (100 mL) des über 3 h abgebauten Hyaluronats (1,5 mg/mL) mit einer Zn2+-Lösung (0,05 mol/L)
143
9 Anhang
0,2
0,3
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0,5
0,6
0,7
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0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
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it [m
S/cm
]
Abbildung A.15: Exemplarische Abbildung für eine Titration einer Lösung (100 mL) des über 3 h abgebauten Hyaluronats (1,5 mg/mL) mit einer Cd2+-Lösung (0,05 mol/L)
0,1
0,2
0,3
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0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
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S/cm
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Abbildung A.16: Exemplarische Abbildung einer Leitfähigkeitskurve für die Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung (100 mL) der Konzentration 1,5 mg/mL mit einer Ca2+-Lösung der Konzentration 0,05 mol/L
144
9 Anhang
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
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it [m
S/cm
]
Abbildung A.17: Exemplarische Abbildung einer Leitfähigkeitskurve für die Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung (100 mL) der Konzentration 1,5 mg/mL mit einer Mg2+-Lösung der Konzentration 0,05 mol/L
0,1
0,3
0,5
0,7
0,9
1,1
1,3
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
tfäh
igke
it [m
S/cm
]
Abbildung A.18: Exemplarische Abbildung einer Leitfähigkeitskurve für die Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung (100 mL) der Konzentration 1,5 mg/mL mit einer Mn2+-Lösung der Konzentration 0,05 mol/L 145
9 Anhang
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
tfäh
igke
it [m
S/cm
]
Abbildung A.19: Exemplarische Abbildung einer Leitfähigkeitskurve für die Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung (100 mL) der Konzentration 1,5 mg/mL mit einer Fe2+-Lösung der Konzentration 0,05 mol/L
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
tfäh
igke
it [m
S/cm
]
Abbildung A.20: Exemplarische Abbildung einer Leitfähigkeitskurve für die Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung (100 mL) der Konzentration 1,5 mg/mL mit einer Cu2+-Lösung der Konzentration 0,05 mol/L 146
9 Anhang
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0,55
0,6
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
tfäh
igke
it [m
S/cm
]
Abbildung A.21: Exemplarische Abbildung einer Leitfähigkeitskurve für die Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung (100 mL) der Konzentration 1,5 mg/mL mit einer Cd2+-Lösung der Konzentration 0,05 mol/L
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005
Konzentration Me2+ [mol/L]
Lei
tfäh
igke
it [m
S/cm
]
Abbildung A.22: Exemplarische Abbildung einer Leitfähigkeitskurve für die Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung (100 mL) der Konzentration 1,5 mg/mL mit einer Pb2+-Lösung der Konzentration 0,05 mol/L
147
9 Anhang
Rotationsviskosimetrie
Viskositätsänderung einer Dextranlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer MgCl2-Lsg. (0,05 mol/L)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014
Konzentration von MgCl2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Dextranlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer MnCl2-Lsg. (0,05 mol/L)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014
Konzentration von MnCl2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Dextranlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe
einer FeCl2-Lsg. (0,05 mol/L)
0,5
0,55
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
0,85
0,9
0,95
1
0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,014 0,016 0,018 0,02
Konzentration von FeCl2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Dextranlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer FeCl3-Lsg. (0,05 mol/L)
0,5
0,55
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
0,85
0,9
0,95
1
0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,014 0,016 0,018 0,02
Konzentration von FeCl3 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Dextranlösung (1,5 mg/mL)
bei Zugabe einer CuCl2-Lsg. (0,05 mol/L)
0,5
0,55
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
0,85
0,9
0,95
1
0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,014 0,016 0,018 0,02
Konzentration von CuCl2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Dextranlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer ZnAc2-Lsg. (0,05 mol/L)
0,5
0,55
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
0,85
0,9
0,95
1
0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,014 0,016 0,018 0,02
Konzentration von ZnAc2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Dextranlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer CdAc2-Lsg. (0,05 mol/L)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014
Konzentration von CdAc2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Dextranlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer PbAc2-Lsg. (0,05 mol/L)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014 0,0016 0,0018 0,002
Konzentration von PbAc2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
148
9 Anhang
Viskositätsänderung einer Hyaluronatlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer MgCl2-Lsg. (0,05 mol/L)
0
10
20
30
40
50
60
70
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014
Konzentration von MgCl2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Hyaluronatlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer MnCl2-Lsg. (0,05 mol/L)
0
10
20
30
40
50
60
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014
Konzentration von MnCl2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Hyaluronatlösung (1,0 mg/mL) bei Zugabe einer FeCl2-Lsg. (0,05 mol/L)
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
2,2
2,4
0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,014
Konzentration von FeCl2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Hyaluronatlösung (1,0 mg/mL) bei Zugabe einer CuCl2-Lösung (0,05 mol/L)
0,75
0,95
1,15
1,35
1,55
1,75
1,95
2,15
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014
Konzentration von CuCl2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Hyaluronatlösung (1,5 mg/mL) bei
Zugabe einer ZnAc2-Lsg. (0,05 mol/L)
0
10
20
30
40
50
60
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014
Konzentration von ZnAc2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Hyaluronatlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer CdAc2-Lsg. (0,05 mol/L)
0
10
20
30
40
50
60
70
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014
Konzentration von CdAc2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Hyaluronatlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer PbAc2-Lsg. (0,05 mol/L)
1,5
1,7
1,9
2,1
2,3
2,5
2,7
2,9
3,1
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014
Konzentration von PbAc2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Xanthanlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer MgCl2-Lsg. (0,05 mol/L)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014
Konzentration von MgCl2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
149
9 Anhang
Viskositätsänderung einer Xanthanlösung (1,5 mg/mL) bei Zugabe einer MnCl2-Lsg. (0,05 mol/L)
1,5
1,7
1,9
2,1
2,3
2,5
2,7
2,9
3,1
3,3
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014
Konzentration von MnCl2 [mol/L]
η (
Visk
ositä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Xanthanlösung (1,0 mg/mL) bei Zugabe einer FeCl2-Lsg. (0,5 mol/L)
1
1,5
2
2,5
3
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025
Konzentration von FeCl2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Xanthanlösung (1,0 mg/mL) bei Zugabe einer CuCl2-Lsg. (0,1 mol/L)
1
1,5
2
2,5
3
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014
Konzentration von CuCl2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Xanthanlösung (1,0 mg/mL) bei Zugabe einer ZnAc2-Lsg. (0,5 mol/L)
1
1,5
2
2,5
3
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025
Konzentration von ZnAc2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Xanthanlösung (1,0 mg/mL) bei Zugabe einer
CdAc2-Lsg.(0,2 mol/L)
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025
Konzentration von CdAc2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
Viskositätsänderung einer Xanthanlösung (1,0 mg/mL) bei Zugabe einer
PbAc2-Lsg. (0,05 mol/L)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014
Konzentration von PbAc2 [mol/L]
η (V
isko
sitä
t) [m
Pa*s
]
150
9 Anhang
151
3C-NMR-Spektroskopie
1
255075100125150175 Abbildung 5.26: Exemplarische Darstellung eines 13C-NMR-Spektrums von Hyaluronat in Gegenwart von 0,3 mmol/L (a) und 1,2 mmol/L (b) Cu2+- Ionen.
102030405060708090100110120130140150160170180190
pektrums von Xanthan in egenwart von 0,3 mmol/L (a) und 1,2 mmol/L (b) Cu2+- Ionen.
a)
b)
Abbildung 5.26: Exemplarische Darstellung eines 13C-NMR-SG
9 Anhang
152
nhang B - Abbildungsverzeichnis
Abbildung 2.1: et
den konvektiven Fluss durch offene Wasserkanäle in der Matrix [10]. 3
bbildung 2.2: Rasterelektronische (SEM) Aufnahme von Leuconostoc mesenteroides 7
ooepidemicus 8
bbildung 2.4: Rasterelektronische (SEM) Aufnahme von Xanthomonas campestris 9
bbildung 2.5: Häufige Monosaccharideinheiten in Biopolymeren 11
Abbildung 2.6: kationischer Polyelektrolyt Polydiallyldimethyl-ammoniumchlorid (rechts) 13
Abbildung 2.7: nte:
r Koordination eines Calciumions innerhalb einer „Eggbox“ [42] 16
Abbildung 2.8: ckten Konformation (b) und einer Perlenketten Struktur (c) [52] 17
Abbildung 2.9: (Monosaccharidbaustein) 18
Abbildung 2.10 einheit der Hyaluronsäure (Disaccharidbaustein) 19
Abbildung 2.11 heit des Xanthans (Pentasaccharidbaustein) 20
Abbildung 2.12 Oberflächengewässer Deutschlands im Jahr 1985, 1995 und 2000 [69] 23
A
Modell eines Biofilms in wässriger Umgebung. Es sind diskrete Mikrokolonien, in denen die Zellen in eine dichte EPS-Matrix eingebettsind, erkennbar. Die Pfeile symbolisieren
A Abbildung 2.3: Rasterelektronische (SEM) Aufnahme von Streptococcus equi subsp. Z A A
Anionischer Polyelektrolyt Natrium-Polystyrolsulfonat (links) und
Das „Eggbox“-Modell für Calcium-Alginat; hellblaue Kettensegmente: Polymannuronatblöcke; dunkelblaue KettensegmePolyguluronatblöcke; rechts: Detailansicht de
Computersimulation eines statistischen Knäuels (a), der gestre
Abbildung einer Monomereinheit des Dextrans
: Abbildung einer Grund
: Abbildung einer Grundein
: Schwermetallemissionen aus Punkt- und diffusen Quellen in die
9 Anhang
153
Abbildung 2.13 ulenfüllmaterials (A) und des Trenn- mechanismus der SEC (B) 25
Abbildung 2.14 konduktometrische Untersuchungen. B) Wheatstone Brückenschaltung [80] 29
Abbildung 2.15 n Wellen, die 90 ° phasenverschoben sind. B) Links polarisiertes Licht 31
Abbildung 2.16 einer optisch aktiven Verbindung (εL ≠ εR) resultiert ein CD-Signal
[82]. 31
Abbildung 2.17 h der Absorption; Charakteristisch für einen positiven Cotton-Effekt. 32
Abbildung 2.18 lengangs in einem CD-Spektrometer (Yobin Yvon Dichrograph Mark III) 33
bbildung 2.19: Laminares Strömungsdiagram 34
bbildung 2.20: Schematische Darstellung des Fließverhaltens nicht-Newtonscher Fluide 35
Abbildung 2.21 e Darstellung eines Koaxial-Zylinder-Rotationsviskosi- meters [86] 37
Abbildung 2.22 e Darstellung eines Kegel-Platte- Rotationsviskosi- meters [86] 38
bbildung 2.23: Schematische Darstellung eines Platte-Platte-Viskosimeters [86] 39
bbildung 2.24: Impulsfolge bei der Breitbandentkopplung [92] 41
Abbildung 2.25ird.
Abhängigkeit von der Anzahl der direkt gebundenen Wasserstoffatome [95] 41
: Darstellung des porösen Sä
: A) Schematische Darstellung einer Präzisionsleitfähigkeitsmesszelle für
: A) Zirkular polarisiertes Licht; Erzeugung aus zwei linear polarisierte
: Durch unterschiedliche Absorption des links- bzw. rechtspolarisierten Lichts
: UV-Spektrum und zugehöriges Circulardichrogramm im Bereic
: Schematische Darstellung eines Strah
A A
: Schematisch
: Schematisch
A A
: Angeregter Kern ist 1H. Nach der Zeit τ entsteht ein Antiphasentherm, der mit Hilfe des 90°-Pulses auf 13C in einen Multiquantentherm überführt w In der folgenden τ-Periode differenzieren sich die Operatortherme in
9 Anhang
154
Abbildung 2.26 uf 13C
ünschte Magnetisierung. Detektiert wird 1H unter 13C-Entkopplung [96] 42
Abbildung 4.1
wässrige Polyelektrolytlösung (b). 49
Abbildung 4.2 einer Titration einer Salzlösung in eine wässrige Polyelektrolytlösung 51
Abbildung 5.1 dem Viskositätsdetektor (links) und dem Differentialrefraktometer (rechts) 55
Abbildung 5.2: abbau von Xanthan (0 h, 5 h, 10 h, 15 h mit einer Intensität von 60 Watt) 56
Abbildung 5.3: Degradationszeit 56
Abbildung 5.4: Titration von Dextran (1,5 mg/mL) mit einer Ca2+-Lösung (0,05 mol/L) 59
Abbildung 5.5: über auten Hyaluronats (1,5 mg/mL) mit einer Pb2+-Lösung (0,05
mol/L) 60
Abbildung 5.6: von Hyaluronat (1,0 mg/mL; 100 mL) mit dem Kation „Pb2+“ 61
Abbildung 5.7: tration 1,0 mg/mL
mit einer Zn2+-Lösung der Konzentration 0,05 mol/L 64
Abbildung 5.8: sfunktion
Ionenkonzentration 65
: Angeregter Kern ist 1H. In der Zeit τ wird die Polarisation von 1H a übertragen. In t1 entwickelt sich diese 13C-Verschiebung ohne 1H- Kopplungen. Während der Zeit δ dephasiert ein Gradient (Echo/Antiecho) die Magnetisierung. Nach einem Polarisationstransfer rephasiert der letzte Gradient (G2) τ die gew
: Exemplarische Abbildung der Leitfähigkeitsfunktion einer Titration einer reinen Salzlösung in bidestilliertes Wasser (a) und einer Salzlösung in eine
: Exemplarische Abbildung der Viskositätsfunktion
: Exemplarische Abbildung der Elutionskurve für Hyaluronat, detektiert mit
SEC-Malls für den Ultraschall
Auftragung der mittleren Molmassen der abgebauten Fraktionen gegen die
Exemplarische Abbildung für eine
Exemplarische Abbildung für eine Titration einer Lösung (100 mL) des3 h abgeb
Exemplarische Darstellung der ersten Ableitung einer Leitfähigkeitsfunktion
Exemplarische Abbildung einer Leitfähigkeitskurve für die Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung (100 mL) der Konzen
Exemplarische Darstellung der ersten Ableitung einer Leitfähigkeitvon Xanthan (1,5 mg/mL; 100 mL) in Abhängigkeit von der Zn2+-
9 Anhang
155
Abbildung 5.9: L mit einer Lösung von Cd2+-Ionen mit einer Konzentration von 0,05 mol/L 67
Abbildung 5.10 n. Es wurde eine
Hyaluronatlösung (1,5 mg/mL; 50 mL) gegeben 69
Abbildung 5.11+-Lösung (0,05 mol/L)
in eine Dextranlösung (1,5 mg/mL; 50 mL) gegeben 70
Abbildung 5.12
Lösung (0,05 molar) in eine Hyaluronatlösung (1,5 mg/mL; 50 mL) titriert 71
Abbildung 5.13 mL; 3h abgebaut) durch Titration mit einer CaCl2-Lösung (0,05
mol/L) 73
Abbildung 5.14 xtran (1,5 mg/mL) bei unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten 75
Abbildung 5.15
(CaCl2) 76
Abbildung 5.16
(CaCl2) 77
Abbildung 5.17onzentration von 0,0025 mol/L (b), 0,005 mol/L
(c) und 0,0075 mol/L (d) 78
Abbildung 5.18onzentration von 0,002 mol/L (b), 0,005 mol/L
(c) und 0,0075 mol/L (d) 79
Abbildung 5.19
Titration einer wässrigen Xanthan-Lösung der Konzentration 2,5 mg/m
: Beispielabbildung für die Viskositätsmessung einer Fe3+-Titratio in 50 µL-Schritten eine Eisen(III)-Lösung (0,05 mol/L) in
: Exemplarische Abbildung für eine rotationsviskosimetrische Titration an Dextranlösung. Es wurde in 50 µL-Schritten eine Ca2
: Exemplarischer Verlauf für eine typische Viskositätsmessung des Hyaluronats (nicht abgebaut). Es wurde in 50 µL-Schritten eine Ca2+-
: Exemplarische Abbildung der Viskositätsänderung einer Xanthan-Lösung (1,5 mg/
: Abbildung einer Viskositätsmessung von De
: Abbildung einer Viskositätsmessung von Hyaluronat (1,5 mg/mL) bei unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten und Salzkonzentrationen
: Abbildung einer Viskositätsmessung von Xanthan (1,5 mg/mL) bei unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten und Salzkonzentrationen
: CD-Kurven von über 3 h abgebautem Hyaluronat (a) und von Hyaluronat- Lösungen mit einer Ca2+-K
: CD-Kurven von über 3 h abgebautem Hyaluronat (a) und von Hyaluronat- Lösungen mit einer Pb2+-K
: Vergrößerung von CD-Kurven aufgenommen im Bereich von 210 bis 280 nm von über 3 h abgebautem Xanthan und von Xanthan-Lösungen mit
9 Anhang
156
Abbildung 5.20 ung sch-Verhältnis einer 13C-NMR-Untersuchung von
Xanthan bei 60°C 82
Abbildung 5.21 ei 60°C; 0 h abgebaut und
16 mg/mL (a); 3 h abgebaut und 75 mg/mL (b) 83
Abbildung 5.22 ms einer Dextran-Lösung der Konzentration 75 mg/mL, gemessen bei 60°C 84
Abbildung 5.23 rt
-glucosamid gehören, sind durch eckige Klammern gekennzeichnet ([...]) 85
Abbildung 5.24 Mn2+-Inonen (b), 1,2 mmol/L Cu2+-Ionen (c)
und ohne Salzzusatz (a). 87
Abbildung 5.25 rums einer Dextranlösung (75 mg/mL), gemessen bei 60°C 88
Abbildung 5.26
- glucosamid gehören sind durch eckige Klammern gekennzeichnet ([...]) 89
Abbildung 5.27
e, die zum id gehören sind durch eckige Klammern
gekennzeichnet ([...]) 90
Abbildung 5.28 .
-glucosamid
gehören sind durch eckige Klammern gekennzeichnet ([...]) 90
einer Ca2+-Konzentration von 0,002 mol/L, 0,005 mol/L und 0,0075 mol/L 80 : Einfluss der Abbauzeit bzw. der Konzentration auf die spektrale Auflös und das Signal-Rau
: Einfluss der Abbauzeit bzw. der Konzentration auf die spektrale Auflösung einer 13C-NMR-Untersuchung von Hyaluronat b
: Exemplarische Abbildung eines 1H-NMR-Spektru
: Gegenüberstellung dreier 1H-NMR-Spektren von Hyaluronat in Gegenwa von 1,2 mmol/L Mn2+-Inonen (b), 1,2 mmol/L Cu2+-Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a). Die Signale, die zum N-Acetyl-D
: Gegenüberstellung dreier 1H-NMR-Spektren von Xanthan aufgezeichnet in Gegenwart von 1,2 mmol/L
: Exemplarische Abbildung eines 13C-NMR-Spekt
: Exemplarische Gegenüberstellung dreier 13C-NMR-Spektren von Hyaluronat in Gegenwart von 0,3 mmol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a). Die Signale die zum N-Acetyl-D
: Vergrößerung des Bereichs zwischen 70 und 80 ppm für 13C-NMR- Spektren von Hyaluronat in Gegenwart von 0,3 mmol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a). Die Signal N-Acetyl-D-glucosam
: Vergrößerung des Bereichs zwischen 175 und 185 ppm (linke Abb.) bzw von 20 bis 30 ppm (rechts) für 13C-NMR-Spektren von Hyaluronat in Gegenwart von 0,3 mmol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a). Die Signale, die zum N-Acetyl-D
9 Anhang
157
Abbildung 5.29ol/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c)
und ohne Salzzusatz (a) 92
Abbildung 5.30l/L Mn2+- Ionen (b), 1,2
mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a) 92
Abbildung 5.31 bzw.
l/L Mn2+- Ionen (b), 1,2 mmol/L Mn2+- Ionen (c) und ohne Salzzusatz (a) 93
Abbildung 5.32 C)
-Achse) und das 13C-NMR-Spektrum eines DEPT-Experiments (Y-Achse) 94
Abbildung 6.1: ronat in wässriger Lösung nach Rechnungen von Haxaire et al. [107] 101
bbildung 6.2: Ausschnitt von Hyaluronat (Tetrasaccharideinheit) in wässriger Lösung 102
Abbildung 6.3: (Tetrasaccharideinheit) in einem unpolaren Lösemittel (z. B. DMSO). 102
bbildung 6.4: Ausschnitt von Xanthan (Trisaccharideinheit) 106
Abbildung 6.5: r durch
Leitfähigkeit κ* 113
Abbildung 6.6: ier rfen konform zu den im Rahmen dieser
Arbeit erhaltenen Ergebnisse. 117
Abbildung 6.7: itstitrationen ermittelten Abnahme der spezifischen
Leitfähigkeit κ* 119
: Exemplarische Gegenüberstellung dreier 13C-NMR-Spektren von Xanthan in Gegenwart von 0,3 mm
: Vergrößerung des Bereichs zwischen 96 und 116 ppm für 13C-NMR- Spektren von Xanthan in Gegenwart von 0,3 mmo
: Vergrößerung des Bereichs zwischen 168 und 188 ppm (linke Abb.) von 15 bis 35 ppm (rechts) für 13C-NMR-Spektren von Xanthan in Gegenwart von 0,3 mmo
: Exemplarisches 2D-Spektrum einer inversen 1H-13C-Korelation (HSQ von Hyalronat (75 mg/mL) bei 60°C. Aufgetragen sind ein 1H-NMR- Spektrum (X
Exemplarische Darstellung von Hyalu
A
Schematische Darstellung eines Hyaluronatauschnittes
A
Balkendiagramm für den Ionenradius bivalenter Kationen mit deLeitfähigkeitstitrationen ermittelten Abnahme der spezifischen
Postulierte Struktur eines oktaerischen Metall-Hyaluronatkomplexes zweTetrasaccharideinheiten. Entwo
Balkendiagramm für den Ionenradius bivalenter Kationen mit der durch Leitfähigke
9 Anhang
158
Abbildung 6.8: ng von Xanthan
(Natriumsalz) in wässriger Lösung [130]. 120
Abbildung 6.9:
arer Assoziation in wässriger Lösung vorgeschlagen von Tako et al. [130]. 124
Abbildung 6.10 ren
tion analog zu den im Rahmen dieser Arbeit rhaltenen Ergebnissen. 124
Schematische Darstellung einer möglichen Struktur der intermolekularen Wasserstoffbrückenbindu
Schematische Darstellung einer möglichen Struktur der intermolekularen Calcium(II)-Brückenbindung von Xanthan (Calciumsalz) einschließlich intramolekul
: Schematische Darstellung einer möglichen Struktur der intermolekulaBrückenbindung von Xanthan über bivalente Kationen einschließlich intramolekularer Assoziae
9 Anhang
159
nhang C - Tabellenverzeichnis
abelle 2.1: Allgemeine Zusammensetzung bakterieller EPS [11] 5
abelle 2.2: Zusammenstellung wichtiger Polysaccharide [34] 12
abelle 3.1: Verwendete Polysaccharide 43
abelle 3.2: Verwendete Chemikalien 44
abelle 3.3: Verwendete Geräte 45
abelle 3.4: Verwendete Computer-Software 46
abelle 5.1: Mittlere molare Massen der verwendeten EPS 54
abelle 5.2: Viskosität der verwendeten EPS mit einer Konzentration von 1,5 mg/mL 57
abelle 5.3: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Calcium 62
abelle 5.4: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Magnesium 62
abelle 5.5: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Mangan 62
abelle 5.6: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Kupfer 62
abelle 5.7: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Eisen(II) 62
abelle 5.8: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Zink 62
abelle 5.9: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Cadmium 63
abelle 5.10: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Blei 63
A T T T T T T T T T T T T T T T T
9 Anhang
160
Tabelle 5.11: den komplementären Kationen und der Polymeruntereinheit von Hyaluronat 63
abelle 5.12: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Calcium 66
abelle 5.13: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Magnesium 66
abelle 5.14: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Mangan 66
abelle 5.15: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Kupfer 66
abelle 5.16: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Eisen(II) 66
abelle 5.17: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Zink 66
abelle 5.18: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Cadmium 67
abelle 5.19: Äquivalenzkonzentration und ∆κ*-Werte von Blei 67
Tabelle 5.20 hen den komplementären Kationen und der Polymeruntereinheit von Xanthan 68
Tabelle 5.21:
mg/mL) 72
Tabelle 5.22entären Kationen und der Polymeruntereinheit von Xanthan (1,5
mg/mL) 74
Tabelle 5.23: e und Glucosamid) bei 13C-NMR-Spektren angegeben in der
Einheit ppm. 95
Stöchiometrisches Verhältnis zwischen
T T T T T T T T
: Stöchiometrisches Verhältnis zwisc
Äquivalenzkonzentration und stöchiometrisches Verhältnis zwischen den komplementären Kationen und der Polymeruntereinheit von Hyaluronat (1,5
: Äquivalenzkonzentration und stöchiometrisches Verhältnis zwischen den komplem
Chemische Verschiebung der Signale für die Monomere des Hyaluronats (Glucuronsäur
Selbständigkeitserklärung Hiermit erkläre ich, die vorliegende Arbeit selbständig ohne fremde Hilfe verfasst zu haben
und nur die angegebene Literatur und Hilfsmittel verwendet zu haben.
Essen, 14. November 2006
(Guido Furth)
161